BR112019018630A2 - vírus hsv recombinante, vetor viral, célula hospedeira, método para obter o vírus hsv recombinante, composição farmacêutica, método para tratar um tumor e uso do vírus hsv recombinante - Google Patents
vírus hsv recombinante, vetor viral, célula hospedeira, método para obter o vírus hsv recombinante, composição farmacêutica, método para tratar um tumor e uso do vírus hsv recombinante Download PDFInfo
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Abstract
a invenção refere-se ao campo da virologia e terapia de tumor. em particular, a presente invenção provê um vírus simplex herpes recombinante (hsv) capaz de replicar, especificamente, em um nível elevado em uma célula de tumor e efetivamente matar a célula de tumor, mas replicar em baixos níveis em células normais, assim, o vírus simplex herpes recombinante da presente invenção não apenas tem alta letalidade contra as células do tumor, mas também tem efeitos colaterais significativamente reduzidos (especialmente neurotoxicidade). adicionalmente, apresente invenção refere-se a um vetor viral construído com base no vírus simplex herpes recombinante, uma composição farmacêutica compreendendo o vírus simplex herpes recombinante ou o vetor viral, e ao uso do vírus simplex herpes recombinante ou o vetor viral. o vírus simplex herpes recombinante da presente invenção pode ser usado para infectar e matar células de tumor, e pode ser usado para liberação de fármaco genômico dentro das células de tumor para terapia de gene.
Description
VÍRUS HSV RECOMBINANTE, VETOR VIRAL, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA OBTER O VÍRUS HSV RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA TRATAR UM TUMOR E USO DO VÍRUS HSV RECOMBINANTE
Campo da invenção [0001] A invenção refere-se ao campo da virologia e terapia de tumor. Em particular, a presente invenção provê um vírus simplex herpes recombinante (HSV) que é capaz de replicar especificamente em um nível alto em uma célula de tumor e efetivamente matar a célula de tumor, mas replicar em um nível baixo em uma célula normal, de modo que o vírus simplex herpes recombinante da presente invenção não apenas tenha uma letalidade elevada contra uma célula de tumor, mas também tenha uma diminuição significante nos efeitos colaterais (especialmente neurotoxicidade). Além disso, a presente invenção refere-se a um vetor viral construído com base no vírus simplex herpes recombinante, uma composição farmacêutica compreendendo o vírus simplex herpes recombinante ou o vetor viral. O vírus simplex herpes recombinante da presente invenção pode ser usado para infectar e matar uma célula de tumor, e pode ser usado para liberação de um fármaco de gene dentro de um fármaco de gene em uma célula de tumor para terapia de gene.
Antecedentes da invenção [0002] A radioterapia, quimioterapia e fármacos alvos são atualmente e amplamente usados em regimes de tratamento de tumor, mas eles têm todos muitos problemas tais como tratamento incompleto, grandes efeitos colaterais, propensos à resistência de fármaco, incapazes de controlar a recorrência do tumor e metástase, e insatisfatórios nos
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2/113 efeitos de tratamento do tumor. Portanto, existe uma necessidade urgente para desenvolver novos e efetivos métodos de tratamentos de tumor. Em anos recentes, a melhora significante no entendimento das pessoas da relação entre o tumor e a imunidade foi conseguida, e a imunoterapia dos tumores foi desenvolvida rapidamente. Entre elas, a terapia do vírus oncolítico (OV) tem atenção atraída como um novo tipo de imunoterapia do tumor (Lichty B.D., Breitbach CJ, Stojdl. DF., et.al., Going viral with cancer immunotherapy [J] . Nat. Ver. Cancer., 2014, 14 (8) : 559-567) . 0 virus oncolítico são uma classe de virus com propriedades tumorfílico que são capazes de replicar seletivamente em células de tumor, enquanto sua proliferação em células normais é limitada. O vírus oncolítico pode replicar em células de tumor conduzindo a lise de célula de tumor e morte, e o vírus amplificado pode continuar a infectar em torno das células de tumor, criando um efeito cascata. Em adição, durante o processo de lise das células de tumor, os vírus oncolítico podem também liberar os antígenos de tumor, estimular o corpo a produzir os anticorpos anti-tumor com imunidade anti-tumor específica, e ainda, melhorar o efeito oncolítico do vírus oncolítico. Os vírus oncolítico são os fármacos de terapia de gene novos mais populares no campo do tratamento de tumor maligno. Especialmente, no tratamento controle local de tumores sólidos, a infecção e a proliferação do vírus oncolítico conduz a ablação do sítio de injeção, e a lise das células de tumor conduz à liberação dos antígenos de tumor a partir das células de tumor, induzindo, assim, a resposta imune anti-tumor sistêmica para lutar contra o tumor em outras áreas no corpo, que podem ser uma
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3/113 resposta imune chave para o controle sistêmico da dispersão do tumor e metástase (Russell S. J., Peng KW, Bell J.C., Oncolytic virotherapy [J]. Nat. Biotechnol., 2012, 30(7):658670) .
[0003] O vírus oncolítico atual pode ser dividido dentro de mais do que dez tipos de acordo com o tipo de vírus. Entre eles, o tipo de vírus simplex herpes oncolítico I (HSV-1) tornou-se a primeira escolha para os fármacos de tratamento de tumor na engenharia genética em casa e fora, pois o vetor viral usado tem grande capacidade de carregar genes grandes, ciclo de replicação curto, eficiência de infecção alta, capacidade de inserção de múltiplos genes terapêuticos e outras vantagens.
| [0004] | 0 vírus | HSV-1 | pertence à família | do | vírus | da | herpes |
| e é um | tipo de | vírus | de DNA envelopado | que | causa | a | herpes |
| labial, | nos olhos e na | pele facial nos seres | vivos. | De | acordo |
com os estudos epidemiológicos, mais do que 60% da população foram infectados com vírus HSV-1. O genoma do vírus HSV-1 consiste de DNA linear de fita dupla de 152 kb, que compreende dois fragmentos ligados um ao outro: os fragmentos longos e curtos (Macdonald S.J., Mostafa HH, Morrison L.A., et a.., Genome sequence of herpex simplex vírus 1 strain KOS [J] . J. Virol, 2012, 86 (11) : 6371-6372) . O fragmento longo (região L) conta com cerca de 82% do genoma, enquanto os fragmentos curtos (região S) contam com cerca de 18% do genoma, e os fragmentos curtos e longos são ligados juntos por uma região de junção. A região L compreende um par de segmentos de repetição invertidos, o segmento entre eles é referido como um segmento único UL; a região S também tem um par de segmentos de repetição invertida, e o segmento entre
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4/113 eles é referido como um segmento único Us. No momento, todo o sequenciamento do genoma da cepa HSV-1 KOS foi completado. 0 genoma da cepa KOS compreende um total de 152011 bases de nucleotídeos, e compreende um total de 72 genes codificantes de proteínas, sendo que o segmento único UL compreende 56 genes, o segmento único Us compreende 12 genes, e o segmento de repetição invertido terminal UL (TRL) e a sequência de repetição invertido intermediário (IRl) compreendem cada um três genes idênticos (ICP34,5; ICPO, e LAT, respectivamente), o segmento de repetição invertido terminal Us (TRS) e a sequência de repetição invertida intermediária (IRs)compreendem, cada uma um gene idêntico (ICP4) .
[0005] Quando HSV-1 é abundantemente replicado, HSV-1 sintetiza as proteínas de uma maneira reguladora da cascata em nível de transcrição. Estas proteínas podem ser classificadas dentro de três tipos: CC, β, e γ de acordo com o tempo da ordem de suas sínteses. O vírus HSV-1 primeiro transcreve os genes do tipo (X que codifica cinco proteínas imediatas precoces (Proteínas IE), incluindo ICPO, ICP, ICP22, ICP27 e ICP47, que por sua vez ativa os genes do tipo b e g em nível de transcrição, e promove a expressão de proteínas precoce (E) e tardia (L) do vírus. A proteína imediata precoce ICPO pode ativar, independentemente, todos os tipos dos genes virais (ou seja, IE, E e L) bem como uma variedade de genes celulares (em alguns casos, a ativação sinergística do ICP4 pode ser requerida) . O ICPO não apenas interage com fatores múltiplos de transcrição intracelular ou proteínas regulatórias e ativa transcrição de certos genes em célula hospedeira, mas também regula a expressão do genoma viral e a transcrição do gene viral através de seu domínio
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5/113 funcional E3 ligase ubiquitina (Kawaguchi Y, Bruni, R, Roizman B., Interaction of herpes simplex virus 1 alpha regulartory protein ICpO with elongation fator ldelta: ICPO affects translational machinery [J] . J. Virol., 1997, 71 (2):1019-1024). ICp4 e ICP27 são proteínas precoces imediatas necessárias para replicação viral (DeLuca N.A., McCarthy A.M., Schaffer P.A. Isolation and characterization of deletion mutants of herpes simplex virus type 1 in the gene encoding immediate-early regulatory protein ICP4 [J] . J. Virol, 1985, 56 (2) : 558-570; Sacks WR, Greene C.C., Aschman D.P., et al., Herpes simplex virus type I ICP27 is na essential regulatory protein [J] . J. Virol, 1985, 55 (3) :
796-805). ICP27 é uma proteína regulatória multifuncional que promove a transcrição dos genes vitais por interação com a polimerase de RNA II, O ICP27 é capaz de interagir com ICP4 para ativar a expressão precoce e tardia do gene. O ICP27 também promove indiretamente a replicação do DNA viral por super-regulação dos genes associados de replicação viral. Em adição, ICP27 também tem a função de inibição do anelamento do RNA primordial celular e a promoção da translocação e tradução do mRNA viral. O ICP34,5 pode reverter a ação da proteína PKR antiviral, permitindo síntese do hospedeiro e da proteína viral para continuar facilitando assim, a replicação viral. Em adição, o ICP34.5 pode também evadir a resposta antiviral do hospedeiro por regulação da atividade fosfatase PPI (Randall G., Roizman, B. Transcription of the derepessed open Reading frame P of herpes simplex vírus 1 precludes the expression. Of the antisense gamma (1) 34.5 gene, e pode contar para a atenuação do vírus mutante {J] . J. Virol., 1997, 71 (10) : 7750-7757) .
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6/113 [0006] Atualmente, uma variedade de vetores virais HSV-1 oncolítico tem na fase pré-clínica ou pesquisa clínica, incluindo HSV1716, que foi obtida pelo nocaute do gene ICP34.5 na cepa mutante R3616 (derivada da cepa HSV-1 F) (MacKie R.M., Stweart B, Brown S.M., Intralesional injection of herpes simplex vírus 1716 in metastatic melanoma [J], Lancet, 2001, 357(9255): 525-526; e Papanastassiou V.,
Rampling R, Fraser M. et al.. O potencial para eficácia do virus herpes simplex (ICP 34.5(-)) modificado HSV1716 após a injeção intratumoral dentro do glioma maligno humano: uma prova de estudo principal [J). Gene Ther., 2002, 9(6): 398406); G207, que foi obtido pelo nocaute duplo de ICP34.5/ICP6 dos genes na cepa mutante R3616 (Markert J.M. Medlock M.D., Rabkin S.D., et al., Conditionally replicating herpes simplex vírus mutante, G207 for the treatment of malignant glioma: results of phase 1 trial [J). Gene Ther., 2000, 7(10); 867-874, e Markert J.J., Razdan S.N., Kuo H.C., et al., A phase 1 trial of oncolytic HSV-1, G207, dado em combinação com radiação para GBM recorrente demonstra segurança e radiográfica [J] . Mol. Ther., 2014, 22 (5) :10481055); NV1020, que foi obtido por deleção de uma cópia única do gene ICP34.5/ICpO/ICP4/UL56 na cepa mutante R7020 (derivado de cepa HSV-1 F) (Gutermann A., Mayer E, von DehnRothfelser K., et al., Efficacy of oncolytic herpesvirus NV1020 can be enhanced by combination with chemotherpauetics in colon carcinoma cells [J] . Hum Gene Ther., 2006, 2006 (12) :1241-1253; e Geevarghese S.K., Geller D.A., de Haan H.A., et al., Phase I/II study of oncolytic herpes simplex virus NV1020 in patients with extensively pretreated refractory colorectal cancer metastatic to the liver [J] .
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Hum. Gene Ther., 2010, 21 (9): 1119-1128); e T-VEC, que foi obtido por nocaute duplo do gene ICP34.5/ICP47 no HS1 HSV-1 isolado clínico (Liu B L, Robinson M, Han Z Q, et al., ICP34.5 deleted herpes simplex virus with enhanced oncolytic, imune stimulating, and anti-tumour properties [J]. Gene Ther, 2003, 10(4) : 292-303) . Na Amgen Company, USA, o vírus HSV- TVEC recombinante teve um avanço na fase II da triagem clínica dos pacientes com melanoma avançado, tornando-se o primeiro tipo de fármaco de vírus oncolítico terapêutico aprovado pelo FDA. Entretanto, os dados sugerem que esta triagem clínica apenas alcançou apenas um ponto extremo primário de duração da taxa de resposta (DRR) , mas não alcança um ponto extremo secundário da sobrevivência total melhorada (OS), apesar do grupo de tratamento T-VEC mostrou uma tendência favorável forte (Andtbacka, R.H., Kaufman H.L, Collichio F., et al. , Talimogene Laherparepvec Improves Durable Resposne Rate in Patients With Advanced Melanoma [J] . J. Clin. Oncol., 2015, 33(25): 2780-2788). Isto é principalmente devido ao T-VEC tem forte efeito colateral tóxico, e sua dose terapêutica intratumoral inicial é apenas 106 PFU do Vírus, que resulta na diminuição significante do efeito do tratamento tumoral e conduz o paciente à perda do melhor tempo para tratamento oncolítico.
[0007] Apesar da terapia oncolítica do vírus simplex herpes do tipo I tem certos resultados conseguidos nos anos atuais, a análise do vírus HSV-1 recombinante que foi introduzida no estudo clínico do tratamento de câncer mostrou que devido aos vírus oncolítico diferentes teve modificações genéticas diferentes, diferentes efeitos oncolítico e propriedades seguras, suas indicações de tumor e efeitos de tratamento de
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8/113 tumor são diferentes (Eager R M, Nemunaitis J. Clinical development directions in oncolytic virus therapy [J]. Cancer Gene Ther., 2011, 18(5); 3050317). Em geral, o virus oncolitico existente tem efeitos colaterais e tóxicos significantes, pobre segurança, e dose terapêutica limitada do virus oncolitico, que representa desafios severos para pesquisas de tratamento de tumor (Liu T.C., Galanis E., Kirn D., Clinical trial results with oncolytic virotherapy: a century of prompise, a decade of progress [J] . Nat. Clin. Pract Oncol., 2007, 4 (2) : 101-117) . O efeito terapêutico do virus oncolitico é positivamente correlacionado com a dose de virus administrado. Se a especificidade e a segurança do virus oncolitico não são altos o suficiente, a dose necessária do virus oncolitico pode ser limitada de modo a evitar sérios efeitos colaterais par ao corpo. Estes efeitos sérios do efeito de tratamento clinico do virus oncolitico e conduz a certos riscos de segurança. Tomando T-VEC de Amgen nos Estados Unidos como um exemplo, a toxicidade/efeito colateral do mesmo são fatores importantes limitantes dos efeitos clínicos de T-VEC. Apesar dos cientistas terem realizados experimentos com ele, nenhum vírus oncolitico foi encontrado até agora possa replicar em altos níveis nas células de tumor e morte de células tumorais sem causar sérios efeitos colaterais sobre células normais. Portanto, existe ainda uma necessidade de desenvolver novos vírus oncolitico para conseguir baixa toxicidade e alta eficácia de terapia do vírus oncolitico.
[0008] De modo a contornar as desvantagens acima mencionadas do vírus simplex herpes recombinantes na terapia de gene de tumores no estado da técnica, os inventores do
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9/113 presente pedido construído de um vírus simplex herpes recombinante novo que pode não apenas replica em um nível alto em uma célula de tumor e apresenta em uma letalidade alta sobre a célula de tumor, mas também tem um efeito colateral reduzido significativamente (especialmente neurotoxicidade). Portanto, o vírus herpes simplex recombinante d apresente invenção não apenas mantém um efeito terapêutico alto do vírus oncolítico, mas também melhora grandemente a segurança do vírus oncolítico.
Conteúdo da invenção [0009] Na presente invenção, os termos científicos e técnicos usados aqui tem o significado comumente entendido pelos técnicos no assunto, a menos que de outro modo indicado. Além disso, a cultura celular, genética molecular, química de ácido nucléico, e procedimentos laboratoriais imunológicos usados aqui são também etapas de rotina amplamente usadas no estado da técnica correspondente. Ademais, para um melhor entendimento da presente invenção, as definições e explicações de termos relacionados são providos abaixo.
[0010] Como usado aqui, o termo vírus recombinante HSV refere-se a um vírus HSV construído compreendendo uma mutação introduzida artificialmente quando comparado a um vírus HSV alelo-selvagem. Deve ser entendido que o vírus HSV recombinante da presente invenção não é limitado à sua maneira de produção. Por exemplo, o vírus HSV recombinante da presente invenção pode ser produzido por recombinação homóloga ou por cultivo de uma célula hospedeira infectada com o vírus HSV recombinante.
[0011] Como usado aqui, o termo vetor viral refere-se a
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10/113 um veículo deliberação de ácido nucléico que é construído com base no genoma viral e é capaz de carregar a sequência de nucleotídeo exógeno. Em geral, o vetor viral é capaz de se auto-replicar e/ou expressar os genes (endógenos e exógenos) compreendido dentro de uma célula hospedeira apropriada. O vetor viral pode compreender um genoma de um vírus do tipo alelo-selvagem intacto, ou um genoma viral que foi alterado ou mutado. Entretanto, por motivos de segurança, o vetor viral compreende preferivelmente e geralmente um genoma viral mutado ou modificado. Uma vez que o vetor viral da presente invenção é derivado a partir do genoma viral de HSV, o vetor viral da presente invenção pode também ser referido como um vetor viral HSV.
[0012] Como usado aqui, a expressão não expressa uma proteína funcional de interesse significa que quando uma célula é infectada com um vírus ou vetor viral ou genoma viral, o vírus ou vetor viral ou genoma viral é incapaz de produzir ou expressar uma proteína de interesse com atividade funcional biológica. Por exemplo, o vírus ou vetor viral ou genoma viral pode não produzir ou expressar a proteína de interesse em todo devido a uma deleção do gene, ou pode produzir ou expressar uma proteína de interesse sem a atividade funcional biologicamente devido a uma mutação de perda de função.
[0013] Como usado aqui, o termo mutação de perda de função refere-se a uma mutação que resulta na perda de atividade funcional biologicamente de uma proteína codificada e expressa pelo gene mutado. A mutação de perda de função inclui, mas não é limitada a, mutação com troca de sentido, mutação sem-sentido, mutação por deslocação do quadro de
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11/113 leitura, deleção de base, substituição base, adição de base, e qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, deleção ou substituição ou adição de um fragmento de gene), tanto quanto o gene compreendendo a mutação da perda de função não pode produzir ou expressar uma proteína tendo a atividade funcional biologicamente.
[0014] Como usado aqui, o termo gene essencial refere-se a um gene que é essencial para manter a sobrevivência e replicação de um vírus HSV. Os exemplos específicos de tais genes essenciais incluem, mas não estão limitados ao, gene ICP27 (ver, por exemplo, GenBank No. AFE62883.1), gene
| ICP4 (ver | , por exemplo | , GenBank No. | AFE62888.1) | , gene | VP 5 | ||
| (ver, por | exemplo, | GenBank No. AFE62846.1) | , gL | gene (ver, | |||
| por exemplo, GenBank 1 | 4o. AFE62828.: | 1) , gene gH | (ver, | por | |||
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62849.1), | gene | gD | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62894.1), | gene | gK | (see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62882. 1) | , gene gB | (see, | por | |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62855.1), | gene | gN | (see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62878.1), | gene | UL5 | (see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62832.1), | gene | UL6 | (see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62833.1), | gene | UL8 | (see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62835.1), | gene | UL9 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62836.1), | gene | UL12 | ( see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62839.1), | gene | UL25 | ( see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62852.1), | gene | UL26 | ( see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62853.1), | gene | UL28 | ( see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62856.1), | gene | UL29 | ( see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62857.1), | gene | UL30 | ( see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62858.1), | gene | UL33 | ( see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62861.1), | gene | UL36 | ( see, | por |
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| exemplo, | GenBank | No . | AFE62864.1), | gene | UL38 | ( see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62866.1), | gene | UL42 | ( see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62870.1), | gene | UL48 | ( see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62876.1), | gene | UL52 | ( see, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62881.1) . | Para | uma | descrição | |
| detalhada | dos genes es | senciais para | o vírus HSV, | see, | por |
exemplo, Roizman B, Knipe DM. Herpes simplex viruses and their replication. In: Knipe D M, Howley P M, editors. Fields Virology. 2nd ed. Vol 2. Philadelphia, PA Lippincot,
| Williams | and | Wilkins, 2 0 01: | 2399-2460; | Subak- | Sharpe J H, |
| Dargan D | J. | HSV molecular | biology: | general | aspects of |
herpes simplex virus molecular biology. Virus Genes, 1998, 16(3): 239-251.
[0015] Como usado aqui, o termo gene não-essencial refere-se a um gene que não é requerido para manter a sobrevivência e replicação de um vírus HSV. Em geral, tal gene no genoma viral HSV pode ser nocauteado (deletado) ou mutado sem afetar a sobrevivência e capacidade de replicação
| do vírus | HSV. Exemplos | específicos de | tais | genes | essenciais | ||
| incluem, | mas não | estão limitados ao, | gene | : UL3 | (ver, | por | |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62830.1), | gene | UL4 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62831.1), | gene | UL14 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62841.1), | gene | UL16 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62843.1), | gene | UL21 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62848.1), | gene | UL24 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62851.1), | gene | UL31 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62859. 1), | gene | UL32 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62860.1), | gene | US3 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62891.1), | gene | UL51 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62880.1), | gene | UL55 | (ver, | por |
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| exemplo, | GenBank | No . | AFE62884.1), | gene | UL56 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62885.1), | gene | US2 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62890.1), | gene | US12 | (ver, | por |
| exemplo, | GenBank | No . | AFE62901.1; ou | seja, | gene | ICP47) | , e |
gene LAT (ver, por exemplo,GenBank No. JQ673480.1) . Para uma descrição detalhda dos genes não-essenciais do virus HSV. Ver, por exemplo, Roizman B, Knipe D M. Herpes simplex viruses and their replication. In: Knipe D M, Howley P M, editors. Fields Virology. 2nd ed. Vol 2. Philadelphia, PA: Lippincot, Williams and Wilkins, 2001: 2399-2460; Subak-Sharpe J H, Dargan D J. HSV molecular biology: general aspects of herpes simplex virus molecular biology. Virus Genes, 1998, 16(3) : 239-251.
[0016] Como usado aqui, o termo proteína ICP0 refere-se a uma proteína de célula infectada 0 de um vírus HSV, que é codificado pelo gene RL2 e é um dos produtos de gene precoce imediatos do vírus HSV. A sequência de aminoácido da proteína IPC0 é conhecido e pode ser vista, por exemplo, no banco da dados públicos NCB1 (AFE62827.1).
[0017] Como usado aqui, o termo proteína ICP34.5 referese a uma proteína de célula infectada 34.5 de um vírus HSV, que é codificada pelo gene RL1 e é um dos produtos de gene precoce imediato do vírus HSV. A sequência de aminoácido da proteína ICP34.5 é conhecida e pode ser, por exemplo, no banco de dados públicos NCBI (AFE62826.1).
[0018] Como usado aqui, o termo proteína ICP27 refere-se a uma proteína de célula infectada 27 de um vírus HSV, que é codificado pelo gene UL54. A sequência de aminoácido do ICP27 da proteína é conhecido e pode ser visto, por exemplo, no banco de dados público NCBI (AFE62883.1).
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14/113 [0019] Como usado aqui, o termo proteína ICP4 refere-se a uma proteína de célula infectada 4 de um vírus HSV, que é codificado pelo gene RSI. A sequência de aminoácido da
| proteína | ICP4 | é conhecida e | pode | ser visto, | por | exemplo, | no |
| banco de | dados públicos NCBI | (AFE | 62888.1) . | ||||
| [0020] | Como | usado aqui, o | termo | proteína | VP5 | refere-se | a |
| uma proteína | de capsídeo | maior | de um vírus | HSV, que | é | ||
| codificado pelo gene UL19. | A sequência de aminoácido | da | |||||
| proteína | VP5 | é conhecida e | pode | ser visto, | por | exemplo, | no |
| banco de | dados públicos NCBI | (AFE62888.1) . | |||||
| [0021] | Como | usado aqui, o | termo | proteína | VP5 | refere-se | a |
| uma proteína | de capsídeo | maior | de um vírus | HSV, que | é | ||
| codificado pelo gene UL19. | A sequência de aminoácido | da | |||||
| proteína | VP5 | é conhecida e | pode | ser vista, | por | exemplo, | no |
| banco de | dados público NCBI | (AFE 62846.1). | |||||
| [0022] | Como | usado aqui, o ' | termo | gene ICP0' | ' refere-se a uma |
sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína ICPO em um genoma viral HSV. Como usado aqui, o termo gene ICP34.5 refere-se a uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína ICP34.5 em um genoma viral HSV. Como usado aqui, o termo gene ICp27 refere-se a uma sequência de nucleotídeo codificante de um proteína ICP27 em uma genoma viral HSV. Como usado aqui, o termo gene ICP4 refere-se a uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína ICP4 em um genoma viral HSV. Como usado aqui, o termo gene VP5 refere-se a uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína VP5 em um genoma viral HSV.
[0023] Como usado aqui, o termo sequência de nucleotídeo exógeno refere-se para uma sequência de nucleotídeo introduzido artificialmente que é exógeno em uma sequência
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15/113 original. As sequências de nucleotídeos exógenos incluem, mas não estão limitados a, qualquer gene não encontrado no genoma viral. Entretanto, em certos exemplos, preferivelmente, a sequência de nucleotídeo exógena codificante de um polipeptídio tendo uso terapêutico, tal como um polipeptídio imuno-modulatório, uma citocina, uma quimocina, um anticorpo, e um peptídeo citotóxico.
[0024] Como usado aqui, o termo polipeptídio imunomodulatório refere-se a um polipeptídio que modula uma função de uma célula imune, exemplos dos quais incluem, mas não estão limitados a, CD40L, OX40L, moléculas coestimulatório induzível (ICOS), FTL3L, LIGHT, CD137L, CD70, 4-1BB, G1TR, e CD28 (ver, por exemplo, Khalil DN, Smith E.L, Brent jens, RJ., et al., The Future of câncer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy [J] . Nat. Ver. Clin. Oncol., 2016, 13 (5):273-290).
Como usado aqui, o termo citocina tem o significado bem conhecido por aqueles técnicos no assunto. Entretanto, no método da presente invenção, quando o vírus recombinante da presente invenção é usado para tratar um tumor, é particularmente preferido que a citocina é uma citocina que pode ser usada para o tratamento do tumor. Exemplos de citocina incluem, mas não estão limitados a, interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-12, e IL-15), interferons (e.g., IFNoí, IFNp, IFNy) , fatores de necrose tumoral (por exemplo, (e.g., TNFa), fatores estimulatórios de colônia (e.g., GM-CSF), e qualquer combinação dos mesmos (ver, por exemple, Ardolino M, Hsu J, Raulet D H. Cytokine treatment in cancer immunotherapy [J] . Oncotarget, 2015, 6 (23) :
19346-19347 .
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16/113 [0025] Como usado aqui, o termo quimocina tem o significado bem conhecido pelos técnicos no assunto. Entretanto, no método da presente invenção, quando o vírus recombinante da presente invenção é usado para tratar um tumor, é particularmente preferido que a citocina é um quimocina capaz de ser usada para o tratamento tumor. Exemplos de quimocina incluem, mas não estão limitadas a, CCL2, RANTES, CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20, XCL-1, e qualquer combinação dos mesmos (Homey B, Muller A, Zlotnik A. CHEMOKINES: AGENTS FOR THE
IMMUNOTHERAPY OF CANCER? [J]. Nat Rev Immunol, 2002, 2:
175-184) .
