-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Verwendung von
modifizierten Herpes Simplex Viren als therapeutische Behandlung
für Tumoren.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Die
Entwicklung von Viren als Antikrebsmittel ist eine faszinierende,
aber trügerische
Strategie gewesen. Das Ziel der viralen Antikrebs-Therapie ist es, einen
kleinen Prozentsatz an Tumorzellen mit replikationskompetenten Viren
zu inokulieren, was zu einer viralen Replikation in den angesteuerten
Tumorzellen führt,
gefolgt durch zelluläre
Lysis (Onkolyse) und Infektion der umgebenden Tumorzellen. Ein Schlüssel zur
viralen Onkolyse ist die genetische Modifikation des Virus, so dass
die Replikation hauptsächlich
in Tumorzellen stattfindet und nicht in dem umgebenden normalen
Gewebe. Viele Strategien haben auf der Verwendung von genetisch
modifizierten Viren für
die Onkolyse fokussiert. Beispielsweise wurden, in einem Ansatz,
attenuierte Retroviren erzeugt, die derart modifiziert waren, dass
sie Herpes simplex Virus (HSV) Thymidinkinase kodierten, um damit
sich teilende Tumorzellen anzusteuern [Culver, et al., Science 256:1550–1552 (1992);
Ram, et al, Nat. Med. 3:1354–1361
(1997)]. In dieser Technik war allerdings die virale Infektion von
Tumorzellen limitiert, da nur 10 bis 15% der Tumorzellen aktiv den Zellzyklus
durchschritten. In einem anderen Ansatz wurden konditionell replikationskompetente
Adenoviren (E1b deletierte) entwickelt, damit sie nur in Tumorzellen
replizieren, denen p53 fehlt, allerdings wird nur von 50% der Tumoren
angenommen, dass sie nicht-funktionelles p53 enthalten [Bischoff,
et al., Science 274:373–376
(1996); Heise, et al. Nat. Med. 3:639–645 (1997); Holstein, et al.,
Science 253:49–53
(1991)]. Der Erfolg dieser Strategien war daher experimentell nur
auf kleine Tumorheterotransplantate limitiert.
-
Kürzlich wurde
genetisch veränderter
replikationskompetenter HSV zum Behandeln von malignen Gliomen vorgeschlagen
[Martuza, et al., Science 252:854–856 (1991)]. In der Anti-Gliomtherapie
wurden HSV-1-Mutanten konstruiert, um vorzugsweise in prolieferierenden
Tumorzellen zu replizieren, wodurch das Risiko einer weit verbreiteten
Verteilung des Virus im zentralen Nervensystem eliminiert wurde,
die in seltenen Fällen
von HSV-Enzephalitis
im Menschen beobachtet wird. Anfängliche
Strategien fokusierten auf der Deletion von viralen Genen, die Enzyme
kodieren, die für
virale DNA-Synthese benötigt werden
(z.B. Thymidinkinase, Ribonukleotidreduktase [Martuza, et al., Science
252:854–856 (1991);
Mineta, et al., Cancer Res. 54:3963–3966 (1994)]). Neuere Studien
konzentrierten sich auf die Verwendung von HSV-Mutanten, denen ein
neu identifiziertes 5-Gen fehlt, das an den Neurovirulenz beteiligt
ist [Chou, et al., Science 250:1262–1266 (1990); Chou, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:3266–3270 (1992); Chou, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:10516–10520 (1995); Andreansky,
et al. Cancer Res. 57:1502–1509
(1997)]. Die Kombination vorhergehender Resultate legte allerdings
nahe, dass eine Abnahme im viralen prolifertiven Potential, die
für eine
sichere intracraniale HSV-Inokulierung erforderlich
ist, mit einer Abnahme des onkolytischen Potentials des Virus korreliert
[Advani, et al. Gene Ther. 5:160–165 (1998)]. Die potentiellen
therapeutischen Wirkungen eines genetisch veränderten HSV, der eine größere Antitumoreffizienz
als diejenige zeigt, die für
eine intracraniale Inokulierung möglich ist, ist nicht in Modellen üblicher
humaner Tumore studiert worden.
