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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen, die mit Papillomaviren,
insbesondere den humanen Papillomaviren (HPV) vom Typ 16, 18, 31,
33 und 45, in Verbindung stehen, bestimmt ist.
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Die
Papillomaviren sind DNA-Viren, welche ein zirkuläres Genom von etwa 7900 Basenpaaren,
umhüllt
von einem Capsidprotein, aufweisen. Es wurden eine Anzahl von bovinen
(BPV) und humanen (HPV) Papillomaviren identifiziert und ihr Genom
sequenziert (Pfister, 1987, in The papovaviridae: The Papillomaviruses (Edition
Salzmann und Howley) Plenum Press, New York, S. 1–38). Es
enthält
eine frühe
Region und eine späte
Region. Die späte
Region enthält
zwei Leseraster L1 und L2, welche die Hauptbestandteile des Capsids kodieren.
Die frühe
Region enthält
wenigstens die Leseraster E1, E2, E4, E5, E6 und E7. Die Expressionsprodukte
E1 und E2 regulieren die virale Replikation und die Expression der
viralen Gene, während
die der Bereiche E5, E6 und E7 in die onkogenen Transformationsprozesse
der infizierten Zellen verwickelt sind. Es konnte experimentell
gezeigt werden, dass das Protein E5 von BPV-1 in vitro Zellen transformieren
kann (Schlegel et al., 1986, Science 233, 464–467). Die Proteine E6 von
BPV-1 und E7 von HPV-16 sind in die Induktion und Aufrechterhaltung
der onkogenen Tranformation verwickelt. Das Transformationsvermögen von
E7 wurde für HPV-16
und HPV-18 gezeigt (Kanda et al., 1988, J. Virol 62, 610–613, Vousden
et. al., 1988, Oncogene Res. 3, 1–9; Bedell et al., 1987, J.
Virol 61, 3635–3640).
Die Funktion von E4 wurde nicht aufgeklärt.
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Beim
Menschen stehen die HPV in Verbindung mit Pathologien, die von gutartigen
Infektionen der Haut über
Warzen bis hin zu bösartigen
Tumoren gehen. Diese Viren sind hochspezifisch für die Epithelien der Epidermis
der Genitalwege, oralen und respiratorischen Wege. Die epi demiologischen
Daten zeigen die Rolle bestimmter Stämme bei Krebs des Uterushalses
und der darunter liegenden Wege, insbesondere HPV-16 und 18, und, in
geringerem Ausmaß,
HPV-31, 33 und 45. Uterushalskrebs ist der zweithäufigste
weibliche Krebs in der Bevölkerung.
Gemäß OMS werden
jedes Jahr 460 000 neue Fälle
registriert, von denen wenigstens 200 000 Fälle eindeutig mit HPV in Verbindung
stehen. Eine Anzahl von Studien zeigt die transformierende Rolle dieser
Viren, ihre spezifische Integration in das Genom der neoplastischen
Zellen, ihre Genaktivität
in den Krebszellen und die Wichtigkeit der Expression dieser frühen Gene
E6 und E7 bei der Aufrechterhaltung des bösartigen Phänotyps der neoplastischen HPV-positiven
Zellen (Monsenego, J. Impact Medecin, 11. März 1994).
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Die
mit den HPV-Viren in Verbindung stehenden Pathologien stellen aufgrund
ihrer dauerhaften und rückfälligen Natur
ein therapeutisches Problem dar. Es wurden bereits eine Anzahl von
Ansätzen
bei der Behandlung dieser Erkrankungen verwendet, wie die Chirurgie,
die Chemotherapie, antivirale Mittel und die Immuntherapie.
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Das
europäische
Patent
EP 0 462 187 beschreibt
einen Ansatz der Impfung, welche die frühen Gene des Papillomavirus
verwendet, um eine Immunität
hinsichtlich der aus der Integration des HPV-Genoms in die zelluläre DNA resultierenden
Tumoren, in denen die Proteine des Capsids nicht mehr exprimiert
werden, zu etablieren. Die Anmeldung W093/02184 beschreibt einen
therapeutischen Ansatz basierend auf der Verwendung von Antigenen
des Capsids als immunogene Agenzien. Diese Dokumente erwähnen nicht
die Möglichkeit,
die präventive
Wirkung, die durch die frühen
Polypeptide hervorgerufen wird, und die kurative Wirkung, die durch
die späten
Polypeptide der Papillomaviren verursacht werden, zu verbinden,
um Zusammensetzungen zu erhalten, die an die Gesamtheit der schweren
Pathologien aufgrund von HPV angepasst sind. Außerdem wurde im Verlauf der
vergangenen Jahre vor geschlagen, Polypeptide zu verwenden, die eine
immunstimulierende Wirkung aufweisen, mit dem Ziel, die T-Zellen
zu aktivieren, mit mehr oder weniger zufriedenstellendem Ergebnis
bezüglich
der anvisierten Pathologien (siehe beispielsweise WO96/11279).
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Außerdem beschreiben
WO93/00436 und WO94/23037 immunogene Eigenschaften des Proteins
L2 von BPV, welche zur Behandlung oder Vorbeugung von durch Papillomavirus
verursachten Tumoren ausgenutzt werden können. Eine besondere Formulierung
verbindet die Proteine L2 und E7 von BPV-4, welche auf rekombinantem
Weg in E. coli produziert werden. Es wird darauf hingewiesen, dass
die antitumorale Wirkung, die durch die Verbindung L2 + E7 hervorgerufen
wird, ähnlich
der ist, die mit L2 alleine erhalten wird.
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WO96/11274
beschreibt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Vorbeugung oder
Behandlung von durch Papillomavirus verursachte Infektionen, die
durch Expression des Polypeptids L1 und ein Fusionspolypeptid L2-E7
in einem Baculovirus-System erhalten werden. Die chimären VLP's (Virus Like Particles), welche
das Polypeptid E7 an ihrer Oberfläche präsentieren, werden in Insektenzellen
Sf9 produziert und durch Zentrifugation auf einem Sucrosegradienten
gereinigt. Die durch diese chimären
Partikel immunisierten Kaninchen erzeugen Antikörper gegen die viralen Polypeptide
L1 und E7. WO96/11274 offenbart ebenso VLP's, welche ein immunstimulierendes Molekül an ihrer
Oberfläche
aufweisen, und beschreiben dessen Einführung in den Bereich von L2,
welcher außen
auf dem Capsid exponiert ist.
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Schließlich beschreiben
WO96/260912 und WO97/46693 pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur
Behandlung von durch Papillomavirus verursachten Infektionen oder
Tumoren bestimmt sind und ein Polypeptid, welches aus der frühen Region
stammt und/oder ein Polypeptid, welches aus der späten Region
des Papillomavirus-Genoms stammt, in Verbindung mit einem Protein,
welches eine immunstimulie rende Wirkung aufweist, enthalten. Insbesondere
beschreibt WO96/29091 die vorteilhafte Wirkung von Interleukin-12
zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Papillomavirus in Verbindung
stehen, und beabsichtigt die Kombination von Interleukin-12 mit
einem Papillomavirus-Antigen, entweder in Form von Polypeptid-Zusammensetzungen oder
von rekombinanten Vektoren, welche diese Polypeptide exprimieren,
und WO97/46693 beschreibt leere Capside VLP's, welche durch Selbstzusammensetzung
der späten
Polypeptide L1 oder L1 + L2 als Transfervektor eines genetischen
Materials, welches ein Protein von Interesse kodiert, gebildet werden.
