JPS61501426A - 酵母ハイブリッドベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ベクター （発明の分野］ 本発明は、組み換えＤＮＡ生物工学の分野に関する。 詳細にいえば、本発明は、酵母ベクター、酵母宿主生物およびポリペプチドの生 産方法に関する。 ［発明の背景］ 組み換えＤＮＡ生物工学の技術を用いて生産しうるポリペプチドとして、今や多 数の例が知られている。　広義にいえば、こうした技術は、所望のポリペプチド に対する遺伝子コードを宿主生物中において安定して存在しうるベクター中に挿 入することから成る。　ベクター中の適切な制御配列に関する位置に遺伝子を挿 入すると、宿主生物の体内に入るやいなや前記ベクターは挿入遺伝子を発現して ポリペプチドを生産する。　こうしたベクターは当業技術において「発現ベクタ ー」と呼ばれてあり、近年かなり多くの研究の対象とされている。　このような 研究の主要な目的は、周知の宿主生物（たとえば細菌、酵母および哺乳類細胞） に対する相溶性をもち、かつ高収率でポリペプチドを生産する発現ベクターの開 発にある。　このため、発現に影響を及ぼす制御配列をとりわけプロモーター配 列に関する詳細な研究がなされてきた。　これまでに多数のプロモーターが同定 され、有効な発現ベクターの生産に利用されている。 しかしながら、形質転換を施された宿主生物によって製造される蛋白質の凹は、 生物の細胞内で安定して存在するベクターの数（以下、「ベクターコピー数」と 称する）によって制限される。 本発明の目的は、酵母宿主生物中において酵母発現ベクターのコピー数を増加さ せることができる酵母ベクターを提供することにある。 公開されたヨーロッパ特許出願明細書ＥＰ−Ａ２−００７３６３５において、発 明者らは酵母中のポリペプチドの発現に有用なプラスミドベクターのセットにつ いて説明し１）、１−１４をも参照のこと）。　上記プラスミドのひとつは、酵 母ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子および複製の酵母２μ原型の　 制御配列を利用したものである。　このプラスミドならびに酵母野生型２μプラ スミドにもとづいた他の酵母プラスミドのすべては、有効な複製および高コピー 数の維持を可能にするトランス配置機能を与えるために、内因性２μプラスミド の存在を必要とする。　これらの機能はＲＥＰｌ、ＢよびＲＥＰ２遺伝子にょｐ 、２０３＞。　２μプラスミド複製は、通常８期の初期に起る（Ｚｏｋｉａｎら 、Ｃｅ１ｌ　、　１９７８年、１７ｐ。 ９２３）。　ただしコピー数が小ざい場合は、プラスミド複製は細胞サイクルか ら切り離され、再度正常なコピー数［発明の概要］ 本発明の第一の局面において、発明者らは酵母２μプラスミドに由来するＲＥＰ ｌおよび（または）ＲＥＰ２遺伝子のいずれかまたは両方を含有し、ＲＥＰＩお よび（または）ＲＥＰ２遺伝子の発現を指向する１種以上の制御配列に関して位 置づけられる酵母ベクターにおいて、少なくとも１種の制御配列が前記ベクター によって形質転換される宿主生物中のコピー数を実質上独立的に操作するプロモ ーターを含むことを特徴とする酵母ベクターを提供する。 本発明によるベクターは、ＲＥＰｌおよび（または）旦ＥＰ２遺伝子の酵母野生 型２μプラスミド中における自然位において前記遺伝子に加えられる制御とは無 関係に、宿主生物中にあける前記遺伝子の生成物の生産を許容する。 この遺伝子生成物の生産はベクター中の制御配列によって制御されるものであり 、コピー数とは無関係でおる。 こうして酵母発現系におけるコピー数が増大し、所望のポリペプチドが高収率で 得られる。　