-
HSV
bietet viele Vorteile als ein onkolytisches Mittel. Das Virus repliziert
gut in einer großen Vielzahl
von Krebszellen und es zerstört
die Zellen, in denen es repliziert. Das Virus kann durch Einführen von
spezifischen Deletionen attenuiert werden und es toleriert die Insertion
und Expression von fremden Genen [Meignier, et al., J. Infect. Dis.
158:602–614 (1988)].
Außerdem
sind die Funktionen von vielen viralen HSV-Genen bekannt [Shih,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 81:5867–5870 (1984); Roizman, Proc.
Natl. Acad. Sci (USA) 93:11307–11312
(1996)]. Die unerwünschten
Eigenschaften von HSV schließen
allerdings Neuroinvasivität,
die Fähigkeit,
ein Latenz zu etablieren und die Kapazität, aus dem Latenzstadium zu
reaktivieren, ein.
-
Eine
vorhergehende Arbeit hat die interaktiven Wirkungen der zytolytischen
Kapazität
von modifiziertem HSV, dem beide γ134.5-Gene fehlen, und ionisierende Bestrahlung
auf Gliomheterotransplantate gezeigt [Advani, et al., Gene Ther.
5:160–165 (1998)].
Ionisierende Bestrahlung kombiniert mit der Inokulierung mit γ134.5-defizienten
HSV-Viren führte zu
einer supra-additiven Reduzierung des Volumens des Tumorheterotransplantats
und zu einer Verstärkung
der viralen Proliferation und intratumoralen Verteilung in Gliomheterotransplantaten.
-
In
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) Vol. 92, 1411–1415 (1995) werden HSV-Mutanten,
die entweder eine Deletion beider γ134.5-Gene
oder ein Stopkodon in beiden γ134.5-Genen aufweisen, in der Tumorbehandlung
verwendet.
-
R7020
ist ein solcher HSV-Stamm, der durch genetische Veränderung
attenuiert wurde und in einer Vielzahl von Nagern, Kaninchen und nicht-menschlichen
Primatenmodellen getestet wurde [Meignier, et al., J. Infect. Dis.
158:602–614 (1988);
Meignier, et al., J. Infect. Dis. 162:313–321 (1990)], die gezeigt haben,
dass die virale Infektivität in
allen getesteten Spezies attenuiert ist. Eine Schlüsseleigenschaft,
die vorliegend bei diesem Stamm von Interesse ist, ist das Fehlen
der Neuroinvasivität
sogar in den am meisten empfänglichen, bislang
gestesteten Spezies. R7020 ist ein modifizierter HSV-Stamm, der
als Kandidat für
die humane Immunisierung gegen HSV-1- und HSV-2-Infektionen entwickelt
wurde [Meignier, et al., Infect. Dis. 158:602–614 (1988)]. Ursprünglich hergestellt,
um ein lebendes attenuiertes virales Vakzin gegen HSV-Infektion
zu sein, wurde R7020 bezüglich
der Sicherheit und Stabilität
in Nagern und Primatenstudien untersucht [Meignier, et al., J. Infect.
Dis. 158:602–614
(1988); Meignier, et al., J. Infect. Dis. 162:313–321 (1990)].
Die Konstruktion von R7020 ist kürzlich
beschrieben worden [Meignier, et al., J. Infect. Dis. 158:602–614 (1988);
und Roizman, US-Patent Nr.: 4,859,587, vorliegend als Referenz eingeschlossen].
Kurz gesagt besteht Wildtyp-HSV-DNA aus zwei Regionen von einzigartigen
Doppelstrang-DNA-Sequenzen, die durch invertierte Wiederholungen
flankiert werden [Roizman, et al., Proc Natl. Acad. Sci. (USA) 93:11307–11312 (1996)].
Die invertierten Wiederholungsregionen enthalten zwei Kopien von
fünf Genen,
die als α0, α4, γ134.5,
ORF P und ORF O bezeichnet werden. R7020 enthält ein HSV-2-DNA-Fragment,
das an Stelle eines Sets der Repeats eingefügt worden war und dem daher
nur eine der zwei Kopien des γ134.5-Gens fehlt. Vorherige Arbeiten haben
gezeigt, dass in gewissen Zelllinien, R7020 effizienter repliziert
als Viren, denen beide Kopien des γ134.5-Gens
fehlen [Advani, et al. Gene Ther. 5:160–165 (1998)]. Bislang ist R7020
beschränkten
Untersuchungen im Menschen unterworfen worden.
