BRPI0107736B1 - cepa hsv1 js1, composição farmacêutica, e, uso de uma cepa hsv1 js1 - Google Patents

Abstract

"uso de uma cepa de vírus não laboratorial método para determinar se um gene tem um efeito sobre um fenótipo associado com um distúrbio dos sistemas nervosos periférico e central ou sobre uma célula dos sistemas nervosos periférico e central, para determinar se um gene codifica um antígeno associado com uma infecção patogênica ou câncer, para determinar a adequabilidade de uma cepa de vírus não laboratorial para modificação em uma cepa modificada, para determinar se um gene aumenta os efeitos anti-tumorais de um vírus e para produzir uma cepa de vírus não laboratorial oncolítica, modificada, cepa de vírus não laboratorial, uso de um gene, cepa hsv1 js1, composição farmacêutica, e, métodos para tratar um tumor em um indivíduo, para suprir um gene a um indivíduo e para tratar ou impedir um distúrbio do sistemas nervosos periférico e central". a presente invenção refere-se a cepas de vírus não laboratorial, por exemplo, dos vírus da herpes, tais como hsv, com capacidades melhoradas de suprimento oncolítico e/ou genético, em comparação com cepas de vírus de laboratório.

Description

“CEPA HSV1 JS1, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UMA CEPA HSV1 JS1”

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a cepas de vírus não laboratorial, por exemplo, dos vírus da herpes, tais como HSV, com melhoradas capacidades de suprimento oncolítico e/ou genético, em comparação com as cepas de vírus de laboratório.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os vírus foram sugeridos ou demonstrados terem utilidade em uma variedade de aplicações em biotecnologia e medicina em muitas ocasiões. Cada uma é devida à capacidade única dos vírus penetrarem nas células com alta eficiência. Isto é observado em tais aplicações por expressão e replicação da expressão genética do vírus e/ou expressão de um gene heterólogo inserido. Assim, os vírus podem suprir e expressar genes em (SEGUE-SE À PÁGINA 2) células (genes virais ou outros), que podem ser úteis, por exemplo, em terapia genética ou no desenvolvimento de vacinas, oXÚe.Itjs «p^d^rd $er «ütçàs ejrf··. seletivamente matar células por replicação lítica ou ação de um gene suprido, por exemplo, no câncer.

O vírus simplex da herpes (HSV) foi sugerido ser de utilidade tanto como um vetor de suprimento genético no sistema nervoso como para o tratamento oncolítico do câncer. Em ambas as aplicações o vírus deve, entretanto, ser incapacitado de modo que não seja mais patogênico, porém de modo que possa ainda penetrar nas células e realizar a função desejada. Assim, para o suprimento genético não-tóxico em células alvo utilizando-se HSV, tomou-se evidente que, na maioria dos casos, imediata e precoce expressão genética do vírus deve ser evitada/minimizada. Para o tratamento oncolítico do câncer, que pode também incluir o suprimento de gene(s) aumentando o efeito terapêutico, numerosas mutações do HSV foram identificadas que ainda permitem que o vírus replique em cultura ou em células ativamente divisórias in vivo (por exemplo, em tumores), porém que impedem a replicação significativa no tecido normal. Tais mutações incluem rompimento dos genes codificando ICP34.5, ICP6 e timidina quinase. Destes, vírus com mutações para ICP34.5 ou ICP34.5, junto com mutações de, por exemplo, ICP6, mostraram até agora o mais favorável perfil de segurança. Os vírus deletados para somente ICP34.5 mostraram replicar em muitos tipos de células tumorais in vitro e replicar seletivamente em tumores cerebrais artificialmente induzidos em camundongos, enquanto poupando o tecido circundante. Experimentos clínicos em estágio precoce mostraram também sua segurança no homem.

Entretanto, embora esperança tenha sido revelada para vários vírus incluindo HSV para suprimento/terapia genética ou para o tratamento oncolítico do câncer, a maioria deste trabalho utilizou cepas de vírus que foram mantidas em células de cultura de tecido por muitos anos. Em aplicações em que o vírus simplesmente necessita penetrar em células para suprir genes, isto pode não se provar problemátiçp, γι^οί qije _:a*Jn^ftútençãoi-_ de cultura de célula também requer que o vírus penetre nas células, embora com freqüência células de um diferente tipo ou espécie, em comparação com 5 as prováveis células alvo para um vetor. Entretanto, em aplicações em que outras propriedades sejam requeridas, o uso de cepas de vírus de laboratório pode não permitir que o potencial total de um vírus em uma aplicação particular seja utilizado.

O HSV tem a capacidade única entre os vírus atualmente sob l

desenvolvimento como vetores, pelo fato de que ele tem evoluído naturalmente para infectar e permanecer latente nos neurônios. O HSV tem também evoluído para ser altamente eficiente transportado ao longo dos nervos a partir do local de infecção, usualmente na periferia, para o corpo celular neuronal, usualmente nos gânglios espinhais. Tais capacidades não são requeridas em cultura de célula e como tais capacidades requerem propriedades específicas desenvolvidas do HSV, mais adaptação para crescimento em cultura pode ter resultado em capacidades de transporte axonal otimamente eficientes terem sido perdidas. Os vetores HSV para suprimento genético ao sistema nervoso central ou periférico são prováveis mostrarem eficácia máxima se as propriedades de transporte axonais tiverem sido retidas em máxima eficiência. Aqui, a inoculação em um sítio periférico permitiría então suprimento genético maximamente eficiente aos corpos celulares do neurônios periféricos e a inoculação no cérebro permitiría suprimento genético maximamente eficiente aos múltiplos sítios conectados.

Os vetores atuais, baseados em cepas de laboratório de HSV, podem não permitir que isto ocorra com a máxima eficiência possível. Na realidade, em razão da alta capacidade do HSV ser transportada ao longo dos nervos, há potencialmente uma particularmente grande discrepância entre as propriedades que se deseja conservar e aquelas provavelmente a serem retidas na cultura.

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Ο HSV e outros vírus tais como adeno- ou reovírus também têm utilidade potencial no tratamento oncoMficp: do: cãnêei. .Entrètaritçr,· • ··· ·· ··· ·· · · ·· ·· repetindo, os vírus sob desenvolvimento para tais propósitos foram previamente mantidos extensamente em cultura. Como o tratamento oncolítico do câncer requer replicação ativa em células tumorais humanas, com freqüência desenvolvendo-se relativamente de modo lento, seria antecipado que a adaptação das cepas de vírus de laboratório, em células cultivadas particulares, pode ter reduzido a eficiência com que tal replicação lítica em células tumorais humanas, ou em infecção de células tumorais humanas, podería otimamente ocorrer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê a oportunidade de desenvolveremse vírus com melhoradas capacidades in vivo de transferência genética e/ou destruição lítica de células tumorais. Aqui, as cepas de vírus são construídas apropriadas para estas finalidades, com base em recentes isolados clínicos do vírus apropriado, em vez de as cepas de laboratório serialmente passadas, que foram anteriormente usadas. A presente invenção, portanto, tem o potencial de prover vírus com melhoradas capacidades de infectar células humanas in vivo, melhorada capacidade replicativa/lítica em tais células e (no caso do HSV) melhoradas capacidades de trafegar ao longos dos nervos a partir do sítio de inoculação para ao corpo celular neuronal. A invenção é exemplificada usando-se HSV, mas é igualmente aplicável para outros vírus atualmente sob desenvolvimento como vetores e/ou para a destruição oncolítica de células cancerosas.

A Requerente demonstrou que dois isolados clínicos do HSV1 (cepas JS1 e BL1) aumentaram a replicação em algumas linhagens de células tumorais humanas, em comparação com a cepa 17+ HSV1 (uma cepa padrão de laboratório).

A Requerente deletou ICP34.5 da cepa JS1 de isolado clínico e novamente comparamos o potencial replicativo dos tipos de células tumorais humanas em comparação com a cepa? Jpri HSyi fuma, .cèpajâe.

• ··· ·· ··· ·· · · ·· ·· laboratório padrão) em que ICP34.5 foi também deletado. Esta cepa (JS1/ICP34.5-) é uma cepa modificada, derivada de um isolado clínico, e é, assim, uma cepa não laboratorial modificada da invenção.

JS1 com ICP34.5 deletado mostrou crescimento aumentado em algumas células tumorais humanas testadas, em comparação com a cepa 17+ deletada de ICP34.5 HSV1, isto é, um vírus de cepa de laboratório com a mesma modificação. Entretanto, em comparação com a cepa de laboratório 10 derivada da cepa 17+, as capacidades de matar célula foram aumentadas com o vírus JS1/ICP34.5 em todas as linhagens tumorais testadas.

Assim, o uso de cepas de vírus não laboratorial pode ser visto aumentar as capacidades anti-tumor de tais vírus e ficou evidente em todas as linhagens de células tumorais testadas até agora. Isto terá aplicabilidade para 15 tratamento de câncer em pacientes humanos.

Atividade mais aumentada pode também ser antecipada se estes vírus forem então usados para suprir genes com atividade anti-tumor. Tais genes incluem aqueles codificando ativadores de pró-droga, supressor tumoral ou fatores pró-apoptóticos, ou proteínas imune estimuladoras.