本発明による酵母ベクターは、たとえば所望のポリペプチドを発現 し得る２μ由来の酵母発現ベクターを用いて酵母宿主生物に共形質転換を施すの に使用できる。　本発明による酵母ベクターは、共形質転換発現ベクターのコピ ー数を増大させることができ、ひいては収率を上昇ざぜることができる。 発現系の商品としての使用は、毒性発現生産物が宿主生物に及ぼす到死または衰 弱作用によって制限される。　発明者らによる公開されたヨーロッパ特許出願明 細書ＥＰ−Ａ２−００７３６３５に記載の発現ベクターにおいては、ＰＧＫ制御 配列が宿主生物の培地中の発醇性炭素のレベルによる調節を可能とするプロモー ターを含む。　この系を利用すると、グルコース培地とアセテート培地との生産 物レベルの差異が３０倍に及ぶように、遺伝子発現を調節することができる。　 また他の外因に反応するプロモーターを用いることによって発現レベルを制御す る、他の酵母発現ベクターも報告されている（たとえば公開イギリス特許出願明 細書ＧＢ−２１０４９０２Ａを参照）。 被制御発現系においては、挿入されたベクター中における遺伝子の発現を最小限 に保ちつつ、宿主細胞を培養して高細胞濃度を得ることができる。　宿主生物が 適当な細胞密度に達した時点で、たとえば培地に物質を添加することによって発 現を誘発し、多量の生産物を形成させればよい。 宿主生物に対して到死作用をもつポリペプチドの生産によつて生細胞密度は低下 するが、生成物の収率は短期間高レベルに保たれる。　酵母を含有する既知の被 制＠発現系には、広範囲の発現レベルにわたる発現を制御する能力はない。　ヨ ーロッパ特許出願明細書Ｅ　Ｐ−Ａ　２−○０７３６３５およびＴｕｉｔｅら（ 前出）に記載の系の場合は、毒性生産物が細胞の増殖に影響を及ぼさなくなるま で、その濃度を低下させることはできない。 本発明による酵母ベクターは、好ましくはＲＥＰＩおよび（または）ＲＥＰ２ｉ 伝子のいずれかまたは両方の発現を指向し、かつ外因による制御が可能なプロモ ーターを含有する。　外因とは、ベクターに課される条件のどのような変更（た とえば温度変化）でもよいが、酵母宿主生物培地に物質を添加するといった形を とるのが好ましい。 こうした好ましい種類の酵母ベクターは、ベクターコピー数の制御を可能にする ・。　この酵母ベクターは、酵母宿主生物の共形質転換に利用できる。　この場 合、ポリペプチド発現を指向するプロモーターの制御によるだｔブではなく、本 発明の酵母ベクターを用いた発現ベクターのコピー数の制御によっても、異種ポ リペプチドの生産を制御することができる。 本発明による酵母ベクターに含まれるプロモーターは、酵母ＰＧＫ遺伝子由来の ものが好ましく、また外部物質は定配性炭素源（たとえばグルコース）が好まし い。 酵母ベクターは、ＲＥＰｌまたはＲＥＰ２遺伝子のいずれかまたは前記両遺伝子 を含み得る。 この酵母ベクターは、酵母宿主生物の′＋：色体ゲノムによる前記酵母ベクター の組込みを生じ得るＤＮＡ配列を含むことが好ましい。　たとえばこのベクター は、酵ｆｆ１ＨＩｓ３遺伝子部分およびファージスＤＮＡ部分な含み得る。 本発明の第二の局面においては、発明者らは、本発明の第一の局面によるところ の酵母ベクターによって形質転換された酵ｆｆ１宿主生物を提供する。　酵母ベ クターは宿主生物の染色体とは独立的に存在してもよく、または酵母染色含む１ 種類の本発明による酵母ベクター、あるいは一方がＲＥＰ１遺伝子を他方がＲＦ Ｐ２遺伝子ををそれぞれ含む２種類のベクターによって形質転換される。　酵母 宿主生物は二倍性株（たとえば本明細書に記載のＭＤＸｌまたはＭＤＸ２酵母株 ）でもよく、または半数性株（たとえば本明細書に記載のＭＤＸ３）でもよい。 　