PT2516629T - Vacinas de vírus herpes simplex - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "VACINAS DE VÍRUS HERPES SIMPLEX"
Campo da Invenção A presente invenção refere-se principalmente a vacinas que podem ser utilizadas para imunizar pacientes contra infeções por Virus Herpes Simplex tipo 2 (VHS-2) associadas a úlceras genitais crónicas. A vacina utiliza um virus VHS-2 de replicação deficiente que foi modificado para expressar elevados niveis de antigénio glicoproteina D de VHS-2 (gD2). Em concretizações preferidas, o virus VHS-2 expressa também um ou mais genes imunomoduladores, tais como IL15 e/ou antigénios principais de VHS-1 ou VHS-2 tais como gB ou gC.
Antecedentes da Invenção
Virus Herpes Simplex (VHS) e Infeções por VHS
Os virus Herpes simplex 2 (VHS-2) são a principal causa de doença de úlceras genitais. Podem causar tanto uma infeção produtiva aguda como uma infeção latente a longo prazo caracterizada por recidivas periódicas imprevisíveis (66) . Além de causar úlceras genitais recorrentes ao longo da vida, as infeções por VHS são uma grande preocupação em pacientes com SIDA. Foi documentado que a infeção genital por VHS-2 triplica o risco de adquirir sexualmente a infeção por VIH (20), e, em África, este aumento do risco pode contribuir para 25-35% das infeções por VIH incidentes (D .
Embora a gravidade e duração das infeções primárias por VHS mais sintomáticas possa ser reduzida através de tratamento oral ou intravenoso com aciclovir, valaciclovir, ou famciclovir, a terapia antiviral não impede o estabelecimento de infeção latente a partir da infeção primária nem reduz subsequentes recidivas (66). A propagação continuada de herpes genital nos Estados Unidos nas últimas duas décadas (19) e o aumento da incidência de VHS resistente aos medicamentos antivirais atuais sugerem que existe a necessidade de vacinas seguras e eficazes contra infeções por VHS (31, 60). Além disso, a descoberta de que terapia supressora de VHS leva a uma redução significativa nos niveis de VIH na mucosa genital e plasma de mulheres infetadas tanto com VHS-2 e como VIH (52) sugere que uma vacina eficaz contra VHS pode também ter implicações importantes no controlo da infeção por VIH (1, 31) .
Glicoproteina D de VHS-2 (gD2) A glicoproteina D de VHS (gD) é um dos antigénios virais mais predominantes expressos à superfície de células infetadas (21) bem como no envelope virai (24). gD é essencial para a entrada do vírus nas células e é um alvo importante para anticorpos neutralizadores contra a infeção por VHS (12, 49, 53) . Além disso, gD é o alvo virai predominante para células T CD4+ incluindo citotoxicidade de células T CD4+ e células T CD8+ em modelos humanos e de murídeo da infeção por VHS (27, 28, 30, 34, 47, 65, 75) . Por estas razões, gD tem sido um foco principal para o desenvolvimento de vacinas de subunidades de VHS (32, 60).
Num ensaio clínico de fase 3, Stanberry, et al. mostraram que a vacinação com gD de VHS-2 (gD2) recom-binante, em combinação com adjuvante AS04, proporcionou 73-74% de eficácia na proteção contra o desenvolvimento da doença herpes genital em mulheres seronegativas para VHS (62). No entanto, não foi observada eficácia significativa em homens e em sujeitos que eram seropositivos para VHS-1. Embora respostas humoral e de células T CD4+ específicas de gD2 tivessem sido detetadas nos hospedeiros imunizados, não é claro se gD2/AS04 era eficaz a desencadear uma resposta de células T CD8+ (31, 32). Este estudo sugere que existe a necessidade de uma vacina de VHS que desencadeie uma resposta humoral mars ampla, bem como de células T CD4 e CD8, tanto a gD2 como a outros antigénios virais de VHS (29, 31, 32) .
Vacinas Virais
Está bem documentado que vacinas virais vivas capazes de síntese de novo de imunogénios no hospedeiro induzem uma resposta imunitária mais ampla e mais durável que vacinas consistindo em apenas péptidos ou proteínas. Várias formas de VHS de replicação deficiente e mutantes neuroatenuados, de replicação competente foram desenvolvidos e testados como potenciais em vacinas contra infeção por VHS (US 7223411; (18)).
Como tanto os virus de replicação deficiente como os mutantes neuroatenuados se podem co-replicar com o virus de tipo selvagem ou tornar-se de replicação competente no contexto de virus de tipo selvagem, a sua utilização como vacina em humanos coloca um problema de segurança, particularmente em indivíduos que possuem infeção latente por VHS (33) . A observação de que mutantes de VHS-1 de replicação deficiente podem reativar o promotor imediato-precoce de VHS-1 latente no cérebro de roedores tem levantado preocupações de segurança adicionais sobre a possibilidade de tais recombinantes desencadearem surtos de infeções virais produtivas em indivíduos com infeção latente (63) . Assim, uma vacina de VHS recombinante de replicação deficiente desejável deve possuir não só a capacidade de expressar um amplo espectro de antigénios codificados pelo vírus como deve também codificar uma função única que possa prevenir a infeção lítica de VHS de tipo selvagem quando se encontrarem nas mesmas células. Um tal mecanismo de segurança minimizaria o potencial surto do vírus da vacina causado pela recombinação do vetor da vacina com o vírus de tipo selvagem no hospedeiro.
Lu Zheming et ai. (Journal of Investigative Dermatology 129(5): págs. 1174-84 [2009]) divulga um vírus VHS-1 recombinante dominante-negativo de replicação deficiente compreendendo UL9-C535C e gD de VHS-1 sob controlo do promotor tet-O-LCMVIE.
Sumário da Invenção
Em geral, a presente invenção baseia-se na utilização de tecnologia de interruptor de genes com tetraciclina (T-REx, Invitrogen), (73) e uma forma mutante dominante-negativa do polipéptido UL9 de VHS-1, e.g., UL9-C535C, para desenvolver uma vacina virai recombinante segura e eficaz contra infeção por VHS-2.
No seu primeiro aspeto, a invenção é dirigida a um vírus recombinante de Herpes simplex 2 (VHS-2) de replicação deficiente, dominante-negativo. O genoma do vírus tem, pelo menos, uma primeira sequência de codificação de uma primeira glicoproteína D de VHS-2 (gD2) operativamente ligada a um primeiro promotor e, de preferência, uma segunda sequência de codificação de uma segunda gD2 de VHS-2 que está operativamente ligada a um segundo promotor. O ou os promotores estão operativamente ligados a uma primeira sequência operativa de tetraciclina (tet-O) e a uma segunda sequência tet-0, respetivamente, cada uma das quais permite que a transcrição prossiga quando livre do repressor tet, mas que bloqueia a transcrição quando o repressor se liga. O genoma inclui também uma terceira sequência que codifica, pelo menos, uma primeira forma mutante dominante-negativa da proteína UL9 de VHS-1 ou VHS-2 ligada a um terceiro promotor e, de preferência, uma quarta sequência que codifica uma segunda forma dominante-negativa da proteína UL9 de VHS-1 ou VHS-2 ligada a um quarto promotor. Tal como o primeiro e o segundo promotores, o terceiro e o quarto promotores estão, cada um, operativamente ligados a uma sequência tet-0 que, se tiver o repressor tet ligado, bloqueia a transcrição. Adicionalmente, o genoma do vírus caracteriza-se pela ausência de uma sequência de codificação de uma proteína ICPO funcional.
Para aumentar a sua antigenicidade, o genoma deve também expressar de preferência genes imunomoduladores, tais como IL12 ou IL15 e/ou antigénios principais de VHS-1 ou VHS-2, tais como gB ou gC. 0 termo "operativamente ligado" refere-se a elementos genéticos que são unidos de modo a que lhes seja permitido realizar as suas funções normais. Por exemplo, um gene está operativamente ligado a um promotor quando a sua transcrição está sob o controlo do promotor e esta transcrição resulta na produção do produto normalmente codificado pelo gene. Uma sequência operadora tet está operativamente ligada a um promotor quando o operador bloqueia a transcrição a partir do promotor na presença de repressor tet ligado mas permite a transcrição na ausência do repressor. 0 termo "recombinante" refere-se a um vírus que tem sequências de ácido nucleico que foram, em algum momento, formadas através da recombinação de sequências de ácido nucleico e elementos de sequência e a introdução destas sequências recombinadas no virus ou num virus ancestral.
De preferência, os promotores utilizados são aqueles que têm um elemento TATA e as sequências operadoras tet ligadas aos promotores, têm dois locais de ligação ao repressor op2 unidos através de entre dois e vinte nucleótidos de ligação. 0 posicionamento da sequência operadora é importante para se conseguir um controlo eficaz sobre o promotor. Especificamente, o primeiro nucleótido na sequência operadora deve estar localizado entre seis e vinte e quatro nucleótidos a 3' do último nucleótido no elemento TATA. Sequências estruturais codificando, por exemplo gD ou um polipéptido mutante dominante-negativo de UL9, estariam a 3' do operador. Entre promotores especi-ficamente preferidos estão o promotor imediato precoce de hCMV e os promotores imediatos precoces de VHS-1 ou VHS-2. Especialmente preferido é o promotor de ICP4 de VHS-1 ou VHS-2.