Para esta finalidade, produzimos um isolado clínico deletado

ICP34.5 do HSV1, que expressa GMCSF humano. Este vírus é projetado para aumentar as respostas imunes anti-tumor, em seguida a injeção intra-tumoral.

A invenção também fornece vírus da invenção que contêm um gene/genes heterólogo(s). A expressão gene heterólogo é destinada a 25 englobar qualquer gene não encontrado no genoma viral. O gene heterólogo pode ser qualquer variante alélica de um gene tipo selvagem, ou pode ser um gene mutante. Os genes heterólogos são preferivelmente operavelmente ligados a uma seqüência de controle permitindo expressão de dito gene heterólogo em uma célula in vivo. Os vírus da invenção podem, assim, ser usados para suprir um gene/genes heterólogo(s) a uma célula in vivo em que eles serão expressos. Para terapia viral oncojítica; íais genes tipiçámehle.

• ··· ·· ··· ·· · · ·· ·· codificam proteínas capazes de aumentar as propriedades destruidoras de tumor do vírus. Estes genes podem codificar proteínas que são elas próprias 5 citotóxicas, são ativadoras de pró-droga, ou que podem ser capazes de estimular/aumentar uma resposta imune anti-tumor. Para suprimento genético ao sistema nervoso periférico utilizando-se HSV, o gene/genes heterólogo(s) podem codificar um polipeptídeo capaz de modificar respostas a estímulos dolorosos ou reduzir a dor crônica, por exemplo, uma proteína capaz de 10 seqüestrar, por exemplo, o fator de crescimento de nervo, outro fator neurotrófico modulador da dor ou moléculas semelhantes a fator neurotrófico, ou substância P ou outros neuropeptídeos. Os gene/genes heterólogo(s) podem também codificar um polipeptídeo capaz de estimular o re-crescimento dos nervos avariados ou impedir a degeneração mais extensa 15 dos nervos em condições degenerativas. No sistema nervoso central, os genes heterólogos podem incluir aqueles potencialmente benéficos em doença neurodegenerativa, tal como doença de Parkinson ou doença de Alzheimer, e podería tipicamente incluir genes codificando fatores neurotróficos e/ou enzimas capazes de aumentar a atividade das células remanescentes em tais 20 doenças. Em todos os casos, genes heterólogos únicos ou múltiplos podem ser transportados por um único vírus.

Portanto, a invenção provê:

Uso de uma cepa de vírus não laboratorial modificada, oncolítica, na manufatura de um medicamento para o tratamento oncolítico 25 do câncer;

Uso de uma cepa de vírus não laboratorial, incompetente para replicação, modificada, compreendendo um gene heterólogo na manufatura de um medicamento para o suprimento de dito gene a um indivíduo;

Um método de determinar se um gene tem um efeito sobre um fenótipo associado com um distúrbio do sistema nervoso periférico ou em uma célula do sistema nervoso periférico que β .Mévânle’para: uni distúrbio.

« ··· ·· ··· ·· · · ·· ·· do sistema nervoso periférico, método este compreendendo:

(i) inocular um vírus da herpes incompetente para replicação da invenção, compreendendo um gene heterólogo dentro de um nervo periférico; e (ii) monitorar um fenótipo de dito distúrbio ou um efeito da expressão de dito gene em dita célula, para determinar, desse modo, se dito gene tem um efeito relevante para dito distúrbio;

Um método de determinar se um gene tem um efeito sobre um fenótipo associado com um distúrbio do sistema nervoso central ou sobre uma célula do sistema nervoso central que é relevante para um distúrbio do sistema nervoso central, método este compreendendo:

(i) inocular dentro de uma célula do sistema nervoso central um vírus da herpes incompetente para replicação da invenção; e (ii) monitorar um fenótipo de dito distúrbio ou um efeito da expressão de dito gene sobre dita célula, para determinar, desse modo, se dito gene tem um efeito sobre dita célula ou dito fenótipo;

Um método de determinar se um gene codifica um antígeno associado com uma infecção patogênica ou câncer, método este compreendendo infectar uma célula dendrítica ou um macrófago com um vírus incompetente para replicação da invenção, compreendendo um gene heterólogo codificando um antígeno e monitorando a apresentação do antígeno do produto polipeptídico de dito gene, ou um efeito de expressão de dito gene, ou um fenótipo de dita infecção patogênica ou câncer, para determinar, desse modo, se dito gene codifica um antígeno associado com dita infecção ou câncer e que ele próprio tenha potencial terapêutico ou seja um alvo para intervenção terapêutica;

Um método de determinar a adequabilidade de uma cepa de vírus não laboratorial para modificação em uma cepa modificada como aqui definida, compreendendo: . ’j :··.

• ··· ·· ··· ·♦ · · ·· ·· (i) opcionalmente, isolar um vírus não laboratorial de um hospedeiro;

(ii) prover dita cepa de vírus não laboratorial;

(iii) estimar as propriedades do vírus com respeito a uma ou mais características desejáveis; e, opcionalmente, (iv) selecionar para modificação cepas de vírus com propriedades desejáveis;

Um método de determinar a adequabilidade de uma cepa de vírus não laboratorial para modificação em uma cepa oncolítica modificada da invenção, compreendendo:

(i) opcionalmente, isolar uma cepa de vírus não laboratorial de um hospedeiro;

(ii) estimar o crescimento do vírus em um ou mais tipos de célula tumoral; e opcionalmente (iii) selecionar para modificação cepas de vírus com um alto grau de crescimento ou capacidade de matar células;

Um método de determinar a adequabilidade de uma cepa de vírus não laboratorial, para modificação em uma cepa oncolítica modificada, compreendendo:

(i) prover uma cepa de vírus não laboratorial, opcionalmente uma selecionada por um método como há pouco definido;

(ii) modificar dita cepa de modo que se tome oncolítica; e (iii) estimar a capacidade de dita cepa não laboratorial oncolítica para matar células tumorais; e, opcionalmente, (iv) selecionar cepas que exibam alta capacidade de matar célula tumoral para modificações mais extensas; e, opcionalmente, (v) realizar outras modificações;

Um método de determinar se um gene aumenta os efeitos antitumorais de um vírus compreendendo: < :·· • ··· ·· ··· ·· · · ·· ·« (i) prover uma cepa não laboratorial oncolítica da invenção;

(ii) inserir dito gene dentro de dito vírus como um gene heterólogo; e (iii) estimar a capacidade de dita cepa não laboratorial oncolítica modificada, para matar células tumorais, em comparação com a capacidade da cepa precursora provida na etapa (i);

Um método de produzir uma cepa de vírus não laboratorial oncolítica, modificada, compreendendo:

(i) isolar de um hospedeiro uma cepa não laboratorial de um vírus;

(ii) opcionalmente determinar sua adequabilidade para modificação como definido acima; e (iii) modificá-la para tomá-la oncolítica e, opcionalmente, (iv) realizar outras modificações;

Um método de produzir uma cepa de vírus não laboratorial modificada, compreendendo:

(i) prover uma cepa não laboratorial de um vírus;

(ii) modificá-la para tomá-la incompetente para replicação e (iii) inserir um gene heterólogo;

Uma cepa de vírus não laboratorial oncolítica, modificada, como definida aqui;

Uma cepa de vírus não laboratorial, modificada, compreendendo um gene heterólogo, como aqui definida

Uso de um gene identificado como tendo um efeito sobre um fenótipo associado com um distúrbio do sistema nervoso periférico ou em uma célula do sistema nervoso periférico, que seja relevante para um distúrbio do sistema nervoso periférico, por um método como definido acima, ou de um produto genético codificado por dito gene na manufatura de um medicamento para o tratamento de um distúrbio: do’: sisferpà .nervoso periférico;

Uso de um gene identificado como tendo um efeito sobre um fenótipo associado com um distúrbio do sistema nervoso central ou sobre uma célula do sistema nervoso central que seja relevante para um distúrbio do sistema nervoso central, por um método como definido acima, ou de um produto genético codificado por dito gene, na manufatura de um medicamento para o tratamento de um distúrbio do sistema nervoso central;

Uso de um gene identificado como codificando um antígeno associado com uma infecção patogênica ou câncer, por um método como definido acima, ou de um antígeno codificado por dito gene, na manufatura de um medicamento para o tratamento ou prevenção de dita infecção ou câncer;

Um cepa de vírus não laboratorial identificada por ou produzida no curso de um método da invenção;

Uso de um gene identificado como aumentando os efeitos anti-tumorais de um vírus por um método como definido acima, ou de um produto genético codificado por dito gene, na manufatura de um medicamento para o tratamento ou prevenção do câncer;

Uma cepa de vírus não laboratorial, modificada, obtida ou obtenível por um método da invenção;

Cepa HSV1 JS1 como depositada na European Collection of Cell Cultures (ECACC) sob o número de acesso provisório 01010209, ou uma cepa HSV1 derivada dela, uma composição farmacêutica compreendendo tal vírus; tal vírus para uso no tratamento do corpo humano ou animal;

Um método de tratar um tumor em um indivíduo em necessidade dele, pela administração a dito indivíduo de uma quantidade eficaz de um vírus oncolítico da invenção;

Um método de suprir um gene ajum.ih(Êvídüo jem néces*sidâde.