また宿主生物は、２μ酵母プラスミド由来の複製原型を有し異種ポリペプチド に対する遺伝子コードを含む酵母発現ベクターによって形質転換されてもよい。 　このような発現ベクターのコピー数は、本発明による酵母ベクターによって増 大および（または）制御できる。　本明細書中における「異種」という表現は、 天然には酵母中に存在しないポリペプチドを意味する。　また本明細書中におけ る「ポリペプチド」という３旧ヨ、いかなるポリペプチドにもめてはまり、また 蛋白質も含むものとする。　適当なポリペプチドの例としては、ホルモン（たと えば成長ホルモン）や酵素（たとえばキモシン〉が挙げられる。 異種ポリペプチドに対する遭伝子コードは、このポリペプチドの発現を指向し得 る制御シグナルに関連した酵母発現ベクター中に位置する。　この制御シグナル は、本発明による酵母ベクターに含まれるプロモーターと同一の、または異なる プロモーターを含むことができる。　酵母としては、３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが好ましい。 本発明の第三の局面においては、発明者らは、本発明によるベクターおよびポリ ペプチドに対する遺伝子コードを含み、かつ酵母２μプラスミド由来の複製原型 を有するところの酵母発現ベクターによって共形質転換された酵母宿主生物を培 養する諸段階からなる、前記ポリペプチドの生産方法を提供する。 酵母宿主生物の培養は、必らかしめ定められた細胞密度に遅するまでの期間は第 一のレベルでポリペプチドの生産を行ない、上記細胞密度に退した後は、第二の より高レベルにおいてポリペプチドの生産を行ない得るような条件に変えるとい った方法をとることが好ましい。　生産レベルは発現および（または）ベクター コピー数を、独立的に、または同時に制御することによってコントロールできる 。 発現ベクターのコピー数を一定期間第一レベルとしてあらかしめ定められた培養 細胞密度となし、この密度において条件を変えることにより発現ベクターのコピ ー数を第ニレベルにするといった条件下において、酵母宿主生物を培養すること が好ましい。 あらかじめ定められた細胞密度において、発現レベルおもっとも好ましい。 ［図面の簡単な説明］ 添付の図面を参照し、以下に示す本発明の実施例によって本発明を説明する。　 図面は以下のとありである。 第１図　−プラスミドｐＪＤＢ２１９の制限部位地図（１，Ｒ−一逆方向反復） 第２図　−プラスミドｐＭＡ５００の制限部位地図第３図　−プラスミドｐＭＡ ３０１の制限部位地図第４図　−プラスミドｐＭＡ４０１の制限部位地図第５図 　−プラスミドＹＲＤ７の制限部位地図第６図　−プラスミドＤＭＡ４０２の制 限部位地図第７図　−プラスミドｐＭＡ４０３　（ｐＭＡ４０４）の制限部位地 図 第８図　−プラスミドｐＭＡ　４０５の制限部位地図第９図　−プラスミドＩ） ＭＡ　５０５の構造第１０図−形質転換および組み込みに含まれる組換え現象 図中に用いる略号は、下記のとおりである。 Ｒ−ＥｃｏＲ工　Ｂ　＝ＢａｍＨＩ Ｘｂ−ＸｂａＩ　Ｂｇ＝ＢｇＮ　ＩＩ Ｐ　＝ＰｓｔＩ　Ｃ＝ＣｆＩａ工 Ｐｖ＝ＰｖｕＩＩ　Ｈ＝Ｈｉｎｄｌ （実施例の説明］ 一般的な方法は、公開されたヨーロッパ特許出願明細書ＥＰ−Ａ２−００７６３ ３５中に記載されたとありであって、その内容を参考として本明細書中に取り入 れる。 １、ＲＥＰｌおよびＲＥＰ２ｍ伝子のサブクローニングＨａｒｔ　ｌｅｙと［） 　ｏｎｅ　Ｉ　ｓｏｎは２μプラスミドのヌクレオチド配列を完全に決定した（ Ｎａｔｕｒｅ　、　１９８０年、■旦、ｏ、８６０）。　第１図および第２図に 用いた配位はＢ−型配位である。 ＰＧＫプロモーターから発現用ＲＥＰ１およびＲＥＰｌを製造するため、以下の 操作を行なった。 