JP2013514784A - 単純ヘルペスウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、陰部ヘルペスに対して患者を免疫するためのワクチンにおいて使用され得る単純ヘルペスウイルス２型に関する。一実施形態において、本発明は、複製欠損性ドミナントネガティブ単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）組換えウイルスを提供し、このウイルスは、そのゲノム内に、ａ）第１のＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）をコードする第１の配列であって、ここで該配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され、該第１のプロモーターは、第１のテトラサイクリンオペレーター（Ｔｅｔ−Ｏ）配列に作動可能に連結されている、第１の配列などを含む。

Description

（関連出願の引用）
この出願は、２００９年１２月２１日に出願された米国仮出願第６１／２８８，８３６号に対する優先権およびその利益を主張する。この先の出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。

（発明の分野）
本発明は、主に、慢性陰部潰瘍と関連した単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）感染に対して患者を免疫するために使用され得るワクチンに関する。上記ワクチンは、高レベルのＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄ抗原（ｇＤ２）を発現するように操作された複製欠損性ＨＳＶ−２ウイルスを利用する。好ましい実施形態において、上記ＨＳＶ−２ウイルスはまた、１個以上の免疫調節遺伝子（例えば、ＩＬ１５および／またはＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２の主要抗原（例えば、ｇＢもしくはｇＣ））を発現する。

（発明の背景）
（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびＨＳＶ感染）
単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）は、陰部潰瘍疾患の主要原因である。ＨＳＶ−２は、急性の増殖性感染および予測できない周期的再発によって特徴付けられる長期潜伏性の感染の両方を引き起こし得る（６６、非特許文献１）。一生の、再発性の陰部潰瘍を引き起こすことに加えて、ＨＳＶ感染は、ＡＩＤＳ患者において大きな懸念事項である。性器ＨＳＶ−２感染は、性行為によるＨＩＶ感染（ｓｅｘｕａｌｌｙ ａｃｑｕｉｒｉｎｇ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のリスクを３倍にし（２０、非特許文献２）、アフリカでは、このリスク増加は、付帯的なＨＩＶ感染のうちの２５〜３５％の一因となり得る（１）ことが実証された。

最も症候性であるＨＳＶ一次感染（ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の重篤度および持続期間は、アシクロビル、バラシクロビル、もしくはファムシクロビルでの経口処置もしくは静脈内処置によって減少させられ得るが、抗ウイルス治療は、一次感染からの潜伏感染の確立を妨げもせず、その後の再発を低下させもしない（６６、非特許文献１）。過去２０年間にわたって米国で陰部ヘルペスが継続して拡大していること（１９）および近年の抗ウイルス薬物療法に耐性のＨＳＶの発生率が増大しつつあることから、ＨＳＶ感染に対する安全かつ効果的なワクチンが必要であることが示唆される（３１，６０）。さらに、ＨＳＶ抑制治療が、ＨＳＶ−２およびＨＩＶの両方に感染した女性の性器粘膜および血漿におけるＨＩＶのレベルの顕著な低下をもたらすという知見（５２）は、有効なＨＳＶワクチンがまた、ＨＩＶ感染の制御において大きな影響を有し得ることを示唆する（１，３１）。

（ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２））
ＨＳＶ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）は、感染細胞の表面に（２１）およびウイルスエンベロープ（２４）に発現される最も優勢なウイルス抗原のうちの１つである。ｇＤは、ウイルスが細胞へ入るのに必須であり、ＨＳＶ感染に対する中和抗体の主要な標的である（１２，４９，５３）。さらに、ｇＤは、ＨＳＶ感染のヒトおよびマウスモデルにおいて、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞（ＣＤ４^＋ Ｔ細胞細胞傷害性を含む）およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の優勢なウイルス標的である（２７，２８，３０，３４，４７，６５，７５）。これら理由から、ｇＤは、ＨＳＶサブユニットワクチン開発の主な焦点であった（３２，６０）。

フェーズ３臨床試験において、Ｓｔａｎｂｅｒｒｙらは、アジュバントＡＳ０４と組み合わせた、ＨＳＶ−２由来の組換えｇＤ（ｇＤ２）でのワクチン接種が、ＨＳＶ−セロネガティブの女性における陰部ヘルペス疾患の発生に対する保護において７３〜７４％の効力を提供することを示した（６２）。しかし、男性において、およびＨＳＶ−１に対してセロポジティブであった被験体においては、顕著な効力は認められなかった。ｇＤ２特異的液性応答およびＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は、上記免疫された宿主において検出されたが、ｇＤ２／ＡＳ０４がＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を惹起することにおいて有効であったか否かは、明らかでない（３１，３２）。この研究から、ｇＤ２および他のＨＳＶウイルス抗原の両方に対する、より広い液性応答、ならびにＣＤ４ Ｔ細胞応答およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を惹起するＨＳＶワクチンが必要であることが示唆される（２９，３１，３２）。

（ウイルスワクチン）
上記宿主において免疫原をデノボ合成する能力がある生ウイルスワクチンは、ペプチドもしくはタンパク質のみからなるワクチンより、広くかつ持続性の免疫応答を誘導することが十分に実証されている。複製欠損性ＨＳＶおよび神経系弱毒化（ｎｅｕｒｏａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）された複製能のある変異体の種々の形態が開発されてきており、ＨＳＶ感染に対するワクチンにおける可能性として試験されてきた（特許文献１；（１８））。

複製欠損性ウイルスおよび神経系弱毒化変異体の両方が、野生型ウイルスとともに同時に複製し得るか、または野生型ウイルスの状況において複製能のある状態になり得るので、ヒトにおけるそれらのワクチンとしての使用は、特に、潜伏性ＨＳＶ感染を有する個体において安全上の懸念事項を提起する（３３）。複製欠損性ＨＳＶ−１変異体が、齧歯類の脳において上記潜伏性ＨＳＶ−１最初期プロモーターを再活性化させ得るという観察は、このような組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）が潜伏性に感染した個体における増殖性ウイルス感染の大発生を誘発する可能性についてさらなる安全上の懸念事項を惹起した（６３）。従って、望ましい複製欠損性組換えＨＳＶワクチンは、ウイルスによってコードされた抗原の広いスペクトルを発現する能力を有すべきだけでなく、同じ細胞内で遭遇した場合に、野生型ＨＳＶの溶解感染（ｌｙｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を妨げ得る特有の機能もまたコードすべきである。このような安全上の機構は、上記ワクチンベクターの、上記宿主において野生型ウイルスとの組換えによって引き起こされる、上記ワクチンウイルスの潜在的な大発生を最小限にする。

米国特許第７，２２３，４１１号明細書

Ｗｈｉｔｌｅｙら、Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ（１９９８）２６：５４１〜５３；ｑｕｉｚ ５５４〜５ Ｆｒｅｅｍａｎら、Ａｉｄｓ（２００６）２０：７３〜８３

一般に、本発明は、ＨＳＶ−２感染に対する安全かつ有効な組換えウイルスワクチンを開発するための、テトラサイクリン遺伝子−スイッチ技術（Ｔ−ＲＥｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（７３）および上記ＨＳＶ−１ ＵＬ９ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体形態（例えば、ＵＬ９−Ｃ５３５Ｃ）の使用に基づく。

その第１の局面において、本発明は、複製欠損性ドミナントネガティブ単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）組換えウイルスに関する。上記ウイルスのゲノムは、少なくとも、第１のＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）をコードする第１の配列（これは、第１のプロモーターに作動可能に連結されている）、および好ましくは、第２のＨＳＶ−２ ｇＤ２をコードする第２の配列（これは、第２のプロモーターに作動可能に連結されている）を有する。上記プロモーターは、それぞれ、第１のテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔ−Ｏ）配列および第２のｔｅｔ−Ｏ配列に作動可能に連結されており、これらの各々は、ｔｅｔリプレッサーがない場合に転写を進行させるが、リプレッサーによって結合される場合に転写をブロックする。上記ゲノムはまた、少なくとも、上記ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２のＵＬ９タンパク質の第１のドミナントネガティブ変異体形態をコードする第３の配列（これは、第３のプロモーターに連結されている）、および好ましくは、上記ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２のＵＬ９タンパク質の第２のドミナントネガティブ形態をコードする第４の配列（これは、第４のプロモーターに連結されている）を含む。上記第１のおよび第２のプロモーターと同様に、上記第３のおよび第４のプロモーターは、ｔｅｔ−Ｏ配列に各々作動可能に連結されており、これらは、ｔｅｔリプレッサーによって結合される場合、転写をブロックする。さらに、上記ウイルスのゲノムは、機能的ＩＣＰ０タンパク質をコードする配列の非存在によって特徴付けられる。その抗原性を増強させるために、上記ゲノムはまた、好ましくは、免疫調節遺伝子（例えば、ＩＬ１２もしくはＩＬ１５および／またはＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２の主要抗原（例えば、ｇＢもしくはｇＣ）を発現すべきである。

用語「作動可能に連結される」とは、通常の機能を遂行させる様式で、一緒に結合される遺伝的エレメントに言及する。例えば、遺伝子は、その転写が、プロモーターの制御下にありかつこの転写が、上記遺伝子によって通常コードされる生成物の生成を生じる場合に、上記プロモーターに作動可能に連結されている。ｔｅｔオペレーター配列は、上記オペレーターが、結合したｔｅｔリプレッサーの存在下で上記プロモーターからの転写をブロックするが、上記リプレッサーの非存在下で転写を可能にする場合に、プロモーターに作動可能に連結されている。用語「組換え」とは、ときおり、核酸配列および配列エレメントの組換え、およびこれら組換わった配列の、上記ウイルスへのもしくは祖先ウイルスへの導入によって形成された核酸配列を有するウイルスに言及する。

好ましくは、上記使用されるプロモーターは、ＴＡＴＡエレメントを有するものであり、上記プロモーターに連結された上記ｔｅｔオペレーター配列は、２〜２０個の間の連結するヌクレオチドによって一緒に繋げられた２個のｏｐ２リプレッサー結合部位を有する。上記オペレーター配列の配置は、上記プロモーターを超えて有効な制御を達成するために重要である。具体的には、上記オペレーター配列における第１のヌクレオチドは、上記ＴＡＴＡエレメントにおける最後のヌクレオチドに対して６〜２４ヌクレオチド、３’側に配置されなければならない。例えば、ｇＤもしくはＵＬ９のドミナントネガティブ変異体ポリペプチドをコードする構造配列は、上記オペレーターに対して３’側にある。具体的に好ましいプロモーターの中には、上記ｈＣＭＶ最初期プロモーターおよびＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２の最初期プロモーターがある。特に好ましいのは、ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２のＩＣＰ４プロモーターである。