• ·«· ·· ♦ ·· ·♦ · · ·· ·· dele, pela administração a dito indivíduo de uma quantidade eficaz de um vírus não-oncolítico da invenção; e

Um método de tratar ou prevenir um distúrbio do sistema nervoso periférico central, pela administração a um nervo periférico de um indivíduo em necessidade dele de uma quantidade eficaz de um vírus neurotrófico da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1. Vírus

Do topo à base, os diagramas mostram: cepa 17+ HSV1 de laboratório, cepa BL1 clínica, cepa clínica JS1, 17+/ICP34.5-, JS1/ICP34.5-, JS l/ICP34.5-/ICP47-/hGMCSF.

Fig. 2. Isolados clínicos mostram crescimento aumentado das células tumorais (1) Crescimento de 17+, BL1 e JS1. Diagrama à esquerda: células U87. Diagrama à direita: células LNCaP.

(2) Crescimento de 17+ e JS1 ICP34.5- em células tumorais. Diagrama à esquerda: células LNCaP. Diagrama à direita: células MDA-MB231.

(3) JS 1/34.5- não cresce em células não-permissivas para mutantes HSV ICP34.5. Diagrama esquerdo: células 3T6 - 17+, JS1. Diagrama direito: células 3T6 - 17+, JS1 ICP34.5-.

Fig. 3. Um isolado clínico HSV deletado de ICP34.5 mostra lise aumentada em todas as células tumorais testadas.

Linhagens de células tumorais foram infectadas simuladamente, infectadas com cepa 17+/34.5- HSV1, ou infectadas com cepa JS 1/34.5- HSV1 no MOI indicado e tingidas com violeta cristal em pontos do tempo após infecção, para permitir a visualização das células. Cada bloco de fotografias refere-se a um tipo de célula. Do topo à base, estas são adenocarcinoma colo-retal HT29, adenocarcinoma. |*e-ptóSÍa(a JLNC^P.FQÇ·,·. adenocarcinoma de seios MB-231, melanoma maligno SK-MEL-28 e glioblastoma astrocitoma MG U-87. Os blocos esquerdo referem-se a resultados para a cepa 17+/34.5- HSV1. Os blocos direitos referem-se a resultados para cepa JS 1/34.5- HSV1. Os blocos centrais representam células infectadas simuladamente. Dentro de cada bloco, a fileira de topo representa um ponto de tempo de 24 h, a segunda um ponto de tempo de 48 h e a terceira um ponto de tempo de 72 h dentro de cada bloco, a coluna esquerda representa MOI=0,2, a coluna central MOI=0,1 e a coluna direita MOI=5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A. Vírus

Cepas de Vírus da Invenção

A invenção é aplicável a vírus em geral. Preferivelmente, uma cepa de vírus da invenção será uma cepa de um vírus da herpes, adenovirus, picomavírus, retrovirus ou alfavírus. Mais preferivelmente, uma cepa de vírus da invenção será uma cepa de um vírus da herpes. Ainda mais preferivelmente, uma cepa de vírus da invenção será uma cepa de um vírus simplex da herpes (HSV), tipicamente uma cepa de HSV1 ou HSV2.

Quando o vírus da invenção é um vírus simplex da herpes, o vírus pode ser derivado de, por exemplo, cepas HSV1 ou HSV2, ou derivadas delas, preferivelmente HSV1. Os derivados incluem recombinantes intertipos contendo DNA de cepas HSV1 e HSV2. Tais recombinantes inter-tipos são descritas na técnica, por exemplo, em Thompson e outros (1998) e Meignier e outros (1988). Os derivados preferivelmente têm pelo menos 70% de homologia de seqüência com os genomas de HSV1 ou HSV2, mais preferivelmente pelo menos 80%, mesmo mais preferivelmente pelo menos 90 ou 95%. Mais preferivelmente, um derivado tem pelo menos 70% de identidade de seqüência com o genoma de HSV1 ou HSV2, mais preferivelmente pelo menos 80% de identidade, mesmo mais preferivelmente pelo menos 90%, 95% ou 98% de identidade. ·*. r*

Por exemplo, o Pacote UWGCG provê o programa BESTFIT que pode ser usado para calcular a homologia (por exemplo, usado em seus 5 ajustes padrão) (Devereux e outros (1984) Nucleic Acids Research 12, pág.

387-395). Os algoritmos PILEUP e BLAST podem ser usados para calcular a homologia ou seqüências de alinhamento (tipicamente em seus ajustes padrão), por exemplo, como descrito em Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

O software para realizar análises BLAST é publicamente disponível através do National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve identificar primeiro os pares de alta seqüência de contagem (HSPs) pela identificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência de consulta que iguala ou satisfaz alguma contagem T limite de valor positivo, quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de base de dados. T é referido como o limite de contagem de palavras vizinhas (Altschul e outros, 1990). Estes acertos de palavra de vizinhança iniciais atuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs contendo-os. Os acertos de palavra 20 são estendidos em ambas as direções ao longo de cada seqüência até que a contagem de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. Extensões para os acertos de palavra em cada direção são paradas quando: a contagem de alinhamento cumulativa desvia-se pela quantidade X de seu valor máximo obtido; a contagem cumulativa vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de 25 um ou mais alinhamentos de resíduo de contagem negativa; ou o fim de uma ou outra seqüência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLAST utiliza como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de contagem BLOSUM62 (vide Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Nat. Acad.

Sci. USA 89: 10915-10919) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N=4 e uma comparação de ambos filame&ios·: _t • »·· ·♦ » * ·· ··

O algoritmo BLAST realiza uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências; vide, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Uma medida da similaridade provida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que provê uma indicação da probabilidade pela qual uma igualdade entre duas seqüências de nucleotídeo ou aminoácido ocorrería por acaso. Por exemplo, uma seqüência é considerada similar a outra seqüência se a menor probabilidade de soma em comparação da primeira seqüência com a segunda seqüência for menor do que cerca de 1, preferivelmente menor do que cerca de 0,1, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01 e muitíssimo preferivelmente menor do que cerca de 0,001.

Um derivado pode ter a seqüência de um genoma HSV1 ou

HSV2 modificada por substituições nucleotídicas, por exemplo, de 1, 2 ou 3 a

10, 25, 50 ou 100 substituições. O genoma HSV1 ou HSV2 pode, alternativa ou adicionalmente, ser modificado por uma ou mais inserções e/ou deleções e/ou por uma extensão em uma ou outra ou em ambas extremidades. Propriedades da Cepa de Vírus da Invenção

As cepas de vírus da invenção são cepas “não laboratorial”.

Elas podem também ser referidas como cepas “clínicas”. Uma pessoa hábil na técnica prontamente será capaz de distinguir entre uma cepa de laboratório e uma não laboratorial ou uma clínica. Mais orientação sobre as propriedades prováveis de serem exibidas por cepas de vírus é dada abaixo.

A distinção chave entre uma cepa de laboratório e não laboratorial é que as cepas de laboratório presentemente em uso comum foram mantidas por longos períodos, muitos anos em alguns casos, em cultura. A cultura de vírus tais como HSV envolve uma técnica conhecida como passagem em série. Para criar e manter os vírus, células adequadas são z infectadas com o vírus, o vírus replica dentro da célula e o vírus é então colhido; células frescas são então reinfectadas, hstei pnjcêssb çohsiituiridp-iií».

• ·~» ·· ··· ·· € ~ ·» ♦· ciclo de passagem em série. Cada tal ciclo pode levar, por exemplo, alguns dias no caso do HSV. Como discutido acima, tal passagem em série pode conduzir a mudanças das propriedades da cepa de vírus, pelo fato de que a seleção ocorre para propriedades que favoreçam o crescimento em cultura (por exemplo, replicação rápida), o oposto a propriedades úteis para aplicações práticas, por exemplo, manutenção da capacidade de deslocar-se ao longo axônios, no caso do HSV.

As cepas de vírus da invenção são cepas não laboratorial pelo fato de que elas são derivadas de cepas recentemente isoladas de indivíduos infectados. As cepas da invenção são modificadas, em comparação com os isolados clínicos originais, e podem ter gasto um tempo em cultura, porém qualquer tempo gasto em cultura será comparativamente mais curto. As cepas 15 da invenção são preparadas de maneira a reter substancialmente as propriedades desejáveis dos isolados clínicos originais de que elas são derivadas.

Um vírus da invenção é capaz de eficientemente infectar células humanas alvo. Tal vírus é recentemente isolado de um indivíduo 20 infectado e, em seguida, tríada quanto à capacidade desejada de replicação aumentada em células tumorais e/ou outras células in vitro e/ou in vivo, em comparação com cepas padrão de laboratório, ou (no caso de vírus neurotróficos tais como HSV) quanto a uma capacidade aumentada para trafegar ao longo dos nervos, como comparado com as cepas padrão de 25 laboratório utilizando um modelo in vivo. Tais vírus com propriedades aperfeiçoadas, em comparação com cepas de vírus de laboratório, são os vírus da invenção. Vírus identificados com tais propriedades aperfeiçoadas desejadas podem ser então construídos de modo que eles possam seletivamente matar células tumorais pela mutação de apropriado(s) gene(s), ou mutados de modo que eles possam suprir um gene(s) para alvejar tecido sem efeito tóxico em aplicações não-oncolíticas.:Èstes virus’••rriodifjtadbs.S^d • ··· ·· ··· ·· · · ·· também vírus da invenção. Altemativamente, as cepas de vírus podem ser isoladas de um indivíduo infectado e as mutações, prognosticadas serem apropriadas para terapia oncolítica e/ou suprimento genético, feitas. Estes vírus modificados são então triados quanto às desejadas propriedades aperfeiçoadas, em comparação com as cepas de laboratório, vírus com tais propriedades aperfeiçoadas provendo mais vírus da invenção.