-
Eine
der Ursachen des Scheiterns in der Krebstherapie ist die Tumorzellresistenz
gegenüber konventionellen
cytotoxischen und/oder hormonellen Behandlungen, die aus der genetischen
Instabilität resultiert,
die durch diese Mittel hervorgerufen wird und aus der inhärenten Instabilität von Tumorzellen. Beispielsweise
kann die p53-Gendeletion oder -mutation die Empfänglichkeit der Tumorzelle gegenüber Apoptose,
die durch Chemotherapie und/oder Bestrahlung induziert wurde, erniedrigen
[Houldsworth, et al., Oncogene 16:2345–2349 (1998); Aas. et al. Nat.
Med. 2:811–814
(1998); Lowe, et al., Science 266:807–810 (1994); Dalta, et al.,
Cell Growth Differ. 6:363–370
(1995)] und Mutationen im Androgenrezeptor führen zur Hormonresistenz bei
Prostatakrebs. Außerdem
verstärken "Erhalt von Funktionen"-Mutationen, wie
die Aktivierung der bcl-2-Familie von Genen, die Resistenz gegenüber einer
Vielzahl von cytotoxischen Therapien. Zusätzlich zur intrinsischen genetischen
Instabilität
von Tumorzellen sind allgemein verwendete Antikrebstherapien, die auf
einem DNA-Schaden der Tumorzellen beruhen, mutagen und eine Konsequenz
der Antikrebsbehandlung ist die Auswahl und Evolution der Resistenz
gegenüber
DNA-schädigenden
Mitteln. Ein Nutzen des Verwendens der viralen Lyse als eine Antitumorstrategie
ist, dass die virale Lyse das Potential hat, die Tumorresistenz
gegenüber
konventionellen Mitteln zu überwinden.
Da die Tumorzellinfektion mit replikationskompetentem Herpes zu
einer Zelllyse führt
und nicht per se mutagen ist, ist es weniger wahrscheinlich, dass
innerhalb der Tumorzellpopulation eine selektive Evolution von Tumorzellen
zum Entkommen von Herpes auftritt.
-
Es
besteht daher im Stand der Technik ein Bedürfnis, virale therapeutische
Mittel und wirksame Verfahren zum Behandeln, zum Retardieren und/oder
Reduzieren des Tumorwachstums in Patienten, die dieses benötigen, zu
identifizieren und zu entwickeln.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren zum Behandeln von Krebs
umfassend die Schritte des Verabreichens an ein dieses benötigendes
Individuum einer wirksamen Menge eines Herpes Simplex Virus (HSV),
der ein modifiziertes HSV-Genom umfasst, wobei die Modifikation
eine Modifikation einer invertierten Wiederholungsregion des HSV-Genoms
umfasst. Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung
eines genetisch modifizierten Herpes Simplex Virus (HSV) bereit,
wobei die Modifikation eine Deletion einer invertierten Wiederholungsregion
des HSV-Genoms umfasst, so dass die Region unfähig gemacht wird, ein aktives Genprodukt
von nur einer Kopie von jedem von α0, α4, ORF O, ORF P und γ134.5
zu exprimieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
zur Behandlung von Krebs. In einer Ausführungsform schließt die Erfindung
die Verwendung von HSV-Stämmen
ein, wobei die Modifizierung der invertierten Wiederholungsregion
des Genoms eine Veränderung
einer Kopie eines γ134.5-Gens umfasst, welche die Kopie des
Gens unfähig
macht, ein aktives Genprodukt zu exprimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Erfindung die Verwendung eines HSV-Stammes, wobei die Veränderung des γ134.5-Gens
(i) eine Einfügung
einer DNA-Sequenz, die eine oder mehrere Nukleotide umfasst, in die
kodierende Region oder regulatorische Region des Gens oder (ii)
eine Deletion der gesamten oder Teile der kodierenden Region oder
regulatorischen Region des Gens umfasst. Die Erfindung schließt auch
die Verwendung von HSV-Stämmen
ein, wobei das modifizierte HSV-Genom ferner eine Veränderung
in einer einzigartigen Region des HSV-Genoms umfasst.
