TWI839805B - 一種重組單純皰疹病毒及其用途 - Google Patents

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本發明涉及病毒學和腫瘤治療領域。特別地，本發明提供了一種重組單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV），其能夠特異性地在腫瘤細胞中以高水準複製並殺傷腫瘤細胞，但是在正常細胞中以低水準複製，從而本發明的重組單純皰疹病毒不僅對腫瘤細胞具有高殺傷力，而且具有顯著降低的副作用（特別是神經毒性）。進一步，本發明涉及了基於該重組單純皰疹病毒構建的病毒載體，包含該重組單純皰疹病毒或該病毒載體的藥物組合物，以及該重組單純皰疹病毒或該病毒載體的用途。本發明的重組單純皰疹病毒可以用於感染並殺傷腫瘤細胞，並且可以用於將基因藥物遞送至腫瘤細胞內，進行基因治療。

Description

一種重組單純皰疹病毒及其用途
本發明涉及病毒學和腫瘤治療領域。特別地，本發明提供了一種重組單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV），其能夠特異性地在腫瘤細胞中以高水準複製並有效殺傷腫瘤細胞，但是在正常細胞中以低水準複製，從而本發明的重組單純皰疹病毒不僅對腫瘤細胞具有高殺傷力，而且具有顯著降低的副作用（特別是神經毒性）。進一步，本發明涉及了基於該重組單純皰疹病毒構建的病毒載體，包含該重組單純皰疹病毒或該病毒載體的藥物組合物，以及該重組單純皰疹病毒或該病毒載體的用途。本發明的重組單純皰疹病毒可以用於感染並殺傷腫瘤細胞，並且可以用於將基因藥物遞送至腫瘤細胞內，進行基因治療。
放療、化療和靶向藥物是目前廣泛採用的腫瘤治療方案，但是它們都存在著治療不徹底、毒副作用大、容易產生抗藥性、無法控制腫瘤復發和轉移等諸多問題，腫瘤治療效果不理想。因此，急需開發新型高效的腫瘤治療方法。近年來，人們對腫瘤與免疫關係的認識大幅提高，腫瘤免疫治療發展迅速，其中，使用溶瘤病毒（Oncolytic Virus，OV）的療法作為一種新型的腫瘤免疫治療方法備受矚目（Lichty B D, Breitbach C J, Stojdl D F , et al.Going viral with cancer immunotherapy [J]. Nat Rev Cancer, 2014, 14 (8): 559-567）。溶瘤病毒是一類具有嗜腫瘤特性的病毒，其能夠選擇性地在腫瘤細胞中複製，而在正常細胞內的增殖則受到限制。溶瘤病毒能在腫瘤細胞中複製從而導致腫瘤細胞溶解和死亡，並且擴增的病毒能繼續感染周圍的腫瘤細胞，產生一種級聯效應。此外，溶瘤病毒在裂解腫瘤細胞的過程中，還能夠釋放腫瘤抗原，刺激機體產生針對腫瘤抗體的特異性抗腫瘤免疫，進一步擴大溶瘤病毒的溶瘤效果。溶瘤病毒是目前惡性腫瘤治療領域中最為熱門的新型基因治療藥物。特別是在實體瘤的局部控制治療上，溶瘤病毒的感染和增殖不僅會導致注射部位的腫瘤消融，而且腫瘤細胞的裂解會導致腫瘤抗原從腫瘤細胞中釋放，從而誘導機體產生系統性的抗腫瘤免疫應答來對抗其它部位的腫瘤，這可能是機體系統性控制腫瘤擴散和轉移的關鍵免疫應答（Russell S J, Peng K W, Bell J C. Oncolytic virotherapy [J]. Nat Biotechnol, 2012, 30 (7): 658-670）。
目前的溶瘤病毒按病毒種類劃分可分為十餘種，其中，溶瘤型I型單純皰疹病毒（HSV-1）因所使用的病毒載體具有基因容量大、複製週期短、感染效率高、可插入複數治療基因等優勢，成為國內外基因工程腫瘤治療藥物的首選。
HSV-1病毒屬於皰疹病毒科，是一類有包膜的DNA病毒，能引起人口唇、眼睛和面部皮膚的皰疹。據流行性研究統計，60%以上人群都感染過HSV-1病毒。HSV-1病毒的基因組由152kb的雙股線性DNA組成，包含相互連接的二片段：長片段和短片段（Macdonald S J, Mostafa H H, Morrison L A , et al.Genome sequence of herpes simplex virus 1 strain KOS [J]. J Virol, 2012, 86 (11): 6371-6372）。長片段（L區）約占基因組的82%，而短片段（S區）則約占基因組的18%，並且長片段和短片段通過連接區連接在一起。L區包含一對倒置重複片段，其間的區段則稱為獨特區段U L；S區也具有一對倒置重複片段，其間的區段則稱為獨特區段U s。目前，HSV-1 KOS株的全基因組測序工作已完成。KOS病毒株的基因組共含有152011個核苷酸鹼基，並且一共包含72個編碼蛋白的基因，其中獨特區段U L包含56個基因，獨特區段U s包含12個基因，並且，U L末端倒置重複區段（TR L）和U L中間倒置重複序列（IR L）上各含有3個相同的基因（分別為ICP34.5、ICP0和LAT），U S末端倒置重複區段（TR S）和U S中間倒置重複序列（IR S）上各含有1個相同的基因（ICP4）。
在HSV-1大量複製時，HSV-1在轉錄水準上以級聯調控的方式合成蛋白質。這些蛋白質按其合成時序的先後，可分為𝛼、𝛽、𝛾三類。HSV-1病毒首先轉錄𝛼類基因，這些基因編碼5個立即早期蛋白（immediate-early protein，IE protein），包括ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，繼而在轉錄水準上啟動𝛽類和𝛾類基因，促進病毒早期（E）和晚期（L）蛋白表現。立即早期蛋白ICP0能獨立啟動所有類別的病毒基因（IE, E和L）以及多種細胞基因（在某些情況下，可能需要ICP4的協同啟動）。ICP0不僅能同細胞內的多種轉錄因數或調節蛋白相互作用，啟動宿主細胞中某些基因的轉錄；而且能通過其泛素連接酶E3功能域，調控病毒基因組的表現以及病毒基因的轉錄（Kawaguchi Y, Bruni R,Roizman B. Interaction of herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 with elongation factor 1delta: ICP0 affects translational machinery [J]. J Virol, 1997, 71 (2): 1019-1024）。ICP4和ICP27是病毒複製所必須的立即早期蛋白（DeLuca N A, McCarthy A M, Schaffer P A. Isolation and characterization of deletion mutants of herpes simplex virus type 1 in the gene encoding immediate-early regulatory protein ICP4 [J]. J Virol, 1985, 56 (2): 558-570；Sacks W R, Greene C C, Aschman D P , et al.Herpes simplex virus type 1 ICP27 is an essential regulatory protein [J]. J Virol, 1985, 55 (3): 796-805）。ICP27是一多功能的調節蛋白，其通過與RNA聚合酶II相互作用來促進病毒基因的轉錄。ICP27能夠與ICP4相互作用共同啟動早期和晚期基因表現。ICP27還能夠通過上調病毒複製相關基因，從而間接促進病毒DNA複製。此外，ICP27還具有抑制細胞原始RNA剪接，促進病毒mRNA的轉運及翻譯等功能。ICP34.5可逆轉抗病毒蛋白PKR的作用，使宿主和病毒蛋白合成繼續進行，從而有利於病毒複製。此外，ICP34.5還能通過調節PP1磷酸酶活性來逃避宿主的抗病毒反應（Randall G, Roizman B. Transcription of the derepressed open reading frame P of herpes simplex virus 1 precludes the expression of the antisense gamma(1)34.5 gene and may account for the attenuation of the mutant virus [J]. J Virol, 1997, 71 (10): 7750-7757）。
至今，世界上已經有多種溶瘤型HSV-1病毒載體處於臨床前或臨床研究階段，包括HSV1716，其是通過在R3616突變株（來源於HSV-1 F株）中敲除ICP34.5基因獲得的（MacKie R M, Stewart B,Brown S M. Intralesional injection of herpes simplex virus 1716 in metastatic melanoma [J]. Lancet, 2001, 357 (9255): 525-526；和Papanastassiou V, Rampling R, Fraser M , et al.The potential for efficacy of the modified (ICP 34.5(-)) herpes simplex virus HSV1716 following intratumoural injection into human malignant glioma: a proof of principle study [J]. Gene Ther, 2002, 9 (6): 398-406）；G207，其是通過在R3616突變株中雙敲除ICP34.5/ICP6基因獲得的（Markert J M, Medlock M D, Rabkin S D , et al.Conditionally replicating herpes simplex virus mutant, G207 for the treatment of malignant glioma: results of a phase I trial [J]. Gene Ther, 2000, 7 (10): 867-874；和Markert J M, Razdan S N, Kuo H C , et al.A phase 1 trial of oncolytic HSV-1, G207, given in combination with radiation for recurrent GBM demonstrates safety and radiographic responses [J]. Mol Ther, 2014, 22 (5): 1048-1055）；NV1020，其是通過在R7020突變株（來源於HSV-1 F株）中刪除單拷貝的ICP34.5/ICP0/ICP4/UL56基因獲得的（Gutermann A, Mayer E, von Dehn-Rothfelser K , et al.Efficacy of oncolytic herpesvirus NV1020 can be enhanced by combination with chemotherapeutics in colon carcinoma cells [J]. Hum Gene Ther, 2006, 17 (12): 1241-1253；和Geevarghese S K, Geller D A, de Haan H A , et al.Phase I/II study of oncolytic herpes simplex virus NV1020 in patients with extensively pretreated refractory colorectal cancer metastatic to the liver [J]. Hum Gene Ther, 2010, 21 (9): 1119-1128）；以及T-VEC，其是通過在臨床HSV-1分離株JS1中雙敲除ICP34.5/ICP47基因獲得的（Liu B L, Robinson M, Han Z Q , et al.ICP34.5 deleted herpes simplex virus with enhanced oncolytic, immune stimulating, and anti-tumour properties [J]. Gene Ther, 2003, 10 (4): 292-303）。美國Amgen公司的重組HSV-1病毒T-VEC在治療晚期黑色素瘤患者的Ⅲ期臨床試驗中取得了突破，成為首個獲得FDA批准的溶瘤病毒類治療藥物。然而，資料表明，該項臨床研究僅達到了持久反應率（DRR）的主要終點，但未達到改善總生存期（OS）的次要終點，儘管T-VEC治療組表現出強烈的有利趨勢（Andtbacka R H, Kaufman H L, Collichio F , et al.Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in Patients With Advanced Melanoma [J]. J Clin Oncol, 2015, 33 (25): 2780-2788）。這主要是因為T-VEC具有較強的毒副作用，其首次瘤內治療劑量僅為10 6PFU病毒，這大大降低了腫瘤治療的效果，並且導致患者錯過了溶瘤治療的最佳時機。
儘管I型單純皰疹病毒溶瘤療法在近些年取得一定的成績，但是對已進入腫瘤治療臨床研究的重組HSV-1病毒進行分析後發現，由於不同的溶瘤病毒具有不同的遺傳學修飾、不同的溶瘤效果及安全性，因而它們所適用的腫瘤適應症及治療腫瘤的效果也不盡相同（Eager R M, Nemunaitis J. Clinical development directions in oncolytic viral therapy [J]. Cancer Gene Ther, 2011, 18 (5): 305-317）。總的來說，現有的溶瘤病毒均存在毒副作用大、安全性差及溶瘤病毒的治療劑量明顯受限等缺陷，這給腫瘤治療研究帶來嚴峻的挑戰（Liu T C, Galanis E,Kirn D. Clinical trial results with oncolytic virotherapy: a century of promise, a decade of progress [J]. Nat Clin Pract Oncol, 2007, 4 (2): 101-117）。溶瘤病毒的治療效果與病毒給藥劑量呈正相關。如果溶瘤病毒的特異性和安全性不高，那麼溶瘤病毒的使用劑量必然需要降低，以避免給機體帶來嚴重的副反應。這嚴重影響了溶瘤病毒的臨床治療效果，並且導致了一定的安全性隱患。以美國Amgen公司的T-VEC為例，藥物毒性/副作用是限制T-VEC臨床效果的重要因素。儘管科學家們一直在進行各種嘗試，但迄今為止，尚未發現既能夠在腫瘤細胞中以高水準複製並殺傷腫瘤細胞，又不會對正常細胞造成嚴重副作用的溶瘤病毒。因此，仍然需要開發新的溶瘤病毒，以實現溶瘤病毒療法的低毒性和高有效性。
為了克服現有技術中的重組單純皰疹病毒在腫瘤基因治療中的上述缺陷，本申請的發明人構建了一種全新的重組單純皰疹病毒，其不僅能夠在腫瘤細胞中以高水準複製，對腫瘤細胞具有高殺傷力，而且具有顯著降低的副作用（特別是神經毒性），因此，本發明的重組單純皰疹病毒不僅維持了溶瘤病毒的高療效，而且大大提高了溶瘤病毒的安全性。
在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
如本文中所使用的，術語“重組HSV病毒”是指經改造的HSV病毒，其與野生型HSV病毒相比，包含人工引入的突變。應當理解的是，本發明的重組HSV病毒不受限於其生產方式。例如，本發明的重組HSV病毒可通過同源重組產生，也可通過培養感染了該重組HSV病毒的宿主細胞而製備。
如本文中所使用的，術語“病毒載體（viral vector）”是指，基於病毒基因組而構建獲得的、能夠攜帶外源核苷酸序列的一種核酸運載工具。通常而言，病毒載體能夠在合適的宿主細胞中自我複製和/或表現其所包含的基因（內源的和外源的）。病毒載體可包含完整的野生型病毒的基因組，或者經突變或修飾的病毒基因組。然而，出於安全性的考慮，病毒載體一般較佳包含經突變或修飾的病毒基因組。由於本發明的病毒載體衍生自HSV的病毒基因組，因此，本發明的病毒載體也可被稱為HSV病毒載體。
如本文中所使用的，表述“不表現功能性目的蛋白”是指，當病毒或病毒載體或病毒基因組感染細胞後，該病毒或病毒載體或病毒基因組不能產生或表現具有生物學功能活性的目的蛋白。例如，該病毒或病毒載體或病毒基因組可以因基因缺失而完全不產生或表現該目的蛋白，或者因功能喪失性突變而產生或表現不具有生物學功能活性的目的蛋白。
如本文中所使用的，術語“功能喪失性突變”是指這樣的突變，其導致突變基因所編碼和表現的蛋白喪失了其生物學功能活性。功能喪失性突變包括但不限於，錯義突變、無義突變、移碼突變、鹼基缺失、鹼基置換、鹼基添加，以及其任何組合（例如，基因片段的缺失或置換或添加），只要包含該功能喪失性突變的基因不能產生或表現具有生物學功能活性的蛋白即可。
如本文中所使用的，術語“必需基因”是指維持HSV病毒生存和複製所不可或缺的基因。此類必需基因的具體實例包括但不限於，ICP27基因（參見例如GenBank No. AFE62883.1）、ICP4基因（參見例如GenBank No. AFE62888.1）、VP5基因（參見例如GenBank No. AFE62846.1）、gL基因（參見例如GenBank No. AFE62828.1）、gH基因（參見例如GenBank No. AFE62849.1）、gD基因（參見例如GenBank No. AFE62894.1）、gK基因（參見例如GenBank No. AFE62882.1）、gB基因（參見例如GenBank No. AFE62855.1）、gN基因（參見例如GenBank No. AFE62878.1）、UL5基因（參見例如GenBank No. AFE62832.1）、UL6基因（參見例如GenBank No. AFE62833.1）、UL8基因（參見例如GenBank No. AFE62835.1）、UL9基因（參見例如GenBank No. AFE62836.1）、UL12基因（參見例如GenBank No. AFE62839.1）、UL25基因（參見例如GenBank No. AFE62852.1）、UL26基因（參見例如GenBank No. AFE62853.1）、UL28基因（參見例如GenBank No. AFE62856.1）、UL29基因（參見例如GenBank No. AFE62857.1）、UL30基因（參見例如GenBank No. AFE62858.1）、UL33基因（參見例如GenBank No. AFE62861.1）、UL36基因（參見例如GenBank No. AFE62864.1）、UL38基因（參見例如GenBank No. AFE62866.1）、UL42基因（參見例如GenBank No. AFE62870.1）、UL48基因（參見例如GenBank No. AFE62876.1）、UL52基因（參見例如GenBank No. AFE62881.1）。有關HSV病毒的必需基因的詳細描述，還可參見例如，Roizman B, Knipe DM. Herpes simplex viruses and their replication. In: Knipe D M, Howley P M, editors. Fields Virology. 2 nded. Vol 2. Philadelphia, PA: Lippincot, Williams and Wilkins, 2001: 2399-2460; Subak-Sharpe J H, Dargan D J. HSV molecular biology: general aspects of herpes simplex virus molecular biology. Virus Genes, 1998, 16(3): 239-251。
如本文中所使用的，術語“非必需基因”是指這樣的基因，其不是維持HSV病毒生存和複製所必需的。一般情況下，可對HSV病毒基因組中的此類基因進行敲除（缺失）或突變，而不影響HSV病毒的生存和複製能力。此類必需基因的具體實例包括但不限於，UL3基因（參見例如GenBank No. AFE62830.1）、UL4基因（參見例如GenBank No. AFE62831.1）、UL14基因（參見例如GenBank No. AFE62841.1）、UL16基因（參見例如GenBank No. AFE62843.1）、UL21基因（參見例如GenBank No. AFE62848.1）、UL24基因（參見例如GenBank No. AFE62851.1）、UL31基因（參見例如GenBank No. AFE62859.1），UL32基因（參見例如GenBank No. AFE62860.1）、US3基因（參見例如GenBank No. AFE62891.1）、UL51基因（參見例如GenBank No. AFE62880.1）、UL55基因（參見例如GenBank No. AFE62884.1）、UL56基因（參見例如GenBank No. AFE62885.1）、US2基因（參見例如GenBank No. AFE62890.1）、US12基因（參見例如GenBank No. AFE62901.1；即，ICP47基因），和LAT基因（參見例如GenBank No. JQ673480.1）。有關HSV病毒的非必需基因的詳細描述，還可參見例如，Roizman B, Knipe DM. Herpes simplex viruses and their replication. In: Knipe D M, Howley P M, editors. Fields Virology. 2 nded. Vol 2. Philadelphia, PA: Lippincot, Williams and Wilkins, 2001: 2399-2460; Subak-Sharpe J H, Dargan D J. HSV molecular biology: general aspects of herpes simplex virus molecular biology. Virus Genes, 1998, 16(3): 239-251。
如本文中所使用的，術語“ICP0蛋白”是指HSV病毒的infected cell protein 0，其由RL2基因編碼，並且為HSV病毒的立即早期基因產物之一。ICP0蛋白的胺基酸序列是已知的，並可參見例如公共資料庫NCBI（AFE62827.1）。
如本文中所使用的，術語“ICP34.5蛋白”是指HSV病毒的infected cell protein 34.5，其由RL1基因編碼，並且為HSV病毒的立即早期基因產物之一。ICP34.5蛋白的胺基酸序列是已知的，並可參見例如公共資料庫NCBI（AFE62826.1）。
如本文中所使用的，術語“ICP27蛋白”是指HSV病毒的infected cell protein 27，其由UL54基因編碼。ICP27蛋白的胺基酸序列是已知的，並可參見例如公共資料庫NCBI（AFE62883.1）。
如本文中所使用的，術語“ICP4蛋白”是指HSV病毒的infected cell protein 4，其由RS1基因編碼。ICP4蛋白的胺基酸序列是已知的，並可參見例如公共資料庫NCBI（AFE62888.1）。
如本文中所使用的，術語“VP5蛋白”是指HSV病毒的主要衣殼蛋白，其由UL19基因編碼。VP5蛋白的胺基酸序列是已知的，並可參見例如公共資料庫NCBI（AFE62846.1）。
如本文中所使用的，術語“ICP0基因”是指HSV病毒基因組中編碼ICP0蛋白的核苷酸序列。如本文中所使用的，術語“ICP34.5基因”是指HSV病毒基因組中編碼ICP34.5蛋白的核苷酸序列。如本文中所使用的，術語“ICP27基因”是指HSV病毒基因組中編碼ICP27蛋白的核苷酸序列。如本文中所使用的，術語“ICP4基因”是指HSV病毒基因組中編碼ICP4蛋白的核苷酸序列。如本文中所使用的，術語“VP5基因”是指HSV病毒基因組中編碼VP5蛋白的核苷酸序列。
如本文中所使用的，術語“外源核苷酸序列”是指，人工引入的核苷酸序列，其相對於原始序列而言是外來的。外源核苷酸序列包括但不限於，未在該病毒基因組中發現的任何基因。然而，在某些情況下，較佳地，外源核苷酸序列編碼具有治療用途的多肽，例如免疫調節多肽、細胞因數、趨化因數、抗體和細胞毒性肽。
如本文中所使用的，術語“免疫調節多肽”是指，能調節免疫細胞功能的多肽，其實例包括但不限於，CD40L、OX40L、可誘導共刺激分子（ICOS）、FTL3L、LIGHT、CD137L、CD70、4-1BB、GITR、和CD28（參見例如，Khalil D N, Smith E L, Brentjens R J, et al. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy [J]. Nat Rev Clin Oncol, 2016, 13 (5): 273-290）。