Die VLP's werden
eingesetzt, um in vivo ein genetisches Material von Interesse, beispielsweise
eines, welches ein Cytokin, wie das Interleukin-2, ein Polypeptid
mit einer co-stimulierenden Aktivität, wie das B7.1 und B7.2, oder
auch die frühen
Polypeptide eines Papillomavirus, kodiert, freizusetzen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Präparat, basierend auf einer
Mischung von Antigenen, welche aus den frühen und späten Regionen eines Papillomavirus
stammen, oder auf einem Vektor, der diese gleichzeitig exprimiert,
mit dem Ziel, eine dauerhafte Immunität gegen die infizierten Zellen
zu etablieren. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgeschlagenen
Vakzine können
präventiv
(Immunprophylaxe) zur Begrenzung der Entwicklung oder Ausbreitung
von viraler Infektion auf benachbarte Gewebe oder kurativ (Immuntherapie)
zum Verhindern oder Reduzieren einer Tumorentwicklung bei infizierten
Patienten verwendet werden. Die Verwendung von Capsid-Antigenen
induziert die Produktion von Antikörpern gegen die antigenen Epitope, welche
auf der Oberfläche
der viralen Partikel lokalisiert sind, wodurch eine dauerhafte Etablierung
der Infektion verhindert wird. Die Verwendung von frühen Proteinen
ermöglicht
die Induzierung einer Immunität
gegen die infizierten Zellen nach der Integration der viralen DNA.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Präparat, welches ein Polypeptid,
das aus einem Papillomavirus stammt, und ein immunstimulierendes
Molekül
verbindet. Einer der Vorteile einer derartigen Zusammensetzung ist,
dass sie die spezifische Immunität,
welche durch die viralen Antigene induziert wird, und die unspezifische
Immunität,
welche durch das immunstimulierende Molekül induziert wird und dazu bestimmt
ist, die spezifische Antwort zu verstärken, kombiniert.
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung ist, pharmazeutische Zusammensetzungen
zur Verfügung
zu stellen, welche die Behandlung von HPV-Infektionen, und insbesondere
von schweren Pathologien, wie Uterushalskrebs, mit verbesserter
Wirksamkeit gegenüber
den Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik ermöglicht.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft somit eine pharmazeutische Zusammensetzung
zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors,
verursacht durch ein Papillomavirus, welche als therapeutische Wirkstoffe:
ein
Polypeptid, welches aus der frühen
Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der frühen Region
E7 stammt, ein Polypeptid, welches aus der späten Region L1 stammt, ein Polypeptid,
welches aus der späten Region
L2 eines Papillomavirus stammt, und wenigstens ein Polypeptid mit
immunstimulierender Wirkung, ausgewählt aus der Gruppe Interleukin-2,
Interleukin-7 und den Coadhäsionsmolekülen B7.1
und B7.2, enthält,
wobei
das Polypeptid mit immunstimulierender Wirkung ein natives Polypeptid
ist, und die Polypeptide, die aus der frühen Region stammen, und die
Polypeptide, die aus der späten
Region stammen, native Proteine oder Varianten davon sind, die durch
wenigstens eine Mutation einer Aminosäure gekennzeichnet sind. Unter
Mutation wird eine Deletion, Insertion und/oder Substitution einer
Aminosäure
verstanden.
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Insbesondere
weist ein Polypeptid zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung
eine Aminosäuresequenz
auf, deren Übereinstimmungsgrad
mit der Sequenz des nativen Proteins über 75%, vorteilhafterweise über 85%
und bevorzugt über
95% liegt. Der Übereinstimmungsgrad
kann leicht mit Hilfe eines geeigneten Computerprogramms oder durch
Anordnung der Sequenzen derart, dass eine maximale Homologie erhalten
wird, und durch Bestimmung der Anzahl der Positionen, in denen die
Aminosäuren
der zwei Sequenzen identisch sind, im Verhältnis zu der Gesamtzahl an
Positionen, berechnet werden. Die Sequenz der Genome von HPV-16
und HPV-18 ist in der "Genebank" unter den Hinterlegungsnummern
K02718 und X05015 veröffentlicht.
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Wie
zuvor erwähnt,
kodiert das Genom des Virus der Papillomavirusfamilie, insbesondere
BPV und HPV, wenigstens 8 Polypeptide, zwei späte Polypeptide L1 und L2, welche
das virale Capsid bilden, und 6 frühe Polypeptide (E1, E2, E4,
E5, E6 und E7), welche in die Regulation, die Aufrechterhaltung
des viralen Genoms und die Transformation der infizierten Zellen
verwickelt sind.
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Im
Fall der Proteine E6 und E7 kann es vorteilhaft sein, auf eine nicht
onkogene Variante, die auf Höhe der
Regionen, die in den Transformationensprozess der infizierten Zellen
verwickelt sind, mutiert ist, auszuweichen. Derartige Varianten
sind in der Literatur beschrieben (Munger et al., 1989, EMBO J.
8, 4099–4105; Crook
et al., 1991, Cell 67, 547–556;
Heck et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442–4446; Phelps
et al., 1992, J. Virol. 66, 2418–2427).
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Unter "immunstimulierend" wird die Fähigkeit
verstanden, eine humorale Immunantwort zu stimulieren, indem B-Lymphozyten
aktiviert werden, um die Produktion von Antikörpern, die gegen die Papillomavirus-Antigene
gerichtet sind, zu amplifizieren, oder eine Immunantwort als zellulären Vermittler
zu stimulieren, indem die T-Lymphozyten aktiviert werden, um eine
signifikante cytotoxische Antwort auszulösen, die gegen die tumoralen
oder durch ein Papillomavirus infizierten Zellen gerichtet ist.
Die Immunstimulation kann im Tiermodell bewertet werden (durch Vergleich
der Abstoßungsrate
in einem Tier, dem ein Tumor implantiert wurde, welcher das Ziel-Antigen
exprimiert, in Gegenwart und Abwesenheit des Immunstimulators).
Allgemein sind die Mittel zum Nachweis einer Immunstimulation in
Roitt (Immunology, 4. Edition, Moby Ltd.) angegeben.
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Es
kann ein immunstimulierendes natives Molekül verwendet werden, welches
in einem Säugetier
und insbesondere beim Menschen gefunden wird.
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Eine
bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzung
enthält:
- (1) ein Polypeptid, welches aus der Region
E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region E7 stammt, ein
Polypeptid, welches aus der Region L1 stammt, ein Polypeptid, welches
aus der Region L2 eines Papillomavirus stammt, und ein Polypeptid,
welches von Interleukin-2 abgeleitet ist,
- (2) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid,
welches aus der Region E7 stammt, ein Polypeptid, welches aus der
Region L1 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region L2 eines
Papillomavirus stammt, und ein Polypeptid, welches von dem Molekül B7.1 abgeleitet
ist, oder
- (3) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid,
welches aus der Region E7 stammt, ein Polypeptid, welches aus der
Region L1 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region L2 eines
Papillomavirus stammt, ein Polypeptid, welches von dem Molekül B7.1 abgeleitet
ist, und ein Polypeptid, welches vom Interleukin-2 abgeleitet ist.
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Bei Übertragung
der obigen Beobachtungen auf die Infektionsfrequenz durch bestimmte
HPV-Typen im Fall von Uterushalskrebs, enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
ein Polypeptid, welches von einem gefährlichen Papillomavirus des
Typs HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 und/oder HPV-45, insbesondere
vom HPV-16-Virus, abstammt. Wenn die Zusammensetzung mehrere Papillomavirus-Antigene
enthält, können diese
gleichen oder verschiedenen Ursprungs sein.
