DE69728914T2

DE69728914T2 - Pharmazeutische Zusammensetzung gegen durch Papillomaviren verursachte Tumoren und Infektionen

Info

Publication number: DE69728914T2
Application number: DE69728914T
Authority: DE
Inventors: Jean-Marc Balloul; Nadine Bizouarne; Marie Paule Kieny
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1997-07-29
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2017-07-30
Also published as: ES2163795T3; CA2234263A1; DK1149910T3; JP2000500662A; CA2234263C; EP0862634A1; WO1998004705A1; ATE205881T1; ATE265535T1; DE69706825D1; DE69706825T3; EP0862634B2; JP4198735B2; EP1149910A1; FR2751879B1; HK1043809A1; AU736720B2; JP2007254474A; ES2215805T3; DK0862634T4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen, die mit Papillomaviren, insbesondere den humanen Papillomaviren (HPV) vom Typ 16, 18, 31, 33 und 45, in Verbindung stehen, bestimmt ist.
Die Papillomaviren sind DNA-Viren, welche ein zirkuläres Genom von etwa 7900 Basenpaaren, umhüllt von einem Capsidprotein, aufweisen. Es wurden eine Anzahl von bovinen (BPV) und humanen (HPV) Papillomaviren identifiziert und ihr Genom sequenziert (Pfister, 1987, in The papovaviridae: The Papillomaviruses (Edition Salzmann und Howley) Plenum Press, New York, S. 1–38). Es enthält eine frühe Region und eine späte Region. Die späte Region enthält zwei Leseraster L1 und L2, welche für die Hauptbestandteile des Capsids kodieren. Die frühe Region enthält wenigstens die Leseraster E1, E2, E4, E5, E6 und E7. Die Expressionsprodukte E1 und E2 regulieren die virale Replikation und die Expression der viralen Gene, während die der Bereiche E5, E6 und E7 in die onkogenen Transformationsprozesse der infizierten Zellen verwickelt sind. Es konnte experimentell gezeigt werden, dass das Protein E5 von BPV-1 in vitro Zellen transformieren kann (Schlegel et al., 1986, Science 233, 464–467). Die Proteine E6 von BPV-1 und E7 von HPV-16 sind in die Induktion und Aufrechterhaltung der onkogenen Transformation verwickelt. Das Transformationsvermögen von E7 wurde für HPV-16 und HPV-18 gezeigt (Kanda et al., 1988, J. Virol 62, 610–613, Vousden et. al., 1988, Oncogene Res. 3, 1–9; Bedell et al., 1987, J. Virol 61, 3635–3640). Die Funktion von E4 wurde nicht aufgeklärt.
Beim Menschen stehen die HPV in Verbindung mit Pathologien, die von gutartigen Infektionen der Haut über Warzen bis hin zu bösartigen Tumoren gehen. Diese Viren sind hochspezifisch für die Epithelien der Epidermis der Genitalwege, oralen und respiratorischen Wege. Die epidemiologischen Daten zeigen die Rolle bestimmter Stämme bei Krebs des Uterushalses und der darunter liegenden Wege, insbesondere HPV-16 und 18, und, in geringerem Ausmaß, HPV-31, 33 und 45. Uterushalskrebs ist der zweithäufigste Krebs in der weiblichen Bevölkerung. Gemäß OMS werden jedes Jahr 460 000 neue Fälle registriert, von denen wenigstens 200 000 Fälle eindeutig mit HPV in Verbindung stehen. Eine Anzahl von Studien zeigt die transformierende Rolle dieser Viren, ihre spezifische Integration in das Genom der neoplastischen Zellen, ihre Genaktivität in den Krebszellen und die Wichtigkeit der Expression dieser frühen Gene E6 und E7 bei der Aufrechterhaltung des bösartigen Phänotyps der neoplastischen HPV-positiven Zellen (Monsenego, J. Impact Medecin, 11. März 1994).
Die mit den HPV-Viren in Verbindung stehenden Pathologien stellen aufgrund ihrer dauerhaften und rückfälligen Natur ein therapeutisches Problem dar. Es wurden bereits eine Anzahl von Ansätzen bei der Behandlung dieser Erkrankungen verwendet, wie die Chirurgie, die Chemotherapie, antivirale Mittel und die Immuntherapie.
Das europäische Patent EP 0 462 187 beschreibt einen Impfansatz, welcher die frühen Gene des Papillomavirus verwendet, um eine Immunität hinsichtlich der aus der Integration des HPV-Genoms in die zelluläre DNA resultierenden Tumoren, in denen die Proteine des Capsids nicht mehr exprimiert werden, zu etablieren. Die Anmeldung WO93/02184 beschreibt einen therapeutischen Ansatz basierend auf der Verwendung von Antigenen des Capsids als immunogene Agenzien. Diese Dokumente erwähnen nicht die Möglichkeit, die präventive Wirkung, die durch die frühen Polypeptide hervorgerufen wird, und die kurative Wirkung, die durch die späten Polypeptide der Papillomaviren verursacht werden, zu verbinden, um Zusammensetzungen zu erhalten, die an die Gesamtheit der schweren durch HPV verursachten Pathologien angepasst sind. Außerdem wurde im Verlauf der vergangenen Jahre vorgeschlagen, Polypeptide zu verwenden, die eine immunstimulierende Wirkung aufweisen, mit dem Ziel, die T-Zellen zu aktivieren, mit mehr oder weniger zufriedenstellendem Ergebnis bezüglich der anvisierten Pathologien (siehe beispielsweise WO96/11279).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Präparat, basierend auf einer Mischung von Antigenen, welche aus den frühen und späten Regionen eines Papillomavirus stammen, oder auf einem Vektor, der diese gleichzeitig exprimiert, mit dem Ziel, eine dauerhafte Immunität gegen die infizierten Zellen zu etablieren. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgeschlagenen Vaccine können präventiv (Immunprophylaxe) zur Begrenzung der Entwicklung oder Ausbreitung der viralen Infektion auf benachbarte Gewebe oder kurativ (Immuntherapie) zur Verhinderung oder Reduzierung einer Tumorentwicklung bei infizierten Patienten verwendet werden. Die Verwendung von Capsid-Antigenen induziert die Produktion von Antikörpern gegen die antigenen Epitope, welche auf der Oberfläche der viralen Partikel lokalisiert sind, wodurch eine dauerhafte Etablierung der Infektion verhindert wird. Die Verwendung von frühen Proteinen ermöglicht die Induzierung einer Immunität gegen die infizierten Zellen nach der Integration der viralen DNA.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Präparat, welches ein Polypeptid, das aus einem Papillomavirus stammt, und ein immunstimulierendes Molekül verbindet. Einer der Vorteile einer derartigen Zusammensetzung ist, dass sie die spezifische Immunität, welche durch die viralen Antigene induziert wird, und die unspezifische Immunität, welche durch das immunstimulierende Molekül induziert wird und dazu bestimmt ist, die spezifische Antwort zu verstärken, kombiniert.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, welche die Behandlung von HPV-Infektionen, und insbesondere von schweren Patholien, wie Uterushalskrebs, mit besserer Wirksamkeit als die Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus, welche als therapeutische Wirkstoffe ein oder mehrere Polypeptide, die aus einer frühen Region eines Papillomavirus stammen, und eines oder mehrere der Polypeptide mit immunstimulierender Wirkung Interleukin-2, Interleukin-7, und/oder die Co-Adhäsionsmoleküle B7.1 und/oder B7.2 enthält.