Mais orientação sobre as propriedades prováveis das cepas de vírus da invenção é provida como segue.

Preferivelmente, uma cepa de vírus da invenção passou por três anos ou menos de cultura desde o isolamento de sua cepa precursora clínico não modificada de seu hospedeiro. Mais preferivelmente, uma cepa da invenção passou por um ano ou menos de cultura, por exemplo, nove meses ou menos, seis meses ou menos, três meses ou menos ou dois meses ou menos, um mês ou menos, duas semanas ou menos ou uma semana ou menos. Por estas definições de tempo em cultura, queremos significar tempo realmente gasto em cultura. Assim, por exemplo, é uma prática comum congelar cepas de vírus a fim de preservá-las. Evidentemente, preservar por congelamento ou em uma maneira equivalente não qualifica como mantendo a cepa em cultura. Assim, o tempo gasto congelada ou de outro modo , preservada não é incluído nas definições acima de tempo gasto em cultura. O tempo gasto em cultura é tipicamente tempo realmente gasto sofrendo passagem em série, isto é, tempo durante o qual a seleção de características indesejáveis pode ocorrer.

Preferivelmente, uma cepa de vírus da invenção sofre 1000 ou menos ciclos de passagem em série desde isolamento de sua cepa precursora clínica não modificada de seu hospedeiro. Mais preferivelmente, ela sofre 500 ou menos, 100 ou menos, 90 ou menos, 80 ou menos, 70 ou menos, 60 ou menos, 50 ou menos, 40 ou menos, 30 ou menos, 20 ou menos ou 10 ou menos de tais ciclos. ·* • ··· ·· ··· ·· · · ·· ·

Preferivelmente, um vírus da invenção tem uma maior capacidade, conforme medido por testes estatísticos padrão, do que uma cepa de laboratório de referência com modificações equivalentes, de realizar certas funções úteis na aplicação à mão. Por exemplo, no caso de um vírus oncolítico para tratamento de tumor, uma cepa de vírus da invenção preferivelmente terá uma maior capacidade, do que uma cepa de laboratório de referência com modificações equivalentes, de infectar ou replicar qualquer célula tumoral, matar as células tumorais ou dispersar-se entre as células do tecido. Mais preferivelmente, tal maior capacidade é uma maior capacidade estatisticamente significativa. Por exemplo, de acordo com a invenção, uma pode ter até 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes a capacidade da cepa de referência com respeito à propriedade sendo testada.

Preferivelmente, um vírus da invenção tem, isto é, retém, substancialmente a capacidade de sua cepa precursora clínica não modificada, com respeito a uma ou mais das propriedades características de utilidade na aplicação à mão. Por exemplo, no caso de um vírus oncolítico pretendido para o tratamento de tumores, uma cepa de vírus da invenção preferivelmente tem substancialmente a capacidade de sua cepa precursora clínica não modificada de infectar ou replicar uma célula tumoral, matar as células tumorais ou espalhar-se entre as células do tecido.

Preferivelmente, de acordo com a invenção, um vírus retém substancialmente as propriedades de sua cepa precursora clínica não modificada se, em um teste quantitativo, retiver 75%, mais preferivelmente 80, 90, 95, 98, 99 ou 100% da capacidade da cepa precursora clínica nãomodificada, com respeito à propriedade sendo testada. Mais preferivelmente, quanto à propriedade sendo testada, quaisquer diferenças entre a cepa

5R precursora clínica não modificada e a cepa modificada da invenção não serão estatisticamente significativas. .·’ _t ’j :

Análises estatísticas das propriedades aqui descritas podem ser realizadas por testes padrão, por exemplo, testes-t, ANOVA, ou testes de qui-quadrado. Tipicamente, a significância estatística será medida a um nível de p = 0,05 (5%), mais preferivelmente p = 0,01, p = 0,001, p = 0,0001, p = 0,000001.

Modificações

Os vírus da invenção são tipicamente modificados em comparação com suas cepas clínicas precursoras. Em particular, certos genes tipicamente serão tomados não funcionais e os vírus podem também compreender um gene(s) heterólogo(s). Tipicamente, os vírus da invenção são atenuados.

As regiões virais alteradas para os fins aqui descritos podem ser eliminadas (completa ou parcialmente) ou tomadas não-funcionais, ou substituídas por outras seqüências, em particular por uma seqüência genética heteróloga. Um ou mais genes podem ser tomados não funcionais e um ou mais genes heterólogos inseridos.

Vírus Oncolíticos da Invenção

Em uma versão, os vírus da invenção são vírus não laboratorial modificados oncolíticos. Estes serão úteis no tratamento oncolítico do câncer. Tais vírus infectam e replicam em células tumorais, subseqüentemente matando as células tumorais. Assim, tais vírus são competentes para replicação. Preferivelmente, eles são seletivamente competentes para replicação em células tumorais. Isto significa que eles replicam em células tumorais e não em células não-tumorais ou que eles replicam mais eficazmente em células tumorais do que em células nãotumorais. A medição da competência de replicação seletiva pode ser realizada pelos testes aqui descritos para medição da replicação e capacidade de matar células tumorais e também analisada pelas técnicas estatísticas mencionadas aqui, se desejado. . : : : : .·’ .·* . S f • ··· ♦· ··· ·· · · ·· ·

Um vírus oncolítico da invenção preferivelmente tem uma maior capacidade de infectar ou replicar em uma célula tumoral, matar células tumorais ou espalhar-se entre as células dos tecidos, do que uma cepa de laboratório de referência, com as mesmas modificações. Preferivelmente, esta capacidade é uma maior capacidade estatisticamente significante como descrito aqui. As propriedades da cepa de vírus quanto às células tumorais podem ser medidas de qualquer maneira conhecida na técnica.

Por exemplo, a capacidade de um vírus infectar uma célula tumoral pode ser quantificada medindo-se a dose de vírus requerida para medir uma dada percentagem de células, por exemplo, 50% ou 80% de células. A capacidade de replicar em uma célula tumoral pode ser medida por medições de crescimento, tais como aquelas realizadas nos Exemplos (vide Figura 2), por exemplo, medindo-se o crescimento do vírus em células durante um período de 6, 24, 36, 48 ou 72 horas ou mais.

A capacidade de um vírus matar células tumorais pode ser quantificada aproximadamente a olho (vide Figura 3) ou mais exatamente quantificada contando-se o número de células vivas que permanecem durante o tempo para um dado ponto do tempo e MOI para determinado tipo de célula. Por exemplo, podem ser feitas comparações durante 24, 48 ou 72 horas e utilizando-se qualquer tipo de célula tumoral conhecida. Em particular, podem ser usadas células de adenocarcinoma colo-retal HT29, adenocarcinoma da próstata LNCaP.FGC, adenocarcinoma da mama MDAMB-231, melanoma maligno SK-MEL-28 ou glioblastoma astrocitoma U-87 MG. Qualquer um destes tipos de célula ou qualquer combinação destes tipos de célula podem ser usados, como o podem outros tipos de células tumorais. Pode ser desejável construir-se um painel padrão de tipos de célula tumorais para esta finalidade. Para contar o número de células vivas permanecendo em um dado ponto do tempo, o número de células excluindo azul de tripano (isto é células vivas) podem ser contado. A quartíi.ficâçáo · pód£ jtapibçfri.

• ··· ·· ··· ·· · · ·· ·· realizada por escolha de células ativadas por fluorescência (FACS) ou ensaio MTT. A capacidade de matar células tumorais pode também ser medida in vivo, por exemplo, medindo-se a redução do volume tumoral engendrado por um vírus particular.

A capacidade de um vírus espalhar-se no tecido, especialmente tecido sólido, pode ser medida determinando-se o número de células em sítios conectados ao sítio da infecção original.

A fim de determinar as propriedades dos vírus da invenção, será geralmente desejável utilizar-se uma cepa de referência de laboratório padrão para comparação. Qualquer cepa de referência de laboratório padrão adequada pode ser usada. No caso do HSV, prefere-se utilizar uma ou mais de cepa 17+ HSV1, cepa F HSV1 ou cepa KOS HSV1. A cepa de referência tipicamente terá modificações equivalentes à cepa da invenção sendo testada. Assim, a cepa de referência tipicamente terá modificações equivalentes, tais como deleções genéticas ou inserções genéticas heterólogas. Por exemplo, no caso de uma cepa HSV, se os genes codificando ICP34.5 e ICP47 tiverem sendo tomados não-fimcionais no vírus da invenção, então eles também serão tomados não-fimcionais na cepa de referência. As modificações feitas na cepa de referência podem ser idênticas àquelas feitas na cepa da invenção. Queremos dizer com isto que os rompimentos de gene na cepa de referência serão em posições exatamente equivalentes àquelas da cepa da invenção, por exemplo, as deleções serão do mesmo tamanho e no mesmo lugar. Similarmente, nestas versões, genes heterólogos serão inseridos no mesmo lugar, acionados pelo mesmo promotor etc. Entretanto, não é essencial que modificações idênticas sejam feitas. O que é importante é que o gene de referência tenha modificações fimcionalmente equivalentes, por exemplo, que os mesmos genes sejam tomados não-fimcionais e/ou o mesmo gene ou genes heterólogos seja(m) inseridos.

