JP4070815B2 - パピローマウイルス腫瘍および感染を治療するための医薬組成物 - Google Patents
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Description
ヒトの場合、HPVは皮膚いぼへの良性感染から悪性腫瘍までの範囲の病変と関連がある。これらのウイルスは生殖器管、口腔管および呼吸器管表面の外層に対して高度な特異性を示す。疫学データによると、ある種の株特にHPV−16および−18が低級の病状の、またHPV−31、−33および−45がより少ない程度で子宮頚部がんにおいて演ずる役割を強く暗示している。世界的にみて子宮頚部がんは女性がん中2位を占める。WHOによれば毎年460,000件に及ぶ新規ケースが記録され、このうち少なくとも200,000ケースは明らかにHPVと関連がある。一連の研究は、これらのウイルスの形質転換における役割、新生物形成細胞ゲノムへのこれらの特異的組み込み、がん細胞中におけるこれらの遺伝子活性および、HPV−ポジテイブ新生物形成細胞の悪性表現型保存におけるE6およびE7初期遺伝子の発現の重要性を実証している(Monsenego, J. Impact Medecin, March 11, 1994)。
HPVウイルスと関係する病的状態は、これらが永続性で再発性であるという理由で治療的問題を引き起こしている。これら疾病の処置には手術、化学療法、抗ウイルス剤および免疫療法等、既に多くのアプローチが採用されている。
この観点で欧州特許EP第0,462,187号公報は、細胞性DNA中へのHPVゲノムの組み込みに由来する腫瘍に対する免疫を確立するための、パピローマウイルス初期遺伝子を用いるワクチン接種アプローチを記載しており、ここではキヤプシドタンパク質はもはや発現されない。出願WO第93/02184号公報は、免疫原性剤としてのキヤプシド抗原の使用に基ずく処置的アプローチを教示している。これらの文献では、HPVにより引き起こされる重い病的状態のすべてに適する組成物を生じさせるために、初期ポリペプチドにより提供される予防効果とパピローマウイルスの後期ポリペプチドにより授けられる治療効果とを併合することの可能性については暗示がない。その上、過去数年間T細胞活性化の目的で免疫刺激活性を有するポリペプチドの使用が提案され、目標とする病的状態の大小に応じて有益な結果を生じている(例えばWO96/11279号公報参照)。
さらに詳しくは本発明は、感染細胞に対する持続的免疫確立を目的にした製剤であって、パピローマウイルスの初期および後期領域からの抗原の混合物、またはこれらを同時に発現するベクターに基ずく製剤に関する。本発明の枠組み以内で提供される候補的ワクチンはウイルス感染の隣接組織への進行または伝播を制限する予防目的(免疫予防)、または感染患者の腫瘍進行を防止または軽減する治療目的(免疫治療)のために使用できる。このキヤプシド抗原を使用するとウイルス粒子表面に位置する抗原エピトープに対する抗体の生産が誘発されて、感染が長期間持続するのを妨げる。この初期タンパク質の使用により、ウイルスDNAの組み込み後に感染した細胞に対する免疫性を誘発させることが可能になる。
また本発明は、パピローマウイルスからのポリペプチドと免疫刺激分子との組み合わせによる製剤を提供する。かかる組成物の利点の一つは、ウイルス抗原により誘発される特異的免疫性と、特異的応答を強化するように設計された免疫刺激分子により誘発される特異的免疫性とが併合されることにある。
本発明の目的は、従来技術の組成物に較べて改良された効能を有し、HPV感染および一層具体的には子宮頚部がん等の特に一層重大な病変の治療を可能にする医薬組成物の公の提供にある。
したがって本発明の主題は、パピローマウイルス感染または腫瘍の治療または予防を意図した医薬組成物にあり、この組成物は治療剤として:
(1)パピローマウイルスの初期領域からの少なくとも一種のポリペプチドおよびパピローマウイルスの後期領域からの少なくとも一種のポリペプチド、
(2)パピローマウイルスの初期領域からの少なくとも一種のポリペプチド、パピローマウイルスの後期領域からの少なくとも一種のポリペプチドおよび免疫刺激活性を有する少なくとも一種のポリペプチド、または
(3)パピローマウイルスの初期または後期領域からの少なくとも一種のポリペプチドおよび免疫刺激活性を有する少なくとも種のポリペプチド
を含有する。
一般的にポリペプチドなる用語は、未変性(native)ポリペプチドの全てまたは一部、起源を異にする配列の融合に起因するキメラポリペプチド、またはアミノ酸の少なくとも一つの突然変異(欠失、挿入および/または置換)により特徴ずけされる変異体を指す。一層具体的には、本発明の枠組み以内で用いるポリペプチドは、特に、未変性タンパクの配列と較べた際の相似度(degree of similarity)が75%より大きい、有利には85%より大きい、好ましくは95%より大きいアミノ酸配列を有する。この相似度は、適当なコンピユータプログラムを用いて、またはホモロジーの最高度合いが得られるように配列を整列させ、位置全数に関して2つの配列のアミノ酸が同一であると認められる位置数を数え上げることにより容易に計算できる。HPV−16およびHPV−18ゲノムの配列はそれぞれ受託番号(accession number)K02718およびX05015としてGenebankに開示されている。
パピローマウイルス系列(family)のウイルスゲノム特にBPVおよびHPVのゲノムは、ウイルスキヤプシドを含む2つの後期ポリペプチドL1およびL2、ならびにウイルスゲノムの調節と保存および感染細胞の形質転換に関与する6つの初期ポリペプチド(E1、E2、E4、E5、E6およびE7)の少なくとも8つのポリペプチドをコードする。
パピローマウイルスの初期タンパク質はいずれも本発明の枠組み以内で使用できるが、E6タンパク質から誘導される(もしくは由来する)ポリペプチド、E7タンパク質から誘導されるポリペプチドまたはE6とE7タンパク質から誘導されるポリペプチドから選択して使用するするのが好都合である。感染細胞の形質転換プロセスに関与する領域のレベルで突然変異した非発がん性変異体を使用するのが有利であろう。かかる変異体については文献に記載がある(Mungerら、1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Crookら、1991, Cell 67, 547-556; Heckら、1992, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89, 4442-4446; Phelpsら、1992, J. Virol. 66, 2418-2427)。
パピローマウイルスの後期領域からの好ましいポリペプチドはL1タンパク質、L2タンパク質、またはL1とL2タンパク質から誘導される。
特に有利な実施態様(2)および(3)によれば、本発明の組成物はまた、免疫刺激活性を有するポリペプチドを含む。”免疫刺激”とは、パピローマウイルス抗原に対する抗体の生産を増幅するようにBリンパ球を活性化して体液性免疫応答を刺激する能力、または腫瘍細胞もしくはパピローマウイルス感染細胞に対する有意細胞毒性応答を引き起こすようにTリンパ球を活性化することにより細胞媒介免疫応答を刺激する能力を意味する。一つの指針として、この免疫刺激性は動物モデルで評価できる(免疫刺激剤の存在および不在下、ターゲット抗原発現腫瘍を移植した動物の拒絶レベルの比較による)。一層一般的は、免疫刺激を実証するための方法がRoitt(Immunology, 4th edition, Moby Ltd)により示されている。