ＲＥＰｌおよびＲＥＰ２遺伝子を含有するプラスミド５、　ｐ、１０４）を、Ｅ Ｃ０ＲＩおよびｐｖｕｌを用いて切断し、ついでＥＣＯＲ工付着端と結合させる べく　Ｅ　ＣＯＲＩおよびＢａｍＨ工で切断したｐＢＲ３２２と、低リガーゼ濃 度において連結ざぜた。　ＢａｍＨＩリンカ−（ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）を加え 、高リガーゼ濃度において連結させることにより、ＢａｍＨＩリンカ−をｐｖｕ ｌプラントエンドに付けた。 ついでこの混合物をＢａｍＨ工で処理し、ＢａｍＨＩ端に結合させるべく再度連 結した。　得られた生成物を用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＡＫＥＣ２８株に形質転換を 施してアンピシリン耐性にし、得られたコロニーをスクリーニングして第２図に 示す構造をもつプラスミドを見出した。 このプラスミドをｐＭＡ５００と名づけだ。　プラスミドｐＭＡ５００をＸｂａ 工を用いて切断し、ヌクレアーゼ３ａ１３１で処理することにより、１５０−３ ６０ｂｐを除去した。　この欠失プールを、過剰量のＢａｍＨニリンカー　（Ｃ ＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）の存在下において連結した。 個々の欠失誘導体を配列分析法で処理することにより、ＬＥ一旦」−およびＲＦ Ｐ２の１００ｂｐの終結コドン内に析しいＢａｌｌｌＨＩ部位を有する誘導体を 見出した。　１００ｂｐのＲＥＰ１終結コドン内に８８１［ｌＨ工部位をもつ誘 導体をｐＭＡ　５０１と名づけ、１００ｂｐのＲＥＰ２終結コドン内に新しいＢ ａｍＨＩ部位をもつ同様の誘導体をｐＭＡ５０２と名づけだ。 ２、ＲＥＰ１遺伝子を含む酵母ベクターの構成ｐＭＡ　５０１から得たＲＦＰＩ コード配列を含有するＢａｍＨＩフラグメントを、正しい方向にプラスミドｌ） ＭＡ３０１３のＢｇｕ　Ｉ［発現部位に挿入した（公開された得られたプラスミ ド（ｐＭＡ３０１３−ＲＥＰｌと呼ぶ〉を、つぎに内因性２μプラスミドを使用 しくまたは使用せずに）酵母ＭＤ４０−４Ｃの形質転換に用いた。 形質転換の頻度、被形質転換体の安定性、およびプラスミドのコピー数を発現ベ クターだけを用いて得たデータと比較した（第１表）。　両方のプラスミドは２ μ“宿主をほぼ同じ頻度で形質転換し、両波形質転換体は共に安定でめった。　 ただしｐＭＡ３０１３−ＲＥＰｌのコピー数は、ｐＭＡ３０１３よりも若干小さ かった。　予想どおり、ＤＭＡ３０１３は２μ°　（内因性２μプラスミドを欠 く）をきわめて低須度で形質転換した。　ざらに分析を行なった結果、Ｉ）ＭＡ ３０１３由来の被形質転換体はすべて染色体ＬＥＵ２部分にわたる組み換え交換 によるものと判明した。　すなわち、これらの被形質転換体中にはプラスミドは 存在しないわｔブである。　これは、２μ−由来プラスミド複製に必要とされる ＲＥＰＩならびにＲＥＰ２機能がこの株に欠けているためである。 これに対して、プラスミドｐＭＡ３０１３−ＲＥＰｌは高頻度で形質転換を行な い、そのプラスミド保有細胞１個あたりのコピー数はきわめて大きい。　（実際 このプラスミドは、２μをベースとするあらゆるプラスミドについて報告されて いるうちで、最大のコピー数を示す）。 これはＲＥＰｌはコピー数制御とは無関係に発現され、かつその過剰土産はコピ ー数を非常に大きくすることを示している。　