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Ein
Polypeptid, welches von einem Papillomavirus stammt oder eine immunstimulierende
Wirkung aufweist, kann durch die konventionellen Methoden der chemischen
Synthese oder auch durch die rekombinanten DNA-Techniken hergestellt
werden (siehe beispielsweise Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Insbesondere
umfasst ein Herstellungsverfahren das Kultivieren einer Zelle, welche
durch ein DNA-Fragment transformiert wurde, welches das fragliche Polypeptid
kodiert, um eine produzierende Zelle zu erzeugen, und das Polypeptid
aus der Kultur zu gewinnen. Bei der produzierenden Zelle kann es
sich unter anderem um ein Bakterium, eine Hefe oder auch eine Säugetierzelle
handeln, wobei das betreffende DNA-Fragment entweder in das Genom
oder in einen geeigneten Expressionsvektor, welcher sich replizieren
kann, integriert ist. Das DNA-Fragment wird unter der Kontrolle
von Transkriptions- und Translationssignalen platziert, die seine
Expression in der produzierenden Zelle ermöglichen. Expressionsvektoren
und Regulationssignale sind dem Fachmann bekannt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine pharmazeutische Zusammensetzung
zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors,
verursacht durch ein Papillomavirus, welche als therapeutische(n)
Wirkstoff(e) ein oder mehrere rekombinante Vektoren enthält, der/die
von einem Pockenvirus abgeleitet ist/sind, in den/die DNA-Fragmente eingefügt sind,
welche
- (1) ein Polypeptid, welches aus der
frühen
Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der frühen Region
E7 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region L1 stammt, und
ein Polypep tid, welches aus der Region L2 eines Papillomavirus stammt,
oder
- (2) wenigstens ein Polypeptid, welches aus der frühen Region
eines Papillomavirus stammt, wenigstens ein Polypeptid, welches
aus der späten
Region eines Papillomavirus stammt, und wenigstens ein Polypeptid mit
immunstimulierender Wirkung, ausgewählt aus der Gruppe Interleukin-2,
Interleukin-7 und den Coadhäsionsmolekülen B7.1
und B7.2, kodieren,
wobei die DNA-Fragmente unter der
Kontrolle von Elementen platziert sind, die für ihre Expression in einer Wirtszelle
oder einem Wirtsorganismus notwendig sind.
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Gemäß dieser
bevorzugten Alternative ist der therapeutische Wirkstoff ein Vektor,
in den die DNA-Fragmente, welche die Polypeptide kodieren, die von
einem Papillomavirus stammen, eingefügt sind, oder die zuvor definierten
Immunstimulatoren. Dieser Zusammensetzungstyp weist den Vorteil
einer kostengünstigen
Produktion und hohen Stabilität
bei veränderlichen
Umgebungsbedingungen auf. Insbesondere sind die Konservierungsbedingungen
günstiger.
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Die
DNA-Fragmente, welche ein Polypeptid kodieren, welches von einem
Papillomavirus stammt, können
durch Klonierung, durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) oder durch
chemische Synthese gemäß den konventionellen
Techniken erhalten werden, jeweils unter Verwendung von positiven
Papillomaviruszellen, die von Patienten oder Sammlungen erhalten
wurden.
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Das
Gen, welches ein Polypeptid mit immunstimulierender Wirkung kodiert,
kann ebenso gemäß den Standardtechniken
ausgehend von einem Genom einer Zelle (Genomtyp) oder von mRNA einer
Zelle, in der es exprimiert wird (cDNA-Typ) isoliert werden. Außerdem kann
das fragliche Gen (i) ein lösliches
Molekül,
welches entweder intrazellulär
ist oder in das äußere Medium
sekretiert wird, oder (ii) ein Molekül, wel ches in der Membran verankert
und somit auf der Oberfläche
von Zellen, welche es exprimieren, präsentiert wird, kodieren.
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Der
erfindungsgemäße rekombinante
virale Vektor ist von einem Pockenvirus und, insbesondere einem
Vogel-Pockenvirus wie beispielsweise dem Canaripockenvirus, einem
Geflügelpockenvirus
oder einem Kuhpockenvirus abgeleitet, wobei der letztere bevorzugt
ist. Unter den Kuhpockenviren, die im Rahmen den vorliegenden Erfindung
vorgesehen sind, werden bevorzugt die Stämme Kopenhagen, Wyeth und modifizierter
Ankara (MVA für
Modified Vaccinia Virus Ankara) ausgewählt. Die allgemeinen Bedingungen
zum Erhalt eines Kuhpockenvirus, der ein heterologes Gen exprimieren
kann, sind im europäischen
Patent
EP 83 286 und der
Anmeldung
EP 206 920 geschildert.
Das MVA-Virus ist insbesondere in (Mayr et al., 1975, Infection
3, 6–14;
Sutter et Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USD 89, 10847–10851)
beschrieben.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die DNA-Fragmente unter der
Kontrolle von Elementen platziert, die für ihre Expression notwendig
sind. Dazu zählen
die entsprechenden Elemente der Transkriptionsregulation sowie die
Initiations- und Terminationssignale der Translation. Dem Promotor
kommt eine besondere Bedeutung zu. Allgemein greift man auf einen
Promotor zurück,
der im dem Organismus oder der Wirtzelle, die behandelt werden soll,
funktionell und an den verwendeten Vektor angepasst ist. Außerdem kann er
derart modifiziert sein, dass er regulatorische Sequenzen enthält, beispielsweise
ein Aktivierungselement der Transkription oder Sequenzen, die auf
bestimmte zelluläre
Signale antworten. Aus dieser Sicht kann es vorteilhaft sein, einen
gewebespezifischen Promotor zu verwenden, da die mit Papillomavirus
in Verbindung stehenden Erkrankungen im Bereich der Genitalwege
lokalisiert sind, wo ein Promotor auf spezifische tumorale Signale
antwortet (beispielsweise aktiviert in Gegenwart von Wachstumsfaktoren,
die allgemein durch die Tumorzellen über-exprimiert werden), um
die Expression ausschließlich
auf die Tumorzellen zu begrenzen.
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Von
den im Rahmen der Erfindung geeigneten Promotoren seien die Promotoren
SV40 (Virus Simian 40), HMG (Hydroxy-Methyl-Glutarylcoenzym A), TK (Thymidin-Kinase),
CMV (Cytomegalovirus), RSV (Rous Sarcoma Virus), MLP (Major Late
Promotor) von Adenoviren, die an den adenoviralen Vektor angepasst
sind, und die LTR von Mo-MLV
(Moloney Murine Leukemia Virus), welche spezifischer zu den retroviralen
Vektoren ist, genannt. Wenn der Vektor von einem Pockenvirus abgeleitet
ist, handelt es sich bevorzugt bei dem Promotor um den Promotor
eines Gens des verwendeten Pockenvirus, beispielsweise den Promotor
des Gens, welches das Protein 7,5K, HSR, TK oder K1L des Kuhpockenvirus
kodiert. Diese Letzteren sind in der Literatur beschrieben und können ausgehend
von dem viralen Genom durch klassische Techniken kloniert werden.
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Außerdem können die
für die
Expression notwendigen Elemente Sequenzen tragen, die die Expression
verbessern oder in der Wirtzelle aufrechterhalten (Intron, Signalsequenz,
Transkriptions-Terminationssequenz,
Translations-Initiationsstelle, Sequenzen, die die Präsentation
des Polypeptids den Zellen des Immunsystems des Wirts modifizieren
...). Wenn es sich jedoch um einen von einem Pockenvirus abgeleiteten
Vektor handelt, wird die Verwendung von Introns vermieden.
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Eine
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann entweder mit mehreren rekombinanten Vektoren, von denen jeder
ein gegebenes Polypeptid exprimiert, oder mit einem einzigen Vektor,
welcher die DNA-Fragmente,
die den ausgewählten
Polypeptiden entsprechen, exprimiert, platziert unter der Kontrolle
von unabhängigen
oder gemeinsamen Elementen, erhalten werden. Im letzten Fall kann
man auf Sequenzen zurückgreifen, die
die Initiation der Translation auf interne Weise ermöglichen
(IRES) oder auf In-Phasen-Fusionen verschiedener Gene.
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Die
allgemeinen Bedingungen zum Erhalt eines rekombinanten Vektors unter
Verwendung der vorliegenden Erfindung sind ausführlich im Stand der Technik
beschrieben. Wenn es sich um einen pockenviralen Vektor handelt,
kann auf das europäische
Patent
EP 83 286 Bezug
genommen werden. Diese Bedingungen sind auf andere als Vektor geeignete
Viren übertragbar,
die einen nicht-essentiellen genomischen Bereich aufweisen, in den
die Expressionsblöcke
eingebaut werden können.
Sie können
in den gleichen Lokus oder in verschiedene Loci eingefügt werden.