哺乳動物特にヒト中に見い出されるような未変性免疫刺激分子、その一部、各種起源の配列の融合から得られるキメラ分子または突然変異体の使用も可能であるが、免疫刺激機能が保存されることが前提である。想定できるすべての分子のなかでも、インターロイキン−2、インターロイキン−7、インターロイキン−12ならびに共付着(co-adhesion)分子B7.1およびB7.2からなる、またはこれらから誘導されるポリペプチドの使用が好ましいが、本発明の枠組以内ではインターロイキン−2および上記分子B7.1が特に好ましい。
本発明の好ましい組成物は:
(1)パピローマウイルスの、E6領域からのポリペプチド、E7領域からのポリペプチド、L1領域からのポリペプチドおよびL2領域からのポリペプチド、
(2)パピローマウイルスのE6領域からのポリペプチド、E7領域からのポチペプチド、およびインターロイキン−2から誘導されるポリペプチド、
(3)パピローマウイルスのE6領域からのポリペプチド、E7領域からのポチペプチド、および上記分子B7.1から誘導されるポリペプチド、
(4)パピローマウイルスのE6領域からのポリペプチド、E7領域からのポチペプチド、上記分子B7.1から誘導されるポリペプチド、およびインターロイキン−2から誘導されるポリペプチド、
(5)パピローマウイルスの、E6領域からのポリペプチド、E7領域からのポチペプチド、L1領域からのポリペプチド、L2領域からのポリペプチド、およびインターロイキン−2から誘導されるポリペプチド、
(6)パピローマウイルスのE6領域からのポリペプチド、E7領域からのポチペプチド、L1領域からのポリペプチド、L2領域からのポリペプチド、および上記分子B7.1から誘導されるポリペプチド、または
(7)パピローマウイルスのE6領域からのポリペプチド、E7領域からのポチペプチド、L1領域からのポリペプチド、L2領域からのポリペプチド、上記分子B7.1から誘導されるポリペプチド、およびインターロイキン−2から誘導されるポリペプチド
を含んでいる。
いくつかのHPVタイプによる子宮頚部がんでの感染の上記発生を考慮して、本発明の組成物はHPV−16、HPV−18、HPV−31、HPV−33および/またはHPV−45タイプの危険なパピローマウイルスからのポリペプチド、および特にHPV−16ウイルスからのポリペプチドを含む。当然ながら、この組成物が各種パピローマウイルス抗原を含有している場合には、これらは共通または異なった起源のものである。
一般には、パピローマウイルスからのポリペプチドまたは免疫刺激活性を有するポリペプチドは、化学合成による公知方法、または別法として組み換えDNA技術(例えば、Maniatisらの、1989, Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, Laboratory Press, Cold Sprng Harbor, NY参照)により生産できる。一層具体的に一つの調製法は、問題ポリペプチドをコードするDNAフラグメントを用いて形質転換した細胞を培養して生産性細胞を生じさせる行為、および上記ポリペプチドを培養物から収集する行為を含む。考慮されるDNAフラグメントがそのゲノム中に組み込まれるか、または複製し得る適当な発現ベクター中に組み込まれるかのいずれかである限りは、この生産性細胞の起源は問わず、また制限はなく、バクテリア、酵母または別法として哺乳動物細胞のものであってもよい。当然ながらDNAフラグメントは、転写および翻訳シグナルの統制下に置いて生産性細胞におけるその発現を可能にさせる。発現ベクターおよび制御シグナルは当業者に公知である。
また本発明はパピローマウイルス感染または腫瘍の治療もしくは予防を意図した医薬組成物にも関し、この組成物は治療剤として次の:
(1)パピローマウイルスの初期領域からの少なくとも1種のポリペプチドおよびパピローマウイルスの後期領域からの少なくとも1種のポリペプチド、
(2)パピローマウイルスの初期領域からの少なくとも1種のポリペプチド、パピローマウイルスの後期領域からの少なくとも1種のポリペプチド、および免疫刺激活性を有する少なくとも1種のポリペプチド、または
(3)パピローマウイルスの初期または後期領域からの少なくとも1種のポリペプチド、および免疫刺激活性を有する少なくとも1種のポリペプチド;
をコードするDNAフラグメントが挿入される1種または2種以上の組み換えベクターを含有し、上記DNAフラグメントは宿主細胞または生物体中でのそれら発現に要する諸要素の支配下に置かれる。
実際上好ましい別法によれば、上記治療剤はベクターであって、その中にパピローマウイルスからのポリペプチドまたは上記定義の免疫刺激剤をコードするDNAフラグメントが挿入される。このタイプの組成物は安価に生産でき、多様な環境条件下で高度に安定である利点がある。特に、保管条件には制約が少ない。
パピローマウイルスからのポリペプチドをコードするDNAフラグメントは、クローニング、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)または化学合成により、患者もしくはコレクションから得られるパピローマウイルス陽性の細胞から出発する、通常使用される公知技術により得られる。
免疫刺激活性を示すポリペプチドをコードする遺伝子は標準技術に従って細胞(ゲノムタイプ)のゲノムから、またはそれが発現される細胞のメッセンジャーRNA(相補的DNAタイプ)から単離することもできる。その上、問題の遺伝子は、(i)細胞内、もしくは外部媒体中のいずれかに分泌される可溶性分子、または(ii)膜に固定された分子、したがってそれを発現する細胞の表面に存在する分子をコードすることができる。
本発明の枠組み以内での好ましい組み換えベクターはウイルスベクターであって、そのゲノム中に上記DNAフラグメントが、宿主細胞もしく生物体中でのそれらのトランスフアーおよび発現を可能にするように挿入されている。本発明の枠組み以内で使用できるウイルスベクターは、特にポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルス関連ウイルスから誘導できる。弱毒化病原性を有する非組込み性ベクターも有利である。かかるベクターならびにそれらの調製技術は当業者にとり公知である。
アデノウイルスベクターを使用する場合、複製に必須の領域の欠失、特に宿主生物または環境中でその増殖を回避し得るように大部分のE1領域の欠失のために非複製性であるようなベクターの使用が好ましい。いうまでもなく、アデノウイルスゲノムの他の領域は、欠陥必須機能がトランス補足(trans-complemented)される限りにおいて修飾もしくは欠失されてもよい。本発明における好ましいアデノウイルスベクターはエンカプシデーションに必須の配列、すなわち5’および3’ITR(逆方向末端反復)(Inverted Terminal Repeat)およびエンカプシデーション領域を保持している。各種アデノウイルスベクターならびにそれらの調製技術は公知であり、かつGrahamおよびPrevect(1991, Methods in Molecular Biology, vol 7, 109-128頁;Ed: E.J. Murey, The Human Press Inc.)中に、および出願WO第94/28152号公報中に記載がある。もしレトロウイルスが用いられても、LTR(Long Terminal Repeat)およびエンカプシデーション配列は保持されるはずである(例えば、NaviauxおよびVermaら、1992, Current Opinion in Biotechnology 3, 540-547参照)。