如本文中所使用的，術語“細胞因數”具有本領域技術人員公知的含義。然而，在本發明的方法中，當使用本發明的重組病毒來治療腫瘤時，特別佳地，該細胞因數為能夠用於腫瘤治療的細胞因數。“細胞因數”的實例包括但不限於，白介素（例如IL-2、IL-12和IL-15）、干擾素（例如IFNα、IFNβ、IFNγ）、腫瘤壞死因數（例如TNFα）、集落刺激因數（例如GM-CSF），及其任何組合（參見例如，Ardolino M, Hsu J, Raulet D H. Cytokine treatment in cancer immunotherapy [J]. Oncotarget, 2015, 6 (23): 19346-19347）。
如本文中所使用的，術語“趨化因數”具有本領域技術人員公知的含義。然而，在本發明的方法中，當使用本發明的重組病毒來治療腫瘤時，特別佳地，該細胞因數為能夠用於腫瘤治療的趨化因數。“趨化因數”的實例包括但不限於，CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20、XCL-1，及其任何組合（Homey B, Muller A, Zlotnik A. CHEMOKINES: AGENTS FOR THE IMMUNOTHERAPY OF CANCER? [J]. Nat Rev Immunol, 2002, 2: 175-184）。
如本文中所使用的，術語“細胞毒性肽”是指，對細胞具有毒性或可誘導細胞凋亡的多肽，其實例但不限於胸苷激酶TK（TK/GCV）、TRAIL和FasL（參見例如，Candolfi M, King G D, Muhammad A G, et al. Evaluation of proapototic transgenes to use in combination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach for Glioblastoma multiforme (GBM) [J]. FASEB J, 2008, 22: 1077.13）。
如本文中所使用的，術語“抗體”具有本領域技術人員公知的含義。然而，在本發明的方法中，當使用本發明的重組病毒來治療腫瘤時，特別佳地，該抗體為能夠用於腫瘤治療的抗體。“抗體”的實例包括但不限於抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA-4抗體、抗Tim-3抗體、抗Lag-3抗體、抗CD137抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體、抗CD73抗體、抗KIR抗體、抗ICOS抗體、抗CSF1R抗體、抗EGFR抗體、抗VEGFR抗體、抗HER2抗體和抗PDGFR抗體（參見例如，Khalil D N, Smith E L, Brentjens R J, et al. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy [J]. Nat Rev Clin Oncol, 2016, 13 (5):  273-290; 和Hughes P E, Caenepeel S, Wu L C. Targeted Therapy and Checkpoint Immunotherapy Combinations for the Treatment of Cancer [J]. Trends Immunol, 2016, 37 (7): 462-476）。
如本文中所使用的，術語“藥學可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的（參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995），並且包括但不限於：pH調節劑、表面活性劑、佐劑、離子強度增強劑。例如，pH調節劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液；表面活性劑包括但不限於陽離子、陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80；佐劑包括但不限於鋁佐劑（例如氫氧化鋁）、弗氏佐劑（例如完全弗氏佐劑）；離子強度增強劑包括但不限於氯化鈉。
如本文中所使用的，術語“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預防疾病有效量是指，足以預防、阻止，或延遲疾病的發生的量；治療疾病有效量是指，足以治癒或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其併發症的量。測定這樣的有效量完全在本領域技術人員的能力範圍之內。例如，對於治療用途有效的量將取決於待治療的疾病的嚴重度、患者自己的免疫系統的總體狀態、患者的一般情況例如年齡、體重和性別、藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。
為了克服現有用於腫瘤治療的重組HSV病毒的安全性及毒副反應問題，本申請的發明人構建了一種新的重組HSV病毒，其不表現功能性ICP0和ICP34.5蛋白（例如缺失了雙拷貝ICP0和ICP34.5基因）。本發明的重組HSV病毒在腫瘤細胞中具有高水準的複製能力，並且能夠有效殺傷多種腫瘤細胞，但是在正常細胞中卻具有顯著降低的複製能力和殺傷能力。此外，還已發現，本發明的重組HSV病毒在動物體內具有顯著降低的神經毒性，可以以顯著提高的劑量施用給動物。因此，與現有的重組HSV病毒相比，本發明的重組HSV病毒不僅維持了高溶瘤能力，而且具有顯著提高的安全性，能夠以更高的劑量施用，具有廣闊的應用前景。 重組HSV病毒
因此，在一方面，本發明提供了一種重組HSV病毒，其不表現功能性ICP0蛋白和ICP34.5蛋白。
如本領域技術人員所熟知的，可通過對編碼目的蛋白（例如ICP0蛋白和/或ICP34.5蛋白）的基因進行改造來阻止該目的蛋白的功能性表現。例如，可在編碼目的蛋白（例如ICP0蛋白和/或ICP34.5蛋白）的基因中引入功能喪失性突變，或者將編碼目的蛋白（例如ICP0蛋白和/或ICP34.5蛋白）的基因缺失或置換成外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列），從而阻止該目的蛋白的功能性表現。
本領域技術人員已經知曉，HSV病毒的基因組中包含2個拷貝的ICP0基因和2個拷貝的ICP34.5基因。因此，為了阻止ICP0蛋白和ICP34.5蛋白在重組HSV病毒中的功能性表現，需要對2個拷貝的ICP0基因和2個拷貝的ICP34.5基因同時進行改造。然而，易於理解的是，對該2個拷貝的ICP0基因和2個拷貝的ICP34.5基因（4個核苷酸區段）的改造是彼此獨立的，並且可以是相同的或不同的。
因此，在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒具有這樣的基因組，其中， 2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）；並且， 2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組包含下述修飾： 2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）；並且， 2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換），並且另一拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP0基因被缺失，並且另一拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP0基因被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列），並且另一拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因包含相同的功能喪失性突變。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因包含不同的功能喪失性突變。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因包含第一功能喪失性突變，而第二拷貝的ICP0基因包含第二功能喪失性突變。該第一功能喪失性突變與第二功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被置換為相同的外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被置換為不同的外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因被置換為第一外源核苷酸序列，而第二拷貝的ICP0基因被置換為第二外源核苷酸序列。該第一外源核苷酸序列與第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換），並且另一拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP34.5基因被缺失，並且另一拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP34.5基因被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列），並且另一拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因包含相同的功能喪失性突變。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因包含不同的功能喪失性突變。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP34.5基因包含第三功能喪失性突變，而第二拷貝的ICP34.5基因包含第四功能喪失性突變。該第三功能喪失性突變與第四功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因被置換為相同的外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因被置換為不同的外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP34.5基因被置換為第三外源核苷酸序列，而第二拷貝的ICP34.5基因被置換為第四外源核苷酸序列。該第三外源核苷酸序列與第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因包含第一功能喪失性突變，第二拷貝的ICP0基因包含第二功能喪失性突變；並且，第一拷貝的ICP34.5基因包含第三功能喪失性突變，第二拷貝的ICP34.5基因包含第四功能喪失性突變。該第一功能喪失性突變、第二功能喪失性突變、第三功能喪失性突變和第四功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因包含第一功能喪失性突變，第二拷貝的ICP0基因包含第二功能喪失性突變；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。該第一功能喪失性突變和第二功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因包含第一功能喪失性突變，第二拷貝的ICP0基因包含第二功能喪失性突變；並且，第一拷貝的ICP34.5基因被置換為第三外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP34.5基因被置換為第四外源核苷酸序列。該第一功能喪失性突變和第二功能喪失性突變可以相同或者不同。該第三外源核苷酸序列與第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）。例如，在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，第一拷貝的ICP34.5基因包含第三功能喪失性突變，第二拷貝的ICP34.5基因包含第四功能喪失性突變。該第三功能喪失性突變和第四功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。在此類實施方案中，該重組HSV病毒不表現ICP0蛋白和ICP34.5蛋白。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組缺失了野生型HSV-1病毒基因組的nt510至nt5439之間的鹼基序列以及nt120802至nt125731之間的鹼基序列。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。例如，在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，第一拷貝的ICP34.5基因被置換為第三外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP34.5基因被置換為第四外源核苷酸序列。該第三外源核苷酸序列與第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因被置換為第一外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP0基因被置換為第二外源核苷酸序列；並且，第一拷貝的ICP34.5基因包含第三功能喪失性突變，第二拷貝的ICP34.5基因包含第四功能喪失性突變。該第一外源核苷酸序列與第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。該第三功能喪失性突變和第四功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因被置換為第一外源核苷酸序列，而第二拷貝的ICP0基因被置換為第二外源核苷酸序列；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。該第一外源核苷酸序列與第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因被置換為第一外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP0基因被置換為第二外源核苷酸序列；並且，第一拷貝的ICP34.5基因被置換為第三外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP34.5基因被置換為第四外源核苷酸序列。該第一外源核苷酸序列、第二外源核苷酸序列、第三外源核苷酸序列和第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該第一功能喪失性突變、第二功能喪失性突變、第三功能喪失性突變和第四功能喪失性突變各自獨立地選自錯義突變、無義突變、移碼突變、鹼基缺失、鹼基置換、鹼基添加、以及其任何組合（例如，基因片段的缺失或置換或添加）。
在某些較佳的實施方案中，該第一外源核苷酸序列、第二外源核苷酸序列、第三外源核苷酸序列和第四外源核苷酸序列各自獨立地編碼選自下列的外源蛋白：螢光蛋白、免疫調節多肽、細胞因數、趨化因數、抗體和細胞毒性肽。
在某些較佳的實施方案中，該螢光蛋白選自綠色螢光蛋白（例如，具有如SEQ ID NO: 7所示胺基酸序列的綠色螢光蛋白）、紅色螢光蛋白、藍色螢光蛋白、黃色螢光蛋白，及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，該免疫調節多肽選自CD40L、OX40L、可誘導共刺激分子（ICOS）、FTL3L、LIGHT、CD137L、CD70、4-1BB、GITR、CD28，及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，該細胞因數選自白介素（例如IL-2、IL-12和IL-15）、干擾素（例如IFNα、IFNβ、IFNγ）、腫瘤壞死因數（例如TNFα）、集落刺激因數（例如GM-CSF），及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，該趨化因數選自CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20、XCL-1，及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，該細胞毒性肽選自胸苷激酶TK（TK/GCV）、TRAIL、FasL，及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，該抗體選自抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA-4抗體、抗Tim-3抗體、抗Lag-3抗體、抗CD137抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體、抗CD73抗體、抗KIR抗體、抗ICOS抗體、抗CSF1R抗體、抗EGFR抗體、抗VEGFR抗體、抗HER2抗體、抗PDGFR抗體，及其任何組合。
近五年來，針對PD-1的抗體藥物已經在臨床上取得巨大成功，相繼被FDA批准用於治療黑色素瘤、肺癌等實體瘤病人。然而臨床研究表明，抗PD-1抗體僅對30%左右的實體瘤病人有效。這可能是因為T細胞難以滲透至實體腫瘤內部，不能與抗PD-1抗體一起作用於實體腫瘤內部的腫瘤細胞。不拘於理論限制，溶瘤型HSV病毒不僅能夠直接靶向並殺死腫瘤細胞，而且還能夠誘導免疫細胞（例如T細胞）浸潤腫瘤。因此，本發明的重組HSV病毒與抗PD-1抗體的組合使用對於提高腫瘤治療的效果可能是特別有利的，在腫瘤免疫治療中有著巨大的應用前景。因此，在某些較佳的實施方案中，該外源蛋白為抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體或其任何組合。例如，該外源蛋白為抗PD-1單鏈抗體。
在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒為重組HSV-1病毒，重組HSV-2病毒，或HSV-1/HSV-2嵌合病毒（即，其基因組既含有來源於HSV-1的DNA，又含有來源於HSV-2的DNA的重組HSV病毒）。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒衍生自HSV-1病毒株KOS。
在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒能夠表現功能性UL43蛋白，功能性UL41蛋白（即，vhs蛋白），功能性UL48蛋白（即，VMW65蛋白），或其任何組合。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒能夠表現功能性UL43蛋白。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒能夠表現功能性UL41蛋白。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒能夠表現功能性UL48蛋白。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒能夠表現功能性UL43蛋白和功能性UL41蛋白。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒能夠表現功能性UL43蛋白和功能性UL48蛋白。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒能夠表現功能性UL41蛋白和功能性UL48蛋白。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒能夠表現功能性UL43蛋白，功能性UL41蛋白和功能性UL48蛋白。
在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組包含能夠表現功能性UL43蛋白的UL43基因，能夠表現功能性UL41蛋白的UL41基因(即，vhs基因)，和/或，能夠表現功能性UL48蛋白的UL48基因(即，VMW65基因)。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組包含能夠表現功能性UL43蛋白的UL43基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組包含能夠表現功能性UL41蛋白的UL41基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組包含能夠表現功能性UL48蛋白的UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組包含能夠表現功能性UL43蛋白的UL43基因，和能夠表現功能性UL41蛋白的UL41基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組包含能夠表現功能性UL43蛋白的UL43基因，和能夠表現功能性UL48蛋白的UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組包含能夠表現功能性UL41蛋白的UL41基因，和能夠表現功能性UL48蛋白的UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組包含能夠表現功能性UL43蛋白的UL43基因，能夠表現功能性UL41蛋白的UL41基因，和能夠表現功能性UL48蛋白的UL48基因。
在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組含有UL43基因，UL41基因(即，vhs基因)，和/或UL48基因(即，VMW65基因)，並且該UL43基因，UL41基因，和/或UL48基因不包含功能喪失性突變。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL43基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL41基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL43基因和UL41基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL43基因和UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL41基因和UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL43基因、UL41基因和UL48基因。