Beispielsweise ist, wenn ein Kuhpockenvirus des Stammes Kopenhagen verwendet
wird, die bevorzugte Insertionsstelle der TK-Lokus und/oder der K1L-Lokus. Die Insertion
auf Höhe des
viralen TK-Gens
bewirkt die Inaktivierung des Gens, wodurch die Selektion der Rekombinanten
erleichtert wird. Bei einem Kuhpockenvirus des Stammes MVA kann
die Insertion der Papillomavirus-Gene und Immunstimulatoren inmitten
einer der Ausschnitte I bis VI und, bevorzugt des Ausschnittsbereichs
II oder III durchgeführt
werden (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol 72, 1031–1038; Sutter
et al., 1994, Vaccine 12, 1032–1040).
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In Übereinstimmung
mit den durch die vorliegende Erfindung verfolgten Zielen kann ein
rekombinanter Vektor außerdem
einen Expressionsblock eines Selektionsmarkergens enthalten, um
die Stufen der Isolierung und Aufreinigung des rekombinanten Virus
zu erleichtern. Insbesondere seien das Gen Neo, welches eine Resistenz
gegen das Antibiotikum G418 verleiht, das Gen Pac, welches Puromycin-Resistenz
verleiht, das TK-Gen des Herpes-Simplexvirus vom Typ I (HSV-1),
welches eine Empfindlichkeit auf bestimmte Nukleosidanaloge, wie
beispielsweise Ganciclovir oder Acyclovir verleiht, die bakteriellen
Gene LacZ, welches die β-Galactosidase
kodiert, und gus A, welches die β-Glucuronidase
kodiert, genannt. Diese zwei letztgenannten enzymatischen Marker
mar kieren die rekombinanten Viren durch Anfärbung in Gegenwart der Substrate
X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid)
bzw. XglcA (5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-glucoronid).
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Eine
erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder
eines Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus, enthält einen
oder mehrere rekombinante Vektoren, der/die von einem Kuhpockenvirus
abgeleitet ist/sind, in den/die
- (1) wenigstens
ein DNA-Fragment, welches wenigstens ein Polypeptid kodiert, welches
aus der späten
Region eines Papillomavirus stammt, und ein DNA-Fragment, welches
das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches
das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches
das Molekül
B7.1 kodiert,
- (2) wenigstens ein DNA-Fragment, welches wenigstens ein Polypeptid
aus späten
Region eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches das Protein E6 eines
Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein E7
eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches das
Interleukin-2 kodiert,
- (3) wenigstens ein DNA-Fragment, welches wenigstens ein Polypeptid
der späten
Region eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches das Protein E6 eines
Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein E7
eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Molekül B7.1 kodiert,
und ein DNA-Fragment, welches das Interleukin-2 kodiert,
- (4) ein DNA-Fragment, welches das Protein E6 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein E7 ein Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert,
ein DNA-Fragment, welches das Protein L2 eines Papillomavirus kodiert,
und ein DNA-Fragment, welches das Molekül B7.1 kodiert,
- (5) ein DNA-Fragment, welches das Protein E6 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein E7 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein L1 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein L2 eines Papillomavirus
kodiert, und ein DNA-Fragment, welches das Interleukin-2 kodiert,
oder
- (6) ein DNA-Fragment, welches das Protein E6 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein E7 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein L1 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein L2 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Molekül B7.1 kodiert, und ein DNA-Fragment,
welches das Interleukin-2 kodiert,
eingefügt sind.
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Dagegen
enthält
eine erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung, die insbesondere zur Immunprophylaxe bestimmt ist,
ein oder mehrere rekombinante Vektoren, der/die von einem Kuhpockenvirus abgeleitet
ist/sind, in den/die wenigstens ein DNA-Fragment, welches wenigstens
ein Polypeptid kodiert, welches aus der frühen Region eines Papillomavirus
stammt, und
- (1) ein DNA-Fragment, welches das
Protein L1 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches das
Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches
das Molekül
B7.1 kodiert,
- (2) ein DNA-Fragment, welches das Protein L1 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein L2 eines Papillomavirus
kodiert, und ein DNA-Fragment, welches das Interleukin-2 kodiert,
oder
- (3) ein DNA-Fragment, welches das Protein L1 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Protein L2 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches das Interleukin-2 kodiert, und
ein DNA-Fragment, welches das Molekül B7.1 kodiert,
eingefügt sind.
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Eine
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann gemäß den auf
dem Gebiet der Impfstoffe bekannten Verfahren hergestellt werden,
und die verabreichbaren Dosen können
in einem großen
Bereich variieren. Sie sind insbesondere abhängig von den Polypeptiden und
den verwendeten Viren, der zu behandelnden Pathologie, dem Zustand
des Patienten und anderen Parametern, die durch die Kliniker festgestellt
werden. Jedoch ist im Allgemeinen die Virusdosis pro Kilo 104 bis 1011, vorteilhafterweise
106 bis 1010, und
bevorzugt 107 bis 109 plaquebildende
Einheiten (ufp), wenn das therapeutische Agens ein viraler Vektor
ist, und 0,05 bis 500 mg, vorteilhafterweise 0,5 bis 200 mg, und
bevorzugt 1 bis 100 mg, wenn das therapeutische Agens seinen Ursprung
in einem Polypeptid hat.
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Eine
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann auf jedem beliebigem konventionellen Verabreichungsweg, insbesondere
intravenös,
intramuskulär,
subkutan oder subepithelial, oder durch Skarifikation verabreicht
werden. Im Fall eines zugänglichen
Tumors ist es auch möglich,
eine direkte Injektion in die Stelle oder den angrenzenden Bereich
des Tumors oder eine topische Anwendung durchzuführen. Als Impfstoff kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
gemäß den auf
dem Gebiet üblichen
Praktiken, beispielsweise in einer einzelnen Dosis oder einer oder
mehreren wiederholten Dosen nach einem bestimmten Unterbrechungsintervall
verabreicht werden. Im Gegensatz dazu kann sie bei einer kurativen
Behandlung regelmäßig innerhalb
eines für
eine wirksame Behandlung ausreichenden Zeitraums verabreicht werden.
Wenn das therapeutische Agens ein viraler Vektor ist, liegt dieses
Virus bevorzugt in lebender Form vor. Wenn es sich um einen Pockenvirus-Vektor handelt, ist
die Verwendung eines abgeschwächten
Stammes, wie des Stammes MVA oder des Thymidinkinase-negativen Stammes
Kopenhagen bevorzugt. Ein viraler rekombinanter Vektor kann durch
eine geeignete, dem Fachmann geläufige,
chemische Behandlung abgeschwächt
werden. Jedoch kann auch die Injektion eines abgetöteten rekombinanten
Vektors in Betracht gezogen werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
eine erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung eine wirksame therapeutische Menge eines rekombinanten
Vektors in Verbindung mit einem aus pharmazeutischer Sicht geeigneten
Träger.
Der Träger
wird derart ausgewählt,
dass seine Verabreichung durch Injektion beim Menschen oder Tier
ermöglicht
wird. Sie kann außerdem
einen Trägerstoff,
ein Lösungsmittel und/oder
einen Zusatzstoff enthalten und in flüssiger oder lyophilisierter
Form vorliegen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische
Zusammensetzung als Medikament zur Behandlung oder Vorbeugung von
Gebärmutterhalskrebs,
einer Dysplasie des Halses niederen Grads und einer Papillomavirus-Infektion.
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Schließlich betrifft
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung
der oben zitierten Erkrankungen, wobei einem Individuum, welches
einer derartiger Behandlung bedarf, eine aus pharmazeutischer Sicht
wirksame Menge einer Mischung des Polypeptids oder eines rekombinanten
Vektors unter Anwendung der vorliegenden Erfindung verabreicht wird.
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Die
vorliegende Erfindung wird in Bezug auf die folgenden Figuren veranschaulicht.
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1 ist
eine schematische Darstellung des Vektors pTG5021, welcher den Transfer
der späten
Gene L1 und L2 von HPV-16, platziert unter der Kontrolle des Promotors
p7,5K, wobei die beiden Kassetten entgegengesetzte Orientierung
zueinander haben, in den TK-Lokus des Kopenhagen-Impfstoffs ermöglicht.