有利な実施態様によると、本発明の組換えウイルスベクターはポックスウイルス、特にカナリアポックスウイルス、鶏痘(もしくは禽痘)ウイルス、またはワクシニアウイルス等のトリポックスウイルスから誘導され、後者が好ましい。本発明の枠組以内で想定し得るすべてのワクシニアウイルスの中では、Copenhagen、Wyethおよび修飾Ankara(修飾ワクシニア症アンカラウイルス)(Modified Vaccinia Ankara Virusの略MVA)株が特に好ましく選択される。
異型遺伝子を発現し得るワクシニアウイルスを得るための一般的条件は、EP特許第83 286号公報およびEP出願第206 920号中に教示されている。MVAウイルスについては、一層具体的には(Mayrら、1975, Infection 3, 6-14; SutterおよびMossら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851)中に記載がある。
当然ながら本発明の枠組み以内では、上記DNAフラグメントはそれら発現に要する諸要素の統率下に置かれる。これらの中には、翻訳の開始および終結のためのシグナルはもとより、転写制御のための適当な諸要素が包含される。プロモーターは特に重要である。
一般的には、処置(treat)が望まれ、かつ使用ベクターに適した宿主生物もしくは細胞中で機能するプロモーターが使用される。その上、このものは調節配列例えば転写活性化用要素、またはある種細胞性シグナルに応答する配列を含むように修飾できる。この観点で、パピローマウイルスが関与する病変は生殖器管のレベルに位置するので組織特異性プロモーターの使用、または腫瘍細胞のみに発現を限定するための腫瘍特異性シグナルに応答するプロモーター(例えば、このものは腫瘍細胞により一般的に過剰発現される成長因子の存在下で活性化される)の使用が有利である。
本発明の枠組み以内で想定されるプロモーターのなかでは、SV40(Simian Virus 40)プロモーター、HMG(Hydroxy-Methyl-Glutaryl-coenzyme A)プロモーター、TK(Thymidine Kinase)プロモーター、CMV(cytomegalovirus)プロモーター、RSV(Rous Sarcoma Virus)プロモーター、アデノウイルスベクターに適するアデノウイルスMLP(Major LatePromoter)プロモーター、およびレトロウイルスベクターに対して一層特異的なMo−MLV(Moloney Murine Leukemia Virus)LTRプロモーターが挙げられる。このベクターがポックスウイルス由来である場合のプロモーターは、使用ポックスウイルスの遺伝子のプロモーター例えばワクシニアウイルスのタンパク質7.5K、H5R、TKもしくはK1Lをコードする遺伝子のプロモーターが好ましい。これらは文献に記載があり、かつ通常技術によりウイルスゲノムからクローン化できる。
その上、発現に要する上記諸要素も、宿主細胞中での発現性や保存性を増強する配列[イントロン、シグナル配列、転写終結配列、翻訳開始部位、宿主免疫系の細胞にポリペプチドの提示(プレゼンテーション)を修飾する配列その他]を含んでいてもよい。しかし、ポックスウイルス由来のベクターの場合は、イントロンの使用は避ける。
本発明組成物は、所定ポリペプチドをそれぞれが発現する各種組み換えベクター、または独立もしくは共通諸要素の統制下に置かれた選択ポリペプチドに対応するDNAフラグメントを発現する単一ベクターのいずれかを用いて得ることができる。後者オプションによれば、内部的に翻訳を開始させ得る配列(IRES)または同位相で異なった遺伝子の融合を開始し得る配列を使用できる。
本発明で使用する組み換えベクターを得るための一般的条件は、当分野の文献中に広く記載されている。ポックスウイルスベクターに関しては、欧州特許EP第83 286号公報を挙げることができ、その内容をここに引用によって含める。これらの条件はベクターとして許容し得る他のウイルスにも適用でき、このものは非必須ゲノム領域を有しており、この中に上記発現ユニットを組み込める。当然ながら、これらは同一遺伝子座または異なった遺伝子座中に挿入できる。例えば、ワクシニアウイルスのCopenhagen株を使用する場合、挿入に好ましい部位はTK遺伝子座および/またはK1L遺伝子座である。ウイルスTK遺伝子のレベルでの挿入は、それを不活性化する効果があり、したがって組み換え体の選択を容易にする効果がある。ワクシニアウイルスのMVA株と関連させた場合、免疫刺激およびパピローマウイルス遺伝子の挿入は切除帯域IからVIまでの1つの範囲内、好ましくは切除帯域IIまたはIII(Meyerら、1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038;Sntterら、1994、Vaccine 12,1032-1040)のいずれか以内で実施できる。
本発明で追求する諸目的によれば、組み換えベクター中には、組み換えウイルスの単離および精製のための諸工程を容易にするための選択可能マーカー遺伝子の発現用ユニットを追加的に含ませることもできる。これらとしては特に、抗生物質G418に対する抵抗性を授けるネオ遺伝子(Neo gene)、ピユーロマイシンに対する抵抗性のためのpac遺伝子、ガンシクロバー(ganciclovir)もしくはアサイクロバー(acyclovir)等の、ある種ヌクレオシド類似体に対して感受性を授ける単純ヘルペスウイルスタイプ1(HSV−1)TK遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードするバクテリア遺伝子LacZ、およびβ−グルクロニダーゼをコードするgus Aが挙げられる。後の方の2つの酵素マーカーは、基質X−Gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−D−ガラクトピラノシド)およびXglcA(5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリルβ−D−グルコロニド)それぞれの存在下で染色することにより、組み換えウイルスの選び出しを可能にする。
パピローマウイルス感染または腫瘍の処置もしくは予防するための、本発明医薬組成物は、CopenhagenまたはワクシニアウイルスのMVA株から誘導された1種または2種以上の組み換えベクターを含み、この中に次の:
(1)パピローマウイルスのE6タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのE7タンパク質をコードするDNAフラグメント、および分子B7.1をコードするDNAフラグメント、
(2)パピローマウイルスのE6タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのE7タンパク質をコードするDNAフラグメント、およびインターロイキン−2をコードするDNAフラグメント、