Noutro aspeto, a invenção dirige-se a uma vacina que pode ser utilizada profilacticamente ou terapeuticamente contra expressão de VHS e que compreende um ou mais dos virus recombinantes descritos acima na forma de dose unitária. 0 termo "forma de dose unitária" refere-se a uma entidade única de administração de fármacos tal como um comprimido ou uma cápsula. De preferência, a "forma de dose unitária" será uma solução na qual um fármaco é dissolvido a uma concentração que proporcione um efeito terapêutico ou profilático quando um volume selecionado (dose unitária) é administrado a um paciente através de injeção e encontrar-se-á dentro de um frasco para injeção. Com base na dose eficaz utilizada em ratinhos (2 χ 106 pfu), acredita-se que a dose eficaz minima em humanos deva ser de cerca de 1 χ 107 pfu. Assim, uma dose unitária deve ter pelo menos esta quantidade de virus, sendo tipico 1 χ 107 - 1 χ 109 pfu. As vacinas podem ser armazenadas numa forma liofilizada e reconstituídas num transportador farmaceuticamente aceitável antes da administração. Alternativamente, as preparações podem ser armazenadas no próprio veiculo. 0 volume de uma dose única da vacina variará, mas, em geral, deve estar entre cerca de 0,1 ml e 10 ml e, mais tipicamente, entre cerca de 0,2 ml e 5 ml.
A invenção inclui também métodos de imunização de pacientes contra infeção por VHS-1 ou VHS-2 e as condições resultantes de tal infeção (e.g., úlceras de Herpes genital) através de administração ao paciente das vacinas descritas acima. As vacinas podem também ser dadas a pacientes que tenham sido infetados para prevenir ou reduzir focos de virus. Qualquer método para administração de uma vacina a um paciente que não resulte na destruição de virus é compatível com a presente invenção. Geralmente, a administração será através de meios parentéricos tais como através de injeção intramuscular ou intravenosa. A dosagem e esquema de administração de vacinas podem ser determinados utilizando métodos que são de rotina na técnica. As preparações podem ser administradas em injeções únicas ou múltiplas.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura IA e IB: A Figura IA mostra um diagrama esquemático dos plasmideos utilizados para a construção dos recombinantes N2-C535C e CJ2-gD2 de VHS-2 dominante-negativos e de replicação deficiente. 0 plasmideo pVHS-2/ICPO é um plasmideo contendo as sequências de ICPO de VHS-2 cobrindo 268 pb a montante do enquadramento de leitura aberto de ICPO de VHS-2 (caixa cinzenta) até 40 pb a jusante do sinal poli A das sequências de codificação de ICPO. pVHS2.ICP0-V foi construído através da substituição do fragmento de ADN Xhol-ICPO contendo sequências com uma sequência de clonagem múltipla contendo Xhol (MCS). pVHS2.ICPO-lacZ foi criado através da inserção do gene LacZ (caixa listrada) na região MCS de pVHS2.ICPO-V. p021acZ-TOC535C foi construído através da substituição do fragmento contendo lacZ indicado de pVHS2.ICPO-lacZ com sequências de ADN codificando UL9-C535C (caixa negra) sob controlo do promotor principal imediato-precoce de hCMV contendo tetO (caixa de riscas, CMVTO). p021acZTO-gD2.C535C foi construído através da substituição do fragmento SnaB I/Pst I indicado de p02lacZTO-C535C com sequências de ADN codificando o gene de gD2 (caixa de gradiente) sob o controlo do promotor imediato-precoce ICP4 de VHS-1 contendo tetO (caixa aberta, ICP4TO). A Figura IB mostra um diagrama esquemático dos genomas de VHS-2 de tipo selvagem, um mutante nulo de ICPO de VHS-2 (N2-lacZ), N2-C535C e CJ2-gD2. UL e US representam as regiões única longa e única curta do genoma de VHS-2, respetivamente, que são flanqueadas pelas suas regiões de repetição invertida correspondentes (caixas abertas). A substituição de ambas as cópias das sequências de codificação de ICPO pelo gene de lacZ em N2-lacZ e por sequências de ADN (1) codificando UL9-C535C sob controlo do promotor principal imediato-precoce de hCMV possuindo tetO em N2-C535C, e (2) codificando tanto UL9-C535C como gD2 sob os promotores possuindo tetO indicados num sentido oposto é mostrada abaixo das sequências de codificação de ICPO expandidas do genoma de VHS-2.
Figuras 2A e 2B: Estas Figuras mostram expressão de elevado nivel de gD2 e UL9-C535C após infeção por CJ2-gD2 de células Vero. Na Figura 2A, células Vero em duplicado foram falsamente infetadas ou infetadas com VHS-2 de tipo selvagem, N2-lacZ, N2-C535C, ou CJ2-gD2 a uma MOI de 10 PFU/célula. Extratos de células infetadas foram preparados 9 h após a infeção. Na Figura 2B, células Vero foram infetadas com VHS-1 de tipo selvagem estirpe KOS, CJ9-gD, VHS-2 de tipo selvagem, ou CJ2-gD2 a uma MOI de 10 PFU/célula. Extratos de células infetadas foram preparados 9 h após a infeção. As proteínas em extratos de células infetadas foram separadas em SDS-PAGE, seguido por imunomarcação com anticorpos policlonais contra gD de VHS-1 (R45), UL9, ou anticorpos monoclonais específicos para ICP27 e gB (Santa Cruz).
Figura 3: A Figura 3 mostra a regulação da expressão de gD2 e UL9-C535C através de tetR em células VCEP4R-28 infetadas com CJ2-gD2. Células VCEP4R-28 foram semeadas a 5 χ 105 células por caixa de 60 mm. 40 h após a sementeira, células em duplicado foram falsamente infetadas ou infetadas com VHS-2 de tipo selvagem ou CJ2-gD2 a uma MOI de 10 PFU/célula quer na presença quer na ausência de tetraciclina. Extratos de células infetadas foram preparados 9 h após a infeção seguido por imunomarcação com anticorpos policlonais contra gD de VHS e UL9, e um anticorpo monoclonal específico para ICP27.
Figuras 4A e 4B: Estas figuras mostram o efeito trans-dominante-negativo de CJ2-gD2 na replicação de VHS-2 de tipo selvagem. Na Figura 4A, células Vero em triplicado foram infetadas com VHS-2 de tipo selvagem estirpe 186 a uma MOI de 2 PFU/célula, 186 a uma MOI de 2 PFU/célula e CJ2-gD2 a uma MOI de 5 PFU/célula, ou 186 a uma MOI de 2 PFU/célula e N2-lacZ a uma MOI de 5 PFU/célula. Na Figura 4B, células Vero foram infetadas individualmente com VHS-2 de tipo selvagem a uma MOI de 5 PFU/célula, coinfetadas com 186 e CJ2-gD2 a uma MOI de 5 PFU/célula para ambos os vírus, ou individualmente infetadas com 186 a uma MOI de 15 PFU/célula, e coinfetadas com 186 a uma MOI de 15 PFU/célula e CJ2-gD2 a uma MOI de 5 PFU/célula. As células infetadas foram colhidas 18 h após a infeção e os títulos virais foram determinados em monocamadas de células Vero. Os titulos virais são expressos como a média +/- DP. Os números no topo do gráfico indicam as vezes de redução no rendimento do virus de tipo selvagem entre a infeção única e a coinfecção.
Figuras 5A e 5B: Estas figuras mostram a neurovirulência de VHS-2 de tipo selvagem, estirpe 186, N2-lacZ, N2-C535C, e CJ2-gD2 em ratinhos BALB/c após inoculação intracerebral. Fêmeas de ratinhos BALB/c com 4 a 6 semanas de idade foram distribuídas aleatoriamente por cinco grupos de 8 ratinhos cada. Os ratinhos foram anestesiados com pentobarbital de sódio e inoculados com DMEM, 25 PFU/ratinho de VHS-2 de tipo selvagem estirpe 186, 1 x 106 PFU/ratinho de N2-lacZ, 2,5 χ 106 PFU/ratinho de CJ2-GD2 ou N2-C535C através de injeção intracerebral no lobo frontal esquerdo do cérebro, num volume de 20 μΐ a uma profundidade de 4 mm. Os ratinhos foram examinados quanto a sinais e sintomas de doença durante 35 dias após a inoculação. A Figura 5A mostra a pontuação da doença em vários dias após a injeção e a Figura 5B mostra a percentagem de ratinhos sobreviventes.