在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組還包含下述修飾：一或複數非必需基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該非必需基因選自UL3基因、UL4基因、UL14基因、UL16基因、UL21基因、UL24基因、UL31基因、UL32基因、US3基因、UL51基因、UL55基因、UL56基因、US2基因、US12基因(即，ICP47基因)、LAT基因、對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段，及其任何組合。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，UL3基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，UL4基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，UL14基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，UL16基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，UL21基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，UL24基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，UL31基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，UL32基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，US3基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，UL51基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，UL55基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，UL56基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，US2基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，US12基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，LAT基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組還包含下述修飾：UL55基因、US2基因、LAT基因和對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一或複數被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組還包含下述修飾：UL55基因、US2基因、LAT基因或對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的必需基因未被缺失，且不包含功能喪失性突變。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的必需基因的編碼序列未被缺失或突變。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒能夠表現所有必需基因。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組含有所有必需基因，並且，所有必需基因均不包含功能喪失性突變。在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組含有所有必需基因，並且，所有必需基因的編碼序列均不包含突變。必需基因是HSV病毒生存和複製所不可或缺的，因此，通常而言，在重組HSV病毒中，所有必需基因均不包含功能喪失性突變。然而，易於理解的是，可以對此類必需基因的啟動子進行改造（例如，將必需基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子），從而可進一步提高重組HSV病毒的安全性，而不影響本發明的重組HSV病毒的功能/性質。因此，在某些較佳的實施方案中，在該重組HSV病毒的基因組中，一或複數必需基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子。在某些較佳的實施方案中，該必需基因選自ICP27基因、ICP4基因、VP5基因、gL基因、gH基因、gD基因、gK基因、gB基因、gN基因、UL5基因、UL6基因、UL8基因、UL9基因、UL12基因、UL25基因、UL26基因、UL28基因、UL29基因、UL30基因、UL33基因、UL36基因、UL38基因、UL42基因、UL48基因、UL52基因，以及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，除了如上該的2個拷貝的ICP0基因和2個拷貝的ICP34.5基因之外，該重組HSV病毒的基因組含有野生型HSV病毒的所有其他基因，並且該其他基因均不包含功能喪失性突變。然而，易於理解的是，可以對該其他基因的啟動子進行改造（例如，將原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子），從而可進一步提高重組HSV病毒的安全性，而不影響本發明的重組HSV病毒的功能/性質。因此，在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組還包含下述修飾：一或複數HSV基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子。在某些較佳的實施方案中，該HSV基因選自VP5基因、ICP27基因和ICP4基因。
在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組還包含有選自下述的一項或多項修飾： (1) VP5基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子； (2) ICP27基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子； (3) ICP4基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，如hTERT的啟動子；和 (4) UL55基因、US2基因、LAT基因和對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一或複數被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該hTERT啟動子具有如SEQ ID NO: 5所示的序列。
此外，還可修飾本發明的重組HSV病毒，以攜帶一或複數外源核苷酸序列。例如，在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒的基因組還包含第五外源核苷酸序列。在某些較佳的實施方案中，該第五外源核苷酸序列編碼選自下列的外源蛋白：螢光蛋白、免疫調節多肽、細胞因數、趨化因數、抗體和細胞毒性肽。
在本申請中，可以通過本領域內眾所周知的技術，在所提到的各種病毒基因中引入功能喪失性突變。例如，可以通過鹼基的缺失、置換或插入，在病毒基因中引入功能喪失性突變，使病毒基因在功能上失活。在某些示例性實施方案中，通過缺失（例如缺失整個基因或其部分），使病毒基因在功能上失活。在此類實施方案中，可缺失目的病毒基因序列的至少25%、至少50%、至少75%，或100%，或者可缺失至少10 bp、至少100 bp，或至少1000 bp的目的病毒基因序列。在某些示例性實施方案中，通過鹼基的插入或缺失造成移碼突變，從而使病毒基因在功能上失活。在某些示例性實施方案中，通過將整個目的基因或其部分置換為外源核苷酸序列，使病毒基因在功能上失活。 病毒載體
在另一方面，本發明提供了一種病毒載體，其包含根據本發明的重組HSV病毒的基因組或者由根據本發明的重組HSV病毒的基因組組成。
在另一方面，本發明提供了一種病毒載體，其包含或者由不表現功能性功能性ICP0蛋白和ICP34.5蛋白的經突變的HSV基因組組成。
在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，
2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）；並且， 2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組包含下述修飾： 2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）；並且， 2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換），並且另一拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP0基因被缺失，並且另一拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP0基因被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列），並且另一拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因包含相同的功能喪失性突變。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因包含不同的功能喪失性突變。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因包含第一功能喪失性突變，而第二拷貝的ICP0基因包含第二功能喪失性突變。該第一功能喪失性突變與第二功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被置換為相同的外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被置換為不同的外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因被置換為第一外源核苷酸序列，而第二拷貝的ICP0基因被置換為第二外源核苷酸序列。該第一外源核苷酸序列與第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換），並且另一拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP34.5基因被缺失，並且另一拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，一拷貝的ICP34.5基因被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列），並且另一拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變（例如，一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因包含相同的功能喪失性突變。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因包含不同的功能喪失性突變。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP34.5基因包含第三功能喪失性突變，而第二拷貝的ICP34.5基因包含第四功能喪失性突變。該第三功能喪失性突變與第四功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因被置換為相同的外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP34.5基因被置換為不同的外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP34.5基因被置換為第三外源核苷酸序列，而第二拷貝的ICP34.5基因被置換為第四外源核苷酸序列。該第三外源核苷酸序列與第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因包含第一功能喪失性突變，第二拷貝的ICP0基因包含第二功能喪失性突變；並且，第一拷貝的ICP34.5基因包含第三功能喪失性突變，第二拷貝的ICP34.5基因包含第四功能喪失性突變。該第一功能喪失性突變、第二功能喪失性突變、第三功能喪失性突變和第四功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因包含第一功能喪失性突變，第二拷貝的ICP0基因包含第二功能喪失性突變；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。該第一功能喪失性突變和第二功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因包含第一功能喪失性突變，第二拷貝的ICP0基因包含第二功能喪失性突變；並且，第一拷貝的ICP34.5基因被置換為第三外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP34.5基因被置換為第四外源核苷酸序列。該第一功能喪失性突變和第二功能喪失性突變可以相同或者不同。該第三外源核苷酸序列與第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）。例如，在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，第一拷貝的ICP34.5基因包含第三功能喪失性突變，第二拷貝的ICP34.5基因包含第四功能喪失性突變。該第三功能喪失性突變和第四功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。在此類實施方案中，該病毒載體不包含編碼ICP0蛋白的基因和編碼ICP34.5蛋白的基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組缺失了野生型HSV-1病毒基因組的nt510至nt5439之間的鹼基序列以及nt120802至nt125731之間的鹼基序列。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。例如，在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，第一拷貝的ICP34.5基因被置換為第三外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP34.5基因被置換為第四外源核苷酸序列。該第三外源核苷酸序列與第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變（例如一或複數鹼基的添加、缺失和/或置換）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因被置換為第一外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP0基因被置換為第二外源核苷酸序列；並且，第一拷貝的ICP34.5基因包含第三功能喪失性突變，第二拷貝的ICP34.5基因包含第四功能喪失性突變。該第一外源核苷酸序列與第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。該第三功能喪失性突變和第四功能喪失性突變可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因被置換為第一外源核苷酸序列，而第二拷貝的ICP0基因被置換為第二外源核苷酸序列；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失。該第一外源核苷酸序列與第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該2個拷貝的ICP0基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列），並且，該2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地被置換為外源核苷酸序列（例如，編碼外源蛋白的核苷酸序列）。例如，在某些較佳的實施方案中，第一拷貝的ICP0基因被置換為第一外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP0基因被置換為第二外源核苷酸序列；並且，第一拷貝的ICP34.5基因被置換為第三外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP34.5基因被置換為第四外源核苷酸序列。該第一外源核苷酸序列、第二外源核苷酸序列、第三外源核苷酸序列和第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
在某些較佳的實施方案中，該第一功能喪失性突變、第二功能喪失性突變、第三功能喪失性突變和第四功能喪失性突變各自獨立地選自錯義突變、無義突變、移碼突變、鹼基缺失、鹼基置換、鹼基添加、以及其任何組合（例如，基因片段的缺失或置換或添加）。
在某些較佳的實施方案中，該第一外源核苷酸序列、第二外源核苷酸序列、第三外源核苷酸序列和第四外源核苷酸序列各自獨立地編碼選自下列的外源蛋白：螢光蛋白、免疫調節多肽、細胞因數、趨化因數、抗體和細胞毒性肽。
在某些較佳的實施方案中，該螢光蛋白選自綠色螢光蛋白（例如，具有如SEQ ID NO: 7所示胺基酸序列的綠色螢光蛋白）、紅色螢光蛋白、藍色螢光蛋白、黃色螢光蛋白，及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，該免疫調節多肽選自CD40L、OX40L、可誘導共刺激分子（ICOS）、FTL3L、LIGHT、CD137L、CD70、4-1BB、GITR、CD28，及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，該細胞因數選自白介素（例如IL-2、IL-12和IL-15）、干擾素（例如IFNα、IFNβ、IFNγ）、腫瘤壞死因數（例如TNFα）、集落刺激因數（例如GM-CSF），及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，該趨化因數選自CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20、XCL-1，及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，該細胞毒性肽選自胸苷激酶TK（TK/GCV）、TRAIL、FasL，及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，該抗體選自抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA-4抗體、抗Tim-3抗體、抗Lag-3抗體、抗CD137抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體、抗CD73抗體、抗KIR抗體、抗ICOS抗體、抗CSF1R抗體、抗EGFR抗體、抗VEGFR抗體、抗HER2抗體、抗PDGFR抗體，及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，該外源蛋白為抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體或其任何組合。例如，該外源蛋白為抗PD-1單鏈抗體。
在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組衍生自HSV-1病毒，HSV-2病毒，或HSV-1/HSV-2嵌合病毒（即，其基因組既含有來源於HSV-1的DNA，又含有來源於HSV-2的DNA的重組HSV病毒）的基因組。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組衍生自HSV-1病毒株KOS的基因組。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組衍生自GenBank: JQ673480.1所示的基因組。
在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組能夠表現功能性UL43蛋白，功能性UL41蛋白（即，vhs蛋白），功能性UL48蛋白（即，VMW65蛋白），或其任何組合。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組能夠表現功能性UL43蛋白。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組能夠表現功能性UL41蛋白。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組能夠表現功能性UL48蛋白。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組能夠表現功能性UL43蛋白和功能性UL41蛋白。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組能夠表現功能性UL43蛋白和功能性UL48蛋白。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組能夠表現功能性UL41蛋白和功能性UL48蛋白。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組能夠表現功能性UL43蛋白，功能性UL41蛋白和功能性UL48蛋白。
在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組包含能夠表現功能性UL43蛋白的UL43基因，能夠表現功能性UL41蛋白的UL41基因(即，vhs基因)，和/或，能夠表現功能性UL48蛋白的UL48基因(即，VMW65基因)。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組包含能夠表現功能性UL43蛋白的UL43基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組包含能夠表現功能性UL41蛋白的UL41基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組包含能夠表現功能性UL48蛋白的UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組包含能夠表現功能性UL43蛋白的UL43基因，和能夠表現功能性UL41蛋白的UL41基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組包含能夠表現功能性UL43蛋白的UL43基因，和能夠表現功能性UL48蛋白的UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組包含能夠表現功能性UL41蛋白的UL41基因，和能夠表現功能性UL48蛋白的UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組包含能夠表現功能性UL43蛋白的UL43基因，能夠表現功能性UL41蛋白的UL41基因，和能夠表現功能性UL48蛋白的UL48基因。
在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組含有UL43基因、UL41基因(即，vhs基因)，和/或UL48基因(即，VMW65基因)，並且該UL43基因、UL41基因，和/或UL48基因不包含功能喪失性突變。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL43基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL41基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL43基因和UL41基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL43基因和UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL41基因和UL48基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組含有，不包含功能喪失性突變的UL43基因、UL41基因和UL48基因。