[0026] Como usado aqui, o termo peptídeo citotóxico refere-se a um polipeptídio que é tóxico para uma célula ou induzir a apoptose, exemplos dos quais incluem, mas não estão limitados, timidina quinase TK (TK/GCV), TRAIL e FasL (ver, por exemplo, Candolfi M, King G D, Muhammad A G, et al. Evaluation of proapototic transgenes to use in combination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach for Glioblastoma multiforme (GBM) [J] . FASEB J, 2008, 22:
1077.13).
O termo anticorpo como usado aqui tem o significado bem conhecido pelos técnicos no assunto. Entretanto, no método da presente, quando o vírus recombinante da presente invenção é usado para tratar um tumor, é particularmente preferível que o anticorpo seja um anticorpo que pode ser usado para o tratamento do tumor. Exemplos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, anticorpos anti-PD-1, anticorpos anti-PDLl, anticorpos anti-TIGIT, anticorpos anti-BTLA, anticorpos anti-CTLA-4, anticorpos anti-Tim-3, anticorpos anti-Lag-3,
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17/113 anticorpos anti-CD137, anticorpos anti-OX40, anticorpos antiGITR, anticorpos anti-CD73, anticorpos anti-KIR, anticorpos anti-ICOS, anticorpos anti-CSFlR, anticorpos EGFR, anticorpos anti-VEGFR, anticorpos anti-HER2, e anticorpos anti-PDGFR (ver, por exemplo, Khalil D N, Smith E L, Brentjens R J, et al. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy [J] . Nat Rev Clin Oncol, 2016, 13 (5) : 273-290; and Hughes P E, Caenepeel S, Wu L C. Targeted Therapy and Checkpoint Immunotherapy Combinations for the Treatment of Cancer [J]. Trends Immunol, 2016, 37 (7): 462-476).
[0027] O termo veículo farmaceuticamente aceitável e/ou excipiente como usado aqui se refere a um veículo e/ou excipiente que é compatível farmacologicamente e/ou fisiologicamente com um indivíduo e um ingrediente ativo, que é bem conhecido da técnica (ver, por exemplo, Remington's Pharamceutical Sicences. Edited by Gennaro AR, 19th ed., Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), e inclui, mas não está limitado a, agentes de ajuste de pH, surfactantes, adjuvantes, melhoradores de resistência iônica. Por exemplo, agentes de ajuste pH incluem, mas não estão limitados, tampões fosfato, incluem surfactantes, mas não estão limitados a, surfactantes catiônicos, aniônicos, ou surfactantes não-iônicos, tais como Tween-80, adjuvantes, incluem, mas não estão limitados a, adjuvantes de alumínio (por exemplo, hidróxidos de alumínio), adjuvante de Freund's (por exemplo, adjuvante de Freund completo); melhoradores de resistência iônica incluem, mas não estão limitados a, cloreto de sódio.
[0028] Como usado aqui, o termo quantidade efetiva
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18/113 refere-se a uma quantidade suficiente para conseguir, ou pelo menos parcialmente conseguir, um efeito desejado. Por exemplo, uma quantidade profilaticamente efetiva refere-se a uma quantidade suficiente para prevenir, controlar, ou retardar um início de uma doença; uma quantidade terapeuticamente efetiva para uma doença refere-se a uma quantidade suficiente para curar ou em pelo menos parcialmente controlar a doença e complicações dos mesmos em um paciente já sofrendo de uma doença. Determinação de tais quantidades efetivas está dentro da capacidade dos técnicos no assunto. Por exemplo, a quantidade efetiva para uso terapêutico depende da severidade de uma doença a ser tratada, a condição total do sistema imune do próprio paciente, a condição geral do paciente tal como idade, peso e gênero, a forma de administração do fármaco, outros tratamentos simultaneamente aplicados, e assim por diante.
[0029] De modo a contornar as questões de segurança e os efeitos colaterais de existentes nos vírus HSV recombinantes para a terapia de tumor, os inventores do presente pedido construíram um novo vírus HSV recombinante que não expressa as proteínas ICPO e ICP34.5 funcionais (pro exemplo, cópia dupla dos genes ICPO e ICP34.5 foram deletados) . O vírus recombinante HSV da presente invenção tem um nível alto da capacidade de replicação em uma célula de tumor e é capaz de efetivamente matar várias células tumorais, mas mostram significativamente reduzida a capacidade de replicação e a capacidade de matar em uma célula normal. Além disso, foi também descoberto que o vírus HSV recombinante da invenção mostra significantemente uma neurotoxicidade reduzida em um animal e pode ser administrado em um animal em uma dose
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19/113 significativamente aumentada. Portanto, quando comparado com o vírus HSV recombinante existente, o vírus HSV recombinante da presente invenção não apenas mantém alta capacidade oncolítica, mas também mostra a segurança melhorada significante, portanto, pode ser administrada em uma dose superior e tem amplo prospecto de aplicação.
Vírus HSV recombinante [0030] Assim, em um aspecto, a invenção provê um vírus HSV recombinante, que não expressa uma proteína ICPO funcional e proteína ICP34.5.
[0031] Bem conhecidos para os técnicos no assunto, a expressão funcional de uma proteína de interesse (por exemplo, proteína ICP0 e/ou proteína ICP34.5) pode ser prevenido pela modificação de um gene codificante da proteína de interesse. Por exemplo, uma mutação da perda de função pode ser introduzida dentro de um gene codificante de uma proteína de interesse (por exemplo, a proteína ICP0 e/ou proteína ICP34.5), ou um gene codificante de uma proteína de interesse (por exemplo, a proteína ICP0 e/ou a proteína ICP34.5) podem ser deletadas ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, a sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena), prevenindo assim, a expressão funcional da proteína de interesse.
[0032] É conhecido pelos técnicos no assunto que o genoma do vírus HSV compreende duas cópias do gene ICP0 e duas cópias do gene ICP34.5. Portanto, de modo a prevenir a expressão funcional da proteína ICP0 e proteína ICP34.5 no vírus HSV recombinante, é necessário modificar simultaneamente as duas cópias do gene ICP0 e duas cópias do gene ICP34.5. Entretanto, seria facilmente entendido que as
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20/113 modificações das duas cópias o gene ICPO e as duas cópias do gene ICP34.5 (4 segmentos de nucleotídeos) são independentes entre eles, e podem ser os mesmos ou diferentes.
[0033] Assim, em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante tem um genoma no qual:
- as duas cópias do gene ICPO cada um independentemente compreende uma mutação de perda de mutação (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante uma proteína exógena);
- as duas cópias do gene ICP34.5 cada um independentemente compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena).
[0034] Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende as modificações a seguir:
- as duas cópias do gene ICP0 cada uma independentemente compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (pro exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena);
- as duas cópias do gene ICP34.5 cada uma compreende, independentemente, uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de
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21/113 nucleotídeo codificante de uma proteína exógena).
[0035] Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICPO compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de uma ou mais bases), e a outra cópia do gene ICPO compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICPO é deletada e a outra cópia do gene ICPO compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICPO é substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena), e a outra cópia do gene ICPO compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena).
[0036] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO compreende cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) . Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO
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22/113 compreende a mesma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO compreende diferentes mutações de perda de função. Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO compreende uma primeira mutação de perda de função e a segunda cópia do gene ICPO compreende uma mutação de perda de função. A primeira mutação de perda de função e a segunda mutação de perda de função pode ser a mesma ou uma diferente.
[0037] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são deletadas.
[0038] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO cada um é independentemente substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são substituídas com sequências de nucleotídeos exógenos diferentes (por exemplo, sequências de nucleotídeos codificantes das proteínas exógenas). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO é substituída com uma primeira sequência de nucleotídeos exógena e a segunda cópia do gene ICPO é substituído com uma segunda sequência de nucleotídeo exógena. A primeira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda sequência de nucleotídeo exógeno podem ser as mesmas ou diferentes.
[0039] Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICP34.5 compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases), e a outra cópia do gene ICP34.5 compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção,
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23/113 e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICP34.5 é deletada e a outra cópia do gene ICP34.5 compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição e uma ou mais bases) ou é deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICP34.5 é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena) e a outra cópia do gene ICP34.5 compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena).
[0040] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP34.5 compreende cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) . Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP34.5 compreende a mesma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP34.5 compreende diferentes mutações de perda de função. Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICP34.5 compreende uma terceira mutação de perda de função e a segunda cópia do gene ICP34.5 compreende
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24/113 uma quarta de mutação de perda de função. A terceira mutação
| de | perda | de | função | e a quarta mutação de perda | de | função pode | |
| ser | ' a mesma | ou uma | diferente. | ||||
| [0041] | Em | certas | concretizações | preferidas, | as | duas | cópias |
| do | gene | ICP34.5 são | deletadas. | ||||
| [0042] | Em | certas | concretizações | preferidas, | as | duas | cópias |
| do | gene | ICP34.5 são cada uma independentemente | substituído |
com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP34.5 são substituídas com a mesma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP34.5 são substituídas com diferentes sequências de nucleotídeos exógenas (por exemplo, as sequências de nucleotídeos codificantes da proteínas exógenas). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICP34.5 é substituída com uma terceira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda cópia do gene ICP34.5 é substituída com uma quarta sequência de nucleotídeo exógena. A terceira sequência de nucleotídeo exógena e a quarta sequência de nucleotídeo exógena pode ser a mesma ou diferente.
[0043] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO compreende cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases), e as duas cópias do gene ICp34.5 compreende cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de uma ou mais bases) . Por exemplo, em certas
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25/113 concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO compreende uma primeira mutação de perda de função, a segunda cópia do gene ICPO compreende uma segunda mutação de perda de função, e a primeira cópia do gene ICP34.5 compreende uma terceira mutação de perda de função, a segunda cópia do gene ICP34.5 compreende uma quarta mutação de perda de função. A primeira mutação de perda de função, a segunda mutação de perda de função, a terceira mutação de perda de função, e a quarta mutação de perda de função podem ser as mesmas ou diferentes.
[0044] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO compreende cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases), e as duas cópias do gene ICP34.5 são deletadas. Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO compreende uma primeira mutação de perda de função, a segunda cópia do gene ICPO compreende uma segunda mutação de perda de função; e as duas cópias do gene ICP34.5 são deletadas. A primeira mutação de perda de função e a segunda mutação de perda de função podem ser as mesmas ou diferentes.
[0045] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO compreendem cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de um ou mais bases), e as duas cópias do gene ICP34.5 são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos codificantes de uma proteína exógena). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO compreende uma primeira mutação
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26/113 de perda de função, a segunda cópia do gene ICPO compreende uma segunda mutação de perda de função; e a primeira cópia do gene ICP34.5 é substituída com uma terceira sequência de nucleotídeo exógena, e a segunda cópia do gene ICP34.5 é substituída com uma quarta sequência de nucleotídeo exógeno. A primeira mutação de perda de função e a segunda mutação de perda de função pode ser a mesma ou diferente. A terceira sequência de nucleotídeo exógena e a quarta sequência de nucleotídeo exógena pode ser a mesma ou diferente.
[0046] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICpO são deletadas, e as duas cópias do gene ICP34.5 compreende cada uma independentemente uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de uma ou mais bases). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são deletadas, e a primeira cópia do gene ICp34.5 compreende uma terceira mutação de perda de função e a segunda cópia do gene ICP34.5 compreende uma quarta mutação de perda de função. A terceira mutação de perda de função e a quarta mutação de perda de função podem ser a mesma ou diferente.
[0047] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são deletadas; e as duas cópias do gene ICP34.5 são deletadas. Em tais concretizações, o vírus recombinante HSV não expressa a proteína ICPO e a proteína ICP34.5. em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante tem deleções da sequência de base entre nt510 e nt5439 e a sequência de base entre ntl20802 e ntl25731 do genoma viral HSV-1 alelo selvagem.
[0048] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP50 são deletadas, e as duas cópias do gene ICP34.5
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27/113 é, cada uma independentemente substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são deletadas; e a primeira cópia do gene ICP34.5 é substituído com uma terceira sequência de nucleotídeo exógena, a segunda cópia do gene ICp34.5 é substituída com uma quarta sequência de nucleotídeo exógena. A terceira sequência de nucleotídeo exógena e a quarta sequência de nucleotídeos exógena podem ser as mesmas ou diferentes.
[0049] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP50 é cada uma independentemente substituída com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena), e as duas cópias do gene ICP34.5 compreende cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO é substituída com uma primeira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda cópia do gene ICpO é substituída com uma segunda sequência de nucleotídeo exógeno; a primeira cópia do gene ICP34.5 compreende uma mutação de perda de função, e a segunda cópia do gene ICP34.5 compreende uma quarta mutação de perda de função. A primeira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda sequência de nucleotídeo exógena podem ser as mesmas ou diferentes. A terceira mutação de perda de função e a quarta mutação de perda de função podem ser as mesmas ou diferentes.
[0050] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias
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28/113 do gene ICPO são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeo exógenas (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena), e as duas cópias do gene ICP34.5 é deletada. Por exemplo, em certas concretizações preferida, a primeira cópia do gene ICPO é substituído com uma primeira sequência de nucleotídeo exógena e o segundo gene ICPO é substituído com uma segunda sequência de nucleotídeo exógeno, as duas cópias do gene ICP34.5 são deletadas. A primeira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda sequência de nucleotídeo exógena podem ser as mesmas ou diferentes.
[0051] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeos exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena), e as duas cópias dos genes ICP34.5 são cada uma independentemente substituídos com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO é substituída com uma primeira sequência de nucleotídeo exógeno e a segunda cópia do gene ICPO é substituída com uma segunda sequência de nucleotídeos exógena; a primeira cópia do gene ICP34.5 é substituída com uma terceira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda cópia do gene ICP34.5 é substituído com uma quarta sequência de nucleotídeo exógeno. A primeira sequência de nucleotídeo exógena, a segunda sequência de nucleotídeo exógena, a terceira sequência de nucleotídeo exógena, e a quarta sequência de nucleotídeos exógena podem ser as mesmas ou
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29/113 diferentes .
[0052] Em certas concretizações preferidas, a primeira mutação de perda de função, a segunda mutação de perda de função, a terceira mutação de perda de função, e a quarta mutação de perda de função é, cada uma independentemente selecionada a partir de mutação com troca de sentido (missense), mutação sem-sentido, mutação do quadro de leitura, deleção de base, substituição de base, adição de base, e qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, deleção ou substituição ou adição de um fragmento de gene).
[0053] Em certas concretizações preferidas, a primeira sequência de nucleotídeo exógena, a segunda sequência de nucleotídeo exógena, a terceira sequência de nucleotídeo exógena, e a quarta sequência de nucleotídeo exógena cada uma independentemente codificam uma proteína exógena selecionada a partir do grupo consistindo de proteínas fluorescentes, polipeptídios imuno-moduladores, citocinas, quimocinas, anticorpos, e peptideos citotóxicos.
[0054] Em certas concretizações preferidas, a proteína fluorescente é selecionada a partir do grupo consistindo de proteína fluorescente verde (por exemplo, uma proteína fluorescente verde tendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 7), proteína fluorescente vermelha, proteína fluorescente azul, proteína fluorescente amarela, e qualquer combinação dos mesmos.
[0055] Em certas concretizações preferidas, o polipeptídio imuno-modulatório é selecionado a partir do grupo consistindo de CD40L, 0X40 L, molécula co-estimulatória induzível (ICOS), FTL3L, LIGHT, CD137L, CD70, 4-1BB, GITR, CD28, e qualquer combinação dos mesmos.
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30/113 [0056] Em certas concretizações preferidas, a citocina é selecionada a partir do grupo consistindo de interleucina (por exemplo, IL-2, IL-12, e IL-15), interferon (por exemplo, IFNa, ΙΓΝβ, ΙΓΝγ) , fato de necrose tumoral (por exemplo, TNFa), fator estimulante de colônia (e.g., GM-CSF), e qualquer combinação dos mesmos.
[0057] Em certas concretizações preferidas, a quimocina é selecionada a partir do grupo consistindo de CCL2, RANTES, CCL7, CCL9, CCL10, CCL1, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20, XCL1, e qualquer combinação dos mesmos.
[0058] Em certas concretizações preferidas, o peptídeo citotóxico é selecionado a partir do grupo consistindo de timidina quinase TK (TK/GCV), trail, FasL, e qualquer combinação dos mesmos.
[0059] Em certas concretizações preferidas, o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo de anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-PD-Ll, anticorpo anti-TIGIT, anticorpo anti-BTLA, anticorpo anti-CTLA-4, anticorpo anti-Tim-3, anticorpo anti-Lag-3, anticorpo anti-CD137, anticorpo anti-OX40, anticorpo anti-GITR, anticorpo antiCD73, anticorpo anti-KIR, anticorpo anti-ICos, anticorpo anti-CSFIR, anticorpo anti-EGFR, anticorpo anti-VEGFR, anticorpo anti-HER2, anticorpo anti-PDGFR, e qualquer combinação dos mesmos.
[0060] Nos últimos cinco anos, os fármacos do anticorpo contra PD-1 tem conseguido grande sucesso clínico e foram aprovados pelo FDA par ao tratamento de pacientes de tumor sólido tal como melanoma e câncer de pulmão. Entretanto, os estudos clínicos têm mostrado que os anticorpos anti-PD-1 são apenas efetivo em cerca de 30% de pacientes de tumor sólido.
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Isto pode ser devido às células T serem difíceis de penetrar dentro de um tumor sólido e não pode agir em uma célula de tumor dentro do tumor sólido junto com o anticorpo anti-PD-1. Sem estar ligado por qualquer teoria, os vírus HSV oncolítico não apenas buscam diretamente e matam as células de tumor, mas também induzem células imune (tal como células T) a infiltrar o tumor. Portanto, o uso combinado do vírus HSV recombinante da presente invenção e o anticorpo anti-PD-1 podem ser particularmente vantajosos para melhorar o efeito do tratamento de tumor, e têm grandes perspectivas de aplicação na imunoterapia do tumor. Consequentemente, em certas concretizações preferidas, a proteína exógena é um anticorpo anti-PD-Ll, um anticorpo anti-PD-1, ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, a proteína exógena é um anticorpo de cadeia única anti-PD-1.
[0061] Em certas concretizações preferidas, o vírus recombinante HSV é um vírus HSV-1 recombinante, um vírus HSV2 recombinante, ou um vírus quimérico HSV-l/HSV-2 (ou seja, um vírus HSV recombinante, cujo genoma compreende ambos, o DNA derivado de HSV-1 e o DNA derivado do HSV-2) . Em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante é derivado de uma cepa KSO de HSV-1.
[0062] Em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante é capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, uma proteína UL41 funcional (ou seja, proteína vhs), uma proteína UL48 funcional (ou seja, proteína VMW65), ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas concretizações preferidas, o vírus recombinante HSV é capaz de expressar uma proteína UL43 funcional. Em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante é capaz de expressar uma proteína
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UL41 funcional. Em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante é capaz de expressar uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o virus HSV recombinante é capaz de expressar uma proteína UL43 funcional e uma proteína UL41 funcional. Em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante é capaz de expressar uma proteína UL43 funcional e uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante é capaz de expressar uma proteína UL41 funcional e uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante é capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, uma proteína UL41 funcional, e uma proteína UL48 funcional.
[0063] Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreender um gene UL43 capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, um gene UL41 (ou seja, um gene vhs) capaz de expressar uma proteína UL41 funcional, e/ou um gene UL48 (ou seja, o gene VMW65) capaz de expressar uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL43 capaz de expressar uma proteína UL43 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL41 capaz de expressar uma proteína UL41 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL48 capaz de expressar uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL43 capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, e um gene UL41 capaz de expressar uma proteína UL41 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma
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33/113 do vírus HSV recombinante compreende um gene UL43 capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, e um gene UL48 capaz de expressar uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL41 capaz de expressar uma proteína UL41 funcional, e um gene UL48 capaz de expressar uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL43 capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, um gene UL41 capaz de expressar uma proteína UL41 funcional, e um gene UL48 capaz de expressar uma proteína UL48 funcional.
[0064] Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL43, um gene uL41 (ou seja, um gene vhs) , e/ou um gene UL48 (ou seja, um gene VMW65) , e o gene UL43, o gene UL41 e/ou o gene UL48 não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL4 3 que não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL41 que não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL4 8 que não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL43 e um gene USL 41 que não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus recombinante HSV compreende um gene UL43 e o gene UL48 que não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações, o genoma do vírus HSV recombinante compreende
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34/113 um gene UL41 e um gene UL48 que não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende um gene UL43, um gene UL41, e um gene UL48 que não compreende uma mutação por perda de função.
[0065] Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende ainda uma modificação na qual um ou mais genes não essenciais são deletados ou mutados (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou são substituídos com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, o gene não essencial é selecionado a partir do grupo consistindo do gene UL43, gene UL4, gene UL14, gene UL16, gene UL21, gene UL24, gene UL31, gene UL32, gene US3, gene UL51, gene UL55, gene UL56, gene US2, gene US12, (ou seja, gene ICP47), gene LAT, fragmento de nucleotídeo correspondente ao nt5853-nt7485 de JQ673480.1, e qualquer combinação dos mesmos. Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene UL3 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação por perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene UL4 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene UL14 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação por perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene UL16 é deletado ou mutado (por exemplo,
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35/113 compreende uma mutação por perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotideo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene UL21 é deletado ou mutado (pro exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotideo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene UL24 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotideo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene UL31 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotideo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene UL32 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotideo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene US3 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotideo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene UL51 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotideo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene UL55 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotideo exógena). Em certas
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36/113 concretizações preferidas, no genoma do virus HSV recombinante, o gene UL56 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene US2 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene US12 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, o gene LAT é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante, um fragmento de nucleotídeo correspondendo ao nt-5853-nt7485 de JQ673480.1 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena).
[0066] Em certas concretizações preferidas, no genoma do vírus HSV recombinante compreende ainda uma ou mais das seguintes modificações: deleção ou mutação em um ou mais dos: gene UL55, gene US2, gene LAT, e fragmento de nucleotídeo correspondente ao nt-5853-nt7485 de JQ673480.1 (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende ainda as seguintes modificações: deleção ou
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37/113 mutação do gene UL55, gene US2, gene LAT, ou fragmento de nucleotídeo correspondente ao nt-5853-nt7485 de JQ673480.1 (por exemplo, compreendendo uma mutação de perda de função ou sendo substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno).
[0067] Em certas concretizações preferidas, o gene essencial do vírus HSV recombinante não é deletado e não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, a sequência codificante para o gene essencial do vírus HSV recombinante não é deletado ou mutado. Em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante não é deletado ou mutado. Em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante é capaz de expressar todos os genes essenciais. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende todos os genes essenciais. E nenhum dos genes essenciais compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende todos os genes essenciais, e nenhuma das sequências codificantes dos genes essenciais compreende uma mutação. Em geral, os genes essenciais são essenciais para sobrevivência e replicação dos vírus HSV e, portanto, no vírus HSV recombinante, nenhum dos genes essenciais compreende uma mutação de perda de função. Portanto, é prontamente entendido que o promotor de tal gene essencial pode ser construído (por exemplo, o promotor nativo do gene essencial pode ser substituído com um promotor específico para tumor, tal como um promotor de hTERT), melhorando assim, ainda mais a segurança do vírus HSV recombinante sem afetar a função/propriedade do vírus HSV recombinante da invenção. Assim, em certas concretizações preferidas, no genoma do
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38/113 vírus HSV recombinante, o promotor nativo de um ou mais genes essenciais é substituído com um promotor de tumor específico, tal como um promotor de hTERT. Em certas concretizações preferidas, o gene essencial é selecionado a partir do grupo consistindo de gene ICP27, gene ICP4, gene VP5, gene gL, gene gH, gene gD, gene gK, gene gB, gene gN, gene UL5, gene UL6, gene UL8, Gene UL9, gene UL12, gene UL25, gene UL26, gene UL28, gene UL29, gene UL30, gene UL33, gene UL36, gene UL38, gene UL42, gene UL48, gene UL52, e qualquer combinação dos mesmos.
[0068] Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende todos os outros genes de vírus HSV alelo-selvagem, exceto para as duas cópias do gene ICPO e duas cópias dos gene ICP34.5 como descrito acima, e nenhum dos outros genes compreende uma mutação de perda de função. Entretanto, é prontamente entendido que um promotor dos outros genes pode ser construído (por exemplo, um promotor nativo pode ser substituído com um promotor tumorespecífico, tal como um promotor de hTERT), melhorando ainda, adicionalmente a segurança do vírus HSV recombinante. Assim, em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende ainda uma modificação na qual um promotor nativo de um ou mais genes HSV é substituído com um promotor tumor-específico, tal como um promotor de hTERT. Em certas concretizações preferidas, o gene HSV é selecionado a partir do grupo consistindo do gene VP5, gene ICP27, e gene ICP4 .
[0069] Em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo consistindo de:
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39/113 (1) substituição de um promotor nativo do gene Vp5 com um promotor tumor especifico, tal como um promotor de hTERT;
(2) substituição de um promotor nativo do gene ICP27 com um promotor tumor-específico, tal como um promotor de hTERT;
(3) substituição de um promotor nativo do gene ICP4 com um promotor de tumor específico, tal como um promotor hTERT;
(4) deleção ou mutação de um ou mais dos genes UL55, gene US2, gene 1AT, e o fragmento de nucleotídeo correspondente ao nt5853-nt7485 de JQ673480.1 (por exemplo, compreendendo uma mutação de perda de função, ou sendo substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena).
[0070] Em certas concretizações preferidas, o promotor hTERT tem uma sequência representada na SEQ ID NO:5.
[0071] Em adição, o vírus HSV recombinante da invenção pode também ser modificado para carregar uma ou mais sequências de nucleotídeos exógenas. Por exemplo, em certas concretizações preferidas, o genoma do vírus HSV recombinante compreende ainda uma quinta sequência de nucleotídeo exógena. Em certas concretizações preferidas, a quinta sequência de nucleotídeo exógena codifica uma proteína exógena selecionada a partir do grupo consistindo de proteína fluorescente, polipeptídio imuno-modulatório, citocina, quimocina, anticorpo, e peptídeo citotóxico.
[0072] No presente pedido, uma mutação de perda de função pode ser introduzida dentro de vários genes virais como mencionado acima pela técnica bem conhecida da técnica. Por exemplo, uma mutação de perda de função pode ser introduzida dentro de um gene viral por deleção, substituição, ou inserção de uma base de modo a inativar funcionalmente o gene viral. Em certas concretizações exemplificativas, o gene
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40/113 viral é funcionalmente inativado por deleção (por exemplo, deleção do gene todo ou uma porção do mesmo) . Em tais concretizações, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, ou 100% de uma sequência de um gene viral de interesse pode ser deletada, ou pelo menos 10% bp, pelo menos 100 bp, ou pelo menos lOOObp de uma sequência de um gene viral de interesse pode ser deletado. Em certas concretizações exemplificativas, uma mutação de estrutura de leitura é induzida por inserção ou deleção de uma base de modo a inativar funcionalmente o gene viral. Em certas concretizações exemplificativas, o gene viral é funcionalmente inativado por substituição do gene inteiro de interesse ou de uma porção do mesmo com uma sequência de nucleotídeo exógena.
Vetor viral:
[0073] Em um outro aspecto, a invenção provê um vetor viral compreendendo o genoma do vírus HSV recombinante de acordo com a invenção ou consistir do genoma do vírus HSV recombinante de acordo com a invenção.
[0074] Em um outro aspecto, a invenção provê um vetor viral compreendendo ou consistindo de um genoma HSV mutado que não expressa a proteína ICPO funcional e a proteína ICP34.5.
[0075] Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, as duas cópias do gene ICPO compreendem, cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena); as duas cópias do gene ICP34.5 compreendem cada uma independentemente
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41/113 uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena).
[0076] Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende as modificações a seguir:
- as duas cópias do gene ICPO compreendem, cada uma independentemente, uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena);
- as duas cópias do gene ICP34.5 compreendem, cada uma independentemente, uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena).
[0077] Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICPO compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) e a outra cópia do gene ICPO compreende uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICPO é deletado e a outra cópia do gene ICPO compreende uma mutação de perda de função (por exemplo,
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42/113 adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICPO é substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena), e a outra cópia do gene ICPO compreende uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena).