Der Begriff Polypeptid bezieht sich im allgemeinen insgesamt oder teilweise auf ein natives Polypeptid, ein chimäres Polypeptid, welches aus der Fusion von Sequenzen verschiedenen Ursprungs stammt, oder eine Variante, die durch wenigstens eine Mutation (Deletion, Insertion und/oder Substitution) einer Aminosäure gekennzeichnet ist. Insbesondere weist ein Polypeptid zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz auf, deren Übereinstimmungsgrad mit der Sequenz des nativen Proteins über 75%, vorteilhafterweise über 85%, und bevorzugt über 95%, liegt. Der Übereinstimmungsgrad kann leicht mit Hilfe eines geeigneten Computerprogramms oder durch Anordnung der Sequenzen derart, dass eine maximale Homologie erhalten wird, und durch Bestimmung der Anzahl der Positionen, in denen die Aminosäuren der zwei Sequenzen identisch sind, im Verhältnis zu der Gesamtzahl an Positionen, berechnet werden. Die Sequenz der Genome von HPV-16 und HPV-18 ist in der Genbank unter den Hinterlegungsnummern K02718 bzw. X05015 veröffentlicht.
Wie zuvor erwähnt, kodiert das Genom von Viren der Papillomavirusfamilie, insbesondere BPV und HPV, für wenigstens 8 Polypeptide, zwei späte Polypeptide L1 und L2, welche das virale Capsid bilden, und 6 frühe Polypeptide (E1, E2, E4, E5, E6 und E7), welche in die Regulation, die Aufrechterhaltung des viralen Genoms und die Transformation der infizierten Zellen verwickelt sind.
Obwohl die Gesamtheit der frühen Proteine eines Papillomavirus im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wird vorteilhafterweise ein Polypeptid, welches von dem Protein E6, dem Protein E7 oder den Proteinen E6 und E7 abstammt, verwendet. Es kann vorteilhaft sein, auf eine nicht onkogene Variante, die auf Höhe der Regionen, die in den Transformationensprozess der infizierten Zellen verwickelt sind, mutiert ist, auszuweichen. Derartige Varianten sind in der Literatur beschrieben (Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099–4105; Crook et al., 1991, Cell 67, 547–556; Heck et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442–4446; Phelps et al., 1992, J. Virol. 66, 2418–2427).
Ein bevorzugtes Polypeptid aus der späten Region eines Papillomavirus ist von dem Protein L1, dem Protein L2 oder den Proteinen L1 und L2 abgeleitet.
Unter "immunstimulierend" wird die Fähigkeit verstanden, eine humorale Immunantwort zu stimulieren, indem B-Lymphozyten aktiviert werden, um die Produktion von Antikörpern, die gegen die Papillomavirus-Antigene gerichtet sind, zu amplifizieren, oder eine Immunantwort durch zelluläre Vermittlung zu stimulieren, indem die T-Lymphozyten aktiviert werden, um eine signifikante cytotoxische Antwort auszulösen, die gegen die tumoralen oder durch ein Papillomavirus infizierten Zellen gerichtet ist. Die Immunstimulation kann im Tiermodell bewertet werden (durch Vergleich der Abstoßungsrate in einem Tier, dem ein Tumor implantiert wurde, welcher das Ziel-Antigen exprimiert, in Gegenwart und Abwesenheit des Immunstimulators). Allgemein sind die Mittel zum Nachweis einer Immunstimulation in Roitt (Immunology, 4. Edition, Moby Ltd.) angegeben.
Es kann ein immunstimulierendes natives Molekül, welches in einem Säugetier und insbesondere beim Menschen gefunden wird, ein Teil davon, ein chimäres Molekül, welches aus der Fusion von Sequenzen verschiedenen Ursprungs entstanden ist, oder eine Mut ante verwendet werden, immer unter der Voraussetzung, dass die immunstimulierende Wirkung beibehalten wird. Unter allen in Betracht kommenden Molekülen ist die Verwendung eines Polypeptids, welches aus Interleukin-2, Interleukin-7, den Co-Adhäsionsmolekülen B7.1 und B7.2 besteht oder davon abgeleitet ist, bevorzugt, wobei das Interleukin-2 und das Molekül B7.1 im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt sind.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält:

(1) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region E7 eines Papillomavirus stammt, und ein Polypeptid, welches vom Interleukin-2 abgeleitet ist,
(2) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region E7 eines Papillomavirus stammt, und ein Polypeptid, welches vom Molekül B7.1 abgeleitet ist,
(3) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region E7 eines Papillomavirus stammt, ein Polypeptid, welches von dem Molekül B7.1 abgeleitet ist, und ein Polypeptid, welches vom Interleukin-2 abgeleitet ist.

Bei Übertragung der obigen Beobachtungen auf die Infektionsfrequenz durch bestimmte HPV-Typen im Fall von Uterushalskrebs, enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung ein Polypeptid, welches von einem gefährlichen Papillomavirus des Typs HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 und/oder HPV-45, insbesondere vom HPV-16-Virus, abstammt. Wenn die Zusammensetzung mehrere Papillomavirus-Antigene enthält, können diese gleichen oder verschiedenen Ursprungs sein.
Ein Polypeptid, welches von einem Papillomavirus stammt oder eine immunstimulierende Wirkung aufweist, kann durch die konventionellen Methoden der chemischen Synthese oder auch durch die rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden (siehe beispiels weise Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Insbesondere umfasst ein Herstellungsverfahren das Kultivieren einer Zelle, die mit einem DNA-Fragment transformiert wurde, welches für das fragliche Polypeptid kodiert, um eine produzierende Zelle zu erzeugen, und das Polypeptid aus der Kultur zu gewinnen. Bei der produzierenden Zelle kann es sich beispielsweise um ein Bakterium, eine Hefe oder auch eine Säugetierzelle handeln, wobei das betrachtete DNA-Fragment entweder in das Genom oder in einen geeigneten Expressionsvektor, welcher sich replizieren kann, integriert ist. Das DNA-Fragment wird unter der Kontrolle von Transkriptions- und Translationssignalen platziert, die seine Expression in der produzierenden Zelle ermöglichen. Expressionsvektoren und Regulierungssignale sind dem Fachmann bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus, welche als therapeutische(n) Wirkstoff(e) einen oder mehrere rekombinante Vektoren, in den/die DNA-Fragmente eingefügt sind, die für ein oder mehrere Polypeptide kodieren, die aus einer frühen Region eines Papillomavirus stammen, und eines oder mehrere der Polypeptide mit immunstimulierender Wirkung Interleukin-2, Interleukin-7 und/oder die Co-Adhäsionsmoleküle B7.1 und B7.2 enthält, wobei die DNA-Fragmente unter der Kontrolle von Elementen platziert sind, die für ihre Expression in einer Wirtzelle oder einem Wirtorganismus notwendig sind.
Gemäß dieser bevorzugten Alternative ist der therapeutische Wirkstoff ein Vektor, in den die DNA-Fragmente, welche für die Polypeptide kodieren, die von einem Papillomavirus stammen, oder die zuvor definierten Immunstimulatoren eingefügt sind. Dieser Zusammensetzungstyp weist den Vorteil einer kostengünstigen Produktion und hohen Stabilität bei veränderlichen Umgebungsbedin gungen auf. Insbesondere sind die Haltbarkeitsbedingungen günstiger.
Die DNA-Fragmente, die für ein Polypeptid kodieren, welches von einem Papillomavirus stammt, können durch Klonierung, durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) oder durch chemische Synthese gemäß den konventionellen Techniken erhalten werden, jeweils unter Verwendung von positiven Papillomaviruszellen, die von Patienten oder aus Sammlungen erhalten wurden.
Das Gen, welches für ein Polypeptid mit immunstimulierender Wirkung kodiert, kann ebenso gemäß den Standardtechniken ausgehend von einem Genom einer Zelle (Genomtyp) oder von mRNA einer Zelle, in der es exprimiert wird (cDNA-Typ), isoliert werden. Außerdem kann das fragliche Gen für (i) ein lösliches Molekül, welches entweder intrazellulär ist oder in das äußere Medium sekretiert wird, oder (ii) ein Molekül, welches in der Membran verankert und somit auf der Oberfläche von Zellen, welche es exprimieren, präsentiert wird, kodieren.