この遺伝子は、酵母培養培地中の 発酵性炭素レベルを調節することによって制御が可能である、と他の文献（公開 されたヨーロッパ特許出願明細書ＥＰ第　１　表 宿　主　プラスミド　形質転換頻度　１−ｅｕ培地中　平　均　コピー数μｇＤ ＮＡ　での増殖後　ロビー　ＰＬＤ保のＬｅｕ細胞　数　有細胞０ ％９ ２μ　０ＭＡ３０１３　６ｘ１０　１００　１００　１００２μ　ｐＨＡ３０１ ３−ＲＥＰｌ　１ｘ１０　１００　３０　３０２μ’ｐＭＡ３０１３　７　１０ ０　０　０２μ“　ｐＨＡ３０１３−ＲＥＰｌ　２ｘ１０　２４　１４０　６０ ０ａ、　Ｈｉｎｎｅｎらの方法（ＰＮＡＳ、ＵＳＡ　７５　ｐ、１９２９．１９ ７８年） ｂ１選択的（−ＬＥＵ）培地で細胞を一夜増殖させ、ついで希釈してロイシン含 有培地およびロイシン欠如培地に移植した。　２種類の培地上のコロニーを計数 した。 Ｃ１被形質転換体から得た全ＤＮＡをＥＣ０ＲＩを用いて切断し、アガロースゲ ル電気泳動で分離した。　プラスミドバンドの強度とりボゾーム反復バンドとを 、デンシトメーター分析で比較した。 ｄ、プラスミド保有細胞１個めたりのコピー数＝平均コピー数／プラスミド含有 集団中の細胞フラクション。 ３、ＲＥＰ２遺伝子を含む酵母ベクターの構成ｐＭＡ　５０２由来のＲＦＰ２保 有ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ゛　フラグメントを、ＥＣＯＲ工を用いて部分的に切 断したｐＭＡｌ　（Ｍｅｌｌｏｒら、前出）　中に：す７’７０−ニン’；ｆ　 Ｌ／、３ａｍＨ工で切断することによりＤＭＡ５０３を得た。 続いてこのベクターをＸｂａ工で切断し、エキソヌクレアーゼ８ａＪ３１で処理 して１１００ｂｐを除去した。　ついでこの欠失プールをＢａｍＨＩリンカ−の 存在下において連結した。　欠失Ｄ　Ｍ　Ａ　５０３　Ｋ導体をスクリーニング してＲＦＰ２の開始ＡＴＧの２０ｂｐ中に新しイＢａ１ｌｌＨ工部位をもつ誘導 体を見出し、これをｐＭＡ　５０４と名づけだ。　プラスミドＤＭＡ　５０４は 、ＲＥＰ２遺伝子を保有するＢａｍＨエフラグメントを含有する。　このＢａｎ ａｌ　ｌフラグメントをプラスミドｐＭＡ３０１３中に挿入すると（公開された ヨーロッパ特許出願明細ＩＥＰ−Ａ２−００７３６３５＞　、上記２においてＲ ＥＰ１遺伝子を含有するＢａｍＨＩフラグメントについて説明したのと同様に、 ＲＦＰ２のＰＧＫプロモーター指向発現がもたらされる。 ４、組み込み発現ベクターの構成 ＲＥＰｌおよびＲＥＰ２を、たとえば０ＭＡ３０１３のような分子中に挿入する と、ＲＥＰ機能のＰＧＫ制御がもたらされる。　しかし細胞内にこれらのプラス ミドと異種遺伝子を発現するプラスミドとが共存する場合は、複製芸者の競合が 原因となって、前者のプラスミドのコピー数が減少する可能性がある。　同様に 、異なるプラスミド間の組み換えは予想できない好ましくない誘導体をもたらす おそれがある。　これらの問題を解決するため、ＲＥＰｌおよびＲＥＰ２は酵母 染色体ゲノム中の特定部位に組み込まれたＰＧＫ制御シグナルから発現するのが よい。　このためには、一般的に有用な組み込み発現ベクターを構成する。 ＤＭＡ３０１由来のＢＱρ■発現部位から−８２０に及ぶＰＧＫの５′部分（第 ３図）を含有するＣｆ１ａニーｐＳｔエフラグメントを用いて、ｐＢＲ３２２の 大きなＰＳｔニーＣΩａエフラグメントを置き換えることにより、プラスミドｌ ）ＭＡ４０１を得た（第４図）。　つぎにこのプラスミドｐＭＡ　４０１をＥＣ ０ＲＩおよびｐＳｔ工で切断し、ＹＲｐ　７のＥＣ０ＲＩ−ＰＳｔＩダイジェス トと連結した（第５図）。　Ａ　Ｋ　Ｅ　Ｃ２’８に形質転換を施してトリプト ファン独立性にした後、第６図に示される構造のプラスミドをみつけるためにコ ロニーをスクリーニングした。°このプラスミドをｌ）ＭＡ４０２と名づけだ。 