-
Die
Erfindung schließt
die Verwendung des HSV bei der Herstellung der pharmazeutischen
Zusammensetzung für
die Behandlung von nicht-zentralem Nervensystemkrebs genauso wie
zentralem Nervensystemkrebs ein.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG
-
Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von HSV bei der Herstellung
von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung einer Vielzahl
von Tumoren einschließlich
von nicht-zentralen Nervensystemtumoren und von Tumoren, die aus
dem zentralen Nervensystem stammen, bereit. Die Behandlung schließt das Infizieren
von Zieltumoren mit genetisch modifiziertem Herpes Simplex Virus
ein, wobei die Modifizierung eine Modifizierung einer internen Wiederholungsregion
des Herpes Simplex Virusgenoms umfasst. Die Modifizierung des Herpes
Simplex Virusgenoms umfasst die Deletion einer Kopie der internen
Wiederholungssequenz des viralen Gens, wobei die Region eine Kopie
von jedem von α0, α4, ORF O,
ORF P und γ134.5-Genen umfasst. Die Herpes Simplex Viren,
die beim Durchführen
der Erfindung nützlich
sind, sind im Vergleich zu Wildtyp-Herpes Simplex Viren attenuiert, aber
sind replikationskompetenter als Viren, bei denen beide Kopien der
invertierten Wiederholungsregion modifiziert (um die Region unfähig zu machen,
ein aktuelles Genprodukt jedes der verschiedenen Gene zu exprimieren)
oder deletiert sind. Viren, die beim Durchführen der vorliegenden Erfindung
nützlich
sind, können zusätzliche
Veränderungen
in ihrem Genom aufweisen, die die Einfügung von exprimierbaren nicht-natürlichem
Protein-kodierenden Sequenzen unter der Kontrolle von Herpes Simplex
Viruspromotoren einschließen
können,
die wiederum es der Sequenz erlauben, als eine α-, β- oder γ-Klasse von Herpes Simplex Virusgenen
reguliert zu werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind [siehe,
z.B. Fundamental Virology, Second Edition, Field et al. (Hrsg.)
Kapitel 33–34,
Raven Press Ltd., New York (1991), vorliegend als Referenz eingefügt]. Viren,
denen eine interne Wiederholung fehlt, können durch die Deletion eines
oder mehrerer der 46 anderen Gene (andere als diejenigen, auf die
vorliegend Bezug genommen wird, d.h. α0, α4, ORF O, ORF P und γ134.5),
von denen gefunden wurde, dass sie für die virale Replikation in
Kultur entbehrlich sind [Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),
Vol. 93, Seiten 11307–11312, (1996)],
falls notwendig weiter attenuiert wer den. Unter den Genen, die für Deletion
zum weiteren Erniedrigen der Virulenz geeignet sind, sind die UL16, UL40, UL41, UL55, UL56, α22,
US4, US8 und US11 Gene. Die Deletion nahezu jedes der "entbehrlichen" Gene wird die Virulent
um einen Faktor reduzieren, der sich zwischen zweifach und mehreren
Logarithmen bewegt. Zusätzlich
können
Kandidatenviren, denen die internen invertierten Wiederholungen
fehlen, weiter durch die Zugabe von Zytokinen verändert werden,
genauso wie von Enzymen, die Vorläufer von Arzneimitteln aktivieren.
-
Herpes
Viren, die bei der Durchführung
der Erfindung nützlich
sind, können
unter Verwenden von Verfahren hergestellt werden, die im Stand der
Technik gut bekannt sind, wie Verfahren, die in US-Patent Nr. 4,859,587
und in US-Patent Nr. 5,288,641 beschrieben werden.