在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組還包含下述修飾：一或複數非必需基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該非必需基因選自UL3基因、UL4基因、UL14基因、UL16基因、UL21基因、UL24基因、UL31基因、UL32基因、US3基因、UL51基因、UL55基因、UL56基因、US2基因、US12基因(即，ICP47基因)、LAT基因、對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段，及其任何組合。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，UL3基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，UL4基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，UL14基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，UL16基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，UL21基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，UL24基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，UL31基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，UL32基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，US3基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，UL51基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，UL55基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，UL56基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，US2基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，US12基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，LAT基因被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組還包含下述修飾：UL55基因、US2基因、LAT基因和對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一或複數被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組還包含下述修飾：UL55基因、US2基因、LAT基因或對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組中的必需基因未被缺失，且不包含功能喪失性突變。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組中的必需基因的編碼序列未被缺失或突變。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組能夠表現所有必需基因。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組含有所有必需基因，並且，所有必需基因均不包含功能喪失性突變。在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組含有所有必需基因，並且，所有必需基因的編碼序列均不包含突變。必需基因是HSV病毒生存和複製所不可或缺的，因此，通常而言，在重組HSV病毒的基因組中，所有必需基因均不包含功能喪失性突變。然而，易於理解的是，可以對此類必需基因的啟動子進行改造（例如，將必需基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子），從而可進一步提高重組HSV病毒的安全性，而不影響本發明的重組HSV病毒的功能/性質。因此，在某些較佳的實施方案中，在該經突變的HSV基因組中，一或複數必需基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子。在某些較佳的實施方案中，該必需基因選自ICP27基因和、ICP4基因、VP5基因、gL基因、gH基因、gD基因、gK基因、gB基因、gN基因、UL5基因、UL6基因、UL8基因、UL9基因、UL12基因、UL25基因、UL26基因、UL28基因、UL29基因、UL30基因、UL33基因、UL36基因、UL38基因、UL42基因、UL48基因、UL52基因，以及其任何組合。
在某些較佳的實施方案中，除了如上該的2個拷貝的ICP0基因和2個拷貝的ICP34.5基因之外，該經突變的HSV基因組含有野生型HSV病毒的所有其他基因，並且該其他基因均不包含功能喪失性突變。然而，易於理解的是，可以對該其他基因的啟動子進行改造（例如，將原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子），從而可進一步提高重組HSV病毒的安全性，而不影響本發明的重組HSV病毒的功能/性質。因此，在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組還包含下述修飾：一或複數HSV基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子。在某些較佳的實施方案中，該HSV基因選自VP5基因、ICP27基因和ICP4基因。
在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組還包含有選自下述的一項或多項修飾： (1) VP5基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子； (2) ICP27基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，例如hTERT的啟動子； (3) ICP4基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子，如hTERT的啟動子；和 (4) UL55基因、US2基因、LAT基因和對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一或複數被缺失或突變（例如包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列）。
在某些較佳的實施方案中，該hTERT啟動子具有如SEQ ID NO: 5所示的序列。
此外，還可修飾該經突變的HSV基因組，以攜帶一或複數外源核苷酸序列。例如，在某些較佳的實施方案中，該經突變的HSV基因組還包含第五外源核苷酸序列。在某些較佳的實施方案中，該第五外源核苷酸序列編碼選自下列的外源蛋白：螢光蛋白、免疫調節多肽、細胞因數、趨化因數、抗體和細胞毒性肽。 宿主細胞
在另一方面，本發明提供了一種宿主細胞，其感染了根據本發明的重組HSV病毒，或者包含有根據本發明的重組HSV病毒的基因組，或者轉染了根據本發明的病毒載體。此類宿主細胞包括但不限於，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞和動物細胞（如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等）。本發明的重組HSV病毒在腫瘤細胞中具有高複製能力，但在正常細胞中僅以低水準複製。因此，在某些特別佳的實施方案中，該細胞為腫瘤細胞。此類腫瘤細胞包括但不限於，肺癌細胞（例如H1299，H520，H1975，NCI-H358和A549）；肝癌細胞（例如Huh7，Hep3B，HepG2，GSG7701，SMMC7721，Hepa1-6，BEL7404，PLC/PRF和QGY7703）；乳腺癌細胞（例如MADMB231，MCF7和MADMB468）；骨肉瘤細胞（例如U2OS和SAOS2）；卵巢癌細胞（例如SKOV3和CAOV3）；子宮頸癌細胞（例如SiHA和Hela）；前列腺癌細胞（例如PC-3）；神經膠質瘤細胞（例如U87MG）；黑色素瘤細胞（例如A375）；結直腸癌細胞（例如HCT116）和胰腺癌細胞（例如Panc-1）。 製備方法
在另一方面，本發明涉及一種獲得本發明的重組HSV病毒的方法，其包括： （1）培養根據本發明的宿主細胞； （2）待該宿主細胞發生病變後，收集和裂解該宿主細胞，以獲得該宿主細胞的裂解液；和 （3）從該裂解液中回收本發明的重組HSV病毒。 藥物組合物
在另一方面，本發明涉及一種藥物組合物，其包含根據本發明的重組HSV病毒，或者根據本發明的重組HSV病毒的基因組，或者根據本發明的病毒載體，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。本發明的藥物組合物可以用於治療腫瘤，例如，肺癌、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、結直腸癌，和胰腺癌。
本發明的藥物組合物可通過本領域公知的方法進行施用，例如但不限於通過注射進行施用。在某些較佳的實施方案中，本發明的藥物組合物通過注射（例如瘤內注射）來進行施用。在某些較佳的實施方案中，本發明的藥物組合物為注射液或凍乾粉劑。
在某些較佳的實施方案中，該重組HSV病毒或重組HSV病毒的基因組或病毒載體以治療有效量（例如治療腫瘤有效量）存在。在某些較佳的實施方案中，本發明的藥物組合物以單位劑量形式存在。例如但不意欲限定本發明，每單位劑量的藥物組合物中包含的重組HSV病毒的量可以為10 2-10 9pfu，例如10 2-10 3pfu，10 3-10 4pfu，10 4-10 5pfu，10 5-10 6pfu，10 6-10 7pfu，10 7-10 8pfu，或10 8-10 9pfu。 用途/使用方法
本發明的重組HSV病毒可以用於治療各種腫瘤。因此，在另一方面，本發明涉及一種治療腫瘤的方法，其包括，給有此需要的受試者施用治療有效量的本發明的重組HSV病毒或本發明的病毒載體或本發明的藥物組合物。在某些較佳的實施方案中，該腫瘤包括但不限於，肺癌、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、結直腸癌，和胰腺癌。在某些較佳的實施方案中，該受試者是哺乳動物，例如人。在某些較佳的實施方案中，通過注射（例如瘤內注射），將本發明的重組HSV病毒或本發明的病毒載體或本發明的藥物組合物施用給該受試者。
在另一方面，本發明涉及本發明的重組HSV病毒或本發明的病毒載體用於製備藥物組合物的用途，該藥物組合物用於治療受試者的腫瘤。在某些較佳的實施方案中，該腫瘤包括但不限於，肺癌、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、結直腸癌，和胰腺癌。在某些較佳的實施方案中，該受試者是哺乳動物，例如人。在某些較佳的實施方案中，該藥物組合物通過注射（例如瘤內注射）來進行施用。在某些較佳的實施方案中，該藥物組合物為注射液或凍乾粉劑。 發明的有益效果
與現有技術中的重組單純皰疹病毒相比，本發明的重組HSV病毒具有下述有益技術效果：本發明的重組HSV病毒在腫瘤細胞中具有高水準的複製能力，並且能夠有效殺傷多種腫瘤細胞，但是在正常細胞中卻具有顯著降低的複製能力和殺傷能力。此外，還已顯示，本發明的重組HSV病毒在動物體內具有顯著降低的神經毒性，可以以顯著提高的劑量施用給動物。因此，與現有的重組HSV病毒相比，本發明的重組HSV病毒不僅維持了高溶瘤能力，而且具有顯著提高的安全性，能夠以更高的劑量施用，具有廣闊的應用前景。 關於序列資訊的說明
本發明涉及的序列的資訊提供於表1中。 表1：序列資訊
SEQ ID NO: 描述 SEQ ID NO: 描述
1 GenBank: JQ673480.1的nt33至nt5876 2 LacZ的基因序列
3 GenBank: JQ673480.1的nt112861至nt113422 4 GenBank: JQ673480.1的nt113590至nt115194
5 hTERT的核心啟動子序列 6 GenBank: JQ673480.1的nt510 (125731)至nt5439 (120802)
7 GFP的胺基酸序列 8 PD-1 scFv的胺基酸序列
9-16 引物序列 17 GenBank: JQ673480.1的nt91088-nt92557
18 GenBank: JQ673480.1的nt94721-nt95968 19 GenBank: JQ673480.1的nt103527-nt104999
20 GenBank: JQ673480.1的nt115418-nt115978 21 GenBank: JQ673480.1的nt133911-nt134786
22 GenBank: JQ673480.1的nt4781-nt7062 23 GenBank: JQ673480.1的nt5853-nt7485
SEQ ID NO: 1 GCAAAAAAGGCGGGCGGCGGTCCGGGCGGCGTGCGCGCGCGCGGCGGGCGTGGGGGGCGGGGCCGCGGGAGCGGGGGAGGAGCGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGAGGAGCGGCCAGACCCCGGAAACGGGCCCCCCCCAAAACACACCCCCCGGGGGTCGCGCGCGGCCCTTTAAAGGCGGGCGGCGGGCAGCCCGGGCCCCCCGCGGCCGAGACTAGCGAGTTAGACAGGCAAGCACTACTCGCCTCTGCACGCACATGCTTGCCTGTCAAACTCTACCACCCCGGCACGCTCTCTGTCTCCATGGCCCGCCGCCGCCATCGCGGCCCCCGCCGCCCCCGGCCGCCCGGGCCCACGGGCGCGGTCCCAACCGCACAGTCCCAGGTAACCTCCACGCCCAACTCGGAACCCGTGGTCAGGAGCGCGCCCGCGGCCGCCCCGCCGCCGCCCCCCGCCAGTGGGCCCCCGCCTTCTTGTTCGCTGCTGCTGCGCCAGTGGCTCCACGTTCCCGAGTCCGCGTCCGACGACGACGACGACGACTGGCCGGACAGCCCCCCGCCCGAGCCGGCGCCAGAGGCCCGGCCCACCGCCGCCGCCCCCCGCCCCCGGTCCCCACCGCCCGGCGCGGGCCCGGGGGGCGGGGCTAACCCCTCCCACCCCCCCTCACGCCCCTTCCGCCTTCCGCCGCGCCTCGCCCTCCGCCTGCGCGTCACCGCAGAGCACCTGGCGCGCCTGCGCCTGCGACGCGCGGGCGGGGAGGGGGCGCCGAAGCCCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCACGCGGGTGCGCTTCTCGCCCCACGTCCGGGTGCGCCACCTGGTGGTCTGGGCCTCGGCCGCCCGCCTGGCGCGCCGCGGCTCGTGGGCCCGCGAGCGGGCCGACCGGGCTCGGTTCCGGCGCCGGGTGGCGGAGGCCGAGGCGGTCATCGGGCCGTGCCTGGGGCCCGAGGCCCGTGCCCGGGCCCTGGCCCGCGGAGCCGGCCCGGCGAACTCGGTCTAACGTTACACCCGAGGCGGCCTGGGTCTTCCGCGGAGCTCCCGGGAGCTCCGCACCAAGCCGCTCTCCGGAGAGACGATGGCAGGAGCCGCGCATATATACGCTTGGAGCCGGCCCGCCCCCGAGGCGGGCCCGCCCTCGGAGGGCGGGACTGGCCAATCGGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCAGCGTCCGCCGAGTCGTCGGGGCCCGGCCCACTGGGCGGTAACTCCCGCCCAGTGGGCCGGGCCGCCCACTTCCCGGTATGGTAATTAAAAACTTGCAGAGGCCTTGTTCCGCTTCCCGGTATGGTAATTAGAAACTCATTAATGGGCGGCCCCGGCCGCCCTTCCCGCTTCCGGCAATTCCCGCGGCCCTTAATGGGCAACCCCGGTATTCCCCGCCTCCCGCGCCGCGCGTAACCACTCCCCTGGGGTTCCGGGTTATGTTAATTGCTTTTTTGGCGGAACACACGGCCCCTCGCGCATTGGCCCGCGGGTCGCTCAATGAACCCGCATTGGTCCCCTGGGGTTCCGGGTATGGTAATGAGTTTCTTCGGGAAGGCGGGAAGCCCCGGGGCACCGACGCAGGCCAAGCCCCTGTTGCGTCGGCGGGAGGGGCATGCTAATGGGGTTCTTTGGGGGACACCGGGTTGGTCCCCCAAATCGGGGGCCGGGCCGTGCATGCTAATGATATTCTTTGGGGGCGCCGGGTTGGTCCCCGGGGACGGGGCCGCCCCGCGGTGGGCCTGCCTCCCCTGGGACGCGCGGCCATTGGGGGAATCGTCACTGCCGCCCCTTTGGGGAGGGGAAAGGCGTGGGGTATAAGTTAGCCCTGGCCCGACGGTCTGGTCGCATTTGCACCTCGGCACTCGGAGCGAGACGCAGCAGCCAGGCAGACTCGGGCCGCCCCCTCTCCGCATCACCACAGAAGCCCCGCCTACGTTGCGACCCCCAGGGACCCTCCGTCAGCGACCCTCCAGCCGCATACGACCCCCATGGAGCCCCGCCCCGGAGCGAGTACCCGCCGGCCTGAGGGCCGCCCCCAGCGCGAGGTGAGGGGCCGGGCGCCATGTCTGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGACCCCCGACCCTTACACTGGAACCGGCCGCCATGTTGGGGGACCCCCACTCATACACGGGAGCCGGGCGCCATGTTGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGTGGAACCCCGTGACACTATATATACAGGGACCGGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGCGGAACCCCCTGACCCTATATATACAGGGACCGGGGTCGCCCTGTTAGGGGTCGCCATGTGACCCCCTGACTTTATATATACAGACCCCCAACACCTACACATGGCCCCTTTGACTCAGACGCAGGGCCCGGGGTCGCCGTGGGACCCCCCTGACTCATACACAGAGACACGCCCCCACAACAAACACACAGGGACCGGGGTCGCCGTGTTAGGGGGCGTGGTCCCCACTGACTCATACGCAGGGCCCCCTTACTCACACGCATCTAGGGGGGTGGGGAGGAGCCGCCCGCCATATTTGGGGGACGCCGTGGGACCCCCGACTCCGGTGCGTCTGGAGGGCGGGAGAAGAGGGAAGAAGAGGGGTCGGGATCCAAAGGACGGACCCAGACCACCTTTGGTTGCAGACCCCTTTCTCCCCCCTCTTCCGAGGCCAGCAGGGGGGCAGGACTTTGTGAGGCGGGGGGGGAGGGGGAACTCGTGGGCGCTGATTGACGCGGGAAATCCCCCCATTCTTACCCGCCCCCCCTTTTTTCCCCTCAGCCCGCCCCGGATGTCTGGGTGTTTCCCTGCGACCGAGACCTGCCGGACAGCAGCGACTCGGAGGCGGAGACCGAAGTGGGGGGGCGGGGGGACGCCGACCACCATGACGACGACTCCGCCTCCGAGGCGGACAGCACGGACACGGAACTGTTCGAGACGGGGCTGCTGGGGCCGCAGGGCGTGGATGGGGGGGCGGTCTCGGGGGGGAGCCCCCCCCGCGAGGAAGACCCCGGCAGTTGCGGGGGCGCCCCCCCTCGAGAGGACGGGGGGAGCGACGAGGGCGACGTGTGCGCCGTGTGCACGGATGAGATCGCGCCCCACCTGCGCTGCGACACCTTCCCGTGCATGCACCGCTTCTGCATCCCGTGCATGAAAACCTGGATGCAATTGCGCAACACCTGCCCGCTGTGCAACGCCAAGCTGGTGTACCTGATAGTGGGCGTGACGCCCAGCGGGTCGTTCAGCACCATCCCGATCGTGAACGACCCCCAGACCCGCATGGAGGCCGAGGAGGCCGTCAGGGCGGGCACGGCCGTGGACTTTATCTGGACGGGCAATCAGCGGTTCGCCCCGCGGTACCTGACCCTGGGGGGGCACACGGTGAGGGCCCTGTCGCCCACCCACCCTGAGCCCACCACGGACGAGGATGACGACGACCTGGACGACGGTGAGGCGGGGGGGCGGCGAGGACCCTGGGGGAGGAGGAGGAGGGGGGGGGGAGGGAGGAATAGGCGGGCGGGCGGGCGAGGAAAGGGCGGGCCGGGGAGGGGGCGTAACCTGATCGCGCCCCCCGTTGTCTCTTGCAGCAGACTACGTACCGCCCGCCCCCCGCCGGACGCCCCGCGCCCCCCCACGCAGAGGCGCCGCCGCGCCCCCCGTGACGGGCGGGGCGTCTCACGCAGCCCCCCAGCCGGCCGCGGCTCGGACAGCGCCCCCCTCGGCGCCCATCGGGCCACACGGCAGCAGTAACACTAACACCACCACCAACAGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCCGCCAGTCGCGAGCCGCGGTGCCGCGGGGGGCGTCTGGCCCCTCCGGGGGGGTTGGGGTTGTTGAAGCGGAGGCGGGGCGGCCGAGGGGCCGGACGGGCCCCCTTGTCAACAGACCCGCCCCCCTTGCAAACAACAGAGACCCCATAGTGATCAGCGACTCCCCCCCGGCCTCTCCCCACAGGCCCCCCGCGGCGCCCATGCCAGGCTCCGCCCCCCGCCCCGGTCCCCCCGCGTCCGCGGCCGCGTCGGGCCCCGCGCGCCCCCGCGCGGCCGTGGCCCCGTGTGTGCGGGCGCCGCCTCCGGGGCCCGGCCCCCGCGCCCCGGCCCCCGGGGCGGAGCCGGCCGCCCGCCCCGCGGACGCGCGCCGTGTGCCCCAGTCGCACTCGTCCCTGGCTCAGGCCGCGAACCAAGAACAGAGTCTGTGCCGGGCGCGTGCGACGGTGGCGCGCGGCTCGGGGGGGCCGGGCGTGGAGGGTGGACACGGGCCCTCCCGCGGCGCCGCCCCCTCCGGCGCCGCCCCCTCCGGCGCCCCCCCGCTCCCCTCCGCCGCCTCTGTCGAGCAGGAGGCGGCGGTGCGTCCGAGGAAGAGGCGCGGGTCGGGCCAGGAAAACCCCTCCCCCCAGTCCACGCGTCCCCCCCTCGCGCCGGCAGGGGCCAAGAGGGCGGCGACGCACCCCCCCTCCGACTCAGGGCCGGGGGGGCGCGGCCAGGGAGGGCCCGGGACCCCCCTGACGTCCTCGGCGGCCTCCGCCTCTTCCTCCTCCGCCTCTTCCTCCTCGGCCCCGACTCCCGCGGGGGCCACCTCTTCCGCCACCGGGGCCGCGTCCTCCTCCGCTTCCGCCTCCTCGGGCGGGGCCGTCGGTGCCCTGGGAGGGAGACAAGAGGAAACCTCCCTCGGCCCCCGCGCTGCTTCTGGGCCGCGGGGGCCGAGGAAGTGTGCCCGGAAGACGCGCCACGCGGAGACTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCGGCCTCACGCGCTACCTGCCCATCTCGGGGGTCTCTAGCGTGGTCGCCCTGTCGCCTTACGTGAACAAGACGATCACGGGGGACTGCCTGCCCATCCTGGACATGGAGACGGGGAACATCGGGGCGTACGTGGTCCTGGTGGACCAGACGGGAAACATGGCGACCCGGCTGCGGGCCGCGGTCCCCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCTCCCCGAGACCGCGGGTAACCACGTGACGCCCCCCGAGTACCCGACGGCCCCCGCGTCGGAGTGGAACAGCCTCTGGATGACCCCCGTGGGGAACATGCTGTTCGACCAGGGCACCCTAGTGGGCGCCCTGGACTTCCGCAGCCTGCGGTCTCGGCACCCGTGGTCCGGGGAGCAGGGGGCGTCGACCCGGGACGAGGGAAAACAATAAGGGACGCCCCCGTGTTTGTGGGGAGGGGGGGGTCGGGCGCTGGGTGGTCTCTGGCCGCGCCCACTACACCAGCCAATCCGTGTCGGGGAGGTGGAAAGTGAAAGACACGGGCACCACACACCAGCGGGTCTTTTGTGTTGGCCCTAATAAAAAAAACTCAGGGGATTTTTGCTGTCTGTTGGGAAATAAAGGTTTACTTTTGTATCTTTTCCCTGTCTGTGTTGGATGTATCGCGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCCATGTTGGGCAGGCTCTGGTGTT