ついで０ＭＡ４０２の大きなりｇりＩＩ−Ｐｓｔエフラグメントを０ＭＡ３０１ ３（公開されたヨーロッパ１寺許出願明細書ＥＰ−Ａ２−○０７３６３５）の大 きなりＣＩρ■−ｐＳｔエフラグメントと置き換えることにより、ｌ）ＭＡ４０ ３を製造した（第７図）。　続いてプラスミドρ〜１Ａ４０３を非反復ＰＳｔ工 部位において切断し、Ｓ１ヌクレアーゼを用いてプラントエンド化した後に、Ｂ ａｍ１−Ｉニリンカー（ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）の存在下で連結した。 ＡＫＥＣ２８の形質転換後、コロニーをスクリーニングしてＢａｍＨ工部位に置 き換えられたＰＳｔ工部位をもつｐＭＡ４０３誘導体を得た。　この誘導体がＤ ＭＡ４０４である（第７図）。　プラスミドＣ）ＭＡ　４０５は、酵母ＨＩ３３ 部分およびファージの２４２ｂｐを有し、一方の端にλ［）ＮＡをもつ５Ｃ２７ １６とよばれる１、８ｋｂＢａｍＨエフラグメントを含有するρＢＲ３２２誘導 体である（第８図）。　この分子をＢｇｌＨで部分的に切断し、９ＭＡ４０４と よばれるＢａ１ｌｌＨ工と連結する。　ＡＫＥＣ２８に形質転換を施した後にコ ロニーをスクリーニングして、第９図に示す構造をもつプラスミドを得た。 このプラスミドがＤＭＡ５０５である。 プラスミドｌ）ＭＡ　５０５は、多くの場合に適用し得る配母組み込み発現ベク ターである。　いかなるコード配列もＢｑＮ　ＩＩ発現部位に導入して、ＰＧＫ 発現シグナルの制御下に置くことができる。　ついで、λ配列、部分されたＨＩ ３３部分、）−１ｉｎｄｌ［１部位からＢａｍＨ工部位にわたる１）ＢＲ３２２ 配列、ＰＧＫ３’　部分、挿入されたコード配列、ＰＧＫ５’　部分ならびにＴ ＲＰ１遺伝子を含む３ａｍＨＩフラグメント全体をｐＭＡ５０５Ｘ導体から切断 し、アガロースゲルから精製して、酵母Ｍ　Ｄ　４０−４ｃ株（公開されたヨー ロッパ特許出願明細書ＥＰ−Ａ２−００７３６３５＞をトリプトファン独立性に する形質転換に使用する。　ＨＩＳ３相同端はＨＩ３３座への組み込み３指向し 、またλ相同端は組み換え現象が重複ではなく置き換えをもたらすことを確実に する。　したがって、組み込まれたフラグメントは比較的安定である（　Ｒ０ｅ ｄｅｌ”およびＦｉｎｋ、１９８２年、ＰＮＡＳ旦２フラグメントを含むＢａｍ Ｈエフラグメントをｌ）ＭＡ５０５のＢｃ＋Ｎ　ＩＩ発現部位に挿入して、ｐＭ Ａ　５０６（ＲＥＰｌ）およびｐＭＡ５０７　（ＲＥＰ２＞をそれぞれ得た。　 ついでこの結果得られたｐＭＡ５０６およびｐＭＡ５０７由来のＢａｍＨエフラ グメントを用いて、ＲＥＰ１フラグメントの場合は酵母ＭＤ−４Ｄ−４ＣＣ１ｒ ’株（雫、　ｕｒａ　２．　ｔｒｐ　１　、　Ｌｅｕ２４＋　Ｌｅｕ２−１１２ 、　ｈｉｓ　３−１１．　ｈｉｓ　３−１５＞を、またＲＥＰ２フラグメントの 場合はＭＤｘ、　Ｃｉｒ’株（ａ、　１−Ｃｕ３−３．　Ｌｅｕ２−１１２．　 ｔｒｐ　１　、　ｈｉｓ　４−５１９＞をトリプトファン独立性に、それぞれ形 質転換した。 Ｃｉｒ’誘導体は、ｌ）　ｏｂｓｏｎらの方法にしたがって構成した（１９８０ 年、　Ｃｕｒｒ　、　Ｇｅｎｅｔ、　２　ＩＱ、　２０１　＞。 形質転換ならびに組み込みに含まれる組み換え現象を、第１０図に示す。　この 結果、ＨＩ３３座に組み込まれてＰＧＫの制御下において発現されるＲＥＰｌお よび旦ＥＰ２をそれぞれ有するところの、半数性株ＭＤＸ１ａよびＭＤｘ２を得 た。　これらの二株を交差したところ、二倍性ＭＤＸ３　（すなわちＨＪＳ３座 の対立遺伝子として双方のＲＥＰ遺伝子発現配置を含む）を得た。　Ｉ）ＭＡ３ ０１３といったプラスミドを、この二倍体の形質転換に用いることができる。　 その結果得られた被形質転換体は、組み込まれたＲＥＰｌおよびＲＥＰ２のコピ ーのＰＧＫプロモーター制御を通して制御を受ける発現ベクターコピー数を有す る。 