-
Die
unten dargestellten Beispiele beschreiben die Verwendung von Herpes
Simplex Virus Typ HSV-1-Stamm R7020, um die Tumorgröße in Mäusen zu
reduzieren. Die Verwendung von Mäusen
als Modell für
die Behandlung von Tumorerkrankungen ist gut bekannt und im Stand
der Technik breit akzeptiert. Beispiel 1 beschreibt die Struktur
von HSV-1 Stamm R7020, wobei der Virusstamm für die Typen von genetisch modifizierten
Viren, die bei der Durchführung
der vorliegenden Erfindung nützlich
sind, beispielhaft ist. Beispiel 2 beschreibt die Verwendung eines
modifizierten HSV-1, um das Tumorvolumen einer transplantierten
epidermalen Karzinoma-Zelllinie in Mäusen zu reduzieren.
-
Beispiel
3 beschreibt die Kinetiken der viralen Replikation in den epidermalen
Karzinomheterotransplantaten, die in Beispiel 1 beschrieben werden. Die
in Beispiel 4 beschriebenen Experimente etablieren, dass epidermale
Karzinomen, die aus residualen Tumorzellen entstehen, ihre Empfänglichkeit
bezüglich
der Infektion durch HSV-1 R7020 behalten.
-
Die
folgenden Beispiele werden als Illustrierung präsentiert und sind nicht dazu
gedacht, den Schutzbereich der Erfindung, wie in den angehängten Ansprüchen beschrieben,
zu limitieren.
-
Beispiel 1
-
Struktur des HSV-Stamms
R7020
-
Die
Struktur von R7020 (A.T.C.C. Zugangsnr.: VR2123, hinterlegt am 10.
Dezember 1985), wie zuvor beschrieben [Meignier, et al. J. Infect.
Dis. 158:602–614
(1988)] schließt
eine Insertion umfassend ein HindIII-Fragment der HSV-2-DNA ein,
das Gensequenzen einschließt,
die verschiedene Glycoproteine kodieren, eingefügt in die Joint-Region des parenteralen
HSV-Genoms. Eine detaillierte Analyse der R7020-Struktur ergab Unterschiede
bezüglich derjenigen,
die durch Meignier, et al. berichtet wurde, wie unten beschrieben.
-
Erstens
lässt die
Insertion der HSV-2-Sequenz das parenterale HSV-1 UL55-Gen
intakt, während
vorherige Berichte zeigten, dass ein Teil des UL55-Gens
deletiert war. Das UL55-Gen hat allerdings keine bekannte Funktion
und beeinflusst wahrscheinlich nicht die Sicherheit des Virus. Zusätzlich gehen
der UL55-Region 300 bp einer "unbekannten Sequenz" an der Joint-Region
voran. Wie zuvor berichtet wurde die UL56-Region,
die mit Pathogenese in Zusammenhang gebracht wurde [Kehm, et al.,
Virus Res 40:17–40
(1996)] in der korrigierten Sequenz nicht gefunden.
-
Zweitens
sind die UL56-Sequenzen an der Joint-Region
verdoppelt, was wahrscheinlich zu defekten Genomen führt, die
in einer vorhersagbaren und reproduzierbaren Weise entstehen. Von
defekten Genomen ist bekannt, dass sie spontan in HSV-1-Stocks entstehen,
wenn sie mit hoher Multiplizität
passagiert werden und defekte Genome entstehen in R7020 reproduzierbarer
und häufiger.
Eine Passage mit tiefer Multiplizität der Infektion, wie es Routine
ist, minimiert allerdings die Akkumulierung von defekten Genomen.
-
In
einem anderen Unterschied wurden nur 5229 bp der ursprünglich vorhergesagten
9629 bp der HSV-2-Sequenz in R7020 gefunden.
-
Beispiel 2
-
Volumetrische
Reduktion von Tumorheterotransplantat
-
In
einer ersten Experimentenserien, wurden SQ-206-Zellen, eine chemotherapie-/bestrahlungsresistente
epidermale Karzinomzelllinie, die ein nicht-funktionelles p53 exprimiert,
oder PC-3-Zellen, eine hormonunabhängige p53+-Prostata-Adenokarzinomzelllinie,
in das Hinterbein von nackten Mäusen injiziert.