Figuras 6A e 6B: As Figuras 6A e 6B referem-se à indução de anticorpos específicos de gD2 e respostas neutralizantes de VHS-2. Fêmeas de ratinhos BALB/c com 4 a 6 semanas de idade foram falsamente imunizadas com DMEM (n = 7, 6, 8, 8) ou imunizadas com CJ2-gD2 (n = 7, 6, 8, 8), N2-C535C (n = 7, 8, 6), ou CJ9-gD (n = 6, 8, 6) e uma dose de 2 χ 106 PFU/ratinho, e reforçadas 2 semanas mais tarde. Foi obtido sangue a partir das veias caudais dos ratinhos 4-5 semanas após a imunização primária. Na Figura 6A, foi reunido soro de um grupo individual de ratinhos e termo-inativado. Foram determinados os titulos do anticorpo neutralizante especifico de VHS-2. Os resultados representam titulos médios ± EMP. Na Figura 6B, soros de ratinhos falsamente imunizados, imunizados com CJ2-gD2, N2-C535C, ou CJ9-gD foram incubados com extrato celular preparado a partir de células U20S transfetadas com plas-mideo p02.4TO-gD2 expressando gD2. Complexos específicos de gD/IgG de ratinho foram precipitados com Proteina A, separados em SDS-PAGE, e sondados com um anticorpo policlonal especifico de gD, R45.
Figura 7A-7D: Estas Figuras referem-se à indução de respostas de células T CD4+ e CD8+ especificas de VHS-2 em ratinhos imunizados com CJ2-gD2. As fêmeas dos ratinhos BALB/c foram falsamente imunizadas ou imunizadas com CJ2-gD2 a 2 χ 106 PFU por ratinho duas vezes a intervalos de 2 semanas. Nas Figuras 7A e 7B, os ratinhos falsamente imunizados e imunizados foram falsamente infetados ou infetados com VHS-2 tipo selvagem s.c. e uma dose de 1 χ 104 PFU/ratinho a 9-10 semanas após imunização de reforço (n=3) . As respostas de células T CD4+ e CD8+ foram analisadas no dia 5 pós-confronto através de ensaios ELISPOT de IFN-γ com células T CD4+ e CD8+ individualmente purificadas isoladas a partir do baço de ratinhos utilizando estojos Dynal de ratinho negativos para CD4 e CD8. Nas Figuras 7C e 7D, ratinhos falsamente imunizados e imunizados com CJ2-gD2 foram falsamente infetados ou infetados com VHS-2 de tipo selvagem 5-6 semanas após a imunização de reforço seguido por ensaios ELISPOT de IFN-γ no dia 4 após a infeção (n=3). 0 número de células formadoras de manchas de IFN-γ (SFC) foi expresso como a média ± EMP por milhão de células T CD4+ ou CD8+.
Figura 8: A Figura 8 mostra a redução da replicação vaginal de VHS-2 de confronto em ratinhos imunizados com CJ2-GD2. Fêmeas de ratinhos BALB/c com 4 a 6 semanas de idade foram distribuídas aleatoriamente em 4 grupos de 10 ratinhos cada. Os ratinhos foram falsamente imunizados com DMEM ou imunizados com CJ2-GD2, N2-C535C, ou CJ9-gD, a uma dose de 2 χ 106 PFU/ratinho. Os ratinhos foram reforçados após 2 semanas. Às 5 semanas, os ratinhos foram pré-tratados com medroxiprogesterona e confrontados intravaginalmente com 5 χ 105 PFU de VHS-2 estirpe G. Foram tomados esfregaços vaginais nos dias 1, 2, 3, 5, e 7 pós- confronto. Os virus infeciosos no material dos esfregaços foram avaliados através de ensaio de placas fágicas padrão em monocamadas de células Vero. Os titulos virais são expressos como a média ± EMP em esfregaços vaginais individuais.
Figuras 9A e 9B: Estas figuras mostram a prevenção de doença por VHS-2 em ratinhos imunizados com CJ2-gD2. Após confronto com VHS-2 de tipo selvagem, os ratinhos individuais descritos na legenda da Fig. 8 foram observados durante um período de seguimento de 21 dias quanto à incidência de doença genital e disseminada por VHS-2 (Figura 9A) e sobrevivência (Figura 9B) utilizando a seguinte escala: 0 = nenhum sinal, 1 = eritema e edema genital ligeiro, 2 = inflamação genital moderada, 3 = lesões genitais purulentas e/ou doença sistémica, 4 = paralisia dos membros posteriores, 5 = morte.
Figura 10: A Figura 10 mostra a sequência de codificação de UL9-C535C de VHS-1 (SEQ ID NO:2). UL9-C535C consiste nos aminoácidos 1-10 de UL9, um tripéptido Thr-Met-Gly, e nos aminoácidos 535 a 851 de UL9 (ver Yao, et al. (69)).
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção baseia-se no conceito de utilização de tecnologia de interruptor de genes com tetraciclina e num polipéptido mutante dominante-negativo de UL9 de VHS-1 para desenvolver um vírus VHS recombinante de replicação deficiente e capaz de inibir infeções por VHS de tipo selvagem (dominante-negativo) . CJ9-gD é um vírus VHS-1 recombinante dominante-negativo de replicação deficiente protótipo e expressa elevados níveis do antigénio principal de VHS-1 glicoproteína D (gD) independente da replicação do ADN virai de VHS (7) . Na sua forma mais preferida, a presente invenção utiliza um recombinante de VHS-2 dominante-negativo e de replicação deficiente (CJ2-gD2) que codifica 2 cópias do gene de gD (gD2) de VHS-2, dirigido pelo promotor principal imediato-precoce de ICP4 de VHS-1 contendo tetO. CJ2-gD2 expressa gD2 tão eficazmente como VHS-2 de tipo selvagem e pode exercer um poderoso efeito trans-inibidor na replicação de VHS-2 de tipo selvagem em células coinfetadas. A imunização com CJ2-gD2 desencadeia anticorpos neutralizantes específicos de VHS-2 eficazes, bem como respostas de células T, e oferece uma proteção completa contra infeção intravaginal por VHS-2 de tipo selvagem em ratinhos. CJ2-gD2 é uma vacina mais eficaz que CJ9-gD na proteção contra infeção e doença genital por VHS-2 de tipo selvagem. Além disso, a injeção intracerebral de uma dose elevada de CJ2-gD2 não causa mortalidade nem morbidez em ratinhos. Coletivamente, estas observações sugerem que CJ2-gD2 tem vantagens em relação às vacinas tradicionais de virus de replicação deficiente e vacinas de subunidades de VHS-2 na proteção contra infeção e doença genital por VHS-2 em humanos. 0 Interruptor de Operador/Repressor Tet e ADN Recombinante
A presente invenção é dirigida a, inter alia, virus possuindo genes cuja expressão é regulada pela proteina operadora e repressora da tetraciclina. Métodos que podem ser empregues para produzir moléculas de ADN recombinante contendo estes elementos e sequências de ADN foram anteriormente descritos (ver US 6,444,871; US 6,251,640; e US 5,972,650) e os plasmídeo que contêm o interruptor da transcrição indutivel por tetraciclina estão comercialmente disponíveis (T-REx™, Invitrogen, CA).
Uma caracteristica essencial do ADN da presente invenção é a presença de genes que estão operativamente ligados a um promotor, de preferência possuindo um elemento TATA. Uma sequência operadora tet localiza-se entre 6 e 24 nucleótidos a 3' do último nucleótido no elemento TATA do promotor e a 5' do gene. O virus pode ser criado em células que expressem o repressor tet de modo a bloquear a transcrição do gene e permitir a replicação viral. A força com que o repressor tet se liga à sequência operadora é reforçada através da utilização de uma forma do operador que contém dois locais de ligação ao repressor op2 (cada um de tais locais possuindo a sequência nucleotidica: TCCCTATCAGTGATAGAGA (SEQ ID NO :1)) ligada a uma sequência de 2-20, de preferência 1-3 ou 10-13, nucleótidos. Quando o repressor está ligado a este operador, ocorrerá muito pouca ou nenhuma transcrição do gene associado. Se o ADN com estas caracteristicas estiver presente numa célula que também expresse o repressor de tetraciclina, a transcrição do gene que pode impedir infeção virai será bloqueada pela ligação do repressor ao operador e ocorrerá replicação do virus.
Seleção de Promotores e Genes
Durante a infeção produtiva, a expressão dos genes de VHS classifica-se em três categorias principais com base na ordem temporal da expressão: imediato-precoce (a), precoce (β), e tardio (γ) , sendo os genes tardios divididos ainda em dois grupos, γΐ e γ2. A expressão dos genes imediato-precoces não requer síntese de novo da proteína virai e é ativada pela proteína VP16 associada ao virião em conjunto com fatores de transcrição celulares quando o ADN virai entra no núcleo. Os produtos proteicos dos genes imediatos-precoces são designados polipéptidos de células _infetadas ICPO, ICP4, ICP22, ICP27, e ICP47 e são os promotores destes genes que são de preferência utilizados no direcionamento da expressão dos genes recombi-nantes aqui discutidos. ICPO tem um papel principal no reforço da reativação de VHS da latência e confere ao vírus uma vantagem de crescimento significativa a baixas multiplicidades de infeção. ICP4 é a principal proteína reguladora da transcrição de VHS-1, que ativa a expressão dos genes virais precoces e tardios. ICP27 é essencial para infeção virai produtiva e é necessário para uma replicação de ADN virai eficiente e a expressão ótima de genes γ virais e de um subconjunto de genes β virais. A função de ICP47 durante a infeção por VHS parece ser a de regular negativamente a expressão do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I à superfície de células infetadas. A sequência inteira da sequência genómica de VHS-1 da região de codificação da UL9-C535C de VHS-1 é mostrada na Figura 10 (SEQ ID NO:2). As outras sequências descritas para utilização em virus recombinantes são todas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a sequência genómica inteira para VHS-1 pode ser verificada como a sequência X14112de GenBank. A sequência de ICP4 de VHS-1 pode ser verificada como o número X06461 de GenBank; a glicoproteina D de VHS-1 pode ser verificada como a sequência J02217 de GenBank; a glicoproteina D de VHS-2 pode ser verificada como o número K01408 de GenBank; e o gene UL9 de VHS-1 como a sequência M19120 de GenBank (todas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade).