ｃ ＨＩ５３ ＦＩＧ、　１０ 手続ネ甫正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ　８４１００３１６ ２、発明の名称 ベクター ３、補正をする者 裏作との関係　特許出願人 住　所　イギリス国　オックスフォードシャーＯＸ５　２３Ｆ　イスリップ　ミ ドル・ストリート　グレイ・ストレス（番地なし）氏　名　キンゲスマン、アラ ン　ジョン国　籍　イギリス国　（ほか１名） ４、代理人〒１０４ 住　所　東京都中央区築地二丁目１５番１４号６、補正の対象 （１）　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面 （２）　明細書第１頁の翻訳文 （３）　代理権を証明する書面 ７、補正の内容 （１、発明の名称および特許出願人の氏名を正確に記載した（願書翻訳文と一致 させた〉所定の書面を提出する。 （２）　タイプ印書により浄書した明細書第１頁の翻訳文（発明の名称を願書翻 訳文と一致させたもの）を提出する。 （３）　完備した（委任者住所および発明の名称を願書原文と一致させたもの） 委任状およびその訳文を提出する。 国際調量報告 １＃＋７＾　”’　？Ｃ−、７ＧＢ　８４１００３ｉ５

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．ＲＥＰ１および（または）ＲＥＰ２遺伝子の発現を指向する１種以上の制御 配列に関連して位置する酵母２μプラスミド由来のＲＥＰ１および（または）Ｒ ＥＰ２遺伝子のいずれかまたは両方を含む酵母ベクターにおいて、少なくとも１ 種の制御配列が前記ベクターによって形質転換される宿主生物のベクターコピー 数とは実質上無関係に機能するプロモーターを含むことを特徴とする酵母ベクタ ー。
2. ２．請求の範囲第１項記載の酵母ベクターにおいて、ＲＥＰ１および（または） ＲＥＰ２遺伝子のいずれかの発現を指向するプロモーターを外的条件によって制 御しうる酵母ベクター。
3. ３．請求の範囲第２項記載の酵母ベクターにおいて、プロモーターが酵母ホスホ グリセリン酸キナーゼ遺伝子に由来するものであり、かつ外的条件が発酵性炭素 源ある酵母ベクター。
4. ４．請求の範囲第１項記載の酵母ベクターにおいて、ベクターが酵母宿主生物の 染色体ゲノムによる酵母ベクターの組み込みを生じ得るＤＮＡ配列を含む酵母ベ クター。
5. ５．請求の範囲第１項記載の酵母ベクターによって形質転換された宿主生物。
6. ６．異種ポリペプチドに対する遺伝子コードを含み、かつ酵母２μプラスミド由 来の複製原型をもつ酵母発現ベクターによって形質転換された、請求の範囲第５ 項記載の宿主生物。
7. ７．ポリペプチドの生産方法において、請求の範囲第１項記載のベクターおよび 異種ポリペプチドに対する遺伝子コードを含み、かつ酵母２μプラスミド由来の 複製原型をもつ酵母発現ベクターによって共形質転換された酵母宿主生物を培養 する各段階からなる方法。
8. ８．請求の範囲第７項記載の方法において、酵母宿主生物の培養を、あらかじめ 定められた培養細胞密度に達するまでの期間は第一のレベルでポリペプチドの生 産を行ない、上記細胞密度に達した後は第二のより高レベルにおいてポリペプチ ドの生産を行ない得るような条件に変える条件下に実施する方法。
9. ９．請求の範囲第８項記載の方法において、酵母宿主生物の培養を、あらかじめ 定められた培養細胞密度に達するまでの期間は酵母発現ベクターのコピー数を第 一のレベルとし、上記培養細胞密度に達した後は酵母発現ベクターのコピー数が 第二のより高レベルまで上昇しうる条件に変える条件下に実施する方法。