(3)パピローマウイルスのE6タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのE7タンパク質をコードするDNAフラグメント、分子B7.1をコードするDNAフラグメント、およびインターロイキン−2をコードするDNAフラグメント、
(4)パピローマウイルスのE6タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのE7タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL1タンパク質をコードするDNAフラグメント、およびパピローマウイルスのL2タンパク質をコードするDNAフラグメント、
(5)パピローマウイルスのE6タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのE7タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL1タンパク質をコードするDNAフラグンメント、パピローマウイルスのL2タンパク質をコードするDNAフラグンメント、および分子B7.1をコードするDNAフラグメント、
(6)パピローマウイルスのE6タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのE7タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL1タンパク質をコードするDNAフラグンメント、パピローマウイルスのL2タンパク質をコードするDNAフラグメント、およびインターロイキン−2をコードするDNAフラグメント、または
(7)パピローマウイルスのE6タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのE7タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL1タンパク質をコードするDNAフラグンメント、パピローマウイルスのL2タンパク質をコードするDNAフラグメント、分子B7.1をコードするDNAフラグメント、およびインターロイキン−2をコードするDNAフラグメント、
が挿入される。
一方で、一層具体的に免疫予防を意図する本発明医薬組成物は、ワクシニアウイルスのCopenhagenまたはMVA株から誘導された1種または2種以上の組み換えベクターを含み、この中に次の;
(1)パピローマウイルスのL1タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL2タンパク質をコードするDNAフラグメント、および分子B7.1をコードするDNAフラグメント、
(2)パピローマウイルスのL1タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL2タンパク質をコードするDNAフラグメント、およびインターロイキン−2をコードするDNAフラグメント、または
(3)パピローマウイルスのL1タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL2タンパク質をコードするDNAフラグメント、インターロイキン−2をコードするDNAフラグメント、および
分子B7.1をコードするDNAフラグメント、
が挿入される。
本発明組成物は、ワクチン分野で公知の方法に従って調製でき、かつ用量は広い範囲以内で変更可能である。特にこれらは、用いたポリペプチドおよびウイルス、処置されるべき病変状態、患者の状態および臨床医が評価し得る他のパラメータに依存性がある。しかし一般的には、この治療剤がウイルスベクターである。場合、キロ当りのウイルス用量は104から1011、有利には106から1010、および好ましくは107から109プラーク形成ユニット(pfu)であり、この治療剤がポリペプチド由来であれば0.05から500mg、有利には0.5から200mg、好ましくは1から100mgである。
本発明組成物は通常投与ルートのいずれによっても投与でき、特に静脈内、筋肉内、皮下または上皮下ルート、または別法として乱切法によっても投与できる。接近可能な腫瘍の場合、その部位中または腫瘍近辺への直接注射の使用も可能であり、または局所的適用を採用することもできる。本発明組成物はワクチンとして、1回投与量または一定時間を隔てた1回もしくは数回の繰り返し投与量として等、この分野で通常の実践法に従って投与することができる。一方、治療的処置という状況下では、有効な処置に十分である期間に亙って頻繁に投与することもできる。この処置剤がウイルスベクターである場合には、このウイルスは生の形態(live form)であることが好ましい。ポックスウイルスベクターの場合、チミジンキナーゼネガテイブCopenhagen株またはMVA株等の弱毒化株の使用が好ましい。最後に、組み換えウイルスベクターは当業者にとり公知の適当な化学処理により弱毒化できる。しかし、殺死組み換えベクターの注射も想定できる。
好ましい実施態様の1例によると、本発明医薬組成物は組み換えベクターの治療有効量を、薬剤的に許容できる担体と組み合わせで含んでいる。この担体は、ヒトまたは動物中への注射によりその投与が可能になるように選択される。またこの組成物中には、賦形剤、希釈剤および/またはアジュバントを含有してもよく、液状または凍結乾燥形態で供給することもできる。
また本発明は、子宮頚部がんの治療または予防、低等級の頚部形成異常(もしくは異形成)の処置または予防、およびパピローマウイルス感染の処置および予防の場合の医薬物としての、医薬組成物にも関する。
最後に本発明はまた、上記病変状態の治療および予防の方法にも関し、これによればポリペプチドの混合物または本発明に用いる組み換えベクターの医薬的有効量を、かかる処置を必要とする個体に投与する。
以下、図面を参照しながら本発明を説明する。
図1は、プロモーターp7.5Kの統制下に置かれたCopenhagenワクシニアのTK遺伝子座、HPV−16後期遺伝子L1およびL2のTK遺伝子座へのトランスフアーを可能にするベクターpTG 5021を示す略図であり、この2つのカセットは互いに関し反対配向をなしている。
図2は、プロモーターpH5R(この2つのカセットは互いに関し反対配向をなしている)の統制下に置かれたCopenhagenワクシニアのK1L遺伝子座、HPV−16初期遺伝子E6およびE7のK1L遺伝子座、プロモーターp7.5kのコントロール下に置かれたヒトIL−2(IL2h)遺伝子のK1L遺伝子座、およびプロモーターpK1Lの統制下に置かれたマーカー遺伝子LacZ(btaGAL)のK1L遺伝子座へのトランスフアーを可能にするベクターpTG5065を示す略図である。
図3は、HPV−16後期遺伝子L1およびL2をMVAワクシニアウイルスの排除帯域II中に導入するのに使用できる戦略の略式説明図であり、左および右の組み換えアーム(BRG2とBRD2)がそれぞれ示されている。
実施例
実施例を参照しながら次に本発明をさらに詳しく説明するが、結果として制限を意図するものではない。