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2 ist
eine schematische Darstellung des Vektors pTG5065, welcher den Transfer
der frühen
Gene E6 und E7 von HPV-16, platziert unter der Kontrolle des Promotors
pH5R (die beiden Kassetten haben eine zueinander entgegengesetzte
Orientierung), des humanen IL-2-Gens
(IL2h), platziert unter der Kontrolle des Promotors p7,5K, und des
Markergens LacZ (btaGAL), platziert unter der Kontrolle des Promotors
pK1L, in den K1L-Lokus des Kopenhagen-Kuhpockenvirus ermöglicht.
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3 veranschaulicht
schematisch die Strategie, die verwendet werden kann, um die späten Gene
L1 und L2 von HPV-16 inmitten des Ausschnittsbereichs II eines Kuhpockenvirus
MVA einzufügen,
wobei die linken und rechten Rekombinationsarme jeweils gekennzeichnet
sind (BRG2 und BRD2).
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BEISPIELE
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Die
vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der vorliegenden Beispiele
beschrieben, ohne dadurch eingeschränkt zu werden.
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Die
unten beschriebenen Konstrukte werden gemäß den allgemeinen Verfahren
der Gentechnik und der molekularen Klonierung, die detailliert in
Maniatis et al. (1989, supra) beschrieben sind, oder gemäß den Empfehlungen
des Herstellers bei Verwendung eines kommerziellen Kits, hergestellt.
Die gerichtete in-vitro-Mutagenese durch synthetische Oligonucleotide
wird mit Hilfe eines Kits von Amersham durchgeführt. Die Techniken der PCR-Amplifikation
sind dem Fachmann bekannt (siehe beispielweise PCR Protocols-A Guide to
Methods and Applications, 1990, editiert von Innis, Gelfand, Sninsky
et White, Academic Press Inc). Wenn eine Reparatur der Restriktionsstellen
durchgeführt
werden muss, besteht die angewandte Technik in einem Auffüllen der
vorste henden 5'-Enden
mit Hilfe des großen
Fragments der DNA-Polymerase I von E. coli (Klenow).
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Bei
den Klonierungsstufen werden die rekombinanten M13-Bateriophagen in
dem Stamm E. coli NM522 (Stratagene) in einem Gelose-Minimalmedium
(Agar 7,5%) oder in einem LBM-reichen Flüssigmedium vervielfältigt. Die
rekombinaten Plasmide, welche das Ampicillin-Resistenzgen tragen,
werden in den Stämmen
E. Coli C600 (Stratagene), BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol.
166, 557–580)
und NM522 auf mit 100 μg/ml
Antibiotikum supplementiertem Nährboden
oder Flüssigmedium
repliziert. Bevorzugt wird der Stamm BJ5183 verwendet, da die Klonierung
durch humologe Rekombination bewirkt wird (Bubeck et al., 1993,
Nucleic Acid Res. 21, 3601–3602).
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Die
Konstruktion der rekombinanten Kuhpockenviren wird gemäß den klassischen
Technologien, die in den bereits genannten Dokumenten und in Meckett
et al. (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415–7419) und
Mackett et al. (1984, J. Virol. 49, 857–864) beschrieben sind, durchgeführt.
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Beispiel 1 Konstruktion
des Kuhpockenvirus Kopenhagen VVTG5021&5065, welches die Gene E6, E7, L1
und L2 von HPV-16 und das humane IL-2-Gen exprimiert
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A. Isolierung der Gene
L1 und L2 von HPV-16
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Die
Fragmente, welche die Proteine L1 und L2 kodierenden, werden durch
PCR ausgehend von genomischer DNA von Caski-Zellen (ATCC 1550) gemäß der auf
dem Gebiet üblichen
Techniken isoliert. Das Amplifikationsfragment, welches die Sequenzen
L1 trägt,
wird in den Vektor M13TG130 (Kienly et al., 1983, Gene 26, 91–99) subkloniert,
wodurch das Konstrukt M13TG8171 entsteht. Die Sequenz des klonierten L1-Gens
weist mehrere Mutationen im Vergleich zu der in der "Ge nebank" enthaltenen Sequenz
auf (Hinterlegung K02718): C anstelle von A an Position 248, C anstelle
von A an Position 253, G anstelle von A an Position 537, G anstelle
von C an Position 682, G anstelle von A an Position 874, Insertion
eines Tripletts ACT an Position 1393, Deletion eines Tripletts GAT
an Position 1390. Die Insertion des PCR-Fragments, welches die L2-Sequenzen
trägt,
in den Vektor M13TG6131 ergibt M14TG9126. Es werden 5 Punktmutationen
im Vergleich zu der in der Genebank veröffentlichten Sequenz gezählt: C anstelle
von T an Position 378, A anstelle von G an Position 691, A anstelle
von G an Position 702, G anstelle von A an Position 990 und C anstelle
von A an Position 1092. Der Vektor M13TG6131 ist von M13TG131 (Kieny
et al., 1983, supra) durch Mutation der internen BglII-Stelle, welche
außerhalb
der multiplen Klonierungsstellen liegt, abgeleitet.
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B. Konstruktion des Vektros
pTG5021 für
den Transfer der Gene L1 und L2 in den TK-Lokus des Kuhpockenvirus-Genoms
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Das
Gen, welches das Protein L1 kodiert, wird durch Erzeugung einer
BglII-Stelle stromaufwärts
des ATG-Initiators modifiziert. Das mutierte Gen wird aus dem Vektor
M13TG8185 durch BglII-SacI-Verdau ausgeschnitten und zwischen die
BamHI- und SacI-Stellen von pTG186-poly eingefügt. Das entstandene Konstrukt wird
pTG4019 genannt. Der Transfervektor pTG186-poly ist detailliert
in dem französischen
Patent 2 583 429 beschrieben. Er trägt 10 Restriktionsstellen für die Insertion
des zu überführenden
Gens und den Promotor p7,5K für
die Kontrolle seiner Expression.
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Das
Gen, welches das Protein L2 kodiert, wird durch BglII-HindIII-Verdau aus M13TG9126
isoliert und anschließend
zwischen die BamHI- und
HindIII-Stellen 3' des
Promotors 7,5K kloniert. Es wird M13TG9127 erhalten, in den durch
gerichtete Mutagenese eine SalI-Stelle stromaufwärts des Promotors eingefügt wird. Der
Expressionsblock "p7,5K- Gen L2" wird aus dem mutierten
Vektor M13TG9129 isoliert und in die SacI-Stelle des Transfervektors
pTG4019 derart kloniert, dass die zwei Kassetten p7,5K-L1 und p7,5K-L2
in entgegengesetzter Orientierung liegen. Das so erhaltene Konstrukt
pTG5021 ist in 1 dargestellt. Die Expressionsblöcke werden
in das Genoms des Kuhpockenvirus vom Stamm Kopenhagen durch homologe
Rekombination überführt. Das
als VVTG5021 bezeichnete rekombinante Virus wird durch Selektion
auf 5-Bromdeoxyuridin (5BUDR)
isoliert.
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C. Isolierung der Gene
E6 und E7 von HVP-16
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Die
Gene E6 und E7 werden ausgehend von der Caski-Zelllinie wie in den
Beispielen 2 und 3 des europäischen
Patents
EP 0 462 187 beschrieben
isoliert. Es werden zwei Konstrukte von dem Klon M13E7/E6, welcher
die Gene E6 und E7 von HPV-16 enthält, abgeleitet, um die späteren Klonierungsstufen
zu vereinfachen. Das erste, bezeichnet als M13TG8188, stammt aus
der Einführung
der PstI- bzw. BamHI-Stellen stromaufwärts und stromabwärts des
E7-Gens, und das zweite, M13TG8189, trägt eine PstI-Stelle stromaufwärts des
E6-Gens. Die Einführung
der Punktmutationen stromaufwärts
eines ATG-Initiators und stromabwärts eines Stopp-Codons sind
dem Fachmann geläufig.