[0078] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene compreendem, cada uma independentemente, uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases). Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO compreendem as mesmas mutações de perda de função. Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO compreendem diferentes mutações de perda de função. Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO compreende uma primeira mutação de perda de função e a segunda cópia do gene ICPO compreende uma segunda mutação de perda de função. A primeira mutação de perda de função e a
| segunda | mutação de | perda de função pode ser | a mesma | ou uma | |
| diferente. | |||||
| [0079] | Em | certas | concretizações preferidas, | as duas | cópias |
| do gene | ICPO | são deletadas. | |||
| [0080] | Em | certas | concretizações preferidas, | as duas | cópias |
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43/113 do gene ICPO são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são substituídas com a mesma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são substituídas com sequências de nucleotídeos exógenas diferentes (por exemplo, sequências de nucleotídeos codificantes das proteínas exógenas). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO é substituída com uma primeira sequência exógena do nucleotídeo e a segunda cópia do gene ICPO é substituída com uma segunda sequência de nucleotídeo exógena. A primeira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda sequência de nucleotídeo exógena podem ser as mesmas ou uma diferente.
[0081] Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICP34.5 compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases), e a outra cópia do gene ICP34.5 compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICP34.5 é deletada e a outra cópia do gene ICP34.5 compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletada ou substituída com uma sequência de
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44/113 nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, uma cópia do gene ICP34.5 é substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena) e a outra cópia do gene ICP34.5 compreende uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos codificantes de uma proteína exógena).
[0082] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP34.5 compreendem, cada uma independentemente, uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) . Em certas concretizações, as duas cópias do gene ICP34.5 compreendem a mesma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP34.5 compreendem diferentes mutações de perda de função. Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICP34.5 compreende uma terceira mutação por perda de função e a segunda cópia do gene ICP34.5 compreende uma quarta mutação por perda de função. A terceira mutação por perda de função e a quarta mutação por perda de função podem ser as mesmas ou diferentes.
[0083] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP34.5 são deletadas.
[0084] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP34.5 são, cada uma independentemente, substituídas com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma
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45/113 sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP34.5 são substituídas com a mesma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos codificantes de uma proteína exógena). Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICP34.5 são substituídas com diferentes sequências de nucleotídeos exógenas (por exemplo, sequências de nucleotídeos codificantes de proteínas exógenas). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICP34.5 é substituída com uma terceira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda cópia do gene ICP34.5 é substituída com a quarta sequência de nucleotídeo exógena. A terceira sequência de nucleotídeo exógena e a quarta sequência de nucleotídeo exógena podem ser as mesmas ou diferentes.
[0085] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO compreendem, cada uma independentemente, uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de uma ou mais bases), e as duas cópias do gene ICP34.5 compreendem, cada uma independentemente, uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) . Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO compreende uma primeira mutação de perda de função, a segunda cópia do gene ICPO compreende uma segunda mutação por perda de função, e a primeira cópia do gene ICP34.5 compreende uma terceira mutação de perda de função, a segunda cópia do gene ICP34.5 compreende uma quarta mutação de perda de função. A primeira mutação de perda de função, a segunda mutação de perda de função, a terceira mutação de perda de função, e a
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46/113 quarta mutação de perda de função podem ser as mesmas ou diferentes.
[0086] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO compreendem cada uma independentemente, uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) e as duas cópias do gene ICP34.5 são deletadas. Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO compreende uma primeira mutação de perda de função, a segunda cópia do gene ICPO compreende uma segunda mutação de perda de função e, as duas cópias do gene ICP34.5 são deletadas. A primeira mutação de perda de função e a segunda mutação de perda de função podem ser as mesmas ou diferentes.
[0087] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO compreendem cada uma independentemente, uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases), e as duas cópias do gene ICP34.5 são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO compreende uma primeira mutação de perda de função, a segunda cópia do gene ICPO compreende uma segunda mutação de perda de função; e a primeira cópia do gene ICP34.5 é substituída com uma terceira sequência de nucleotídeo exógena, e a segunda cópia da gene ICP34.5 é substituída com uma quarta sequência do nucleotídeo exógeno. A primeira mutação de perda de função e a segunda mutação de perda de função pode ser a mesma ou diferente. A terceira sequência de nucleotídeo exógena e a quarta sequência de
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47/113 nucleotideo exógena pode ser a mesma ou diferente.
[0088] Em certas concretizações preferidas. As duas cópias do gene ICPO são deletadas, e as duas cópias do gene ICP34.5 compreendem cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são deletadas; e a primeira cópia do gene ICP34.5 compreendem uma terceira mutação de perda de função e a segunda cópia do gene ICP34.5 compreendem uma quarta mutação de perda de função. A terceira mutação por perda de função e a quarta mutação por perda de função podem ser as mesmas ou diferentes.
[0089] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são deletadas, e as duas cópias do gene ICP34.5 são deletadas. Em tais concretizações, o vetor viral não compreende um gene codificante da proteína ICPO e um gene codificante da proteína ICP34.5. Em certas concretizações preferidas, o genoma do HSV mutado perde uma sequência base entre os nt510 e nt5439 e uma sequência de base entre ntl20802 e ntl25731 do genoma viral de HSV-1 alelo-selvagem.
[0090] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são deletadas; e as duas cópias do gene ICp34.5 são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotideo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotideo codificante de uma proteína exógena). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICpO são deletadas; e a primeira cópia do gene ICp34.5 é substituída com uma terceira sequência de nucleotideo exógena; a segunda cópia do gene ICP34.5 é substituída com uma quarta sequência de nucleotideo exógena.
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A terceira sequência de nucleotídeo exógena e a quarta sequência de nucleotídeo exógena podem ser as mesmas ou diferentes.
[0091] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeo exógenas (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos codificante de uma proteína exógena), e as duas cópias do gene ICP34.5 compreendem, cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICpO é substituído com uma primeira sequência de nucleotídeos exógena e a segunda cópia do gene ICPO é substituída com uma segunda sequência de nucleotídeos exógena; a primeira cópia do gene ICP34.5 compreende uma terceira mutação de perda de função, e a segunda cópia do gene ICP34.5 compreende uma quarta mutação de perda de função. A primeira sequência de nucleotídeos exógena e a segunda sequência de nucleotídeos exógena podem ser as mesmas ou diferentes. A terceira mutação de perda de função e a quarta mutação de perda de função podem ser as mesmas ou diferentes.
[0092] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeo exógenas (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena), e as duas cópias do gene ICP34.5 são deletadas. Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO é substituída com uma primeira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda cópia do gene ICPO é
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49/113 substituída com uma segunda sequência de nucleotídeos exógena, as duas cópias do gene ICP34.5 são deletadas. A primeira sequência de nucleotídeos exógena e a segunda sequência de nucleotídeo exógena podem ser as mesmas ou diferentes.
[0093] Em certas concretizações preferidas, as duas cópias do gene ICPO são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeos exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena), e as duas cópias do gene ICP34.5 são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeo (por exempli, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena). Por exemplo, em certas concretizações preferidas, a primeira cópia do gene ICPO é substituída com uma primeira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda cópia do gene ICPO é substituída com uma segunda sequência do nucleotídeo exógeno, a primeira cópia do gene ICP34.5 é substituída com a terceira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda cópia do gene ICP34.5 é substituída com uma terceira sequência de nucleotídeo exógena e a segunda cópia do gene ICP34.5 é substituída com a quarta sequência de nucleotídeo exógena. A primeira sequência de nucleotídeo exógena, a segunda sequência de nucleotídeo exógena, a terceira sequência de nucleotídeo exógena, e a quarta sequência de nucleotídeo exógena podem ser as mesmas ou diferentes .
[0094] Em certas concretizações preferidas, a primeira mutação de perda de função, a segunda mutação de perda de função, a terceira mutação de perda de função, e a quarta mutação de perda de função é, cada uma independentemente
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50/113 selecionada a partir do grupo consistindo de mutação por troca de sentido (missense), mutação sem-sentido, mutação da estrutura/quadro de leitura, deleção de base, substituição de base, adição de base, e qualquer combinação das mesmas (por exemplo, deleção ou substituição ou adição do fragmento de gene) .
[0095] Em certas concretizações preferidas, a primeira sequência de nucleotídeo exógena, a segunda sequência de nucleotídeo exógena, a terceira sequência de nucleotídeo exógena, e a quarta sequência de nucleotídeo exógena codifica, cada uma independentemente, uma proteína exógena selecionada a partir do grupo consistindo de proteína fluorescente, polipeptídio imuno-modulatório, citocina, quimocina, anticorpo, e peptídeo citotóxico.
[0096] Em certas concretizações preferidas, a proteína fluorescente é selecionada a partir do grupo consistindo de proteína fluorescente verde (por exemplo, proteína fluorescente verde tendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:7), proteína fluorescente vermelha, proteína fluorescente azul, proteína fluorescente amarela, e qualquer combinação dos mesmos.
[0097] Em certas concretizações preferidas, o polipeptídio imuno-modulatório é selecionado a partir do grupo consistindo de CD40L, OX40L, moléculas co-estimulatórias induzíveis (ICOS), FTL3L, LIGHT, CD137L, CD70, 4-1BB, GITR, CD28, e qualquer combinação dos mesmos.
[0098] Em certas concretizações preferidas, a citocina é selecionada a partir do grupo consistindo de interleucina (por exemplo, IL-2, IL-12, e IL-15), interferons (por exemplo, IFNa, IFNp, IFNy), fator de necrose tumoral (por
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51/113 exemplo, TNFa), fator estimulante de colônia (por exemplo, GM-CSF), e qualquer combinação dos mesmos.
[0099] Em certas concretizações preferidas, a quimocina é selecionada a partir do grupo consistindo de CCL2, RANTEs, CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20, XCL-1, e qualquer combinação dos mesmos.
[0100] Em certas concretizações preferidas, o peptídeo citotóxico é selecionado a partir do grupo consistindo de timidina quinase TK (TK/GCV), TRAIL, FasL, e qualquer combinação dos mesmos.
Em certas concretizações preferidas, o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo de: anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-PD-Ll, anticorpo anti-TIGIT, anticorpo anti-BTLA; anticorpo anti-CTLA-4, anticorpo anti-Tim-3, anticorpo anti-Lag-3, anticorpo anti-CD137; anticorpo anti-OX40; anticorpo anti-GITR, anticorpo antiCD73; anticorpo anti-KIR; anticorpo anti-ICOS, anticorpo anti-CSFlR, anticorpo anti-EGFR; anticorpo anti-VEGFR; anticorpo anti-HER2; anticorpo anti-PDGFR; e qualquer combinação dos mesmos.
[0101] Em certas concretizações preferidas, a proteína exógena é um anticorpo anti-PD-Ll, um anticorpo anti-PD-1, ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, a proteína exógena é um anticorpo de cadeia única anti-PD-1.
[0102] Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado é derivado de um vírus HSV-1, um vírus HSV-2, ou um vírus quimérico HSV-l/HSV-2 (ou seja, um vírus HSV recombinante cujo genoma compreende ambos, um DNA derivado de HSV-1 e um DNA derivado de HSV-2) . Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado é derivado de um genoma de
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52/113 uma cepa HSV-1 KOS. Em certas concretizações preferidas, ο genoma HSV mutado é derivado de um genoma representado no GenBank: HQ673480.1 [0103] Em certas concretizações preferidas, o genoma mutado HSV é capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, uma proteína UL41 funcional (ou seja, uma proteína vhs), uma proteína UL48 funcional (ou seja, uma proteína VMW65), ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado é capaz de expressar uma proteína UL43 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado é capaz de expressar uma proteína UL41 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado é capaz de expressar uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado é capaz de expressar uma proteína UL43 funcional e uma proteína UL41 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado é capaz de expressar uma proteína UL43 funcional e uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado é capaz de expressar uma proteína UL41 funcional e uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado é capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, uma proteína UL41 funcional, e uma proteína UL48 funcional.
[0104] Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende um gene UL43 capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, um gene UL41 (ou seja, um gene vhs) capaz de expressar uma proteína UL41 funcional, e/ou um gene UL48 (ou seja, um gene VMW65) capaz de expressar uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende um gene UL43 capaz de expressar uma
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53/113 proteína UL43 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende um gene UL41 capaz de expressar uma proteína UL41 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende um gene UL48 capaz de expressar um a proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende um gene UL43 capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, e um gene UL41 capaz de expressar uma proteína UL41 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende um gene UL43 capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, e um gene UL48 capaz de expressar uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende um gene UL41 capaz de expressar uma proteína UL41 funcional, e um gene UL48 capaz de expressar uma proteína UL48 funcional. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende um gene UL43 capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, um gene UL41 capaz de expressar uma proteína U141 funcional, e um gene UL48 capaz e expressar uma proteína UL48 funcional.
[0105] Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende um gene UL43, um gene UL41 (ou seja, um gene vhs) , e/ou um gene UL48 (ou seja, um gene VMW65) , e o gene UL43, o gene UL41, e/ou o gene UL48 não compreendem uma mutação por perda de função. Em certas concretizações, o genoma HSV mutado compreende um gene UL41 que não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações, o genoma HSV mutado compreende um gene UL48 que não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende um gene UL43 e um gene UL41 que não compreende uma mutação de perda de função.
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Em certas concretizações, o genoma HSV mutado compreende um gene UL4 3 e um gene UL4 8 que não compreendem uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende um gene UL41 e um gene UL48 que não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, o genoma mutado HSV compreende um gene UL4 3, um gene UL41, e um gene UL4 8 que não compreende uma mutação de perda de função.
[0106] Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende adicionalmente, uma modificação no qual um ou mais genes não-essenciais são deletados ou mutados (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou são substituídos com uma sequência de nucleotídeos exógeno). Em certas concretizações preferidas, o gene não-essencial é selecionado a partir do grupo consistindo do gene UL32, gene UL4, gene UL14, gene UL16, gene UL21, gene UL24, gene UL31, gene UL32, gene US3, gene UL51, gene UL55, gene UL56, gene US2, gene UL12 (ou seja, gene ICP47), gene LAT, fragmento de nucleotídeo correspondente aos nt5853-nt7485 de JQ673480.1, e qualquer combinação dos mesmos. Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene UL3 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda funcional, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógenos). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene UL4 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene UL14 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de
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55/113 nucleotídeo exógeno). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene UL16 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene UL21 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene UL24 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituída com uma sequência de nucleotídeo exógeno). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene UL31 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene UL32 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene US3 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene UL51 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene UL55 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV
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56/113 mutado, o gene UL5 6 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutada, o gene US2 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene US12 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, o gene LAT é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno). Em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, um fragmento de nucleotídeo de nt5853-nt7485 correspondente ao JQ673480.1 é deletado ou mutado (por exemplo, compreende uma mutação de perda de função, ou é substituído com uma sequência de nucleotídeos exógenos).
[0107] Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende adicionalmente uma ou mais das seguintes modificações: deleção ou mutação de um ou mais dos genes UL55, gen US2, gene LAT, e fragmento de nucleotídeo correspondente ao nt5853-nt7485 de JQ673480.1 (por exemplo, compreendendo uma mutação de perda de função, ou ser substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena). Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende ainda uma modificação; deleção ou mutação de gene UL55, gene US2, gene LAT, ou fragmento de nucleotídeo correspondente ao nt5853-nt7485 de JQ673480.1 (por exemplo,
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57/113 compreendendo uma mutação de perda de função ou sendo substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena).
[0108] Em certas concretizações preferidas, o gene essencial no genoma HSV mutado não é deletado e não compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, a sequência codificante do gene essencial no genoma HSV mutado não é deletado ou mutado. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado é capaz de expressar todos os genes essenciais. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende todos os genes essenciais, e nenhum dos genes essenciais compreende uma mutação de perda de função. Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende todos os genes essenciais, e nenhuma das sequências codificantes dos genes essenciais compreende uma mutação. Em geral, os genes essenciais são essenciais para sobrevivência e replicação do vírus HSV e, portanto, no genoma do vírus HSV recombinante, nenhum dos genes essências compreende uma mutação de perda de função. Entretanto, é prontamente entendido que um promotor de tal gene essencial pode ser construído (por exemplo, um promotor nativo do gene essencial é substituído com um promotor tumor-específico, tal como um promotor de hTERT), melhorando assim a segurança do vírus HSV recombinante sem afetar a função/propriedades do vírus HSV recombinante da invenção. Assim, em certas concretizações preferidas, no genoma HSV mutado, um promotor nativo de um ou mais dos genes essenciais é substituído com um promotor tumor-específico, tal como um promotor de hTERT. Em certas concretizações preferidas, o gene essencial é selecionado a partir do grupo consistindo do gene ICP27, gene ICP4, gene
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VP5, gene gL, gene gH, gene gD, gene gK, gene gB, gene gN,
| gene UL5, | gene | UL6, Gene UL8, gene | UL9, | gene | UL12, | gene |
| UL25, gene | UL2 6 | , gene UL28, gene | UL2 9, | gene | UL30, | gene |
| UL33, gene | UL36 | , gene UL38, gene | UL42, | gene | UL48, | gene |
UL52, e qualquer combinação dos mesmos.
[0109] Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende todos os outros genes do vírus HSV alelo-selvagem, exceto para as duas cópias do gene ICPO e as duas cópias do gene ICP34.5 como descrito acima, e nenhum dos outros genes compreende uma mutação de perda de função. Entretanto, é prontamente entendido que um promotor de outros genes pode ser construído (por exemplo, um promotor nativo pode ser substituído com um promotor tumor-específica, tal como promotor de hTERT), melhorando assim, a segurança do vírus HSV recombinante sem afetar as funções/propriedades do vírus HSV recombinante da invenção. Assim, em certas concretizações, preferidas, o genoma HSV mutado compreende ainda as modificações a seguir: um promotor nativo de uma ou mais de genes HSV é substituído com um promotor tumor-específico, tal como um promotor de hTERT. Em certas concretizações preferidas, os genes HSV são selecionados a partir do grupo consistindo no gene VPS, gene ICP27, e gene ICP4.
[0110] Em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo consistindo de:
(1) substituição de um promotor nativo do gene VP5 com um promotor tumor específico, tal como um promotor de hTERT;
(2) substituição de um promotor nativo do gene ICP27 com um promotor tumor específico, tal como um promotor de hTERT;
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59/113 (3) substituição de um promotor nativo do gene iCP4 com um promotor tumor especifico, tal como um promotor hTERT;
(4) deleção ou mutação de um ou mais dos genes UL55, o gene US2, o gene LAT, e o fragmento de nucleotídeo correspondente ao nt5853-nt7485 de JQ673480.1 (por exemplo, compreendendo uma mutação de perda de função, ou sendo substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena).
[0111] em certas concretizações preferidas, o promotor hTERT tem a sequência representada na SEQ ID NO:5.
[0112] Em adição, o genoma HSV mutado pode também ser modificado para carregar ou mais sequências de nucleotídeos exógenos. Por exemplo, em certas concretizações preferidas, o genoma HSV mutado compreende ainda uma quantia sequência de nucleotídeos exógena. Em certas concretizações preferidas, a quinta sequência de nucleotídeo exógena codifica uma proteína exógena selecionada a partir do grupo consistindo de proteína fluorescente, polipeptídio imuno-modulatório, citocina, quimocina, anticorpo, e peptídeo citotóxico.
Célula hospedeira:
[0113] Em um outro aspecto, a invenção provê uma célula hospedeira, que é infectada com um vírus HSV recombinante de acordo com a invenção, ou compreende o genoma do vírus HSV recombinante de acordo com a invenção, ou é transfectados com um vetor viral de acordo com a invenção. Tal célula hospedeira inclui, mas não é limitado a, célula procariótica, tal como célula E. coli, e célula eucariótica, tal como células de leveduras, células de insetos, células de planta, e célula animal (por exemplo, célula de mamífero, tal como célula de camundongo, célula humana, etc..). O vírus HSV recombinante da presente invenção tem alta capacidade de
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60/113 replicação em uma célula de tumor, mas apenas replica em um nível baixo em uma célula normal. Assim, em certas concretizações particularmente preferidas, a célula é uma célula de tumor. Tais célula de tumor incluem, mas não estão limitadas a, célula de câncer de pulmão (por exemplo, Huh7, Hep3B, HepG2, GSG7701, SMMC7721, Hepal-6, BEL7404, PLC/PRF e QGY7703); célula de câncer de mama (e.g., MADMB231, MCF7 e MADMB468); célula de osteosarcoma (e.g., U2OS e SAOS2); célula de câncer ovariano (e.g., SKOV3 e CAOV3); célula de câncer cervical (e.g., SiHA e Hela); célula de câncer de próstata (e.g., PC-3); célula de glioma (e.g., U87MG); célula de melanoma (e.g., A375); célula de câncer coloretal (e.g., HCT116) e célula de câncer pancreático (e.g., Panc-1).
Preparação [0114] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método de preparação de um vírus HSV recombinante da invenção, compreendendo:
(1) cultivar uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção;
(2) coletar e lisar a célula hospedeira após a célula hospedeira ter passado por uma lesão, para obter um lisado da célula hospedeira; e (3) recuperar o vírus HSV recombinante da presente invenção a partir do lisado.
Composição farmacêutica [0115] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o vírus HSV recombinante de acordo com a invenção, ou o genoma do vírus HSV recombinante de acordo com a invenção, ou o vetor viral
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61/113 de acordo com a invenção, e uma veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada para tratamento de um tumor, tal como câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de mama, osteosarcoma, câncer ovariano, câncer de próstata, glioma, melanoma, câncer coloretal, e câncer pancreático.
[0116] A composição farmacêutica da invenção pode ser administrada pelos métodos bem conhecido da técnica tal como, mas não limitado a, administração por injeção. Em certas concretizações preferidas, a composição farmacêutica da invenção é administrada por injeção (por exemplo, injeção intratumoral). Em certas concretizações preferidas, a composição farmacêutica da invenção é uma solução injetável ou um pó liofilizado.
[0117] Em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante ou o genoma do vírus HSV recombinante ou o vetor viral está presente em uma quantidade terapeuticamente efetiva (por exemplo, uma quantidade terapeuticamente efetiva no tratamento tumoral). Em certas concretizações preferidas, a composição farmacêutica da invenção foi apresentada em uma forma de dosagem unitária. Por exemplo, mas não pretende se limitar a invenção, a quantidade do vírus HSV recombinante compreendendo na dose por unidade da composição farmacêutica pode ser de: 102-109 pfu, such as 102-103 pfu, 103-104 pfu, 104-105 pfu, 105-106 pfu, 106-107 pfu, 107-108 pfu, ou 108-109 pfu .
Uso/método de uso [0118] O vírus HSV recombinante da presente invenção pode ser usado no tratamento de vários tumores. Consequentemente, em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método
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62/113 de tratamento de um tumor, compreendendo a administração para um indivíduo necessitando do mesmo, uma quantidade terapeuticamente efetiva do vírus HSV recombinante da invenção ou vetor viral da invenção ou a composição farmacêutica da invenção. Em certas concretizações preferidas, o tumor inclui, mas não está limitado a, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de mama, osteosarcoma, câncer de ovário, câncer de próstata, glioma, melanoma, câncer coloretal, e câncer pancreático. Em certas concretizações preferidas, o vírus HSV recombinante da invenção ou o vetor viral da invenção ou a composição farmacêutica da invenção é administrada ao indivíduo por injeção (por exemplo, injeção intratumoral).
[0119] Em um outro aspecto, a invenção refere-se ao uso do vírus HSV recombinante da invenção ou o vetor viral da invenção na fabricação de uma composição famracêtuica para tratamento de um tumor em um indivíduo. Em certas concretizações preferidas, o tumor inclui, mas não está limitado a, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de mama, osteosarcoma, câncer de ovário, câncer de próstata, glioma, melanoma, câncer coloretal, e câncer pancreático. Em certas concretizações preferidas, o indivíduo é um mamífero, tal como um humano. Em certas concretizações preferidas, a composição farmacêutica é administrada por injeção (por exemplo, injeção intratumoral). Em certas concretizações preferidas, a composição farmacêutica é uma solução injetável ou um pó liofilizado.
Efeitos vantajosos da invenção [0120] Comparada com o vírus simplex herpes recombinante do estado da técnica, o vírus HSV recombinante da presente
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63/113 invenção tem os efeitos técnicos benéficos a seguir: o vírus HSV recombinante da presente invenção tem um nível alto de capacidade de replicação nas células de tumor, e é capaz de efetivamente matar várias células de tumor, mas tem uma nível significativamente reduzido de replicação e capacidade de mar em células normal. Além disso, foi demonstrado que o vírus HSV recombinante da invenção tem um nível significativamente reduzido de neurotoxicidade em animais e pode ser administrado em um animal em uma dose significativamente aumentada. Portanto, comparado com o vírus HSV recombinante existente, o vírus HSV recombinante da presente invenção não apenas mantém um nível alto de capacidade oncolítica, mas também tem um nível significativamente aumentado de segurança, assim, pode ser administrado em uma dose maior, e tem prospectos de aplicação amplos.
Descrição da informação da sequência [0121] A informação sobre as sequências envolvidas na presente invenção é provida na Tabela 1.