Em um vírus oncolítico da invenção,.mddçfícâçpés adequadas”:

• ··· ·· ··· ·· · · ·· ·· serão feitas no vírus para conferir atividade oncolítica, se não estiver naturalmente presente e, preferivelmente, para conferir atividade oncolítica seletiva.

No caso do HSV, tais mutações permitindo atividade oncolítica seletiva incluem mutação nos genes codificando ICP34.5, ICP6 φΙΟ e/ou timidina quinase (TK), preferivelmente ICP34.5. Tais mutações no gene codificando ICP34.5 em cepas de laboratório de HSV são descritas em Chou e outros 1990, Maclean e outros 1991, embora qualquer mutação em que ICP34.5 não seja funcional pode ser usada.

Portanto, em uma cepa HSV, os vírus preferivelmente modificados, de modo que lhes falte um ou mais de um gene funcional codificando ICP34.5, um gene funcional codificando ICP6, um gene funcional codificando glicoproteína H, um gene funcional codificando timidima quinase; ou em uma cepa não-HSV, não têm um gene funcional equivalente a um de ditos genes HSV.

Mais preferivelmente, os vírus não tem um gene funcional

	codificando ICP34.5.
20	Outras modificações podem também ser feitas. Em particular, no caso de HSV, 0 vírus pode ser modificado de modo que lhe falte um gene funcional ICP47. Isto é porque ICP47 usualmente funciona para bloquear a apresentação de antígeno em células infectadas por HSV, de modo que seu rompimento conduz a um vírus que não confere a células tumorais infectadas
25	propriedades particulares que poderíam proteger tais células infectadas por HSV do sistema imune do hospedeiro. Os vírus com quaisquer outros genes deletados/mutados que provejam propriedades oncolíticas (isto é, replicação seletiva em tumores comparada com tecido circundante) são também vírus da invenção, como

aqueles hábeis na técnica reconhecerão que a lista acima não é exaustiva e a identificação da função de outros genes em quaisquer :dôs‘vírus acima’ po’df ·.

• ··· ·· ··· ·· · · ·· ·· sugerir a construção de novos vírus que são também vírus da invenção.

Os gene(s) heterólogo(s) pode(m) também ser inserido(s) dentro de tais vírus da invenção por técnicas conhecidas na técnica e/ou descritas aqui. Em um vírus oncolítico, o gene heterólogo tipicamente será um que aumente a capacidade do vírus neutralizar tumores. Quaisquer genes conferindo ao vírus propriedades anti-tumores podem ser assim inseridos. Em particular, o gene heterólogo pode ser um gene capaz de modificar a resposta imune às células tumorais de uma maneira benéfica, especialmente um polipeptídeo estimulador imune, tal como CD40L, fator estimulante de colônia de macrófago granulócito (GMCSF), outra citoquina ou quimioquina (por exemplo, RANTES), B7.1 ou B7.2 ou IL12. Altemativamente, o gene heterólogo pode codificar um ativador da pró-droga, tal como nitrorredutase ou citocromo P450. Neste contexto, o tratamento combinado de tumores com a pró-droga ativada pelo ativador de pró-droga e um vírus da invenção é considerado. Altemativamente, o gene heterólogo pode codificar um supressor de tumor, tal como p53.

Outras Cepas de Vírus da Invenção

Em outras versões, são desejáveis vírus não-oncolíticos. Estes podem ser vírus incompetentes para replicação. Sua função é tipicamente suprir genes heterólogos a um indivíduo.

Em particular, para uso como um vetor em aplicações nãooncolíticas, podem ser feitas mutações de modo que a expressão genética precoce imediata reguladora do vírus seja minimizada. Assim, os genes codificando ICP4, ICP27, ICP22 e/ou ICPO podem ser inativados ou deletados individualmente ou em combinação, ou mutações na proteína transativadora do virion vmw65 incluídas prevenindo/reduzindo sua capacidade transativante. Em versões particularmente preferidas para aplicações não23 oncolíticas, os genes codificando ICP27, ICPO e ICP4 são deletados (com ou sem deleção/inativação adicional de ICP22 e/oii.ICP4:7)j cãi ifÒP27 e“TC£4*·;

• ··· ·· 4·· ·· · · ·· ♦· deletados com uma mutação inativante em vmw65, ou ICP4 deletado, repetindo com uma mutação inativante em vmw65. Exemplos de tais vírus incluem os vírus informados por Samaniego e outros 1998, Krisky e outros 1998, ou Thomas e outros 1999.

Cepas de Vírus Neurotróficos

Os vírus neurotróficos e particularmente os vírus simplex da herpes, tais como HSV1 e HSV2, podem ser usados de acordo com a invenção no suprimento de genes heterólogos ao sistema nervoso.

Os vírus de acordo com esta versão da invenção tipicamente têm maior capacidade do que cepas de laboratório de referência com equivalentes modificações para infectar um neurônio, espalhadas entre células do tecido nervoso ou a serem transportadas dentro de um axônio. A capacidade de infectar neurônios pode ser determinada como estabelecido acima como para células em geral. A capacidade de ser transportada dentro de um axônio ou de espalhar-se entre células do tecido nervoso pode ser determinada medindo-se a infecção das células no sistema nervoso em sítios conectados ao sítio da infecção original. Os resultados podem ser analisados estatisticamente como descrito acima.

Nestas versões prefere-se que, em uma cepa HSV, o vírus seja modificado de modo que lhe falte um, dois, três ou todos de um gene funcional codificando ICP27, um gene funcional codificando ICP4, um gene funcional codificando ICPO ou um gene funcional codificando ICP22; ou, em uma cepa não-HSV, o vírus não tenha um gene funcional equivalente a um de ditos genes HSV; e/ou, em uma cepa HSV, o vírus não tenha um gene vmw65 funcional devido a uma mutação em dito gene que abole sua atividade de ativação transcricional; ou em uma cepa não-HSV, o vírus não tenha um gene funcional equivalente a vmw65, devido a uma mutação em dito gene que abole sua atividade de ativação transcricional.

Preferivelmente, dois ou mais doi-genês:códiíi(ja$d(5 IÇÍip27j’’í ICP4, ICPO e ICP22 são tomados não-funcionais, mais preferivelmente três e ainda mais preferivelmente todos os quatro. Preferivelmente, de acordo com estas versões, um vírus da invenção não tem tanto um gene funcional codificando ICP4 como um gene funcional codificando ICP27 e que tem uma mutação inativante no gene codificando vmw65 abolindo sua atividade de ativação transcricional.

Tais vírus podem ser usados para o tratamento de distúrbios do sistema nervoso periférico ou distúrbios do sistema nervoso central. No contexto dos distúrbios do sistema nervoso central, é particularmente preferido que pelo menos dois genes precoces imediatos, selecionados de ICPO, ICP4, ICP22 e ICP27, sejam tomados não-funcionais.

Vírus Imunoterapêuticos

Em aplicações imunoterapêuticas, os vírus da herpes da invenção são usados para infectar células dendríticas ou outras células do sistema imune, por exemplo, macrófagos. Normalmente, a infecção do vírus da herpes de células dendríticas reduz a capacidade das células dendríticas de estimularem uma resposta imune. Portanto, os vírus da invenção são modificados a fim de que sejam capazes eficientemente infectarem células dendríticas sem impedir as células dendríticas de estimularem o sistema imune (WO00/08191). Em tais aplicações, os vírus da invenção tipicamente compreendem um gene(s) heterólogo(s) que codifica(m) um produto genético antigênico. Este pode ser um antígeno associado com uma infecção patogênica ou câncer. O gene é expresso na célula dendrítica e o produto genético apresentado como um antígeno na superfície da célula dendrítica. Isto estimula uma resposta imune ao antígeno pela ativação das células T, que procuram células exibindo aquele antígeno em sua superfície, isto é, células tumorais ou patogênicas ou células infectadas com um patógeno, e destróem-nas.

Preferivelmente, em uma cepa HSV, dito vírus carece de um gene funcional UL43 e/ou um gene funcional íkAs, íoii, íem únia.cega’ nabr·. HSV, carece de um equivalente funcional de UL43 e/ou vhs', e, opcionalmente, em uma cepa HSV, carece de um gene funcional vmw65, devido a uma mutação em dito gene que abole sua atividade de ativação transcricional ou, em uma cepa não-HSV, carece de um gene funcional equivalente a vmw65 devido a uma mutação em dito gene, que abole sua atividade de ativação transcricional; e, opcionalmente, falta-lhe pelo menos um gene precoce imediato funcional, selecionado de ICPO, ICP4, ICP22 e ICP27.