Ein im Rahmen der Erfindung bevorzugter rekombinanter Vektor ist ein viraler Vektor in dessen Genom die zuvor genannten DNA-Fragmente eingefügt wurden, derart, dass ihr Transfer und ihre Expression in einer Wirtzelle oder einem Wirtorganismus ermöglicht wird. Ein im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbarer viraler Vektor kann insbesondere von einem Pockenvirus, einem Adenovirus, einem Retrovirus, einem Herpesvirus oder einem mit einem Adenovirus verbundenen Virus abgeleitet sein. Vorteilhafterweise handelt es sich um einen nicht-integrierenden Vektor mit abgeschwächter Virulenz. Derartige Vektoren sowie ihre Herstellungsverfahren sind dem Fachmann bekannt.
Im Fall der Verwendung eines adenoviralen Vektors wird bevorzugt ein durch Deletion der für die Replikation wesentlichen Regionen und, insbesondere, des Hauptteils der Region E1, nicht-replikativer Vektor verwendet, um seine Ausbreitung im Blut des Wirtorganismus oder der Umgebung zu verhindern. Es versteht sich von selbst, dass man andere Regionen des adenoviralen Genoms modifizieren oder deletieren kann, in dem Maß, in dem die defekten wesentlichen Funktionen in trans komplimentiert werden. Ein erfindungsgemäß bevorzugter viraler Vektor enthält die für die Einkapselung wesentlichen Sequenzen, dass heißt, die 5'- und 3'-ITR's (Inverted Terminal Repeat) und die Einkapselungsregion. Die verschiedenen adenovirlanen Vektoren sowie ihre Herstellungsverfahren sind konventionell und in Graham et Pretect (1991, in Methods in Molecular Biology, Vol 7, S. 109–128; Ed: E. J. Murey, The Human Press Inc.) und der internationalen Anmeldung WO94/28152 beschrieben. Wenn es sich um ein Retrovirus handelt, werden die LTR's (Long Terminal Repeat) und die Einkapselungssequenzen konserviert (siehe beispielsweise Naviaux und Verma, 1992, Current Opinion in Biotechnology 3, 540–547).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßer rekombinanter viraler Vektor von einem Pockenvirus und, insbesondere einem Vogel-Pockenvirus wie dem Canaripockenvirus, einem Geflügelpockenvirus oder einem Kuhpockenvirus, wobei der letztere bevorzugt ist, abgeleitet. Unter den Kuhpockenviren, die im Rahmen den vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, werden bevorzugt die Stämme Kopenhagen, Wyeth und modifizierter Ankara (MVA für „Modified Vaccinia Virus Ankara") ausgewählt. Die allgemeinen Bedingungen zum Erhalt eines Kuhpockenvirus, der ein heterologes Gen exprimieren kann, sind im europäischen Patent EP 83 286 und der Anmeldung EP 206 920 geschildert. Das MVA-Virus ist insbesondere in (Mayr et al., 1975, Infection 3, 6–14; Sutter et Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USD 89, 10847–10851) beschrieben.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die DNA-Fragmente unter der Kontrolle von Elementen platziert, die für ihre Expression notwendig sind. Dazu zählen die entsprechenden Elemente der Transkriptionsregulation sowie die Initiations- und Terminationssignale der Translation. Dem Promotor kommt eine besondere Bedeutung zu. Allgemein greift man auf einen Promotor zurück, der im dem Organismus oder der Wirtzelle, die behandelt werden soll, funktionell und an den verwendeten Vektor angepasst ist. Außerdem kann er derart modifiziert sein, dass er regulatorische Sequenzen enthält, beispielsweise ein Aktivierungselement der Transkription oder Sequenzen, die auf bestimmte zelluläre Signale antworten. Aus dieser Sicht kann es vorteilhaft sein, einen gewebespezifischen Promotor zu verwenden, da die mit Papillomavirus in Verbindung stehenden Erkrankungen im Bereich der Genitalwege lokalisiert sind, wo ein Promotor auf spezifische tumorale Signale antwortet (beispielsweise in Gegenwart von Wachstumsfaktoren aktiviert wird, die allgemein durch die Tumorzellen überexprimiert werden), um die Expression ausschließlich auf die Tumorzellen zu begrenzen.
Von den im Rahmen der Erfindung geeigneten Promotoren seien die Promotoren SV40 (Virus Simian 40), HMG (Hydroxy-Methyl-Glutaryl-Coenzym A), TK (Thymidin-Kinase), CMV (Cytomegalovirus), RSV (Rous Sarcoma Virus), MLP (Major Late Promotor) vom Adenovirus, die an den adenoviralen Vektor angepasst sind, und die LTR von Mo-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus), welche spezifischer zu den retroviralen Vektoren sind, beispielhaft genannt. Wenn der Vektor von einem Pockenvirus abgeleitet ist, handelt es sich bevorzugt bei dem Promotor um den Promotor eines Gens des verwendeten Pockenvirus, beispielsweise den Promotor des Gens, welches für das Protein 7,5K, H5R, TK oder K1L des Kuhpockenvirus kodiert. Diese Letzteren sind in der Literatur beschrieben und können ausgehend von dem viralen Genom durch klassische Techniken kloniert werden.
Außerdem können die für die Expression notwendigen Elemente Sequenzen tragen, die die Expression verbessern oder in der Wirtzelle aufrechterhalten (Intron, Signalsequenz, Transkriptions-Terminationssequenz, Translations-Initiationsstelle, Sequenzen, die die Präsentation des Polypeptids den Zellen des Immun systems des Wirts modifizieren ....). Wenn es sich jedoch um einen von einem Pockenvirus abgeleiteten Vektor handelt, wird die Verwendung von Introns vermieden.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann entweder mit mehreren rekombinanten Vektoren, von denen jeder ein gegebenes Polypeptid exprimiert, oder mit einem einzigen Vektor, welcher die DNA-Fragmente, die den ausgewählten Polypeptiden entsprechen, exprimiert, platziert unter der Kontrolle von unabhängigen oder gemeinsamen Elementen, erhalten werden. Im letzten Fall kann man auf Sequenzen, die die Initiation der Translation auf interne Weise ermöglichen (IRES) oder auf In-Phasen-Fusionen verschiedener Gene zurückgreifen.
Die allgemeinen Bedingungen zum Erhalt eines rekombinanten Vektors unter Verwendung der vorliegenden Erfindung sind ausführlich im Stand der Technik beschrieben. Wenn es sich um einen pockenviralen Vektor handelt, kann auf das europäische Patent EP 83 286 Bezug genommen werden, dessen Inhalt hiermit einbezogen wird. Diese Bedingungen sind auf andere als Vektor geeignete Viren übertragbar, die einen nicht-essentiellen genomischen Bereich aufweisen, in den die Expressionsblöcke eingebaut werden können. Sie können in den gleichen Lokus oder in verschiedene Loci eingefügt werden. Beispielsweise ist, wenn ein Kuhpockenvirus des Stammes Kopenhagen verwendet wird, die bevorzugte Insertionsstelle der TK-Lokus und/oder der K1L-Lokus. Die Insertion auf Höhe des viralen TK-Gens bewirkt die Inaktivierung des Gens, wodurch die Selektion der Rekombinanten erleichtert wird. Bei einem Kuhpockenvirus des Stammes MVA kann die Insertion der Papillomavirus-Gene und Immunostimulatoren inmitten einer der Ausschnitte I bis VI und, bevorzugt, des Ausschnittsbereichs II oder III, durchgeführt werden (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol 72, 1031–1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032–1040).
In Übereinstimmung mit den durch die vorliegende Erfindung verfolgten Zielen kann ein rekombinanter Vektor außerdem einen Expressionsblock eines Sektionsmarkergens enthalten, um die Stufen der Isolierung und Aufreinigung des rekombinanten Virus zu erleichtern. Insbesondere seien das Gen Neo, welches eine Resistenz gegen das Antibiotikum G418 verleiht, das Gen Pac, welches Puromycinresistenz verleiht, das TK-Gen des Herpes-Simplexvirus vom Typ I (HSV-1), welches eine Empfindlichkeit auf bestimmte Nukleosidanalogen, wie Ganciclovir oder Acyclovir verleiht, die bakteriellen Gene LacZ, welche für die β-Galactosidase kodieren, und gus A, welches für die β-Glucuronidase kodiert, genannt. Diese zwei letztgenannten enzymatischen Marker ermöglichen die Markierung der rekombinanten Viren durch Anfärbung in Gegenwart der Substrate X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) bzw. XglcA (5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-glucoronid).