Inclusão do Repressor Tet e Produção de Virus
As sequências para os promotores ICPO e ICP4 de VHS e para os genes cuja regulação podem endogenamente controlar são bem conhecidas na técnica (43, 44, 56) e os procedimentos para produção de vetores virais contendo estes elementos foram anteriormente descritos (ver pedido US publicado 2005-0266564). Estes promotores são não só muito ativos na promoção da expressão do gene como também são especificamente induzidos por VP16, uma transativador libertado quando VHS-1 ou VHS-2 infeta uma célula.
Uma vez produzidas construções de ADN apropriadas, estas podem ser incorporadas em virus VHS-2 utilizando métodos que são bem conhecidos na técnica (ver geralmente Yao et al. (68)). Métodos de Imunização
Os virus aqui descritos serão utilizados para imunizar indivíduos e/ou pacientes, tipicamente através de injeção como vacina. A vacina pode ser utilizada tanto profilaticamente para prevenir infeção por VHS-1 ou VHS-2 ou terapeuticamente para reduzir a gravidade de uma infeção por VHS-1 ou VHS-2 que já tenha ocorrido. Para produzir uma vacina, os virus podem ser suspensos em qualquer solução farmaceuticamente aceitável incluindo solução salina isotónica estéril, água, solução salina tamponada com fosfato, 1,2-propilenoglicol, poliglicóis misturados com água, solução de Ringer, etc. 0 número exato de virus a administrar não é crucial para a invenção mas deve ser uma "quantidade eficaz", i.e., uma quantidade suficiente para desencadear uma resposta imunológica suficientemente forte para inibir infeção por VHS. Em geral, espera-se que o número de virus (PFU) inicialmente administrados esteja entre 1 χ 107 e 1 χ 1010. A eficácia de uma dosagem, bem como a eficácia do tratamento global pode ser avaliada usando métodos imunológicos padrão para testar a presença de anticorpos eficazes a atacar VHS. Injeções imunológicas podem ser repetidas tantas vezes quantas as desejadas.
Exemplos 0 presente exemplo descreve a criação de um vírus VHS-2 recombinante e testes para determinar os seus efeitos imunológicos. I. Materiais e Métodos Células Células de Rim de Macaco Verde Africano (Vero) e células da linha de osteossarcoma U20S foram cultivadas e mantidas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma Aldrich) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) na presença de penicilina G a 100 U/ml e sulfato de estreptomicina a 100 yg/ml (GIBCO, Carlsbad, CA) (71) . Células U20S são capazes de complementar funcionalmente a deleção de ICPO de VHS-1 (71). Células U2CEP4R11 são células U20S que expressam tetR que foram mantidas em DMEM mais FBS a 10% e higromicina B a 50 pg/ml (73) . Células VCEP4R-28 são células Vero que expressam tetR que foram mantidas em DMEM mais FBS a 10% e higromicina B a 50 yg/ml (73) .
Plasmldeos O plasmídeo pVHS2/ICP0 é um plasmídeo derivado de pUC19 que codifica as sequências de ICP0 de VHS-2 amplificadas por PCR cobrindo 268 pb a montante do enquadramento de leitura aberto (ORF) de ICPO de VHS-2 até 40 pb a jusante do sinal poli A das sequências de codificação de ICPO. pVHS2.ICP0-V é um plasmídeo de clonaqem de ICPO de VHS-2, derivado do plasmideo pVHS-2/ICP0, através da substituição do fragmento de ADN de ICPO Xhol contendo sequências 25 pb a montante do codão de iniciação de ICPO até 397 pb a montante do codão de terminação do ORF de ICPO com uma sequência de clonagem múltipla (MCS) contendo Xhol. O plasmídeo pVHS2.ICPO-lacZ foi criado através da inserção do fragmento HindIII-Notl contendo o gene de LacZ de pcADN3-lacZ em pVHS2.ICP0-V nos locais HindIII-Notl. pcmvtetO-UL9C535C é um plasmídeo codificando UL9-C535C sob controlo do promotor imediato-precoce de hCMV contendo tetO (68). p021acZ-TOC535C, expressando UL9-C535C dirigido pelo promotor principal imediato-precoce de hCMV contendo tetO (Fig. IA), foi construído substituindo o fragmento EcoRI/Agel contendo lacZ de pVHS2.ICPO-lacZ pelo fragmento EcoRI/HindiII contendo hcmvtetO-UL9C535C de pcmvtetOUL9-C535C (69). pAzgD-VHS-2 é um plasmídeo codificando gD2 de VHS-2 gentilmente cedido pela Dra . Patricia Spear (Northwestern University). pICP4TO-hEGF expressa o fator de crescimento epidérmico humano sob o controlo do promotor de ICP4 imediato-precoce de VHS-1 possuindo tetO, que consiste na sequência promotora de ICP4 de VHS-1 de -377 pb a -19 pb relativamente ao local de início da transcrição do gene de ICP4. Semelhante ao promotor imediato-precoce principal de hCMV possuindo tetO no plasmídeo pcmvtetO-hEGF (73), o promotor de ICP4 contendo tetO contém duas cópias em tandem de operadores tet 10 pb a jusante do elemento TATA de ICP4, TATATGA. Assim, tal como pcmvtetO-hEGF, a expressão de hEGF a partir de pICP4TO-hEGF pode ser fortemente regulada através de tetraciclina na presença de tetR, e a inserção de tetO não tem qualquer efeito na atividade do promotor de ICP4 na ausência de tetR. Uma caracteristica única adicional associada ao promotor de ICP4 possuindo tetO em pICP4TO-hEGF é a ausência da sequência de ligação ao ADN de ICP4 ATCGTCCACACGGAG (SEQ ID NO:3), que abrange o local de iniciação da transcrição do gene de ICP4 (51) no promotor de ICP4 de tipo selvagem. Assim, ao contrário do promotor de ICP4 de tipo selvagem que está sujeito a autorregulação através de ICP4 (16, 57), o promotor de ICP4 possuindo tetO em pICP4TO-hEGF não será suprimido pela proteina reguladora principal ICP4 de VHS-1.
Para clonar gD2 sob o controlo do promotor de ICP4 contendo tetO, construiu-se primeiro o plasmideo p02ICP4-TO através de clonagem Smal-BamHI do promotor de ICP4 contendo tetO em pICP4TO-hEGF em pVHS2.ICP0-V no MCS do vetor. p02.4TO-gD2 é um plasmideo derivado de p02ICP4-TO que codifica o gene de gD2 de pAzgD-VHS-2 sob controlo do promotor de ICP4 possuindo tetO. p021acZTO-gD2.C535C, um plasmideo codificando UL9-C535C sob o controlo do promotor imediato-precoce de hCMV possuindo tetO com uma truncagem a 5' a -236 pb do promotor de hCMV e o gene de gD2 sob controlo do promotor de ICP4 com tetO (Fig. IA), foi criado através da substituição do fragmento SnaBI/PstI de p021acZTO-C535C por um fragmento HindIII/PstI contendo gD2 de p02.4TO-gD2. Em p021acZTO-gD2.C535C, a transcrição do gene de UL9-C535C e do gene de gD2 estão em sentidos opostos.