Neste contexto, prefere-se que um vírus da invenção tenha maior capacidade do que uma cepa de laboratório de referência com equivalentes modificações para infectar uma célula dendrítica ou para estimular uma resposta imune. A infecção de células dendríticas pode ser estimada como descrito acima para células em geral. Em particular, uma cepa de vírus não laboratorial da invenção tipicamente infectará uma maior percentagem de células dendríticas do que a cepa de laboratório de referência, quando a dose das duas cepas for a mesma. Análise estatística pode ser conduzida pelos métodos descritos acima.

B. Complementando linhagens de célula

Quando o vírus da invenção é um vírus simplex da herpes, que carece de um gene essencial funcional particular, por exemplo, um gene codificando ICP4 ou ICP27, o vírus da invenção é propagado em uma linhagem de célula expressando aquele gene essencial. Por exemplo, quando o vírus carece de um gene ICP27 funcional, o vírus pode ser propagado em células V27 (Rice e Knipe, 1990), 2-2 células (Smith e outros, 1992) ou células BI30/2 (Howard e outros, 1998). Quando o vírus carece de um gene ICP4 funcional, o vírus pode ser propagado em uma linhagem de célula expressando ICP4, por exemplo, células E5 (DeLuca e outros, 1985). Quando o vírus não tem um gene ICP4 funcional e um gene ICP27 funcional, o vírus é propagado em uma linhagem de célula expressa^d0’tjnio*ICP4 cbrrío ICP.2^7 (tal como células E26; Samaniego e outros, 1995), e quando o vírus adicionalmente carece de um gene vmw65 funcional, ele pode ser propagado em uma linhagem de célula também contendo um homólogo não-HSV de vmw65 (por exemplo, de vírus da herpes eqüino, como em Thomas e outros, 1999). As mutações para vmw65 podem também ser parcialmente compensadas por inclusão de bisacetamida de hexametileno (HMBA) nos meios usados para crescimento do vírus (MacFarlane e outros, 1992).

As linhagens de célula expressando ICP27 podem ser produzidas cotransfectando-se células mamíferas, por exemplo, as células Vero ou BHK, com um vetor, preferivelmente um vetor de plasmídeo, compreendendo um gene ICP27 HSV funcional, capaz de ser expresso em ditas células e um vetor, preferivelmente um vetor de plasmídeo, codificando um marcador selecionável, por exemplo, de resistência à neomicina. Os clones possuindo o marcador selecionável são então mais triados para determinar que clones também expressam o ICP27 funcional, por exemplo, com base em sua capacidade de suportar o crescimento das cepas HSVICP27, utilizando-se métodos conhecidos daqueles hábeis na técnica (por exemplo, como descrito em Rice e Knipe, 1990).

As linhagens de célula que não permitem a reversão de uma cepa HSV ICP27-mutante para uma cepa com ICP27 funcional são produzidas como descrito acima, assegurando que o vetor compreendendo um gene ICP27 funcional não contém seqüências que se sobrepõem com (isto é, são homólogas a) as seqüências permanecendo no vírus ICP27-mutante.

Onde as cepas HSV da invenção compreenderem modificações inativantes em outros genes essenciais, por exemplo ICP4, a complementação das linhagens de célula compreenderá um gene HSV funcional que complemente o gene essencial modificado da mesma maneira descrita para ICP27. Por exemplo, no caso de cepas HSV compreendendo mutações tanto em ICP27 como ICP4, uma linhagem ide qélüH e^ptesfàndo ·’*: tanto ICP27 como ICP4 é usada (tal como descrito em Samaniego e outros, 1995 ou em Thomas e outros, 1999). As cepas HSV expressando outros genes essenciais pode ser construída de uma maneira similar àquela descrita para ICPD27. Aqui, novamente, se for assegurado que não há sobreposição de seqüências entre o DNA de vírus remanescente e aquele inserido dentro da linhagem de célula para crescimento de vírus, a possibilidade de versão do vírus a uma forma menos incapacitada durante o crescimento será minimizada.

C. Métodos de mutação

Os vários genes virais referidos podem ser tomados funcionalmente inativos por diversas técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, eles podem ser tomados funcionalmente inativos por deleção(ões), substituição(ões) ou inserção(ões), preferivelmente por deleção. Uma deleção pode remover uma parte dos genes ou o inteiro gene. Por exemplo, a deleção de somente um nucleotídeo pode ser feita, resultando em uma mudança de estrutura. Entretanto, preferivelmente uma deleção maior é feita, por exemplo, pelo menos 25%, mais preferivelmente pelo menos 50% da seqüência total codificante ou não-codificante (ou altemativamente, em termos absolutos, pelo menos 10 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 100 nucleotídeos, muitíssimo preferivelmente pelo menos 1000 nucleotídeos). É particularmente preferido remover-se o inteiro gene e algumas das seqüências flanqueantes. Uma seqüência inserida pode incluir um ou mais dos genes heterólogos descritos abaixo. No caso do gene vmw65, o inteiro gene não é deletado, uma vez que ele codifica uma proteína de estrutura essencial, porém uma pequena mutação inativante é feita que abole a capacidade de vmw65 ativar transcricionalmente os genes IE (por exemplo, como em Ace e outros, 1989 ou Smiley e outros, 1997).

As mutações são feitas nos vírus da herpes por métodos de recombinação homóloga bem conhecidos daqueles .hábeis ijajt^cijícaf P.oe ·**: exemplo, o DNA genômico de HSV é transfectado junto com um vetor, preferivelmente um vetor de plasmídeo, compreendendo a seqüência mutada flanqueada por seqüências de HSV homólogas. A seqüência mutada pode compreender uma deleção(ões), inserção(ões) ou substituição(ões), todas podendo ser construídas por técnicas de rotina. As inserções podem incluir genes marcadores selecionáveis, por exemplo, lacZ ou GFP, para triar vírus recombinantes por, por exemplo, atividade de β-galactosidase ou fluorescência.

D. Genes e promotores heterólogos

Os vírus da invenção podem ser modificados para contar um gene/genes heterólogo(s). A expressão “gene heterólogo” engloba qualquer gene. Embora um gene heterólogo seja tipicamente um gene não presente no genoma de um vírus de herpes, o(s) gene/genes da herpes pode(m) ser usado(s) desde que a seqüência codificante não seja operavelmente ligada às seqüências de controle viral com que é naturalmente associada. O gene heterólogo pode ser qualquer variante alélica de um gene tipo selvagem, ou pode ser um gene mutante. O termo “gene” é destinado a cobrir seqüências de ácido nucleico que sejam capazes de serem pelo menos transcritas. Assim, as seqüências codificando mRNA, tRNA e rRNA são incluídas dentro desta definição. Entretanto, a presente invenção refere-se a expressão de polipeptídeos em vez de tRNA e rRNA. As seqüências codificando mRNA incluirão, opcionalmente, algumas ou todas as seqüências flanqueantes transcritas porém não transladadas 5’ e ou 3’ ou de outro modo associadas com a seqüência codificante transladada. Elas podem, opcionalmente, incluir ainda as seqüências de controle transcricional normalmente associadas com as seqüências transcritas, por exemplo, sinais de parada transcricionais, sítios de poliadenilação e elementos intensificadores a jusante.

O gene/genes heterólogos podem ser inseridos dentro do genoma viral por recombinação homóloga de cepas· GorÇi, £dr £*xepipjó; vetores de plasmídeo contendo o gene/genes heterólogo(s) flanqueados por seqüências de HSV. O gene/genes heterólogos podem ser introduzidos dentro de um vetor de plasmídeo adequado compreendendo seqüências virais da herpes, utilizando-se técnicas de clonagem bem conhecidas na técnica. O gene/genes heterólogos pode(m) ser inserido(s) dentro do genoma viral em qualquer local, desde que o vírus possa ainda ser propagado. Os genes heterólogos podem ser inseridos em sítios dentro do genoma de vírus.

A seqüência transcrita do gene/genes heterólogo(s) é preferivelmente operavelmente ligada a uma seqüência de controle permitindo expressão do gene/genes heterólogo(s) em células mamíferas, preferivelmente uma célula tumoral ou uma célula do sistema nervoso. A expressão “operavelmente ligada” refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação permitindo-os funcionar em sua maneira pretendida. Uma seqüência de controle “operavelmente ligada” a uma seqüência codificante é ligada de tal maneira que a expressão da seqüência codificante é obtida sob condições compatíveis com a seqüência de controle. ·'-··

A seqüência de controle compreende um promotor permitindo expressão do gene/genes heterólogo(s) e um sinal para terminação da transcrição. O promotor é selecionado dos promotores que são funcionais em mamífero, preferivelmente células humanas do sistema nervoso ou em tumores ou em células do sistema imune. O promotor/promotores podem ser derivados de seqüências promotoras de genes eucarióticos. Por exemplo, os promotores podem ser derivados do genoma de uma célula em que a expressão do gene heterólogo é para ocorrer, preferivelmente um mamífero, preferivelmente célula humana. Com respeito a promotores eucarióticos, eles podem ser promotores que funcionam de uma maneira ubíqua (tais como promotores de β-actina, tubulina) ou, altemativamente, de uma maneira específica de tecido, tal como o promotor da endlas® £sp4cíÂcà jleiheurômo:’,’: (NSE). Eles podem também ser promotores que respondem a estímulos específicos, por exemplo, promotores que se ligam a receptores de hormônio esteróide. Os promotores virais podem também ser usados, por exemplo, o promotor de repetição de terminal longo do vírus da leucemia de murinos Moloney (MMLV) LTR ou outros promotores retrovirais, o promotor IE do citomegalovírus (CMV) humano ou de camundongo, os promotores dos genes do vírus da herpes, incluindo aqueles acionando a expressão dos transcritos associados a latência.