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus, enthält einen oder mehrere rekombinante Vektoren, der/die von einem Kuhpockenvirus des Stammes Kopenhagen oder MVA abgeleitet ist/sind, in den/die

(1) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert,
(2) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert,
(3) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert,

Dagegen enthält eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung, die insbesondere zur Immunprophylaxe bestimmt ist, ein oder mehrere rekombinante Vektoren, der/die von einem Kuhpockenvirus des Stammes Kopenhagen oder MVA abgeleitet ist/sind, in den/die

(1) ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert,
(2) ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert, oder
(3) ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert,

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann gemäß den auf dem Gebiet der Impfstoffe bekannten Verfahren hergestellt werden, und die verabreichbaren Dosen können in einem großen Bereich variieren. Sie sind insbesondere abhängig von den Polypeptiden und den verwendeten Viren, der zu behandelnden Pathologie, dem Zustand des Patienten und anderen Parametern, die durch die Kliniker festgestellt werden. Jedoch beträgt im Allgemeinen die Virusdosis pro Kilo 10⁴ bis 10¹¹, vorteilhafterweise 10⁶ bis 10¹⁰, und bevorzugt 10⁷ bis 10⁹ plaquebildende Einheiten (ufp), wenn das therapeutische Agens ein viraler Vektor ist, und 0,05 bis 500 mg, vorteilhafterweise 0,5 bis 200 mg, und bevorzugt 1 bis 100 mg, wenn das therapeutische Agens von einem Polypeptid stammt.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auf jedem beliebigem konventionellen Verabreichungsweg, insbesondere intravenös, intramuskulär, subkutan oder subepithelial, oder durch Skarifikation verabreicht werden. Im Fall eines zugänglichen Tumors ist es auch möglich, eine direkte Injektion in die Stelle oder den angrenzenden Bereich des Tumors oder eine topische Anwendung durchzuführen. Als Impfstoff kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung gemäß den auf dem Gebiet üblichen Praktiken, beispielsweise in einer einzelnen Dosis oder einer oder mehreren wiederholten Dosen nach einem bestimmten Unterbrechungsintervall verabreicht werden. Im Gegensatz dazu kann sie bei einer kurativen Behandlung regelmäßig innerhalb eines für eine wirksame Behandlung ausreichenden Zeitraums verabreicht werden. Wenn das therapeutische Agens ein viraler Vektor ist, liegt dieses Virus bevorzugt in lebender Form vor. Wenn es sich um einen Pockenvirus-Vektor handelt, ist die Verwendung eines abgeschwächten Stammes, wie des Stammes MVA oder des Thymidinkinase-negativen Stammes Kopenhagen bevorzugt. Ein viraler rekombinanter Vektor kann durch eine geeignete, dem Fachmann geläufige chemische Behandlung abgeschwächt werden. Jedoch kann auch die Injektion eines abgetöteten rekombinanten Vektors in Betracht gezogen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eine wirksame therapeutische Menge eines rekombinanten Vektors in Verbindung mit einem aus pharmazeutischer Sicht geeigneten Träger. Der Träger wird derart ausgewählt, dass seine Verabreichnung durch Injektion beim Menschen oder Tier ermöglicht wird. Sie kann außerdem einen Trägerstoff, ein Lösungsmittel und/oder einen Zusatzstoff enthalten und in flüssiger oder lyophilisierter Form vorliegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung als Medikament zur Behandlung oder Vorbeu gung von Gebärmutterhalskrebs, einer Dysplasie des Halses niederen Grads und einer Papillomavirus-Infektion.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung der oben genannten Erkrankungen, wobei einem Individium, welches einer derartiger Behandlung bedarf, eine aus pharmazeutischer Sicht wirksame Menge einer Mischung des Polypeptids oder eines rekombinanten Vektors unter Anwendung der vorliegenden Erfindung verabreicht wird.
Die vorliegende Erfindung wird in Bezug auf die folgenden Figuren veranschaulicht.
1 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG5021, welcher den Transfer der späten Gene L1 und L2 von HPV-16, platziert unter der Kontrolle des Promotors p7,5K, wobei die beiden Kassetten entgegengesetzte Orientierung zueinander haben, in den TK-Lokus des Kopenhagen-Kuhpockenvirus ermöglicht.
2 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG5065, welcher den Transfer der frühen Gene E6 und E7 von HPV-16, platziert unter der Kontrolle des Promotors pH5R (die beiden Kassetten haben eine zueinander entgegengesetzte Orientierung), des humanen IL-2-Gens (IL2h), platziert unter der Kontrolle des Promotors p7,5K, und des Markengens LacZ (btaGAL), platziert unter der Kontrolle des Promotors pK1L, in den K1L-Lokus des Kopenhagen-Kuhpockenvirus ermöglicht.
3 veranschaulicht schematisch die Strategie, die verwendet werden kann, um die späten Gene L1 und L2 von HPV-16 inmitten des Ausschnittsbereichs II eines Kuhpockenvirus MVA einzufügen, wobei die linken und rechten Rekombinationsarme jeweils gekennzeichnet sind (BRG2 bzw. BRD2).
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der vorliegenden Beispiele ausführlich beschrieben, ohne dadurch eingeschränkt zu werden.
Die unten beschriebenen Konstrukte werden gemäß der allgemeinen Verfahren der Gentechnik und der molekularen Klonierung, die detailliert in Maniatis et al. (1989, supra) beschrieben sind, oder gemäß den Empfehlungen des Herstellers bei Verwendung eines kommerziellen Kits, hergestellt. Die gerichtete in-vitro-Mutagenese durch synthetische Oligonucleotide wird mit Hilfe eines Kits von Amersham durchgeführt. Die Techniken der PCR-Amplifikation sind dem Fachmann bekannt (siehe beispielweise PCR Protocols-A Guide to Methods and Applications, 1990, editiert von Innis, Gelfand, Sninsky et White, Academic Press Inc). Wenn eine Reparatur der Restriktionsstellen durchgeführt werden muss, besteht die angewandte Technik in einem Auffüllen der vorstehenden 5'-Enden mit Hilfe des großen Fragments der DNA-Polymerase I von E. coli (Klenow).
Bei den Klonierungsstufen werden die rekombinanten M13-Bateriophagen in dem Stamm E. coli NM522 (Stratagene) in einem Agar-Agar-Minimalmedium (Agar 7,5%) oder in einem gehaltreichen LBM-Flüssigmedium vervielfältigt. Die rekombinaten Plasmide, welche das Ampicillin-Resistenzgen tragen, werden in den Stämmen E. Coli C600 (Stratagene), BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557–580) und NM522 auf mit 100 μg/ml Antibiotikum supplementiertem Nährboden oder Flüssigmedium repliziert. Bevorzugt wird der Stamm BJ5183 verwendet, da die Klonierung durch homologe Rekombination bewirkt wird (Bubeck et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21, 3601–3602).
Die Konstruktion der rekombinanten Kuhpockenviren wird gemäß den klassischen Technologien, die in den bereits genannten Dokumenten und in Meckett et al. (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415–7419) und Mackett et al. (1984, J. Virol. 49, 857–864) beschrieben sind, durchgeführt.