SQ20b ist eine epidermale Krebszelllinie, die von einem Patienten
nach Radiotherapie, wie woanders beschrieben, isoliert worden war
[Hallahan, et al., Nat. Med. 1:786–791 (1995)]. Die PC-3- Zelllinie wurde von
American Type Culture Collection (A.T.C.C. Nr. CRL 1435, Manassas,
VA) erhalten. Große
Tumorheterotransplantate wurden verwendet, um sich der relativen
Masse von klinisch evidenten, lokal fortgeschrittenen humanen Krebsen
anzunähern.
Im Gegensatz zu früheren
Studien, die mit einer Tumormasse von etwa 100 mm3 durchgeführt worden
waren, wurden die Experimente in dieser Serie mit Tumoren durchgeführt, die
eine durchschnittliches Anfangsvolumen von 630 mm3 entsprechend etwa
3% des Mausgewichts aufwiesen [Ram, et al. Nat. Med. 3:1354–1361 (1997)].
-
Kurz
gesagt wurden SQ-20b-Tumorzellen in Mengen von 5 × 105 Zellen pro Maus in 100 μl steriler phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
suspendiert (PBS), in das rechte Hinterbein von 5 bis 6 Wochen alten
athymischen nu/nu Mäusen
injiziert und bis zu einer Tumorgröße von 200 bis 1000 mm3 wachsen gelassen. Das Maushinterbeinmodell
ist woanders im Detail beschrieben worden [Advani, d.J. et al. Gene
Ther. 5:160–165
(1998)]. Wie zuvor berichtet ist sein größter Vorteil, dass es das Messen
der Wirkungen auf onkolytische Mittel ohne Zurückgreifen auf invasive Verfahren
gestattet. Das zuvor beschriebene Modell wurde modifiziert, um die
mittlere Größe des Heterotransplantats
von 100 auf 600 mm3 zu einem Zeitpunkt zu
erhöhen,
an dem die Virusinjektion begonnen wurde, um das Verhältnis der
Zellen zu Virus zu erhöhen
und um genauer die Größe des Tumors
in klinisch relevanten Situationen anzunähern.
-
Die
Mäuse wurden
zufällig
in zwei Behandlungsgruppen eingeteilt: (a) Kontrollen, denen 10 μl einer Pufferlösung verabreicht
wurden und (b) Mäuse,
denen 2 × 106 Plaque-Forming-Units
(pfu) von R7020 in 10 μl
eines Puffers mit einer Hamilton-Spritze verabreicht wurden. Der
genetisch veränderte R7020-Virus
stammt von HSV-1(F) ab, was der Prototyp HSV-1-Virus ist [Meignier,
et al., supra]. R7020 fehlt UL24, UL56 und ein Set der invertierten Wiederholungen
kodierend eine Kopie der Gene α0, α4, γ134.5,
ORF P und ORF O. Die deletierte Region der internen invertierten
Wiederholung von HSV-1(F) wurde durch ein DNA-Fragment ersetzt,
das die HSV-2-Glycoproteine G, J, D und I kodiert [Meignier, et
al., J. Infect. Dis. 158:602–614
(1988)]. Das Virus wurde auf Verozellen titriert (American Type
Culture Collection, Manassas, VA) wie woanders beschrieben [Chou,
et al., Science 250:1262–1266
(1990)]. Die Tumormasse wurde zweiwöchentlich oder bis das Tumorvolumen
2000 mm3 erreichte, gemessen. Tumorvolumen
wurden berechnet unter Verwendung der Formel (Länge × Breite × Höhe)/2, die von der Formel eines
Elipsoids (δd3)/6 abgeleitet ist. Tierstudien wurden gemäß einem
Protokoll durchgeführt, das
durch das Animal Resource Center an der Universität von Chicago
abgenommen wur de. Das Teiltumorvolumen wurde definiert als das Tumorvolumen
an dem spezifischen Zeitpunkt geteilt durch das anfängliche
Volumen (V/V0). Tiere wurden getötet, wenn
das Tumorvolumen 2000 mm3 überstieg. Ähnliche
Experimente wurden mit PC-3 durchgeführt, mit der einzigen Ausnahme,
dass 2 × 107 Zellen in 100 μl PBS pro Heterotransplantat
injiziert wurden.