次に記載の構築(constructions)は、一般的遺伝子工学およびManiatisら(1989、上記)が詳述している分子クローニング手法、または市販キット使用の場合はメーカーの指示に従って実施される。In vitroでの合成オリゴヌクレオチド・部位特異的突然変異誘発はAmersham社市販のキットを用いて実施施される。PCR増幅手法は当業者に公知である(例えば、PCR Protocols−A guide tomethods and applications, 1990, Innis, Gelfand, SninskyおよびWhite著、Academic Press Inc.刊行)。制限部位の修復についての使用手法は、E.coliのDNAポリメラーゼIの大フラグメント(Klenow)を用いて突出5’末端を充填することからなる。
クローニング段階、組み換え体M13バクテリオフアージは寒天ベースの最少培地(7.5%寒天)中、または液体に富むLBM培地中でのE.coli NM522株(Stratagene)上で増殖される。アンピシリン抵抗性遺伝子を運搬する組み換えプラスミドは100μg/mlの抗生物質を補充した寒天または液体培地上のE.coli株C600(Stratagene)、BJ 5183(Hanahan, 1983 J. Mol. Bio. 166, 557-580)およびNM 522中で複製される。このBJ 5183株は相同的組み換えによりクローニングを行う場合に好ましく使用される(Bubeckら、1993, Nucleic Acid Res. 21, 3601-3602)。
組み換えワクシニアウイルスの構築は、上記引用文献中に開示され、かつMackettら(1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419)およびMackettら(1984, J. Virol. 49, 857-864)により開示された、当分野で通常の技術に従って実施される。
実施例1: HPV−16 E6、E7、L1およびL2遺伝子ならびにヒトIL−2遺伝子を発現するCopenhagenワクシニアウイルスVVTG5021&5065の構築
A. HPV16 L1およびL2遺伝子の単離
L1およびL2タンパク質をコードするフラグントは従来の一般的手法に従ってCaski細胞(ATCC 1550)のゲノムDNAからPCRにより単離する。このL1配列を保有する増幅用フラグメントを、ベクターM13TG130(Kienyら、1983, Gene 26, 91-99)へとサブクローニングすると、構築体をM13TG8171を与える。クローン化L1遺伝子配列は、Genebank(届出番号(accession)K02718号)中に含まれた配列と比較すると、いくつかの突然変異を現す:位置248でのAに代えてC、位置253でのAに代えてC、位置537でのAに代えてG、位置682でのCに代えてG、位置874でのAに代えてG、位置1393におけるトリプレットACTの挿入、位置1390におけるトリップレットGATの欠失。
L2配列を運搬するPCRフラグメントのベクターM13TG6131への挿入はM13TG9126へと導かれる。Genebankに開示された配列と比較すると、5ポイントの突然変異が観察される:位置378のTに代えてC、位置691のGに代えてA、位置702のGに代えてA、位置990のAに代えてGおよび位置1092のAに代えてC。参考までにベクターM13TG6131は多重クローンニング部位外側に位置する内部BG1II部位の突然変異によりM13TG131(Kienyら、1983, 上記)から誘導される。
B ワクシニアウイルスのゲノムのTK遺伝子座へのL1およびL2遺伝子のトランスフアーの場合のベクターpTG5021の構築
イニシエーターATGの上流にBg1 II部位を創ることにより、L1タンパク質をコードする遺伝子が修飾される。この突然変異遺伝子をBg1 II−SacI消化により先行のベクター(M13TG8185)から切除し、pTG186−ポリのBamHIとSacI部位の間に挿入する。得られた構築体をpTG4019と呼称する。このトランスフアーベクターpTG186−ポリの詳細はフランス特許第2,583,429号公報中に記載がある。トランスフアーされる遺伝子およびその発現を制御するプロモーターp7.5Kの挿入に対する制限部位は10箇所ある。
L2タンパク質をコードする遺伝子はBg1 II−HindII1消化によりM13TG9126から単離し、次いでこの7.5Kプロモーターの3’におけるBamHIとHindIII部位の間にクローン化される。M13TG9127が得られ、この中にSa1 I部位が、局在突然変異誘発により、プロモーター上流に導入される。発現ユニット”p7.5K−L2遺伝子”は突然変異ベクターM13TG9129から単離され、2つのカセットp7.5K−L1およびp7.5K−L2が反対配向するようにトランスフアーベクターpTG4019のSacI部位中にクローン化される。得られるpTG5021構築体を図1に示す。この発現ユニットは相同的組み換えによりワクシニアウイルスのCopenhagen株ゲノム中にトランスフアーされる。VVTG5021と呼称するこの組み換えウイルスは5−ブロモデオキシウリジン(5BUDR)を用いた選択により単離される。
C. HPV16 E6およびE7遺伝子の単離
E6およびE7遺伝子は欧州特許EP第0,462,187号の実施例2および3記載のようにCaski細胞ラインから単離する。2つの構築体は、次のクローニグ段階を容易にするように、HPV−16 E6とE7遺伝子とを含むクローンM13E7/E6から誘導された。第1の命名M13TG8188は、E7遺伝子の上流と下流それぞれに、部位指向性突然変異誘発によりPstIおよびBamHI部位を導入することにより得られ、第2のM13TG8189はE6遺伝子の上流でPstI部位を含んでいる。イニシエーターATGの上流および停止コドンの下流への点突然変異の導入は当業者の通常能力以内のものである。
網膜芽腫遺伝子の産物とHPV−16 E7タンパク質との組み合わせは多くの著者により実証(例えば、Mungerら、1989, EMBO J. 8, 4099-4105参照)され、その形質転換力と関係ずけられている。明らかな安全性の理由で、形質転換機能に関与する未変性E7タンパク質のアミノ酸21から26をコードする配列が削除されている非発がん性突然変異体は、オリゴヌクレオチドoTG5118(SEQ ID NO:1)を用いたベクターM13TG8188の部位指向性突然変異誘発により生じる。M13TG9104が得られる。この突然変異体E7遺伝子を以後E7*と呼称する。
同様に、HPV−16タンパク質は、腫瘍サプレッサー遺伝子p53の発現の産物と相互作用し得ることが実証されている(Crookら、1991, Cell 67, 547-556)。この相互反応に関与するドメインは輪郭が明瞭にされており、かつ未変性タンパク質の残基111〜115に位置している。ベクターM13TG9125はオリゴヌクレオチドoTG5377(SEQ ID NO:2)を用いたM13TG8189の突然変異誘発により生ずる。突然変異体E6遺伝子を以後E6*と呼称する。
D. K1L遺伝子座中に組み込まれるHPV−16 E6とE7遺伝子およびヒトIL−2遺伝子を有するトランスフアーベクターpTG5065の構築