Beispiel 1 Konstruktion des Kuhpockenvirus Kopenhagen VVTG5021&5065, welches die Gene E6, E7, L1 und L2 von HPV-16 und das humane IL-2-Gen exprimiert (Dient nur der Veranschaulichung und ist nicht Teil der Erfindung)
A. Isolierung der Gene L1 und L2 von HPV-16
Die für die Proteine L1 und L2 kodierenden Fragmente werden durch PCR ausgehend von genomischer DNA von Caski-Zellen (ATCC 1550) gemäß der auf dem Gebiet üblichen Techniken isoliert. Das Amplifikationsfragment, welches die Sequenzen L1 trägt, wird in den Vektor M13TG130 (Kienly et al., 1983, Gene 26, 91–99) subkloniert, wodurch das Konstrukt M13TG8171 entsteht. Die Sequenz des klonierten L1-Gens weist mehrere Mutationen im Vergleich zu der in der Genbank enthaltenen Sequenz auf (Hinterlegung K02718): C anstelle von A an Position 248, C anstelle von A an Position 253, G anstelle von A an Position 537, G anstelle von C an Position 682, G anstelle von A an Position 874, Insertion eines Tripletts ACT an Position 1393, Deletion eines Tripletts GAT an Position 1390. Die Insertion des PCR-Fragments, welches die L2-Sequenzen trägt, in den Vektor M13TG6131 ergibt M14TG9126. Es werden 5 Punktmutationen im Vergleich zu der in der Genebank veröffentlichten Sequenz gezählt: C anstelle von T an Position 378, A anstelle von G an Position 691, A anstelle von G an Position 702, G anstelle von A an Position 990 und C anstelle von A an Position 1092. Der Vektor M13TG6131 ist von M13TG131 (Kieny et al., 1983, supra) durch Mutation der internen BglII-Stelle, welche außerhalb der multiplen Klonierungsstellen liegt, abgeleitet.
B. Konstruktion des Vektors pTG5021 für den Transfer der Gene L1 und L2 in den TK-Lokus des Kuhpockenvirus-Genoms
Das für das Protein L1 kodierende Gen wird durch Erzeugung einer BglII-Stelle stromaufwärts des ATG-Initiators modifiziert.
Das mutierte Gen wird aus dem Vektor M13TG8185 durch BglII-SacI-Verdau ausgeschnitten und zwischen die BamHI- und SacI-Stellen von pTG186-poly eingefügt. Das entstandene Konstrukt wird pTG4019 genannt. Der Transfervektor pTG186-poly ist detailliert in dem französischen Patent 2 583 429 beschrieben. Er trägt 10 Restriktionsstellen für die Insertion des zu überführenden Gens und den Promotor p7,5K für die Kontrolle seiner Expression.
Das für das Protein L2 kodierende Gen wird durch BglII-HindIII-Verdau aus M13TG9126 isoliert und anschließend zwischen die BamHI- und HindIII-Stellen 3' des Promotors 7,5K kloniert. Es wird M13TG9127 erhalten, in den durch gerichtete Mutagenese eine SalI-Stelle stromaufwärts des Promotors eingefügt wird. Der Expressionsblock "p7,5K-Gen L2" wird aus dem mutierten Vektor M13TG9129 isoliert und in die SacI-Stelle des Transfervektors pTG4019 derart kloniert, dass die zwei Kassetten p7,5K-L1 und p7,5K-L2 in entgegengesetzter Orientierung liegen. Das so erhaltene Konstrukt pTG5021 ist in 1 dargestellt. Die Expressionsblöcke werden in das Genom des Kuhpockenvirus vom Stamm Kopenhagen durch homologe Rekombination überführt. Das als VVTG5021 bezeichnete rekombinante Virus wird durch Selektion auf 5-Bromdeoxyuridin (5BUDR) isoliert.
C. Isolierung der Gene E6 und E7 von HVP-16
Die Gene E6 und E7 werden ausgehend von der Caski-Zelllinie, wie in den Beispielen 2 und 3 des europäischen Patents EP 0 462 187 beschrieben, isoliert. Es werden zwei Konstrukte von dem Klon M13E7/E6, welcher die Gene E6 und E7 von HPV-16 enthält, abgeleitet, um die späteren Klonierungsstufen zu vereinfachen. Das erste, bezeichnet als M13TG8188, stammt aus der Einführung der PstI- bzw. BamHI-Stellen stromaufwärts und stromabwärts des E7-Gens, und das zweite, M13TG8189, trägt eine PstI-Stelle stromaufwärts des E6-Gens. Die Einführung der Punktmutationen stromaufwärts eines ATG-Initiators und stromabwärts eines Stoppkodons sind dem Fachmann geläufig.
Die Verbindung des Proteins E7 von HPV-16 mit dem Produkt des Retinoblastom-Gens wurde von verschiedenen Autoren gezeigt (siehe beispielsweise Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099–4105) und korreliert mit seinem Transformationsvermögen. Aus offensichtlichen Sicherheitsgründen wird eine nicht onkogene Mutante erzeugt, bei der Sequenzen, die für die Aminosäuren 21 bis 26 des nativen E7-Proteins kodieren und in die Transformationsfunktion verwickelt sind, durch gerichtete Mutagenese des Vektors M13TG8188 mit Hilfe des Oligonucleotids oTG5118 (SEQ ID NO: 1) deletiert sind. Es wird M13TG9104 erhalten. Das mutierte E7-Gen wird im Folgenden als E7* bezeichnet.
Gleichermaßen wurde gezeigt, dass das Protein E6 von HPV-16 mit dem Expressionsprodukt des Tumorsuppressorgens p53 interagieren kann (Crook et al., 1991, Cell 67, 547–556). Der in diese Interaktion verwickelte Bereich ist eindeutig identifiziert und befindet sich zwischen den Resten 111 bis 115 des nativen Proteins. Der Vektor M13TG9125 wird durch Mutagenese von M13TG8189 mit Hilfe des Oligonucleotids oTG5377 (SEQ ID NO: 2) erzeugt. Das mutierte E6-Gen wird im Folgenden als E6* bezeichnet.
D. Konstruktion des Transfervektors pTG5065, Träger der Gene E6 und E7 von HPV-16 und des humanen IL-2-Gens, integriert in den Lokus K1L
Das EcoRI-Fragment K von 5,2 kb vom linken Ende des Genoms des Kuhpockenvirus Kopenhagen (Guillard et al., 1985, J. Virol. 53, 316–318) wird in das Plasmid pUC8 (Gibco BRL), welches durch EcoRI linearisiert wurde, kloniert. Der so erhaltene Vektor wird anschließend einem BglII-Verdau und dann einer Ligation unterzogen, um ein Fragment von 855 bp, welches für das Restriktionsgen des Wirts K1L kodiert, zu deletieren (Guillard et al., 1986, Proc. Natl. Acad, Sci., USA 83, 5573–5577). Das BglII-Fragment von 3,4 kb wird aus diesem Zwischenkonstrukt, welches als pUC8Khr bezeichnet wird, isoliert und anschließend in die BamHI-Stelle des Plasmids pUC7 (Gibco BRL) kloniert. Es wird pBAC1 erzeugt, in den ein XhoI-Adapter links der einzigen BglII-Stelle eingeführt wird. Nach Verdau mit XhoI und BglII wird ein SalI-BglII-Fragment, welches den Kuhpockenvirus-Promotor p7,5K trägt, eingefügt. Die zwei EcoRI-Stellen werden durch EcoRI-Verdau und anschließende Klenow-Behandlung und Religation eliminiert. Der Vektor pTG2147 wird durch Einführen einer multiplen Klonierungsstelle, die aus dem Vektor p poly II (Lathe et al., 187, Gene 57, 193–201) isoliert und in Form eines BglII-BamHI-Fragments isoliert worden war, in die einzige BglII-Stelle erhalten. Er enthält somit die Rekombinationsarme, die die Insertion in den Lokus K1L, welcher den Promotor p7,5K gefolgt von Restriktionsstellen einrahmt, ermöglichen.
Die Gene E6* und E7* werden stromabwärts des Kuhpockenvirus-Promotors pH5R, welcher in dem Vektor M13TG9132 enthalten ist, kloniert, um M13TG9138 bzw. M13TG9139 zu erhalten. Der Vektor M13TG9132 entsteht durch die Insertion des Promotors des H5R-Gens, welches durch PCR aus dem viralen Genom isoliert wurde, in den Phagen M13TG6131.