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Tabela 1
Informação da Sequência
| SEQ ID NO: | Descrição | SEQ ID NO: | Descrição |
| 1 | GenBank: nt33 ant5876 of JQ673480.1 | 2 | Sequência de gene de LacZ |
| 3 | GenBank: ntll2861 a nt113422 de JQ673480.1 | 4 | GenBank: ntll3590 a ntll5194 de JQ673480.1 |
| 5 | hTERT sequência do promotor núcleo | 6 | GenBank: nt510 (125731) a nt5439 (120802) de JQ673480.1 |
| 7 | Sequência de aminoácido de GFP | 8 | Sequência de aminoácido de PD-1 scFv |
| 9-16 | Sequências primárias | 17 | GenBank: nt91088nt92557 de JQ673480.1 |
| 18 | GenBank: nt94721nt95968 de JQ673480.1 | 19 | GenBank: ntl03527ntl04999 de JQ673480.1 |
| 20 | GenBank: ntll5418ntll5978 de JQ673480.1 | 21 | GenBank: ntl33911ntl34786 de JQ673480.1 |
| 22 | GenBank: nt4781nt7062 de JQ673480.1 | 23 | GenBank: nt5853-nt7485 de JQ673480.1 |
SEQ ID NO:1
GCAAAAAAGGCGGGCGGCGGTCCGGGCGGCGTGCGCGCGCGCGGCGGGCGTGGGGGGC
GGGGCCGCGGGAGCGGGGGAGGAGCGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGA
GCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAG
GAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGG
AGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGAGGAGCGGCCA
GACCCCGGAAACGGGCCCCCCCCAAAACACACCCCCCGGGGGTCGCGCGCGGCCCTTT
AAAGGCGGGCGGCGGGCAGCCCGGGCCCCCCGCGGCCGAGACTAGCGAGTTAGACAGG
CAAGCACTACTCGCCTCTGCACGCACATGCTTGCCTGTCAAACTCTACCACCCCGGCA
CGCTCTCTGTCTCCATGGCCCGCCGCCGCCATCGCGGCCCCCGCCGCCCCCGGCCGCC
CGGGCCCACGGGCGCGGTCCCAACCGCACAGTCCCAGGTAACCTCCACGCCCAACTCG
GAACCCGTGGTCAGGAGCGCGCCCGCGGCCGCCCCGCCGCCGCCCCCCGCCAGTGGGC
CCCCGCCTTCTTGTTCGCTGCTGCTGCGCCAGTGGCTCCACGTTCCCGAGTCCGCGTC
CGACGACGACGACGACGACTGGCCGGACAGCCCCCCGCCCGAGCCGGCGCCAGAGGCC
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CGGCCCACCGCCGCCGCCCCCCGCCCCCGGTCCCCACCGCCCGGCGCGGGCCCGGGGG
GCGGGGCTAACCCCTCCCACCCCCCCTCACGCCCCTTCCGCCTTCCGCCGCGCCTCGC
CCTCCGCCTGCGCGTCACCGCAGAGCACCTGGCGCGCCTGCGCCTGCGACGCGCGGGC
GGGGAGGGGGCGCCGAAGCCCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCACGCGGG
TGCGCTTCTCGCCCCACGTCCGGGTGCGCCACCTGGTGGTCTGGGCCTCGGCCGCCCG
CCTGGCGCGCCGCGGCTCGTGGGCCCGCGAGCGGGCCGACCGGGCTCGGTTCCGGCGC
CGGGTGGCGGAGGCCGAGGCGGTCATCGGGCCGTGCCTGGGGCCCGAGGCCCGTGCCC
GGGCCCTGGCCCGCGGAGCCGGCCCGGCGAACTCGGTCTAACGTTACACCCGAGGCGG
CCTGGGTCTTCCGCGGAGCTCCCGGGAGCTCCGCACCAAGCCGCTCTCCGGAGAGACG
ATGGCAGGAGCCGCGCATATATACGCTTGGAGCCGGCCCGCCCCCGAGGCGGGCCCGC
CCTCGGAGGGCGGGACTGGCCAATCGGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACC
AGCGTCCGCCGAGTCGTCGGGGCCCGGCCCACTGGGCGGTAACTCCCGCCCAGTGGGC
CGGGCCGCCCACTTCCCGGTATGGTAATTAAAAACTTGCAGAGGCCTTGTTCCGCTTC
CCGGTATGGTAATTAGAAACTCATTAATGGGCGGCCCCGGCCGCCCTTCCCGCTTCCG
GCAATTCCCGCGGCCCTTAATGGGCAACCCCGGTATTCCCCGCCTCCCGCGCCGCGCG
TAACCACTCCCCTGGGGTTCCGGGTTATGTTAATTGCTTTTTTGGCGGAACACACGGC
CCCTCGCGCATTGGCCCGCGGGTCGCTCAATGAACCCGCATTGGTCCCCTGGGGTTCC
GGGTATGGTAATGAGTTTCTTCGGGAAGGCGGGAAGCCCCGGGGCACCGACGCAGGCC
AAGCCCCTGTTGCGTCGGCGGGAGGGGCATGCTAATGGGGTTCTTTGGGGGACACCGG
GTTGGTCCCCCAAATCGGGGGCCGGGCCGTGCATGCTAATGATATTCTTTGGGGGCGC
CGGGTTGGTCCCCGGGGACGGGGCCGCCCCGCGGTGGGCCTGCCTCCCCTGGGACGCG
CGGCCATTGGGGGAATCGTCACTGCCGCCCCTTTGGGGAGGGGAAAGGCGTGGGGTAT
AAGTTAGCCCTGGCCCGACGGTCTGGTCGCATTTGCACCTCGGCACTCGGAGCGAGAC
GCAGCAGCCAGGCAGACTCGGGCCGCCCCCTCTCCGCATCACCACAGAAGCCCCGCCT
ACGTTGCGACCCCCAGGGACCCTCCGTCAGCGACCCTCCAGCCGCATACGACCCCCAT
GGAGCCCCGCCCCGGAGCGAGTACCCGCCGGCCTGAGGGCCGCCCCCAGCGCGAGGTG
AGGGGCCGGGCGCCATGTCTGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCC
ATGTTGGGGGACCCCCGACCCTTACACTGGAACCGGCCGCCATGTTGGGGGACCCCCA
CTCATACACGGGAGCCGGGCGCCATGTTGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGTGGAACCCC
GTGACACTATATATACAGGGACCGGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGCGGAACCCCCTGA
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CCCTATATATACAGGGACCGGGGTCGCCCTGTTAGGGGTCGCCATGTGACCCCCTGAC
TTTATATATACAGACCCCCAACACCTACACATGGCCCCTTTGACTCAGACGCAGGGCC
CGGGGTCGCCGTGGGACCCCCCTGACTCATACACAGAGACACGCCCCCACAACAAACA
CACAGGGACCGGGGTCGCCGTGTTAGGGGGCGTGGTCCCCACTGACTCATACGCAGGG
CCCCCTTACTCACACGCATCTAGGGGGGTGGGGAGGAGCCGCCCGCCATATTTGGGGG
ACGCCGTGGGACCCCCGACTCCGGTGCGTCTGGAGGGCGGGAGAAGAGGGAAGAAGAG
GGGTCGGGATCCAAAGGACGGACCCAGACCACCTTTGGTTGCAGACCCCTTTCTCCCC
CCTCTTCCGAGGCCAGCAGGGGGGCAGGACTTTGTGAGGCGGGGGGGGAGGGGGAACT
CGTGGGCGCTGATTGACGCGGGAAATCCCCCCATTCTTACCCGCCCCCCCTTTTTTCC
CCTCAGCCCGCCCCGGATGTCTGGGTGTTTCCCTGCGACCGAGACCTGCCGGACAGCA
GCGACTCGGAGGCGGAGACCGAAGTGGGGGGGCGGGGGGACGCCGACCACCATGACGA
CGACTCCGCCTCCGAGGCGGACAGCACGGACACGGAACTGTTCGAGACGGGGCTGCTG
GGGCCGCAGGGCGTGGATGGGGGGGCGGTCTCGGGGGGGAGCCCCCCCCGCGAGGAAG
ACCCCGGCAGTTGCGGGGGCGCCCCCCCTCGAGAGGACGGGGGGAGCGACGAGGGCGA
CGTGTGCGCCGTGTGCACGGATGAGATCGCGCCCCACCTGCGCTGCGACACCTTCCCG
TGCATGCACCGCTTCTGCATCCCGTGCATGAAAACCTGGATGCAATTGCGCAACACCT
GCCCGCTGTGCAACGCCAAGCTGGTGTACCTGATAGTGGGCGTGACGCCCAGCGGGTC
GTTCAGCACCATCCCGATCGTGAACGACCCCCAGACCCGCATGGAGGCCGAGGAGGCC
GTCAGGGCGGGCACGGCCGTGGACTTTATCTGGACGGGCAATCAGCGGTTCGCCCCGC
GGTACCTGACCCTGGGGGGGCACACGGTGAGGGCCCTGTCGCCCACCCACCCTGAGCC
CACCACGGACGAGGATGACGACGACCTGGACGACGGTGAGGCGGGGGGGCGGCGAGGA
CCCTGGGGGAGGAGGAGGAGGGGGGGGGGAGGGAGGAATAGGCGGGCGGGCGGGCGAG
GAAAGGGCGGGCCGGGGAGGGGGCGTAACCTGATCGCGCCCCCCGTTGTCTCTTGCAG
CAGACTACGTACCGCCCGCCCCCCGCCGGACGCCCCGCGCCCCCCCACGCAGAGGCGC
CGCCGCGCCCCCCGTGACGGGCGGGGCGTCTCACGCAGCCCCCCAGCCGGCCGCGGCT
CGGACAGCGCCCCCCTCGGCGCCCATCGGGCCACACGGCAGCAGTAACACTAACACCA
CCACCAACAGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCCGCCAGTCGCGAGCCGCGGTGCCGCGGGG
GGCGTCTGGCCCCTCCGGGGGGGTTGGGGTTGTTGAAGCGGAGGCGGGGCGGCCGAGG
GGCCGGACGGGCCCCCTTGTCAACAGACCCGCCCCCCTTGCAAACAACAGAGACCCCA
TAGTGATCAGCGACTCCCCCCCGGCCTCTCCCCACAGGCCCCCCGCGGCGCCCATGCC
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AGGCTCCGCCCCCCGCCCCGGTCCCCCCGCGTCCGCGGCCGCGTCGGGCCCCGCGCGC
CCCCGCGCGGCCGTGGCCCCGTGTGTGCGGGCGCCGCCTCCGGGGCCCGGCCCCCGCG
CCCCGGCCCCCGGGGCGGAGCCGGCCGCCCGCCCCGCGGACGCGCGCCGTGTGCCCCA
GTCGCACTCGTCCCTGGCTCAGGCCGCGAACCAAGAACAGAGTCTGTGCCGGGCGCGT
GCGACGGTGGCGCGCGGCTCGGGGGGGCCGGGCGTGGAGGGTGGACACGGGCCCTCCC
GCGGCGCCGCCCCCTCCGGCGCCGCCCCCTCCGGCGCCCCCCCGCTCCCCTCCGCCGC
CTCTGTCGAGCAGGAGGCGGCGGTGCGTCCGAGGAAGAGGCGCGGGTCGGGCCAGGAA
AACCCCTCCCCCCAGTCCACGCGTCCCCCCCTCGCGCCGGCAGGGGCCAAGAGGGCGG
CGACGCACCCCCCCTCCGACTCAGGGCCGGGGGGGCGCGGCCAGGGAGGGCCCGGGAC
CCCCCTGACGTCCTCGGCGGCCTCCGCCTCTTCCTCCTCCGCCTCTTCCTCCTCGGCC
CCGACTCCCGCGGGGGCCACCTCTTCCGCCACCGGGGCCGCGTCCTCCTCCGCTTCCG
CCTCCTCGGGCGGGGCCGTCGGTGCCCTGGGAGGGAGACAAGAGGAAACCTCCCTCGG
CCCCCGCGCTGCTTCTGGGCCGCGGGGGCCGAGGAAGTGTGCCCGGAAGACGCGCCAC
GCGGAGACTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCGGCCTCACGCGCTACCTGCCCATCTCGG
GGGTCTCTAGCGTGGTCGCCCTGTCGCCTTACGTGAACAAGACGATCACGGGGGACTG
CCTGCCCATCCTGGACATGGAGACGGGGAACATCGGGGCGTACGTGGTCCTGGTGGAC
CAGACGGGAAACATGGCGACCCGGCTGCGGGCCGCGGTCCCCGGCTGGAGCCGCCGCA
CCCTGCTCCCCGAGACCGCGGGTAACCACGTGACGCCCCCCGAGTACCCGACGGCCCC
CGCGTCGGAGTGGAACAGCCTCTGGATGACCCCCGTGGGGAACATGCTGTTCGACCAG
GGCACCCTAGTGGGCGCCCTGGACTTCCGCAGCCTGCGGTCTCGGCACCCGTGGTCCG
GGGAGCAGGGGGCGTCGACCCGGGACGAGGGAAAACAATAAGGGACGCCCCCGTGTTT
GTGGGGAGGGGGGGGTCGGGCGCTGGGTGGTCTCTGGCCGCGCCCACTACACCAGCCA
ATCCGTGTCGGGGAGGTGGAAAGTGAAAGACACGGGCACCACACACCAGCGGGTCTTT
TGTGTTGGCCCTAATAAAAAAAACTCAGGGGATTTTTGCTGTCTGTTGGGAAATAAAG
GTTTACTTTTGTATCTTTTCCCTGTCTGTGTTGGATGTATCGCGGGGGTGCGTGGGAG
TGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCG
TGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGG
GGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCCATGTTGGGCAGGCTCTGGTGTT
SEQ ID NO: 2
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GTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTG
CAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCC
TTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCA
GAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCG
TCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTA
TCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCG
CTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTG
ATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCA
GGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAAC
CGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATA
TGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACA
AATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTG
GAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTT
TATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATTAT
CGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCG
AAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCG
CCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGAT
TGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGT
CACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATA
TCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCA
TCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAAT
ATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTAC
CGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGT
GATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTAT
CGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCG
ACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCC
CTTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACG
CGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCG
CTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGA
CTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTAC
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GGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCT
TTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTT
CCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCAT AGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCG GTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACT ACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAAC GCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCTGGCGG AAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAG CGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCA
GGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCG ATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCAT TGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAAGC AGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCT CACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTG ATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCA TCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGG CTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACC GCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGG TCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTC CAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATC TGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGG TGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGC TACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAA
SEQ ID NO: 3
CCACCTGGTGTTTTGTCTCCACCATCGGCCTGACAGAGCTGTATTGTATTCTGCGGCG
GGGCCCGGCCCCCAAGAACGCAGACAAGGCCGCCGCCCCGGGGCGATCCAAGGGGCTG
TCGGGCGTCTGCGGGCGCTGTTGTTCCATCATCCTGTCGGGCATCGCAATGCGATTGT
GTTATATCGCCGTGGTGGCCGGGGTGGTGCTCGTGGCGCTTCACTACGAGCAGGAGAT
CCAGAGGCGCCTGTTTGATGTATGACGTCACATCCAGGCCGGCGGAAACCGGAACGGC ATATGCAAACTGGAAACTGTCCTGTCTTGGGGCCCACCCACCCGACGCGTCATATGTA
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AATGAAAATCGTTCCCCCGAGGCCATGTGTAGCCTGGATCCCAACGACCCCGCCCATG GGTCCCAATTGGCCGTCCCGTTACCAAGACCAACCCAGCCAGCGTATCCACCCCCGCC CGGGTCCCCGCGGAAGCGGAACGGTGTATGTGATATGCTAATTAAATACATGCCACGT ACTTATGGTGTCTGATTGGTCCTTGTCTGTGCCGGAGGTG
SEQ ID NO: 4
ACCGGTGCGCCACCACCAGAGGCCATATCCGACACCCCAGCCCCGACGGCAGCCGACA GCCCGGTCATGGCGACTGACATTGATATGCTAATTGACCTCGGCCTGGACCTCTCCGA CAGCGATCTGGACGAGGACCCCCCCGAGCCGGCGGAGAGCCGCCGCGACGACCTGGAA TCGGACAGCAACGGGGAGTGTTCCTCGTCGGACGAGGACATGGAAGACCCCCACGGAG AGGACGGACCGGAGCCGATACTCGACGCCGCTCGCCCGGCGGTCCGCCCGTCTCGTCC AGAAGACCCCGGCGTACCCAGCACCCAGACGCCTCGTCCGACGGAGCGGCAGGGCCCC AACGATCCTCAACCAGCGCCCCACAGTGTGTGGTCGCGCCTCGGGGCCCGGCGACCGT CTTGCTCCCCCGAGCGGCACGGGGGCAAGGTGGCCCGCCTCCAACCCCCACCGACCAA AGCCCAGCCTGCCCGCGGCGGACGCCGTGGGCGTCGCAGGGGTCGGGGTCGCGGTGGT CCCGGGGCCGCCGATGGTTTGTCGGACCCCCGCCGGCGTGCCCCCAGAACCAATCGCA ACCCGGGGGGACCCCGCCCCGGGGCGGGGTGGACGGACGGCCCCGGCGCCCCCCATGG CGAGGCGTGGCGCGGAAGTGAGCAGCCCGACCCACCCGGAGGCCCGCGGACACGGAGC GTGCGCCAAGCACCCCCCCCGCTAATGACGCTGGCGATTGCCCCCCCGCCCGCGGACC CCCGCGCCCCGGCCCCGGAGCGAAAGGCGCCCGCCGCCGACACCATCGACGCCACCAC GCGGTTGGTCCTGCGCTCCATCTCCGAGCGCGCGGCGGTCGACCGCATCAGCGAGAGC TTCGGCCGCAGCGCACAGGTCATGCACGACCCCTTTGGGGGGCAGCCGTTTCCCGCCG CGAATAGCCCCTGGGCCCCGGTGCTGGCGGGCCAAGGAGGGCCCTTTGACGCCGAGAC CAGACGGGTCTCCTGGGAAACCTTGGTCGCCCACGGCCCGAGCCTCTATCGCACTTTT GCCGGCAATCCTCGGGCCGCATCGACCGCCAAGGCCATGCGCGACTGCGTGCTGCGCC AAGAAAATTTCATCGAGGCGCTGGCCTCCGCCGACGAGACGCTGGCGTGGTGCAAGAT GTGCATCCACCACAACCTGCCGCTGCGCCCCCAGGACCCCATTATCGGGACGGCCGCG GCGGTGCTGGATAACCTCGCCACGCGCCTGCGGCCCTTTCTCCAGTGCTACCTGAAGG CGCGAGGCCTGTGCGGCCTGGACGAACTGTGTTCGCGGCGGCGTCTGGCGGACATTAA GGACATTGCATCCTTCGTGTTTGTCATTCTGGCCAGGCTCGCCAACCGCGTCGAGCGT GGCGTCGCGGAGATCGACTACGCGACCCTTGGTGTCGGGGTCGGAGAGAAGATGCATT
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TCTACCTCCCCGGGGCCTGCATGGCGGGCCTGATCGAAATCCTAGACACGCACCGCCA GGAGTGTTCGAGTCGTGTCTGCGAGTTGACGGCCAGTCACATCGTCGCCCCCCCGTAC GTGCACGGCAAATATTTTTATTGCAACTCCCTGTTTTAG
SEQ ID NO: 5
CTGCGCTGTCGGGGCCAGGCCGGGCTCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGACGCCCAGGA CCGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCAC CTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCC CGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCC TCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGC
SEQ ID NO: 6
CATGGCCCGCCGCCGCCATCGCGGCCCCCGCCGCCCCCGGCCGCCCGGGCCCACGGGC GCGGTCCCAACCGCACAGTCCCAGGTAACCTCCACGCCCAACTCGGAACCCGTGGTCA GGAGCGCGCCCGCGGCCGCCCCGCCGCCGCCCCCCGCCAGTGGGCCCCCGCCTTCTTG TTCGCTGCTGCTGCGCCAGTGGCTCCACGTTCCCGAGTCCGCGTCCGACGACGACGAC GACGACTGGCCGGACAGCCCCCCGCCCGAGCCGGCGCCAGAGGCCCGGCCCACCGCCG CCGCCCCCCGCCCCCGGTCCCCACCGCCCGGCGCGGGCCCGGGGGGCGGGGCTAACCC CTCCCACCCCCCCTCACGCCCCTTCCGCCTTCCGCCGCGCCTCGCCCTCCGCCTGCGC GTCACCGCAGAGCACCTGGCGCGCCTGCGCCTGCGACGCGCGGGCGGGGAGGGGGCGC CGAAGCCCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCACGCGGGTGCGCTTCTCGCC CCACGTCCGGGTGCGCCACCTGGTGGTCTGGGCCTCGGCCGCCCGCCTGGCGCGCCGC GGCTCGTGGGCCCGCGAGCGGGCCGACCGGGCTCGGTTCCGGCGCCGGGTGGCGGAGG CCGAGGCGGTCATCGGGCCGTGCCTGGGGCCCGAGGCCCGTGCCCGGGCCCTGGCCCG CGGAGCCGGCCCGGCGAACTCGGTCTAACGTTACACCCGAGGCGGCCTGGGTCTTCCG CGGAGCTCCCGGGAGCTCCGCACCAAGCCGCTCTCCGGAGAGACGATGGCAGGAGCCG CGCATATATACGCTTGGAGCCGGCCCGCCCCCGAGGCGGGCCCGCCCTCGGAGGGCGG GACTGGCCAATCGGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCAGCGTCCGCCGAG TCGTCGGGGCCCGGCCCACTGGGCGGTAACTCCCGCCCAGTGGGCCGGGCCGCCCACT TCCCGGTATGGTAATTAAAAACTTGCAGAGGCCTTGTTCCGCTTCCCGGTATGGTAAT TAGAAACTCATTAATGGGCGGCCCCGGCCGCCCTTCCCGCTTCCGGCAATTCCCGCGG CCCTTAATGGGCAACCCCGGTATTCCCCGCCTCCCGCGCCGCGCGTAACCACTCCCCT
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GGGGTTCCGGGTTATGTTAATTGCTTTTTTGGCGGAACACACGGCCCCTCGCGCATTG
GCCCGCGGGTCGCTCAATGAACCCGCATTGGTCCCCTGGGGTTCCGGGTATGGTAATG
AGTTTCTTCGGGAAGGCGGGAAGCCCCGGGGCACCGACGCAGGCCAAGCCCCTGTTGC
GTCGGCGGGAGGGGCATGCTAATGGGGTTCTTTGGGGGACACCGGGTTGGTCCCCCAA
ATCGGGGGCCGGGCCGTGCATGCTAATGATATTCTTTGGGGGCGCCGGGTTGGTCCCC
GGGGACGGGGCCGCCCCGCGGTGGGCCTGCCTCCCCTGGGACGCGCGGCCATTGGGGG
AATCGTCACTGCCGCCCCTTTGGGGAGGGGAAAGGCGTGGGGTATAAGTTAGCCCTGG
CCCGACGGTCTGGTCGCATTTGCACCTCGGCACTCGGAGCGAGACGCAGCAGCCAGGC
AGACTCGGGCCGCCCCCTCTCCGCATCACCACAGAAGCCCCGCCTACGTTGCGACCCC
CAGGGACCCTCCGTCAGCGACCCTCCAGCCGCATACGACCCCCATGGAGCCCCGCCCC
GGAGCGAGTACCCGCCGGCCTGAGGGCCGCCCCCAGCGCGAGGTGAGGGGCCGGGCGC
CATGTCTGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGACC
CCCGACCCTTACACTGGAACCGGCCGCCATGTTGGGGGACCCCCACTCATACACGGGA
GCCGGGCGCCATGTTGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGTGGAACCCCGTGACACTATATA
TACAGGGACCGGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGCGGAACCCCCTGACCCTATATATACA
GGGACCGGGGTCGCCCTGTTAGGGGTCGCCATGTGACCCCCTGACTTTATATATACAG
ACCCCCAACACCTACACATGGCCCCTTTGACTCAGACGCAGGGCCCGGGGTCGCCGTG
GGACCCCCCTGACTCATACACAGAGACACGCCCCCACAACAAACACACAGGGACCGGG
GTCGCCGTGTTAGGGGGCGTGGTCCCCACTGACTCATACGCAGGGCCCCCTTACTCAC
ACGCATCTAGGGGGGTGGGGAGGAGCCGCCCGCCATATTTGGGGGACGCCGTGGGACC
CCCGACTCCGGTGCGTCTGGAGGGCGGGAGAAGAGGGAAGAAGAGGGGTCGGGATCCA
AAGGACGGACCCAGACCACCTTTGGTTGCAGACCCCTTTCTCCCCCCTCTTCCGAGGC
CAGCAGGGGGGCAGGACTTTGTGAGGCGGGGGGGGAGGGGGAACTCGTGGGCGCTGAT
TGACGCGGGAAATCCCCCCATTCTTACCCGCCCCCCCTTTTTTCCCCTCAGCCCGCCC
CGGATGTCTGGGTGTTTCCCTGCGACCGAGACCTGCCGGACAGCAGCGACTCGGAGGC
GGAGACCGAAGTGGGGGGGCGGGGGGACGCCGACCACCATGACGACGACTCCGCCTCC
GAGGCGGACAGCACGGACACGGAACTGTTCGAGACGGGGCTGCTGGGGCCGCAGGGCG
TGGATGGGGGGGCGGTCTCGGGGGGGAGCCCCCCCCGCGAGGAAGACCCCGGCAGTTG
CGGGGGCGCCCCCCCTCGAGAGGACGGGGGGAGCGACGAGGGCGACGTGTGCGCCGTG
TGCACGGATGAGATCGCGCCCCACCTGCGCTGCGACACCTTCCCGTGCATGCACCGCT
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TCTGCATCCCGTGCATGAAAACCTGGATGCAATTGCGCAACACCTGCCCGCTGTGCAA
CGCCAAGCTGGTGTACCTGATAGTGGGCGTGACGCCCAGCGGGTCGTTCAGCACCATC
CCGATCGTGAACGACCCCCAGACCCGCATGGAGGCCGAGGAGGCCGTCAGGGCGGGCA
CGGCCGTGGACTTTATCTGGACGGGCAATCAGCGGTTCGCCCCGCGGTACCTGACCCT
GGGGGGGCACACGGTGAGGGCCCTGTCGCCCACCCACCCTGAGCCCACCACGGACGAG
GATGACGACGACCTGGACGACGGTGAGGCGGGGGGGCGGCGAGGACCCTGGGGGAGGA
GGAGGAGGGGGGGGGGAGGGAGGAATAGGCGGGCGGGCGGGCGAGGAAAGGGCGGGCC
GGGGAGGGGGCGTAACCTGATCGCGCCCCCCGTTGTCTCTTGCAGCAGACTACGTACC
GCCCGCCCCCCGCCGGACGCCCCGCGCCCCCCCACGCAGAGGCGCCGCCGCGCCCCCC
GTGACGGGCGGGGCGTCTCACGCAGCCCCCCAGCCGGCCGCGGCTCGGACAGCGCCCC
CCTCGGCGCCCATCGGGCCACACGGCAGCAGTAACACTAACACCACCACCAACAGCAG
CGGCGGCGGCGGCTCCCGCCAGTCGCGAGCCGCGGTGCCGCGGGGGGCGTCTGGCCCC
TCCGGGGGGGTTGGGGTTGTTGAAGCGGAGGCGGGGCGGCCGAGGGGCCGGACGGGCC
CCCTTGTCAACAGACCCGCCCCCCTTGCAAACAACAGAGACCCCATAGTGATCAGCGA
CTCCCCCCCGGCCTCTCCCCACAGGCCCCCCGCGGCGCCCATGCCAGGCTCCGCCCCC
CGCCCCGGTCCCCCCGCGTCCGCGGCCGCGTCGGGCCCCGCGCGCCCCCGCGCGGCCG
TGGCCCCGTGTGTGCGGGCGCCGCCTCCGGGGCCCGGCCCCCGCGCCCCGGCCCCCGG
GGCGGAGCCGGCCGCCCGCCCCGCGGACGCGCGCCGTGTGCCCCAGTCGCACTCGTCC
CTGGCTCAGGCCGCGAACCAAGAACAGAGTCTGTGCCGGGCGCGTGCGACGGTGGCGC
GCGGCTCGGGGGGGCCGGGCGTGGAGGGTGGACACGGGCCCTCCCGCGGCGCCGCCCC
CTCCGGCGCCGCCCCCTCCGGCGCCCCCCCGCTCCCCTCCGCCGCCTCTGTCGAGCAG
GAGGCGGCGGTGCGTCCGAGGAAGAGGCGCGGGTCGGGCCAGGAAAACCCCTCCCCCC
AGTCCACGCGTCCCCCCCTCGCGCCGGCAGGGGCCAAGAGGGCGGCGACGCACCCCCC
CTCCGACTCAGGGCCGGGGGGGCGCGGCCAGGGAGGGCCCGGGACCCCCCTGACGTCC
TCGGCGGCCTCCGCCTCTTCCTCCTCCGCCTCTTCCTCCTCGGCCCCGACTCCCGCGG
GGGCCACCTCTTCCGCCACCGGGGCCGCGTCCTCCTCCGCTTCCGCCTCCTCGGGCGG
GGCCGTCGGTGCCCTGGGAGGGAGACAAGAGGAAACCTCCCTCGGCCCCCGCGCTGCT
TCTGGGCCGCGGGGGCCGAGGAAGTGTGCCCGGAAGACGCGCCACGCGGAGACTTCCG
GGGCCGTCCCCGCGGGCGGCCTCACGCGCTACCTGCCCATCTCGGGGGTCTCTAGCGT
GGTCGCCCTGTCGCCTTACGTGAACAAGACGATCACGGGGGACTGCCTGCCCATCCTG
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GACATGGAGACGGGGAACATCGGGGCGTACGTGGTCCTGGTGGACCAGACGGGAAACA
TGGCGACCCGGCTGCGGGCCGCGGTCCCCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCTCCCCGA GACCGCGGGTAACCACGTGACGCCCCCCGAGTACCCGACGGCCCCCGCGTCGGAGTGG AACAGCCTCTGGATGACCCCCGTGGGGAACATGCTGTTCGACCAGGGCACCCTAGTGG GCGCCCTGGACTTCCGCAGCCTGCGGTCTCGGCACCCGTGGTCCGGGGAGCAGGGGGC