Os cassetes de expressão e outros constructos adequados, compreendendo o gene/genes heterólogo(s) e seqüências de controle, podem ser produzidos usando-se técnicas de clonagem de rotina conhecidas das pessoas hábeis na técnica (vide, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning - A laboratory manual: Cold Spring Harbor Press).

Pode também ser vantajoso para os promotores serem indutíveis, a fim de que os níveis de expressão do gene heterólogo possa ser regulado durante o tempo de vida da célula. Indutível significa que os níveis de expressão obtidos usando-se o promotor podem ser regulados. Por exemplo, em uma versão preferida, onde mais do que um gene heterólogo é inserido dentro do genoma HSV, um promotor compreendería um promotor responsivo à proteína de fusão ativadora transcricional do repressor tet/VP16 anteriormente informada (Gossen e Bujard, 1992, Grossen e outros, 1995) e acionaria o gene heterólogo cuja expressão é para ser regulada. O segundo promotor compreendería um promotor forte (por exemplo, o promotor IE CMV) acionando a expressão da proteína de fusão do repressor tet/VP16. Assim, neste exemplo, a expressão do primeiro gene heterólogo dependería da presença ou ausência de tetraciclina.

Os genes heterólogos tipicamente codificariam polipeptídeos de uso terapêutico. Por exemplo, no sistema nervoso em aplicações nãooncolíticas, genes que podem modular a dor, est[ntu4ã{ jõjredrescániéntó dós nervos ou impedir a degeneração dos nervos. Em aplicações oncolíticas, os genes heterólogos podem codificar proteínas que são elas próprias citotóxicas, codificar enzimas ativadoras de pró-droga ou que sejam capazes de estimular ou aumentar uma resposta imune anti-tumor.

Os genes heterólogos podem também incluir genes marcadores (por exemplo, codificando β-galactosidase ou proteína fluorescente verde ou outras proteínas fluorescentes) ou genes cujos produtos regulam a expressão de outros genes (por exemplo, fatores reguladores transcricionais, incluindo a proteína de fusão ativadora transcricional do repressor tet/vmw65 descrita acima.

A terapia genética e outras aplicações terapêuticas podem bem requerer a administração de múltiplos genes. A expressão de múltiplos genes pode ser vantajosa para ao tratamento de uma variedade de condições. Os vírus da herpes são unicamente apropriados quando eles não têm as capacidades de empacotamento limitadas de outros sistemas vetores virais. Assim, múltiplos genes heterólogos podem ser acomodados dentro de seu genoma. Por exemplo, de 2 a 5 genes podem ser inseridos dentro do genoma.

Há, por exemplo, pelo menos duas maneiras pelas quais isto podería ser conseguido. Por exemplo, mais do que um gene heterólogo e seqüências de controle associadas poderíam ser introduzidos dentro de uma cepa de HSV particular, em um único sítio ou em múltiplos sítios do genoma de vírus. Também seria possível utilizarem-se pares de promotores (o mesmo ou diferentes promotores) voltados em orientações opostas entre si, cada um destes promotores acionando a expressão de um gene heterólogo (o mesmo ou diferente gene heterólogo) como descrito acima.

E. Usos terapêuticos

Os vírus da invenção podem ser usados em métodos de terapia. Em particular, vírus oncolíticos da invenção podem ser usados em aplicações incluindo o tratamento oncolítico doj«®’ân(jei pot. êxènjpla,’ poc injeção intra-tumoral direta. Onde o vírus compreender um gene heterólogo codificando um ativador de pró-droga, terapia pró-droga adicional pode ser realizada. Adicionalmente, o tratamento pode ser combinado com uma ou estímulo de uma resposta imune por qualquer meio conhecido na técnica. Os vírus da invenção podem ser usados no tratamento terapêutico de qualquer tumor sólido de um mamífero, preferivelmente em um humano. Por exemplo, os vírus da invenção podem ser administrados a um indivíduo com carcinoma da próstata, mama, pulmão, fígado, endometrial, da bexiga, cólon ou cervical;; adenocarcinoma; melanoma; linfoma; glioma; ou sarcomas tais como sarcomas de tecido mole e osso.

Os vírus incompetentes para replicação da invenção podem ser usados no suprimento de genes a indivíduos requerendo terapia genética. Em particular, os vírus neurotróficos da invenção podem ser usados no tratamento de distúrbios do sistema nervoso central ou periférico. Os distúrbios do sistema nervoso central preferidos para tratamento ou prevenção incluem distúrbios neurodegenerativos. Distúrbios do sistema nervoso central particularmente preferidos, para tratamento ou prevenção, são acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, doença de Tay Sachs e doenças de mucopolissacarídeos. Distúrbios do sistema nervoso periférico preferidos, para tratamento ou prevenção, incluem doença motora dos neurônios, dor crônica e avaria do nervo periférico.

Os vírus imunoterapêuticos da invenção podem ser usados na prevenção ou tratamento da infecção patogênica ou câncer com que o gene codificante heterólogo inserido no antígeno é associado.

F. Administração

Os vírus da invenção podem, assim, ser usados em um paciente, preferivelmente um paciente humano, em necessidade de

3^ tratamento. Os vírus da invenção podem ser usados para o tratamento oncolítico do câncer e os vírus da herpes da invenção j(ajérti $e· aplicações oncolíticas) para o tratamento de, por exemplo, dor, condições degenerativas do sistema nervoso, ou para estimular o recrescimento de nervos. O objetivo do tratamento terapêutico é melhorar a condição do paciente. Tipicamente, o tratamento terapêutico utilizando-se um vírus da invenção aliviará os sintomas da doença ou condição do paciente sendo tratado. Um método de tratamento de acordo com a invenção, portanto, compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus da invenção a um paciente sofrendo de câncer, dor, uma condição neurodegenerativa ou avaria de nervo.

A administração de um vírus oncolítico da invenção a um paciente sofrendo de um tumor tipicamente matará as células do tumor, assim diminuindo o tamanho do tumor e/ou impedindo o espalhamento de células malignas do tumor. A administração de um vírus da invenção a um paciente sofrendo de outras doenças tais como dor, condições degenerativas ou avaria de nervo tipicamente melhorará a condição do paciente. Por exemplo, ao diminuir a severidade da dor, retardando a degeneração do tecido nervoso ou promovendo o recrescimento dos nervos.

Um método de administrar terapia envolve combinar o vírus com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, para produzir uma composição farmacêutica. Veículos e diluentes adequados incluem soluções salinas isotônicas, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato.

O tratamento oncolítico e/ou suprimento de gene às células para fins terapêuticos podem então ser realizados seguindo-se injeção direta da composição vetora para dentro do tecido alvo. A quantidade de vírus administrada é, no caso do HSV, na faixa de 10⁴ a IO¹⁰ pfu, preferivelmente de 10⁵ a 10⁸ pfu, mais preferivelmente cerca de 10⁶ a 10⁸ pfu. Quando injetado para tratamento oncolítico ou não-oncolítico, tipicamente até 500 μΐ, tipicamente de 1-200 μΐ, preferivelmente de 1-10 μΐ, de uma composição farmacêutica consistindo essencialmente do vírus e um veículo ou diluente adequado farmaceuticamente aceitável, seriada·' 4i£ajió.s jpará finjêçãó: Entretanto, para algumas aplicações de terapia oncolítica volumes maiores até 10 ml podem também ser usados, dependendo do tumor e sítio de inoculação.

As vias de administração e as dosagens descritas são destinadas somente como uma orientação, uma vez que um médico hábil será capaz de determinar prontamente as ótimas via de administração e dosagem. A dosagem pode ser determinada de acordo com vários parâmetros, especialmente de acordo com a idade, peso e condição do paciente a ser tratado, a severidade da doença ou condição e a via de administração.

A via de administração preferida para um paciente sofrendo de câncer é por injeção direta dentro do tumor. O vírus pode também ser administrado sistemicamente ou por injeção dentro de um vaso sangüíneo suprindo o tumor. A via ótima de administração dependerá do local e tamanho do tumor. A dosagem pode ser determinada de acordo com vários parâmetros, especialmente de acordo com o local do tumor, o tamanho do tumor, a idade, peso e condição do paciente a ser tratado e a via de administração.

G. Aspectos Não-Terapêuticos

São também providos métodos de identificar as cepas clínicas adequadas para modificação de acordo com a invenção. Além disso, métodos de validação de alvo são providos. Estes referem-se à identificação dos genes adequados para uso nas aplicações terapêuticas da invenção, como descrito acima.

Métodos de produção dos vírus da invenção são também providos.

Os seguintes Exemplos ilustram a invenção

Vírus simplex da herpes tipo-1 (HSV1), em que o fator de neurovirulência ICP34.5 que é inativado mostrou previamente dirigir a lise celular específica de tumor em modelos tumorais tanto in vitro como in vivo. Tais vírus mostraram também ser seguros nos expHmjnio? clínicos jde Fase’1 por injeção intra-cerebral direta em pacientes de glioma de estágio tardio.