Die cDNA, welche für das humane Interleukin-2 kodiert, wird aus dem Plasmid pTG36 (französisches Patent 2 583 770) isoliert, in einen Zwischenvektor eingeführt und durch SalI-BamHI-Verdau ausgeschnitten, um in den Transfervektor pTG2147 gezielt in den Lokus K1L eingefügt zu werden. Die Insertion findet auf Höhe der PstI- und XbaI-Stellen, die stromabwärts des Promotors p7,5K gelegen sind, mit Hilfe von Klonierungsadaptern statt. Es wird pTG5056 erhalten.
Der Expressionsblock pH5R-E6* wird aus dem Vektor M13TG9139 in Form eines BglII-BamHI-Fragments, welches in die BamHI-Stelle des Vektors pTG5056 eingefügt wird, isoliert. Es wird der Vektor pTG5060 erzeugt. Der Expressionsblock pH5R-E7* wird aus M13TG9138 herausgeschnitten und in die BamHI-Stelle des Vektors pTG5060 eingefügt, wodurch pTG5062 erhalten wird. Die Insertion in den K1L-Lokus führt zu rekombinanten Viren, die eine reduzierte oder sogar zerstörte Replikationsfähigkeit in bestimmten Zelltypen aufweisen. Aus diesen Gründen wird ein positiver Selektionsmarker eingeführt, um die Identifikation der rekombinanten Viren zu erleichtern. Der Vektor pTG5065 resultiert aus der Klonierung einer Expressionskassette "pK1L-LacZ-Gen", welche aus dem Plasmid pIV75 (Chen et al., 1993, Virology 196, 682–693) durch BglII-BamHI-Spaltung isoliert wurde, in die BamHI-Stelle von pTG5062. Wie in 2 dargestellt, ermöglicht er den Transfer der Blöcke E6*, E7* und IL-2 in den K1L-Lokus des Kuhpockenvirus.
Das rekombinante Kuhpockenvirus, als VVTG5065 bezeichnet, wird durch homologe Rekombination nach Transfektion des Vektors pTG5065 in embryonale Hühnerzellen, die mit dem Kopenhagen-Wildtyp-Kuhpockenvirus infiziert und durch Anfärbung auf Agar-Agar mit X-Gal markiert worden waren, erzeugt. Die Kuhpockenviren VVTG5021 und VVTG5065 werden in doppelten Infektionsessays verwendet. Die doppelten Rekombinanten werden anhand der zwei Marker, Bildung von blauen Plaques in Gegenwart von X-Gal und Deletion des TK-Markers, selektiert. Diese, bezeichnet als VVTG5021&5065, exprimieren die Blöcke p7,5K-IL-2, pH5R-E6* und pH5R-E7*, integriert in den K1L-Lokus, und die Blöcke p7,5K-L1 und p7,5K-L2, integriert in den TK-Lokus.
Die Expression der HPV-Gene kann durch Analyse im Western-Blot mit Hilfe von geeigneten monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern oder durch reverse PCR verifiziert werden. Die Produktion von IL-2 kann durch einen ELISA- oder CTL-Test, wie in der Literatur beschrieben, bewertet werden. Das Expressionsniveau in vitro liegt in der Größenordnung von 60 ng/ml/10⁶ infizierte Zellen bei 1 pfu/Zelle und 24 Stunden.
Beispiel 2 Konstruktion eines Kuhpockenvirus Kopenhagen, welches die Gene E6, E7 und das humane IL-2-Gen exprimiert
Die für das humane Interleukin-2 kodierende cDNA wird aus dem Plasmid pTG36 durch PstI-Verdau isoliert und in die PstI-Stelle des Plasmids pTG186 eingefügt, wodurch pTG188 erhalten wird. Das durch homologe Rekombaniation erhaltene Virus wird als VVTG188 bezeichnet.
Das Gen E6* wird in Form eines PstI-BamHI-Fragments aus M13TG9125 isoliert und stromabwärts des Promotors 7,5K zwischen die PstI- und XbaI-Stellen von pTG2147 in Gegenwart eines BamHI-XbaI-Adapters eingefügt, wodurch pTG5057 erhalten wird. Das Gen E7* wird unter der Kontrolle des Kuhpockenvirus-Promotors H5R platziert, wodurch M13TG9138 erzeugt wird, und die durch die BamHI-BglII-Stellen eingerahmte Kassette in die BamHI-Stelle von pTG5057 subkloniert. Es wird pTG5059 erhalten, in dessen BamHI-Stelle der Selektionsmarker LacZ unter der Kontrolle des Promotors des Kuhpockenvirus-Gens K1L, welches durch BglII-BamHI-Verdau aus dem Vektor pIV75 isoliert worden war, eingefügt wird. Das entstehende Konstrukt wird als pTG5061 und das durch homologe Rekombination mit dem Kuhpockenvirus-Genom erzeugte Virus als VVTG5061 bezeichnet.
Ein rekombinantes Kuhpockenvirus, welches die Gene E6* und E7* integriert in den K1L-Lokus und das humane IL-2-Gen integriert in den TK-Lokus exprimiert, wird durch Co-Infektion von embryonalen Hühnerzellen durch die Viren VVTG5061 und VVTG188 erhalten. Das letztgenannte produziert IL2 in einer Menge von über 400 ng pro 10⁶ infizierten Zellen bei 1 pfu pro Zelle in 24 Stunden. Das doppelt rekombinante Virus wird als VVTG5061&188 bezeichnet.
Beispiel 3 Konstruktion eines Kuhpockenvirus Kopenhagen, welches die Gene E6, E7 und das für den humanen Adhäsions-Cofaktor kodierende Gen B7.1 exprimiert
Die für B7.1 kodierende cDNA wird aus einer mRNA-Präparation, welche aus der Zelllinie Daudi (ATCC CCL-213) durch reverse PCR erhalten worden war, unter Verwendung der Primer oTG6353 und oTG6352 (SEQ ID NO: 3 und 4) erhalten. Die Gensequenz ist in der Genebank unter der Hinterlegungsnummer M27533 hinterlegt. Das amplifizierte Fragment wird zwischen die BglII- und EcoRI-Stellen von M13TG6131 kloniert, wodurch M13TG9149 entsteht, und anschließend zwischen die BamHI- und EcoRI-Stellen von pTG186 platziert. Das Konstrukt wird pTG5090 und das durch homologe Rekombination erhaltene Virus VVTG5090 genannt. Ein Kuhpockenvirus, welches die Gene E6* und E7* von HPV-16 integriert in den K1L-Lokus und das humane Gen B7.1 integriert in den TK-Lokus exprimiert, kann durch Co-Infektion von embryonalen Hühnerzellen durch die Viren VVTG5061 und VVTG5090 erhalten werden. Das rekombinante Virus wird als VVTG5061&5090 bezeichnet.
Beispiel 4 Konstruktion eines Kuhpockenvirus von Stamm MVA, welches die Gene E6, E7 und das Gen B7.1 integriert in den Ausschnittsbereich III exprimiert
Das MVA-Virus ist von dem Stamm des Kuhpockenvirus Ankara abgeleitet. Es ist nicht mehr im Stande, infektiöse Partikel in den Säugetierzellen zu erzeugen, entwickelt sich jedoch bei embryonalen Hühnerfibroblasten korrekt. Seine Adaption an diese Zellen bewirkt das Ausschneiden von 6 Regionen, die für seine Entwicklung und seinen infektiösen Zyklus bei diesem Zelltyp nicht essentiell sind (Verschwinden von etwa 15% des viralen Genoms; Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031–1038). Die Integration des exogenen genetischen Materials kann auf Höhe irgendeiner dieser Ausschnittsbereiche bewirkt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Ausschnitte II und III, die auf Höhe der Restriktionsfragmente HindIII N bzw. A lokalisiert sind, verwendet (Altenburger et al., 1989, Arch. Virol. 105, 15–27).