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Die
Verbindung des Proteins E7 von HPV-16 mit dem Produkt des Retinoblastom-Gens
wurde von verschiedenen Autoren gezeigt (siehe beispielsweise Munger
et al., 1989, EMBO J. 8, 4099–4105)
und korreliert mit seinem Transformationsvermögen. Aus offensichtlichen Sicherheitsgründen wird
eine nicht onkogene Mutante erzeugt, bei der Sequenzen, die für die Aminosäuren 21
bis 26 des nativen E7-Proteins kodieren und in die Transformationsfunktion
verwickelt sind, durch gerichtete Mutagenese des Vektors M13TG8188
mit Hilfe des Oligonucleotids oTG5118 (SEQ ID NO: 1) deletiert ist.
Es wird M13TG9104 erhalten. Das mutierte E7-Gen wird im Folgenden
als E7* bezeichnet.
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Gleichermaßen wurde
gezeigt, dass das Protein E6 von HPV-16 mit dem Expressionsprodukt
des Tumorsuppressorgens p53 interagieren kann (Crook et al., 1991,
Cell 67, 547–556).
Der in diese Interaktion verwickelte Bereich ist eindeutig identifiziert
und befindet sich zwischen den Resten 111 bis 115 des nativen Proteins.
Der Vektor M13TG9125 wird durch Mutagenese von M13TG8189 mit Hilfe
des Oligonucleotids oTG5377 (SEQ ID NO: 2) erzeugt. Das mutierte
E6-Gen wird im Folgenden als E6* bezeichnet.
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D. Konstruktion des Transfervektors
pTG5065, Träger
der Gene E6 und E7 von HPV-16 und des humanen IL-2-Gens, integriert
in den Lokus KZ L
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Das
EcoRI-K-Fragment von 5,2 kb vom linken Ende des Genoms des Kuhpockenvirus
Kopenhagen (Guillard et al., 1985, J. Virol. 53, 316–318) wird
in das Plasmid pUC8 (Gibco BRL), welches durch EcoRI linearisiert
wurde, kloniert. Der so erhaltene Vektor wird anschließend einem
BglII-Verdau und dann einer Ligation unterzogen, um ein Fragment
von 855 bp, welches das Restriktionsgen des Wirts K1L kodiert, zu
deletieren (Guillard et al., 1986, Proc. Natl. Acad, Sci., USA 83,
5573–5577).
Das BglII-Fragment von 3,4 kb wird aus diesem Zwischenkonstrukt,
welches als pUC8Khr bezeichnet wird, isoliert und anschließend in
die BamHI-Stelle des Plasmids pUC7 (Gibco BRL) kloniert. Es wird
pBAC1 erzeugt, in den ein XhoI-Adapter links der einzigen BglII-Stelle
eingeführt
wird. Nach Verdau mit XhoI und BglII wird ein SalI-BglII-Fragment, welches
den Vaccin-Promotor p7,5K trägt,
eingefügt.
Die zwei EcoRI-Stellen werden durch EcoRI-Verdau und anschließende Klenow-Behandlung
und Religation eliminiert. Der Vektor pTG2147 wird durch Einführen einer
multiplen Klonierungsstelle, die aus dem Vektor p poly II (Lathe
et al., 187, Gene 57, 193–201)
isoliert und in Form eines BglII-BamHI-Fragments isoliert worden
war, in die einzige BglII-Stelle erhalten. Er enthält somit
die Rekombinationsarme, die die Insertion in den Lokus K1L, welcher
den Promotor p7,5K gefolgt von Restriktionsstellen einrahmt, ermöglichen.
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Die
Gene E6* und E7* werden stromabwärts
des Vaccin-Promotors pH5R, welcher in dem Vektor M13TG9132 enthalten
ist, kloniert, um M13TG9138 bzw. M13TG9139 zu ergeben. Der Vektor
M13TG9132 entsteht durch die Insertion des Promotors des H5R-Gens,
welches durch PCR aus dem viralen Genom isoliert wurde, in den Phagen
M13TG6131.
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Die
cDNA, welche das humane Interleukin-2 kodiert, wird aus dem Plasmid
pTG36 (französisches
Patent 2 583 770) isoliert, in einen Zwischenvektor eingeführt und
durch SalI-BamHI-Verdau ausgeschnitten, um in den Transfervektor
pTG2147 gezielt in den Lokus K1L eingefügt zu werden. Die Insertion
findet auf Höhe der
PstI- und XbaI-Stellen, die stromabwärts des Promotors p7,5K gelegen
sind, mit Hilfe von Klonierungs-Adaptern statt. Es wird pTG5056
erhalten.
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Der
Expressionsblock pH5R-E6* wird aus dem Vektor M13TG9139 in Form
eines BglII-BamHI-Fragments, welches in die BamHI-Stelle des Vektors
pTG5056 eingefügt
wird, isoliert. Es wird der Vektor pTG5060 erzeugt. Der Expressionsblock
pH5R-E7* wird aus M13TG9138 herausgeschnitten und in die BamHI-Stelle des
Vektors pTG5060 eingefügt,
wodurch pTG5062 erhalten wird. Die Insertion in den K1L-Lokus führt zu rekombinanten
Viren, die eine reduzierte oder sogar zerstörte Replikationsfähigkeit
in bestimmten Zelltypen aufweisen. Aus diesen Gründen wird ein positiver Selektionsmarker
eingeführt,
um die Identifikation der rekombinanten Viren zu erleichtern. Der
Vektor pTG5065 resultiert aus der Klonierung einer Expressionskassette "pK1L-LacZ-Gen", welche aus dem
Plasmid pIV75 (Chen et al., 1993, Virology 196, 682–693) durch
BglII-BamHI-Spaltung isoliert wurde, in die BamHI-Stelle von pTG5062.
Wie in 2 dargestellt, ermöglicht er den Transfer der
Blöcke
E6*, E7* und IL-2 in den Lokus K1L des Kuhpockenvirus.
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Das
rekombinante Kuhpockenvirus, als VVTG5065 bezeichnet, wird durch
homologe Rekombination nach Transfektion des Vektors pTG5065 in
embryonale Hühnchenzellen,
die mit dem Kopenhagen-Wildtyp-Kuhpockenvirus
infiziert und durch Anfärbung
auf Gelose mit X-Gal markiert worden waren, erzeugt. Die Kuhpockenviren
VVTG5021 und VVTG5065 werden in doppelten Infektionsessais verwendet.
Die doppelten Rekombinanten werden anhand der zwei Marker, Bildung
von blauen Plaques in Gegenwart von X-Gal und Deletion des TK-Markers,
selektiert. Diese, als VVTG5021&5065
bezeichnet, exprimieren die Blöcke p7,5K-IL-2,
pH5R-E6* und pH5R-E7*, integriert in den Lokus K1L, und die Blöcke p7,5K-L1
und p7,5K-L2, integriert in den TK-Lokus.
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Die
Expression der HPV-Gene kann durch Analyse im Western-Blot mit Hilfe
von geeigneten monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern oder
durch reverse PCR verifiziert werden. Die Produktion von IL-2 kann durch
einen ELISA- oder CTL-Test, wie in der Literatur beschrieben, bewertet
werden. Das Expressionsniveau in vitro liegt in der Größenordnung
von 60 ng/ml/106 infizierte Zellen bei 1
pfu/Zelle und 24 Stunden.
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Beispiel 2 Konstruktion
eines Kuhpockenvirus Kopenhagen, welches die Gene E6, E7 und das
humane IL-2-Gen exprimiert
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Die
cDNA, die das humane Interleukin-2 kodiert, wird aus dem Plasmid
pTG36 durch PstI-Verdau isoliert und in die PstI-Stelle des Plasmids
pTG186 eingefügt,
wodurch pTG188 erhalten wird. Das durch homologe Rekombaniation
erhaltene Virus wird als VVTG188 bezeichnet.