-
Das
Resultat zeigt an, dass SQ-20b-Heterotransplantate behandelt mit
R7020 nach 13 Tagen nach Infektion abzunehmen begannen und einen Tiefstpunkt
bei 41 Tagen nach der Infektion erreichten, wobei zu diesem Zeitpunkt
die mittlere Tumorvolumenreduktion auf ein Fünftel des anfänglichen
Tumorvolumens abgenommen hatte. 72 Prozent (8 von 11) der Tumorheterotransplantate
nahmen auf weniger als 10% des anfänglichen Tumorvolumens bei Tag
41 ab, und 7 dieser 8 hielten die reduzierte Größe länger als 80 Tage.
-
R7020
war ebenso bei der Tumorvolumenabnahme von PC-3-Prostata-Adenokarzinom-Heterotransplantaten
wirksam. Das Teiltumorvolumen erreichte einen Tiefstpunkt etwa 20
bis 30 Tage nach der Infektion. R7020 war auch effektiv beim Hervorrufen
einer Abnahme eines Hepatom-Adenokarzinom-Tumorheterotransplantats.
-
Beispiel 3
-
Kinetiken der viralen
Replikation bei SQ-208-Heterotransplantaten
-
Um
die Kinetiken der viralen Replikation in den SQ-208-Heterotransplantaten
zu untersuchen, wurden die folgenden Verfahren durchgeführt. SQ-208-Heterotransplantate
wurden mit 2 × 106 pfu R7020 oder mit gepufferter Kochsalzlösung injiziert. Die
Mäuse,
die mit dem Virus injiziert worden waren, wurden in zwei Gruppen
aufgeteilt. Eine Gruppe wurde zu festgelegten Zeitpunkten getötet. Die
Tumore wurden an spezifischen Zeitpunkten nach der Infektion aseptisch
geerntet, in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bei –70 °C gelagert. Tumore wurden in 1
ml 199V und 1 ml steriler fettfreier Milch 20 Sekunden lang auf
Eis unter Verwenden eines Polytron-Gewebshomogenisators (Kinematics,
Schweiz) homogenisiert. Das Homogenat wurde dreimal 15 Sekunden
lang jedes Mal sonifiziert und das Virus wurde auf Verozellen titriert.
-
Die
Tumorvolumen in Mäusen,
die mit Kochsalzlösung
injiziert worden waren und denjenigen der zweiten Gruppe von identisch
behandelten Mäusen, die
mit Virus injiziert worden waren, wurden bezüglich des Tumorvolumens getestet.
Wie in dem Experiment in Beispiel 2 beschrieben wuchsen Tumore, denen
gepufferter Kochsalzlösung
injiziert worden waren, exponentiell, während Tumore, die mit Virus injiziert
worden waren, abnahmen. Die viralen Titer hatten ihren Höhepunkt
bei sieben Tagen nach der Infektion mit 124 × 105 pfu/Tumor,
d.h. ein 62-facher Anstieg im Virus über die Menge, die in die Tumore injiziert
worden war. Signifikante Virusmengen (größer als 105 pfu)
wurden sogar 30 Tage nach der Infektion gewonnen.
-
Beispiel 4
-
Tumorzellenresistenz gegenüber onkolytischen
Effekten von R7020
-
Um
die Fähigkeit
der SQ-20b-Tumorzellen, resistent gegenüber den onkolytischen Effekten
von R7020 zu werden, zu untersuchen, wurden die folgenden Experimente
durchgeführt.
-
Tumore
wurden wie oben beschrieben wachsen gelassen. Wenn die Tumore größer als
200 mm3 waren, wurden sie mit 2 × 106 pfu R7020 in 10 μl Puffer am Tag 0 injiziert.
Die Tumore wurden zwei-wöchentlich
gemessen. Als die Tumore bis auf ihr Starttumorvolumen (Volumen
am Tag 0) wieder gewachsen waren, wurden sie zufällig aufgeteilt und entweder
mit 10 μl
Puffer, 2 × 106 pfu R7020 oder 2 × 106 pfu
HSV-1(F) im selben Puffervolumen reinjiziert. Tiere mit einem Tumorvolumen
größer als
200 mm3 wurden gemäß institutionellen Richtlinien
getötet.