SEQ ID NO: 7
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPW PTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFE GDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIED GSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITL GMDELYK
SEQ ID NO: 8
DVLMTQTPLFLPVSLGDQASIFCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQFPKLLMYKVSN RFFGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIKGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSSDVQVQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGSSITSDFAWEWIRQF PGNKLECMGYIGYSGGTIYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARW HGSSHWYFDVWGAGTTVTVSS
SEQ ID NO: 17
CTACTCGTCCCAGAATTTGGCCAGGACGTCCTTGTAGAACGCGGGTGGGGGGGCCTGG GTCCGCAGCTGCTCCAGAAACCTGTCGGCGATATCAGGGGCCGTGATATGCCGGGTCA CAATAGATCGCGCCAGGTTTTCGTCGCGGATGTCCTGGTAGATAGGCAGGCGTTTCAG AAGAGTCCACGGCCCCCGCTCCTTGGGGCCGATAAGCGATATGACGTACTTAATGTAG CGGTGTTCCACCAGCTCGGTGATGGTCATGGGATCGGGGAGCCAGTCCAGGGACTCTG GGGCGTCGTGGATGACGTGGCGTCGCCGGCTGGCCACATAACTGCGGTGCTCTTCCAG CAGCTGCGCGTTCGGGACCTGGACGAGCTCGGGCGGGGTGAGTATCTCCGAGGAGGAC GACCTGGGGCCGGGGTGGCCCCCGGTAACGTCCCGGGGATCCAGGGGGAGGTCCTCGT CGTCTTCGTATCCGCCGGCGATCTGTTGGGTTAGAATTTCGGTCCACGAGACGCGCAT CTCGGTGCCGCCGGCGGCCGGCGGCAAAGGGGGCCTGGTTTCCGTGGAGCGCGAGCTG GTGTGTTCCCGGCGGATGGCCCGCCGGGTCTGAGAGCGACTCGGGGGGGTCCAGTGAC ATTCGCGCAGCACATCCTCCACGGAGGCGTAGGTGTTATTGGGATGGAGGTCGGTGTG
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GCAGCGGACAAAGAGGGCCAGGAACTGGGGGTAGCTCATCTTAAAGTACTTTAGTATA TCGCGACAGTTGATCGTGGGAATGTAGCAGGCGCTAATATCCAACACAATATCACAGC CCATCAACAGGAGGTCAGTGTCTGTGGTGTACACGTACGCGACCGTGTTGGTGTGATA GAGGTTGGCGCAGGCATCGTCCGCCTCCAGCTGACCCGAGTTAATGTAGGCGTACCCC AGGGCCCGGAGAACGCGAATACAGAACAGATGCGCCAGACGCAGGGCCGGCTTCGAGG GCGCGGCGGACGGCAGCGCGGCTCCGGACCCGGCCGTCCCCCGGGTCCCCGAGGCCAG AGAGGTGCCGCGCCGGCGCATGTTGGAAAAGGCAGAGCTGGGTCTGGAGTCGGTGATG GGGGAAGGCGGTGGAGAGGCGTCCACGTCACTGGCCTCCTCGTCCGTCCGGCATTGGG CCGTCGTGCGGGCCAGGATGGCCTTGGCTCCAAACACAACCGGCTCCATACAATTGAC CCCGCGATCGGTAACGAAGATGGGGAAAAGGGACTTTTGGGTAAACACCTTTAATAAG CGACAGAGGCAGTGTAGCGTAATGGCCTCGCGGTCGTAACTGGGGTATCGGCGCTGAT ATTTGACCACCAACGTGTACATGACGTTCCACAGGTCCACGGCGATGGGGGTGAAGTA CCCGGCCGGGGCCCCAAGGCCCTGGCGCTTGACCAGATGGTGTGTGTGGGCAAACTTC ATCATCCC GAACAAAC C CAT
SEQ ID NO: 18
ATGCTCCGCAACGACAGCCACCGGGCCGCGTCCCCGGAGGACGGCCAGGGACGGGTCG ACGACGGACGGCCACACCTCGCGTGCGTGGGGGCCCTGGCGCGGGGGTTCATGCATAT CTGGCTTCAGGCCGCCACGCTGGGTTTTGCGGGATCGGTCGTTATGTCGCGCGGGCCG TACGCGAATGCCGCGTCTGGGGCGTTCGCCGTCGGGTGCGCCGTGCTGGGCTTTATGC GCGCACCCCCTCCCCTCGCGCGGCCCACCGCGCGGATATACGCCTGGCTCAAACTGGC GGCCGGTGGAGCGGCCCTTGTTCTGTGGAGTCTCGGGGAGCCCGGAACGCAGCCGGGG GCCCCGGGCCCGGCCACCCAGTGCCTGGCGCTGGGCGCCGCCTATGCGGCGCTCCTGG TGCTCGCCGATGACGTCTATCCGCTCTTTCTCCTCGCCCCGGGGCCCCTGTTCGTCGG CACCCTGGGGATGGTCGTCGGCGGGCTGACGATCGGAGGCAGCGCGCGCTACTGGTGG ATCGGTGGGCCCGCCGCGGCCGCCTTGGCCGCGGCGGTGTTGGCGGGCCCGGGGGCGA CCACCGCCAGGGACTGCTTCTCCAGGGCGTGCCCCGACCACCGCCGCGTCTGCGTCAT CGTCGCAGGCGAGTCTGTTTCCCGCCGCCCCCCGGAGGACCCAGAGCGACCCGGGGAC CCCGGGCCACCGTCCCCCCCGACACCCCAACGATCCCAGGGGCCGCCGGCCGATGAGG TCGCACCGGCCGGGGTAGCGCGGCCCGAAAACGTCTGGGTGCCCGTGGTCACCTTTCT GGGGGCGGGCGCGCTCGCCGTCAAGACGGTGCGAGAACATGCCCGGGAAACGCCGGGC
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CCGGGCCTGCCGCTGTGGCCCCAGGTGTTTCTCGGAGGCCATGTGGCGGTGGCCCTGA CGGAGCTGTGTCAGGCGCTTATGCCCTGGGACCTTACGGACCCGCTGCTGTTTGTTCA CGCCGGACTGCAGGTCATCAACCTCGGGTTGGTGTTTCGGTTTTCCGAGGTTGTCGTG TATGCGGCGCTAGGGGGTGCCGTGTGGATTTCGTTGGCGCAGGTGCTGGGGCTCCGGC GTCGCCTGCACAGGAAGGACCCCGGGGACGGGGCCCGGTTGGCGGCGACGCTTCGGGG CCTCTTCTTCTCCGTGTACGCGCTGGGGTTTGGGGTGGGGGCGCTGCTGTGCCCTCCG GGGTCAACGGGCGGGTGGTCGGGCGATTGA
SEQ ID NO: 19
CTACCCACCGTACTCGTCAATTCCAAGGGCATCGGTAAACATCTGCTCAAACTCGAAG TCGGCCATATCCAGAGCGCCGTAGGGGGCGGAGTCGTGGGGGGTAAATCCCGGACCCG GGGAATCCCCGTCCCCCAACATGTCCAGATCGAAATCGTCTAGCGCGTCGGCATGCGC CATCGCCACGTCCTCGCCGTCTAAGTGGAGCTCGTCCCCCAGGCTGACATCGGTCGGG GGGGCCGTCGACAGTCTGCGCGTGTGTCCCGCGGGGAGAAAGGACAGGCGCGGAGCCG CCAGCCCCGCCTCTTCGGGGGCGTCGTCGTCCGGGAGATCGAGCAGGCCCTCGATGGT AGACCCGTAATTGTTTTTCGTACGCGCGCGGCTGTACGCGTGTTCCCGCATGACCGCC TCGGAGGGCGAGGTCGTGAAGCTGGAATACGAGTCCAACTTCGCCCGAATCAACACCA TAAAGTACCCAGAGGCGCGGGCCTGGTTGCCATGCAGGGTGGGAGGGGTCGTCAACGG CGCCCCTGGCTCCTCCGTAGCCGCGCTGCGCACCAGCGGGAGGTTAAGGTGCTCGCGA ATGTGGTTTAGCTCCCGCAGCCGGCGGGCCTCGATTGGCACTCCCCGGACGGTGAGCG CTCCGTTGACGAACATGAAGGGCTGGAACAGACCCGCCAACTGACGCCAGCTCTCCAG GTCGCAACAGAGGCAGTCAAACAGGTCGGGCCGCATCATCTGCTCGGCGTACGCGGCC CATAGGATCTCGCGGGTCAAAAATAGATACAAATGCAAAAACAGAACACGCGCCAGAC GAGCGGTCTCTCGGTAGTACCTGTCCGCGATCGTGGCGCGCAGCATTTCTCCCAGGTC GCGATCGCGTCCGCGCATGTGCGCCTGGCGGTGCAGCTGCCGGACGCTGGCGCGCAGG TACCGGTACAGGGCCGAGCAGAAGTTGGCCAACACGGTTCGATAGCTCTCCTCCCGCG CCCGTAGCTCGGCGTGGAAGAAACGAGAGAGCGCTTCGTAGTAGAGCCCGAGGCCGTC GCGGGTGGCCGGAAGCGTCGGGAAGGCCACGTCGCCGTGGGCGCGAATGTCGATTTGG GCGCGTTCGGGGACGTACGCGTCCCCCCATTCCACCACATCGCTGGGCAGCGTTGATA GGAATTTACACTCCCGGTACAGGTCGGCGTTGGTCGGTAACGCCGAAAACAAATCCTC GTTCCAGGTATCGAGCATGGTACATAGCGCGGGGCCCGCGCTAAAGCCCAAGTCGTCG
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AGGAGACGGTTAAAGAGGGCGGCGGGGGGGACGGGCATGGGCGGGGAGGGCATGAGCT GGGCCTGGCTCAGGCGCCCCGTTGCGTACAGCGGAGGGGCCGCCGGGGTGTTTTTGGG ACCCCCGGCCGGGCGGGGGGGTGGTGGCGAAGCGCCGTCCGCGTCCATGTCGGCAAAC AGCTCGTCGACCAAGAGGTCCAT
SEQ ID NO: 20
ATGACAGCGACCCCCCTCACCAACCTGTTCTTACGGGCCCCGGACATAACCCACGTGG CCCCCCCTTACTGCCTCAACGCCACCTGGCAGGCCGAAACGGCCATGCACACCAGCAA AACGGACTCCGCTTGCGTGGCCGTGCGGAGTTACCTGGTCCGCGCCTCCTGTGAGACC AGCGGCACAATCCACTGCTTTTTCTTTGCGGTATACAAGGACACCCACCATACCCCTC CGCTGATTACCGAGCTCCGCAACTTTGCGGACCTGGTTAACCACCCGCCGGTCCTACG CGAACTGGAGGATAAGCGCGGGGTGCGGCTGCGGTGTGCGCGGCCGTTTAGCGTCGGG ACGATTAAGGACGTCTCTGGGTCCGGCGCGTCCTCGGCGGGAGAGTACACGATAAACG GGATCGTGTACCACTGCCACTGTCGGTATCCGTTCTCAAAAACATGCTGGATGGGGGC CTCCGCGGCCCTACAGCACCTGCGCTCCATCAGCTCCAGCGGCATGGCCGCCCGCGCG GCAGAGCATCGACGCGTCAAGATTAAAATTAAGGCGTGA
SEQ ID NO: 21
CTACAGGGTGGTAACCGGATAGCAGATGTGAGGAAGTCTGGGCCGTTCGCCGCGAACG GCGATCAGAGGGTCCGTTTCTTGCGGACCACGGCCCGGTGATGTGGGTTGCTCGTCTA AAATCTCGGGCATACCCATACACGCACAACACGGACGCCGCACCGAATGGGACGTCGT AAGGGGGTGGGAGGTAGCTGGGTGGGGTTTGTGCAGAGCAATCAGGGACCGCAGCCAG CGCATACAATCGCGCTCCCGTCCGTTGGTCCCGGGCAGGACCACGCCGTACTGGTATT CGTACCGGCTGAGCAGGGTCTCCAGGGGGTGGTTGGGTGCCGCGGGGAACGGGGTCCA CGCCACGGTCCACTCGGGCAAAAACCGAGTCGGCACGGCCCACGGTTCTCCCACCCAC GCGTCTGGGGTCTTGATGGCGATAAATCTTACCCCGAGCCGGATTTTTTGGGCGTATT CGAGAAACGGCACACACAGATCCGCCGCGCCTACCACCCACAAGTGGTAGAGGCGAGG GGGGCTGGGTTGGTCTCGGTGCAACAGTCGGAAGCACGCCACGGCGTCCACGACCTCG GTGCTCTCCAAGGGGCTGTCCTCCGCAAACAGGCCCGTGGTGGTGTTTGGGGGGCAGC GACAGGACCTAGTGCGCACGATCGGGCGGGTGGGTTTGGGTAAGTCCATCAGCGGCTC GGCCAACCGTCGAAGGTTGGCCGGGCGAACGACGACCGGGGTACCCAGGGGTTCTGAT GCCAAAATGCGGCACTGCCTAAGCAGGAAGCTCCACAGGGCCGGGCTTGCGTCGACGG
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AAGTCCGGGGCAGGGCGTTGTTCTGGTCAAGGAGGGTCATTACGTTGACGACAACAAC GCCCAT
SEQ ID NO: 22
CCCGGGACCCCCCTGACGTCCTCGGCGGCCTCCGCCTCTTCCTCCTCCGCCTCTTCCT CCTCGGCCCCGACTCCCGCGGGGGCCACCTCTTCCGCCACCGGGGCCGCGTCCTCCTC CGCTTCCGCCTCCTCGGGCGGGGCCGTCGGTGCCCTGGGAGGGAGACAAGAGGAAACC TCCCTCGGCCCCCGCGCTGCTTCTGGGCCGCGGGGGCCGAGGAAGTGTGCCCGGAAGA CGCGCCACGCGGAGACTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCGGCCTCACGCGCTACCTGCC CATCTCGGGGGTCTCTAGCGTGGTCGCCCTGTCGCCTTACGTGAACAAGACGATCACG GGGGACTGCCTGCCCATCCTGGACATGGAGACGGGGAACATCGGGGCGTACGTGGTCC TGGTGGACCAGACGGGAAACATGGCGACCCGGCTGCGGGCCGCGGTCCCCGGCTGGAG CCGCCGCACCCTGCTCCCCGAGACCGCGGGTAACCACGTGACGCCCCCCGAGTACCCG ACGGCCCCCGCGTCGGAGTGGAACAGCCTCTGGATGACCCCCGTGGGGAACATGCTGT TCGACCAGGGCACCCTAGTGGGCGCCCTGGACTTCCGCAGCCTGCGGTCTCGGCACCC GTGGTCCGGGGAGCAGGGGGCGTCGACCCGGGACGAGGGAAAACAATAAGGGACGCCC CCGTGTTTGTGGGGAGGGGGGGGTCGGGCGCTGGGTGGTCTCTGGCCGCGCCCACTAC ACCAGCCAATCCGTGTCGGGGAGGTGGAAAGTGAAAGACACGGGCACCACACACCAGC GGGTCTTTTGTGTTGGCCCTAATAAAAAAAACTCAGGGGATTTTTGCTGTCTGTTGGG AAATAAAGGTTTACTTTTGTATCTTTTCCCTGTCTGTGTTGGATGTATCGCGGGGGTG CGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTG GGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTG GGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCCATGTTGGGCAGGCTCTGGTGTTAACCAC AGAGCCGCGGCCCGGGCTGCCTGACCACCGATCCCCGAAAGCATCCTGCCACTGGCAT GGAGCCAGAACCACAGTGGGTTGGGTGTGGGTGTTAAGTTTCCGCGAGCGCCTGCCCG CCCGGACTGACCTGGCCTCTGGCCGCCACAAAGGGCGGGGGGGGGGGTTAACTACACT ATAGGGCAACAAAGGATGGGAGGGGTAGCGGGGCGGGACGGGGCGCCCAAAAGGGGGT CGGCCACACCACAGACGTGGGTGTTGGGGGGTGGGGCGGAGGGGTGGGGGGGGAGACA GAAACAGGAACATAGTTAGAAAACAAGAATGCGGTGCAGCCAGAGAATCACAGGAGAC GAGGGGATGGGCGTGTTGGTTACCAACCCACACCCAGGCATGCTCGGTGGTATGAAGG AGGGGGGGCGGTGTTTCTTAGAGACCGCCGGGGGACGTGGGGTTGGTGTGCAAAGGCA
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CGCGCACCCGCGCCGGCCAGGTGGGCCGGTACCCCATCCCCCCCTCCCCCGACCCTTC CCACCCCCGCGTGCCAGAGATCACCCCGGTCCCCCGGCACCCGCCACTCCTCCATATC CTCGCTTTAGGAACAACTTTAGGGGGGGGTACACACGCGCCGTGCATTTCCTTCCACA CCCCCCCCCTCCCCCGCACTCCCCCCCCCCAGGCAGTAAGACCCAAGCATAGAGAGCC AGGCACAAAAACACAGGCGGGGTGGGACACATGCCTTCTTGGAGTACGTGGGTCATTG GCGTGGGGGGTTACAGCGACACCGGCCGACCCCCTGGCGGTCTTCCAGCCGGCCCTTA GATAAGGGGGCAGTTGGTGGTCGGACGGGTAAGTAACAGAGTCTAACTAAGGGTGGGA GGGGGGGAAAATAACGGGCTGGTGTGCTGTAACACGAGCCCACCCGCGAGTGGCGTGG CCGACCTTAGCCTCTGGGGCGCCCCCTGTCGTTTGGGTCCCCCCCCCTCTATTGGGGA GAAGCAGGTGTCTAACCTACCTGGAAACGCGGCGTCTTTGTTGAACGACACCGGGGCG CCCTCGACGAGTGGGATAACGGGGGAGGAAGGGAGGGAGGAGGGTACTGGGGGTGAAG GGGGGGGGGGAGAAGCGAGAACAGGAAAGGCGACGGAGCCCGGCAGAACACCGAGGAA AAAAAAACCACAGCGCATGC
SEQ ID NO: 23
CCATGTTGGGCAGGCTCTGGTGTTAACCACAGAGCCGCGGCCCGGGCTGCCTGACCAC CGATCCCCGAAAGCATCCTGCCACTGGCATGGAGCCAGAACCACAGTGGGTTGGGTGT GGGTGTTAAGTTTCCGCGAGCGCCTGCCCGCCCGGACTGACCTGGCCTCTGGCCGCCA CAAAGGGCGGGGGGGGGGGTTAACTACACTATAGGGCAACAAAGGATGGGAGGGGTAG CGGGGCGGGACGGGGCGCCCAAAAGGGGGTCGGCCACACCACAGACGTGGGTGTTGGG GGGTGGGGCGGAGGGGTGGGGGGGGAGACAGAAACAGGAACATAGTTAGAAAACAAGA ATGCGGTGCAGCCAGAGAATCACAGGAGACGAGGGGATGGGCGTGTTGGTTACCAACC CACACCCAGGCATGCTCGGTGGTATGAAGGAGGGGGGGCGGTGTTTCTTAGAGACCGC CGGGGGACGTGGGGTTGGTGTGCAAAGGCACGCGCACCCGCGCCGGCCAGGTGGGCCG GTACCCCATCCCCCCCTCCCCCGACCCTTCCCACCCCCGCGTGCCAGAGATCACCCCG GTCCCCCGGCACCCGCCACTCCTCCATATCCTCGCTTTAGGAACAACTTTAGGGGGGG GTACACACGCGCCGTGCATTTCCTTCCACACCCCCCCCCTCCCCCGCACTCCCCCCCC CCAGGCAGTAAGACCCAAGCATAGAGAGCCAGGCACAAAAACACAGGCGGGGTGGGAC ACATGCCTTCTTGGAGTACGTGGGTCATTGGCGTGGGGGGTTACAGCGACACCGGCCG ACCCCCTGGCGGTCTTCCAGCCGGCCCTTAGATAAGGGGGCAGTTGGTGGTCGGACGG GTAAGTAACAGAGTCTAACTAAGGGTGGGAGGGGGGGAAAATAACGGGCTGGTGTGCT
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GTAACACGAGCCCACCCGCGAGTGGCGTGGCCGACCTTAGCCTCTGGGGCGCCCCCTG TCGTTTGGGTCCCCCCCCCTCTATTGGGGAGAAGCAGGTGTCTAACCTACCTGGAAAC GCGGCGTCTTTGTTGAACGACACCGGGGCGCCCTCGACGAGTGGGATAACGGGGGAGG AAGGGAGGGAGGAGGGTACTGGGGGTGAAGGGGGGGGGGGAGAAGCGAGAACAGGAAA GGCGACGGAGCCCGGCAGAACACCGAGGAAAAAAAAACCACAGCGCATGCGCCGGGCC GTTGTGGGGCCCCGGGCCGGGGCCCCTTGGGTCCGCCGGGGCCCCGGGCCGGGCCGCC ACGGGGGCCGGCCGTTGGCGGTAACCCCGAGTGTTCATCTCAGGCCCCGGGCCGGGAA CCCGGAAAAGCCTCCGGGGGGCCTTTTTCGCGTCGCGTGCCGGCGAGCGGGTCCGGAC GGGGCCCGGACCGCCGCGGTCGGGGGCCCCTCGTCCCGGGCCGTACGCGGCCTTCGCC CCGTGAGGGGACAGACGAAC GAAACAT TCCGGCGACG GAAC GAAAAACAC C C CAGAC G GGTTAAAGAAACAGAAACCGCAACCCCCACCACCCCCGAAACGGGGAAAACGAAAAAA CAGACCAGCGGCCGGCCGGCGCTTAGGGGGAGGATGTCGCCGACGCCCCTTGGCCGCC CCGGCTGCA [0122] As concretizações da presente invenção serão descritas em detalhes abaixo com referência aos desenhos e exemplos que acompanham o pedido. Os técnicos no assunto irão apreciar que os desenhos a seguir e os exemplos são meramente ilustrativos da invenção e não pretendem limitar o escopo de proteção da invenção. Os vários objetos e aspectos vantajosos da invenção serão aparentes aos técnicos no assunto, de acordo com as descrições detalhadas a seguir dos desenhos e concretizações preferidas.
Desenhos
| [0123] | A | figura IA mostra a | estratégia | de construção | do |
| vírus | OVN | recombinante. | |||
| [0124] | A | figura 1B mostra a | estratégia | de construção | do |
| vírus | OVH | recombinante. | |||
| [0125] | A | figura 2 é uma | ilustração | esquemática | da |
modificação go genoma compreendido no vírus recombinante
HSV1716, NV1020, G207, OncoVexGM_CSF (T-VEC) e OVN; sendo que o
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81/113 símbolo x indica uma deleção.
[0126] A figura 3 é uma ilustração esquemática das modificações do genoma compreendido no vírus recombinante OVN, OVH e dICPO em comparação com a cepa de vírus KO; sendo que o símbolo x indica uma deleção.
[0127] A figura 4 mostra os resultados da eletroforese em gele de produtos obtidos por PCR usando o genoma da cepa de vírus KOS, OVN, OVH ou dICPO como um padrão e primers capazes de especificamente amplificar o gene ICPO, gene ICP34.5, gene ICP27 ou o promotor do núcleo hTERT.
[0128] A figura 5 mostra os resultados da análise de PCR quantitativo em tempo real da expressão do gene IE (mRNA) de KOS, OVN, ou dICPO.
[0129] A figura 6 mostra os títulos de vírus após a infecção de células L-02 (figura 6 A) ou células U-2OS (Figura 6B) por 48 horas com o vírus KOS, OVN, OVH ou dICPO em uma multiplicidade de infecção de 1 (ou seja, MOI = 1).
[0130] A figura 7 mostra os títulos de vírus de pontos do tempo diferentes (12 h, 24h, 36h, 48 h e 60 h após infecção) após infecção de monocamadas de células U-2 OS com vírus KOS, OVN, OVH, ou dICPO em um MOI de 0,01. Os resultados na figura 7mostra que o vírus KOS, OVN, OVH ou dICPO tem substancialmente a capacidade replicação comparável em células de tumor (por exemplo, células U-2 OS).
[0131] A figura 8 mostra a taxa de sobrevivência celular após infecção das células L-02 (figura 8A) ou células U-2 OS (figura 8B) por 72 horas com o vírus KOS, OVN, OVH ou dICPO em um MOI de 1; sendo que MOCK representa as células sem estar infectada com o vírus. Os resultados na figura 8 mostra que o vírus KOS, OVN, OVH, e dICPO foi substancialmente
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82/113 comparável com a capacidade de morte celular em células de tumor (por exemplo, células U-2 OS) , mas o vírus OVN e OVH teve a capacidade de morte celular significativamente menor em relação aos vírus KOS e dICPO em células normais (por exemplo, células L-02).
[0132] A figura 9 mostra a taxa de sobrevivência celular após a infecção de várias células de tumor com o vírus OVN ou OVH por 48 horas; sendo que o MOCK representa as células de tumor sem estar infectada com o vírus. Os resultados experimentais da figura 9 mostra que o vírus recombinante OVN e OVH pode matar significativamente uma variedade de células de tumor.
[0133] A figura 10 mostra a taxa de sobrevivência de camundongos após a injeção intracranial do vírus KOS, dICPO, OVN ou OVH em uma determinada dose; sendo que os veículos representam os camundongos sem estar injetados com o vírus.
[0134] A figura 11 mostra as curvas de volume-tempo de tumor (Figura 11A) e as curvas de taxa-tempo de sobrevivência (Figura 11B) de camundongos pelados inoculados com as células Huh7 após o tratamento com OVN ou OVH; sendo que DMEM representa os camundongos não tratados.
[0135] A figura 12 mostra as curvas de volume-tempo do tumor de tumores no flanco esquerdo (Figura 12 A) e os tumores sobre o flanco direito (Figura 12B) do camundongo (C57BL/6) inoculado com células Hepal-6 após o tratamento com OVN ou OVH, sendo que DEMEM representa o camundongo não tratado.
[0136] A figura 13 é uma ilustração esquemática mostrando a diferença na estrutura de genoma entre os vírus recombinante OVH, OVH1 e OVH2 e o vírus recombinante OVN; sendo comparado
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83/113 com o vírus recombinante OVN, a sequência do promotor nativo do gene ICP27 do vírus OVH recombinante, a sequência do promotor nativo do gene VP5 do vírus recombinante 0VH1, a sequência do promotor nativo do gene ICP4 do vírus recombinante 0VH2, foram substituídos com a sequência do promotor núcleo hTERT, respectivamente.
[0137] A figura 14 é uma ilustração esquemática das diferenças de estrutura do genoma entre o vírus recombinante d34.5/01acZ, OVN, OVN-GFP,OVN-PD-l-scfv, OVH-GPF e OVH-PD-1scfv; sendo que NULL representa a deleção.
[0138] A figura 15 mostra os resultados de microscopia fluorescente de observação de células U-2 OS infectadas com o vírus recombinante OVN-GFP ou OVH-GFP.
[0139] A figura 16 mostra que após a infecção de células U2-OS com o vírus recombinante OVH ou OVH-PD-l-svfv por 2 4 horas ou 48 horas, a capacidade de sobrenadantes celulares para inibir a ligação específica de PD-1/PD-L1 (Figura 16A) e o resultado da análise da interação entre os sobrenadantes celulares e a proteína PD-1 (Figura 16B); sendo que MOCK representa as células de tumor sem ser infectado com o vírus. [0140] A figura 17 mostra as curvas de volume-tempo do tumor de tumores no flanco esquerdo (Figura 17A) e tumores sobre o flanco direito (Figura 17B) do camundongo (C57BL/6) inoculado com células Hepal-6 após o tratamento com OVH ou OVH-PD-1, sendo que o veículo representa camundongos não tratados.
[0141] A figura 18 mostra os títulos de vírus após a infecção de células U-2 OS por 60 horas com vírus OVN, OVNdUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT ou OVN-dNF em um MOI de 0,01, respectivamente.
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84/113 [0142] A figura 19 mostra as taxas de sobrevivência celular após infecção de células normais (células L-02, figura 19A) ou células de tumor (células U-2 OS, Figura 19B) por 72 horas com o vírus OVN, OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT ou OVN-dNF em um MOI de 0,5 respectivamente.
Modelos específicos para realizar a invenção [0143] A invenção é descrito com referência aos exemplos a seguir que são pretendidos para ilustrar, mas não limitar a invenção.
[0144] A menos que de outro modo especificado, os métodos experimentais de biologia molecular, m'todos experimentais virológicos, imunoensaios, e métodos experimentais zoológicos usados no pedido de patente são todos métodos experimentais convencionais usados pelos técnicos no assunto. Por exemplo, os métodos experimentais biológicos moleculares podem ser os métodos descritos em: J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, e F. M. Ausubel et al., Guide to Molecular Biology Experiments, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995. Os reagentes (por exemplo, enzimas, plasmideos, e primers) usados nos respectivos exemplos foram comprados a partir de companhias comerciais, e vários reagentes (por exemplo, enzimas) foram usados de acordo com as condições recomendadas pelos fabricantes. Estes técnicos no assunto entenderíam que os exemplos são ilustrativos para a invenção, e não pretendem limitar o escopo da invenção.