別の局面において、本発明は、ＨＳＶ発現に対して予防的にもしくは治療的に使用され得、単位用量形態において上記の組換えウイルスのうちの１種以上を含むワクチンに関する。用語「単位用量形態」とは、単一の薬物投与実体（例えば、錠剤もしくはカプセル剤）に言及する。好ましくは、上記「単位用量形態」は、選択された容積（単位用量）が注射によって患者に投与される場合に治療的効果もしくは予防的効果を提供する濃度で薬物が溶解される溶液であり、注射バイアル内で見いだされる。マウスにおいて使用される有効用量（２×１０^６ ＰＦＵ）に基づくと、ヒトにおける最小有効用量は、約１×１０^７ ｐｆｕであるはずだと考えられる。従って、単位用量は、少なくともこの量のウイルスを有するはずであり、１×１０^７〜１×１０^９ ｐｆｕが代表的である。ワクチンは、凍結乾燥形態で貯蔵され得、投与前に薬学的に受容可能なキャリア中で再構成され得る。あるいは、調製物は、ビヒクル自体の中に貯蔵され得る。上記ワクチンの単一用量の容積は変動するが、一般に、約０．１ｍｌ〜１０ｍｌの間、およびより代表的には、約０．２ｍｌ〜５ｍｌの間であるべきである。

本発明はまた、ＨＳＶ−１感染もしくはＨＳＶ−２感染およびこのような感染から生じる状態（例えば、陰部ヘルペス潰瘍）に対して患者を免疫する方法を包含し、上記方法は、上記のワクチンを上記患者に投与することによる。上記ワクチンはまた、上記ウイルスの大発生を予防もしくは低下させるために、感染した患者に与えられ得る。ウイルスの破壊を生じない患者にワクチンを投与するための任意の方法は、本発明と適合する。一般に、投与は、非経口的手段による（例えば、筋肉内注射もしくは静脈内注射による）。ワクチンの投与および投与の予定作成は、当該分野で慣用的な方法を使用して決定され得る。上記調製物は、１回もしくは複数回いずれかの注射において投与され得る。

図１Ａは、ドミナントネガティブおよび複製欠損性ＨＳＶ−２組換え体Ｎ２−Ｃ５３５ＣおよびＣＪ２−ｇＤ２の構築のために使用されるプラスミドの模式図を示す。プラスミドｐＨＳＶ−２／ＩＣＰ０は、上記ＨＳＶ−２ ＩＣＰ０オープンリーディングフレーム（灰色のボックス）の２６８ｂｐ上流からＩＣＰ０コード配列のポリＡシグナルの４０ｂｐ下流を網羅する上記ＨＳＶ−２ ＩＣＰ０配列を含むプラスミドである。Ｘｈｏ Ｉ-ＩＣＰ０ ＤＮＡフラグメントを含む配列をＸｈｏ Ｉを含むマルチクローニング配列（ＭＣＳ）で置換することによって、ｐＨＳＶ２．ＩＣＰ０−Ｖを構築した。ＬａｃＺ遺伝子（斜線が入ったボックス）をｐＨＳＶ２．ＩＣＰ０−ＶのＭＣＳ領域に挿入することによって、ｐＨＳＶ２．ＩＣＰ０−ｌａｃＺを作製した。ｐＨＳＶ２．ＩＣＰ０−ｌａｃＺの示されたｌａｃＺを含むフラグメントを、上記ｔｅｔＯを含むｈＣＭＶ主要最初期プロモーター（縦線が入ったボックス，ＣＭＶＴＯ）の制御下にあるＵＬ９−Ｃ５３５Ｃ（黒塗りのボックス）をコードするＤＮＡ配列で置換することによって、ｐ０２ｌａｃＺ−ＴＯＣ５３５Ｃを構築した。ｐ０２ｌａｃＺＴＯ−Ｃ５３５Ｃの示されたＳｎａＢ Ｉ／Ｐｓｔ Ｉフラグメントを、上記ｔｅｔＯを含むＨＳＶ−１最初期ＩＣＰ４プロモーター（白抜きのボックス，ＩＣＰ４ＴＯ）の制御下にあるｇＤ２遺伝子（グラデーションを付けたボックス）をコードするＤＮＡ配列で置換することによって、ｐ０２ｌａｃＺＴＯ−ｇＤ２．Ｃ５３５Ｃを構築した。図１Ｂは、野生型ＨＳＶ−２、ＨＳＶ−２ ＩＣＰ０ヌル変異体（Ｎ２−ｌａｃＺ）、Ｎ２−Ｃ５３５ＣおよびＣＪ２−ｇＤ２のゲノムの模式図を示す。ＵＬおよびＵＳは、それぞれ、上記ＨＳＶ−２ゲノムの特有の長い領域および特有の短い領域を表し、これらには、それらの対応する逆方向反復領域（白抜きのボックス）が隣接している。上記ＩＣＰ０コード配列の両方のコピーの、Ｎ２−ｌａｃＺにおける上記ｌａｃＺ遺伝子で、ならびに（１）Ｎ２−Ｃ５３５Ｃにおける上記ｔｅｔＯを有するｈＣＭＶ主要最初期プロモーターの制御下にあるＵＬ９−Ｃ５３５ＣをコードするＤＮＡ配列、および（２）反対の配向にある示されたｔｅｔＯを有するプロモーターの下にあるＵＬ９−Ｃ５３５ＣおよびｇＤ２の両方をコードするＤＮＡ配列での置換は、上記ＨＳＶ−２ゲノムの拡がったＩＣＰ０コード配列の下に示される。 図２Ａおよび２Ｂは、Ｖｅｒｏ細胞のＣＪ２−ｇＤ２感染後のｇＤ２およびＵＬ９−Ｃ５３５Ｃの高レベル発現を示す。図２Ａにおいて、二連のＶｅｒｏ細胞に、模擬感染（ｍｏｃｋ−ｉｎｆｅｃｔ）させたか、または１０ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて野生型ＨＳＶ−２、Ｎ２−ｌａｃＺ、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃ、もしくはＣＪ２−ｇＤ２のいずれかを感染させた。感染細胞の抽出物を、感染後９時間で調製した。図２Ｂにおいて、Ｖｅｒｏ細胞に、１０ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで、野生型ＨＳＶ−１株 ＫＯＳ、ＣＪ９−ｇＤ、野生型ＨＳＶ−２、もしくはＣＪ２−ｇＤ２を感染させた。感染細胞の抽出物を、感染後９時間で調製した。感染細胞抽出物中のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、続いて、ＨＳＶ−１ ｇＤに対するポリクローナル抗体（Ｒ４５）、ＵＬ９に対するポリクローナル抗体、またはＩＣＰ２７およびｇＢに対して特異的なモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）でイムノブロットした。 図３は、ＣＪ２−ｇＤ２感染ＶＣＥＰ４Ｒ−２８細胞におけるｔｅｔＲによるｇＤ２発現およびＵＬ９−Ｃ５３５Ｃ発現の調節を示す。ＶＣＥＰ４Ｒ−２８細胞を、６０−ｍｍディッシュあたり５×１０^５細胞で播種した。播種後４０時間で、二連の細胞に、テトラサイクリンの存在下もしくは非存在下のいずれかで、模擬感染させたか、または野生型ＨＳＶ−２もしくはＣＪ２−ｇＤ２を、１０ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて感染させた。感染細胞の抽出物を、感染後９時間において調製し、続いて、ＨＳＶ ｇＤおよびＵＬ９に対するポリクローナル抗体、およびＩＣＰ２７に対して特異的なモノクローナル抗体でイムノブロットした。 図４Ａおよび図４Ｂは、野生型ＨＳＶ−２の複製に対するＣＪ２−ｇＤ２のトランス−ドミナントネガティブ効果を示す。図４Ａにおいて、三連のＶｅｒｏ細胞に、２ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて野生型ＨＳＶ−２株１８６、２ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて１８６および５ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいてＣＪ２−ｇＤ２、または２ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて１８６および５ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいてＮ２−ｌａｃＺ、のいずれかを感染させた。図４Ｂにおいて、Ｖｅｒｏ細胞に、５ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて野生型ＨＳＶ−２で単一に感染させるか、両方のウイルスに関して５ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて１８６およびＣＪ２−ｇＤ２で同時に感染させるか、または１５ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて１８６で単一に感染させ、そして１５ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて１８６で、かつ５ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいてＣＪ２−ｇＤ２で同時に感染させた。感染細胞を感染後１８時間で採取し、ウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞単層に対して決定した。ウイルス力価を、平均±ＳＤとして表す。上記グラフの上の数字は、単一の感染と同時感染との間の野生型ウイルス収量における倍数での低減（ｆｏｌｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を示す。 図５Ａおよび図５Ｂは、脳内接種後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける野生型ＨＳＶ−２、株１８６、Ｎ２−ｌａｃＺ、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃ、およびＣＪ２−ｇＤ２の神経毒性を示す。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢）を、５群（各々８匹）に無作為に割り当てた。マウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔し、ＤＭＥＭ、２５ ＰＦＵ／マウスの野生型ＨＳＶ−２株１８６、１×１０^６ ＰＦＵ／マウスのＮ２−ｌａｃＺ、２．５×１０^６ ＰＦＵ／マウスのＣＪ２−ｇＤ２もしくはＮ２−Ｃ５３５Ｃのいずれかを、深さ４ｍｍにおいて容積２０μｌで脳の左前頭葉に脳内注射を介して接種した。マウスを、接種後３５日間にわたって疾患の徴候および症状について試験した。図５Ａは、注射後の種々の日数での疾患スコアを示し、図５Ｂは、マウス生存のパーセンテージを示す。 図６Ａおよび図６Ｂは、ｇＤ２特異的抗体およびＨＳＶ−２中和応答の誘導と関連する。雌性の４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＤＭＥＭで偽免疫したか（ｎ＝７，６，８，８）、またはＣＪ２−ｇＤ２（ｎ＝７，６，８，８）、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃ（ｎ＝７，８，６）、もしくはＣＪ９−ｇＤ（ｎ＝６，８，６）を２×１０^６ ＰＦＵ／マウスの用量のいずれかで免疫し、２週間後に追加免疫した。初回免疫の４〜５週間後に、マウスの尾静脈から血液を採取した。図６Ａにおいて、マウスの個々の群からの血清を、プールし、熱不活化した。ＨＳＶ−２特異的中和抗体力価を決定した。結果は、平均力価±ＳＥＭを表す。図６Ｂにおいて、偽免疫マウス、ＣＪ２−ｇＤ２免疫マウス、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃ免疫マウス、もしくはＣＪ９−ｇＤ免疫マウスに由来する血清を、ｇＤ２発現プラスミドｐ０２．４ＴＯ−ｇＤ２でトランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞から調製した細胞抽出物とともにインキュベートした。ｇＤ／マウスＩｇＧ特異的複合体を、プロテインＡで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ｇＤ特異的ポリクローナル抗体Ｒ４５でプローブした。 図７Ａ〜７Ｄは、ＣＪ２−ｇＤ２免疫マウスにおけるＨＳＶ−２特異的ＣＤ４^＋ およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答の誘導に関する。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、偽免疫したか、もしくは２週間間隔で２×１０^６ ＰＦＵ／マウスにおいてＣＪ２−ｇＤ２を２回免疫したかのいずれかであった。図７Ａおよび図７Ｂにおいて、偽免疫したマウスおよび免疫したマウスは、追加免疫後９〜１０週間において、模擬感染させたか、または野生型ＨＳＶ−２を１×１０^４ ＰＦＵ／マウスの用量において皮下感染させたかのいずれかであった（ｎ＝３）。上記ＣＤ４^＋ およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を、ＤｙｎａｌマウスＣＤ４−およびＣＤ８−ネガティブキットを使用して、マウス脾臓から単離した、個々に精製したＣＤ４^＋ およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞でのＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後５日目に分析した。図７Ｃおよび図７Ｄにおいて、偽免疫したマウスおよびＣＪ２−ｇＤ２免疫したマウスを、追加免疫後５〜６週間において、模擬感染させたか、または野生型ＨＳＶ−２に感染させ、続いて、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを感染後４日目に行った（ｎ＝３）。ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を、平均±ＳＥＭ／百万個のＣＤ４^＋ もしくはＣＤ８^＋ Ｔ細胞として表した。 図８は、ＣＪ２−ｇＤ２で免疫したマウスにおける抗原投与したＨＳＶ−２の膣での複製の低下を示す。雌性の４〜６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを、４群（各１０匹のマウス）に無作為に割り当てた。マウスは、ＤＭＥＭで偽免疫したか、または２×１０^６ ＰＦＵ／マウスの用量でＣＪ２−ｇＤ２、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃ、もしくはＣＪ９−ｇＤで免疫したかのいずれかであった。マウスを２週間後に追加免疫した。５週間目に、マウスをメドロキシプロゲステロンで予備処置し、５×１０^５ ＰＦＵのＨＳＶ−２株Ｇで膣内抗原投与した。膣スワブを、抗原投与後１日目、２日目、３日目、５日目、および７日目に採取した。スワブ材料における感染性ウイルスを、Ｖｅｒｏ細胞単層に対する標準的プラークアッセイによって評価した。ウイルス力価を、個々の膣スワブにおける平均±ＳＥＭとして表す。 図９Ａおよび図９Ｂは、ＣＪ２−ｇＤ２で免疫したマウスにおけるＨＳＶ−２疾患の予防を示す。野生型ＨＳＶ−２での抗原投与後、図８の凡例に記載される個々のマウスを、性器ＨＳＶ−２疾患および播種性のＨＳＶ−２疾患の発生率（図９Ａ）および生存（図９Ｂ）について、以下のスケールを使用して、２１日間の追跡期間の間に観察した：０＝徴候なし、１＝わずかに性器の紅斑および浮腫、２＝中程度の性器炎症、３＝化膿した性器病変および／もしくは全身の疾患、４＝後肢麻痺、５＝死亡。 図１０は、ＨＳＶ−１ ＵＬ９−Ｃ５３５Ｃコード配列（配列番号２）を示す。ＵＬ９−Ｃ５３５Ｃは、ＵＬ９アミノ酸１〜１０、Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙトリペプチド、およびＵＬ９のアミノ酸５３５〜８５１からなる（Ｙａｏら，（６９）を参照のこと）。