-
Die
Resultate zeigten an, dass alle drei mit Puffer reinjizierten Tumore
weiter wuchsen. Das fraktionelle Tumorvolumen nahm nach der zweiten
viralen Injektion von entweder R7020 oder HSV-1(F) ab. Tumore zeigten
weiterhin gegenüber
viraler Onkolyse eine Sensitivität
nach zwei Zyklen von R7020-Injektion und traten mindestens 120 Tage
nach dem Beginn des Experiments nicht wieder auf. Mäuse, die mit
HSV-1(F) reinjiziert worden waren, starben vier bis sechs Wochen
nach der Wildtyp-Virusinjektion, während Mäuse, die mit R7020 reinjiziert
worden waren, gediehen. Daher behalten SQ-20b-Tumore, die von residualen
Zellen in Tumoren entstehen, die zuvor mit R7020 behandelt worden
waren, ihre Empfänglichkeit
gegenüber
einer Infektion.
-
Beispiel 5
-
R7020-Behandlung in Kombination
mit Bestrahlung
-
Frühere Studien
mit Gliom-Heterotransplantaten haben gezeigt, dass die Kombination
von Bestrahlung und Verabreichung eines attenuierten HSV zu einer
verstärkten
Tumorzellzerstörung
genauso wie zu einer verstärkten
viralen Replikation führt
[Advani, et al. Gene Ther. 5:160–165 (1998)]. Um zu bestimmen,
ob die Bestrahlung der strahlungsresistenten SQ-206-Zelllinien den
onkolytischen Effekt von R7020 verstärkte, wurden Heterotransplantate
wie oben beschrieben infiziert und einem fraktionierten Bestrahlungsprotokoll
wie unten beschrieben unterworfen.
-
Die
Bestrahlung der Heterotransplantate wurde durchgeführt wie
woanders beschrieben [Advani, et al. Gene Ther. 5:160–165 (1998)].
Kurz gesagt wurden tumortragende Hinterbeine einer ionisierenden
Bestrahlung unter Verwenden eines GE 250 kv-Maxitron-Generators (191 cGy/min,
150 kVp) exponiert. Die Bestrahlung wurde beginnend nach sechs Stunden
nach Infektion mit R7020 in 400 cGy-Fraktionen an Montag, Dienstag,
Donnerstag und Freitag zwei Wochen lang bis zu einer Maximumdosis
von 3200 cGy verabreicht. Fraktionierte Bestrahlung wurde in Dosen
verabreicht, die routinemäßig in klinisch
relevanten Protokollen verwendet werden.
-
Die
Resultate zeigen an, dass die Bestrahlung alleine zu einer bescheidenen
Verzögerung
bei dem Wachstum der Heterotransplantate verglichen mit Kontrolltumoren
führte,
was die Bestrahlungsresistenz der SQ-206-Zelllinie bestätigte. Während die Reduktion
des Tumorvolumens nicht vor 13 Tagen nach Infektion von Heterotransplantaten
mit R7020, wie in Beispiel 2 beschrieben, stattfand, führte das Kombinieren
der Bestrahlung mit R7020 zu einer Tumorvolumenregression eine Woche
früher
als in Tumoren, die mit R7020 allein behandelt worden waren. Zusätzlich trat
der Tiefpunkt im Tumorvolumen signifikant früher in Heterotransplantaten
auf, die sowohl Bestrahlung als auch R7020 erhalten hatten, verglichen
mit Heterotransplantaten, die R7020 alleine erhalten hatten (Tag
20 gegenüber
Tag 30).
-
Diese
Resultate zeigen erstmals dramatische Antitumorwirksamkeit von R7020
bei der Behandlung von experimentellen humanen Tumoren, die häufig gegenüber gewöhnlichen
Krebsbehandlungen resistent sind und legen nahe, dass, während R7020
ein wirksames Antitumormittel selbst ist, das Kombinieren der Bestrahlung
mit R7020 auch eine schnellere und vollständigere Tumorzellzerstörung ermöglicht.
Die Kombination von Bestrahlung und attenuiertem HSV als eine Antikrebstherapie
kann sich als besonders vorteilhaft in klinischen Situationen erweisen,
bei denen die Tumorlast zu groß sein
kann für
eine Therapie mit einem einzigen Mittel.