Copenhagenワクシニアウイルスゲノム(Guillardら、1985, J. Virol. 53, 316-318)の左末端の5.2kb EcoRI Kフラグメントを、EcoRIで線形化したプラスミドpUC8(Gibco BRL)中にクローン化する。得られたベクターをBg1 IIを用いる制御消化に処し、次いでK1L宿主制限遺伝子(Guillardら、1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 5573-5577)をコードする855bpフラグメントが削除されるように連結させる。この3.4k
b Bg1 IIフラグメントをpUC8Khrと呼称する中間構築体から単離し、次いでプラスミドpUC7(Gibco BRL)のBamHI部位中にクローン化する。pBAC1が生じ、この中にXhoIアダプターがユニークBg1 II部位の左側に導入される。XhoIとBg1 IIによる消化後、p7.5Kワクシニアプロモーターを有するSa1 I−Bg1 IIフラグメントを挿入する。この2つのEcoR部位はEcoRI消化に続くKlenow処理および再連結により除去される。このベクターpTG2147は、Bg1II−BamHIフラグメントの形で単離されたベクター p ポリII(Latheら、187, Gene 57, 193-201)から単離される多重クローニング部位をユニークBg1II部位中に導入して得られる。したがってこのものは、制限部位が続くp7.5Kプロモーターを取り囲むK1 L遺伝子座中への挿入を可能にする組み換えアームを含んでいる。
上記E6*およびE7*遺伝子はベクターM13TG9132中に含まれるワクシニアプロモーターpH5Rの下流にクローン化され、M13TG9138およびM13TG9139をそれぞれ与える。参考までに、ベクターM13TG9132はウイルスゲノムからPCRにより単離されたH5R遺伝子のプロモーターをフアージM13TG6131へ挿入することにより得られる。
その上、ヒトインターロイキン−2をコードするcDNAは、プラスミドpTg36(フランス特許第2,583,770号公報)から単離され、中間ベクター中に導入され、かつ遺伝子座K1LをターゲットとするトランスフアーベクターpTG2147中に挿入されるように再度Sa1 I−BamHI消化により取り出される。この挿入はクローニングアダプターを用いて、プロモーターp7.5Kの下流に位置するPstIとXbaIのレベルで行われる。pTG5056が得られる。
発現ユニットpH5R−E6*はベクターpTG5056のBamHI部位中に導入されるBg1 II−BamHIフラグメンの形でベクターM13TG9139から単離される。ベクターpTG5060が生ずる。発現ユニットpH5R−E7*はM13TG9138から精製され、かつベクターpTG5060のBamHI部位で挿入されてpTG5062を与える。K1遺伝子座における挿入は、ある種の細胞タイプでは減少したり破壊されたりする複製能力を有する組み換えウイルスに導かれることが判る。これらの理由でポジティブ選択性マーカーが、この組み換えウイルスの確認を容易にするために導入される。ベクターpTg5065は、Bg1 II−BamHI開裂によるプラスミドpIV75(Chenら、1993, Virology 196, 682-693)から単離された発現カセット”pK1 L−Lacz遺伝子”の、pTG5062のBamHI部位へのクローニングにより得られる。図2から判るように、これがワクシニアウイルスのK1 L遺伝子座へのE6*、E7*およびIL−2ユニットのトランスフアーを可能にする。
VVTG5065と呼称する組み換えワクシニアウイルスは、野生型Copenhagenワクシニアで感染させたチキン胚細胞中にベクターpTG5065をトランスフエクション後、相同的組み換えにより生じ、かつX−Galを用いた寒天下での染色により取り出される。このワクシニアウイルスVVTG5021および同VVTG5065は二重感染テストに使用される。この二重組み換え体は2つのマーカーに従って選択される:X−Gal存在下での青色プラークの形成およびTKマーカーの失欠。VVTG5021&5065と呼称されるこれらは、K1 L遺伝子座で組み込まれるユニットp7.5K−IL−2、pH5R−E6*、およびpH5R−E7*を発現し、かつTK遺伝子座で組み込まれたユニットp7.5K−L1およびp7.5K−L2を発現する。
HPV遺伝子の発現は、適当なモノクロナールもしくはポリクロナール抗体を用いたWestern-blot分析により、または逆PCRにより証明できる。IL−2の生産は、文献記載のようなELISAテストまたはCTLテストにより評価できる。参考までに、in vitroにおけるこの発現レベルは60ng/ml/
106細胞(1pfu/細胞および24時間感染)程度である。
実施例2: E6およびE7遺伝子ならびにヒトIL−2遺伝子を発現するCopenhagenワクシニアウイルスの構築
ヒトインターロイキン−2をコードするcDNAをPstI消化によりプラスミドpTG36から単離し、かつプラスミドpTG186のPstI部位中に挿入して、pTG188を得る。相同的組み換えにより得られるこのウイルスをVVTG188と呼称する。
このE6*遺伝子をPstI−BamHIフラグメントの形でM13TG9125から単離し、かつ7.5Kプロモーターの下流でpTG2147のPstIとXbaI部位の間に、BamHI−XbaIアダプターの存在下で、挿入してpTG5057を得る。このE7*遺伝子をM13TG9138生産H5Rワクシニアプロモーターの制御下に置き、BamHI−Bg1IIサイトにより区画されたカセットをpTG5057のBamHIサイト中にサブクローン化する。pTG5059が得られ、そのBamHIサイト中にLacZ選択可能マーカーを、K1Lワクシニア遺伝子のプロモーターの制御下、ベクトルpIV75のBg1II−BamHI消化により挿入する。生成構築体はpTG5061と呼称し、かつこのウイルスはワクシニアゲノムVVTG5061を用いた相同的組み換えにより生ずる。
K1L遺伝子座で組み込まれるE6*およびE7*遺伝子、ならびにTK遺伝子座で組み込まれるヒトIL−2遺伝子を発現する組み換えワクシニアウイルスは、ウイルスVVTG5061およびVVTG188を用いたチキン胚細胞の共感染により得られる。参考として、後者は約400ng/106細胞(細胞当り1pfu、24時間感染)を上回るIL−2量を生産する。この2重組み換えウイルスをVVTG5061&188と呼称する。
実施例3: E6およびE7遺伝子、ならびにヒト付着補因子B7.1をコードする遺伝子を発現するCopenhagenワクシニアウイルスの構築
B7.1をコードするcDNAは、Daudi細胞ライン(ATCC CCL−213)から得られたmRNA調製物から、プライマーoTG6353およびoTG6352(SEQ ID NO: 3および 4)を用いる逆PCRにより単離される。この遺伝子の配列は届出番号第M27533としてGenebankに開示されている。この増幅フラグメントはM13TG6131のBg1IIとEcoRIサイトとの間にクローン化されてM13TG9149に導かれ、次いでpTG186のBamHIとEcoRIとの間にクローン化される。この構築体をpTG5090と呼称し、またこのウイルスは 相同的組み換えVVTG5090により得られる。K1L遺伝子座で組に込まれたHPV−16E6*およびE7*遺伝子、ならびにTK遺伝子座に組み込まれたヒトB7.1遺伝子を発現するワキシニアウイルスは、ウイルスVVTG5061および同VVTG5090を用いたチキン胚の共感染により得ることができる。この組み換えウイルスをVVTG5061&5090と呼称する。