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Das
Gen E6* wird in Form eines PstI-BamHI-Fragments aus M13TG9125 isoliert
und stromabwärts des
Promotors 7,5K zwischen die PstI- und XbaI-Stellen von pTG2147 in
Gegenwart eines BamHI-XbaI-Adapters
eingefügt,
wodurch pTG5057 erhalten wird. Das Gen E7* wird unter der Kontrolle
des Vaccin-Promotors H5R platziert, wodurch M13TG9138 erzeugt wird
und die durch die BamHI-BglII-Stellen einge rahmte Kassette in die
BamHI-Stelle von pTG5057 subkloniert. Es wird pTG5059 erhalten,
in dessen BamHI-Stelle der Selektionsmarker LacZ unter der Kontrolle
des Promotors des Vaccin-Gens K1L, welches durch BglII-BamHI-Verdau aus
dem Vektor pIV75 isoliert worden war, eingefügt wird. Das entstehende Konstrukt
wird als pTG5061 bezeichnet und durch homologe Rekombination wird
mit dem Vaccin-Genom VVTG5061 erzeugt.
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Ein
rekombinantes Kuhpockenvirus, welches die Gene E6* und E7* integriert
in den Lokus K1L und das humane IL-2-Gen integriert in den TK-Lokus
exprimiert, wird durch Co-Infektion von embryonalen Hühnchenzellen
durch die Viren VVTG5061 und VVTG188 erhalten. Das letztgenannte
produziert IL2 in einer Menge von über 400 ng pro 106 infizierten
Zellen bei 1 pfu pro Zelle über
24 Stunden. Das doppelt rekombinante Virus wird als VVTG5061&188 bezeichnet.
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Beispiel 3 Konstruktion
eines Kuhpockenvirus Kopenhagen, welches die Gene E6, E7 und das
den humanen Adhäsions-Cofaktor kodierende
Gen B7.1 exprimiert
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Die
B7.1 kodierende cDNA wird aus einer mRNA-Präparation, welche aus der Zelllinie
Daudi (ATCC CCL-213) durch reverse PCR erhalten worden war, unter
Verwendung der Primer oTG6353 und oTG6352 (SEQ ID NO: 3 und 4) erhalten.
Die Gensequenz ist in der Genebank unter der Hinterlegungsnummer
M27533 hinterlegt. Das amplifizierte Fragment wird zwischen die
BglII- und EcoRI-Stellen von M13TG6131 kloniert, wodurch M13TG9149
entsteht, und anschließend
zwischen die BamHI- und EcoRI-Stellen von pTG186 platziert. Das
Konstrukt wird pTG5090 und das durch homologe Rekombination erhaltene
Virus VVTG5090 genannt. Ein Kuhpockenvirus, welches die Gene E6*
und E7* von HPV-16 integriert in den K1L-Lokus und das humane Gen
B7.1 integriert in den TK-Lokus exprimiert, kann durch Co-Infektion
von emb ryonalen Hühnchenzellen durch
die Viren VVTG5061 und VVTG5090 erhalten werden. Das rekombinante
Virus wird als VVTG5061&5090
bezeichnet.
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Beispiel 4: Konstruktion
eines Kuhpockenvirus von Stamm MVA, welches die Gene E6, E7 und
das Gen B7.1 integriert in den Ausschnittsbereich III exprimiert
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Das
MVA-Virus ist von dem Stamm des Kuhpockenvirus Ankara abgeleitet.
Es ist nicht mehr im Stande, infektiöse Partikel in den Säugetierzellen
zu erzeugen, entwickelt sich jedoch bei embryonalen Hühnchen-Fibroblasten
korrekt. Seine Adaption an diese Zellen bewirkt das Ausschneiden
von 6 Regionen, die für seine
Entwicklung und seinen infektiösen
Zyklus bei diesem Zelltyp nicht essentiell sind (Verschwinden von etwa
15% des viralen Genoms; Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031–1038).
Die Integration des exogenen genetischen Materials kann auf Höhe irgendeiner
dieser Ausschnittsbereiche bewirkt werden. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung werden die Ausschnitte II und III, die auf Höhe der Restriktionsfragmente
HindIII N bzw. A lokalisiert sind, verwendet (Altenburger et al.,
1989, Arch. Virol. 105, 15–27).
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In
einem ersten Schritt wird der Vektor pTG6019, der die Insertion
des MVA-Virus in den Ausschnittsbereich III ermöglicht, konstruiert. Die homologen
Rekombinationsarme auf beiden Seiten des Ausschnittsbereichs III
werden durch PCR ausgehend von dem viralen Genom (siehe amerikanisches
Patent
US 5,185,146 ) unter
Verwendung der Primer oTG7637 und pTG7638 (SEQ ID NO: 5 und 6) für den linken
Arm und oTG7635 und oTG7636 (SEQ ID NO: 7 und 8) für den rechten
Arm isoliert. Die amplifizierten Fragmente werden in die EcoRI-Stelle
des Vektors pTG1E kloniert, wodurch pTG6019 erzeugt wird. Das zu überführende genetische Material
wird zwischen die beiden Rekombinationsarme eingefügt. Der
Vektor pTG1E ist ähnlich
dem pTGiH (französisches Patent
2 583 429), abgesehen von der Gegenwart eines EcoRI-Adapters anstelle
der multiplen Klonierungsstellen.
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Zunächst wird
eine Expressionskassette des Markergens gus A eingefügt. Zuvor
wird der Promotor 7,5K in die BamHI-Stelle von pTG6019 kloniert.
Es wird pTG6021 erhalten, in dessen BamHI-Stelle das Gen gus A,
welches in Form eines BglII-BamHI-Fragments erzeugt wurde, eingefügt wird.
Dieses kann ausgehend von der in der Literatur veröffentlichten
Sequenz erhalten werden. Das entstehenden Konstrukt wird pTG6022 genannt.
Die Gegenwart des Markers ermöglicht
das Unterscheiden der Wildtyp-Viren von den rekombinanten Viren
durch Detektion der enzymatischen GUS-Aktivität durch das Substrat XglcA.
Eine rote Anfärbung
zeigt die Aktivität
der β-Glucuronidase.
Jedoch kann es im Hinblick auf eine klinische Anwendung nützlich sein,
diesen bakteriellen Marker aus dem Endprodukt nach der Selektion
der rekombinaten Viren zu entfernen. Dazu wird die Fähigkeit
des Virus ausgenutzt, diese Sequenzen, die sich zwischen zwei homologen
Stellen befinden, zu deletieren. Aus diesem Grund wird ein zweiter
Promotor p7,5K stromabwärts
des gus-A-Gens in Sinn-Orientierung im Hinblick auf die Sequenzen,
die die Expression des gus-A-Gens steuern, eingefügt. Der Vektor
pTG6022 wird durch Insertion eines p7,5K-Fragments, welches mit
kohäsiven
Enden versehen ist, zwischen die BamHI- und SacI-Stellen modifiziert,
wodurch pTG6025 entsteht.
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Dieser
wird durch Insertion der Expressionskassetten der mutierten E6*-
und E7*-Gene vervollständigt.
Anschließend
wird eine neue Promotorsequenz p7,5K, dieses Mal in Antisense-Orientierung
hinsichtlich der vorausgegangenen Gene, eingeführt. Dieses Konstrukt, genannt
pTG6039, enthält
somit die instabile GUS-Kassette "p7,5K→gusA-p7,5K→", gefolgt von p7,5K in entgegengesetzter
Orientierung. Parallel dazu werden die Gene E6* und E7* jeweils
aus den Vektoren M13TG9104 und M13TG9125 durch BamHI- und PstI-Verdau
isoliert und in entgegengesetzter Orientierung zueinander in die
PstI-Stelle von M13TG6131 zusammengefügt. Das Ganze wird in Form
eines PstI-Fragments
ausgeschnitten, welches in pTG6039, welcher mit dem gleichen Enzym
linearisiert wurde, eingefügt
wird. Es wird der Vektor pTG6056 erhalten, welcher die folgenden
Sequenzen p7,5K→gusA-p7,5K→E7*-E6*←p7,5K" enthält.
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Das
immunstimulierende Gen B7.1 wird in dieses Konstrukt integriert.