SEQ ID NO: 2 GTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAA
SEQ ID NO：3 CCACCTGGTGTTTTGTCTCCACCATCGGCCTGACAGAGCTGTATTGTATTCTGCGGCGGGGCCCGGCCCCCAAGAACGCAGACAAGGCCGCCGCCCCGGGGCGATCCAAGGGGCTGTCGGGCGTCTGCGGGCGCTGTTGTTCCATCATCCTGTCGGGCATCGCAATGCGATTGTGTTATATCGCCGTGGTGGCCGGGGTGGTGCTCGTGGCGCTTCACTACGAGCAGGAGATCCAGAGGCGCCTGTTTGATGTATGACGTCACATCCAGGCCGGCGGAAACCGGAACGGCATATGCAAACTGGAAACTGTCCTGTCTTGGGGCCCACCCACCCGACGCGTCATATGTAAATGAAAATCGTTCCCCCGAGGCCATGTGTAGCCTGGATCCCAACGACCCCGCCCATGGGTCCCAATTGGCCGTCCCGTTACCAAGACCAACCCAGCCAGCGTATCCACCCCCGCCCGGGTCCCCGCGGAAGCGGAACGGTGTATGTGATATGCTAATTAAATACATGCCACGTACTTATGGTGTCTGATTGGTCCTTGTCTGTGCCGGAGGTG
SEQ ID NO：4 ACCGGTGCGCCACCACCAGAGGCCATATCCGACACCCCAGCCCCGACGGCAGCCGACAGCCCGGTCATGGCGACTGACATTGATATGCTAATTGACCTCGGCCTGGACCTCTCCGACAGCGATCTGGACGAGGACCCCCCCGAGCCGGCGGAGAGCCGCCGCGACGACCTGGAATCGGACAGCAACGGGGAGTGTTCCTCGTCGGACGAGGACATGGAAGACCCCCACGGAGAGGACGGACCGGAGCCGATACTCGACGCCGCTCGCCCGGCGGTCCGCCCGTCTCGTCCAGAAGACCCCGGCGTACCCAGCACCCAGACGCCTCGTCCGACGGAGCGGCAGGGCCCCAACGATCCTCAACCAGCGCCCCACAGTGTGTGGTCGCGCCTCGGGGCCCGGCGACCGTCTTGCTCCCCCGAGCGGCACGGGGGCAAGGTGGCCCGCCTCCAACCCCCACCGACCAAAGCCCAGCCTGCCCGCGGCGGACGCCGTGGGCGTCGCAGGGGTCGGGGTCGCGGTGGTCCCGGGGCCGCCGATGGTTTGTCGGACCCCCGCCGGCGTGCCCCCAGAACCAATCGCAACCCGGGGGGACCCCGCCCCGGGGCGGGGTGGACGGACGGCCCCGGCGCCCCCCATGGCGAGGCGTGGCGCGGAAGTGAGCAGCCCGACCCACCCGGAGGCCCGCGGACACGGAGCGTGCGCCAAGCACCCCCCCCGCTAATGACGCTGGCGATTGCCCCCCCGCCCGCGGACCCCCGCGCCCCGGCCCCGGAGCGAAAGGCGCCCGCCGCCGACACCATCGACGCCACCACGCGGTTGGTCCTGCGCTCCATCTCCGAGCGCGCGGCGGTCGACCGCATCAGCGAGAGCTTCGGCCGCAGCGCACAGGTCATGCACGACCCCTTTGGGGGGCAGCCGTTTCCCGCCGCGAATAGCCCCTGGGCCCCGGTGCTGGCGGGCCAAGGAGGGCCCTTTGACGCCGAGACCAGACGGGTCTCCTGGGAAACCTTGGTCGCCCACGGCCCGAGCCTCTATCGCACTTTTGCCGGCAATCCTCGGGCCGCATCGACCGCCAAGGCCATGCGCGACTGCGTGCTGCGCCAAGAAAATTTCATCGAGGCGCTGGCCTCCGCCGACGAGACGCTGGCGTGGTGCAAGATGTGCATCCACCACAACCTGCCGCTGCGCCCCCAGGACCCCATTATCGGGACGGCCGCGGCGGTGCTGGATAACCTCGCCACGCGCCTGCGGCCCTTTCTCCAGTGCTACCTGAAGGCGCGAGGCCTGTGCGGCCTGGACGAACTGTGTTCGCGGCGGCGTCTGGCGGACATTAAGGACATTGCATCCTTCGTGTTTGTCATTCTGGCCAGGCTCGCCAACCGCGTCGAGCGTGGCGTCGCGGAGATCGACTACGCGACCCTTGGTGTCGGGGTCGGAGAGAAGATGCATTTCTACCTCCCCGGGGCCTGCATGGCGGGCCTGATCGAAATCCTAGACACGCACCGCCAGGAGTGTTCGAGTCGTGTCTGCGAGTTGACGGCCAGTCACATCGTCGCCCCCCCGTACGTGCACGGCAAATATTTTTATTGCAACTCCCTGTTTTAG
SEQ ID NO：5 CTGCGCTGTCGGGGCCAGGCCGGGCTCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGACGCCCAGGACCGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGC
SEQ ID NO: 6 CATGGCCCGCCGCCGCCATCGCGGCCCCCGCCGCCCCCGGCCGCCCGGGCCCACGGGCGCGGTCCCAACCGCACAGTCCCAGGTAACCTCCACGCCCAACTCGGAACCCGTGGTCAGGAGCGCGCCCGCGGCCGCCCCGCCGCCGCCCCCCGCCAGTGGGCCCCCGCCTTCTTGTTCGCTGCTGCTGCGCCAGTGGCTCCACGTTCCCGAGTCCGCGTCCGACGACGACGACGACGACTGGCCGGACAGCCCCCCGCCCGAGCCGGCGCCAGAGGCCCGGCCCACCGCCGCCGCCCCCCGCCCCCGGTCCCCACCGCCCGGCGCGGGCCCGGGGGGCGGGGCTAACCCCTCCCACCCCCCCTCACGCCCCTTCCGCCTTCCGCCGCGCCTCGCCCTCCGCCTGCGCGTCACCGCAGAGCACCTGGCGCGCCTGCGCCTGCGACGCGCGGGCGGGGAGGGGGCGCCGAAGCCCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCACGCGGGTGCGCTTCTCGCCCCACGTCCGGGTGCGCCACCTGGTGGTCTGGGCCTCGGCCGCCCGCCTGGCGCGCCGCGGCTCGTGGGCCCGCGAGCGGGCCGACCGGGCTCGGTTCCGGCGCCGGGTGGCGGAGGCCGAGGCGGTCATCGGGCCGTGCCTGGGGCCCGAGGCCCGTGCCCGGGCCCTGGCCCGCGGAGCCGGCCCGGCGAACTCGGTCTAACGTTACACCCGAGGCGGCCTGGGTCTTCCGCGGAGCTCCCGGGAGCTCCGCACCAAGCCGCTCTCCGGAGAGACGATGGCAGGAGCCGCGCATATATACGCTTGGAGCCGGCCCGCCCCCGAGGCGGGCCCGCCCTCGGAGGGCGGGACTGGCCAATCGGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCAGCGTCCGCCGAGTCGTCGGGGCCCGGCCCACTGGGCGGTAACTCCCGCCCAGTGGGCCGGGCCGCCCACTTCCCGGTATGGTAATTAAAAACTTGCAGAGGCCTTGTTCCGCTTCCCGGTATGGTAATTAGAAACTCATTAATGGGCGGCCCCGGCCGCCCTTCCCGCTTCCGGCAATTCCCGCGGCCCTTAATGGGCAACCCCGGTATTCCCCGCCTCCCGCGCCGCGCGTAACCACTCCCCTGGGGTTCCGGGTTATGTTAATTGCTTTTTTGGCGGAACACACGGCCCCTCGCGCATTGGCCCGCGGGTCGCTCAATGAACCCGCATTGGTCCCCTGGGGTTCCGGGTATGGTAATGAGTTTCTTCGGGAAGGCGGGAAGCCCCGGGGCACCGACGCAGGCCAAGCCCCTGTTGCGTCGGCGGGAGGGGCATGCTAATGGGGTTCTTTGGGGGACACCGGGTTGGTCCCCCAAATCGGGGGCCGGGCCGTGCATGCTAATGATATTCTTTGGGGGCGCCGGGTTGGTCCCCGGGGACGGGGCCGCCCCGCGGTGGGCCTGCCTCCCCTGGGACGCGCGGCCATTGGGGGAATCGTCACTGCCGCCCCTTTGGGGAGGGGAAAGGCGTGGGGTATAAGTTAGCCCTGGCCCGACGGTCTGGTCGCATTTGCACCTCGGCACTCGGAGCGAGACGCAGCAGCCAGGCAGACTCGGGCCGCCCCCTCTCCGCATCACCACAGAAGCCCCGCCTACGTTGCGACCCCCAGGGACCCTCCGTCAGCGACCCTCCAGCCGCATACGACCCCCATGGAGCCCCGCCCCGGAGCGAGTACCCGCCGGCCTGAGGGCCGCCCCCAGCGCGAGGTGAGGGGCCGGGCGCCATGTCTGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGACCCCCGACCCTTACACTGGAACCGGCCGCCATGTTGGGGGACCCCCACTCATACACGGGAGCCGGGCGCCATGTTGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGTGGAACCCCGTGACACTATATATACAGGGACCGGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGCGGAACCCCCTGACCCTATATATACAGGGACCGGGGTCGCCCTGTTAGGGGTCGCCATGTGACCCCCTGACTTTATATATACAGACCCCCAACACCTACACATGGCCCCTTTGACTCAGACGCAGGGCCCGGGGTCGCCGTGGGACCCCCCTGACTCATACACAGAGACACGCCCCCACAACAAACACACAGGGACCGGGGTCGCCGTGTTAGGGGGCGTGGTCCCCACTGACTCATACGCAGGGCCCCCTTACTCACACGCATCTAGGGGGGTGGGGAGGAGCCGCCCGCCATATTTGGGGGACGCCGTGGGACCCCCGACTCCGGTGCGTCTGGAGGGCGGGAGAAGAGGGAAGAAGAGGGGTCGGGATCCAAAGGACGGACCCAGACCACCTTTGGTTGCAGACCCCTTTCTCCCCCCTCTTCCGAGGCCAGCAGGGGGGCAGGACTTTGTGAGGCGGGGGGGGAGGGGGAACTCGTGGGCGCTGATTGACGCGGGAAATCCCCCCATTCTTACCCGCCCCCCCTTTTTTCCCCTCAGCCCGCCCCGGATGTCTGGGTGTTTCCCTGCGACCGAGACCTGCCGGACAGCAGCGACTCGGAGGCGGAGACCGAAGTGGGGGGGCGGGGGGACGCCGACCACCATGACGACGACTCCGCCTCCGAGGCGGACAGCACGGACACGGAACTGTTCGAGACGGGGCTGCTGGGGCCGCAGGGCGTGGATGGGGGGGCGGTCTCGGGGGGGAGCCCCCCCCGCGAGGAAGACCCCGGCAGTTGCGGGGGCGCCCCCCCTCGAGAGGACGGGGGGAGCGACGAGGGCGACGTGTGCGCCGTGTGCACGGATGAGATCGCGCCCCACCTGCGCTGCGACACCTTCCCGTGCATGCACCGCTTCTGCATCCCGTGCATGAAAACCTGGATGCAATTGCGCAACACCTGCCCGCTGTGCAACGCCAAGCTGGTGTACCTGATAGTGGGCGTGACGCCCAGCGGGTCGTTCAGCACCATCCCGATCGTGAACGACCCCCAGACCCGCATGGAGGCCGAGGAGGCCGTCAGGGCGGGCACGGCCGTGGACTTTATCTGGACGGGCAATCAGCGGTTCGCCCCGCGGTACCTGACCCTGGGGGGGCACACGGTGAGGGCCCTGTCGCCCACCCACCCTGAGCCCACCACGGACGAGGATGACGACGACCTGGACGACGGTGAGGCGGGGGGGCGGCGAGGACCCTGGGGGAGGAGGAGGAGGGGGGGGGGAGGGAGGAATAGGCGGGCGGGCGGGCGAGGAAAGGGCGGGCCGGGGAGGGGGCGTAACCTGATCGCGCCCCCCGTTGTCTCTTGCAGCAGACTACGTACCGCCCGCCCCCCGCCGGACGCCCCGCGCCCCCCCACGCAGAGGCGCCGCCGCGCCCCCCGTGACGGGCGGGGCGTCTCACGCAGCCCCCCAGCCGGCCGCGGCTCGGACAGCGCCCCCCTCGGCGCCCATCGGGCCACACGGCAGCAGTAACACTAACACCACCACCAACAGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCCGCCAGTCGCGAGCCGCGGTGCCGCGGGGGGCGTCTGGCCCCTCCGGGGGGGTTGGGGTTGTTGAAGCGGAGGCGGGGCGGCCGAGGGGCCGGACGGGCCCCCTTGTCAACAGACCCGCCCCCCTTGCAAACAACAGAGACCCCATAGTGATCAGCGACTCCCCCCCGGCCTCTCCCCACAGGCCCCCCGCGGCGCCCATGCCAGGCTCCGCCCCCCGCCCCGGTCCCCCCGCGTCCGCGGCCGCGTCGGGCCCCGCGCGCCCCCGCGCGGCCGTGGCCCCGTGTGTGCGGGCGCCGCCTCCGGGGCCCGGCCCCCGCGCCCCGGCCCCCGGGGCGGAGCCGGCCGCCCGCCCCGCGGACGCGCGCCGTGTGCCCCAGTCGCACTCGTCCCTGGCTCAGGCCGCGAACCAAGAACAGAGTCTGTGCCGGGCGCGTGCGACGGTGGCGCGCGGCTCGGGGGGGCCGGGCGTGGAGGGTGGACACGGGCCCTCCCGCGGCGCCGCCCCCTCCGGCGCCGCCCCCTCCGGCGCCCCCCCGCTCCCCTCCGCCGCCTCTGTCGAGCAGGAGGCGGCGGTGCGTCCGAGGAAGAGGCGCGGGTCGGGCCAGGAAAACCCCTCCCCCCAGTCCACGCGTCCCCCCCTCGCGCCGGCAGGGGCCAAGAGGGCGGCGACGCACCCCCCCTCCGACTCAGGGCCGGGGGGGCGCGGCCAGGGAGGGCCCGGGACCCCCCTGACGTCCTCGGCGGCCTCCGCCTCTTCCTCCTCCGCCTCTTCCTCCTCGGCCCCGACTCCCGCGGGGGCCACCTCTTCCGCCACCGGGGCCGCGTCCTCCTCCGCTTCCGCCTCCTCGGGCGGGGCCGTCGGTGCCCTGGGAGGGAGACAAGAGGAAACCTCCCTCGGCCCCCGCGCTGCTTCTGGGCCGCGGGGGCCGAGGAAGTGTGCCCGGAAGACGCGCCACGCGGAGACTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCGGCCTCACGCGCTACCTGCCCATCTCGGGGGTCTCTAGCGTGGTCGCCCTGTCGCCTTACGTGAACAAGACGATCACGGGGGACTGCCTGCCCATCCTGGACATGGAGACGGGGAACATCGGGGCGTACGTGGTCCTGGTGGACCAGACGGGAAACATGGCGACCCGGCTGCGGGCCGCGGTCCCCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCTCCCCGAGACCGCGGGTAACCACGTGACGCCCCCCGAGTACCCGACGGCCCCCGCGTCGGAGTGGAACAGCCTCTGGATGACCCCCGTGGGGAACATGCTGTTCGACCAGGGCACCCTAGTGGGCGCCCTGGACTTCCGCAGCCTGCGGTCTCGGCACCCGTGGTCCGGGGAGCAGGGGGC
SEQ ID NO: 7 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
SEQ ID NO: 8 DVLMTQTPLFLPVSLGDQASIFCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQFPKLLMYKVSNRFFGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSDVQVQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGSSITSDFAWEWIRQFPGNKLECMGYIGYSGGTIYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARWHGSSHWYFDVWGAGTTVTVSS
SEQ ID NO: 17 CTACTCGTCCCAGAATTTGGCCAGGACGTCCTTGTAGAACGCGGGTGGGGGGGCCTGGGTCCGCAGCTGCTCCAGAAACCTGTCGGCGATATCAGGGGCCGTGATATGCCGGGTCACAATAGATCGCGCCAGGTTTTCGTCGCGGATGTCCTGGTAGATAGGCAGGCGTTTCAGAAGAGTCCACGGCCCCCGCTCCTTGGGGCCGATAAGCGATATGACGTACTTAATGTAGCGGTGTTCCACCAGCTCGGTGATGGTCATGGGATCGGGGAGCCAGTCCAGGGACTCTGGGGCGTCGTGGATGACGTGGCGTCGCCGGCTGGCCACATAACTGCGGTGCTCTTCCAGCAGCTGCGCGTTCGGGACCTGGACGAGCTCGGGCGGGGTGAGTATCTCCGAGGAGGACGACCTGGGGCCGGGGTGGCCCCCGGTAACGTCCCGGGGATCCAGGGGGAGGTCCTCGTCGTCTTCGTATCCGCCGGCGATCTGTTGGGTTAGAATTTCGGTCCACGAGACGCGCATCTCGGTGCCGCCGGCGGCCGGCGGCAAAGGGGGCCTGGTTTCCGTGGAGCGCGAGCTGGTGTGTTCCCGGCGGATGGCCCGCCGGGTCTGAGAGCGACTCGGGGGGGTCCAGTGACATTCGCGCAGCACATCCTCCACGGAGGCGTAGGTGTTATTGGGATGGAGGTCGGTGTGGCAGCGGACAAAGAGGGCCAGGAACTGGGGGTAGCTCATCTTAAAGTACTTTAGTATATCGCGACAGTTGATCGTGGGAATGTAGCAGGCGCTAATATCCAACACAATATCACAGCCCATCAACAGGAGGTCAGTGTCTGTGGTGTACACGTACGCGACCGTGTTGGTGTGATAGAGGTTGGCGCAGGCATCGTCCGCCTCCAGCTGACCCGAGTTAATGTAGGCGTACCCCAGGGCCCGGAGAACGCGAATACAGAACAGATGCGCCAGACGCAGGGCCGGCTTCGAGGGCGCGGCGGACGGCAGCGCGGCTCCGGACCCGGCCGTCCCCCGGGTCCCCGAGGCCAGAGAGGTGCCGCGCCGGCGCATGTTGGAAAAGGCAGAGCTGGGTCTGGAGTCGGTGATGGGGGAAGGCGGTGGAGAGGCGTCCACGTCACTGGCCTCCTCGTCCGTCCGGCATTGGGCCGTCGTGCGGGCCAGGATGGCCTTGGCTCCAAACACAACCGGCTCCATACAATTGACCCCGCGATCGGTAACGAAGATGGGGAAAAGGGACTTTTGGGTAAACACCTTTAATAAGCGACAGAGGCAGTGTAGCGTAATGGCCTCGCGGTCGTAACTGGGGTATCGGCGCTGATATTTGACCACCAACGTGTACATGACGTTCCACAGGTCCACGGCGATGGGGGTGAAGTACCCGGCCGGGGCCCCAAGGCCCTGGCGCTTGACCAGATGGTGTGTGTGGGCAAACTTCATCATCCCGAACAAACCCAT
SEQ ID NO: 18 ATGCTCCGCAACGACAGCCACCGGGCCGCGTCCCCGGAGGACGGCCAGGGACGGGTCGACGACGGACGGCCACACCTCGCGTGCGTGGGGGCCCTGGCGCGGGGGTTCATGCATATCTGGCTTCAGGCCGCCACGCTGGGTTTTGCGGGATCGGTCGTTATGTCGCGCGGGCCGTACGCGAATGCCGCGTCTGGGGCGTTCGCCGTCGGGTGCGCCGTGCTGGGCTTTATGCGCGCACCCCCTCCCCTCGCGCGGCCCACCGCGCGGATATACGCCTGGCTCAAACTGGCGGCCGGTGGAGCGGCCCTTGTTCTGTGGAGTCTCGGGGAGCCCGGAACGCAGCCGGGGGCCCCGGGCCCGGCCACCCAGTGCCTGGCGCTGGGCGCCGCCTATGCGGCGCTCCTGGTGCTCGCCGATGACGTCTATCCGCTCTTTCTCCTCGCCCCGGGGCCCCTGTTCGTCGGCACCCTGGGGATGGTCGTCGGCGGGCTGACGATCGGAGGCAGCGCGCGCTACTGGTGGATCGGTGGGCCCGCCGCGGCCGCCTTGGCCGCGGCGGTGTTGGCGGGCCCGGGGGCGACCACCGCCAGGGACTGCTTCTCCAGGGCGTGCCCCGACCACCGCCGCGTCTGCGTCATCGTCGCAGGCGAGTCTGTTTCCCGCCGCCCCCCGGAGGACCCAGAGCGACCCGGGGACCCCGGGCCACCGTCCCCCCCGACACCCCAACGATCCCAGGGGCCGCCGGCCGATGAGGTCGCACCGGCCGGGGTAGCGCGGCCCGAAAACGTCTGGGTGCCCGTGGTCACCTTTCTGGGGGCGGGCGCGCTCGCCGTCAAGACGGTGCGAGAACATGCCCGGGAAACGCCGGGCCCGGGCCTGCCGCTGTGGCCCCAGGTGTTTCTCGGAGGCCATGTGGCGGTGGCCCTGACGGAGCTGTGTCAGGCGCTTATGCCCTGGGACCTTACGGACCCGCTGCTGTTTGTTCACGCCGGACTGCAGGTCATCAACCTCGGGTTGGTGTTTCGGTTTTCCGAGGTTGTCGTGTATGCGGCGCTAGGGGGTGCCGTGTGGATTTCGTTGGCGCAGGTGCTGGGGCTCCGGCGTCGCCTGCACAGGAAGGACCCCGGGGACGGGGCCCGGTTGGCGGCGACGCTTCGGGGCCTCTTCTTCTCCGTGTACGCGCTGGGGTTTGGGGTGGGGGCGCTGCTGTGCCCTCCGGGGTCAACGGGCGGGTGGTCGGGCGATTGA