実施例4: E6およびE7遺伝子ならびに切除III帯域中に組み込まれたB7.1遺伝子を発現するワクシニアウイルスのMVA株の構築
このMVAウイルスは、ワクシニアウイルスのAnkara株から導かれる。哺乳類細胞上で感染粒子を発生させることはできないが、チキン胚繊維芽細胞上では満足に発生する。これらの細胞へそれを適応すると、この種タイプの細胞上での発生と感染サイクルにとり必須でない6領域の切除が起きる(ウイルスゲノムの約15%が消失;Meyerら、1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038)。外生遺伝子材料はこれら切除帯域のいずれのレベルでも組み込める。本発明の枠組以内で、HindIII制限フラグメントNおよびAそれぞれのレベルに位置する切除IIおよびIIIが使用される(Altenburgerら、1989, Arch. Virol.105, 15-27)。
最初の例では、MVAウイルスの切除帯域III中への挿入を可能にするベクターpTG6019が構築される。この切除帯域IIIのいずれかの側上の相同的組み換えアームがウイルスゲノム(米国特許第5,185,146号公報参照)および左アームの場合はプライマーoTG7637およびoTG7638(SEQ ID NO: 5および6)、かつ右アームの場合はoTG7635およびoTG7636(SEQ ID NO:7および8)からPCRにより単離される。この増幅フラグメントをベクターpTG1EのEcoRIサイト中にクローン化するとpTG6019を与える。トランスフアーされる遺伝子材料はこの2つの組み換えアームの間に挿入される。ベクターpTG1Eは多重クローニングサイトの代わりにEcoRIアダプターが存在する以外は、pTG1H(フランス特許第2,583,429号公報)に類似している。
先ず、gusAマーカー遺伝子の発現用カセットを挿入する。この7.5Kプロモーターを先ずpTG6019のBamHIサイト中にクローン化する。pTG6021が得られ、これのBamHIサイト中に、Bg1II−BamHIフラグメントの形で生じたgusA遺伝子をを挿入する。このものは文献に開示の配列から得られる。生じた構築体をpTG6022と呼称する。このマーカーの存在により、基質Xg1cAを用いたGUS酵素活性の検出による、野生型ウイルスと組み換えウイルスとの間の識別が可能になる。赤色はβ−グルクロニダーゼ活性を示す。しかし、臨床に応用する目的では、このバクテリアマーカーを組み換えウイルスの選択後に最終産物から除去し得ることが有用かもしれない。これを行うためには、2つの相同サイト間の配列を削除するワクシニアの能力を利用するのが便利である。したがって、第2プロモーターp7.5Kを、その発現を指令するものと比較してセンス配向で、gusA遺伝子の下流に挿入する。
このベクターpTG6022は付着末端を備えたフラグメントp7.5KのBamHIサイトとSacIサイトとの間への挿入により修飾を受けてpTG6025を与える。
後者は突然変異体E6*およびE7*遺伝子発現カセットの挿入により完成させる。新規プロモーター配列p7.5Kを先ず導入するが、この場合は先行のものとは相対的にアンチセンス配向で導入する。したがってpTG6039と呼称されるこの構築体は、反対配向におけるp7.5Kが後続する不安定GUSカセット”p7.5K→gus A−p7.5K→”を含む。平行して、E6*およびE7*遺伝子はBamHIおよびPstI消化によりベクターM13TG9104およびM13TG9125それぞから単離され、かつM13TG6131のPstIサイトで、お互いに関して反対配向で組み立てられる。全体は、同一酵素を用いて線状化したpTG6039中に挿入されるPstIフラグメントの形で取り出される。ベクターpTG6056が得られ、このものは次の配列p7.5K→gusA−p7.5K→E7*−E6*←p7.5Kを含む。
免疫刺激遺伝子B7.1は後者構築体中に組み込まれる。これを行うには、ベクターpTG6056を、オリゴヌクレオチドoTG10451およびoTG10450(SEQ ID NO:9および10)の存在下で連結させるに先立ってHindIIIおよびKpnIを用いて開裂し、pTG6070を生じさせる。後者は相同的組み換えにより発現カセット”pH5R−B7.1”のクローニングを可能にする。この趣旨で、M13TG9149から単離したB7.1配列をワクシニアプロモーターpH5Rの下流でクローン化し、M13TG9184を形成させる。このカセットを有するBg1II−EcoRIフラグメントは、E.coli中の相同的組み換えによりXhoIで線状化したベクターpTG6070中に組み込む。ベクターpTG6079が得られ、このものは全体として”不安定”型のgusAマーカー遺伝子、およびHPV−16初期遺伝子の発現用カセット、ならびに共刺激遺伝子B7.1用のカセットを含む。MVAゲノムを用いた相同的組み換えにより生じたウイルスはMVATG6079と呼称する。
HPV−16後期遺伝子の発現用ユニットは、トランスフアーベクターpTG6018を用いて切除帯域II中に挿入できる。このものはII切除を区画するpTG1E左および右組み換えアームのEcoRIサイト中に挿入することにより構築され、それらはプライマーoTG7665およびoTG7584(SEQ ID NO:11および12)ならびにoTG7639よびoTG7640(SEQ ID NO:13および14)を用いたPCRにより生じさせる。このように、ポジテイブマーカーの発現用カセットは、組み換えウイルスの検出を容易にする目的で、上記2つのアーム間に組み込まれるが、選択工程後にこれを除去すことができる(Spehnerら、1990, J. Virol. 64, 527-533)。ベクターpTG6020は、プロモーターp7.5Kの下流に位置するLacZ遺伝子の、BamHIで線状化したベクターpTG6018中へのクローニングにより得られる。pTG6020は、LacZ遺伝子の下流に位置するBamHIおよびSacIサイト間に配列p7.5Kを挿入することにより修飾される。pTg6024が得られる。このカセットL1およびL2は、次いで図3に示す戦略に従って導入することができる。
実施例5: E6およびE7遺伝子、ならびに切除帯域III中に組み込まれたIL−2遺伝子を発現するワクシニアウイルスのMVA株の構築
上記と同じ戦略を用いてベクターpTG6056中にIL−2遺伝子を導入する。組み換えオリゴヌクレオチドoTG10503およびoTG10502(SEQ ID NO:15および16)をクローン化してpTG6076を生産後、XhoIを用いて後者を開裂し、かつ相同的組み換えにより挿入したM13TG9185(pH5R−IL−2)からBg1II−EcoRIフラグメントを調製する。かくして得られるベクターpTG6090は、”不安定”型gusAマーカー遺伝子、HPV−16初期遺伝子の発現用カセット、ならびにヒトIL−2遺伝子カセットを含んでいる。MVAゲノムを用いた相同的組み換えにより得られる組み換えウイルスをMVATG6090と呼称する。この後期遺伝子は上記のようにpTG6018を用いて切除帯域II中に組み込める。
実施例6: 動物モデルにおけるベクターVVTG5021および5065の確認
A. 毒性研究