Virus VHS-2 de tipo selvagem, estirpes 186 e G, foram propagados e ensaiados por placas fágicas em células Vero. N2-lacZ é um mutante nulo de ICPO de VHS-2 codificando o gene de LacZ sob o controlo do promotor de ICPO de VHS-2, em que ambas as cópias do gene de ICPO são substituídas pelo gene de LacZ em pVHS2. ICPO-lacZ através de recombi-nação homóloga transfetando células U20S com pVHS2.ICP0-lacZ linearizado com Nhel seguido por superinfeção com VHS-2 tal como anteriormente descrito (74) . A substituição do gene de ICPO pelo gene de LacZ no locus de ICPO foi confirmada por análise de PCR de ADN virai de N2-lacZ com os iniciadores que flanqueiam o gene de ICPO e iniciadores específicos para o gene de lacZ (41, 74). N2-C535C é um derivado de N2-lacZ, em que ambas as cópias do gene de LacZ são substituídas por sequências de ADN codificando UL9-C535C sob controlo do promotor de hCMV contendo tetO no plasmideo p021acZ-TOC535C (Fig. 1B) . Em resumo, células U2CEP4R11 foram cotransfetadas com o p021acZ-TOC535C linearizado e ADN virai infecioso de N2-lacZ através de Lipofectamina 2000. A descendência da transfeção foi pesquisada quanto à substituição por recombinação dos genes de lacZ de N2-lacZ pela sequência de ADN contendo o cmvtetOUL9-C535C através de ensaio de placas fágicas padrão. As placas foram coradas com 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactopiranósido (X-Gal) 96 h pós-infeção. Foram isoladas placas fágicas brancas, refletindo a substituição de ambas as cópias do gene de lacZ pela sequência de codificação de ADN de UL9-C535C. Um dos isolados, designado N2-C535C, rendeu placas fágicas uniformemente brancas após quatro ciclos de purificação de placas fágicas. CJ2-gD2 é construído através da substituição de ambas as cópias do gene de LacZ no locus de ICPO em N2-lacZ por sequências de ADN codificando UL9-C535C sob o promotor imediato-precoce principal de hCMV possuindo tetO e gD2 sob o controlo do promotor de ICP4 de VHS-1 contendo tetO (Fig. 1B), que consiste na sequência do promotor de ICP4 de VHS-1 de -377 pb a -19 pb relativamente ao local de inicio da transcrição do gene de ICP4 (71). SDS-PAGE e Análise Western Blot Células Vero semeadas em placas de 60 mm a 7,5 χ 105 células/placa foram falsamente infetadas ou infetadas com os virus indicados a uma MOI de 10 PFU/célula. Extratos celulares foram preparados 9 h ou 16 h após a infeção (72). As proteínas no extrato celular foram separadas por eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio- poliacrilamida (SDS-PAGE) (acrilamida a 9%) , transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) e sondadas com anticorpos policlonais contra gD de VHS-1 (R45, uma oferta dos Drs. Gary H. Cohen e Roselyn J. Eisenberg), UL9 (uma oferta de Mark Challberg), ou anticorpos monoclonais especificos para ICP27 e gB (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) .
Ratinhos Fêmeas de ratinho BALB/c com 4-6 semanas de idade foram adquiridas em Charles River Laboratories (Wilmington, MA) . Os ratinhos foram alojados em gaiolas de metal a quatro ratinhos por gaiola e mantidos num ciclo de luz/escuridão de 12 h. Os ratinhos foram deixados a aclimatizar às condições de alojamento durante 1 semana antes da experimentação. Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com os protocolos aprovados pela Harvard Medical Area Standing Committee on Animals e
American Veterinary Medical Association.
Imunização e Confrontos
Ratinhos BALB/c foram divididos aleatoriamente em vários grupos e o pelo no seu flanco traseiro esquerdo foi cortado. Os ratinhos foram vacinados com 2 χ 106 PFU/ratinha de CJ2-GD2, N2-C535C, CJ9-gD, ou falsamente vacinados com DMEM num volume de 30 μΐ s.c. no flanco traseiro esquerdo usando uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de calibre 27. Os ratinhos foram reforçados após 2 semanas e confrontados com VHS-2 de tipo selvagem estirpe G, 3 semanas após a imunização secundária. Cinco dias antes do confronto, os ratinhos foram injetados s.c. na prega do pescoço com medroxiprogesterona (SICOR Pharmaceuticals, Inc., Irvine, CA) a 3 mg por ratinho num volume de 20 μΐ (7, 50) . Para confronto intravaginal, os ratinhos de todos os grupos foram anestesiados, pré-esfregados com um esfregaço de alginato de cálcio (aplicador com ponta estéril uretro-genital de alginato de cálcio, Puritan Medical Products company LLC, Guilford, Maine, EUA) e inoculados intravaginalmente com 20 μΐ de meio de cultura contendo 5 χ 105 PFU (50 DL50) de VHS-2 estirpe G (50) . Os animais foram mantidos de costas com a sua parte traseira elevada sob a influência da anestesia durante 30-45 min após a infeção.
Ensaios de Infeção Aguda e Observações Clínicas
Nos dias 1, 2, 3, 5 e 7 após o confronto, as mucosas vaginais foram esfregadas com alginato de cálcio (7). Os vírus infeciosos presentes nos materiais dos esfregaços foram avaliados através de ensaio de placas fágicas padrão em monocamadas de células Vero. Após o confronto com VHS-2 de tipo selvagem, os ratinhos foram avaliados diariamente durante um período de seguimento de 21 dias quanto a sinais de lesões genitais e doença sistémica. A gravidade da doença foi classificada como se segue: 0 = sem sinal de infeção herpética, 1 = ligeiro eritema e edema genital, 2 = inflamação genital moderada, 3 = lesões genitais purulentas e/ou doença sistémica, 4 = paralisia dos membros traseiros, e 5 = morte (8, 50).
Detecção de Anticorpos Neutralizantes Específicos de VHS-2
Sangue foi recolhido das veias da cauda de ratinhos imunizados e falsamente imunizados 4 semanas após a imunização primária. Os titulos de anticorpos neutralizantes no soro foram determinados tal como descrito anteriormente na presença de complemento (5-7) com 250 PFU de VHS-2 de tipo selvagem estirpe 186. O titulo de anticorpo neutralizante foi expresso como a diluição sérica final necessária para se obter uma redução de 50% nas PFU de VHS em relação às PFU de VHS obtidas em apenas meio mais complemento.
Imunoprecipitação Células U20S semeadas a 7,5 χ 106 células por placa de 100 mm foram falsamente transfetadas ou transfetadas com 10 pg de p02.4TO-gD através de lipofectamina 2000 24 h após a sementeira. Extratos celulares foram preparados 48 h após a transfeção (72). As imunoprecipitações foram realizadas através da mistura de 10 μΐ de soro reunido recolhido de ratinhos falsamente imunizados e imunizados com 70 μΐ dos extratos celulares preparados acima. Os complexos específicos de gD/IgG de ratinho foram precipitados com Proteina A (Estojo Pierce Classic IP, Pierce Biotechnology, Rockford, IL), separados em SDS-PAGE e sondados com o anticorpo policlonal de coelho especifico anti-gD, R45, seguido de reação com IgG de cabra anti-coelho conjugado com HRP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Ensaios ELISPOT de IFN-γ Fêmeas de ratinho Balb/c foram falsamente imunizadas com DMEM ou imunizadas com CJ2-GD2 a uma dose de 2 x 106 PFU/ratinho duas vezes com 2 semanas de intervalo. 5 a 10 semanas após a segunda imunização, os ratinhos falsamente imunizados e imunizados com CJ2-gD2 foram falsamente confrontados ou confrontados com VHS-2 de tipo selvagem, estirpe 186 s.c. a uma dose de 1 χ 104 PFU/ratinho. Foram isolados esplenócitos a partir de grupos individuais de ratinhos (n=3) no dia 4 ou 5 pós-confronto. O ensaio ELISPOT de células T CD4+ e CD8+ foi realizado tal como anteriormente descrito (42). Em resumo, células T CD4+ e CD8+ foram isoladas a partir de esplenócitos utilizando estojos de isolamento Dynal negativos para CD4 ou CD8 e semeadas em quadruplicado numa placa de filtração de 96 poços pré-revestida com anticorpo monoclonal especifico anti-IFN-γ de ratinho (AN18) a 7,5 χ 104 ou 1,5 χ 105 células/poço. Após incubação a 37 °C durante 20 h, os poços foram lavados, feitos reagir com anticorpo monoclonal especifico de IFN-γ biotinilado (R4-6A2, Mabtech) à temperatura ambiente, e incubou-se com Estreptavidina-
Fosfatase Alcalina (Mabtech). As células formadoras de manchas de IFN-γ foram detetadas através da adição de substrato BCIP/NBT. As manchas foram contadas num microscópio de dissecção e o número de células formadoras de manchas de IFN-γ (SFC) foi expresso como a média ± EMP por milhão de células T CD4+ ou CD8+. PCR Quantitativa em Tempo Real A parte lombar inferior e sacral da coluna vertebral, incluindo espinal-medula e gânglios da raiz dorsal, foram colhidas 16 dias após imunização de reforço ou 21 dias após confronto intravaginal com 5 χ 105 PFU de VHS-2 estirpe G de 9 ou 10 ratinhos que tinham sido imunizados com CJ2-gD2 ou CJ9-gD. A coluna vertebral foi cortada em 4 porções e cada pedaço foi mantido separadamente em 0,5 ml de meio de crescimento normal e armazenado a -80 °C para posterior processamento. O ADN total foi isolado a partir de cada gânglio da raiz dorsal utilizando o estojo de tecido DNeasy (Qiagen, Santa Clarita, CA), e suspendeu-se em 400 μΐ de tampão AE. A presença de ADN de VHS-2 foi quantificada através de PCR em tempo real (Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System) com 100 ng de ADN dos gânglios e iniciadores específicos para a ADN-polimerase de VHS (Direto: 5' GCT CGA GTG CGA AAA AAC GTT C (SEQ ID NO: 4) , Inverso: 5' CGG GGC GCT CGG CTA AC (SEQ ID NO:5)) tal como anteriormente descrito (8). As cópias mínimas de ADN virai de VHS-2 que podem ser detetadas com confiança foram de 1 cópia por reação.