SEQ ID NO: 19 CTACCCACCGTACTCGTCAATTCCAAGGGCATCGGTAAACATCTGCTCAAACTCGAAGTCGGCCATATCCAGAGCGCCGTAGGGGGCGGAGTCGTGGGGGGTAAATCCCGGACCCGGGGAATCCCCGTCCCCCAACATGTCCAGATCGAAATCGTCTAGCGCGTCGGCATGCGCCATCGCCACGTCCTCGCCGTCTAAGTGGAGCTCGTCCCCCAGGCTGACATCGGTCGGGGGGGCCGTCGACAGTCTGCGCGTGTGTCCCGCGGGGAGAAAGGACAGGCGCGGAGCCGCCAGCCCCGCCTCTTCGGGGGCGTCGTCGTCCGGGAGATCGAGCAGGCCCTCGATGGTAGACCCGTAATTGTTTTTCGTACGCGCGCGGCTGTACGCGTGTTCCCGCATGACCGCCTCGGAGGGCGAGGTCGTGAAGCTGGAATACGAGTCCAACTTCGCCCGAATCAACACCATAAAGTACCCAGAGGCGCGGGCCTGGTTGCCATGCAGGGTGGGAGGGGTCGTCAACGGCGCCCCTGGCTCCTCCGTAGCCGCGCTGCGCACCAGCGGGAGGTTAAGGTGCTCGCGAATGTGGTTTAGCTCCCGCAGCCGGCGGGCCTCGATTGGCACTCCCCGGACGGTGAGCGCTCCGTTGACGAACATGAAGGGCTGGAACAGACCCGCCAACTGACGCCAGCTCTCCAGGTCGCAACAGAGGCAGTCAAACAGGTCGGGCCGCATCATCTGCTCGGCGTACGCGGCCCATAGGATCTCGCGGGTCAAAAATAGATACAAATGCAAAAACAGAACACGCGCCAGACGAGCGGTCTCTCGGTAGTACCTGTCCGCGATCGTGGCGCGCAGCATTTCTCCCAGGTCGCGATCGCGTCCGCGCATGTGCGCCTGGCGGTGCAGCTGCCGGACGCTGGCGCGCAGGTACCGGTACAGGGCCGAGCAGAAGTTGGCCAACACGGTTCGATAGCTCTCCTCCCGCGCCCGTAGCTCGGCGTGGAAGAAACGAGAGAGCGCTTCGTAGTAGAGCCCGAGGCCGTCGCGGGTGGCCGGAAGCGTCGGGAAGGCCACGTCGCCGTGGGCGCGAATGTCGATTTGGGCGCGTTCGGGGACGTACGCGTCCCCCCATTCCACCACATCGCTGGGCAGCGTTGATAGGAATTTACACTCCCGGTACAGGTCGGCGTTGGTCGGTAACGCCGAAAACAAATCCTCGTTCCAGGTATCGAGCATGGTACATAGCGCGGGGCCCGCGCTAAAGCCCAAGTCGTCGAGGAGACGGTTAAAGAGGGCGGCGGGGGGGACGGGCATGGGCGGGGAGGGCATGAGCTGGGCCTGGCTCAGGCGCCCCGTTGCGTACAGCGGAGGGGCCGCCGGGGTGTTTTTGGGACCCCCGGCCGGGCGGGGGGGTGGTGGCGAAGCGCCGTCCGCGTCCATGTCGGCAAACAGCTCGTCGACCAAGAGGTCCAT
SEQ ID NO: 20 ATGACAGCGACCCCCCTCACCAACCTGTTCTTACGGGCCCCGGACATAACCCACGTGGCCCCCCCTTACTGCCTCAACGCCACCTGGCAGGCCGAAACGGCCATGCACACCAGCAAAACGGACTCCGCTTGCGTGGCCGTGCGGAGTTACCTGGTCCGCGCCTCCTGTGAGACCAGCGGCACAATCCACTGCTTTTTCTTTGCGGTATACAAGGACACCCACCATACCCCTCCGCTGATTACCGAGCTCCGCAACTTTGCGGACCTGGTTAACCACCCGCCGGTCCTACGCGAACTGGAGGATAAGCGCGGGGTGCGGCTGCGGTGTGCGCGGCCGTTTAGCGTCGGGACGATTAAGGACGTCTCTGGGTCCGGCGCGTCCTCGGCGGGAGAGTACACGATAAACGGGATCGTGTACCACTGCCACTGTCGGTATCCGTTCTCAAAAACATGCTGGATGGGGGCCTCCGCGGCCCTACAGCACCTGCGCTCCATCAGCTCCAGCGGCATGGCCGCCCGCGCGGCAGAGCATCGACGCGTCAAGATTAAAATTAAGGCGTGA
SEQ ID NO: 21 CTACAGGGTGGTAACCGGATAGCAGATGTGAGGAAGTCTGGGCCGTTCGCCGCGAACGGCGATCAGAGGGTCCGTTTCTTGCGGACCACGGCCCGGTGATGTGGGTTGCTCGTCTAAAATCTCGGGCATACCCATACACGCACAACACGGACGCCGCACCGAATGGGACGTCGTAAGGGGGTGGGAGGTAGCTGGGTGGGGTTTGTGCAGAGCAATCAGGGACCGCAGCCAGCGCATACAATCGCGCTCCCGTCCGTTGGTCCCGGGCAGGACCACGCCGTACTGGTATTCGTACCGGCTGAGCAGGGTCTCCAGGGGGTGGTTGGGTGCCGCGGGGAACGGGGTCCACGCCACGGTCCACTCGGGCAAAAACCGAGTCGGCACGGCCCACGGTTCTCCCACCCACGCGTCTGGGGTCTTGATGGCGATAAATCTTACCCCGAGCCGGATTTTTTGGGCGTATTCGAGAAACGGCACACACAGATCCGCCGCGCCTACCACCCACAAGTGGTAGAGGCGAGGGGGGCTGGGTTGGTCTCGGTGCAACAGTCGGAAGCACGCCACGGCGTCCACGACCTCGGTGCTCTCCAAGGGGCTGTCCTCCGCAAACAGGCCCGTGGTGGTGTTTGGGGGGCAGCGACAGGACCTAGTGCGCACGATCGGGCGGGTGGGTTTGGGTAAGTCCATCAGCGGCTCGGCCAACCGTCGAAGGTTGGCCGGGCGAACGACGACCGGGGTACCCAGGGGTTCTGATGCCAAAATGCGGCACTGCCTAAGCAGGAAGCTCCACAGGGCCGGGCTTGCGTCGACGGAAGTCCGGGGCAGGGCGTTGTTCTGGTCAAGGAGGGTCATTACGTTGACGACAACAACGCCCAT
SE ID NO: 22 CCCGGGACCCCCCTGACGTCCTCGGCGGCCTCCGCCTCTTCCTCCTCCGCCTCTTCCTCCTCGGCCCCGACTCCCGCGGGGGCCACCTCTTCCGCCACCGGGGCCGCGTCCTCCTCCGCTTCCGCCTCCTCGGGCGGGGCCGTCGGTGCCCTGGGAGGGAGACAAGAGGAAACCTCCCTCGGCCCCCGCGCTGCTTCTGGGCCGCGGGGGCCGAGGAAGTGTGCCCGGAAGACGCGCCACGCGGAGACTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCGGCCTCACGCGCTACCTGCCCATCTCGGGGGTCTCTAGCGTGGTCGCCCTGTCGCCTTACGTGAACAAGACGATCACGGGGGACTGCCTGCCCATCCTGGACATGGAGACGGGGAACATCGGGGCGTACGTGGTCCTGGTGGACCAGACGGGAAACATGGCGACCCGGCTGCGGGCCGCGGTCCCCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCTCCCCGAGACCGCGGGTAACCACGTGACGCCCCCCGAGTACCCGACGGCCCCCGCGTCGGAGTGGAACAGCCTCTGGATGACCCCCGTGGGGAACATGCTGTTCGACCAGGGCACCCTAGTGGGCGCCCTGGACTTCCGCAGCCTGCGGTCTCGGCACCCGTGGTCCGGGGAGCAGGGGGCGTCGACCCGGGACGAGGGAAAACAATAAGGGACGCCCCCGTGTTTGTGGGGAGGGGGGGGTCGGGCGCTGGGTGGTCTCTGGCCGCGCCCACTACACCAGCCAATCCGTGTCGGGGAGGTGGAAAGTGAAAGACACGGGCACCACACACCAGCGGGTCTTTTGTGTTGGCCCTAATAAAAAAAACTCAGGGGATTTTTGCTGTCTGTTGGGAAATAAAGGTTTACTTTTGTATCTTTTCCCTGTCTGTGTTGGATGTATCGCGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCCATGTTGGGCAGGCTCTGGTGTTAACCACAGAGCCGCGGCCCGGGCTGCCTGACCACCGATCCCCGAAAGCATCCTGCCACTGGCATGGAGCCAGAACCACAGTGGGTTGGGTGTGGGTGTTAAGTTTCCGCGAGCGCCTGCCCGCCCGGACTGACCTGGCCTCTGGCCGCCACAAAGGGCGGGGGGGGGGGTTAACTACACTATAGGGCAACAAAGGATGGGAGGGGTAGCGGGGCGGGACGGGGCGCCCAAAAGGGGGTCGGCCACACCACAGACGTGGGTGTTGGGGGGTGGGGCGGAGGGGTGGGGGGGGAGACAGAAACAGGAACATAGTTAGAAAACAAGAATGCGGTGCAGCCAGAGAATCACAGGAGACGAGGGGATGGGCGTGTTGGTTACCAACCCACACCCAGGCATGCTCGGTGGTATGAAGGAGGGGGGGCGGTGTTTCTTAGAGACCGCCGGGGGACGTGGGGTTGGTGTGCAAAGGCACGCGCACCCGCGCCGGCCAGGTGGGCCGGTACCCCATCCCCCCCTCCCCCGACCCTTCCCACCCCCGCGTGCCAGAGATCACCCCGGTCCCCCGGCACCCGCCACTCCTCCATATCCTCGCTTTAGGAACAACTTTAGGGGGGGGTACACACGCGCCGTGCATTTCCTTCCACACCCCCCCCCTCCCCCGCACTCCCCCCCCCCAGGCAGTAAGACCCAAGCATAGAGAGCCAGGCACAAAAACACAGGCGGGGTGGGACACATGCCTTCTTGGAGTACGTGGGTCATTGGCGTGGGGGGTTACAGCGACACCGGCCGACCCCCTGGCGGTCTTCCAGCCGGCCCTTAGATAAGGGGGCAGTTGGTGGTCGGACGGGTAAGTAACAGAGTCTAACTAAGGGTGGGAGGGGGGGAAAATAACGGGCTGGTGTGCTGTAACACGAGCCCACCCGCGAGTGGCGTGGCCGACCTTAGCCTCTGGGGCGCCCCCTGTCGTTTGGGTCCCCCCCCCTCTATTGGGGAGAAGCAGGTGTCTAACCTACCTGGAAACGCGGCGTCTTTGTTGAACGACACCGGGGCGCCCTCGACGAGTGGGATAACGGGGGAGGAAGGGAGGGAGGAGGGTACTGGGGGTGAAGGGGGGGGGGGAGAAGCGAGAACAGGAAAGGCGACGGAGCCCGGCAGAACACCGAGGAAAAAAAAACCACAGCGCATGC
SEQ ID NO: 23 CCATGTTGGGCAGGCTCTGGTGTTAACCACAGAGCCGCGGCCCGGGCTGCCTGACCACCGATCCCCGAAAGCATCCTGCCACTGGCATGGAGCCAGAACCACAGTGGGTTGGGTGTGGGTGTTAAGTTTCCGCGAGCGCCTGCCCGCCCGGACTGACCTGGCCTCTGGCCGCCACAAAGGGCGGGGGGGGGGGTTAACTACACTATAGGGCAACAAAGGATGGGAGGGGTAGCGGGGCGGGACGGGGCGCCCAAAAGGGGGTCGGCCACACCACAGACGTGGGTGTTGGGGGGTGGGGCGGAGGGGTGGGGGGGGAGACAGAAACAGGAACATAGTTAGAAAACAAGAATGCGGTGCAGCCAGAGAATCACAGGAGACGAGGGGATGGGCGTGTTGGTTACCAACCCACACCCAGGCATGCTCGGTGGTATGAAGGAGGGGGGGCGGTGTTTCTTAGAGACCGCCGGGGGACGTGGGGTTGGTGTGCAAAGGCACGCGCACCCGCGCCGGCCAGGTGGGCCGGTACCCCATCCCCCCCTCCCCCGACCCTTCCCACCCCCGCGTGCCAGAGATCACCCCGGTCCCCCGGCACCCGCCACTCCTCCATATCCTCGCTTTAGGAACAACTTTAGGGGGGGGTACACACGCGCCGTGCATTTCCTTCCACACCCCCCCCCTCCCCCGCACTCCCCCCCCCCAGGCAGTAAGACCCAAGCATAGAGAGCCAGGCACAAAAACACAGGCGGGGTGGGACACATGCCTTCTTGGAGTACGTGGGTCATTGGCGTGGGGGGTTACAGCGACACCGGCCGACCCCCTGGCGGTCTTCCAGCCGGCCCTTAGATAAGGGGGCAGTTGGTGGTCGGACGGGTAAGTAACAGAGTCTAACTAAGGGTGGGAGGGGGGGAAAATAACGGGCTGGTGTGCTGTAACACGAGCCCACCCGCGAGTGGCGTGGCCGACCTTAGCCTCTGGGGCGCCCCCTGTCGTTTGGGTCCCCCCCCCTCTATTGGGGAGAAGCAGGTGTCTAACCTACCTGGAAACGCGGCGTCTTTGTTGAACGACACCGGGGCGCCCTCGACGAGTGGGATAACGGGGGAGGAAGGGAGGGAGGAGGGTACTGGGGGTGAAGGGGGGGGGGGAGAAGCGAGAACAGGAAAGGCGACGGAGCCCGGCAGAACACCGAGGAAAAAAAAACCACAGCGCATGCGCCGGGCCGTTGTGGGGCCCCGGGCCGGGGCCCCTTGGGTCCGCCGGGGCCCCGGGCCGGGCCGCCACGGGGGCCGGCCGTTGGCGGTAACCCCGAGTGTTCATCTCAGGCCCCGGGCCGGGAACCCGGAAAAGCCTCCGGGGGGCCTTTTTCGCGTCGCGTGCCGGCGAGCGGGTCCGGACGGGGCCCGGACCGCCGCGGTCGGGGGCCCCTCGTCCCGGGCCGTACGCGGCCTTCGCCCCGTGAGGGGACAGACGAACGAAACATTCCGGCGACGGAACGAAAAACACCCCAGACGGGTTAAAGAAACAGAAACCGCAACCCCCACCACCCCCGAAACGGGGAAAACGAAAAAACAGACCAGCGGCCGGCCGGCGCTTAGGGGGAGGATGTCGCCGACGCCCCTTGGCCGCCCCGGCTGCA
下面將結合附圖和實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將理解，下列附圖和實施例僅用於說明本發明，而不是對本發明的範圍的限定。根據附圖和較佳實施方案的下列詳細描述，本發明的各種目的和有利方面對於本領域技術人員來說將變得顯然。
現參照下列意在舉例說明本發明（而非限定本發明）的實施例來描述本發明。
除非特別指明，否則本申請中所使用的分子生物學實驗方法、病毒學實驗方法、免疫檢測法以及動物學實驗方法均是本領域技術人員慣常使用的實驗方法。例如，分子生物學實驗方法可參照J. Sambrook等人，分子複製：實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989，以及F. M. Ausubel等人，精編分子生物學實驗指南，第3版，John Wiley & Sons, Inc.，1995中該的方法進行。各實施例中所使用的試劑（例如酶，質粒及引物）均購自商業化公司，並且，各種試劑（例如酶）依照產品製造商推薦的條件來使用。本領域技術人員知曉，實施例以舉例方式描述本發明，且不意欲限制本發明所要求保護的範圍。 實施例1. 重組病毒OVN和OVH的構建  （1.1）I型單純皰疹病毒（HSV-1）的培養及滴度測定
野生型HSV-1病毒株KOS購自美國ATCC公司（貨號VR-1493™），其全基因組資訊已揭露於NCBI（GenBank: JQ673480.1）。在MOI=0.1的條件下，用病毒株KOS感染培養的Vero細胞（購買於美國ATCC公司，貨號CCL-81™）。48小時後，用細胞刮收集所有的細胞，並進行離心，以去除細胞培養液。將獲得的細胞沉澱重懸於新鮮的完全培養基中，並保存在-80℃。隨後，對細胞懸液進行反覆凍融（3次），然後離心，收集上清，獲得病毒液。將病毒液分裝，並保存在-80℃。
以1×10 6個細胞的密度，將U-2 OS細胞（購買於美國ATCC公司，貨號HTB-96™）接種於6cm培養板中。待細胞長成單層後，對如上獲得的病毒液進行系列10倍梯度稀釋，然後用各個稀釋梯度的病毒液（500μl）感染細胞。感染75min之後，棄去細胞培養液，加入5mL新鮮的完全培養基，繼續培養細胞。2h後，加入10mL甲基纖維素培養基，然後將培養板放入培養箱中培養2天。隨後，向培養板中加入含有0.01%中性紅的基礎培養基，並繼續培養12hr。培養結束後，棄去所有細胞培養液，並對各個培養板的空斑進行計數。根據各個培養板的空斑數及病毒液的稀釋倍數，按照以下公式計算出病毒滴度：病毒滴度（PFU/mL） = 每板空斑數×2×病毒稀釋倍數。 （1.2）重組質粒的構建
使用限制性內切酶SacI和PstI，將野生型HSV-1病毒基因組（GenBank: JQ673480.1）的第33位鹼基（nt33）至第5876位鹼基（nt5876）之間的序列（SEQ ID NO: 1）複製入商購獲得的PUC57載體（上海生工），從而獲得質粒PUC57-F0。隨後，使用限制性內切酶NcoI和SalI，將質粒PUC57-F0中NcoI和SalI酶切位點之間的序列替換成LacZ的基因序列（SEQ ID NO: 2），從而獲得質粒PUC57-d34.5/0lacZ。另外，還將質粒PUC57-F0中NcoI和SalI酶切位點之間的序列切除，從而獲得PUC57-d34.5/0質粒。 （1.3）重組病毒OVN和OVH的構建及鑒定
重組病毒OVN和OVH的構建策略分別如第1A圖至第1B圖所示。 （1.3.1）重組病毒d34.5/0lacZ的構建
以每孔1×10 5個細胞的密度，將U-2 OS細胞接種於24孔板，並於37℃、在細胞培養箱中培養過夜。利用轉染試劑lipofectamine 2000，將重組質粒PUC57-d34.5/0lacZ轉染入U-2 OS細胞中。轉染24h後，以MOI=3的感染複數，用病毒株KOS感染細胞。待細胞發生病變後，收穫細胞。用反覆凍融法裂解收穫的細胞，然後離心，收集上清，從而獲得病毒液。測定所獲得的病毒液的病毒滴度。
將收穫的病毒接種於U-2 OS細胞長成單層的培養板中。培養2天後，向培養板中均勻加入含有0.01%中性紅、100ug/mL X-gal的基礎培養基，繼續培養細胞12hr。隨後，挑選培養板上出現的藍色空斑，並對獲自藍色空斑的病毒進行單複製化（3次），從而獲得重組病毒d34.5/0lacZ。經測序驗證，與病毒株KOS相比，重組病毒d34.5/0lacZ基因組中二拷貝的ICP34.5和ICP0基因均被置換為lacZ基因。 （1.3.2）重組病毒OVN（d34.5/0）的構建
以每孔1×10 5個細胞的密度，將U-2 OS細胞接種於24孔板，並於37℃、在細胞培養箱中培養過夜。利用轉染試劑lipofectamine 2000，將重組質粒PUC57-d34.5/0轉染入U-2 OS細胞中。轉染24h後，以MOI=3的感染複數，用重組病毒d34.5/0lacZ感染細胞。待細胞發生病變後，收穫細胞。用反覆凍融法裂解收穫的細胞，然後離心，收集上清，從而獲得病毒液。測定所獲得的病毒液的病毒滴度。
將收穫的病毒接種於U-2 OS細胞長成單層的培養板中。培養2天後，向培養板中均勻加入含有0.01%中性紅、100ug/mL X-gal的基礎培養基，繼續培養細胞12hr。隨後，挑選培養板上出現的白色空斑，並對獲自白色空斑的病毒進行單複製化（3次），從而獲得重組病毒OVN（d34.5/0）。經測序驗證，與重組病毒d34.5/0lacZ相比，重組病毒OVN（d34.5/0）基因組中，二拷貝的lacZ基因均已被缺失；與病毒株KOS相比，重組病毒OVN（d34.5/0）缺失了野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt510至nt5439區間的序列（SEQ ID NO: 6）和nt120802至nt125731區間的序列（SEQ ID NO: 6）。 （1.3.3）重組病毒OVH的構建
使用限制性內切酶SacI和PmeI，將野生型HSV-1病毒基因組（GenBank: JQ673480.1）的第112861位鹼基（nt112861）至第113422位鹼基（nt113422）之間的序列（SEQ ID NO: 3）複製入商購獲得的PUC57載體，從而獲得質粒PUC57-27p0。隨後，使用限制性內切酶SpeI和PstI，將野生型HSV-1病毒基因組（GenBank: JQ673480.1）的第113590位鹼基（nt113590）至第115194位鹼基（nt115194）之間的序列（SEQ ID NO: 4）複製入質粒PUC57-27p0，從而獲得質粒PUC57-27p1。在質粒PUC57-27p1中，ICP27基因的原生啟動子序列（野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt113422至nt113590）已被缺失。
隨後，將質粒PUC57-27p1中PmeI和SpeI酶切位點之間的序列替換成LacZ表現序列（SEQ ID NO: 2），從而獲得質粒PUC57-27p/lacZ。另外，還將質粒PUC57-27p1中PmeI和SpeI酶切位點之間的序列替換成人端粒酶逆轉錄酶hTERT的核心啟動子序列（SEQ ID NO: 5；參見，Takakura M, Kyo S, Kanaya T , et al.Cloning of human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene promoter and identification of proximal core promoter sequences essential for transcriptional activation in immortalized and cancer cells [J]. Cancer Res, 1999, 59 (3): 551-557），從而獲得質粒PUC57-27p/htert。在質粒PUC57-27p/htert中，ICP27基因受腫瘤特異性啟動子（即，hTERT核心啟動子）調控。
隨後，參照（1.3.1）和（1.3.2）描述的構建方法，以重組病毒OVN為起始病毒，利用質粒PUC57-27p/lacZ和PUC57-27p/htert，將hTERT核心啟動子序列導入重組病毒OVN基因組中，用於調控ICP27基因，從而構建獲得重組病毒OVH。經測序驗證，與重組病毒OVN相比，重組病毒OVH基因組中，ICP27基因的原生啟動子序列（野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt113423至nt113589）已被替換為hTERT核心啟動子序列（SEQ ID NO: 5）。 （1.4）重組病毒OVN和OVH與已知的重組HSV病毒的比較
目前，已開發了多種意欲用於腫瘤治療的重組HSV病毒，包括例如HSV1716、NV1020、G207、OncoVex GM-CSF（T-VEC）等。這些重組HSV病毒與本發明的重組病毒OVN和OVH各自包含的基因組修飾概述於下面的表2中。 表2：各種重組HSV病毒所包含的基因組修飾
名稱 基因改造 國家
HSV1716 缺失雙拷貝的ICP34.5 英國
NV1020 缺失UL/US交界處15kb的片段（即，缺失單拷貝的ICP34.5、ICP0、ICP4和UL56） 美國
G207 缺失雙拷貝的ICP34.5和ICP6 美國
OncoVex GM-CSF（T-VEC） 缺失雙拷貝的ICP34.5和ICP47 美國