（発明の詳細な説明）
本発明は、複製欠損性であり、野生型ＨＳＶ感染を阻害し得る（ドミナントネガティブ）ＨＳＶ組換えウイルスを開発するために、テトラサイクリン遺伝子−スイッチ技術およびＨＳＶ−１ ＵＬ９のドミナントネガティブ変異体ポリペプチドを使用するという概念に基づく。ＣＪ９−ｇＤは、プロトタイプのドミナントネガティブで複製欠損性のＨＳＶ−１組換えウイルスであり、ＨＳＶウイルスＤＮＡ複製とは無関係に高レベルのＨＳＶ−１主要抗原である糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）を発現する（７）。その最も好ましい形態において、本発明は、上記ｔｅｔＯを有するＨＳＶ−１主要最初期ＩＣＰ４プロモーターによって駆動される、上記ＨＳＶ−２ ｇＤ（ｇＤ２）遺伝子の２コピーをコードするドミナントネガティブおよび複製欠損性のＨＳＶ−２組換え（ＣＪ２−ｇＤ２）を使用する。ＣＪ２−ｇＤ２は、野生型ＨＳＶ−２と同程度に効率的にｇＤ２を発現し、同時感染細胞における野生型ＨＳＶ−２の複製に対して強力なトランス阻害効果を発揮し得る。ＣＪ２−ｇＤ２での免疫は、有効なＨＳＶ−２特異的中和抗体およびＴ細胞応答を誘発し、マウスにおける野生型ＨＳＶ−２による膣内感染に対して完全な保護を提供する。

ＣＪ２−ｇＤ２は、野生型ＨＳＶ−２性器感染および疾患に対する防御において、ＣＪ９−ｇＤより有効なワクチンである。さらに、ＣＪ２−ｇＤ２の高用量の脳内注射は、マウスにおいて死亡状態も病的状態も引き起こさない。まとめると、これら観察から、ＣＪ２−ｇＤ２は、ヒトにおけるＨＳＶ−２性器感染および疾患に対する防御において、伝統的な複製欠損性ウイルスワクチンおよびＨＳＶ−２サブユニットワクチンを超える利点を有することが示唆される。

（Ｔｅｔオペレーター／リプレッサースイッチおよび組換えＤＮＡ）
本発明は、とりわけ、上記テトラサイクリンオペレーターおよびリプレッサータンパク質によって発現が調節される遺伝子を有するウイルスに関する。これらエレメントおよびＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を作製するために使用され得る方法は、以前に記載されており（米国特許第６，４４４，８７１号；同第６，２５１，６４０号；および同第５，９７２，６５０号を参照のこと）、上記テトラサイクリン誘導性転写スイッチを含むプラスミドは、市販されている（Ｔ−ＲＥｘ^ＴＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）。

本発明のＤＮＡの本質的特徴は、プロモーター（好ましくは、ＴＡＴＡエレメントを有する）に作動可能に連結された遺伝子の存在である。ｔｅｔオペレーター配列は、上記プロモーターの上記ＴＡＴＡエレメントにおける最後のヌクレオチドに対して３’側および上記遺伝子に対して５’側の６〜２４ヌクレオチドの間に位置する。ウイルスは、遺伝子転写をブロックし、ウイルス複製を可能にするために、上記ｔｅｔリプレッサーを発現する細胞において増殖させられ得る。上記ｔｅｔリプレッサーが上記オペレーター配列に結合される強度は、２〜２０個、好ましくは、１〜３個もしくは１０〜１３個のヌクレオチドの配列によって連結された２個のｏｐ２リプレッサー結合部位（各々のこのような部位は、ヌクレオチド配列：ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ（配列番号１）を有する）を含むオペレーターの形態を使用することによって増強される。リプレッサーがこのオペレーターに結合される場合、その会合した遺伝子の転写は、ほとんどもしくは全く起こらない。これら特徴を有するＤＮＡが、上記テトラサイクリンリプレッサーをも発現する細胞に存在する場合、ウイルス感染を予防し得る遺伝子の転写は、上記オペレーターに結合する上記リプレッサーによってブロックされ、上記ウイルスの複製が起こる。

（プロモーターおよび遺伝子の選択）
増殖性感染の間に、ＨＳＶ遺伝子発現は、発現の時間的順序に基づいて、３つの主要なクラスに分かれる：最初期（α）、初期（β）、および後期（γ）。後期遺伝子は、２つのグループ、γ１およびγ２にさらに分けられる。最初期遺伝子の発現は、デノボウイルスタンパク質合成を必要とせず、上記ウイルスＤＮＡが核に入る場合に、細胞転写因子と一緒にビリオン会合タンパク質ＶＰ１６によって、活性化される。上記最初期遺伝子のタンパク質生成物は、感染細胞ポリペプチド（ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、およびＩＣＰ４７と称され、それは、好ましくは、本明細書で考察される組換え遺伝子の発現を指向することにおいて使用されるこれら遺伝子のプロモーターである。

ＩＣＰ０は、潜伏期からのＨＳＶの再活性化を増強することにおいて主要な役割を果たし、低い感染多重度で上記ウイルスに対して顕著な増殖の利点を付与する。ＩＣＰ４は、ＨＳＶ−１の主要な転写調節タンパク質であり、これは、ウイルス初期遺伝子および後期遺伝子の発現を活性化する。ＩＣＰ２７は、増殖性ウイルス感染に必須であり、効率的なウイルスＤＮＡ複製、ならびにウイルスγ遺伝子およびウイルスβ遺伝子のサブセットの最適な発現に必要とされる。ＨＳＶ感染の間のＩＣＰ４７の機能は、感染細胞の表面上で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩの発現をダウンレギュレートすることであるようである。

上記ＨＳＶ−１ ＵＬ９−Ｃ５３５Ｃのコード領域のＨＳＶ−１ゲノム配列の全長配列は、図１０に示される（配列番号２）。組換えウイルスにおいて使用するために記載される他の配列は、すべて当該分野で周知である。例えば、ＨＳＶ−１の全長ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ配列 Ｘ１４１１２として見いだされ得る。上記ＨＳＶ−１ ＩＣＰ４配列は、ＧｅｎＢａｎｋ番号 Ｘ０６４６１として見いだされ得る；ＨＳＶ−１ 糖タンパク質Ｄは、ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｊ０２２１７として見いだされ得る；ＨＳＶ−２ 糖タンパク質Ｄは、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｋ０１４０８として見いだされ得る；そして上記ＨＳＶ−１ ＵＬ ９遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｍ１９１２０として見いだされ得る（これらはすべて、その全体が本明細書に参考として援用される）。