In einem ersten Schritt wird der Vektor pTG6019, der die Isertion des MVA-Virus in den Ausschnittsbereich III ermöglicht, konstruiert. Die homologen Rekombinationsarme auf beiden Seiten des Ausschnittsbereichs III werden durch PCR ausgehend von dem viralen Genom (siehe amerikanisches Patent US 5,185,146 ) unter verwendung der Primer oTG7637 und pTG7638 (SEQ ID NO: 5 und 6) für den linken Arm und oTG7635 und oTG7636 (SEQ ID NO: 7 und 8) für den rechten Arm isoliert. Die amplifizierten Fragmente werden in die EcoRI-Stelle des Vektors pTG1E kloniert, wodurch pTG6019 erzeugt wird. Das zu überführende genetische Material wird zwischen die beiden Rekombinationsarme eingefügt. Der Vektor pTG1E ist ähnlich dem pTG1H (französisches Patent 2 583 429), abgesehen von der Gegenwart eines EcoRI-Adapters anstelle der multiplen Klonierungsstellen.
Zunächst wird eine Expressionskassette des Markergens gus A eingefügt. Zuvor wird der Promotor 7,5K in die BamHI-Stelle von pTG6019 kloniert. Es wird pTG6021 erhalten, in dessen BamHI-Stelle das Gen gus A, welches in Form eines BglII-BamHI-Fragments erzeugt wurde, eingefügt wird. Dieses kann ausgehend von der in der Literatur veröffentlichten Sequenz erhalten werden. Das entstehenden Konstrukt wird pTG6022 genannt. Die Gegenwart des Markers ermöglicht das Unterscheiden der Wildtyp-Viren von den rekombinanten Viren durch Detektion der enzymatischen GUS-Aktivität durch das Substrat XglcA. Eine rote Anfärbung zeigt die Aktivität der β-Glucuronidase. Jedoch kann es im Hinblick auf eine klinische Anwendung nützlich sein, diesen bakteriellen Marker aus dem Endprodukt nach der Selektion der rekombinaten Viren zu entfernen. Dazu wird die Fähigkeit des Virus ausgenutzt, diese Sequenzen, die sich zwischen zwei homologen Stellen befinden, zu deletieren. Aus diesem Grund wird ein zwei ter Promotor p7,5K stromabwärts des gus-A-Gens in Sinn-Orientierung im Hinblick auf die Sequenzen, die die Expression des gus-A-Gens steuern, eingefügt. Der Vektor pTG6022 wird durch Insertion eines p7,5K-Fragments, welches mit kohäsiven Enden versehen ist, zwischen die BamHI- und SacI-Stellen modifiziert, wodurch pTG6025 entsteht.
Dieser wird durch Insertion der Expressionskassetten der mutierten E6*- und E7*-Gene vervollständigt. Anschließend wird eine neue Promotorsequenz p7,5K, dieses Mal in Antisense-Orientierung hinsichtlich der vorausgegangenen Gene, eingeführt. Dieses Konstrukt, genannt pTG6039, enthält somit die instabile GUS-Kassette "p7,5K→gusA-p7,5K→", gefolgt von p7,5K in entgegengesetzter Orientierung. Parallel dazu werden die Gene E6* und E7* jeweils aus den Vektoren M13TG9104 und M13TG9125 durch BamHI- und PstI-Verdau isoliert und in entgegengesetzter Orientierung zueinander in die PstI-Stelle von M13TG6131 zusammengefügt. Das Ganze wird in Form eines PstI-Fragments ausgeschnitten, welches in pTG6039, welcher mit dem gleichen Enzym linearisiert wurde, eingefügt wird. Es wird der Vektor pTG6056 erhalten, welcher die folgenden Sequenzen p7,5K→gusA-p7,5K→E7*-E6*E←p7,5K" enthält.
Das immunstimulierende Gen B7.1 wird in dieses Konstrukt integriert. Dazu wird der Vektor pTG6056 mit HindIII und KpnI gespalten, bevor er in Gegenwart der Oligonucleotide oTG10451 und oTG10450 (SEQ ID NO: 9 und 10) ligiert wird, um pTG6070 zu erzeugen. Die Oligonucleotide ermöglichen die Klonierung der Expressionskassette "pH5R-B7.1" durch homologe Rekombination. Zu diesem Zweck werden die aus M13TG9149 isolierten Sequenzen B7.1 stromabwärts des Kuhpockenvirus-Promotors pH5R kloniert, um M13TG9184 zu bilden. Das BglII-EcoRI-Fragment, welches die Kassette trägt, wird in den durch XhoI linearisierten Vektor pTG6070 durch homologe Rekombaniation in E. coli integriert. Es wird der Vektor pTG79 erhalten, der insgesamt das Markergen gus A in einer "labilen" Form und die Expressionskassetten der frühen Gene von HPV-16 sowie eine Kassette des Costimulierungsgens B7.1 trägt. Das durch homologe Rekombination mit dem MVA-Genom erzeugte Virus wird als MVATG6079 bezeichnet.
Die Expressionsblöcke der späten Gene von HPV-16 können in den Ausschnittsbereich II mit Hilfe des Transfervektors pTG5018 eingefügt werden. Dieser wird durch Insertion von linken und rechten Rekombinationsarmen, die den Ausschnitt II umrahmen, erzeugt durch PCR unter Verwendung der Primer oTG7665 und pTG7584 (SEQ ID NO: 11 und 12) und oTG7639 und opTG7640 (SEQ ID NO: 13 und 14), durch Insertion in die EcoRI-Stelle von pTG1E konstruiert. Wie zuvor werden die beiden Arme einer Expressionskassette eines positiven Markers integriert, um die Detektion der rekombinanten Viren zu vereinfachen; dieser kann nach der Selektionsstufe entfernt werden (Spehner et al., 1990, J. Virol. 64, 527–533). Der Vektor pTG6020 resultiert aus der Klonierung des Gens LacZ, platziert stromabwärts des Promotors p7,5K in den durch BamHI linearisierten Vektor pTG6018. Der Vektor pTG6020 wird durch Insertion einer Sequenz p7,5K zwischen seine BamHI- und SacI-Stellen stromabwärts des Gens LacZ modifiziert. Es wird pTG6024 erhalten. Die Kassetten L1 und L2 können anschließend gemäß einer in 3 gezeigten Strategie eingeführt werden.
Beispiel 5 Konstruktion des Kuhpockenvirusstammes MVA, welcher die Gene E6, E7 und das IL2-Gen integriert in den Ausschnittsbereich III exprimiert
Es wird die gleiche Strategie wie zuvor verwendet, um das Gen IL-2 in den Vektor pTG6056 einzuführen. Nach Klonierung der Rekombinations-Oligonucleotide oTG10503 und oTG10502 (SEQ ID NO: 15 und 16) zur Erzeugung von pTG6076 wird dieser mit XhoI gespalten und das BglII-EcoRI-Fragment, welches ausgehend von M13TG9185 erzeugt wurde (pH5R-IL-2), durch homologe Rekombination eingefügt. Der so erhaltene Vektor pTG6090 enthält das Mar kergen gus A in einer "labilen" Form, die Expressionskassetten der frühen Gene von HPV-16 sowie eine Kassette des humanen IL-2-Gens. Das durch homologe Rekombination mit dem MVA-Genom erhaltene Virus wird als MVATG6090 bezeichnet. Die späten Gene können in den Ausschnittsbereich II unter Verwendung von pTG6018, wie oben beschrieben, integriert werden.