OVN 缺失雙拷貝的（ICP34.5和ICP0） 中國
OVH 缺失雙拷貝的（ICP34.5和ICP0），並且ICP27基因的原生啟動子被替換為hTERT核心啟動子 中國
第2圖示意性展示了重組病毒HSV1716、NV1020、G207、OncoVex GM-CSF（T-VEC）和OVN所包含的基因組修飾。 實施例2. 重組病毒OVN和OVH的表徵
參照實施例1中描述的方法，構建了重組病毒dICP0，其與病毒株KOS相比，缺失了雙拷貝的ICP0基因。將病毒株KOS和重組病毒dICP0用作對照病毒，以對重組病毒OVN和OVH進行表徵。第3圖示意性展示了與病毒株KOS相比，重組病毒OVN、OVH和dICP0所包含的基因組修飾；其中，與病毒株KOS相比，重組病毒dICP0缺失了雙拷貝的ICP0基因；重組病毒OVN缺失了雙拷貝的ICP34.5基因和ICP0基因；重組病毒OVH缺失了雙拷貝的ICP34.5基因和ICP0基因，並且ICP27基因的原生啟動子被替換為hTERT核心啟動子。
通過PCR方法來驗證重組病毒OVN、OVH和dICP0中的基因缺失。簡言之，以病毒株KOS、OVN、OVH或dICP0的基因組為範本，用特異性擴增ICP0基因、ICP34.5基因、ICP27基因或hTERT核心啟動子的引物分別進行PCR。PCR所使用的引物概述於表3中。 表3：引物序列
SEQ ID NO: 引物名稱 序列（5’-3’）
9 ICP0-F GACGTGTGCGCCGTGTGCACGGATGA
10 ICP0-R ACTCTGTTCTTGGTTCGCGGCCTGAGCCA
11 ICP34.5-F ATGGCCCGCCGCCGCCATCGC
12 ICP34.5-R TTAGACCGAGTTCGCCGGGC
13 ICP27-F ATGGCGACTGACATTGATATGCTAATTGA
14 ICP27-R CTAAAACAGGGAGTTGCAATAAAAATATTTGC
15 htertp-F CTCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGAC
16 htertp-R CTGCCTGAAACTCGCGCCGCGAGGA
反應結束後，通過凝膠電泳檢測PCR產物。結果如第4圖所示。第4圖顯示了以病毒株KOS、OVN、OVH或dICP0的基因組為範本，用特異性擴增ICP0基因、ICP34.5基因、ICP27基因或hTERT核心啟動子的引物分別進行PCR所獲得的產物的凝膠電泳結果；其中，泳道1表示DNA分子量標記；泳道2表示以病毒株KOS基因組為範本的PCR產物；泳道3表示以重組病毒dICP0基因組為範本的PCR產物；泳道4表示以重組病毒OVN基因組為範本的PCR產物；泳道5表示以重組病毒OVH基因組為範本的PCR產物；泳道6表示以水為範本的PCR產物。
第4圖的結果顯示，病毒株KOS的基因組中包含ICP0基因、ICP34.5基因和ICP27基因，但不包含hTERT核心啟動子；重組病毒dICP0的基因組中包含ICP34.5基因和ICP27基因，但不包含ICP0基因和hTERT核心啟動子；重組病毒OVN的基因組中包含ICP27基因，但不包含ICP34.5基因、ICP0基因和hTERT核心啟動子；重組病毒OVH的基因組中包含ICP27基因和hTERT核心啟動子，但不包含ICP34.5基因和ICP0基因。
另外，還使用即時定量PCR法分析KOS、OVN、OVH或dICP0感染細胞後的基因表現（mRNA）。簡言之，用KOS、OVN、OVH和dICP0分別感染宿主細胞U-2 OS。待細胞發生病變後，收穫細胞並提取總mRNA。將總mRNA反轉錄為cDNA，並使用特異性擴增ICP0基因、ICP34.5基因或ICP27基因的引物分別進行即時定量PCR。結果如第5圖所示。
第5圖顯示了分析KOS、OVN、OVH或dICP0的IE基因表現（mRNA）的即時定量PCR的實驗結果。第5圖的結果顯示，病毒株KOS能夠表現ICP0基因、ICP34.5基因和ICP27基因；重組病毒dICP0能夠表現ICP34.5基因和ICP27基因，但不表現ICP0基因；重組病毒OVN和OVH均能夠表現ICP27基因，但均不表現ICP34.5基因和ICP0基因。這表明，重組病毒dICP0已缺失了雙拷貝的ICP0基因，其在感染宿主細胞後不能表現ICP0蛋白；並且，重組病毒OVN和OVH均缺失了雙拷貝的ICP34.5基因和ICP0基因，其在感染宿主細胞後不能表現ICP0蛋白和ICP34.5蛋白。 實施例3. 重組病毒OVN/OVH的複製能力和殺傷能力的評估
以5-7.5×10 6個細胞/板的密度，將狀態良好、處於對數生長期的正常細胞（L-O2細胞）和腫瘤細胞（U-2 OS細胞）接種於6cm培養板中。隨後，以MOI=1的感染複數，用病毒KOS、OVN、OVH或dICP0感染培養的細胞。感染48h後，在顯微鏡下觀察細胞的狀態，並拍照記錄。隨後，將感染了病毒的細胞消化，並用台盼藍染色法計算細胞的存活率。細胞存活率（％）=（感染病毒後的活細胞數目）/（未感染病毒的對照細胞的數目）×100。每組實驗均設置3孔重複，實驗結果為3次獨立實驗的平均值。另外，參照實施例1中描述的方案，測定用病毒KOS、OVN、OVH或dICP0感染正常細胞（L-O2細胞）和腫瘤細胞（U-2 OS細胞）後不同時間點的病毒滴度。每組實驗均設置3孔重複，實驗結果為3次獨立實驗的平均值。實驗結果如第6圖至第8圖所示。
第6圖顯示了以MOI=1的感染複數用病毒KOS、OVN、OVH或dICP0感染L-O2細胞（第6A圖）或U-2 OS細胞（第6B圖）48h後的病毒滴度。第6A圖的結果顯示，在感染L-O2細胞後，病毒KOS和dICP0均以高水準複製，感染48h後二者的病毒滴度分別達到約1.94× 10 7和3.01 × 10 6pfu/ml；而病毒OVN和OVH的複製能力顯著下降，感染48h後二者的病毒滴度分別僅為約2.14 × 10 5和1.85 × 10 3pfu/ml。第6B圖的結果顯示，在感染U-2 OS細胞後，病毒KOS、OVN、OVH和dICP0均以高水準複製，感染48h後它們的病毒滴度均在1.01-1.83 × 10 8pfu/ml。這些結果表明，病毒KOS和dICP0能夠在正常細胞（例如L-O2細胞）和腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）中以高水準複製；而病毒OVN和OVH僅能在腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）中以高水準複製（其複製能力與病毒KOS和dICP0相比，僅略微下降），在正常細胞（例如L-O2細胞）中的複製能力則顯著下降。例如，在L-O2細胞中，與病毒KOS相比，病毒OVN和OVH的複製能力分別下降約90倍和10 4倍；與病毒dICP0相比，病毒OVN和OVH的複製能力分別下降約14倍和1.6×10 3倍。
第7圖顯示了以MOI=0.01的感染複數用病毒KOS、OVN、OVH或dICP0感染單層的U-2 OS細胞後不同時間點（感染後12h、24h、36h、48h和60h）的病毒滴度。第7圖的結果顯示，病毒KOS、OVN、OVH或dICP0在腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）中具有基本上相當的複製能力。
第8圖顯示了以MOI=1的感染複數用病毒KOS、OVN、OVH或dICP0感染L-O2細胞（第8A圖）或U-2 OS細胞（第8B圖） 72h後的細胞存活率；其中，MOCK表示未感染病毒的細胞。第8A圖的結果顯示，在感染72h後，病毒KOS和dICP0對L-O2細胞的殺傷分別為約91.5%和89%（二者對L-O2細胞均有顯著殺傷）；病毒OVN和OVH對L-O2細胞的殺傷分別為約42%和5%（二者對L-O2細胞的殺傷能力顯著下降）。第8B圖的結果顯示，在感染72h後，病毒KOS、OVN、OVH和dICP0均能100%殺傷U-2 OS細胞（對U-2 OS細胞均具有極強的殺傷能力）。這些結果表明，病毒KOS和dICP0對正常細胞（例如L-O2細胞）和腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）均具有極高的殺傷活性；而病毒OVN和OVH僅對腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）具有高殺傷活性（其殺傷能力與病毒KOS和dICP0基本上相同），但是對正常細胞（例如L-O2細胞）的殺傷能力則顯著下降。例如，在L-O2細胞中，與病毒KOS相比，病毒OVN和OVH的殺傷能力分別下降約54.1%和94.5%；與病毒dICP0相比，病毒OVN和OVH的殺傷能力分別下降約52.8%和94.4%。
第6圖至第8圖的實驗結果表明，與野生型病毒KOS和重組病毒dICP0相比，重組病毒OVN和OVH在正常細胞中的複製能力和殺傷能力顯著降低，而在腫瘤細胞中的複製能力和殺傷能力基本上相當（或者僅略微下降）。這表明，本發明的重組病毒OVN和OVH不僅能夠維持在腫瘤細胞中的高複製能力和高殺傷能力（具有良好的抗腫瘤活性），而且對正常細胞的毒力顯著降低。因此，本發明的重組病毒OVN和OVH可用於抗腫瘤治療，並且其對正常細胞具有更高的安全性，可以以更高的劑量使用。
另外，還參照如上描述的方法，測定了重組病毒OVN和OVH對各種腫瘤細胞的殺傷能力。簡言之，以5-7.5×10 6個細胞/板的密度，將狀態良好、處於對數生長期的腫瘤細胞接種於6cm培養板中。隨後，以MOI=1的感染複數，用病毒OVN或OVH感染培養的腫瘤細胞。感染48h後，將感染了病毒的腫瘤細胞消化，並用台盼藍染色法計算腫瘤細胞的存活率。在本實驗中，將未用病毒感染的細胞用作對照。細胞存活率（％）=（感染病毒後的活細胞數目）/（未感染病毒的對照細胞的數目）×100。每組實驗均設置3孔重複，實驗結果為3次獨立實驗的平均值。實驗結果如第9圖所示。
第9圖顯示了用病毒OVN或OVH感染各種腫瘤細胞48h後的細胞存活率；其中，MOCK表示未感染病毒的腫瘤細胞。第9圖的實驗結果顯示，重組病毒OVN和OVH可顯著殺傷多種腫瘤細胞，包括例如肺癌細胞H1299，H520，H1975，NCI-H358和A549（5株）；肝癌細胞Huh7，Hep3B，HepG2，GSG7701，SMMC7721，Hepa1-6，BEL7404，PLC/PRF，QGY7703（9株）；乳腺癌細胞MADMB231，MCF7，MADMB468（3株）；骨肉瘤細胞U2OS和SAOS2（2株）；卵巢癌細胞SKOV3和CAOV3（2株）；子宮頸癌細胞SiHA和Hela（2株）；前列腺癌細胞PC-3（1株）；神經膠質瘤細胞U87MG（1株）；黑色素瘤A375（1株）；結直腸癌HCT116（1株）和胰腺癌Panc1（1株）；並且OVN和OVH的腫瘤殺傷能力相當。這些實驗結果表明，本發明的重組病毒OVN和OVH對各種腫瘤細胞均具有良好的殺傷活性，可用於腫瘤治療。 實施例4. 重組病毒OVN/OVH的神經毒性和體內安全性的評估
皰疹病毒具有神經毒性以及神經潛伏性，其最大的危害在於能感染人或動物的中樞神經系統，導致嚴重的副反應例如腦炎等。因此，評價皰疹病毒安全性的最直接以及最靈敏的方式是，在幼鼠顱內注射病毒，並評估病毒對鼠中樞神經系統的直接殺傷。在本實施例中，我們利用由顱內注射病毒誘發的小鼠腦炎模型，評價了各種重組HSV-1病毒對小鼠的神經毒性及安全性。
簡言之，以4-6週齡的BALB/c雌鼠（n=10）為實驗物件，在鼠腦的左前葉、靠近冠狀縫與矢狀縫交界的位置處緩慢顱內注射20μl病毒。注射完畢後，每天觀察小鼠的發病情況及生存情況。第10圖顯示了以指定劑量顱內注射病毒KOS、dICP0、OVN或OVH後小鼠的存活率；其中，Vehicle表示未注射病毒的小鼠。
實驗結果顯示，當顱內注射1×10 4PFU野生型病毒KOS時，100%的小鼠會發生中度至重度的副反應；疾病發作後，小鼠常伴有毛髮聳立、厭食、怕冷、行動遲緩甚至癱瘓等症狀；並且，100%的小鼠會在病毒注射後4-6日內死亡（第10圖）。當顱內注射1×10 5PFU的病毒dICP0時，約80%的小鼠會在病毒注射後4-8日內死亡，僅有剩下20%的小鼠在一週後逐漸恢復。
當顱內注射高劑量（1×10 7PFU）的病毒OVN時，在整個實驗週期內，無小鼠（0/10）死亡，小鼠存活率為100%。這表明，與野生型病毒KOS和重組病毒dICP0相比，病毒OVN的神經毒性顯著降低，體內安全性顯著提高，其使用劑量分別可提高至少1000倍和100倍。
當顱內注射更高劑量（4×10 7PFU）的病毒OVN時，在整個實驗週期內，僅一隻小鼠（1/10）死亡，小鼠存活率為90%。這表明，病毒OVN對小鼠的半致死劑量高於4×10 7PFU，具有優良的體內安全性。
當顱內注射4×10 7PFU的病毒OVH時，在整個實驗週期內，無小鼠（0/10）死亡，小鼠存活率為100%。並且，更重要的是，在整個實驗週期內，小鼠未表現出任何不良反應。這表明，相對於病毒OVN，病毒OVH的神經毒性進一步顯著下降，體內安全性進一步顯著提升。
上述實驗結果表明，本發明的病毒OVN和OVH的神經毒性小，體內安全性高，具有廣闊的應用前景。 實施例5. 重組病毒OVN/OVH的治療潛能的評估
在37℃，5% CO 2的培養箱中，在含10%小牛血清的完全培養基中培養腫瘤細胞（Huh7和Hepa1-6）。當細胞生長至對數生長期時，細胞用0.05%的胰酶進行消化，並用PBS進行洗滌，從而獲得重懸於PBS中的細胞懸液（細胞密度為5×10 7個/mL）。
取0.1 mL的Huh7細胞懸液，分別接種於5-6週齡的裸鼠（nude mice）背部右側皮下。當小鼠背部腫瘤生長至6mm×6mm（腫瘤體積約為100mm 3）時，將小鼠分組（n=8/組），並開始給予治療（第0天）。治療方案如下：瘤內注射1×10 7PFU病毒（OVN或OVH）或相同體積的DMEM（用作對照），每3天注射一次，共注射3次。
取0.1 mL的Hepa1-6細胞懸液，分別接種於5週齡正常小鼠（C57BL/6）背部左右兩側皮下。當小鼠背部腫瘤生長至6mm×6mm（腫瘤體積約為100mm 3）時，將小鼠分組，並開始給予治療。治療方案如下：右側瘤內注射1×10 7PFU病毒（OVN或OVH）或相同體積的DMEM，每3天注射一次，共注射3次。
每隔3天監測小鼠狀態，並用電子遊標卡尺測量腫瘤的大小。按照以下公式計算腫瘤體積和抑瘤率： V (volume) =[L×(W) 2]/2；L表示長徑，W表示短徑。
抑瘤率=（對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積）/對照組腫瘤體積×100%。
實驗結果概述於第11圖至第12圖中。
第11圖顯示了接種了Huh7細胞的裸鼠在接受OVN或OVH治療後的腫瘤體積-時間曲線（第11A圖）和存活率-時間曲線（第11B圖）；其中，DMEM表示未接受治療的小鼠。第11A圖的結果顯示，在三次病毒注射後，重組病毒OVN和OVH都顯著抑制了腫瘤的生長；在第21天，OVN的抑瘤率達到86.1%，OVH的抑瘤率達到78%。第11B圖的結果顯示，在三次病毒注射後，重組病毒OVN和OVH都顯著延長了荷瘤裸鼠的生存時間；在第60天，對照組裸鼠完全死亡，而接受重組病毒OVN或OVH的裸鼠在整個實驗結束後，存活率仍達到75%。
第12圖顯示了接種了Hepa1-6細胞的正常小鼠（C57BL/6）在接受OVN或OVH治療後背部左側腫瘤（第12A圖）和背部右側腫瘤（第12B圖）的腫瘤體積-時間曲線；其中，DMEM表示未接受治療的小鼠。第12圖的結果顯示，在右側腫瘤接受三次病毒注射後，重組病毒OVN和OVH不僅安全清除了小鼠背部右側的腫瘤，而且清除了背部左側的腫瘤。
這些實驗結果證實，本發明的病毒OVN和OVH在體內具有顯著的治療腫瘤的潛能，具有廣闊的應用前景。 實施例6. 其他重組病毒的構建和表徵（1）
在本實施例中，基於重組病毒OVN和OVH，構建了一系列衍生的重組病毒。
參照實施例1（特別是1.3.1-1.3.3）中描述的方法，以重組病毒OVN為起始病毒，利用重組質粒將hTERT核心啟動子序列導入重組病毒OVN基因組中，用於調控VP5基因或ICP4基因，從而構建獲得重組病毒OVH1和OVH2。
經測序驗證，與重組病毒OVN相比，重組病毒OVH1基因組中，VP5基因的原生啟動子序列（野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt40729-nt40475）已被替換為hTERT核心啟動子序列（SEQ ID NO: 5）；重組病毒OVH2基因組中，ICP4基因的原生啟動子序列（野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt146151-nt146867以及nt131706-nt130990）已被替換為hTERT核心啟動子序列（SEQ ID NO: 5）。
第13圖示意性展示了重組病毒OVH、OVH1和OVH2與重組病毒OVN的基因組結構差異；其中，與重組病毒OVN相比，重組病毒OVH的ICP27基因的原生啟動子序列、重組病毒OVH1的VP5基因的原生啟動子序列、重組病毒OVH2的ICP4基因的原生啟動子序列分別被替換為hTERT核心啟動子序列。
另外，參照實施例1（特別是1.3.1-1.3.3）中描述的方法，以重組病毒d34.5/0lacZ為起始病毒，利用重組質粒將編碼GFP蛋白（SEQ ID NO: 7）的核苷酸序列和編碼抗人PD-1單鏈抗體（SEQ ID NO: 8）的核苷酸序列分別導入重組病毒d34.5/0lacZ基因組中並替換lacZ基因，從而構建獲得重組病毒OVN-GFP和OVN-PD-1-scfv。經測序驗證，與重組病毒d34.5/0lacZ相比，重組病毒OVN-GFP基因組中，二拷貝的lacZ基因均已被替換為編碼GFP蛋白的核苷酸序列（也即，在重組病毒OVN-GFP的基因組中，野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt510至nt5439區間的序列和nt120802至nt125731區間的序列被替換為編碼GFP蛋白的核苷酸序列）；重組病毒OVN-PD-1-scfv基因組中，二拷貝的lacZ基因均已被替換為編碼PD-1單鏈抗體的核苷酸序列（也即，在重組病毒OVN-PD-1-scfv的基因組中，野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt510至nt5439區間的序列和nt120802至nt125731區間的序列被替換為編碼PD-1單鏈抗體的核苷酸序列）。
進一步，以重組病毒OVN-GFP和OVN-PD-1-scfv為起始病毒，利用質粒PUC57-27p/lacZ和PUC57-27p/htert，將hTERT核心啟動子序列導入起始病毒基因組中，用於調控ICP27基因，從而構建獲得重組病毒OVH-GFP和OVH-PD-1-scfv。
經測序驗證，與重組病毒OVN-GFP相比，重組病毒OVH-GFP基因組中，ICP27基因的原生啟動子序列（野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt113423至nt113589）已被替換為hTERT核心啟動子序列（SEQ ID NO: 5）。與重組病毒OVN-PD-1-scfv相比，重組病毒OVH-PD-1-scfv基因組中，ICP27基因的原生啟動子序列（野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt113423至nt113589）已被替換為hTERT核心啟動子序列（SEQ ID NO: 5）。
第14圖示意性展示了重組病毒d34.5/0lacZ、OVN、OVN-GFP、OVN-PD-1-scfv、OVH-GFP和OVH-PD-1-scfv的基因組結構差異。
以1×10 6個細胞的密度，將U-2 OS細胞（購買於美國ATCC公司，貨號HTB-96™）接種於6cm培養板中。待細胞長成單層後，用重組病毒OVN-GFP和OVH-GFP分別感染細胞。待細胞發生病變後，在螢光顯微鏡下觀察重組病毒OVN-GFP和OVH-GFP感染的細胞。結果如第15圖所示。第15圖顯示了用重組病毒OVN-GFP或OVH-GFP感染的U-2 OS細胞的螢光顯微鏡觀察結果。第15圖的結果顯示，OVN-GFP和OVH-GFP感染的U-2 OS細胞能夠發出綠色螢光。這表明，重組病毒OVN-GFP和OVH-GFP在感染宿主細胞後，能夠表現GFP蛋白。
以1×10 6個細胞的密度，將U-2 OS細胞（購買於美國ATCC公司，貨號HTB-96™）接種於6cm培養板中。待細胞長成單層後，用重組病毒OVH和OVH-PD-1-scfv分別感染細胞。分別於感染24小時和48小時後，收穫細胞的培養上清，用於後續檢測。對感染後48h收集的上清進行系列2倍梯度稀釋，並通過基於PD-1單鏈抗體和PD-L1蛋白競爭結合PD-1蛋白而建立的ELISA方法檢測各個稀釋度的上清抑制PD-1/PD-L1之間的相互作用的能力。另外，還通過基於PD-1單鏈抗體和PD-1蛋白之間的反應性而建立的ELISA方法，測定了感染後24h和48h收集的上清與PD-1之間的相互結合能力。實驗結果如第16圖所示。
第16圖顯示了用重組病毒OVH或OVH-PD-1-scfv感染U-2 OS細胞24h或48h後，細胞上清液抑制PD-1/PD-L1的特異性結合的能力（第16A圖）以及細胞上清液與PD-1蛋白之間的相互作用（第16B圖）的分析結果；其中，MOCK表示未感染病毒的腫瘤細胞。第16圖的結果顯示，OVH-PD-1-scfv感染的U-2 OS細胞的上清液能夠抑制PD-1/PD-L1的特異性結合，並且能夠特異性結合PD-1。這表明，重組病毒OVH-PD-1-scfv在感染宿主細胞後表現了PD-1單鏈抗體，其能夠與PD-1結合，且能夠阻斷PD-1/PD-L1之間的相互作用。
第15圖至第16圖的實驗結果表明，本發明的重組病毒OVN和OVH的基因組可用作病毒載體，用於攜帶和表現外源基因。
另外，還按照實施例5中描述的方法，在接種了Hepa1-6細胞的正常小鼠（C57BL/6）中驗證了重組病毒OVH和OVH-PD-1-scfv治療腫瘤的能力。結果如第17圖所示。
第17圖顯示了接種了Hepa1-6細胞的正常小鼠（C57BL/6）在接受OVH或OVH-PD-1-scfv治療後背部左側腫瘤（第17A圖）和背部右側腫瘤（第17B圖）的腫瘤體積-時間曲線；其中，Vehicle表示未接受治療的小鼠。第17圖的結果顯示，在右側腫瘤接受三次病毒注射後，重組病毒OVH和OVH-PD-1-scfv不僅安全清除了小鼠背部右側的腫瘤，而且清除了背部左側的腫瘤。
這些實驗結果證實，本發明的重組病毒OVH-PD-1-scfv和OVH在體內具有顯著的治療腫瘤的潛能，具有廣闊的應用前景。 實施例7. 其他重組病毒的構建和表徵（2）
在本實施例中，基於重組病毒OVN，構建了一系列衍生的重組病毒。簡言之，參照實施例1（特別是1.3.1-1.3.3）中描述的方法，以重組病毒OVN為起始病毒，利用重組質粒將重組病毒OVN基因組中的非必需基因UL41、UL43、UL48、UL55、US2、LAT或NF分別刪除，從而構建獲得重組病毒OVN-dUL41、OVN-dUL43、OVN-dUL48、OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT和OVN-dNF。
經測序驗證，與重組病毒OVN相比，重組病毒OVN-dUL41基因組中，UL41 (vhs)基因（GenBank: AFE62869.1；對應於野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt91088 - nt92557）已被缺失；重組病毒OVN-dUL43基因組中，UL43基因（GenBank: AFE62871.1；對應於野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt94721 - nt95968）已被缺失；重組病毒OVN-dUL48基因組中，UL48 (VMW65)基因（GenBank: AFE62876.1；對應於野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt103527 - nt104999）已被缺失；重組病毒OVN-dUL55基因組中，UL55基因（GenBank: AFE62884.1；對應於野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt115418 - nt115978）已被缺失；重組病毒OVN-dUS2基因組中，US2基因（GenBank: AFE62890.1；對應於野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt133911 - nt134786）已被缺失；重組病毒OVN-dLAT基因組中，LAT基因（對應於野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt4781 - nt7062）已被缺失；並且，重組病毒OVN-dNF基因組中，核苷酸片段(NF)（對應於野生型HSV-1基因組（GenBank: JQ673480.1）的nt5853 - nt7485）已被缺失。