Análise Estatística
Para a análise estatística, foram realizados testes t de Student desemparelhados. Os resultados são considerados estatisticamente significativos quando o valor de P é inferior a 0,05. II. Resultados
Construção de CJ2-gD2
Como primeiro passo na geração de um vírus recombinante VHS-2 dominante-negativo expressando gD2 e UL9-C535C e de replicação deficiente, construímos um mutante de deleção de ICPO de VHS-2, N2-lacZ, no qual ambas as cópias do gene de ICPO em VHS-2 estirpe 186 são substituídas pelo gene de LacZ sob o controlo do promotor de ICPO de VHS-2 (Fig. 1B). Mostramos que, à semelhança do mutante nulo de ICPO de VHS-1 7314 (11), a eficiência de formação de placas fágicas de N2-lacZ em células da linha celular de osteossarcoma humano U20S é 425 vezes mais elevada que em células Vero, indicando que a atividade celular em células U20S também pode substituir funcionalmente ICPO de VHS-2. Em comparação com VHS-2 de tipo selvagem, a eficiência da replicação de N2-lacZ em células Vero é reduzida mais de 600 vezes a uma MOI de 0,1 PFU/célula. Consistente com esta descoberta, a inoculação intravaginal de N2-lacZ a 1 χ 105 e 5 χ 105 PFU/ratinho não conduziu a nenhuma doença local ou sistémica, enquanto os ratinhos infetados com 1 χ 104 PFU/ratinho de VHS-2 de tipo selvagem desenvolveram herpes genital grave, e todas morreram pelo dia 11 após a infeção. Além disso, N2-lacZ não consegue estabelecer infeção latente reativável após infeção intravaginal a uma dose de 5 χ 105 PFU/ratinho. Estes resultados indicam que, semelhante a ICPO de VHS-1 (10, 11, 37, 64), a deleção de ICPO de VHS-2 impede significativamente a capacidade do virus para iniciar infeção aguda e latente reativável in vivo.
Tentando maximizar os niveis de expressão de gD2 por um recombinante virai de VHS-2 dominante-negativo e de replicação deficiente, construímos um recombinante de VHS-2 dominante-negativo e de replicação deficiente (CJ2-gD2) substituindo ambas as cópias do gene de LacZ em N2-lacZ por sequências de ADN codificando o gene de gD2 dirigido pelo promotor imediato-precoce principal de ICP4 de VHS-1 possuindo tetO e UL9-C535C sob o controlo do promotor imediato-precoce principal de hCMV contendo tetO com uma truncagem no -236 pb do promotor imediato-precoce de hCMV inteiro (Fig. 1B). Assim, ao contrário de CJ9-gD, que codifica uma única cópia do gene de gD de VHS-1 inserido dirigido pelo promotor de hCMV contendo tetO no locus de UL9 de VHS-1 (41), CJ2-gD2 contém 2 cópias do gene de gD2 controlado pelo promotor imediato-precoce de ICP4 de VHS-1 possuindo tetO, que consiste na sequência do promotor de ICP4 de VHS-1 de -377 pb a -19 pb relativamente ao local de inicio da transcrição do gene de ICP4. N2-C535C é um recombinante de VHS-2 no qual ambas as cópias do gene de Lac Z em N2-lacZ são substituídas por UL9-C535C sob ο controlo do promotor imediato-precoce de hCMV possuindo tetO inteiro. CJ2-gD2 Expressa Elevados Níveis de gD2 e UL9-C535C em Células Vero Infetadas
Para examinar a expressão de gD2 e UL9-C535C a partir do promotor imediato-precoce de ICP4 de VHS-1 possuindo tetO e do promotor imediato-precoce de hCMV, respetivamente, células Vero foram infetadas com VHS-2 de tipo selvagem, N2-lacZ, N2-C535C, e CJ2-gD2 a uma MOI de 10 PFU/célula e colhidas 9 h após a infeção. As proteínas das células infetadas foram analisadas através de ensaios Western blot com um anticorpo monoclonal de ICP27 de VHS-1/2, um anticorpo policlonal de UL9, e um anticorpo policlonal de gDl (R45) . Dado que, tal como gD2, gB2 é o alvo principal para o anticorpos neutralizante bem como respostas de células T e é um produto γΐ, as proteínas das células infetadas foram também sondadas com um anticorpo monoclonal específico de gB. A Fig. 2A mostra que CJ2-gD2 e N2-C535C expressam níveis semelhantes de proteína imediata-precoce ICP27 de VHS-2 aos expressos por VHS-2 de tipo selvagem e N2-lacZ. Embora tenham sido detetadas quantidades significativas de UL9-C535C em células infetadas com CJ2-gD2 e N2-C535C, pouca gD2 ou gB2 foi detetada em células infetadas com N2-C535C. Em contraste com a infeção por N2-C535C, no entanto, a infeção de células Vero com CJ2-gD2 conduz a expressão de elevado nível de gD2 a níveis semelhantes àqueles em células infetadas por VHS-2 de tipo selvagem, e a expressão de gD2 não tem qualquer efeito na expressão de gB2. Os resultados indicam também que, tal como o mutante nulo de ICPO de VHS-1 7134 (71), a deleção de ICPO de VHS-2 em N2-lacZ reduz grandemente a expressão de gD2. Devido à expressão de muito baixo nível de UL9 do seu promotor precoce de VHS autêntico (68), não foi detetada UL9 de tipo selvagem entre as células infetadas com estes quatro vírus diferentes. Adicionalmente, observa-se que os níveis de UL9-C535C expressa em células infetadas com CJ2-gD2 são consistentemente mais elevados que em células infetadas com N2-C535C, sugerindo que os elementos responsivos a VP16 de VHS, TAATGARAT, presentes no promotor de ICP4 de VHS-1 (71) podem levar a maior expressão de UL9-C535C do promotor imediato-precoce de hCMV do sistema promotor híbrido de ICP4/hCMV descrito. A análise Western blot com o anticorpo policlonal de gDl (R45) apresentado na Fig. 2B mostra que, enquanto foram detetados níveis mais elevados de gD em células infetadas com VHS-1 de tipo selvagem que em células infetadas com VHS-2 de tipo selvagem, os níveis de gD detetados em células infetadas com CJ9-gD foram marcadamente inferiores que em células infetadas com CJ2-gD2. Esta descoberta demonstra que CJ2-gD2 expressa gD2 mais eficientemente que a gDl expressa por CJ9-gD.
Para demonstrar que a UL9-C535C e gD2 expressas em células Vero infetadas com CJ2-gD2 estão, de facto, sob o controlo dos promotores possuindo teto, em seguida infetámos uma linha estável de células Vero expressando tetR, células VCEP4R-28, com VHS-2 de tipo selvagem e CJ2-gD2 a uma MOI de 10 PFU/célula na ausência ou presença de tetraciclina. As proteínas de células infetadas foram colhidas 9 h após a infeção e analisadas através de western blots. Tal como se pode observar (Fig. 3), embora tenham sido detetados níveis semelhantes de ICP27 em células VCEP4R-28 infetadas com VHS-2 de tipo selvagem e CJ2-gD2, tanto na ausência como na presença de tetraciclina, UL9-C535C foi detetada em células VCEP4R-28 infetadas com CJ2-gD2 apenas quando estava presente tetraciclina e níveis significativamente mais elevados de gD2 foram detetados na presença de tetraciclina que na sua ausência. CJ2-gD2 Não se Pode Replicar em Células Vero
Devido à falta de ICPO e à expressão de elevado nível de UL9-C535C a partir do promotor imediato-precoce principal de hCMV possuindo tetO, CJ2-gD2 teve de ser construído e propagado na linha celular U20S complementar de ICPO e que expressa tetR U2CEP4R11 (68) . Ensaiou-se em placas fágicas 6, 65 * 107 PFU de CJ2-gD2 em monocamadas de células Vero e não se detetou qualquer vírus infecioso, o que demonstra que a eficiência de formação de placas fágicas de CJ2-gD2 em células Vero é reduzida pelo menos 6,65 x 107 vezes em comparação com as suas células U2CEP4R11 complementares.
Inibição da Replicação de VHS-2 de Tipo Selvagem através de CJ2-gD2 A seguir testou-se o efeito dominante-negativo da expressão de elevado nivel de UL9-C535C por CJ2-gD2 na replicação do virus VHS-2 de tipo selvagem através de ensaio de coinfeção (Fig. 4) . A Fig. 4A mostra que a coinfeção de células Vero com CJ2-gD2 a uma MOI de 5 PFU/célula e VHS-2 de tipo selvagem a uma MOI de 2 PFU/células conduziu a uma diminuição de quase 500 vezes na produção de VHS-2 de tipo selvagem em comparação com células infetadas isoladamente com VHS-2 de tipo selvagem à mesma MOI, independentemente de se os titulos do virus foram determinados em células Vero ou em células U2CEP4R11. Foi detetada pouca redução na produção de virus de tipo selvagem quando foi realizada uma experiência de coinfeção semelhante com N2-lacZ.