Exemplo 1 - Construção de vírus recombinante OVN e OVH (1.1) Cultura e determinação do título do vírus simplex herpes tipo 1 (HSV-1):
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85/113 [0145] A cepa KOS de HSV-1 alelo-selvagem foi comprada na ATCC (Cat. No. VR-1493™), e sua informação de todo o genoma foi publicado no NCB1 (GenBank: JQ673480.1) . As células Vero cultivadas (compradas da ATCC< USA, Cat. No. CCL-81™) foram infectadas com a cepa KOS em um MOI de 0,1. Após 48 horas, todas as células foram colhidas por uma espátula de célula e centrifugadas para remover o meio de cultura. O precipitado celular obtido foi re-suspenso no meio completo fresco e armazenado a -80°C. Subsequentemente, a suspensão celular foi repetidamente congelada-descongelada (3 vezes), então centrifugada, e o sobrenadante foi colhido para obter uma solução de vírus. A solução de vírus foi aliquotada e armazenada em -80°C.
[0146] As células U-2 OS (comprados na ATCC, USA, catálogo número HTB_96™) foram semeadas em placas de cultura de 6 cm em uma densidade de 1 x 106 células. Após as células serem crescidas em uma monocamada, 10 diluições em séries da solução do vírus obtido acima foram realizadas e então as células foram infectadas com as soluções do vírus (500 μΐ) de gradientes diferentes de diluição, respectivamente. Após 75 minutos de infecção, o meio de cultura celular foi descartado, 5 mL do meio completo fresco foi adicionado, e as células foram cultivadas ainda. Após 2 horas, 10 mL de meio metilcelulose foi adicionado, e a placa foi colocada em um incubador por 2 dias. Subsequentemente, um meio basal compreendendo 0,01% de vermelho neutro foi adicionado dentro da placa e a incubação foi continuada por 12 horas. Após completar a cultura, todo o meio de cultura celular foi descartado, e as placas das respetivas placas de cultura foram contadas. De acordo com o número de placas de cada
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86/113 placa de cultura e o fator de diluição da solução de vírus, o título do vírus foi calculado de acordo com a fórmula a seguir: título de vírus (PFU/ml) = número de placas por placa x 2 x fator de diluição do vírus.
(1.2) Construção do plasmídeo recombinante:
[0147] A sequência (SEQ ID NO:1) entre a base 33 (nt33) para a base 587 6 (nt587 6) do genoma do vírus HSV-1 alelo selvagem (GenBank: JQ673480.1) foi clonada em um vetor PUC57 comercialmente disponível (Shanghai Shenggong) usando enzimas de restrições Saci e PstI obtendo, assim, plasmídeo PUC57-F0. Subsequentemente, a sequência entre os sítios de divagem Ncol e Sall no plasmídeo PUC57-F0 foi substituído com a sequência de gene de LacZ (SEQ ID NO:2) usando endonucleases de restrição Ncol e Sail, obtendo assim, o plasmídeo PUC57d34,5/01acZ. Adicionalmente, a sequência entre os sítios de divagem Ncol e Sall no plasmídeo PUC57-F0 foi também cortado obtendo, assim, o plasmídeo PUC57-d34.5/0.
(1.3) Construção e identificação do vírus recombinante OVN e OVH:
[0148] As estratégias de construção do vírus recombinante OVN e OVH são mostradas nas Figuras IA - 1B, respectivamente. (1.3.1) Construção de vírus recombinante d34.5/0LacZ:
[0149] As células U-2 OS foram semeadas em placas de 24 poços em uma densidade de 1 x 105 células por poço e cultivados durante anoite a 37°C em um incubador de cultura celular. O plasmídeo recombinante PUC57-d34.5/01acZ foi transfectados dentro de células U-2 OS usando o reagente de transfecção lipofectamina 2000. Após 24 horas de transfecção, as células foram infectadas com a cepa do vírus KOS em um MOI de 3. Após o efeito citopático ser observado, as células
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87/113 foram colhidas. As células colhidas foram lisadas por repetição do método congelamento-descongelamento, então centrifugadas e o sobrenadante foram colhidos para obter uma solução vírus. 0 título do vírus da solução do vírus obtido foi medido.
[0150] O vírus colhido foi inoculado dentro de uma placa cultura no qual as monocamadas de células U-2 OS foram crescidos. Após cultivar 2 dias, um meio basal compreendendo 0,01% de vermelho neutro e 100 mg/mL X-gal foi uniformemente adicionado à placa de cultura, e as células foram ainda cultivadas por 12 horas. Subsequentemente, as placas azuis apareceram sobre a placa de cultura foram selecionadas, e o vírus obtido a partir das placas azuis serem monoclonalizadas (3 vezes) para obter o vírus recombinante d34.5/01acZ. Após ser verificado por sequenciamento, foi observado que as duas cópias dos genes ICP34.5 e ICPO no genoma do vírus recombinante d34.5/01aZ foram substituídos com o gene LacZ quando comparado à cepa KOS.
(1.3.2) Construção do vírus recombinante OVN (d34.5/0) [0151] As células U-2 OS foram semeadas em placas de 24 poços em uma densidade de 1 x 105 células pro poço e cultivadas durante a noite a 37°C em um incubador de cultura celular. O plasmídeo recombinante PUC57-d34.5/0 foi transfectados dentro das células U-2 OS usando o reagente de transfecção lipofectamina 2000. Após 24 horas de transfecção, as células foram infectadas com o vírus recombinante d34.5/01acZ em um MOI de 3. Após o efeito citopático ser observado, as células foram colhidas. As células colhidas foram lisadas pelo método congelamento-descongelamento, então centrifugadas, e o sobrenadante foram colhidos para obter uma
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88/113 solução viral. 0 título do vírus da solução de vírus obtida foi medido.
[0152] O vírus colhido foi semeado em uma placa de cultura na qual a monocamada das células U-2 OS foi crescida. Após o cultivo por 2 dias, um meio basal compreendendo 0,01% de vermelho neutro e 100 mg/mL X-gal foi uniformemente adicionado a placa de cultura, e as células foram ainda cultivadas por 12 horas. Subsequentemente, as placas brancas pareceram sobre a placa de cultura foram selecionadas, e o vírus obtido a partir das placas brancas foi monoclonado (3 vezes) para obter o vírus recombinante OVN (d34.5/0). Após ser verificado pelo sequenciamento, as duas cópias do gene lacZ foram deletados no genoma do vírus recombinante OVN (d34.5/0) quando comparado com o vírus recombinante d34.5/01acZ; e a sequência de nt510 para nt5439 (SEQ ID NO:6) e a sequência de ntl20802 para ntl25731 (SEQ ID NO:6) do genoma HSV-1 alelo-selvagem (GenBank: JQ673480.1) foram deletados no vírus recombinante OVN (d34.5/0) quando comparado com a cepa KOS.
(1.3.3) Construção do vírus recombinante OVH:
[0153] Sequência de base 112861 (ntll2861) para 113422 (ntll3422) (SEQ ID NO:3) do genoma do vírus HSV-1 aleloselvagem (GenBank: JQ673480.1) foi clonado dentro do vetor PUC57 comercialmente disponível pelo uso dea endonuclease de restrição Saci e Pmel, obtendo assim, o plasmídeo PUC57-27pO. Subsequentemente, a sequência da base 113590 (ntll3590) para a base 115194 (ntll5194) (SEQ ID NO:4) do genoma viral HSV-1 alelo-selvagem (GenBank: JQ673480.1) foi clonado dentro do plasmídeo PUC57-27pO pelo uso das enzimas de restrição Spel e PstI, obtendo assim, o plasmídeo PUC57-27pl. No plasmídeo
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PUC57-27pl, a sequência promotora nativa do gene ICP27 (ntll3422 para ntll3590 do genoma HSV-1 alelo selvagem (GenBank; JQ673480.1)) foi deletado.
[0154] Subsequentemente, a sequência entre os sítios de divagem Pmel e Spel no plasmídeo PUC57-27pl foi substituído com a sequência de expressão LacZ (SEQ ID NO:2), obtendo assim o plasmídeo PCU57-27p/lacZ. Em adição, a sequência entre os sítios de divagem Pmel eSpel no plasmídeo PUC5727pl foi substituído para a sequência do núcleo do promotor da transcriptase reversa telomerase adulta hTERT (SEQ ID NO:5; ver, Takakura M., Kyo S, Kanaya T., et al., Cloning of human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene promoter and identification of proximal core promoter sequences essential for transcriptional activation in immortalized and câncer cells [J]. Cancer Res., 1999, 59(3): 551-557), obtendo assim o plasmídeo PUC57-27p/htert. No plasmídeo PUC57-27p/htert, o gene ICP27 foi regulado por um promotor tumor-específico (ou seja, o núcleo do promotor hTERT).
[0155] Subsequentemente, com referência aos métodos e construção descritos em (1.3.1) e (1.3.2), o vírus recombinante OVN foi usado como um vírus de partida, e a sequência do núcleo do promotor hTERT foi introduzida dentro do genoma OVN do vírus recombinante pelo uso do plasmídeo PUC57-27p/lacZ e PUC57-27p/htert para regular o gene ICP27, construindo asism, um vírus recombinante OVH. Após ser verificado pelo sequenciamento, a sequência do promotor nativo do gene ICP27 (ntll2423 para ntll2589 do genoma HSV-1 alelo selvagem (GenBank: JQ673480.1)) foram substituídos pelo núcleo do promotor hTERT (SEQ ID NO:5) no genoma do vírus recombinante OVH quando comparado com o vírus recombinante
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OVN.
(1.4) Comparação do vírus recombinante OVN e OVH com vírus HSV recombinante conhecido:
[0156] Atualmente, uma variedade de vírus HSV recombinante foi desenvolvida par auso na terapia de tumor, incluindo, por exemplo, HSV1716, NV1020, OncoVexGM_CSF (T-VEC) , e do gênero. A modificação do genoma compreendido nestes vírus HSV recombinante e o vírus recombinante OVN e OVH da presente invenção estão resumidos na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2: Modificações do genoma compreendido em vários vírus
HSV recombinante
| Nome | Modificação Genética | País |
| HSV1716 | Deleção de cópias duplas de ICP34.5 | UK |
| NV1020 | Deleção de fragmento 15kb na junção UL/US (ou seja, deleção de cópias únicas ICP34.5, ICPO, ICP4 e UL56) | USA |
| G207 | Deleção de duas cópias de ICP34.5 e ICP6 | USA |
| OncoVexGM_CSF (t-vec) | Deleção de duas cópias d ICP34.5 e ICP47 | USA |
| OVN | Deleção de duas cópias de (ICP34.5 e ICPO) | China |
| OVH | Deleção de duas cópias de (ICP34.5 e ICPO), e o promotor nativo do gene ICP27 foi substituído com o núcleo do promotor hTERT | China |
[0157] A figura 2 é uma ilustração esquemática das modificações do genoma compreendido no vírus recombinante HSV1716, NV1020, G207, OncoVexGM_CSF (T-VEC) e OVN.
Exemplo 2 - Caracterização de vírus recombinante OVN e OVH: [0158] O vírus recombinante dICPO foi construído com a referência para o método descrito no Exemplo 1, que teve a deleção de duas cópias do gene ICPO quando comparado à cepa KOS. A cepa do vírus KOS e o vírus recombinante dICPO foram usados como controle do vírus para caracterizar o vírus recombinante OVN e OVH. A figura 3 é uma ilustração esquemática das modificações do genoma compreendido no vírus recombinante OVN, OVH e dICPO comparado à cepa KOS do vírus;
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91/113 sendo que o vírus recombinante dICPO foi a deleção de duas cópias do gene ICPO comparado à cepa do vírus KOS; o vírus recombinante OVN teve a deleção de duas cópias do gene ICP34.5 e as duas cópias do gene ICPO; o vírus OVH recombinante teve a deleção de duas cópias do gene ICP34.5 e as duas cópias do gene ICPO, e o promotor nativo do gene ICP27 foi substituído com o núcleo do promotor hTERT.
[0159] As deleções do gene no vírus recombinante OVN, OVH e dICPO foram verificados por PCR. Resumidamente, o PCR foi realizado usando primers para a amplificação específica do gene ICPO, gene ICP34.5, gene ICP27 ou núcleo do promotor hTERT e uso do genoma da cepa do vírus KSO, OVN, OVH ou dICPO como um padrão. Os primers usados no PCR são resumidos na Tabela 3.
Tabela 3 - Sequências de primers
| SEQ ID NO: | Nome do Primer | Sequência (5'-3') |
| 9 | ICP0-F | GACGTGTGCGCCGTGTGCACGGATGA |
| 10 | ICP0-R | ACTCTGTTCTTGGTTCGCGGCCTGAGCCA |
| 11 | ICP34.5-F | ATGGCCCGCCGCCGCCATCGC |
| 12 | ICP34.5-R | TTAGACCGAGTTCGCCGGGC |
| 13 | ICP27-F | ATGGCGACTGACATTGATATGCTAATTGA |
| 14 | ICP27-R | C TAAAACAG G GAG T T G CAATAAAAATAT T T G C |
| 15 | htertp-F | CTCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGAC |
| 16 | htertp-R | CTGCCTGAAACTCGCGCCGCGAGGA |
[0160] Após a reação ter completada, o produto do PCR foi analisado por eletroforese em gel. Os resultados são mostrados na Figura 4. A figura 4 mostra os resultados da eletroforese em gel dos produtos obtidos pelo PCR usando um genoma da cepa do vírus KOS, OVN, OVH, ou dICPO como padrão e os primers capazes de amplificar especificamente o gene ICPO, gene ICP34.5, gene ICP27 ou núcleo do promotor hTERT, sendo que a coluna 1 representa um marcador de peso molecular DNNA;
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92/113 coluna 2 representa um produto de PCR usando o genoma KOS da cepa do vírus como padrão; coluna 3 representa um produto de PCR usando o genoma dICPO do vírus recombinante como padrão; a coluna 4 representa um produto de PCR usando o genoma OVN do vírus recombinante como padrão; a coluna 5 representa um produto de PCR usando o genoma OVH do vírus recombinante como padrão; a coluna 6 representa um produto de PCR usando água como padrão.
[0161] Os resultados na figura 4 mostra que o genoma da cepa do vírus KOS compreendendo o gene ICPO, gene ICP34.5 e o gene ICp27, mas não compreende o núcleo do promotor hTERT; o genoma do vírus recombinante dICP compreendendo o gene ICP34.5 e o gene ICp27, mas não compreendendo o gene ICPO e o núcleo do promotor hTERT; o genoma do vírus OVN recombinante compreendendo o gene ICP27, mas não compreendem o gene ICp34.5, o gene ICPO e o núcleo do promotor hTERT, o genoma do vírus recombinante OVH compreendendo o gene ICp27 e o núcleo do promotor hTERT, mas não compreende o gene ICP34.5 e o gene ICPO.
[0162] Em adição, a expressão do gene (mRNA) das células após infecção com KOS, OVN, OVH ou dICPO foi também analisado pelo uso de PCR quantitativo em tempo real. Resumidamente, as células hospedeiras U-2 OS foram infectadas com KOS, OVN, OVH e dICPO, respectivamente. Após efeito citopático ser observado, as células foram colhidas e o mRNA total foi extraído. O mRNA total foi transcrito reverso dentro do cDNA, e o PCR quantitativo em tempo real foi realizado usando primers especificamente amplificando o gene ICPO, o gene ICP34.5 ou o gene ICP27, respectivamente. O resultado é mostrado na Figura 5.
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93/113 [0163] A figura 5 mostra os resultados da análise de PCR quantitativo em tempo real da expressão do gene IE (mRNA) de KOS, OVN, OVH ou dICPO. Os resultados na figura 5 mostra que a cepa KOS foi capaz de expressar o gene ICPO, o gene ICP34.5 e o gene ICP27; o vírus dICPO recombinante foi capaz de expressar o gene ICp34,5 e o gene ICP27, mas não expressa o gene ICPO; o vírus OVN recombinante e OVH foram capazes de expressar o gene ICp27, mas não expressou nem o gene ICp34.5 nem o gene ICPO. Isto indica que o vírus recombinante dICPO teve a deleção de duas cópias do gene ICPO, e a proteína ICPO não podería ser expressa após infecção das células hospedeiras; e o vírus recombinante OVN e OVH, ambos tiveram delção de duas cópias do gene ICP34.5 e o gene ICPO, e assim, a proteína ICpO e a proteína ICP34,5 podería não ser expressa após a infecção de células hospedeiras.
Exemplo 3 - Avaliação da capacidade de replicação e capacidade morte do vírus recombinante OVN/OVH:
[0164] As células normais (células L-02) e células de tumor (células U-2 OS) em fase de crescimento logarítmica forma semeadas em placas de cultura de 6 cm em uma densidade de 5-
7,5 x 106 células/placa. Subsequentemente, as células de cultura foram infectadas com o vírus KOS, OVN, OVH ou dICPO em um MOI de 1. Após 48 horas de infecção, o estado das células foi observado sob um microscópio e fotografada. Subsequentemente, as células infectadas pelo vírus foram digeridas, e a taxa de sobrevivência das células foi calculada pela coloração azul tripan. A taxa de sobrevivência celular (%) = (número de células viáveis após infecção com vírus) / (número de células controle não infectadas com o vírus) x 100. Uma replicação, 3 vezes, foi observada em cada
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94/113 grupo de experimentos e o resultado experimental foi a média de 3 experimentos independentes. Em adição, o título do vírus em pontos do tempo diferente após infecção de células normais (células L-02) e células de tumor (células U-2 OS) com o vírus KOS, OVN, OVH ou dICPO foram determinados com referência para o protocolo descrito no Exemplo 1. Uma replicação em 3 poços foi ajustada para cada grupo de experimentos e o resultado experimental foi a média de 3 experimentos independentes. Os resultados experimentais são mostrados na figura 6-8.
[0165] A figura 6 mostra o título do vírus após 48 horas de infecção de células L-02 (Figura 6 A) ou células U-2 OS (figura 6B) com o vírus KOS, OVN, OVH ou dICPO em um MOI de
1. Os resultados na Figura 6 A mostra que ambos os vírus KOS e dICPO teve um nível alto de replicação após infecção de células L-02, e seu título de vírus alcançou aproximadamente 1, 94 x 107 e 3,01 x 106 pfu/ml após 48 horas de infecção; enquanto a capacidade de replicação do vírus OVN e OVH foram diminuídas significativamente, e seu título de vírus apenas cerca de 2,14 x 105 e 1,85 x 103 pfu/ml após 48 horas de infecção. Os resultados na figura 6B mostra que o vírus KOS, OVN, OVH e dICPO teve um nível alto de replicação após infecção de células U-2 OS, e seu título de vírus foram 1,011,83 x 108 pfu/ml após 48 horas de infecção. Estes resultados indicam que o vírus KOS e dICPO foram capazes de replicar em altos níveis em células normais (por exemplo, células L-02) e células de tumor (por exemplo, células U-2 OS) , enquanto o vírus OVN e OVH foram apenas capazes de replicar em altos níveis em células de tumor (por exemplo, células U-2 OS) (sua capacidade de replicação foram apenas levemente diminuídas
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95/113 quando comparadas em células normais (por exemplo, células L02). Por exemplo, em células L-02, a capacidade de replicação do vírus OVN e OVH foram diminuídas por cerca de 90 vezes e 104 vezes, respectivamente, quando comparado aquela do vírus KOS; e a capacidade de replicação do vírus OVN e OVH foram diminuídas por cerca de 14 vezes e 1,6 x 103 vezes, respectivamente, quando comparado aquela do vírus dICPO.
[0166] A figura 7 mostra o título do vírus em diferentes pontos do tempo (12h, 24h, 36 h, 48 h e 60 h após infecção) após infecção de monocamadas de células U-2 OS com vírus KOS, OVN, OVH ou dICPO em um MOI de 0,01. Os resultados na figura 7 mostra que o vírus KOS, OVN, OVH ou dICPO em um MOI de 0,01. Os resultados na figura 4 mostra que o vírus KOS, OVN, OVH ou dICPO teve uma capacidade de replicação substancialmente comparável em células de tumor (por exemplo, células U-2 OS).
[0167] A figura 8 mostra a taxa de sobrevivência celular após 72 horas de infecção de células L-02 (Figura 8A) ou células U-2 OS (Figura 8B) com o vírus KOS, OVN, OVH ou dICPO em um MOI de 1; sendo que MOCK representa as células sem ser infectada com o vírus. Os resultados na figura 8A mostra que após 72 horas de infecção, a capacidade de morte do vírus KOS e dICPO para células L-02 foram de cerca de 91,5% e 89%, respectivamente (ambas tendo significativa capacidade de morte para as células L-02); a capacidade de morte do vírus OVN e OVH para as células L-02 foram de cerca de 42% e 5%, respectivamente (sua capacidade de morte para as células L-02 foi significativamente diminuída). Os resultados na figura 8B mostra que o vírus KOS, OVN, OVH e dICPO podería matar 100% de células U-2 OS após infecção por 72 horas (todos eles
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96/113 tendo capacidade muito forte de morte para as células U-2 OS). Estes resultados indicam que o virus KOS e dICPO tiveram capacidade extremamente alta para as células normais (por exemplo, células L-02) e células de tumor (por exemplo, células U-2 OS); enquanto o vírus OVN e OVH apenas teve alta capacidade de morte para células tumorais (por exemplo, células U-2 OSO (sua capacidade de morte foi substancialmente a mesma que aquelas do vírus KOS e dICPO), mas sua capacidade de morte para células normais (por exemplo, células L-02) foram significativamente diminuída. Por exemplo, as células L-02, a capacidade de morte do vírus OVN e OVH foram diminuídas por certa de 54,1% e 94,5%, respectivamente, quando comparado com o vírus KOS; e a capacidade de morte do vírus OVN e OVH foram diminuídos por certa de 52,7% e 94,4%, respectivamente, quando comparado com o vírus dICPO.
[0168] Os resultados experimentais nas figuras 6-8 mostra que comparado com o vírus KOS alelo-selvagem e o vírus dICP) recombinante, a capacidade de replicação e capacidade de morte do vírus recombinante OVN e OVH em células normais são significativamente diminuído, enquanto sua capacidade de replicação e capacidade de morte nas células de tumor foram substancialmente o mesmo (ou apenas levemente diminuído). Isto indica que o vírus recombinante OVN e OVH da presente invenção são capazes de não apenas manter a capacidade de replicação alta e a capacidade de morte alta (com boa atividade anti-tumor) em células de tumor, mas também significativamente reduzindo a virulência para células normais. Portanto, o vírus recombinante OVN e OVH da presente invenção são úteis para o tratamento anti-tumor, e eles tem segurança maior para as células normais e podem ser usadas em
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97/113 doses maiores.
[0169] Em adição, a capacidade de morte do vírus recombinante OVN e OVH para várias células de tumor foram também determinadas com referência ao método descrito acima. Resumidamente, as células de tumor em bom estado e em fase de crescimento logarítmica foram semeadas em placas de cultura de 6 cm em uma densidade de 5-7,5 x 106 células/placa. Subsequentemente, as células de tumor cultivadas foram infectadas com o vírus OVN ou OVH em um MOI de 1. Após 48 horas de infecção, as células de tumor infectadas foram digeridas, e a taxa de sobrevivência das células de tumor foi calculada por coloração de tripan azul. Neste experimento, as células sem ser infectada com o vírus foram usadas como controle. A taxa de sobrevivência celular (%) = (número de células viáveis após infecção com o vírus) / (número de células controle não infectadas com o vírus) x 100. Uma replicação de 3 poços foi ajustada para cada grupo de experimento e o resultado experimental foi a média de 3 experimentos independentes. Os resultados experimentais estão mostrados na figura 9.
[0170] A figura 9 mostra os resultados da taxa de sobrevivência celular após infecção de várias células de tumor com o vírus OVN ou OVH por 4 8 horas; sendo que MOCK representa as células de tumor que não foram infectadas com o vírus. O resultado experimental na figura 9 mostra que o vírus recombinante OVN e OVH podería significativamente matar uma variedade de células de tumor, incluindo por exemplo, células de câncer de pulmão H1299, H520, H1975, NCI-H358 e A549 (5 cepas), células de câncer de fígado Huh7, Hep3B,
HepG2, GSG7701, SMMC7721, Hepal-6, BEL7404, PLC/PRF, QGY7703
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98/113 (9 cepas); células de câncer de mama MADMB231, MCF7, MADMB468 (3 cepas); células de osteosarcoma U2OS e SAOS2 (2 cepas); células de câncer de ovário SKOV3 e CA0V3 (2 cepas); células de câncer cervical SiHA e Hela (2 cepas); células de câncer de próstata PC-3 (1 cepa); células de glioma U87MG (1 cepa); melanoma A375 (1 cepa); câncer coloretal HCT116 (1 cepa) e câncer pancreático Panel (1 cepa) ; e o OVN e OVH teve capacidade de morte do tumor comparável. Estes resultados experimentais mostram que o vírus recombinante OVH e OVH da presente invenção teve boa capacidade de morte para várias células de tumor e pode ser usado para tratamento tumoral.
Exemplo 4 - Avaliação de neurotoxicidade e segurança in vivo do vírus recombinante OVN/OVH:
[0171] O vírus herpes é neurotóxico e neurologicamente latente, com o dano maior sendo a capacidade de infectar o sistema nervoso central de humanos ou animais conduzindo a sérios efeitos colateral tais como encefalite. Entretanto, o caminho mais direto e sensível para avaliar a morte direta do sistema nervoso central de camundongo pelo vírus. Neste exemplo, foi avaliada a neurotoxicidade e a segurança de vários vírus HSV-1 recombinante em camundongos usando um modelo encefalite de camundongo induzido pela injeção intracranial do vírus.
[0172] Resumidamente, 4-6 semanas os camundongos fêmeas BALB/c (n=10) foram usados como indivíduos experimentais, e 20 μΐ de vírus foi lentamente injetado intracranialmente no lóbulo anterior esquerdo do cérebro, próximo da junção da sutura coronal e sutura sagital. Após a injeção, a incidência e sobrevivência do camundongo foram observadas a cada dia. A figura 10 mostra a taxa de sobrevivência de camundongo após
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99/113 injeção intracranial do virus KOS, dICPO, OVN ou OVH em uma dose determinada; sendo que o veículo representa camundongo sem ser injetado com vírus.
[0173] Os resultados mostram que quando a injeção intracranial de 1 x 104 PFU do vírus KOS alelo selvagem, 100% do camundongo moderado desenvolvido para efeitos colaterais severos; após o início da doença, o camundongo foi frequentemente acompanhado pelos sintomas tais como aumento de cabelo, anorexia, frio, dilatação, e ainda paralisia, e 100% dos camundongos morreram dentro de 4-6 dias após a infecção do vírus (Figura 10). Quando a injeção intracranial de 1 x 105 PFU do vírus dICPO, cerca de 80% dos camundongos morreram dentro de 4-8 dias após a injeção do vírus, e apenas 20% do camundongo recuperou gradualmente após uma semana.
[0174] Quando uma dose alta (1 x 107 PFU) do vírus OVN foi injetado intracranialmente, sem camundongo (0/10) morreu durante o período experimental total, e a taxa de sobrevivência do camundongo foi 100%. Isto indica que comparado com o vírus KOS alelo-selvagem e o vírus recombinante dICPO, a neurotoxicidade do vírus OVN foi significativamente diminuída, a segurança in vivo foi
| notavelmente melhorada, | e | as doses usadas | podería ser | |
| aumentada por pelo | menos | 1000 vezes | e | 100 vezes, |
| respectivamente. | ||||
| [0175] Quando uma dose | mais | alta (4 x 107 | PFU) | do vírus OVN |
foi injetada intracranialmente, apenas um camundongo (1/10) morreu durante o período do experimento total, e a taxa de sobrevivência do camundongo foi 90%. Isto indica que o vírus OVN teve uma desse meio-letal mais alta do que 4 x 107 PFU no camundongo, e assim, teve excelente segurança in vivo.
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100/113 [0176] Quando 4 x 107 PFU do vírus OVH foi intracranialmente injetado, nenhum camundongo (0/10) morreu durante o período experimental total, e a taxa de sobrevivência de camundongo foi 100%. E, mais importantemente, o camundongo não mostra qualquer reação colateral através do período experimental. Isto indica que o vírus OVH teve ainda uma diminuição significativa na neurotoxicidade e ainda melhorou significativamente a segurança in vivo, quando comparado ao vírus OVN.