另外，也可使用CRISPR技術，例如通過設計特異性sgRNA引物，並使用可商購獲得的LentiCRISPR v2載體（Addgene），將重組病毒OVN基因組中的非必需基因UL41、UL43、UL48、UL55、US2、LAT或NF分別刪除。
關於非必需基因UL41、UL43、UL48、UL55、US2、LAT和NF的資訊，還提供於表4中。 表4. 非必需基因的資訊
基因名稱 GenBank No. 基因組中的位置 SEQ ID NO:
UL41 (vhs) AFE62869.1 nt91088-nt92557 17
UL43 AFE62871.1 nt94721-nt95968 18
UL48 (VMW65) AFE62876.1 nt103527-nt104999 19
UL55 AFE62884.1 nt115418-nt115978 20
US2 AFE62890.1 nt133911-nt134786 21
LAT 來自JQ673480.1 nt4781-nt7062 22
核苷酸片段(NF) 來自JQ673480.1 nt5853-nt7485 23
以5-7.5×10 6個細胞/板的密度，將狀態良好、處於對數生長期的腫瘤細胞（U-2 OS細胞）接種於6cm培養板中。隨後，以MOI=0.01的感染複數，用重組病毒OVN、OVN-dUL41、OVN-dUL43、OVN-dUL48、OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT或OVN-dNF分別感染培養的細胞。感染60h後，參照實施例1中描述的方案，測定上述重組病毒的病毒滴度。每組實驗均設置3孔重複，實驗結果為3次獨立實驗的平均值。實驗結果如第18圖所示。
第18圖顯示了以MOI=0.01的感染複數用病毒OVN、OVN-dUL41、OVN-dUL43、OVN-dUL48、OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT或OVN-dNF分別感染U-2 OS細胞60h後的病毒滴度。第18圖的結果顯示，在感染U-2 OS細胞後，病毒OVN、OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT和OVN-dNF均以高水準複製：感染60h後，它們的病毒滴度均在1.01-1.18 × 10 8pfu/ml之間，為10 8pfu/ml量級；而病毒OVN-dUL43、OVN-dUL41和OVN-dUL48均以低水準複製：感染60h後，它們的病毒滴度均低於10 7pfu/ml，為10 4至10 6pfu/ml量級。這些重組病毒的病毒滴度還提供於表5中。 表5：重組病毒感染U-2 OS細胞60h後的病毒滴度
重組病毒 病毒滴度（pfu/ml） 重組病毒 病毒滴度（pfu/ml）
OVN 1.01×10 8± 8.54×10 6 OVN-dUL55 1.05×10 8± 5.00×10 6
OVN-dUL41 1.80×10 5± 2.65×10 4 OVN-dUS2 1.18×10 8± 2.89×10 6
OVN-dUL43 1.83×10 6± 2.89×10 5 OVN-dLAT 1.07×10 8± 5.77×10 6
OVN-dUL48 3.37×10 4± 3.21×10 3 OVN-dNF 1.02×10 8± 7.64×10 6
這些結果表明，病毒OVN、OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT和OVN-dNF能夠在腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）中以高水準複製；而病毒OVN-dUL43、OVN-dUL41和OVN-dUL48在腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）中的複製能力則顯著下降。例如，在U-2 OS細胞中，與病毒OVN相比，病毒OVN-dUL41、OVN-dUL43和OVN-dUL48的複製能力分別下降約561倍、55倍和3×10 3倍。
另外，還以MOI=0.5的感染複數，用重組病毒OVN、OVN-dUL41、OVN-dUL43、OVN-dUL48、OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT或OVN-dNF分別感染培養的正常細胞（L-O2細胞）或腫瘤細胞（U-2 OS細胞）。感染72h後，測定細胞的存活率。每組實驗均設置3孔重複，實驗結果為3次獨立實驗的平均值。實驗結果如第19圖所示。
第19圖顯示了以MOI=0.5的感染複數用病毒OVN、OVN-dUL41、OVN-dUL43、OVN-dUL48、OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT或OVN-dNF分別感染正常細胞（L-O2細胞；第19A圖）或腫瘤細胞（U-2 OS細胞；第19B圖）72h後的細胞存活率。
第19A圖的結果顯示，在感染72h後，病毒OVN-dUL41和OVH-dUL48對L-O2細胞的殺傷率分別為約17.67%和14.33%；二者對L-O2細胞的殺傷能力強於病毒OVN。病毒OVN-dUL43、OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT或OVN-dNF對L-O2細胞的殺傷率均在8.33%-11.00%之間，與病毒OVN無顯著差異。
第19B圖的結果顯示，在感染72h後，病毒OVN、OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT和OVN-dNF均能100%殺傷U-2 OS細胞（即，對腫瘤細胞均具有極強的殺傷能力）。病毒OVN-dUL41、OVN-dUL43和OVN-dUL48殺傷U-2 OS細胞的能力則顯著減弱。
這些重組病毒對L-O2和U-2 OS細胞的殺傷率還提供於表6中。 表6：重組病毒對L-O2細胞和U-2 OS細胞的殺傷率
   殺傷率
重組病毒 L-O2細胞 U-2 OS細胞
OVN 90.00% ± 1.00% 0.87% ± 0.71%
OVN-dUL41 82.33% ± 0.58% 76.00% ± 2.65%
OVN-dUL43 89.00% ± 1.00% 52.67% ± 0.58%
OVN-dUL48 85.67% ± 1.15% 68.33% ± 0.58%
OVN-dUL55 90.33% ± 0.58% 0.90% ± 0.10%
OVN-dUS2 90.67% ± 0.58% 0.77% ± 0.06%
OVN-dLAT 90.33% ± 0.58% 0.46% ± 0.05%
OVN-dNF 91.67% ± 0.58% 0.90% ± 0.10%
這些結果表明，與病毒OVN類似，病毒OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT和OVN-dNF對正常細胞（例如L-O2細胞）僅具有非常有限的殺傷活性，而對腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）具有極高的殺傷活性；這表明，這四株重組病毒與病毒OVN的效果相當。與病毒OVN相比，病毒OVN-dUL41和OVH-dUL48不僅對正常細胞（例如L-O2細胞）的殺傷能力增強，而且對腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）的殺傷能力顯著下降；這表明這兩株重組病毒對正常細胞的毒性增大，抑瘤活性降低。與病毒OVN相比，病毒OVN-dUL43對正常細胞（例如L-O2細胞）的殺傷活性雖然沒有顯著增強，但是對腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）的殺傷活性顯著下降。
具體而言，在正常細胞中，與病毒OVN相比，病毒OVN-dUL41、OVN-dUL43和OVH-dUL48的殺傷能力分別提高約7.67%、1.00%和4.33%。在腫瘤細胞中，與病毒OVN相比，病毒OVN-dUL41、OVN-dUL43和OVH-dUL48的殺傷能力分別降低約75.13%、51.80%和67.46%。
以上實驗結果表明，在本發明的重組HSV病毒中，可對除了UL41、UL43和UL48之外的非必需基因（例如，UL55、US2、LAT和NF）進行進一步的改造，例如在其中引入功能喪失性突變或將其缺失。
儘管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，但本領域技術人員將理解：根據已經揭露的所有教導，可以對細節進行各種修改和變動，並且這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發明的全部範圍由所附申請專利範圍及其任何等同物給出。
無
第1A圖顯示了重組病毒OVN的構建策略。 第1B圖顯示了重組病毒OVH的構建策略。 第2圖示意性展示了重組病毒HSV1716、NV1020、G207、OncoVex GM-CSF（T-VEC）和OVN所包含的基因組修飾；其中，符號“×”表示缺失。 第3圖示意性展示了與病毒株KOS相比，重組病毒OVN、OVH和dICP0所包含的基因組修飾；其中，符號“×”表示缺失。 第4圖顯示了以病毒株KOS、OVN、OVH或dICP0的基因組為範本，用特異性擴增ICP0基因、ICP34.5基因、ICP27基因或hTERT核心啟動子的引物分別進行PCR所獲得的產物的凝膠電泳結果。 第5圖顯示了分析KOS、OVN、OVH或dICP0的IE基因表現（mRNA）的即時定量PCR的實驗結果。 第6圖顯示了以MOI=1的感染複數用病毒KOS、OVN、OVH或dICP0感染L-O2細胞（第6A圖）或U-2 OS細胞（第6B圖）48h後的病毒滴度。 第7圖顯示了以MOI=0.01的感染複數用病毒KOS、OVN、OVH或dICP0感染單層的U-2 OS細胞後不同時間點（感染後12h、24h、36h、48h和60h）的病毒滴度。第7圖的結果顯示，病毒KOS、OVN、OVH或dICP0在腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）中具有基本上相當的複製能力。 第8圖顯示了以MOI=1的感染複數用病毒KOS、OVN、OVH或dICP0感染L-O2細胞（第8A圖）或U-2 OS細胞（第8B圖） 72h後的細胞存活率；其中，MOCK表示未感染病毒的細胞。第8圖的結果顯示，病毒KOS、OVN、OVH和dICP0對腫瘤細胞（例如U-2 OS細胞）具有基本上相當的細胞殺傷能力，但是病毒OVN和OVH對正常細胞（例如L-O2細胞）的細胞殺傷能力顯著低於病毒KOS和dICP0。 第9圖顯示了用病毒OVN或OVH感染各種腫瘤細胞48h後的細胞存活率；其中，MOCK表示未感染病毒的腫瘤細胞。第9圖的實驗結果顯示，重組病毒OVN和OVH可顯著殺傷多種腫瘤細胞。 第10圖顯示了以指定劑量顱內注射病毒KOS、dICP0、OVN或OVH後小鼠的存活率；其中，Vehicle表示未注射病毒的小鼠。 第11圖顯示了接種了Huh7細胞的裸鼠在接受OVN或OVH治療後的腫瘤體積-時間曲線（第11A圖）和存活率-時間曲線（第11B圖）；其中，DMEM表示未接受治療的小鼠。 第12圖顯示了接種了Hepa1-6細胞的正常小鼠（C57BL/6）在接受OVN或OVH治療後背部左側腫瘤（第12A圖）和背部右側腫瘤（第12B圖）的腫瘤體積-時間曲線；其中，DMEM表示未接受治療的小鼠。 第13圖示意性展示了重組病毒OVH、OVH1和OVH2與重組病毒OVN的基因組結構差異；其中，與重組病毒OVN相比，重組病毒OVH的ICP27基因的原生啟動子序列、重組病毒OVH1的VP5基因的原生啟動子序列、重組病毒OVH2的ICP4基因的原生啟動子序列分別被替換為hTERT核心啟動子序列。 第14圖示意性展示了重組病毒d34.5/0lacZ、OVN、OVN-GFP、OVN-PD-1-scfv、OVH-GFP和OVH-PD-1-scfv的基因組結構差異；其中“NULL”表示缺失。 第15圖顯示了用重組病毒OVN-GFP或OVH-GFP感染的U-2 OS細胞的螢光顯微鏡觀察結果。 第16圖顯示了用重組病毒OVH或OVH-PD-1-scfv感染U-2 OS細胞24h或48h後，細胞上清液抑制PD-1/PD-L1的特異性結合的能力（第16A圖）以及細胞上清液與PD-1蛋白之間的相互作用（第16B圖）的分析結果；其中，MOCK表示未感染病毒的腫瘤細胞。 第17圖顯示了接種了Hepa1-6細胞的正常小鼠（C57BL/6）在接受OVH或OVH-PD-1-scfv治療後背部左側腫瘤（第17A圖）和背部右側腫瘤（第17B圖）的腫瘤體積-時間曲線；其中，Vehicle表示未接受治療的小鼠。 第18圖顯示了以MOI=0.01的感染複數用病毒OVN、OVN-dUL41、OVN-dUL43、OVN-dUL48、OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT或OVN-dNF分別感染U-2 OS細胞60h後的病毒滴度。 第19圖顯示了以MOI=0.5的感染複數用病毒OVN、OVN-dUL41、OVN-dUL43、OVN-dUL48、OVN-dUL55、OVN-dUS2、OVN-dLAT或OVN-dNF分別感染正常細胞（L-O2細胞；第19A圖）或腫瘤細胞（U-2 OS細胞；第19B圖）72h後的細胞存活率。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (19)

  1. 一種重組HSV病毒，其不表現功能性ICP0蛋白和ICP34.5蛋白；但能夠表現功能性UL43蛋白，功能性UL41蛋白和功能性UL48蛋白；其中，該重組HSV病毒為重組HSV-2病毒；並且，其中，該重組HSV病毒的基因組包含下述修飾：2個拷貝的ICP0基因各自獨立地包含功能喪失性突變或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列；並且，2個拷貝的ICP34.5基因各自獨立地包含功能喪失性突變或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列。
  2. 如請求項1所述的重組HSV病毒，其中，在該重組HSV病毒的基因組中，對於該2個拷貝的ICP0基因：(a1)一個拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變，並且另一個拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列；或者(b1)一個拷貝的ICP0基因被缺失，並且另一個拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列；或者(c1)一個拷貝的ICP0基因被置換為外源核苷酸序列，並且另一個拷貝的ICP0基因包含功能喪失性突變或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列；並且對於該2個拷貝的ICP34.5基因：(a2)一個拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變，並且另一個拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列；或者 (b2)一個拷貝的ICP34.5基因被缺失，並且另一個拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列；或者(c2)一個拷貝的ICP34.5基因被置換為外源核苷酸序列，並且另一個拷貝的ICP34.5基因包含功能喪失性突變或者被缺失或者被置換為外源核苷酸序列。
  3. 如請求項1所述的重組HSV病毒，其中，在該重組HSV病毒的基因組中，(1)第一拷貝的ICP0基因包含第一功能喪失性突變，第二拷貝的ICP0基因包含第二功能喪失性突變；並且，第一拷貝的ICP34.5基因包含第三功能喪失性突變，第二拷貝的ICP34.5基因包含第四功能喪失性突變；或者(2)第一拷貝的ICP0基因包含第一功能喪失性突變，第二拷貝的ICP0基因包含第二功能喪失性突變；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失；或者(3)第一拷貝的ICP0基因包含第一功能喪失性突變，第二拷貝的ICP0基因包含第二功能喪失性突變；並且，第一拷貝的ICP34.5基因被置換為第三外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP34.5基因被置換為第四外源核苷酸序列；或者(4)該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，第一拷貝的ICP34.5基因包含第三功能喪失性突變，第二拷貝的ICP34.5基因包含第四功能喪失性突變；或者(5)該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失；或者(6) 該2個拷貝的ICP0基因被缺失；並且，第一拷貝的ICP34.5基因被置換為第三外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP34.5基因被置換為第四外源核苷酸序列；或者 (7) 第一拷貝的ICP0基因被置換為第一外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP0基因被置換為第二外源核苷酸序列；並且，第一拷貝的ICP34.5基因包含第三功能喪失性突變，第二拷貝的ICP34.5基因包含第四功能喪失性突變；或者 (8) 第一拷貝的ICP0基因被置換為第一外源核苷酸序列，而第二拷貝的ICP0基因被置換為第二外源核苷酸序列；並且，該2個拷貝的ICP34.5基因被缺失；或者 (9) 第一拷貝的ICP0基因被置換為第一外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP0基因被置換為第二外源核苷酸序列；並且，第一拷貝的ICP34.5基因被置換為第三外源核苷酸序列，第二拷貝的ICP34.5基因被置換為第四外源核苷酸序列。
  4. 如請求項3所述的重組HSV病毒，其中， 該第一功能喪失性突變、第二功能喪失性突變、第三功能喪失性突變和第四功能喪失性突變各自獨立地選自錯義突變、無義突變、移碼突變、鹼基缺失、鹼基置換和鹼基添加；和/或， 該第一外源核苷酸序列、第二外源核苷酸序列、第三外源核苷酸序列和第四外源核苷酸序列各自獨立地編碼選自下列的外源蛋白：一螢光蛋白、一免疫調節多肽、一細胞因數、一趨化因數、一抗體和一細胞毒性肽。
  5. 如請求項4所述的重組HSV病毒，其中，該重組HSV病毒具有選自下列的一項或多項特徵： （1）該螢光蛋白選自綠色螢光蛋白，紅色螢光蛋白，藍色螢光蛋白和黃色螢光蛋白； （2）該免疫調節多肽選自CD40L、OX40L、可誘導共刺激分子、FTL3L、LIGHT、CD137L、CD70、4-1BB、GITR和CD28； （3）該細胞因數選自白介素、干擾素、腫瘤壞死因數和集落刺激因數； （4）該趨化因數選自CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20和XCL-1； （5）該細胞毒性肽選自胸苷激酶TK、TRAIL和FasL； （6）該抗體選自抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA-4抗體、抗Tim-3抗體、抗Lag-3抗體、抗CD137抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體、抗CD73抗體、抗KIR抗體、抗ICOS抗體、抗CSF1R抗體、抗EGFR抗體、抗VEGFR抗體、抗HER2抗體和抗PDGFR抗體。
  6. 如請求項5所述的重組HSV病毒，其中，該重組HSV病毒的基因組包含能夠表現功能性UL43蛋白的UL43基因，能夠表現功能性UL41蛋白的UL41基因，和/或，能夠表現功能性UL48蛋白的UL48基因。
  7. 如請求項6所述的重組HSV病毒，其中，該重組HSV病毒還具有選自下列的一個或複數個特徵： （1）一個或複數個非必需基因被缺失或突變； （2）該重組HSV病毒的必需基因未被缺失，且不包含功能喪失性突變； （3）除了2個拷貝的ICP0基因和2個拷貝的ICP34.5基因之外，該重組HSV病毒的基因組含有野生型HSV病毒的所有其他基因，並且該其他基因均不包含功能喪失性突變；和 （4）該重組HSV病毒的基因組還包含下述修飾：一個或複數個HSV基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子。
  8. 如請求項7所述的重組HSV病毒，其中，該重組HSV病毒還具有選自下列的一個或複數個特徵： （1）該非必需基因選自UL3基因，UL4基因，UL14基因，UL16基因，UL21基因，UL24基因，UL31基因，UL32基因，US3基因，UL51基因，UL55基因，UL56基因，US2基因，US12基因，LAT基因以及對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段； （2）該非必需基因包含功能喪失性突變，或者被置換為外源核苷酸序列； （3）該必需基因選自ICP27基因、ICP4基因、VP5基因、gL基因、gH基因、gD基因、gK基因、gB基因、gN基因、UL5基因、UL6基因、UL8基因、UL9基因、UL12基因、UL25基因、UL26基因、UL28基因、UL29基因、UL30基因、UL33基因、UL36基因、UL38基因、UL42基因、UL48基因和UL52基因；和 （4）該腫瘤特異性啟動子為hTERT啟動子。
  9. 如請求項6所述的重組HSV病毒，其中，該重組HSV病毒的基因組還包含有選自下述的一項或多項修飾： (1) VP5基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子； (2) ICP27基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子； (3) ICP4基因的原生啟動子被替換為腫瘤特異性啟動子；和 (4) UL55基因、US2基因、LAT基因和對應於JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一個或複數個被缺失或突變。
  10. 如請求項1至請求項9中任一項所述的重組HSV病毒，其中，該重組HSV病毒還包含第五外源核苷酸序列。
  11. 一種病毒載體，其包含如請求項1至請求項10中任一項所述的重組HSV病毒的基因組或者由如請求項1至請求項10中任一項所述的重組HSV病毒的基因組組成。
  12. 一種宿主細胞，其感染了如請求項1至請求項10中任一項所述的重組HSV病毒，或者包含有如請求項1至請求項10中任一項所述的重組HSV病毒的基因組，或者轉染了如請求項11所述的病毒載體。
  13. 如請求項12所述的宿主細胞，其中，該細胞為腫瘤細胞。
  14. 如請求項12所述的宿主細胞，其中，該細胞選自肺癌細胞，肝癌細胞，乳腺癌細胞，骨肉瘤細胞，卵巢癌細胞，宮頸癌細胞，前列腺癌細胞，神經膠質瘤細胞，黑色素瘤細胞，結直腸癌細胞，和胰腺癌細胞。
  15. 一種獲得如請求項1至請求項10中任一項所述的重組HSV病毒的方法，其包括： （1）培養根據如請求項12至請求項14中任一項所述的宿主細胞； （2）待該宿主細胞發生病變後，收集和裂解該宿主細胞，以獲得該宿主細胞的裂解液；和 （3）從該裂解液中回收該重組HSV病毒。
  16. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至請求項10中任一項所述的重組HSV病毒，或者如請求項1至請求項10中任一項所述的重組HSV病毒的基因組，或者如請求項11所述的病毒載體，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
  17. 如請求項16所述的藥物組合物，其中，該藥物組合物具有選自下列的一項或多項特徵： （1）該藥物組合物用於治療腫瘤； （2）該藥物組合物為注射液或凍幹粉劑； （3）該藥物組合物包含治療有效量的該重組HSV病毒或重組HSV病毒的基因組或病毒載體； （4）該藥物組合物以單位劑量形式存在；和 （5）每單位劑量的藥物組合物中包含10 2-10 9pfu的重組HSV病毒。
  18. 一種如請求項1至請求項10中任一項所述的重組HSV病毒或者如請求項11所述的病毒載體用於製備藥物組合物的用途，該藥物組合物用於治療一受試者的腫瘤。
  19. 如請求項18所述的用途，其具有選自下列的一項或多項特徵： （1）該腫瘤選自肺癌，肝癌，乳腺癌，骨肉瘤，卵巢癌，前列腺癌，神經膠質瘤，黑色素瘤，結直腸癌，和胰腺癌； （2）該受試者是哺乳動物；和 （3）該受試者是人。
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