（Ｔｅｔリプレッサーの含有およびウイルスの作製）
上記ＨＳＶ ＩＣＰ０プロモーターおよびＩＣＰ４プロモーターの配列、ならびにその調節が内因的に制御される遺伝子の配列は、当該分野で周知であり（４３，４４，５６）、これらエレメントを含むウイルスベクターを作製するための手順は、以前に記載されてきた（米国出願公開２００５−０２６６５６４を参照のこと）。これらプロモーターは、遺伝子発現を促進することにおいて非常に活性であるだけでなく、それらはまた、ＶＰ１６（ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２が細胞に感染する場合に放出されるトランスアクチベーター）によって特異的に誘導される。

いったん適切なＤＮＡ構築物が生成されると、それらは、当該分野で周知の方法を使用して、ＨＳＶ−２ウイルスに組み込まれ得る（一般に、Ｙａｏら（６８）を参照のこと）。

（免疫方法）
本明細書に記載されるウイルスは、代表的には、ワクチンとしての注射によって、個体および／もしくは患者を免疫するために使用される。上記ワクチンは、ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２の感染を予防するために予防的に、または既に起こったＨＳＶ−１感染もしくはＨＳＶ−２感染の重篤度を低下させるために治療的に、の両方のために、使用され得る。ワクチンを作製するために、上記ウイルスは、任意の薬学的に受容可能な溶液（滅菌等張性生理食塩水、水、リン酸緩衝化生理食塩水、１，２−プロピレングリコール、水と混合したポリグリコール、リンゲル溶液などが挙げられる）中で懸濁され得る。投与されるべきウイルスの正確な数は、本発明にとって重要ではないが、「有効量」（すなわち、ＨＳＶ感染を阻害するに十分強い免疫学的応答を誘発するために十分な量）であるべきである。一般に、最初に投与されるウイルスの数（ＰＦＵ）は、１×１０^７〜１×１０^１０の間であると予測される。

投与量の有効性、および全体的な処置の有効性は、ＨＳＶを攻撃することにおいて有効な抗体の存在について試験するために、標準的な免疫学的方法を使用して評価され得る。免疫学的注射は、所望される程度の回数、反復され得る。

本実施例は、ＨＳＶ−２組換えウイルスの作製、およびその免疫学的効果を決定するための試験を記載する。

（Ｉ．材料および方法）
（細胞）
アフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞および骨肉腫株Ｕ２ＯＳ細胞を増殖させ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌ 硫酸ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下で、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した（７１）。Ｕ２ＯＳ細胞は、上記ＨＳＶ−１ ＩＣＰ０欠失を機能的に補完し得る（７１）。Ｕ２ＣＥＰ４Ｒ１１細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳおよびハイグロマイシンＢ（５０μｇ／ｍｌ）中で維持したｔｅｔＲ発現Ｕ２ＯＳ細胞である（７３）。ＶＣＥＰ４Ｒ−２８細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳおよびハイグロマイシンＢ（５０μｇ／ｍｌ）中で維持したｔｅｔＲ発現Ｖｅｒｏ細胞である（７３）。

（プラスミド）
プラスミドｐＨＳＶ２／ＩＣＰ０は、上記ＨＳＶ−２ ＩＣＰ０オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の２６８ｂｐ上流からＩＣＰ０コード配列のポリＡシグナルの４０ｂｐ下流まで網羅するＰＣＲ増幅したＨＳＶ−２ ＩＣＰ０配列をコードするｐＵＣ１９由来プラスミドである。ｐＨＳＶ２．ＩＣＰ０−Ｖは、ＩＣＰ０の開始コドンの２５ｂｐ上流からＩＣＰ０ ＯＲＦの終止コドンの３９７ｂｐ上流までの配列を含むＸｈｏ Ｉ-ＩＣＰ０ ＤＮＡ配列を、Ｘｈｏ Ｉ含有マルチクローニング配列（ＭＣＳ）で置換することによって、プラスミドｐＨＳＶ−２／ＩＣＰ０に由来するＨＳＶ−２ ＩＣＰ０クローニングプラスミドである。プラスミドｐＨＳＶ２．ＩＣＰ０−ｌａｃＺを、ｐｃＤＮＡ３−ｌａｃＺのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｎｏｔ Ｉ−ＬａｃＺ遺伝子含有フラグメントをｐＨＳＶ２．ＩＣＰ０−Ｖに、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｎｏｔ Ｉ部位で挿入することによって作製した。ｐｃｍｖｔｅｔＯ−ＵＬ９Ｃ５３５Ｃは、上記ｔｅｔＯ含有ｈＣＭＶ最初期プロモーターの制御下でＵＬ９−Ｃ５３５Ｃをコードするプラスミドである（６８）。ｐ０２ｌａｃＺ−ＴＯＣ５３５Ｃ（上記ｔｅｔＯ含有ｈＣＭＶ主要最初期プロモーターによって駆動されるＵＬ９−Ｃ５３５Ｃを発現する（図１Ａ））を、ｐＨＳＶ２．ＩＣＰ０−ｌａｃＺの上記ＥｃｏＲ Ｉ／Ａｇｅ Ｉ−ｌａｃＺ含有フラグメントをｐｃｍｖｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５３５Ｃの上記ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ｈｃｍｖｔｅｔＯ−ＵＬ９Ｃ５３５Ｃ含有フラグメントで置換することによって、構築した（６９）。

ｐＡｚｇＤ−ＨＳＶ−２は、Ｐａｔｒｉｃｉａ Ｓｐｅａｒ博士（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が提供してくれたＨＳＶ−２ ｇＤ２コードプラスミドである。ｐＩＣＰ４ＴＯ−ｈＥＧＦは、上記ｔｅｔＯを有するＨＳＶ−１最初期ＩＣＰ４プロモーターの制御下でヒト上皮増殖因子を発現する。上記プロモーターは、ＩＣＰ４遺伝子の転写開始部位に対して−３７７ｂｐ〜−１９ｂｐまでのＨＳＶ−１ ＩＣＰ４プロモーター配列からなる。プラスミドｐｃｍｖｔｅｔＯ−ｈＥＧＦにおける上記ｔｅｔＯを有するｈＣＭＶ主要最初期プロモーター（７３）に類似して、上記ｔｅｔＯ含有ＩＣＰ４プロモーターは、上記ＩＣＰ４ ＴＡＴＡエレメント（ＴＡＴＡＴＧＡ）の１０ｂｐ下流においてｔｅｔオペレーターの２コピーをタンデムで含む。従って、ｐｃｍｖｔｅｔＯ−ｈＥＧＦと同様に、ｐＩＣＰ４ＴＯ−ｈＥＧＦからのｈＥＧＦ発現は、ｔｅｔＲの存在下でテトラサイクリンによって厳密に調節され得、上記ｔｅｔＯの挿入は、ｔｅｔＲの非存在下で上記ＩＣＰ４プロモーター活性に対して何ら影響を有さない。ｐＩＣＰ４ＴＯ−ｈＥＧＦにおいて上記ｔｅｔＯを有するＩＣＰ４プロモーターと関連したさらなる特有の特徴は、上記野生型ＩＣＰ４プロモーターにおいてＩＣＰ４遺伝子の転写開始部位にまたがる（５１）上記ＩＣＰ４ ＤＮＡ結合配列 ＡＴＣＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧ（配列番号３）がないことである。従って、ＩＣＰ４による自己調節を受けやすい上記野生型ＩＣＰ４プロモーター（１６，５７）とは異なって、ｐＩＣＰ４ＴＯ−ｈＥＧＦにおける上記ｔｅｔＯを有するＩＣＰ４プロモーターは、上記ＨＳＶ−１主要調節タンパク質ＩＣＰ４によって抑制されない。

ｇＤ２を、上記ｔｅｔＯ含有ＩＣＰ４プロモーターの制御下でクローニングするために、本発明者らは、ｐＩＣＰ４ＴＯ−ｈＥＧＦにおけるＳｍａ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ ｔｅｔＯ含有ＩＣＰ４プロモーターを、ｐＨＳＶ２．ＩＣＰ０−Ｖの中へ、上記ベクターのＭＣＳの中にクローニングすることによって、プラスミドｐ０２ＩＣＰ４−ＴＯを最初に構築した。ｐ０２．４ＴＯ−ｇＤ２は、上記ｔｅｔＯを有するＩＣＰ４プロモーターの制御下にあるｐＡｚｇＤ−ＨＳＶ−２のｇＤ２遺伝子をコードするｐ０２ＩＣＰ４−ＴＯ由来プラスミドである。

ｐ０２ｌａｃＺＴＯ−ｇＤ２．Ｃ５３５Ｃ（上記ｈＣＭＶプロモーターの−２３６ｂｐにおいて５’短縮を有する上記ｔｅｔＯを有するｈＣＭＶ最初期プロモーターの制御下でＵＬ９−Ｃ５３５Ｃを、かつ上記ｔｅｔＯ−ＩＣＰ４プロモーターの制御下にある上記ｇＤ２遺伝子をコードするプラスミド（図１Ａ））を、ｐ０２ｌａｃＺＴＯ−Ｃ５３５ＣのＳｎａＢ Ｉ／Ｐｓｔ Ｉフラグメントをｐ０２．４ＴＯ−ｇＤ２のＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｐｓｔ Ｉ−ｇＤ２含有フラグメントで置換することによって作った。ｐ０２ｌａｃＺＴＯ−ｇＤ２．Ｃ５３５Ｃにおいて、ＵＬ９−Ｃ５３５Ｃ遺伝子およびｇＤ２遺伝子の転写は、反対の配向にある。

（ウイルス）
野生型ＨＳＶ−２（株１８６および株Ｇ）を増殖させ、Ｖｅｒｏ細胞上でプラークアッセイした。Ｎ２−ｌａｃＺは、ＨＳＶ−２ ＩＣＰ０プロモーターの制御下にあるＬａｃ Ｚ遺伝子をコードするＨＳＶ−２ ＩＣＰ０ヌル変異体である。この中で上記ＩＣＰ０遺伝子の両方のコピーは、Ｎｈｅ Ｉで直線状にしたｐＨＳＶ２．ＩＣＰ０−ｌａｃＺでＵ２ＯＳ細胞をトランスフェクトし、続いて、以前に記載される（７４）ようにＨＳＶ−２を重感染することによる相同組み換えを介して、ｐＨＳＶ２．ＩＣＰ０−ｌａｃＺにおける上記Ｌａｃ Ｚ遺伝子によって置換されている。上記ＩＣＰ０遺伝子の、上記ＩＣＰ０遺伝子座における上記Ｌａｃ Ｚ遺伝子での置換を、上記ＩＣＰ０遺伝子に隣接するプライマーおよび上記Ｌａｃ Ｚ遺伝子に対して特異的なプライマーを用いる、Ｎ２−ｌａｃＺウイルスＤＮＡのＰＣＲ分析によって確認した（４１，７４）。