Para examinar melhor a potência de CJ2-qD2 na inibição da replicação de VHS-2 de tipo selvagem, realizaram-se experiências de coinfeção com VHS-2 de tipo selvagem e CJ2-gD2 a razões de MOI de 1:1 e 3:1, respetivamente. Os resultados na Fig. 4B mostram que CJ2-gD2 é eficaz na prevenção de infeção por VHS-2 de tipo selvagem sob ambas as condições, conduzindo a uma redução de cerca de 151 e 94 vezes na sintese de virus de tipo selvagem nas razões de coinfeção indicadas em comparação com células infetadas isoladamente com VHS-2 de tipo selvagem a uma MOI de 5 PFU/célula e 15 PFU/célula, respetivamente. CJ2-gD2 é Avirulenta Após Injeção Intracerebral em Ratinhos A neurovirulência é uma das características da infeção por VHS. Para determinar a capacidade de CJ2-gD2 e N2-C535C para se replicarem no SNC, fêmeas de ratinhos BALB/c com 5 a 6 semanas de idade foram distribuídas aleatoriamente por cinco grupos de 8 ratinhos cada. CJ2-gD2 e N2-C535C foram diretamente inoculadas no cérebro de cada ratinho no lobo frontal esquerdo a 2,5 χ 106 PFU por ratinho num volume de 20 μΐ com uma agulha de insulina de calibre 28 a uma profundidade de 4 mm (74) . A morbidez e mortalidade foram monitorizadas durante 35 dias. Dado que a DL50 do VHS-2 de tipo selvagem estirpe 186 é de cerca de 10 PFU em fêmeas de ratinhos BALB/c após injeção intravítrea (38), um grupo de ratinhos foi também inoculado com VHS-2 de tipo selvagem a 25 PFU/ratinho. Como controlo adicional, os ratinhos no quinto grupo foram inoculados com N2-lacZ a 1 χ 106 PFU/ratinho. A Fig. 5 mostra que, tal como os ratinhos inoculados com DMEM, os ratinhos inoculados intracerebralmente com CJ2-gD2 e N2-C535C a uma dose de 2,5 x ]_g6 ppu ng0 mostraram sinais de neurovirulência durante um seguimento de 35 dias, enquanto todos os ratinhos inoculados com o VHS-2 de tipo selvagem a uma dose de 25 PFU/ratinho (uma dose 100000 vezes inferior à dada aos ratinhos inoculados com CJ2-gD2) morreram pelo dia 10 pós- inoculação, e todos os ratinhos inoculados exibiram sinais de doença do SNC normalmente associada a infeção por VHS-2, incluindo pelo áspero, postura arqueada, ataxia e anorexia. Embora 100% dos ratinhos inoculados com N2-lacZ tenham sobrevivido, todos os ratinhos apresentaram sinais de encefalite.
Indução de Anticorpos Neutralizantes Específicos de VHS-2 e uma Resposta de Anticorpos Especifica de gD2 em Ratinhos Imunizados com CJ2-gD2 A capacidade de CJ2-gD2 para desencadear anticorpos neutralizantes específicos anti-VHS-2 foi determinada em ratinhos imunizados com CJ2-gD2 a uma dose de 2 x 106 PFU. Como controlos, grupos de ratinhos foram também imunizados com N2-C535C ou CJ9-gD à mesma dose. Tal como mostrado (Fig. 6A) , a média do titulo de anticorpos neutralizantes específicos de VHS-2 em ratinhos imunizados com CJ2-gD2 foi em média de 500, o que é 3 vezes mais elevado que a dos ratinhos imunizados com N2-C535C (p = 0,015), e é comparável com o titulo de anticorpo neutralizante induzido em ratinhos imunizados com CJ9-gD (p = 0,28) . Não foram detetados titulos de anticorpos específicos contra VHS-2 em ratinhos falsamente vacinados a uma diluição de 1:10. A Fig. 6B mostra que embora tenham sido detetados niveis semelhantes de resposta de anticorpos específicos de gD entre ratinhos imunizados com CJ2-gD2 e CJ9-gD quando os respetivos complexos de gD2 imunoprecipitados foram sondados com anticorpos anti-gDl, R45, os niveis de anticorpos específicos anti-gD em ratinhos imunizados com CJ2-gD2 foram significativamente mais elevados que em ratinhos imunizados com N2-C535C e no controlo falsamente imunizado. Tomados em conjunto, os resultados apresentados na Fig. 6 indicam que a expressão de elevado nivel de gD2 por CJ2-gD2 leva a um aumento da eficácia no desencadear do anticorpo anti-gD2, bem como das respostas de anticorpos neutralizantes específicos anti-VHS-2 em comparação com N2-C535C.
Indução de Resposta de Células T Específica de VHS-2 em Ratinhos Imunizados com CJ2-gD2
Para avaliar a eficácia da imunização de CJ2-gD2 no desencadear da resposta de células T específica de VHS-2, realizou-se a experiência de memória para examinar as respostas das células T de memória em ratinhos imunizados após confronto com VHS-2 de tipo selvagem. Primeiro, os ratinhos falsamente vacinados e vacinados com CJ2-gD2 foram falsamente confrontados ou confrontados com VHS-2 de tipo selvagem 9-10 semanas após a imunização de reforço seguido por ensaios ELISPOT de IFN-γ com células T CD4+ e CD8 + isoladas de baços de grupos individuais de ratinhos (n=3) no dia 5 pós-confronto (Fig. 7A). Os ratinhos vacinados com CJ2-gD2 confrontados com VHS-2 de tipo selvagem tiveram um aumento de 4,8 vezes de células T CD4+ positivas para IFN-γ em comparação com os ratinhos falsamente infetados imunes a CJ2-gD2 (p <0,0001). Mais significativamente, o número de células T CD4+ que segregam IFN-γ detetadas em ratinhos infetados com VHS-2 previamente vacinados com CJ2-gD2 foi 18 vezes mais que os ratinhos falsamente vacinados infetados com VHS-2 (p <0,0001). Não foram detetadas células T CD4+ positivas para IFN-γ em ratinhos de controlo falsamente vacinados e falsamente infetados sob condições idênticas. Estas descobertas mostram que a imunização com CJ2-gD2 desencadeia uma forte resposta de células T CD4+ de memória.
Embora tenha havido um aumento de mais de 2 vezes nas células T CD8+ segregadoras de IFN-γ em ratinhos vacinados com CJ2-gD2 em comparação com os controlos falsamente vacinados, números semelhantes de células T de células T CD8+ segregadoras de IFN-γ foram detetados nos baços de ratinhos infetados com VHS-2 falsamente vacinados e ratinhos infetados com VHS-2 vacinados com CJ2-gD2 (Fig. 7B) . Realizou-se assim o segundo conjunto de experiências de memória, em que ratinhos falsamente vacinados e vacinados com CJ2-gD2 foram falsamente confrontados ou confrontados com VHS-2 de tipo selvagem (n=3) 5-6 semanas após a segunda vacinação. Os ensaios ELISPOT de CD4+ e CD8+ foram realizados no dia 4 após a infeção (Fig. 7C e 7D). Um aumento de 8,6 e 5,7 vezes nas células T CD4+ e CD8 + segregadoras de IFN-γ, respetivamente, foi detetado em ratinhos imunizados com CJ2-gD2 após infeção por VHS-2 em comparação com ratinhos imunes a CJ2-gD2 falsamente infetados (células T CD4+: p = 0,035; células T CD8+: p = 0,01) . Além disso, após confronto com VHS-2, as células T CD4+ e CD8+ segregadoras de IFN-γ foram 8 e 9,5 mais elevadas, respetivamente, em ratinhos vacinados com CJ2-gD2 em comparação com falsamente vacinados (células T CD4+: p = 0,036; células T CD8+: p = 0,01). Coletivamente, estes estudos demonstram que a imunização com CJ2-gD2 pode desencadear respostas robustas de células T CD4+ e CD8+ de memória especificas de VHS-2, que podem ser eficientemente recordadas durante a infeção por VHS-2.
Projeção contra Infeção e Doença Genital por VHS-2 em Ratinhos Imunizados
Cinco a seis semanas após a imunização inicial, os ratinhos foram confrontados intravaginalmente com VHS-2 estirpe G a 50 DL50 (5 χ 105 PFU/ratinho) . Esfregaços vaginais foram tomados nos dias 1, 2, 3, 5, e 7 após o confronto. Os ratinhos foram observados durante um periodo de seguimento de 21 dias para a incidência de doença genital e disseminada por VHS-2. Tal como mostrados na Fig. 8A, as produções de virus de confronto foram reduzidas mais de 200 vezes no dia 1 (p <0,001) e 130 vezes no dia 2 (p <0,0001) em ratinhos imunizados com CJ2-gD2 (n=9) em comparação com aqueles de controlo falsamente imunizados (n=10). Embora não tenha havido diferença significativa na redução do derramamento do virus de confronto nos dias 1, 2, e 3 pós-confronto entre grupos de ratinhos imunizados com CJ2-gD2 e N2-C535C (n=10), a imunização com CJ2-gD2 foi mais eficaz que CJ9-gD na redução do derramamento de virus de confronto no dia 1 (p=0,03), 2 (p=0,025) e 3 (p <0,007). Pouco ou nenhum vírus de confronto foi detetado em ratinhos imunizados com CJ2-gD2, N2-C535C, ou CJ9-gD no dia 5 pós-confronto, enquanto que todos os ratinhos falsamente vacinados continuaram a derramar vírus a um rendimento médio de mais de 5 χ 103 PFU/ml. Nenhum vírus de confronto estava presente nos materiais de esfregaço vaginal recolhido no dia 7 pós-confronto em três grupos imunizados de ratinhos. Numa experiência separada, observou-se que enquanto não houve derrame do vírus em ratinhos imunizados com CJ2-gD2 no dia 5 pós-confronto, a presença de VHS-2 de tipo selvagem foi detetada em 5 dos 7 ratinhos imunizados com N2-C535C e 4 dos 7 ratinhos imunizados com CJ9-gD.