Beispiel 6 Funktionsfähigkeit des Vektors VVTG5021&5065 im Tiermodell (Dient nur der Veranschaulichung und ist nicht Teil der Erfindung)
A. Toxizitätsstudien
Nacktmäuse erhielten 10⁷ pfu von VVTG5021&5065 oder 10⁷ pfu des Wildtyp-Kuhpockenvirus auf intravenösem, intramuskulärem, subkutanem oder intracranialem Weg. Es wurden Gruppen zu je 5 Mäusen gemäß dem injizierten Virustyp und dem Verabreichungsweg gebildet und 26 Tage nach der Injektion die Anzahl der Tiere festgestellt, die Erkrankungen aufweisen, die mit dem Kuhpockenvirus in Zusammenhang stehen. Die Mäuse, die das rekombinante Virus erhalten hatten, zeigten keinerlei Erkrankungen, wie der verwendete Verabreichungsweg auch war, während die Mehrzahl der mit dem Wildvirus behandelten Tiere Erkrankungen mit einer Häufigkeit und einer Schwere in Abhängigkeit des Verabreichungsweges zeigten. Außerdem wurden im Fall einer intravenösen und intracranialen Injektion Todesfälle registriert. Diese Daten zeigen, dass VVTG5021&5065 in Bezug auf das Wildvirus abgeschwächt ist und auch nach intercranialer Injektion keine Erkrankungen hervorruft.
B. Immunprophylaxeversuche mit VVTG5021&5065
C57BL6-Mäuse wurden dreimal auf subkutanem Weg mit 10⁷ pfu von VVTG5021&5065 geimpft. Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurden diese Tiere mit 10³-Zellen E7W1, die subkutan implan tiert wurden, überprüft. Diese E7W1-Zellen stammen aus einer murinen Lymphomlinie, die mit einem Vektor transfiziert ist, welcher das onkogene E7-Gen von HPV-16 exprimiert. Der prozentuale Anteil der überlebenden Tiere in Abhängigkeit der Zeit wird mit dem verglichen, der mit Vergleichsmäusen, die mit 10⁷ pfu eines nicht-rekombinanten Kuhpockenvirus VVTG186 (erhalten aus dem obigen Vektor TG186) behandelt worden waren, erhalten wurde. Das Verfolgen der Sterblichkeit zeigt einen Unterschied zwischen den beiden Gruppen. In der Vergleichsgruppe sind 100% der Tiere am Tag 36 gestorben, während 40% der mit VVTG5021&5065 geimpften Tiere noch am Tag 36 und mehr als 30% am Tag 51 leben.
Folglich weisen die rekombinanten Viren, die die Antigene von HPV und ein immunstimulierendes Gen exprimieren, eine antitumorale Wirkung gegen die Tumorzellen, die das Onkogen E7 von HP-16 exprimieren, auf.
C. Immuntherapieversuche
C57BL6-Mäuse werden mit 10³-Zellen E7W1, welche subkutan implantiert werden, geimpft (Tag 0). 10⁷ pfu des rekombinanten Virus werden anschließend subkutan an Tag 3, Tag 6 und Tag 9 verabreicht, und der prozentuale Anteil der überlebenden Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren, die das nicht-rekombinante Virus erhalten hatten, bestimmt. Während 100% der Kontrolltiere gestorben sind, beobachtet man einen bemerkenswerten Anstieg an überlebenden Tieren, die mit einer Mischung von VVTG5061&5021 und VVTG188 injiziert worden waren. Ähnliche Ergebnisse werden nach Verabreichung von VVTG5065&5021 und VVTG188 erhalten.
Diese Immuntherapie-Versuche wurden unter Verwendung eines anderen Tumormodells reproduziert, wobei BMK-16-myc-Zellen die E7w1-Zellen ersetzten. Bei BMK-16-myc-Zellen handelt es sich um Nierenzellen von neugeborenen Mäusen, die mit dem Genom von HPV-16 und dem murinen Gen c myc transfiziert worden sind. Die Tiere werden mit 10⁷ Viren MVATG6090, welche die Gene E6*, E7* von HPV- 16 und das humane IL-2 exprimieren, behandelt. Im Vergleich zu den Kontrollen weisen die behandelten Mäuse eine Verzögerung des Tumorwachstums bis zum Tag 15 auf.
Sequenzliste

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus, welche als therapeutische Wirkstoffe aus einem oder mehreren Polypeptiden, welche(s) aus der frühen Region eines Papillomavirus stammt/stammen, und einem oder mehreren der Polypeptide mit immunstimulierender Wirkung besteht, gewählt aus der Gruppe, die aus Interleukin-2, Interleukin-7 und die Co-Adhäsionsmoleküle B7.1 und B7.2 besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, welches aus der frühen Region eines Papillomavirus stammt, von dem Protein E6, dem Protein E7 oder den Proteinen E6 und E7 eines Papillomavirus abgeleitet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, welches aus der frühen Region eines Papillomavirus stammt, eine nicht-onkogene Variante des Proteins E6 und/oder E7 eines Papillomavirus ist.
Pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, welches eine immunstimulierende Wirkung aufweist, vom Interleukin-2 abgeleitet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, welches eine immunstimulierende Wirkung aufweist, von dem Molekül B7.1 abgeleitet ist.
Pharmaszeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie (1) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region E7 eines Papillomavirus stammt, und ein Polypeptid, welches vom Interleukin-2 abgeleitet ist, (2) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region E7 eines Papillomavirus stammt, und ein Polypeptid, welches von dem Molekül B7.1 abgeleitet ist, oder (3) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region E7 eines Papillomavirus stammt, ein Polypeptid, welches von dem Molekül B7.1 abgeleitet ist, und ein Polypeptid, welches vom Interleukin-2 abgeleitet ist, enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Papillomavirus unter den Typen HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 und/oder HPV-45 ausgewählt wird
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus, welche als therapeutische(n) Wirkstoff(e) einen oder mehrere rekombinante Vektoren, in den/die DNA-Fragmente eingefügt sind, welche für ein oder mehrere Polypeptide kodieren, die aus einer frühen Region eines Papillomavirus stammen, und eines oder mehrere der Polypeptide mit immunstimulierender Wirkung Interleukin-2, Interleukin-7 und/oder die Co-Adhäsionsmoleküle B7.1 und/oder B7.2 enthält, wobei die DNA-Fragmente unter der Kontrolle von Elementen platziert sind, die für ihre Expression in einer Wirtzelle oder einem Wirtorganismus notwendig sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptide die in den Ansprüchen 2 bis 7 definierten Eigenschaften aufweisen.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem rekombinanten Vektor um einen viralen Vektor handelt, der von dem Genom eines Pockenvirus, Adenovirus, Retrovirus, Herpesvirus und/oder mit einem Adenovirus verwandten Virus abgeleitet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor von einem der Pockenviren Kuhpockenvirus, Kanarienpockenvirus und/oder Geflügelpockenvirus abgeleitet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor von einem Kuhpockenvirus des Stammes Kopenhagen, Wyeth oder modifizierter Ankara (MVA) abgeleitet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Elemente, die für die Expression der für die Polypeptide kodierenden DNA-Fragmente notwendig sind, einen Promotor eines Kuhpockenvirusgens beinhalten, wobei es sich um den Promotor des Thymidinkinase (TK)-Gens, des 7,5K-Gens, des H5R-Gens und/oder des K1L-Gens handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor von einem Kuhpockenvirus des Stammes Kopenhagen abgeleitet ist, und dass die DNA-Fragmente, welche für die Polypeptide kodieren, in den TK-Locus und/oder den K1L-Locus des Kuhpockenvirus eingefügt sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor von einem Kuhpockenvirus des Stammes MVA abgeleitet ist, und dass die DNA-Fragmente, welche für die Polypeptide kodieren, auf Höhe eines der Ausschnittsbereiche I, II, III, IV, V und/oder VI des Kuhpockenvirus eingefügt sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 15 zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen oder mehrere rekombinante Vektoren enthält, der/die von einem Kuhpockenvirus des Stammes Kopenhagen oder MVA abgeleitet ist/sind, in den/die: (4) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert, (5) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert, oder (6) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert und ein DNA-Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert, eingefügt sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor lebend oder abgetötet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen aus pharmazeutischer Sicht geeigneten Träger enthält, welcher ihre Verabreichung durch Injektion in den Menschen oder das Tier ermöglicht.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 als Medikament zur Behandlung oder Vorbeugung von Gebärmutterhalskrebs, einer Dysplasie des Halses niederen Grads und einer Papillomavirusinfektion.