Ｎ２−Ｃ５３５Ｃは、Ｎ２−ｌａｃＺの誘導体である。この中で、上記Ｌａｃ Ｚ遺伝子の両方のコピーは、プラスミドｐ０２ｌａｃＺ−ＴＯＣ５３５Ｃにおける上記ｔｅｔＯ含有ｈＣＭＶ プロモーターの制御下でＵＬ９−Ｃ５３５ＣをコードするＤＮＡ配列で置換されている（図１Ｂ）。簡潔には、Ｕ２ＣＥＰ４Ｒ１１細胞を、上記直線状にしたｐ０２ｌａｃＺ−ＴＯＣ５３５Ｃおよび感染性Ｎ２−ｌａｃＺウイルスＤＮＡで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００によって同時トランスフェクトした。上記トランスフェクションの子孫を、標準的なプラークアッセイによって、Ｎ２−ｌａｃＺの上記Ｌａｃ Ｚ遺伝子の、上記ｃｍｖｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５３５Ｃを含むＤＮＡ配列での組換え置換についてスクリーニングした。プラークを、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）で、感染後９６時間で染色した。白いプラーク（これは、上記ＵＬ ９−Ｃ５３５Ｃ ＤＮＡコード配列による上記Ｌａｃ Ｚ遺伝子の両方のコピーの置換を反映する）を単離した。上記単離物のうちの１つを、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃと称し、これは、４回のプラーク精製の後に、均質に白いプラークを得た。

Ｎ２−ｌａｃＺの中のＩＣＰ０遺伝子座における上記Ｌａｃ Ｚ遺伝子の両方のコピーを、上記ｔｅｔＯを有するｈＣＭＶ主要最初期プロモーターの制御下にあるＵＬ９−Ｃ５３５Ｃおよび上記ｔｅｔＯ含有ＨＳＶ−１ ＩＣＰ４プロモーター（これは、ＩＣＰ４遺伝子の転写開始部位に対して−３７７ｂｐから−１９ｂｐまでのＨＳＶ−１ ＩＣＰ４プロモーター配列からなる（７１））の制御下にあるｇＤ２をコードするＤＮＡ配列で置換することによって、ＣＪ２−ｇＤ２を構築する（図１Ｂ）。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析）
６０ｍｍディッシュ中に、７．５×１０^５ 細胞／ディッシュで播種したＶｅｒｏ細胞に、模擬感染させたか、または１０ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで示されたウイルスを感染させた。細胞抽出物を、感染後９時間もしくは１６時間で調製した（７２）。上記細胞抽出物中のタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（９％ アクリルアミド）によって分離し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に移し、ＨＳＶ−１ ｇＤに対するポリクローナル抗体（Ｒ４５（Ｇａｒｙ Ｈ．Ｃｏｈｅｎ博士およびＲｏｓｅｌｙｎ Ｊ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ博士から贈与））、ＵＬ９（Ｍａｒｋ Ｃｈａｌｌｂｅｒｇから贈与）、もしくはＩＣＰ２７およびｇＢに対して特異的なモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）のいずれかでプローブした。

（マウス）
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）から購入した。マウスを、１ケージあたり４匹で金属製ケージの中に収容し、１２時間明暗サイクルで維持した。マウスを、実験前に１週間にわたって上記収容条件に順応させた。すべての動物実験は、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｒｅａ Ｓｔａｎｄｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ＡｎｉｍａｌｓおよびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎによって承認されたプロトコルに従って行った。

（免疫および抗原投与）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、いくつかの群に無作為に分け、彼らの左背側脇腹部（ｌｅｆｔ ｒｅａｒ ｆｌａｎｋ）を剃毛した。マウスは、２７ゲージ針を取り付けた１ｍｌシリンジを使用して、左背側脇腹部に、２×１０^６ ＰＦＵ／マウスのＣＪ２−ｇＤ２、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃ、ＣＪ９−ｇＤをワクチン接種したか、もしくは容積３０μｌにおいてＤＭＥＭを皮下に模擬ワクチン接種したかのいずれかであった。２週間後に、マウスを追加免疫し、野生型ＨＳＶ−２株Ｇを２回目の免疫の３週間後に抗原投与した。抗原投与の５日前、マウスに、メドロキシプロゲステロン（ＳＩＣＯＲ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を２０μｌの容積中３ｍｇ／マウスで頚部のひだ襟に皮下注射した（７，５０）。膣内抗原投与については、すべての群のマウスを麻酔し、アルギン酸カルシウムスワブ（滅菌泌尿生殖器アルギン酸カルシウムが先端についたアプリケーター（ｕｒｅｔｈｒｏ−ｇｅｎｉｔａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｔｉｐｐｅｄ ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ），Ｐｕｒｉｔａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃｏｍｐａｎｙ ＬＬＣ，Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｉｎｅ ＵＳＡ）で予めぬぐい、ＨＳＶ−２株Ｇの５×１０^５ ＰＦＵ（５０ ＬＤ_５０）を含む２０μｌの培養培地を膣内接種した（５０）。動物を、感染後３０〜４５分間にわたって麻酔の影響下で、彼らの下半身（ｒｅａｒ ｐａｒｔ）を持ち上げた状態で背中を保持し続けた。

（急性感染アッセイおよび臨床的観察）
抗原投与後１日目、２日目、３日目、５日目、および７日目に、膣粘膜を、アルギン酸カルシウムでぬぐった（７）。スワブ材料中の感染性ウイルスを、Ｖｅｒｏ細胞単層に対する標準的プラークアッセイによって評価した。野生型ＨＳＶ−２での抗原投与後、マウスを、性器病変および全身の疾患の徴候について２１日の追跡期間の間に毎日評価した。疾患の重篤度を、以下のとおりスコア付けした：０＝ヘルペス感染の徴候なし、１＝わずかな性器紅斑および浮腫、２＝中程度の性器炎症、３＝化膿した性器病変および／もしくは全身の疾患、４＝後肢麻痺、および５＝死亡（８，５０）。

（ＨＳＶ−２特異的中和抗体の検出）
初回免疫の４週間後に、免疫したマウスおよび模擬免疫したマウスの尾静脈から血液を採取した。中和血清抗体力価を、補体（５−７）と２５０ ＰＦＵの野生型ＨＳＶ−２株１８６の存在下で先に記載されるように決定した。上記中和抗体力価を、培地＋補体単独で得られた上記ＨＳＶ ＰＦＵに対して、ＨＳＶ ＰＦＵにおける５０％低下を達成するために必要とされる最終血清希釈度として表した。

（免疫沈降）
７．５×１０^６ 細胞／１００−ｍｍディッシュにおいて播種したＵ２ＯＳ細胞を、模擬トランスフェクトしたか、または播種後２４時間において１０μｇのｐ０２．４ＴＯ−ｇＤでリポフェクタミン２０００によってトランスフェクトした。細胞抽出物を、トランスフェクション後４８時間において調製した（７２）。免疫沈降を、模擬免疫したマウスおよび上記で調製した７０μｌの細胞抽出物で免疫したマウスから採取した１０μｌのプールされた血清を混合することによって行った。上記ｇＤ／マウスＩｇＧ特異的複合体を、プロテインＡ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｌａｓｓｉｃ ＩＰ ｋｉｔ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）で沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウサギ抗ｇＤ特異的ポリクローナル抗体Ｒ４５でプローブし、続いて、ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）と反応させた。

（ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＤＭＥＭで偽免疫したか、またはＣＪ２−ｇＤ２で用量２×１０^６ ＰＦＵ／マウスで、２週間間隔で２回免疫した。２回目の免疫後５〜１０週間において、偽免疫したマウスおよびＣＪ２−ｇＤ２免疫したマウスを、模擬抗原投与したか、または野生型ＨＳＶ−２株１８６を皮下で用量１×１０^４ ＰＦＵ／マウスにおいて抗原投与した。脾細胞を、抗原投与後４日目もしくは５日目にマウスの個々の群（ｎ＝３）から単離した。上記ＣＤ４^＋ およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、先に記載されたように行った（４２）。簡潔には、ＣＤ４^＋ およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、ＤｙｎａｌマウスＣＤ４陰性単離キットもしくはＣＤ８陰性単離キットを使用して脾細胞から単離し、抗マウスＩＦＮ−γ特異的モノクローナル抗体（ＡＮ１８）で予めコーティングした９６ウェル濾過プレート中、７．５×１０^４もしくは１．５×１０^５ 細胞／ウェルにおいて四連で播種した。３７℃で２０時間にわたるインキュベーション後、ウェルを洗浄し、ビオチン化ＩＦＮ−γ特異的モノクローナル抗体（Ｒ４−６Ａ２，Ｍａｂｔｅｃｈ）で室温において反応させ、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｍａｂｔｅｃｈ）とともにインキュベートした。上記ＩＦＮ−γスポット形成細胞を、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質の添加によって検出した。スポットを解剖顕微鏡で計数し、ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を、平均±ＳＥＭ／１００万 ＣＤ４^＋ もしくはＣＤ８^＋ Ｔ細胞として表した。

（定量的リアルタイムＰＣＲ）
脊髄および後根神経節を含む脊柱の下部腰椎（ｌｏｗｅｒ ｌｕｍｂａｒ）および仙骨部を、追加免疫の１６日後、もしくは５×１０^５ ＰＦＵのＨＳＶ−２株Ｇでの膣内抗原投与の２１日後に、ＣＪ２−ｇＤ２もしくはＣＪ９−ｇＤのいずれかで免疫した９匹もしくは１０匹のマウスから回収した。上記脊柱を４つの小片に切断し、各小片を、０．５ｍｌの通常の増殖培地中で別個に保持し、−８０℃においてさらに加工処理するために貯蔵した。総ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を使用して各後根神経節から単離し、４００μｌ ＡＥ緩衝液中で懸濁した。ＨＳＶ−２ ＤＮＡの存在を、先に記載されるように（８）、１００ｎｇの神経節ＤＮＡおよび上記ＨＳＶ ＤＮＡポリメラーゼに特異的なプライマー（順方向： ５’ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＴＧ ＣＧＡ ＡＡＡ ＡＡＣ ＧＴＴ Ｃ （配列番号４）、逆方向： ５’ ＣＧＧ ＧＧＣ ＧＣＴ ＣＧＧ ＣＴＡ ＡＣ （配列番号５））を用いて、リアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）によって定量した。確実に検出され得るＨＳＶ−２ウイルスＤＮＡの最小限のコピーは、反応あたり１コピーであった。