Trabalho anterior utilizou isolados de laboratório serialmente passados de HSV1 (vírus derivado da cepa 17+ HSV1 ou cepa F HSV1) que poderíam ser antecipados serem atenuados em sua capacidade lítica em células tumorais humanas, em comparação com isolados clínicos mais recentes.

Em trabalho dirigido à produção de HSV deletado de ICP34.5 com potencial oncolítico e anti-tumor aumentado, deletamos ICP34.5 de um isolado clínico de HSV1 e comparamos o potencial replicativo e lítico em numerosos tipos de células tumorais humanas, em comparação com a cepa 17+ HSV1 (uma cepa de laboratório padrão).

Construção do Vírus (vide Fig. 1)

Os vírus usados foram baseados na cepa 17+HSV1 (uma cepa de laboratório padrão) ou dois isolados clínicos de herpes simplex com freqüentes reativadores do HSV1. Estas cepas foram chamadas BL1 e JS1. ICP34.5 foi completamente deletado da cepa 17+ e JS1, junto com a inserção de um cassete CMV-GFP. JS1 foi também ainda construída pela inserção de GM-CSF humano ou de camundongo, a fim de substituir o gene ICP34.5. BL1 e JS1 são assim isolados clínicos ou “cepas não laboratorial”. Os derivados de JS1 discutidos acima são também cepas não laboratorial, isto é, cepas não laboratorial modificadas da invenção.

Crescimento de Vírus em Células Tumorais (vide Fig. 2)

JS1 e BL1 mostraram aumentado crescimento em algumas células tumorais humanas testadas, como comparado com a cepa 17+ com ICP34.5 de HSV1 deletado, quando testadas durante um período de 72 h (Fig. 2). JS1 foi selecionada para mais estudo e as modificações descritas acima (Vide Fig. 1 e acima) foram feitas nela.

Capacidades Líticas dos Vírus (vide Fig. 3) ·«· rr · *· β·Ο· ·«·* ··· ·

As capacidades líticas (matança dç^él^asJlJ-foÈam.àuíneütadgS ?’’t com os vírus derivados de cepas não laboratorial derivadas de JS1 em todas as linhagens de células testadas. Mais particularmente, com referência à Figura 3, o vírus JS 1/34.5-, isto é, JS1 com ICP34.5 removido por deleção, mostrou aumentadas capacidades líticas em adenocarcinoma colo-retal HT29, adenocarcinoma da próstata LNCaP.FGC, adenocarcinoma da mama MDAMB-231, melanoma maligno SK-MEL-28 e células astrocitoma gliobastoma MGU-87.

As capacidades líticas foram também estimadas em células SK-MEL-28, MDA-MB-231 e HT29 por ensaio de exclusão de azul tripano de células infectadas em várias doses e tempos após infecção com BL1, JS1 como comparado com a cepa 17+. O azul de tripano é excluído das células vivas e assim numerosas células vivas permanecendo em uma cultura puderam ser estimadas por este meio. As linhagens de células tumorais em poços duplicata de seis pratos de poço foram infectadas por 24, 48 ou 72 h em um MOI de 0,1 ou 1 com 17+, BL1 ou JS1 e numerosas células vivas, foram contadas. A percentagem do número de células vivas em poços de controle não infectados equivalentes é mostrada na Tabela 1.

Assim, como em todos os casos, mais células tumorais são mortas com os vírus de isolado clínico BL1 e JS1 em vez de com o isolado de laboratório 17+, para prover atividade oncolítica aumentada, o uso de recentes vírus clínicos é provável aumentar as capacidades anti-tumor de tais vírus modificados para fornecer replicação seletiva tumoral (por exemplo, pela deleção de ICP34.5), quando usados em pacientes humanos para tratamento de câncer.

Tabela 1

Linhagem de célula	Tempo após infecção	JS1 MOI=0,1 MOI=1	17 : MOI=0,1 :‘*MCükl:..	•blj : : .·’ .·* ·'. : ΜΟΙ=0·,1 ’·
percentagem do número de células vivas em poços de controle não infectados
SK-MEL-28	24 h amostras duplicadas	41 33,7	8 7	57,3 62,6	19 19,3	43,7 39	6,67 6,33
48 h	5,51 5,05	1,9 0,8	7,4 7,1	3,7 2,6	4,5 4,8	0,8 1,1
72 h	0 0	0 0	0 0	0 0	0 0	0 0
MDA-MB-231	24 h	44,91 44,02	16,7 16,96	69,37 65,8	36,34 34,55	55,63 60,45	26,79 25,27
48 h	14,1 13,5	4.7 3.8	27,9 27	8,3 8,5	18 20	6,7 8,3
72 h	0 0	0 0	2,91 2,91	0,73 1,27	1,46 1,64	0 0
HT-29	24 h	37,53 39,24	15 15	47,28 45,76	23,61 24,24	42,22 43,04	22,15 21,33
48 h	13,2 14	2,3 3	29,4 27,7	4,2 4,7	18,4 21,2	4,4 3,7
72 h	0 0	0 0	1,57 1,89	0 0	1,64 1,57	0 0

Atividade Anti-Tumor Mais Aumentada

Atividade mais aumentada pode também ser antecipada se estes vírus forem então usados para suprir genes com atividade anti-tumor.

Tais genes incluem aqueles codificando ativadores de pró-droga ou proteínas estimuladoras imunes.

Para esta finalidade, produzimos de JS1 um isolado clínico de HSV1 com ICP34.5 deletado, que expressa GM-CSF humano ou de camundongo. GM-CSF é um potente estimulador imune. Este vírus é 10 projetado para aumentar as respostas imunes anti-tumor, em seguida a injeção intra-tumoral.

Referências

Chou e outros, 1990, Science 250: 1262-1266

Maclean e outros, 1991, J. Gen. Virol. 72: 631-639

Samaniego e outros, 1998, J. Virol. 72: 3307 - 3320

Krisky e outros, 1998, Gene Therapy 5: 1593 - 1603

Thomas e outros, 1999, J. Virol. 73: 7399 - 7409

MacFarlane e outros, 1992), J. Gen. Virol. 73: 285 - 292

Howard e outros, 1998, Gene Therapy 5: 1137-1147 .....

:··. ·:· f: :..

Samaniego LA e outros, 1995, J. Vjròl..‘óSL ,57$$·.£7|5 ·

Ace CI e outros, 1989, J. Virol. 63: 2260 - 2269

Smith IL e outros, 1992, Virol. 186: 74-86

Rice, SA e Knipe DM, 1990, J. Virol. 64: 1704 - 1715

DeLuca NA e outros, 1985, J. Virol. 56: 558 - 570

Gossen M & Bujard H, 1992, PNAS 89: 5547 - 5551

Gossen M e outros, 1995, Science 268: 1766 - 1769 Smiley, J.R. & Duncan J., 1997, J. Virol. 71:6191-6193 10 Thompson e outros, 1998, Virus Genes 1 (3); 275 - 286

Meignier e outros, 1998, J. Infec. Dis. 159; 602 - 614 Informação de Depósito

A cepa HSV1 JS1 foi depositada na European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido, 15 em 2 de janeiro de 2001, sob número de acesso provisório 01010209.

Claims (10)

1. Cepa HSV1 JS1, caracterizada pelo fato de ser como depositada na European Collection of Cell Cultures (ECACC) sob número de acesso 01010209, e ser modificada de modo a carecer de um ou mais de urn gene funcional codificando ICP34.5, um gene funcional codificando ICP6, um gene funcional codificando glicoproteína H e um gene funcional codificando timidina quinase.

2. Cepa HSV1 JS1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de carecer de um gene funcional codificando ICP34.5.

3. Cepa HSV1 JS1 de acordo com a reivindicação2, caracterizada pelo fato de compreender ainda um gene heterólogo.

4. Cepa HSV1 JS1 de acordo com a reivindicação3, caracterizada pelo fato de dito gene heterólogo ser um gene capazde modificar respostas imunes.

5. Cepa HSV1 JS1 de acordo com a reivindicação4, caracterizada pelo fato de dito gene heterólogo capaz de modificar respostas imunes codificar um polipeptídeo estimulador imune ou outro produto gênico capaz de modificar respostas imunes, um ativador de pró-fármaco, um supressor de tumor ou um produto gênico pró-apoptótico.

6. Cepa HSV1 JS1 de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato do dito polipeptídeo estimulador imune ser fator estimulador de colônia de granulócito macrófago (GMCSF), outra citoquina ou quimioquina, RANTES, B7.1 ou B7.2 ou IL12, ou em que o ativador de pró-fármaco é nitrorredutase ou citocromo p450, ou em que o supressor de tumor ép53.

7. Cepa HSV1 JS1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do vírus carecer ainda de um gene funcional ICP47.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender uma cepa HSV1 JS1 como definida nas reivindicações 1 a 7.

9. Cepa HSV1 JS1 de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de um tumor.

10. Uso de uma cepa HSV1 JS1 como definida nas reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um

5 medicamento para o tratamento oncolítico do câncer.