[0177] Os resultados experimentais acima mostram que o vírus OVN e OVH da presente invenção tem baixa neurotoxicidade, alta segurança in vivo, e tem amplos prospectos de aplicação.
Exemplo 5 - Avaliação de potencial terapêutico do vírus recombinante OVN/OVH:
[0178] As células de tumor (Huh7 e Hepal-6) foram cultivadas no meio completo compreendendo 10% de soro de bezerro em um incubador a 37 °C, com 5% de CO2. Quando as células forma crescidas na fase de crescimento logarítmica, as células foram digeridas com 0,05% de tripsina e lavadas com PBS para obter uma suspensão celular (densidade celular de 5 x 107/mL) re-suspensas em PBS.
[0179] 0,1 mL de suspensão de células Huh7 foram inoculados subcutaneamente dentro do flanco direito de cada um dos camundongos pelados com 5-6 semanas de idade. Quando o tumor sobre as costas do camundongo cresceu 6 mm x 6 mm (volume do tumor foi aproximadamente 100 mm3), os camundongos foram agrupados (n=8/grupo) e o tratamento foi iniciado (Dia 0) . O regime de tratamento foi como a seguir: 1 x 107 PFU do vírus (OVN ou OVH) ou o mesmo volume de DMEM (usado como um
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101/113 controle) foi injetado intratumoralmente, uma vez a cada 3 dias, por um total de 3 injeções.
[0180] 0,1 mL da suspensão de célula Hepa 1-6 foi inoculado subcutaneamente sobreo franco esquerdo e direito de cada camundongo com 5 semanas de idade (C57BL/6). Quando o tumor sobre as costas do camundongo cresceu 6 mm x 6 mm (volume do tumor foi de aproximadamente cerca de 100 mm3) , os camundongos foram agrupados e o tratamento foi iniciado. O regime de tratamento foi como a seguir: 1 x 107 PFU do vírus (OVN ou OVH) ou o mesmo volume de DMEM foi injetado intratumoralmente, uma vez a cada 3 dias, por um total de 3 injeções.
[0181] O status do camundongo foi monitorado a cada 3 dias e o tamanho do tumor foi medido usando um calibrador vernier eletrônico, o volume do tumor e a taxa de inibição do tumor foram calculados de acordo com a fórmula a seguir:
V(volume) = [L x (W)2]2; L representa um diâmetro longo, e W representa um diâmetro curto
Taxa de inibição do tumor = (volume do tumor do grupo controle - volume do tumor do grupo experimental)/volume do tumor do grupo controle x 100% [0182] A figura 11 mostra as curvas de volume-ptempo do tumor (Figura 11 A) e as curvas de tempo taxa de sobrevivência (Figura 11B) do camundongo pelado inoculado com células Huh7 após o tratamento com OVH ou OVH; sendo que DMEM representa o camundongo não tratado. Os resultados da figura 11 A mostra que após três doses das injeções do vírus, ambos os vírus recombinante OVN e OVH inibiram significativamente o crescimento do tumor; no dia 21, a taxa de inibição do OVN alcançou 86,1% e a taxa de inibição de OVH alcançou 78%. Os
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102/113 resultados na figura 11B mostra que após as três injeções do vírus, o vírus recombinante OVN e OVH prolongou significativamente o tempo de sobrevivência do camundongo pelado carregando o tumor; no dia 60, o grupo controle de camundongos pelados morreram completamente, enquanto o camundongo pelado administrado com o virus recombinante OVN ou OVH ainda tinha uma taxa de sobrevivência de 7 5% após o final do experimento.
[0183] A figura 12 mostra as curvas de volume-tempo do tumor de tumores no flanco esquerdo (Figura 12A) e os tumores no flanco direito (Figura 12B) do camundongo (C57BL/6) inoculado com células Hepal-6 após o tratamento com OVN ou OVH; sendo que DMEM representa o camundongo não tratado. Os resultados na figura 12 mostram que após três doses de injeções de virus sobre o tumor no flanco direito, o virus recombinante OVN e OVH não apenas claramente segurou o tumor no flanco direito do camundongo, mas também liberou o tumor do flanco direito.
[0184] Estes resultados experimentais confirmaram que o virus OVN e OVH da presente invenção tem potencial significante para o tratamento do tumor in vivo, e tem amplo prospecto de aplicação.
Exemplo 6 - construção e caracterização de outros vírus recombinantes (1):
[0185] Neste exemplo, uma série de vírus recombinante derivados foi construída com base no vírus recombinante OVN e OVH.
[0186] Com referência ao método descrito no Exemplo 1 (particularmente 1.3.1 a 1.3.3) o vírus recombinante OVN foi usado como o vírus de partida, e a sequência do núcleo do
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103/113 promotor hTERT foi introduzida dentro do genoma do vírus
| recombinante | OVN | pelo plasmídeo | recombinante | para | regulação |
| do gene VP5 | ou | do gene ICP4, | construindo | assim, | o vírus |
| recombinante | OVH1 | e OVH2. | |||
| [0187] Após | ser | verificado pelo | sequenciamento, a | sequência |
do promotor nativo do gene VP5 (nt40729) para nt40475 do genoma HSV-1 alelo-selvagem (GenBank:JQ673480.1) foram substituídos com a sequência do núcleo do promotor hTERT (SEQ ID NO:5) no genoma do virus recombinante OVH1 comparado com o virus recombinante OVH; no genoma do virus recombinante OVH2, a sequência do promotor nativo do gene ICP4 (ntl46151 para ntl46867 e ntl31706 para ntl30990 do genoma HSV-1 alelo selvagem (GenBank: JQ673480.1) foram substituídos com a sequência do núcleo do promotor hTERT (SEQ ID NO:5).
[0188] A figura 13 é uma ilustração esquemática mostrando as diferenças na estrutura do genoma entre o vírus recombinante OVH, OVH1 e OVH2 e o vírus recombinante OVH; sendo que a sequência do promotor nativo do gene ICp27 do vírus recombinante OVh, a sequência do promotor nativo do gene VP5 do vírus recombinante OVH1, e a sequência do promotor nativo do gene ICP4 do vírus recombinante OVH2 foram substituídos com a sequência do núcleo do promotor hTERT, respectivamente, quando comparado com o vírus recombinante OVN.
[0189] Adicionalmente, com referência ao método descrito no Exemplo 1 (particularmente 1.3.1 para 1.3.3), o vírus recombinante d34.5/01acZ usado como o vírus de partida, e a sequência de nucleotideo codificante da proteína GFP (SEQ ID NO:7), e a sequência de nucleotideo codificante do anticorpo de cadeia única PD-1 anti-humano (SEQ IDNO:8) foram
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104/113 introduzidos dentro do genoma do vírus recombinante d34.5/01acZ para substituído o gene lacZ pelo uso dos plasmídeos recombinantes, construindo assim, e obtendo o vírus recombinante OVN-GFP e OVN-PD-l-scfv. Após ser verificado por sequenciamento, comparado com o vírus recombinante d34.5/01acZ, no genoma do vírus recombinante OVN-GFP, as duas cópias do gene lacZ foram substituídas com a sequência de nucleotídeo codificante da proteína GFP (ou seja, no genoma do vírus recombinante OVN-GFP, a sequência de nt510 para nt5439 e a sequência de nl20802 para ntl25731 do genoma HSV-1 alelo-selvagem (GenBank: JQ673480.1) foram substituídos com a sequência de nucleotídeo codificante da proteína GFP); no genoma do vírus recombinante OVN-PD-l-scfv, as duas cópias do gene lacZ foram substituídas com a sequência de nucleotídeo codificante do anticorpo de cadeia única PD-1 (ou seja, no genoma do vírus recombinante OVN-PDl-scfv, a sequência de nt510 para nt5439 e a sequência de ntl20802 para ntl25731 do genoma HSV-1 alelo selvagem (GenBank:JQ673480.1) foram substituídas com a sequência de nucleotídeo codificante do anticorpo de cadeia única PD-1).
[0190] Adicionalmente, o vírus recombinante OVN-GFP e OVNPD-l-scfv foram usadas como o vírus de partida, e a sequência do núcleo do promotor hTERT foi introduzido dentro do genoma do vírus de partida para regular o gene ICP27 pelo uso do plasmídeo PUZ e PUC57-27p/htert construindo, assim e obtendo o vírus recombinante OVN-GFP e OVH-PD-l-scfv.
[0191] Após ser verificada pelo sequenciamento, comparado com o vírus recombinante OVN-GFP, a sequência do promotor nativo do gene ICP27 (ntll3423 para ntll3589 do genoma do HSV-1 alelo selvagem (GenBank:JQ673480.1)) no genoma do vírus
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105/113 recombinante OVH-GFP foram substituído com a sequência do núcleo do promotor hTERT (SEQ ID NO:5). Comparado com o virus recombinante OVN-PD-l-scfv, a sequência de promotor nativa do gene ICP27 (ntl3423 para ntll3589 do genoma HSV-1 alelo selvagem (GenBank: JQ73480.1)) no genoma do virus recombinante OVH-PD-l-scfv foram substituído com a sequência do núcleo do promotor hTERT (SEQ ID NO:5).
[0192] A figura 14 é uma ilustração esquemática mostrando a diferença da estrutura do genoma do vírus recombinante d34.5/01acZ, OVN, OVN-GFP, OVN-PD-l-scfv, OVH-GFP e OVH-PD-lscfv .
[0193] As células U-2 OS (comprada de ATCC, USA, número do item HTB-96™) foram semeadas nas placas de cultura de 6 cm em uma densidade de 1 χ 106 células. Após as células forma crescidas dentro de uma monocamada, as células forma infectadas com o vírus recombinante OVN-GFP e OVH-GFP, respectivamente. Após o efeito citopático ser observado, as células infectadas com o vírus recombinante OVN-GFP e OVH-GFP foi observado sob um microscópio fluorescente. Os resultados são mostrados na figura 15. A figura 15 mostra os resultados da observação microscópica fluorescente das células U-2 OS infectadas com o vírus recombinante OVN-GFP ou OVH-GFP. Os resultados na figura 15 mostram que OVN-GFP e OVH-GFP infectados com as células U-2 OS foram capazes de emitir fluorescência verde. Isto indica que o vírus recombinante OVN-GFP e OVH-GFP foi capaz de expressar a proteína GFP após infecção das células hospedeiras.
[0194] As células U-2 OS (compradas de ATCC, USA, número de catálogo HTB-96TM) foram semeadas em placas de culturas de 6 cm em uma densidade de 1 χ 106 células. Após as células foram
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106/113 crescidas dentro de uma monocamada, as células foram infectadas com o vírus recombinante OVH e OVH-PD-l-scfv, respectivamente. O sobrenadante na cultura das células foi colhido após 24 horas e 48 horas de infecção, respectivamente, para análise subsequente. O sobrenadante colhido 48 horas após infecção foi submetido a um gradiente de diluições seriais 2 vezes, e a capacidade do sobrenadante de cada diluição para inibir a interação entre PD-1 e PD-L1 foi determinado por um método ELISA com base na competição entre o anticorpo de cadeia única PD-1 e a proteína PD-L1 para ligação para proteína PD-1. Em adição, a capacidade dos sobrenadantes colhidos em 24 horas e 48 horas após infecção para ligar PD-1 foi também determinada por um método ELISA com base na reatividade entre o anticorpo de cadeia única PD1 e a proteína PD-1. Os resultados experimentais estão mostrados na figura 16.
[0195] A figura 16 mostra após infecção das células U-2 OS com o vírus recombinante OVH ou OVH-PD-l-scfv POR 24 HORAS OU 48 horas, a capacidade do sobrenadante celular em inibir a
| ligação específica d< | e PD-1/PD-L1 | (Figura 1 6A) , | e os | |||
| resultados | de | análise | da | interação | entre o sobrenadante | |
| celular e | a | proteína | PD- | -1 (Figura | 16B); sendo que | MOCK |
| representa | as | células | de | tumor sem | ser infectadas | com o |
vírus. Os resultados na figura 16 mostram que o sobrenadante OVH-PD-l-scfv-infectando as células U-2 OS foram capazes de inibir a ligação específica do PD-1/PD-L1 e foram capazes de se ligar especificamente a PD-1. Isto indica que o vírus recombinante OVH-PD-l-scfv expressou um anticorpo de cadeia única PD-1 após infecção de células hospedeira, que se liga ao PD-1 e bloqueia a interação entre PD-1 e PD-L1.
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107/113 [0196] Os resultados experimentais da figura 15-16 indicam que os genomas do vírus recombinante OVN e OVH da presente invenção são úteis como vetores virais para carregar e expressar os genes exógenos.
[0197] Em adição, a capacidade do vírus recombinante OVH e OVH-PD-l-scfv para tratar tumores foram também verificado em camundongo (C57BL/6) inoculado com células Hepl-6 de acordo com o método descrito no Exemplo 5. Os resultados estão mostrados na figura 17.
[0198] A figura 17 mostra as curvas volume-tempo do tumor de tumores sobre o flanco esquerdo (Figura 17A) e os tumores sobre o flanco direito (Figura 17B) dos camundongos (C57BL/6) inoculados com as células Hepal-6 após o tratamento com OVH ou OVH-PD-l-scfv; sendo que o veículo representa o camundongo não tratado. Os resultados na figura 17 mostram que após três doses das injeções de vírus sobre os tumores no flanco direito, o vírus recombinante OVH e OVH-PD-l-scfv não apenas removeu com segurança os tumores no flanco direito do camundongo, mas também removeu os tumores do flanco esquerdo.
[0199] Estes resultados experimentais confirmam que o vírus recombinante OVH-PD-l-scfv e OVH da presente invenção tem potencial significância para tratar os tumores in vivo, e tiveram amplos prospectos de aplicação.
Exemplo 7 - Construção e caracterização de outros vírus recombinantes (2):
[0200] Neste exemplo, uma série de vírus recombinantes derivados foi construída com base no vírus recombinante OVN. Resumidamente, com referência ao método descrito no Exemplo 1 (especialmente 1.3.1 para 1.3.3), o vírus recombinante OVH foi usado como o vírus de partida, e o gene não-essencial
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UL41, UL43, UL48, UL55, US2, LAT ou NF no genoma virus recombinante OVN foi deletado pelo uso de plasmideos recombinantes, respectivamente, construindo assim, e obtendo o vírus recombinante OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVNdUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT e OVN-dNF.
[0201] De acordo com a verificação por sequenciamento, comparado com o vírus recombinante OVN, o genoma do vírus recombinante OVN-dUL41 teve uma deleção do gene UL41 (vhs) (GenBank:AFE62869.1; correspondente aos nt91088 para nt92557 do genoma HSV-1 alelo selvagem (GenBank;JQ673480.1)); o genoma do vírus recombinante OVN-dUL43 teve uma deleção do gene UL43 (GenBank:AFE62871.1; correspondente aos nt94721 para nt95968 do genoma HSV-1 alelo-selvagem (GEnBank: JG673480.1)); o genoma do vírus recombinante OVN-dUL48 teve uma deleção do gene UL48 (VMW65) (GenBank: AFE62876.1; correspondente ao ntl03527 para ntl04999 do genoma HSV-1 alelo selvagem (GenBank: JQ673480.1)); o genoma OVN-dUL55 do vírus recombinante teve uma deleção do gene UL55 (GenBank: AFE62884.1; correspondente ao ntll5418-ntll5978 do genoma HSv-1 alelo selvagem (GenBank: JQ673480.1)) , o genoma do vírus recombinante OVN-dUS2 teve uma deleção do gene US2 (GenBank: AFE62890.1; corresponde ao ntl3391 para ntl34786 do genoma HSV-1 alelo-selvagem (Genbank: JQ673480.1); o genoma do vírus recombinante OVn-dLAT teve uma deleção do gene Lat (correspondente ao nt4781 para nt7062 do genoma HSV-alelo selvagem (GenBank: HQ673480.1)); e o genoma do vírus recombinante OVN-dNF teve uma deleção do fragmento de nucleotídeo (NF) (correspondente aos nt-5853 para nt7485 do genoma HSV-1 alelo-selvagem (GenBank: JG673480.1)).
[0202] Alternativamente, a tecnologia CRISPR pode também
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109/113 ser usada, por exemplo, por projeção específica de primers sgRNA e uso de vetor LentiCRISPR v2 comercialmente disponível (Addgen), o gene não-essencial UL41, UL43, UL48, UL55, US2, LAT ou NF no genoma do vírus recombinante OVN podería ser deletado, respectivamente.
[0203] Informação sobre os genes não essenciais UL41, UL43, UL48, UL55, US2, LAT e NF também é provida na Tabela 4.
Tabela 4 - Informação sobre os genes não essenciais
| Nome do Gene | GenBank No . | Sítios no genoma | SEQ ID NO: |
| UL41 (vhs) | AFE62869.1 | nt91088-nt92557 | 17 |
| UL43 | AFE62871.1 | nt 94 7 21-nt95 9 68 | 18 |
| UL48 (VMW65) | AFE62876.1 | nt103527-nt104999 | 19 |
| UL55 | AFE62884.1 | ntll5418-ntll5978 | 20 |
| US2 | AFE62890.1 | nt133911-nt134786 | 21 |
| LAT | Derivada de JQ673480.1 | nt4781-nt7062 | 22 |
| Fragmento de nucleotídeo (NF) | Derivada de JQ673480.1 | nt5853-nt7485 | 23 |
[0204] As células de tumor (células U-2 OS) em boas condições e em fase de crescimento logarítmico foram semeadas em placas de culturas de 6 cm em uma densidade de 5 - 7,5 x 106 células/placa. Subsequentemente, as células cultivadas foram infectadas com o vírus recombinante OVN, OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVn-dUS2, OVN-dLAT ou OVNdNF, respectivamente, em um MOI de 0,01. Após 60 horas de infecção, o título do vírus do vírus recombinante acima foi determinado por referência ao protocolo descrito no exemplo
1. Uma replicação em 3 poços foi ajustada para cada grupo de experimentos e o resultado experimental foi a média de 3
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110/113 experimentos independentes. Os resultados experimentais são mostrados na figura 18.
[0205] A figura 18 mostra o título do vírus após 60 horas de infecção das células U-2 OS com o vírus OVN, OVN-dUL41, OVn-dUL43, OVn-dUL48, OVN-dUL55, OVn-dUS2, OVN-dLAT ou OVNdNF, respectivamente em um MOI de 0,01. Os resultados na figura 18 mostram que após a infecção das células U-2 OS, o vírus OVN, OVN—dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT e OVN-dNF mostrou replicação em níveis elevados: após 60 horas de infecção, seu título viral foi entre 1,01-1,18 x 108 pfu/ml, na ordem de 108 pfu/ml; enquanto o vírus OVN-dUL43, OVN-dUL41 e OVN-dUL48 mostrou replicação em níveis baixos: após 60 horas de infecção, seus títulos virais foram menores que 107 pfu/ml, na ordem de 104 para 106 pfu/ml. Os títulos virais destes vírus recombinante são também providos na Tabela 5.
Tabela 5 - Título Viral do vírus recombinante após 60 horas de infecção de células U-2 OS:
| Vírus recombinante | Título viral (pfu/ml) | Vírus recombinante | Título viral (pfu/ml) |
| OVN | Ι,ΟΙχΙΟ8 ± 8,54xl06 | OVN—dUL55 | l,05xl08 ± 5,OOxlO6 |
| OVN—dUL41 | 1,80xl05 ± 2,65xl04 | OVN-dUS2 | 1,18χ108 ± 2,89xl06 |
| OVN-dUL43 | 1,83xl06 ± 2,89xl05 | OVN-dLAT | 1,07χ108 ± 5,77xl06 |
| OVN-dUL48 | 3,37xl04 ± 3,21xl03 | OVN-dNF | 1,02χ108 ± 7,64xl06 |
[0206] Estes resultados indicam que o vírus OVN, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT, e OVN-dNF foram capazes de replicar em níveis elevados em células tumorais (por exemplo, células U-2 OS); enquanto a capacidade de replicação do vírus OVN-dUL43,
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0VN-dUL41 e OVN-dUL48 em células tumorais (por exemplo, células U-2 OS) foram significativamente diminuídas. Por exemplo, em células U-2 OS, a capacidade de replicação dos vírus 0VN-dUL41, OVN-dUL43 e OVN-dUL48 foram diminuídas em cerca de 561 vezes, 55 vezes, e 3 χ 103 vezes, respectivamente, quando comparado ao vírus OVN.
[0207] Em adição, as células normais cultivadas (células L02) ou células de tumor (células U-2 OS) forma infectadas com o vírus recombinante OVN, OVn-dUL41, OVn-dUL43, OVN-dUL48, OVN—dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT ou OVN-dNF, respectivamente, em um MOI de 0,5. Após 72 horas de infecção, a taxa de sobrevivência das células foi determinada. Um replicado de 3 horas foi ajustado para cada experimento e o resultado experimental foi a média de 3 experimentos independentes. Os resultados experimentais estão mostrados na figura 19.
[0208] A figura 19 mostra a taxa de sobrevivência celular de células normais (células L-02; Figura 19 A) ou células de tumor (células U-2 OS; Figura 19B) após 72 horas de infecção com o vírus OVn, OVN-dUL41, OVN=dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT ou OVN-dNF, respectivamente, em um MOI de 0,5.
[0209] Os resultados da figura 19A mostra que a taxa de morte do vírus OVN-dUL41 e OVH-dUL48 sobre as células L-02 após 72 horas de infecção foram cercas de 17,67% e 14,33%, respectivamente, a capacidade de morte de ambas as células L02 foram mais fortes do que o vírus OVN. As taxas de morte do vírus OVN-dUL43, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT e OVN-dNF sobre as células L-02 forma entre 8,33% e 11,00% que não foram significativamente diferentes daqueles do vírus OVN.
[0210] Os resultados na figura 19B mostram que a taxa de
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112/113 morte do vírus OVN, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT e OVN-dNF sobre as células U-2 OS após 72 horas de infecção foram 100% (ou seja, tendo capacidade de morte extremamente alta sobre as células de tumor) . A capacidade de morte do vírus OVNdUL41, OVN-dUL43 e OVN-dUL48 sobre as células U-2 OS foi significativamente diminuída.
[0211] A taxa de morte destes vírus recombinante contra L02 e células U-2 OS são também providos na Tabela 6.
Tabela 6 - Taxa de morte dos vírus recombinante contra as células L-02 e células U-2 OS:
| Taxa de | morte | |
| Vírus recombinante | Células L-02 | Células U-2 OS |
| OVN | 90,00% ± 1,00% | 0,87% ± 0,71% |
| OVN—dUL41 | 82,33% ± 0,58% | 76,00% ± 2,65% |
| OVN-dUL43 | 89,00% ± 1,00% | 52,67% ± 0,58% |
| OVN-dUL48 | 85,67% ± 1,15% | 68,33% ± 0,58% |
| OVN—dUL55 | 90,33% ± 0,58% | 0,90% ± 0,10% |
| OVN-dUS2 | 90,67% ± 0,58% | 0,77% ± 0,06% |
| OVN-dLAT | 90,33% ± 0,58% | 0,46% ± 0,05% |
| OVN-dNF | 91,67% ± 0,58% | 0,90% ± 0,10% |
[0212] Estes resultados indicam que, similar ao vírus OVN, o vírus OVN—dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT e OVN-dNF teve apenas uma atividade de morte muito limitada para células normais (por exemplo, células L-02), enquanto sua capacidade de morte para células e tumor (por exemplo, células U-2 OS) foi extremamente alta; isto indica que os quatro vírus recombinante foram equivalentes ao vírus OVN. Comparado com o vírus OVN, o vírus OVN-dUL41 e OVH-dUL4 8 não apenas teve capacidade de morte melhorada para células normais (por exemplo, células L-02), mas teve também capacidade morte
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113/113 significativamente diminuída para células de tumor (por exemplo, células U-2 OS) ; o que indica que os dois vírus recombinante tiveram toxicidade aumentada para células normais e diminuída atividade anti-tumor. Apesar da atividade de morte do vírus OVN-dUL43 para células normais (por exemplo, células L-02) não ter sido significativamente melhorada quando comparada com o vírus OVN, sua atividade de morte para células de tumor (por exemplo, células U-2 OS) foi significativamente diminuída.
[0213] Especificamente, em células normais, a capacidade de morte do vírus OVN-dUL41, OVN-dUL43 e OVH-dUL48 foram aumentada por cerca de 7,6%, 1,00% e 4,33%, respectivamente, quando comparado ao vírus OVN. Em células de tumor, a capacidade de morte do vírus OVN-dUL41, OVN-dUL43 e OVH-dUL48 foram diminuídos por cerca de 75,13%, 51,80% e 67,46%, respectivamente, quando comparado ao vírus OVN.
[0214] Os resultados experimentais indicam que no vírus HSV recombinante da presente invenção, genes não essenciais outros senão UL41, UL43 e UL48 (por exemplo, UL55, US2, LAT e NF) podem ser ainda modificados, por exemplo, inseridos com uma mutação de perda de função, ou deleção.
[0215] Apesar das concretizações específicas da invenção foram descritos em detalhes, seria entendido pelos técnicos no assunto que várias modificações e mudanças podem ser feitas em detalhes da presente invenção. O escopo total de proteção da invenção é dado pelas reivindicações anexas e quaisquer equivalentes das mesmas.
Claims (24)
- (1) cultivar uma célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 12;(1) substituição de um promotor nativo do gene VP5 com um promotor tumor-específico, tal como um promotor de hTERT;(1) um ou mais genes não-essenciais serem deletados ou mutados (por exemplo, compreender mutação por perda dePetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 34/40(1) a primeira cópia do gene ICPO compreender uma primeira mutação por perda de função, a segunda cópia do gene ICPO compreender uma segunda mutação por perda de função; e a primeira cópia do gene ICP34,5 compreender uma terceira mutação por perda de função, a segunda cópia do gene ICP34,5 compreende uma quarta mutação por perda de função; ou (2) a primeira cópia do gene ICPO compreender uma primeira mutação por perda de função; a segunda cópia do gene ICPO compreender uma segunda mutação por perda de função; e as duas cópias do gene ICP34,5 serem deletadas; ou (3) a primeira cópia do gene ICPO compreender uma primeira mutação por perda de função; a segunda cópia do gene ICPO compreender uma segunda mutação por perda de função; e a primeira cópia do gene ICP34,5 ser substituída com uma terceira sequência do nucleotídeo exógeno, a segunda cópia do gene ICP34,5 ser substituído com uma quarta sequência do nucleotídeo exógeno; ou (4) as duas cópias do gene ICPO são deletados; e a primeira cópia do gene ICP34,5 compreender uma terceira mutação por perda de função; e a segunda cópia do gene ICP34,5 compreender uma quarta mutação por perda de função; ou (5) as duas cópias do gene ICPO serem deletadas; e as duas cópias do gene ICP34,5 são deletados; por exemplo, o genoma do vírus HSV recombinante tem deleção de uma sequência basePetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 31/40(1) as duas cópias dos genes ICPO compreenderem cada uma independentemente uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases), e as duas cópias do gene ICP34,5 compreenderem cada uma independentemente uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases); ou (2) as duas cópias do gene ICPO compreenderem cada uma independentemente uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases), e as duas cópias do gene ICP34,5 são deletadas; ou (3) as duas cópias do gene ICPO compreenderem cada uma independentemente, uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases), e as duas cópias do gene ICP34,5 ser cada umaPetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 29/40(1) substituição de um promotor nativo do gene VP5 com um promotor tumor-específico; tal como um promotor de hTERT;(1) um ou mais genes não-essenciais serem deletados ou mutados (por exemplo, compreendendo uma mutação de perda de função, ou sendo substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno); preferivelmente, o gene nãoessencial ser selecionado a partir do grupo consistindo do gene UL3, gene UL4, gene UL14, gene UL16, gene UL21, gene UL24, gene UL31, gene UL32, gene US3, gene UL51, gene UL55, gene UL56, gene US2, gene US12 (ou seja, gene ICP47), gene LAT, fragmento de nucleotídeo correspondente ao nt5853-nt7485 de JQ673480.1, e qualquer combinação dos mesmos; preferivelmente, uma ou mais de gene UL55, gene US2, o gene LAT, e o fragmento de nucleotídeo correspondente ao nt5853-nt7485 de JQ673480.1 serem deletados ou mutados (por exemplo, compreender mutação por perda de função, ou serem substituídos com uma sequência de nucleotídeo exógeno);(1) a primeira cópia do gene ICPO compreender uma primeira mutação de perda de função, a segunda cópia do gene ICPO compreender uma segunda mutação de perda de função; e a primeira cópia do gene ICP34,5 compreender uma terceira mutação de perda de função, a segunda cópia do gene ICP34,5 compreender uma quarta mutação de perda de função; ou (2) a primeira cópia do gene ICPO compreender uma primeira mutação de perda de função, a segunda cópia do gene ICPO compreender uma segunda mutação de perda de função; e as duas cópias do gene ICP34,5 serem deletadas; ou (3) a primeira cópia do gene ICPO compreenderem uma primeira mutação de perda de função, a segunda cópia do ICPO uma segunda mutação de perda de função; e a primeira cópia do gene ICP34,5 ser substituída com uma terceira sequência dePetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 20/401. Vírus HSV recombinante, caracterizado pelo fato de não expressar uma proteína ICPO funcional e proteína ICP34,5 mas é capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, uma proteína UL41 funcional (ou seja, uma proteína vhs), uma proteína UL48 funcional (ou seja, uma proteína VMW65), ou qualquer combinação dos mesmos; preferivelmente, o vírus HSV recombinante é um vírus HSV-1 recombinante, um vírus HSV-2 recombinante, ou um vírus quimérico HSV-l/HSV-2; preferivelmente, o vírus HSV recombinante é derivado de uma cepa KOS HSV-1.