（統計分析）
統計分析のために、片側スチューデントｔ検定を行った。結果は、Ｐ値が０．０５未満である場合に統計的に有意であるとみなされる。

（ＩＩ．結果）
（ＣＪ２−ｇＤ２の構築）
ｇＤ２発現ドミナントネガティブおよびＵＬ９−Ｃ５３５Ｃ発現ドミナントネガティブかつ複製欠損性ＨＳＶ−２組換えウイルスの生成における第１の工程として、本発明者らは、ＨＳＶ−２ ＩＣＰ０欠失変異体、Ｎ２−ｌａｃＺを構築した。この中でＨＳＶ−２株１８６におけるＩＣＰ０遺伝子の両方のコピーが、上記ＨＳＶ−２ ＩＣＰ０プロモーターの制御下にある上記Ｌａｃ Ｚ遺伝子によって置換されている（図１Ｂ）。本発明者らは、上記ＨＳＶ−１ ＩＣＰ０ヌル変異体７３１４（１１）と同様に、ヒト骨肉腫株Ｕ２ＯＳ細胞に対するＮ２−ｌａｃＺの上記プラーク形成効率は、Ｖｅｒｏ細胞におけるものの４２５倍であることを示し、このことは、Ｕ２ＯＳ細胞における細胞活性が、ＨＳＶ−２ ＩＣＰ０を機能的に代替し得ることを示す。野生型ＨＳＶ−２と比較して、Ｖｅｒｏ細胞におけるＮ２−ｌａｃＺの複製効率は、０．１ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて６００分の１未満に低下する。この知見と一致して、１×１０^５ および５×１０^５ ＰＦＵ／マウスにおけるＮ２−ｌａｃＺの膣内接種は、局所的な疾患も全身的な疾患ももたらさかった一方で、１×１０^４ ＰＦＵ／マウスの野生型ＨＳＶ−２で感染させたマウスは、重篤な陰部ヘルペスを発症し、感染後１１日目までにすべて死亡した。さらに、Ｎ２−ｌａｃＺは、用量５×１０^５ ＰＦＵ／マウスでの膣内感染後に、再活性化可能な潜伏感染を確立できない。これら結果は、ＨＳＶ−１ ＩＣＰ０（１０，１１，３７，６４）と同様に、ＨＳＶ−２ ＩＣＰ０の欠失は、上記ウイルスが急性感染および再活性化可能な潜伏感染をインビボで開始する能力を有意に減弱することを示す。

ドミナントネガティブおよび複製欠損性ＨＳＶ−２ウイルス組換え体によるｇＤ２発現のレベルを最大にする目的で、本発明者らは、Ｎ２−ｌａｃＺにおける上記Ｌａｃ Ｚ遺伝子の両方のコピーを、上記ｔｅｔＯを有するＨＳＶ−１主要最初期ＩＣＰ４プロモーターにより駆動されるｇＤ２遺伝子およびｈＣＭＶ最初期プロモーターの全長の−２３６ｂｐにおいて短縮を有する上記ｔｅｔＯ含有ｈＣＭＶ主要最初期プロモーターの制御下にあるＵＬ９−Ｃ５３５ＣをコードするＤＮＡ配列（図１Ｂ）で置換することによって、ドミナントネガティブおよび複製欠損性ＨＳＶ−２組換え体（ＣＪ２−ｇＤ２）を構築した。従って、ＨＳＶ−１ ＵＬ９遺伝子座における上記ｔｅｔＯ含有ｈＣＭＶプロモーターによって駆動される挿入されたＨＳＶ−１ ｇＤ遺伝子の単一のコピーをコードする（４１）ＣＪ９−ｇＤとは異なって、ＣＪ２−ｇＤ２は、上記ｔｅｔＯを有するＨＳＶ−１最初期ＩＣＰ４プロモーター（これは、ＩＣＰ４遺伝子の転写開始部位に対して−３７７ｂｐから−１９ｂｐまでのＨＳＶ−１ ＩＣＰ４プロモーター配列からなる）によって制御されるｇＤ２遺伝子の２コピーを含む。Ｎ２−Ｃ５３５Ｃは、Ｎ２−ｌａｃＺにおける上記Ｌａｃ Ｚ遺伝子の両方のコピーが上記全長ｔｅｔＯを有するｈＣＭＶ最初期プロモーターの制御下にあるＵＬ９−Ｃ５３５Ｃによって置換されるＨＳＶ−２組換え体である。

（ＣＪ２−ｇＤ２は、感染したＶｅｒｏ細胞において高レベルのｇＤ２およびＵＬ９−Ｃ５３５Ｃを発現する）
それぞれ、上記ｔｅｔＯを有するＨＳＶ−１最初期ＩＣＰ４プロモーターおよびｈＣＭＶ最初期プロモーターからのｇＤ２およびＵＬ９−Ｃ５３５Ｃの発現を試験するために、Ｖｅｒｏ細胞に、１０ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて、野生型ＨＳＶ−２、Ｎ２−ｌａｃＺ、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃ、およびＣＪ２−ｇＤ２を感染させ、感染後９時間に採取した。感染細胞タンパク質を、ＨＳＶ−１／２ ＩＣＰ２７モノクローナル抗体、ＵＬ９ポリクローナル抗体、およびｇＤ１ポリクローナル抗体（Ｒ４５）でのウェスタンブロットアッセイによって分析した。ｇＤ２と同様に、ｇＢ２が中和抗体およびＴ細胞応答の主要な標的であり、γ１生成物であると仮定すると、感染細胞タンパク質をまた、ｇＢ特異的モノクローナル抗体でプローブした。図２Ａは、ＣＪ２−ｇＤ２およびＮ２−Ｃ５３５Ｃが、野生型ＨＳＶ−２およびＮ２−ｌａｃＺによって発現されるものに類似のレベルのＨＳＶ−２最初期タンパク質ＩＣＰ２７を発現することを示す。有意な量のＵＬ９−Ｃ５３５Ｃが、ＣＪ２−ｇＤ２感染細胞およびＮ２−Ｃ５３５Ｃ感染細胞において検出された一方で、ｇＤ２もｇＢ２も、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃ感染細胞においてほとんど検出されなかった。しかし、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃ感染とは対照的に、ＣＪ２−ｇＤ２でのＶｅｒｏ細胞の感染は、野生型ＨＳＶ−２が感染した細胞におけるものに類似のレベルで、ｇＤ２の高レベル発現をもたらし、ｇＤ２発現は、ｇＢ２発現に対して何ら影響を与えない。上記結果はまた、上記ＨＳＶ−１ ＩＣＰ０ヌル変異体７１３４（７１）と同様に、Ｎ２−ｌａｃＺにおけるＨＳＶ−２ ＩＣＰ０の欠失は、ｇＤ２発現を大いに低下させることを示す。その真正のＨＳＶ初期プロモーターからのＵＬ９の非常に低いレベルの発現（６８）に起因して、野生型ＵＬ９は、これら４種の異なるウイルスが感染した細胞の中では検出されなかった。さらに、本発明者らは、ＣＪ２−ｇＤ２感染細胞において発現されたＵＬ９−Ｃ５３５Ｃのレベルが、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃが感染した細胞より一貫して高いことを観察する。このことは、上記ＨＳＶ−１ ＩＣＰ４プロモーターに存在する上記ＨＳＶ ＶＰ１６応答性エレメントＴＡＡＴＧＡＲＡＴ（７１）が、上記記載されたハイブリッドＩＣＰ４／ｈＣＭＶプロモーターシステムのｈＣＭＶ−最初期プロモーターからのＵＬ９−Ｃ５３５Ｃの増強された発現をもたらし得ることを示唆する。

図２Ｂで示された上記ｇＤ１ポリクローナル抗体（Ｒ４５）でのウェスタンブロット分析から、遙かにより高いレベルのｇＤが野生型ＨＳＶ−２に感染した細胞より野生型ＨＳＶ−１感染細胞において検出された一方で、ＣＪ９−ｇＤ感染細胞において検出されたｇＤのレベルは、ＣＪ２−ｇＤ２が感染した細胞より顕著に低かったことが示される。この知見は、ＣＪ２−ｇＤ２がＣＪ９−ｇＤによって発現されたｇＤ１より効率的にｇＤ２を発現することを示す。

ＣＪ２−ｇＤ２感染Ｖｅｒｏ細胞において発現された上記ＵＬ９−Ｃ５３５ＣおよびｇＤ２が、実際に、上記ｔｅｔＯを有するプロモーターの制御下にあることを実証するために、本発明者らは、次に、安定なｔｅｔＲ発現Ｖｅｒｏ細胞株であるＶＣＥＰ４Ｒ−２８細胞に、野生型ＨＳＶ−２およびＣＪ２−ｇＤ２を、１０ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて、テトラサイクリンの非存在下および存在下で感染させた。感染細胞由来のタンパク質を、感染後９時間において採取し、ウェスタンブロットによって分析した。認められ得るように（図３）、類似のレベルのＩＣＰ２７が、テトラサイクリンの非存在下および存在下の両方で、野生型ＨＳＶ−２感染ＶＣＥＰ４Ｒ−２８細胞およびＣＪ２−ｇＤ２感染ＶＣＥＰ４Ｒ−２８細胞において検出されたが、ＵＬ９−Ｃ５３５Ｃは、テトラサイクリンが存在したときにのみ、ＣＪ２−ｇＤ２感染ＶＣＥＰ４Ｒ−２８細胞において検出され、顕著により高いレベルのｇＤ２が、テトラサイクリンの非存在下よりテトラサイクリンの存在下で検出された。