Dazu wird der Vektor pTG6056 mit HindIII und KpnI gespalten, bevor
er in Gegenwart der Oligonucleotide oTG10451 und oTG10450 (SEQ ID NO:
9 und 10) ligiert wird, um pTG6070 zu erzeugen. Die Oligonucleotide
ermöglichen
die Klonierung der Expressionskassette "pH5R-B7.1" durch homologe Rekombination. Zu diesem
Zweck werden die aus M13TG9149 isolierten Sequenzen B7.1 stromabwärts des
Vaccin-Promotors pH5R kloniert, um M13TG9184 zu bilden. Das BglII-EcoRI-Fragment, welches
die Kassette trägt,
wird in den durch XhoI linearisierten Vektor pTG6070 durch homologe
Rekombaniation in E. coli integriert. Es wird der Vektor pTG79 erhalten,
der insgesamt das Markergen gus A in einer "labilen" Form und die Expressionskassetten der
frühen
Gene von HPV-16 sowie eine Kassette des Co-Stimulierungsgens B7.1
trägt.
Das durch homologe Rekombination mit dem MVA-Genom erzeugte Virus
wird als MVATG6079 bezeichnet.
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Die
Expressionsblöcke
der späten
Gene von HPV-16 können
in den Ausschnittsbereich II mit Hilfe des Transfervektors pTG5018
eingefügt
werden. Dieser wird durch Insertion von linken und rechten Rekombinationsarmen,
die den Ausschnitt II umrahmen, erzeugt durch PCR unter Verwendung
der Primer oTG7665 und pTG7584 (SEQ ID NO: 11 und 12) und oTG7639
und opTG7640 (SEQ ID NO: 13 und 14), durch Insertion in die EcoRI-Stelle
von pTG1E konstruiert. Wie zuvor werden die beiden Arme einer Expressionskassette
eines positiven Markers integriert, um die Detektion der rekombinanten
Viren zu vereinfachen; dieser kann nach der Selektionsstufe entfernt
werden (Spehner et al., 1990, J. Virol. 64, 527–533). Der Vektor pTG6020 resultiert aus
der Klonierung des Gens LacZ, platziert stromabwärts des Promotors p7,5K in
den durch BamHI linearisierten Vektor pTG6018. Der Vektor pTG6020
wird durch Insertion einer Sequenz p7,5K zwischen seine BamHI- und
SacI-Stellen stromabwärts des
Gens LacZ modifiziert. Es wird pTG6024 erhalten. Die Kassetten L1 und
L2 können
anschließend
gemäß einer
in 3 gezeigten Strategie eingeführt werden.
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Beispiel 5: Konstruktion
des Kuhpockenvirusstammes MVA, welcher die Gene E6, E7 und das IL2-Gen
integriert in den Ausschnittsbereich III exprimiert
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Es
wird die gleiche Strategie wie zuvor verwendet, um das Gen IL-2 in den Vektor pTG6056
einzuführen.
Nach Klonierung der Rekombinations-Oligonucleotide oTG10503 und
oTG10502 (SEQ ID NO: 15 und 16) zur Erzeugung von pTG6076 wird dieser
mit XhoI gespalten und das BglII-EcoRI-Fragment, welches ausgehend
von M13TG9185 erzeugt wurde (pH5R-IL-2) durch homologe Rekombination
eingefügt.
Der so erhaltene Vektor pTG6090 enthält das Markergen gus A in einer "labilen" Form, die Expressionskassetten
der frühen Gene
von HPV-16 sowie eine Kassette des humanen IL-2-Gens. Das durch
homologe Rekombination mit dem MVA-Genom erhaltene Virus wird als
MVATG6090 bezeichnet. Die späten
Gene können
in den Ausschnittsbereich II unter Verwendung von pTG6018, wie oben
beschrieben, integriert werden.
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Beispiel 6: Funktionsfähigkeit
des Vektors VVTG5021&5065
im Tiermodell
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A. Toxizitätsstudien
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Nacktmäuse erhielten
107 pfu von VVTG5021&5065 oder 107 pfu
des Wildtyp-Kuhpockenvirus auf intravenösem, intramuskulärem, subkutanem
oder intracranialem Weg. Es wurden Gruppen zu je 5 Mäusen gemäß dem injizierten
Virustyp und dem Verabreichungsweg gebildet und 26 Tage nach der
Injektion die Anzahl der Tiere, die Erkrankungen in Verbindung mit
dem Vakzin aufweisen, festgestellt. Die Mäuse, die das rekombinante Virus
erhalten hatten, zeigten keinerlei Erkrankungen, wie der verwendete
Verabreichungsweg auch war, während
die Mehrzahl der mit dem Wildvirus behandelten Tiere Erkrankungen
mit einer Häufigkeit
und einer Schwere in Abhängigkeit
des Verabreichungsweges zeigten. Außerdem wurden im Fall einer
intravenösen
und intracranialen Injektion Todesfälle registriert. Diese Daten
zeigen, dass VVTG5021&5065
in Bezug auf das Wildvirus abgeschwächt ist und auch nach intracranialer
Injektion keine Erkrankungen hervorruft.
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B. Immunprophylaxeversuche
mit VVTG5021&5065
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C57BL6-Mäuse wurden
dreimal auf subkutanem Weg mit 107 pfu von
VVTG5021&5065
geimpft. Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurden diese Tiere
mit 103-Zellen E7W1, die subkutan implantiert
wurden, überprüft. Diese
E7W1-Zellen stammen aus einer murinen Lymphomlinie, die mit einem
Vektor transfiziert ist, welcher das onkogene E7-Gen von HPV-16
exprimiert. Der prozentuale Anteil der überlebenden Tiere in Abhängigkeit
der Zeit wird mit dem verglichen, der mit Vergleichmäusen, die
mit 107 pfu eines nicht-rekombinanten Kuhpockenvirus
VVTG186 (erhalten aus dem obigen Vektor TG186) behandelt worden
waren, erhalten wurden. Das Verfolgen der Sterblichkeit zeigt einen
Unterschied zwischen den beiden Gruppen. In der Vergleichsgruppe
sind 100% der Tiere am Tag 36 gestorben, während 40% der mit VVTG5021&5065 geimpften Tiere
noch am Tag 36 und mehr als 30% am Tag 51 leben.
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Folglich
weisen die rekombinanten Viren, die die Antigene von HPV und ein
immunstimulierendes Gen exprimieren, eine antitumorale Wirkung gegen
die Tumorzellen, die das Onkogen E7 von HP-16 exprimieren, auf.
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C. Immuntherapieversuche
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C57BL6-Mäuse werden
mit 103-Zellen E7W1, welche subkutan implantiert
werden, geimpft (Tag 0). 107 pfu des rekombinanten
Virus werden anschließend
subkutan an Tag 3, Tag 6 und Tag 9 verabreicht, und der prozentuale
Anteil der überlebenden
Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren, die das nicht-rekombinante Virus
erhalten hatten, bestimmt. Während
100% der Kontrolltiere gestorben sind, beobachtet man einen bemerkenswerten
Anstieg an überlebenden
Tieren, die mit einer Mischung von VVTG5061&5021 und VVTG188 injiziert worden
waren. Ähnliche
Ergebnisse werden nach Verabreichung von VVTG5065&5021 und VVTG188 erhalten.
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Diese
Immuntherapie-Versuche wurden unter Verwendung eines anderen Tumormodells
reproduziert, wobei BMK-16-myc-Zellen die E7w1-Zellen ersetzten.
Bei BMK-16-myc-Zellen handelt es sich um Nierenzellen von neugeborenen
Mäusen,
die mit dem Genom von HPV-16 und dem murinen Gen c myc transfiziert
worden sind. Die Tiere werden mit 107 Viren
MVATG6090, welche die Gene E6*, E7* von HPV-16 und das humane IL-2
exprimieren, behandelt. Im Vergleich zu den Kontrollen weisen die
behandelten Mäuse
eine Verzögerung des
Tumorwachstums bis zum Tag 15 auf.
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