Os resultados na Fig. 9 mostram que os ratinhos imunizados com CJ2-gD2 estavam completamente protegidos do desenvolvimento de lesões genitais locais e não exibiam sinais de doença sistémica após confronto com VHS-2 de tipo selvagem (Fig. 9A). Todos os ratinhos falsamente imunizados desenvolveram graves lesões genitais e sucumbiram à infeção por VHS-2 de tipo selvagem pelo dia 11 pós-confronto (Fig. 9B). Embora a imunização com N2-C535C e CJ9-gD tenha protegido os ratinhos contra confronto letal com VHS-2 de tipo selvagem, 20% e 30% dos ratinhos experimentaram um grau transiente baixo de doença local genital (pontuação 1) em ratinhos imunizados com N2-C535C e CJ9-gD, respetivamente (Tabela 1). Numa experiência semelhante (Tabela 1), observou-se que entre os ratinhos imunizados com CJ9-gD (n=7), 2 ratinhos experimentaram baixos graus de doença local genital, e 1 ratinho mostrou sinais de doença sistémica e morreu no dia 14 pós-conf ronto, e 3 dos 7 ratinhos imunizados com N2-C535C (43%) mostraram um baixo grau de doença local genital (pontuação = 1). Novamente, não foram observados sinais de doença herpética local nem sistémica em ratinhos imunizados com CJ2-gD2 (n=7). Coletivamente, estes estudos demonstram gue CJ2-gD2 é uma vacina mais eficaz gue N2-C535C e CJ9-gD na proteção de ratinhos contra doença genital após confronto intravaginal com VHS-2 de tipo selvagem.
Tabela 1: Percentagem de proteção contra doença herpética em ratinhos falsamente imunizados e imunizados após confronto intravaginal com VHS-2 de tipo selvagem
__Falso__CJ2-gD2 N2-C535C CJ9-gD
Exp 1 (n=9-10) 0__100%__80%__70%_
Exp 2 (n=7-8) 0_ 100%_ 57%_ 57%_
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<210> 2 <211> 953 <212> ADN <213> herpesvirus humano 1 <400> 2 atgggagagg cgtcgctgcc ggcccaggcc gccgagacgg aggaggtggg tcttttgtcg 60 aaaaatacct ccggtccgat gtcgcgccgg cggaaattgt cgcgctcatg cgcaacctca 120 acagcctgat gggacgcacg cggtttattt acctggcgtt gctggaggcc tgtctccgcg 180 ttcccatggc cacccgcagc agcgccatat ttcggcggat ctatgaccac tacgccacgg 240 gcgtcatccc cacgatcaac gtcaccggag agctggagct cgtggccctg ccccccaccc 300 tgaacgtaac ccccgtctgg gagctgttgt gcctgtgcag caccatggcc gcgcgcctgc 360 attgggactc ggcggccggg ggatctggga ggaccttcgg ccccgatgac gtgctggacc 420 tactgacccc ccactacgac cgctacatgc agctggtgtt cgaactgggc cactgtaacg 480 taaccgacgg acttctgctc tcggaggaag ccgtcaagcg cgtcgccgac gccctaagcg 540 gctgtccccc gcgcgggtcc gttagcgaga cggaccacgc ggtggcgctg ttcaagataa 600 tctggggcga actgtttggc gtgcagatgg ccaaaagcac gcagacgttt cccggggcgg 660 ggcgcgttaa aaacctcacc aaacagacaa tcgtggggtt gttggacgcc caccacatcg 720 accacagcgc ctgccggacc cacaggcagc tgtacgccct gcttatggcc cacaagcggg 780 agtttgcggg cgcgcgcttc aagctacgcg tgcccgcgtg ggggcgctgt ttgcgcacgc 840 actcatccag cgccaacccc aacgctgaca tcatcctgga ggcggcgctg tcggagctcc 900 ccaccgaggc ctggcccatg atgcaggggg cggtgaactt tagcacccta taa 953
<210> 3 <211> 15 <212> ADN <213> herpesvirus humano 1 <400> 3 atcgtccaca cggag 15
<210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> herpesvirus humano 2 <400> 4 gctcgagtgc gaaaaaacgt tc 22
<210> 5 <211> 17 <212> ADN <213> herpesvirus humano 2 <400> 5 cggggcgctc ggctaac 17

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Vírus de Herpes simplex 2 (VHS-2) recom-binante de replicação deficiente, dominante-negativo, compreendendo no seu genoma: a) uma primeira sequência codificando uma primeira glicoproteína D de VHS-2 (gD2), em que a referida sequência está operativamente ligada a um primeiro promotor de ICP4 de VHS-1 contendo tet-O; b) uma segunda sequência codificando uma segunda gD2 de VHS-2, em que a referida segunda sequência está operativamente ligada a um segundo promotor de ICP4 de VHS-1 contendo tet-O; c) uma terceira sequência codificando uma primeira proteína UL9-C535C (SEQ ID N0:2), em que a referida terceira sequência está operativamente ligada a um primeiro promotor imediato precoce de hCMV contendo tet-O com uma truncagem no -236 pb do promotor inteiro; e d) uma quarta sequência codificando uma segunda proteína UL9-C535C (SEQ. ID N0:2) em que a referida quarta sequência está operativamente ligada a um segundo promotor imediato precoce de hCMV contendo tet-O com uma truncagem no -236 pb do promotor inteiro; e em que o referido genoma não compreende uma sequência de codificação de uma proteína ICPO funcional.
  2. 2. Vírus recombinante da reivindicação 1, em que: a) os referidos primeiro e segundo promotores de ICP4 de VHS-1 contendo tet-0 e os referidos primeiro e segundo promotores imediatos precoces de hCMV contendo tet-0 possuem, cada um, um elemento TATA; b) cada uma das referidas sequências promotoras contendo Tet-0 compreende dois locais de ligação ao repressor op2 unidos através de 2-20 nucleótidos de ligação, em que o primeiro nucleótido no referido operador tet está entre os nucleótidos 6 e 24 a 3' do último nucleótido no referido elemento TATA; c) a referida primeira sequência codificando uma gD2 de VHS-2 e a referida segunda sequência codificando uma gD2 de VHS-2 residem a 3' dos referidos primeiro e segundo promotores de ICP4 de VHS-1 contendo Tet-0 respetivamente; d) a referida terceira sequência codificando uma proteína UL9-C535C (SEQ ID NO:2) e a referida quarta sequência codificando uma proteína UL9-C535C (SEQ ID NO:2) residem a 3' dos referidos primeiro e segundo promotores imediatos precoces de hCMV contendo tet-O, respetivamente.
  3. 3. Vírus recombinante da reivindicação 1 ou reivindicação 2, que expressa também um ou mais genes imunomoduladores recombinantes, e.g. IL12 ou IL15; gB de VHS-2 sob o controlo do promotor imediato-precoce de VHS ou hCMV possuindo tet-O; e/ou gC de VHS-2 sob o controlo do promotor imediato-precoce de VHS ou hCMV possuindo tet-O.
  4. 4. Virus recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, que expressa gB de VHS-2 sob o controlo do promotor imediato precoce de VHS ou hCMV possuindo tet-O.
  5. 5. Virus recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a transcrição da referida terceira sequência codificando a proteina UL9-C535C (SEQ ID N0:2) e a transcrição da referida primeira sequência de codificação de gD2 de VHS-2 estão em sentidos opostos, e em que a transcrição da referida quarta sequência codificando a proteina UL9-C535C (SEQ ID N0:2) e a transcrição da referida segunda sequência codificando gD2 de VHS-2 estão em sentidos opostos.
  6. 6. Virus recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que os promotores de ICP4 não possuem uma sequência de ligação ao ADN de ICP4.
  7. 7. Vacina compreendendo o virus recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, na forma de dose unitária.
  8. 8. Vacina da reivindicação 7, em que o virus recombinante está presente a um minimo de 1 χ 107 pfu por dose unitária, e.g. 1 χ 107 a 1 χ 109 pfu por dose unitária .
  9. 9. Vacina da reivindicação 7 ou reivindicação 8, para utilização em imunização de um paciente contra infeção por VHS-1 ou VHS-2.
  10. 10. Vacina de acordo com a reivindicação 7 ou 8 ou vacina para utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o paciente é seropositivo para infeção por VHS-1, seropositivo para VHS-2, seropositivo tanto para VHS-1 como para VHS-2, ou seronegativo para VHS-1 e VHS-2.
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