（ＣＪ２−ｇＤ２はＶｅｒｏ細胞において複製できない）
ＩＣＰ０の欠如および上記ｔｅｔＯを有するｈＣＭＶ主要最初期プロモーターからのＵＬ９−Ｃ５３５Ｃの高レベル発現が原因で、ＣＪ２−ｇＤ２は、上記ｔｅｔＲ発現ＩＣＰ０補完Ｕ２ＯＳ細胞株Ｕ２ＣＥＰ４Ｒ１１において構築され、増殖されなければならなかった（６８）。本発明者らは、Ｖｅｒｏ細胞単層上で６．６５×１０^７ ＰＦＵのＣＪ２−ｇＤ２をプラークアッセイし、感染性ウイルスを検出しなかった。このことは、Ｖｅｒｏ細胞におけるＣＪ２−ｇＤ２のプラーク形成効率が、その補完Ｕ２ＣＥＰ４Ｒ１１細胞と比較して、少なくとも６．６５×１０^７分の１になったことを示す。

（ＣＪ２−ｇＤ２による野生型ＨＳＶ−２複製の阻害）
本発明者らは、次に、同時感染アッセイによって野生型ＨＳＶ−２ウイルス複製の、複製に対するＣＪ２−ｇＤ２による高レベルＵＬ９−Ｃ５３５Ｃ発現のドミナントネガティブ効果を試験した（図４）。図４Ａは、５ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでのＣＪ２−ｇＤ２および２ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでの野生型ＨＳＶ−２によるＶｅｒｏ細胞の同時感染は、上記ウイルス力価が、Ｖｅｒｏ細胞においてもしくはＵ２ＣＥＰ４Ｒ１１細胞において決定されたか否かにかかわらず、同じＭＯＩでの野生型ＨＳＶ−２によって単一で感染させた細胞と比較して、野生型ＨＳＶ−２生成においてほぼ５００分の１になったことを示す。野生型ウイルス収量のわずかな低下が、類似の同時感染実験がＮ２−ｌａｃＺで行われた場合に検出された。

野生型ＨＳＶ−２の複製を阻害することにおいてＣＪ２−ｇＤ２の有効性をさらに試験するために、本発明者らは、それぞれ、１：１および３：１のＭＯＩ比において、野生型ＨＳＶ−２およびＣＪ２−ｇＤ２での同時感染実験を行った。図４Ｂの結果は、ＣＪ２−ｇＤ２が、野生型ＨＳＶ−２感染を両方の条件下で妨げることにおいて有効である（それぞれ、５ ＰＦＵ／細胞および１５ ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて、野生型ＨＳＶ−２に単一に感染させた細胞と比較して、示された同時感染比において、野生型ウイルス合成の約１５１分の１および約９４分の１の低下をもたらす）ことを示す。

（ＣＪ２−ｇＤ２は、マウスにおける脳内注射後に無毒性である）
神経毒性は、ＨＳＶ感染の顕著な特徴のうちの１つである。ＣＪ２−ｇＤ２およびＮ２−Ｃ５３５ＣがＣＮＳにおいて複製する能力を決定するために、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（５〜６週齢）を、５群（各々８匹のマウス）に無作為に割り当てた。ＣＪ２−ｇＤ２およびＮ２−Ｃ５３５Ｃを、深さ４ｍｍで２８ゲージインスリン針を用いて、２０μｌ容積中２．５×１０^６ ＰＦＵ／マウスにおいて各マウスの脳の左前頭葉に直接接種した（７４）。罹病率および死亡率を、３５日間にわたってモニターした。野生型ＨＳＶ−２株１８６のＬＤ_５０が、硝子体内注射後に雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて約１０ ＰＦＵであると仮定して（３８）、マウスの１群に、２５ ＰＦＵ／マウスにおいて野生型ＨＳＶ−２もまた接種した。さらなるコントロールとして、第５群のマウスに、１×１０^６ ＰＦＵ／マウスにおいてＮ２−ｌａｃＺを接種した。図５は、ＤＭＥＭを接種したマウスと同様に、ＣＪ２−ｇＤ２およびＮ２−Ｃ５３５Ｃを用量２．５×１０^６ ＰＦＵにおいて脳内接種したマウスが、３５日間の追跡の間に神経毒性の徴候を示さなかった一方で、用量２５ ＰＦＵ／マウス（ＣＪ２−ｇＤ２を接種したマウスに与えられた用量の１００，０００分の１の用量）において野生型ＨＳＶ−２を接種したすべてのマウスは、接種後１０日目までに死亡したことを示す。そしてすべての接種したマウスは、ＨＳＶ−２感染と一般に関連したＣＮＳ疾患の徴候（粗くなった毛並み、猫背、失調、および食欲不振が挙げられる）を示した。Ｎ２−ｌａｃＺを接種したマウスのうちの１００％が生き残ったが、すべてのマウスは、脳炎の徴候を示した。

（ＣＪ２−ｇＤ２で免疫したマウスにおけるＨＳＶ−２特異的中和抗体およびｇＤ２特異的抗体応答の誘導）
ＣＪ２−ｇＤ２が抗ＨＳＶ−２特異的中和抗体を誘発する能力を、用量２×１０^６ ＰＦＵにおいてＣＪ２−ｇＤ２で免疫したマウスで決定した。コントロールとして、マウスの群にも、Ｎ２−Ｃ５３５ＣもしくはＣＪ９−ｇＤを同じ用量で免疫した。示されるように（図６Ａ）、ＣＪ２−ｇＤ２で免疫したマウスにおける上記ＨＳＶ−２特異的中和抗体力価の平均は、平均５００であり、これは、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃで免疫したマウスのものの３倍であり（ｐ＝０．０１５）、ＣＪ９−ｇＤ免疫マウスにおいて誘導された中和抗体力価に匹敵する（ｐ＝０．２８）。ＨＳＶ−２に対する特異的抗体力価は、１：１０希釈で模擬ワクチン接種したマウスにおいては検出されなかった。

図６Ｂは、ｇＤ特異的抗体応答の類似のレベルが、ＣＪ２−ｇＤ２で免疫したマウスとＣＪ９−ｇＤで免疫したマウスとの間で、それぞれの免疫沈降させたｇＤ２複合体を抗ｇＤ１抗体Ｒ４５でプローブした場合に検出された一方で、ＣＪ２−ｇＤ２で免疫したマウスにおける抗ｇＤ特異的抗体のレベルは、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃで免疫したマウスおよび模擬免疫したコントロールより有意に高かったことを示す。まとめると、図６に示された結果は、ＣＪ２−ｇＤ２によるｇＤ２の高レベル発現が、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃと比較して、抗ｇＤ２抗体および抗ＨＳＶ−２特異的中和抗体応答を誘発することにおいて増大した効力をもたらすことを示す。

（ＣＪ２−ｇＤ２で免疫したマウスにおけるＨＳＶ−２特異的Ｔ細胞応答の誘導）
ＨＳＶ−２特異的Ｔ細胞応答を誘発することにおいてＣＪ２−ｇＤ２免疫の有効性を評価するために、本発明者らは、野生型ＨＳＶ−２で抗原投与した後の免疫したマウスにおいて記憶Ｔ細胞応答を試験するために再現実験（ｒｅｃａｌｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を行った。第１に、偽ワクチン接種したマウスおよびＣＪ２−ｇＤ２ワクチン接種したマウスを、模擬抗原投与したか、または追加免疫後９〜１０週間において野生型ＨＳＶ−２で抗原投与し、続いて、抗原投与後５日目に個々のマウス群の脾臓から単離したＣＤ４^＋ およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞でのＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ｎ＝３）を行った（図７Ａ）。野生型ＨＳＶ−２で抗原投与したＣＪ２−ｇＤ２ワクチン接種したマウスは、上記模擬感染したＣＪ２−ｇＤ２免疫マウスと比較して、ＩＦＮ−γ−陽性ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の４．８倍の増大を有した（ｐ＜０．０００１）。より有意なことには、以前にＣＪ２−ｇＤ２でワクチン接種したＨＳＶ−２感染マウスにおいて検出されたＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の数は、ＨＳＶ−２感染した偽ワクチン接種マウスより１８倍多かった（ｐ＜０．０００１）。ＩＦＮ−γ−陽性ＣＤ４^＋ Ｔ細胞は、同一条件下で、偽ワクチン接種した模擬感染コントロールマウスにおいて検出されなかった。これら知見は、ＣＪ２−ｇＤ２での免疫は、強力な記憶ＣＤ４^＋ Ｔ細胞応答を誘発することを示す。

上記偽ワクチン接種コントロールと比較して、ＣＪ２−ｇＤ２ワクチン接種したマウスにおいてＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の２倍超の増加が存在した一方で、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の類似の数が、ＨＳＶ−２感染させた偽ワクチン接種マウスおよびＨＳＶ−２感染させたＣＪ２−ｇＤ２ワクチン接種マウスの脾臓において検出された（図７Ｂ）。本発明者らは、従って、再現実験の第２のセットを行った。ここで偽ワクチン接種したマウスおよびＣＪ２−ｇＤ２ワクチン接種したマウスを、模擬抗原投与したか、または２回目のワクチン接種後５〜６週間において、野生型ＨＳＶ−２で抗原投与した（ｎ＝３）。ＣＤ４^＋ およびＣＤ８^＋ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、感染後４日目に行った（図７Ｃおよび図７Ｄ）。それぞれ、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４^＋ およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞における８．６倍および５．７倍の増加は、模擬感染させたＣＪ２−ｇＤ２免疫マウスと比較して、ＨＳＶ−２感染後のＣＪ２−ｇＤ２免疫マウスにおいて検出された（ＣＤ４^＋ Ｔ細胞：ｐ＝０．０３５；ＣＤ８^＋ Ｔ細胞：ｐ＝０．０１）。さらに、ＨＳＶ−２での抗原投与後に、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４^＋ およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞は、偽ワクチン接種マウスと比較して、ＣＪ２−ｇＤ２ワクチン接種マウスにおいてそれぞれ、８倍および９．５倍高かった（ＣＤ４^＋ Ｔ細胞：ｐ＝０．０３６；ＣＤ８^＋ Ｔ細胞：ｐ＝０．０１）。まとめると、これら研究から、ＣＪ２−ｇＤ２での免疫が、確固としたＨＳＶ−２特異的記憶ＣＤ４^＋ およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を誘発し得、これは、ＨＳＶ−２感染の間に効率的に再現され得ることが示される。