- (2) coletar e lisar a célula hospedeira, após a célula hospedeira ter passado por uma lesão para obter um lisado de célula hospedeira;(2) substituição de um promotor nativo do gene ICP27 com um promotor tumor-específico; tal como um promotor hTERT;(2) um gene essencial no genoma HSV mutado não ser deletado e não compreender uma mutação por perda de função; preferivelmente, um promotor nativo de um ou mais genes essenciais (por exemplo, gene ICP27, gene ICP4, gene VP5, gene gL, gene gH, gene gD, gene gK, gene gB, gene gN, gene UL5, gene UL6, gene UL8, gene UL9, gene UL12, gene UL25, gene UL26, gene UL28, gene UL29, gene UL30, gene UL33, gene UL36, gene UL38, gene UL42, gene UL48 e/ou gene UL52) ser substituído com um promotor tumor-específico, tal como um promoter de hTERT; e (3) exceto para as duas cópias do gene ICPO e as duas cópias do gene ICP34,5, o gene mutado HSV compreender todos os outros genes do vírus HSV alelo-selvagem, e nenhum dos outros genes compreender uma mutação por perda de função, preferivelmente, o genoma HSV mutado, compreender ainda uma modificação na qual um promotor nativo de um ou mais genes HSV ser substituído com um promotor tumor-específico, talPetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 35/40(2) substituição de um promotor nativo do gene ICP27 com um promotor tumor-específico; tal como um promotor de hTERT;(2) um gene essencial do vírus HSV recombinante não ser deletado, e não conter uma mutação de perda de função; preferivelmente, um promotor nativo de um ou mias genes essenciais (por exemplo, gene ICP27, gene ICP4, gene VP5,Petição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 24/402/24 uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de um ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos codificante de uma proteína exógena); ou (bl) uma cópia do gene ICPO é deletado, e a outra cópia do gene ICPO compreender uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de um ou mais bases) ou é deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeos exógenos (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos codificantes de uma proteína exógena); ou (cl) uma cópia do gene ICPO é substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena) , e a outra cópia do gene ICPO compreender uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de um ou mais bases) ou é deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeos exógenos (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos codificantes de uma proteína exógena); e (a2) uma cópia do gene ICP34,5 compreender uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de uma ou mais bases), e a outra cópia do gene ICP34,5 compreender uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de um ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena); ou (b2) uma cópia do gene ICP34,5 é deletada, e a outra cópia do gene ICP34,5 compreender uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou maisPetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 17/402. Vírus HSV recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o genoma do vírus HSV recombinante compreender as modificações a seguir:- duas cópias do gene ICPO cada um compreender independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de um ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena); e- duas cópias do gene ICP34,5 compreender, cada um independentemente, uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de um ou mais bases) ou é deletado ou substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena);- por exemplo, no genoma do vírus HSV recombinante, (ai) uma cópia do gene ICPO compreender uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de um ou mais bases), e a outra cópia do gene ICPO compreenderPetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 16/40
- (3) recuperar o vírus HSV recombinante a partir do lisado.(3) substituição de um promotor nativo do gene ICP4 com um promotor tumor-específico, tal como promotor de hTERT;(3) substituição de um promotor nativo do gene ICP4 com um promotor tumor-específico, tal como um promotor hTERT; e (4) deleção ou mutação de um ou mais do gene UL55, o gene US2, o gene LAT, e o fragmento de nucleotídeo correspondente a nt5853-nt7485 de JQ673480.1 (por exemplo,Petição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 25/403. Vírus HSV recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a primeira mutação por perda de função, a segunda mutação por perda de função, a terceira mutação por perda de função, e a quarta mutação por perda de função ser cada uma independentemente selecionada a partir do grupo consistindo de: mutação de troca de sentido (missense), mutação sem-sentido, mutação por deslocação do quadro de leitura, deleção de base, substituição de base, adição de base, e qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, deleção ou substituição ou adição de um fragmento do gene); e/ou- a primeira sequência de nucleotídeo exógena, a segunda sequência de nucleotídeo exógena, a terceira sequência de nucleotídeo exógena, e a quarta sequência de nucleotídeo exógeno codificar cada uma independentemente uma proteína exógena selecionada a partir do grupo consistindo de: proteína fluorescente, polipeptídio imuno-modulatório, citocina, quimocina, anticorpo, e peptídeo citotóxico;Preferivelmente, a proteína fluorescente ser selecionada a partir do grupo consistindo da proteína fluorescente verde (por exemplo, uma proteína fluorescente verde tendo uma sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO:7), proteína fluorescente vermelha, proteína fluorescente azul,Petição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 22/403/24
bases) ou é deletada ou substituída com uma sequência de nucleotideo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotideo codificante de uma proteína exógena); ou (c2) uma cópia do gene ICP34,5 é substituído com uma sequência de nucleotideo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotideo codificante de uma proteína exógena), e a outra cópia do gene ICP34,5 compreender uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de uma ou mais bases) ou é deletada ou substituída com uma sequência de nucleotideo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotideo codificante de uma proteína exógena);- preferivelmente, as duas cópias do gene ICPO compreenderem a mesma mutação de perda de função ou diferentes mutações de perda de função; ou serem todas deletadas; ou serem substituídas com a mesma sequência de nucleotideo exógena ou diferentes sequências de nucleotideos exógenos;- preferivelmente, as duas cópias do gene ICP34,5 compreender a mesma mutação de perda de função ou diferentes mutações de perda de função; ou serem todas deletadas; ou serem substituídas com a mesma sequência de nucleotideos exógenas ou diferentes sequências de nucleotideos exógenas;- preferivelmente, no genoma do vírus HSV recombinante, (1) as duas cópias dos genes ICPO compreenderem cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de um ou mais bases) e, as duas cópias do gene ICP34,5 compreenderem independentemente cada um uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases); ouPetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 18/40 - (4) deleção ou mutação de um ou mais de gene UL55, gene US2, gene LAT, e o fragmento de nucleotídeo correspondente a nt5853-nt7485 de JQ673480.1 (por exemplo, compreendendo uma mutação por perda de função, ou sendo substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno);- preferivelmente, o promotor de hTERT ter uma sequência como
representada na SEQ ID NO: 5 . 11. Vetor vi ral, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10, caracteri zado pelo fato de compreender o genoma HSV compreender adicionalmente uma quinta sequência de nucleotídeo exógeno;- preferivelmente, a quinta sequência de nucleotídeo exógeno codificar uma proteína exógena selecionada a partir do grupo consistindo de proteína fluorescente, polipeptídio imunomodulatório, citocina, quimocina, anticorpo, e peptideo citotóxico.4. Vírus HSV recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de o genoma do vírus HSV recombinante compreender um gene UL43 capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, e um gene UL41 (ou seja, um gene vhs) capaz de expressar uma proteína UL41 funcional, e/ou um gene UL48 (ou seja, um gene VMW65) capaz de expressar uma proteína UL48 funcional;- preferivelmente, o vírus HSV recombinante ter adicionalmente um ou mias das características a seguir selecionado a partir do grupo consistindo de:4/24 (2) as duas cópias do gene ICPO compreenderem cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) e, as duas cópias do gene ICP34,5 serem deletadas; ou (3) as duas cópias do gene ICPO compreenderem cada um independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases), e as duas cópias do gene ICP34,5 cada sendo independentemente substituído com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena); ou (4) as duas cópias do gene ICPO são deletados; e as duas cópias do gene ICP34,5 compreenderem cada um independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases); ou (5) as duas cópias do gene ICPO serem deletados; e as duas cópias do gene ICP34,5 serem deletados; ou (6) as duas cópias do gene ICPO serem deletados; e as duas cópias do gene ICP34,5 serem cada um independentemente substituídos com uma sequência de nucleotídeos exógenos (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena); ou (7) as duas cópias do gene ICPO são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena); e duas cópias do gene ICP34,5 compreenderem cada um independentemente uma mutação de perda de função (porPetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 19/40 -
(5) as duas cópias do gene ICPO serem deletados; e as duas cópias do gene ICP34 , 5 serem deletadas; ou (6) as duas cópias do gene ICPO serem deletados; e as duas cópias do gene ICP34,5 cada uma serem independentemente substituídos com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena); ou (7) as duas cópias do gene ICPO cada uma é independentemente substituída com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena), e as duas cópias do gene ICP34,5 compreenderem cada uma independentemente uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases); ou (8) as duas cópias do gene ICPO cada uma é independentemente substituída com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena), e as duas cópias do gene ICP34,5 serem deletadas; ou (9) as duas cópias do gene ICPO cada uma é independentemente substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de umaPetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 30/405. Vírus HSV recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de o vírus HSV recombinante compreender ainda uma quinta sequência de nucleotídeo exógena;- preferivelmente, a quinta sequência de nucleotídeo exógeno codificar uma proteína exógena selecionada do grupo consistindo de proteína fluorescente, polipeptídio imunomodulatório, citocina, quimocina, anticorpo, e peptideo citotóxico.5/24exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases); ou (8) as duas cópias do gene ICPO são cada uma independentemente substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante uma proteína exógena), e as duas cópias do gene ICP34,5 serem deletadas; ou (9) as duas cópias do gene ICPO são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeo exógenas (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena), e as duas cópias do gene ICP34,5 são cada uma independentemente substituídas com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos codificante de uma proteína exógena);- preferivelmente, no genoma do vírus HSV recombinante; - 6. Vetor viral, caracterizado pelo fato de o genoma do vírus HSV recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, ou consistindo do genoma do vírus HSV recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5.6/24 nucleotídeo exógena, a segunda cópia do gene ICP34,5 é substituída com uma quarta sequência de nucleotídeo exógena; ou (4) as duas cópias do gene ICPO são deletadas; e a primeira cópia do gene ICP34,5 compreender uma terceira mutação de perda de função, e a segunda cópia do gene ICP34,5 compreender uma quarta mutação de perda de função; ou (5) as duas cópias do gene ICPO são deletados; e as duas cópias do gene ICP34,5 serem deletadas; por exemplo, o genoma do vírus HSV recombinante ter deleção de uma sequência base de nt510 a nt5439 e uma sequência base de ntl20802 a ntl25731 do genoma do vírus HSV-1 alelo-selvagem; ou (6) as duas cópias do gene ICPO são deletadas; e a primeira cópia do gene ICP34,5 ser substituída com uma terceira sequência de nucleotídeo exógena, e a segunda cópia do gene ICP34,5 ser substituída com uma quarta sequência de nucleotídeo exógena; ou (7) a primeira cópia do gene ICPO ser substituída com uma primeira sequência de nucleotídeo exógena, a segunda cópia do gene ICPO ser substituída com uma segunda sequência de nucleotídeo exógena, e a primeira cópia do gene ICP34,5 compreender uma terceira mutação de perda de função, a segunda cópia do gene ICP34,5 compreender uma quarta mutação de perda de função; ou (8) a primeira cópia do gene ICPO ser substituída com uma primeira sequência de nucleotídeo exógena, e a segunda cópia do gene ICPO ser substituída com uma segunda sequência de nucleotídeo exógena; e as duas cópias dos genes ICP34,5 serem deletadas; ouPetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 21/40
- 7. Vetor viral, caracterizado pelo fato de compreender ou consistir de um genoma HSV alterado; sendo que o genoma HSV alterado não expressar uma proteína ICPO funcional e uma proteína ICP34,5 funcional, mas ser capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, uma proteína UL41 funcional (ou seja, uma proteína vhs), uma proteína UL48 funcional (ou seja, uma proteína VMW65), ou qualquer combinação dos mesmos;- preferivelmente, o genoma HSV alterado ser derivado a partir do genoma de um vírus HSV-1, um vírus HSV-2, ou um vírus quimérico HSV-l/HSV-2;- preferivelmente, o genoma HSV mutado ser derivado a partir de um genoma de uma cepa HSV-1 KOS;Petição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 26/407/24 (9) a primeira cópia do gene ICPO ser substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena, a segunda cópia do gene ICPO ser substituída com uma segunda sequência de nucleotídeo exógena; e a primeira cópia do gene ICP34,5 ser substituída com uma terceira sequência de nucleotídeo exógena, e a segunda cópia do gene ICP34,5 ser substituída com uma quarta sequência de nucleotídeo exógena.
- 8. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de o genoma HSV mutado compreender as modificações a seguir:- duas cópias do gene ICPO compreender cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou ser deletada ou substituída com uma sequência de nucleotideo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotideo codificante de uma proteína exógena); e- duas cópias do gene ICP34,5 compreender cada uma independentemente uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou ser deletada ou substituída com uma sequência de nucleotideo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotideo codificante de uma proteína exógena); por exemplo, no genoma HSV mutada, (al) uma cópia do gene ICPO compreender uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) , e a outra cópia do gene ICPO compreenderem uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição de uma ou mais bases) ou ser deletado ou substituído com uma sequência de nucleotideo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotideo codificante de uma proteína exógena); ou (bl) uma cópia do gene ICPO ser deletada, e a outra cópia do gene ICPO compreender uma mutação por perda de função (por exemplo, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou ser deletada ou substituída com uma sequência de nucleotideoPetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 27/408/24 proteína fluorescente amarela, e qualquer combinação dos mesmos;- preferivelmente, o polipeptídio imuno-modulatório ser selecionado a partir do grupo consistindo de CD40L, OX40L, molécula co-estimulatória induzível (ICOS), FTL3L, LIGHT, CD137L, CD70, 4-1BB, GITR, CD28, e qualquer combinação dos mesmos;- preferivelmente, a citocina ser selecionada a partir do grupo consistindo da interleucina (por exemplo, IL-2, IL12, e IL-15), interferon (por exemplo, IFNOC, ΙΕΝβ, IFNy) , fator de necrose tumoral (por exemplo, TNFCC) , fator estimulante de colônia (por exemplo, GM-CSF), e qualquer combinação dos mesmos;
- preferivelmente, a quimocina é selecionada a partir do grupo consistindo de CCL2, RANTES, CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL12, CCL19, CCL21, CCL20, XCL-1, e qualquer combinação dos mesmos;- preferivelmente, o peptídeo citotóxico é selecionado a partir do grupo consistindo de timidina quinase TK (TK/GCV), TRAIL, FasL, e qualquer combinação dos mesmos;- preferivelmente, o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo do anticorpo anti-PD-1, anticorpo a ntiPD-L1, anticorpo anti-TIGIT, anticorpo anti-BTLA; anticorpo anti-CTLA-4, anticorpo anti-Tim-3, anticorpo anti-Lag-3, anticorpo anti-CDl37; anticorpo anti-0X4 0; anticorpo anti-GITR, anticorpo anti-CD73; anticorpo antiKIR; anticorpo anti-ICOS, anticorpo anti-CSFlR, anticorpo anti-EGFR; anticorpo anti-VEGFR; anticorpo anti-HER2; anticorpo anti-PDGFR; e qualquer combinação dos mesmos.Petição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 23/40 - 9. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de a primeira mutação por perda de função; a segunda mutação por perda de função; a terceira mutação por perda de função; e a quarta mutação por perda dePetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 32/409/24
- 10. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de o genoma HSV mutado compreender um gene UL43 capaz de expressar uma proteína UL43 funcional, um gene UL41 capaz de expressar uma proteína UL41 funcional (ou seja, um gene vhs), e/ou um gene UL48 capaz de expressar uma proteína UL48 funcional (ou seja, um gene VMW65);- preferivelmente, o genoma HSV mutado ter, ainda uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo de:10/24
gene gL, gene gH, gene gD, gene gK, gene gB, gene gN, gene UL5, gene UL6, gene UL8, gene UL9, gene UL12, gene UL25, gene UL26, gene UL28, gene UL29, gene UL30, gene UL33, gene UL36, gene UL38, gene UL42, gene UL4 8 e/ou gene UL52) é substituído com um promotor tumor-específico , tal como um promotor de hTERT; e (3) exceto para as duas cópias do gene ICPO e as duas cópias do gene ICP34,5 , O genoma do vírus HSV recombinante compreender todos os outros genes do vírus HSV alelo selvagem, e nenhum dos outros genes compreender uma mutação por perda de função; preferivelmente, o genoma do vírus HSV recombinante compreender ainda uma modificação na qual um promotor nativo de um ou mais genes HSV ser substituído com um promotor tumor-específico, tal como um promotor de hTERT; preferivelmente, o gene HSV é selecionado a partir do gene VP5, gene ICP27 e gene ICP4;- preferivelmente, o genoma do vírus HSV recombinante compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo consistindo de: - 11/24 compreendendo uma mutação de perda de função, ou sendo substituído com uma sequência de nucleotídeo exógena);- preferivelmente, o promotor hTERT tem a sequência representada na SEQ ID NO:5.
- 12. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser infectada com o vírus HSV recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou compreender umPetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 36/4012/24- preferivelmente, o genoma HSV mutado ser derivado de um genoma como representado no GenBank: HQ673480.1.
- 13. Método para obter o vírus HSV recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de compreender:13/24 exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante uma proteína exógena); ou (cl) uma cópia do gene ICPO ser substituída com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena) e a outra cópia do gene ICPO compreenderem uma mutação por perda de função (por exemplo, adição deleção e/ou substituição de uma ou mais bases) ou ser deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena); e (a2) uma cópia do gene ICP34,5 compreender uma mutação de perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases), e a outra cópia do gene ICP34,5 compreender uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou ser deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena); ou (b2) uma cópia do gene ICP34,5 ser deletada, e a outra cópia do gene ICP34,5 compreender uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases) ou ser deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena); ou (c2) uma cópia do gene ICP34,5 ser substituída com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos codificante de uma proteína exógena), e a outra cópia do gene ICP34,5 compreender uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção e/ou substituição dePetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 28/40
- 14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender o vírus HSV recombinante, conforme definido de acordo com a reivindicação de 1 a 5, ou um genoma do vírus HSV recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, ou o vetor viral, conforme definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável;- preferivelmente, a composição farmacêutica é usada para tratar um tumor, por exemplo, um câncer de pulmão, um câncer de fígado, um câncer de mama, um osteosarcoma, um câncer dePetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 37/4014/24 uma ou mais bases) ou ser deletada ou substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena);- preferivelmente, as duas cópias do gene ICPO compreenderem a mesma mutação por perda de função ou diferentes mutações por perda de função; ou serem todas deletadas; ou serem substituídas com a mesma sequência de nucleotídeo exógena ou diferentes sequências de nucleotídeos exógenas;- preferivelmente, as duas cópias do gene ICP34,5 compreenderem a mesma mutação por perda de função ou diferentes mutações por perda de função; ou são todas deletadas; ou são substituídas com a mesma sequência de nucleotídeo exógena ou diferentes sequências de nucleotídeos exógenas;- preferivelmente, no genoma HSV mutada;
- 15. Método para tratar um tumor, caracterizado pelo fato de compreender administrar a um indivíduo necessitando do mesmo, uma quantidade terapeuticamente efetiva do vírus HSV recombinante, conforme definido de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, ou o vetor viral, conforme definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14;- preferivelmente, o tumor é selecionado a partir do grupo consistindo do câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de mama, osteosarcoma, câncer de ovário, câncer de próstata, glioma, melanoma, câncer coloretal, e câncer pancreático; preferivelmente, o indivíduo é um mamífero, tal como um humano.15/24 independentemente substituída com uma sequência de nucleotídeo exógeno (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena); ou (4) as duas cópias do gene ICPO são deletadas; e as duas cópias do gene ICP34,5 compreenderem cada uma independentemente uma mutação por perda de função (por exemplo, adição, deleção, e/ou substituição de uma ou mais bases); ou
- 16. Uso do vírus HSV recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, ou o vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 11,Petição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 38/4016/24 proteína exógena); e as duas cópias do gene ICP34,5 cada uma é independentemente substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificante de uma proteína exógena);- preferivelmente, no genoma HSV mutado;
- 17/24 de nt510 a nt5439 e uma sequência base de ntl20802 a ntl25731 do genoma do virus HSV-1 alelo-selvagem; ou (6) as duas cópias do gene ICPO serem deletadas; e a primeira cópia do gene ICP34,5 ser substituída com uma terceira sequência de nucleotídeo exógeno; e a segunda cópia do gene ICP34,5 ser substituída com uma quarta sequência de nucleotídeo exógena; ou (7) a primeira cópia do gene ICPO ser substituída com uma primeira sequência de nucleotídeo exógeno, a segunda cópia do gene ICPO ser substituída com uma segunda sequência de nucleotídeo exógena; e a primeira cópia do gene ICP34,5 compreender uma terceira mutação por perda de função; a segunda cópia do gene ICP34,5 compreender uma quarta mutação por perda de função; ou (8) a primeira cópia do gene ICPO ser substituída com uma sequência de nucleotídeo exógena; e a segunda cópia do gene ICPO ser substituída com uma segunda sequência de nucleotídeo exógena; e as duas cópias dos genes ICP34,5 serem deletadas; ou (9) a primeira cópia do gene ICPO ser substituída com uma primeira sequência de nucleotídeo exógena, a segunda cópia do gene ICPO ser substituída com uma segunda sequência de nucleotídeo exógena; e a primeira cópia do gene ICP34,5 ser substituída com uma terceira sequência de nucleotídeo exógena; e a segunda cópia do gene ICP34,5 ser substituída com uma quarta sequência de nucleotídeo exógena.
- 18/24 função ser cada uma independentemente selecionada a partir da mutação de troca de sentido (missense), mutação semsentido, mutação por deslocação do quadro de leitura, deleção de base, substituição de base, adição de base, e qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, deleção ou substituição ou adição de um fragmento do gene); e/ou- a primeira sequência de nucleotídeo exógena, a segunda sequência de nucleotídeo exógena, a terceira sequência de nucleotídeo exógena, e a quarta sequência de nucleotídeo exógeno codificar cada uma independentemente uma proteína exógena selecionada a partir do grupo consistindo de: proteína fluorescente, polipeptídio imuno-modulatório, citocina, quimocina, anticorpo, e peptídeo citotóxico;- preferivelmente, a proteína fluorescente ser selecionada a partir do grupo consistindo da proteína fluorescente verde (por exemplo, uma proteína fluorescente verde tendo uma sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO:7), proteína fluorescente vermelha, proteína fluorescente azul, proteína fluorescente amarela, e qualquer combinação dos mesmos;- preferivelmente, o polipeptídio imuno-modulatório ser selecionado a partir do grupo consistindo de CD40L, OX40L, molécula co-estimulatória induzível (ICOS), FTL3L, LIGHT, CD137L, CD70, 4-1BB, GITR, CD28, e qualquer combinação dos mesmos;- preferivelmente, a citocina ser selecionada a partir do grupo consistindo da interleucina (por exemplo, IL-2, IL12, e IL-15), interferon (por exemplo, IFNOC, ΙΕΝβ, IFNy) , fator de necrose tumoral (por exemplo, TNFCC) , fatorPetição 870190088526, de 09/09/2019, pág. 33/40
- 19/24 estimulante de colônia (por exemplo, GM-CSF), e qualquer combinação dos mesmos;
- preferivelmente, a quimocina é selecionada a partir do grupo consistindo de CCL2, RANTES, CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL12, CCL19, CCL21, CCL20, XCL-1, e qualquer combinação dos mesmos;- preferivelmente, o peptídeo citotóxico é selecionado a partir do grupo consistindo de timidina quinase TK (TK/GCV), TRAIL, FasL, e qualquer combinação dos mesmos;- preferivelmente, o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo do anticorpo anti-PD-1, anticorpo antiPD-L1, anticorpo anti-TIGIT, anticorpo anti-BTLA; anticorpo anti-CTLA-4, anticorpo anti-Tim-3, anticorpo anti-Lag-3, anticorpo anti-CDl37; anticorpo anti-0X4 0; anticorpo anti-GITR, anticorpo anti-CD73; anticorpo antiKIR; anticorpo anti-ICOS, anticorpo anti-CSFlR, anticorpo anti-EGFR; anticorpo anti-VEGFR; anticorpo anti-HER2; anticorpo anti-PDGFR; e qualquer combinação dos mesmos. - 20/24 função, ou serem substituídos com uma sequência de nucleotídeo exógeno); preferivelmente, o gene não-essencial ser selecionado a partir do gene UL3, gene UL4, gene UL14, gene UL16, gene UL21, gene UL24, gene UL31, gene UL32, gene US3, gene UL51, gene UL55, gene UL56, gene US2, gene US12 (ou seja, gene ICP47), gene LAT, fragmento de nucleotídeo correspondente a nt5853-nt7485 de JQ673480.1, e qualquer combinação dos mesmos; preferivelmente, um ou mais dos genes UL55, o gene US2, o gene LAT, e o fragmento de nucleotídeo correspondente a nt5853-nt7485 de JQ673480.1 são deletadas ou mutadas (por exemplo, compreender uma mutação por perda de função, ou são substituídos com uma sequência de nucleotídeo exógeno);
- 21/24 como um promotor de hTERT; preferivelmente, o gene HSV ser selecionado a partir do gene VP5, gene ICP27 e gene ICP4;- preferivelmente, o genoma HSV mutado compreender ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo consistindo de:
- 22/24
genoma do vírus HSV recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, ou ser transfectadas com o vetor viral, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 6 a 11;- preferivelmente, a célula é uma célula de tumor selecionado a partir do grupo consistindo de célula de câncer de pulmão, célula de câncer de fígado, célula de câncer de mama, célula de osteosarcoma, célula de câncer ovariano, célula de câncer cervical, célula de câncer de próstata, célula de glioma, célula melanoma, célula de câncer coloretal, e célula de câncer pancreático. - 23/24 ovário, um câncer de próstata, um glioma, um melanoma, um melanoma, um câncer coloretal, e um câncer pancreático;- preferivelmente, a composição farmacêutica ser uma solução injetável ou um pó liofilizado;- preferivelmente, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente efetiva (por exemplo, uma quantidade terapeuticamente efetiva para tratar um tumor) do vírus HSV recombinante ou o genoma do vírus HSV recombinante ou o vetor viral;- preferivelmente, a composição farmacêutica estar presente em uma forma de dosagem unitária; por exemplo, 102-109 pfu do vírus HSV recombinante ser contido por doesse unitária da composição farmacêutica.
- 24/24 caracterizado pelo fato de ser para fabricar a composição farmacêutica para tratar um tumor em um indivíduo; preferivelmente, o tumor sendo selecionado a partir do grupo consistindo do câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de mama, osteosarcoma, câncer de ovário, câncer de próstata, glioma, melanoma, câncer coloretal, e câncer pancreático; preferivelmente, o indivíduo ser um mamífero, tal como um humano.
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