（免疫したマウスにおけるＨＳＶ−２性器感染および疾患に対する防御）
初回免疫の５〜６週間後に、マウスを、５０ ＬＤ_５０（５×１０^５ ＰＦＵ／マウス）においてＨＳＶ−２株Ｇで膣内に抗原投与した。膣スワブを、抗原投与後１日目、２日目、３日目、５日目、および７日目に採取した。性器ＨＳＶ−２疾患および播種性のＨＳＶ−２疾患の発生率について、２１日の追跡期間の間にマウスを観察した。図８Ａに示されるように、抗原投与するウイルスの収量は、模擬免疫したコントロール（ｎ＝１０）のものと比較して、ＣＪ２−ｇＤ２で免疫したマウス（ｎ＝９）において、１日目に２００分の１未満に（ｐ＜０．００１）、および２日目に１３０分の１未満に（ｐ＜０．０００１）低下した。ＣＪ２−ｇＤ２で免疫したマウス群とＮ２−Ｃ５３５Ｃで免疫したマウス群との間で（ｎ＝１０）、抗原投与後１日目、２日目、および３日目の抗原投与ウイルス排出の低下において有意差はなかったが、ＣＪ２−ｇＤ２での免疫は、１日目（ｐ＝０．０３）、２日目（ｐ＝０．０２５）および３日目（ｐ＜０．００７）に抗原投与ウイルス排出の低下において、ＣＪ９−ｇＤより有効であった。抗原投与後５日目に、ＣＪ２−ｇＤ２、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃ、もしくはＣＪ９−ｇＤで免疫したマウスにおいて抗原投与ウイルスは、ほとんどもしくは全く検出されなかったのに対して、すべての模擬ワクチン接種したマウスは、５×１０^３ ＰＦＵ／ｍｌより多くの平均収量で、ウイルスを排出し続けた。マウスの３つの免疫群において、抗原投与後７日目に、集められた膣スワブ材料中に抗原投与ウイルスは存在しなかった。別個に実験において、本発明者らは、抗原投与後５日目に、ＣＪ２−ｇＤ２免疫マウスにおいてウイルス排出は認められなかった一方で、野生型ＨＳＶ−２の存在は、７匹のＮ２−Ｃ５３５Ｃ免疫したマウスのうちの５匹において、および７匹のＣＪ９−ｇＤ免疫したマウスのうちの４匹において検出されたことを観察した。

図９における結果は、ＣＪ２−ｇＤ２で免疫したマウスは、局所的な性器病変の発生から完全に保護され、野生型ＨＳＶ−２での抗原投与後に全身的な疾患の徴候を示さなかったことを示す（図９Ａ）。すべての模擬免疫したマウスは、重篤な性器病変を発生させ、抗原投与後１１日目までには、上記野生型ＨＳＶ−２感染で死亡した（図９Ｂ）。Ｎ２−Ｃ５３５ＣおよびＣＪ９−ｇＤでの免疫は、野生型ＨＳＶ−２での致死的抗原投与に対してマウスを防御したが、マウスのうちの２０％および３０％は、それぞれ、Ｎ２−Ｃ５３５Ｃ免疫マウスおよびＣＪ９−ｇＤ免疫マウスにおいて、局所的な性器疾患の一時的な低い程度（スコア１）を経験した（表１）。類似の実験において（表１）、ＣＪ９−ｇＤで免疫したマウス（ｎ＝７）の中で、２匹のマウスは、局所的な性器疾患の低い程度を経験したことが観察され、１匹のマウスは、全身的な疾患の徴候を示し、抗原投与後１４日目に死亡した。７匹のＮ２−Ｃ５３５Ｃ免疫マウスのうちの３匹（４３％）は、局所的な性器疾患の低い程度（スコア＝１）を示した。繰り返すと、ＣＪ２−ｇＤ２免疫したマウス（ｎ＝７）において、局所的および全身的なヘルペス疾患の徴候は何ら認められなかった。まとめると、これら研究から、ＣＪ２−ｇＤ２は、野生型ＨＳＶ−２での膣内抗原投与後の性器疾患に対するマウスの保護において、Ｎ２−Ｃ５３５ＣおよびＣＪ９−ｇＤより有効なワクチンであることが示される。

本明細書で引用されるすべての参考文献は、完全に参考として援用される。本発明はここで十分に記載されたが、本発明が、本発明もしくはその任意の実施形態の趣旨もしくは範囲に影響を及ぼすことなく、条件、パラメーターなどの広いおよび等価な範囲内で実施され得ることは、当業者によって理解される。

Claims (23)

1. 複製欠損性ドミナントネガティブ単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）組換えウイルスであって、該ウイルスは、そのゲノム内に：
   ａ）第１のＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）をコードする第１の配列であって、ここで該配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され、該第１のプロモーターは、第１のテトラサイクリンオペレーター（Ｔｅｔ−Ｏ）配列に作動可能に連結されている、第１の配列；
   ｂ）第２のＨＳＶ−２ ｇＤ２をコードする第２の配列であって、ここで該第２の配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結され、該第２のプロモーターは、第２のｔｅｔ−Ｏ配列に作動可能に連結されており、ここで、該第２の配列は必要に応じたものである、第２の配列；
   ｃ）ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２のＵＬ９タンパク質の第１のドミナントネガティブ変異体形態をコードする第３の配列であって、ここで該第３の配列は、第３のプロモーターに作動可能に連結され、該第３のプロモーターは、第３のテトラサイクリンオペレーター（Ｔｅｔ−Ｏ）配列に作動可能に連結されている、第３の配列；
   ｄ）ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２のＵＬ９タンパク質の第２のドミナントネガティブ変異体形態をコードする第４の配列であって、ここで該第４の配列は、第４のプロモーターに作動可能に連結され、該第４のプロモーターは、第４のテトラサイクリンオペレーター（Ｔｅｔ−Ｏ）配列に作動可能に連結されており、ここで、該第４の配列は必要に応じたものである、第４の配列；
   を含み、そしてここで該ゲノムは、機能的ＩＣＰ０タンパク質をコードする配列を含まない、組換えウイルス。
2. 前記組換えウイルスは、そのゲノム内に、第２のＨＳＶ−２ ｇＤ２をコードする前記第２の配列を含み、ここで該第２の配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結され、該第２のプロモーターは、第２のｔｅｔ−Ｏ配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の組換えウイルス。
3. 前記組換えウイルスは、そのゲノム内に、ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２のＵＬ９タンパク質の第２のドミナントネガティブ変異体形態をコードする前記第４の配列を含み、該第４の配列は、第４のプロモーターに作動可能に連結され、該第４のプロモーターは、第４のテトラサイクリンオペレーター（Ｔｅｔ−Ｏ）配列に作動可能に連結されている、請求項２に記載の組換えウイルス。
4. 前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、前記第３のプロモーターおよび前記第４のプロモーターのうちの１つ以上は、ｈＣＭＶ最初期プロモーターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
5. 前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、前記第３のプロモーターおよび前記第４のプロモーターのうちの１つ以上は、ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２の最初期プロモーターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
6. 前記ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２の最初期プロモーターは、ＩＣＰ４である、請求項５に記載の組換えウイルス。
7. 前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、前記第３のプロモーターおよび前記第４のプロモーターは、すべてＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２の最初期プロモーターである、請求項５に記載の組換えウイルス。
8. 前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、前記第３のプロモーターおよび前記第４のプロモーターは、ＩＣＰ４プロモーターである、請求項５に記載の組換えウイルス。
9. ａ）前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、前記第３のプロモーターおよび前記第４のプロモーターは、各々ＴＡＴＡエレメントを有し；
   ｂ）前記第１のＴｅｔ−Ｏ配列、前記第２のＴｅｔ−Ｏ配列、前記第３のＴｅｔ−Ｏ配列および前記第４のＴｅｔ−Ｏ配列の各々は、２〜２０個連結するヌクレオチドによってつながれた２個のｏｐ２リプレッサー結合部位を含み、ここで該ｔｅｔオペレーターにおける最初のヌクレオチドは、該ＴＡＴＡエレメントにおける最後のヌクレオチドに対して６〜２４ヌクレオチド、３’側にあり；
   ｃ）ＨＳＶ−２ ｇＤ２をコードする前記配列およびＨＳＶ−２ ｇＤ２をコードする前記第２の配列は、該第１のｔｅｔ−Ｏ配列および該第２のｔｅｔ−Ｏ配列に対して３’側にあり、該第１のプロモーターおよび該第２のプロモーターに作動可能に連結されており、
   ｄ）ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２のＵＬ９タンパク質の前記第１のドミナントネガティブ変異体形態をコードする前記配列は、該第３のＴｅｔ−Ｏ配列に対して３’側にあり、該第３のプロモーターに作動可能に連結されており；
   ｅ）ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２のＵＬ９タンパク質の前記第２のドミナントネガティブ変異体形態をコードする前記配列は、該第４のＴｅｔ−Ｏ配列に対して３’側にあり、該第４のプロモーターに作動可能に連結されている、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
10. ＵＬ９タンパク質の前記変異体形態は、ＵＬ９−Ｃ５３５Ｃである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
11. 前記組換えウイルスはまた、１個以上の組換え免疫調節遺伝子を発現する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
12. 前記組換えウイルスは、ＩＬ１２を発現する、請求項１１に記載の組換えウイルス。
13. 前記組換えウイルスは、ＩＬ１５を発現する、請求項１１に記載の組換えウイルス。
14. 前記組換えウイルスはまた、前記ｔｅｔＯを有するＨＳＶ最初期プロモーターもしくはｈＣＭＶ最初期プロモーターの制御下で、ＨＳＶ−２ ｇＢを発現する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
15. 前記組換えウイルスはまた、前記ｔｅｔＯを有するＨＳＶ最初期プロモーターもしくはｈＣＭＶ最初期プロモーターの制御下で、ＨＳＶ−２ ｇＣを発現する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
16. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組換えウイルスを単位用量形態で含む、ワクチン。
17. 前記組換えウイルスは、１×１０^７ ｐｆｕ／単位用量の最小限の量で存在する、請求項１６に記載のワクチン。
18. 前記組換えウイルスは、１×１０^７〜１×１０^９ ｐｆｕ／単位用量において存在する、請求項１６に記載のワクチン。
19. ＨＳＶ−１感染もしくはＨＳＶ−２感染に対して患者を免疫する方法であって、該方法は、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のワクチンを該患者に投与する工程を包含する、方法。
20. 前記患者は、ＨＳＶ−１に対してセロポジティブである、請求項１９に記載の方法。
21. 前記患者は、ＨＳＶ−２に対してセロポジティブである、請求項１９に記載の方法。
22. 前記患者は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方に対してセロポジティブである、請求項１９に記載の方法。
23. 前記個体は、ＨＳＶ−１感染およびＨＳＶ−２感染に対してセロネガティブである、請求項１９に記載の方法。