静脈内、筋肉内、皮下または頭蓋内ルートでVVTG5021&5065の107pfuまたは野生型ワクシニアウイルスの107pfuをヌードマウスに投与した。注射ウイルスのタイプ、および投与ルートに応じて5マウスからなる群を形成させ、ワクシニアに関連する病変を有する動物数を注射後26日で評価した。組み換えウイルスを投与したマウスは採用投与ルートに係わらずなんらの病変も示さなかった。一方、野生型ワクシニアを用いて処置した大部分の動物は病変を有し、その頻度および重大さは投与ルートに依存する。その上、静脈内および頭蓋内注射の場合は複数の死亡例が記録される。これらのデータでは、VVTG5021&5065は野生型ウイルスに較べて減衰的であり、かつこのものは頭蓋内注射後でさえも病変を起こさせないことを示す。
B. VVTG5021&5065を用いた免疫予防実験
C57BL6マウスをVVTG5021&5065の107pfuを用いて皮下ルートで3回ワクチン投与した。最終免疫化の3日後、これらの動物に皮下経由で103E7W1細胞を移植して抗原投与する。参考までに、このE7W1細胞はHPV−16発がん性E7遺伝子を発現するベクターを用いてトランスフエクションしたネズミ(murine)リンパ腫ラインから得られる。時間の関数としての動物の生存率%を非組み換えワクシニアウイルスVVTG186(上記TG186ベクターの誘導体)の107pfuを用いて処置した対照マウスで得られた生存率%と比較する。死亡率のモニタリングによれば、2群間に差異がみられる。
対照群では、D36において100%の動物が死滅し、一方、VVTG5021&5065を用いたワクチン処置では40%の動物がD36において依然として生存し、D51では30%を超えて生存していた。
このように、HPV抗原および免疫刺激遺伝子を発現する組み換えウイルスは、HPV−16 E7発がん性遺伝子(oncogene)を発現する腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性を示す。
C. 免疫治療実験
皮下経由(D0)で移植した103E7W1細胞を用いてC57BL6マウスに接種する。次いで107pfuの組み換えウイルスを同じく皮下ルートでD3、さらにD6で最終的にはD9において投与し、動物の生存率%を、非組み換えウイルスを投与した対照動物と比較して決定した。対照動物の100%が死滅したが、一方、VVTG5061&5021およびVVTG188の混合物を用いて注射した動物の生存率は著しい増加が観測される。同様の結果が、VVTG5065&5021とVVTG188の投与後に得られる。
E7W1細胞に代えて異なった腫瘍モデル、BMK16myc細胞を用いてこれらの免疫治療実験を繰り返した。BMK16myc細胞はHPV−16ゲノムおよびネズミ c myc遺伝子を用いてトランスフエクションした新生マウスからの腎臓細胞である。複数動物をHPV−16 E6*およびE7*遺伝子ならびにヒトIL−2遺伝子を発現するMVATG6090ウイルスの107を用いて処置する。対照と比較すると、処置マウスの腫瘍成長遅延はD15までであることを示す。
配列表
(2)SEQ ID NO:1の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 36塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: NO
(vi)起源:
(A)生物名: ヒト パピローマウイルス
(B)株名: HPV−16
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG5118(E7、21から26まで削除)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 1:
(2)SEQ ID NO:2の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 32塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: NO
(vi)起源:
(A)生物名: ヒト パピローマウイルス
(B)株名: HPV−16
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG5377(E6、111から115まで削除)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 2:
(2)SEQ ID NO:3の情報:
(i)配列特性
(A)配列の長さ: 35塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: NO
(vi)起源:
(A)生物名: Homo sapiens
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG6353(PCR 遺伝子B7.1)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 3:
(2)SEQ ID NO:4の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 33塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: YES
(vi)起源:
(A)生物名: Homo sapiens
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG6352(PCR 遺伝子B7.1)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 4:
(2)SEQ ID NO:5の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 32塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: NO
(vi)起源:
(A)生物名: Vaccinia virus
(B)株名: 修飾 Ankara
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG7637(PCR zone III)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 5:
(2)SEQ ID NO:6の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 39塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: YES
(vi)起源:
(A)生物名: Vaccinia virus
(B)株名: 修飾 Ankara
(C)個体・単離クローン名: 合成 オリゴヌクレオチド
oTG7638(PCR zone III)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 6:
(2)SEQ ID NO:7の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 32塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: No
(vi)起源:
(A)生物名: Vaccinia virus
(B)株名: 修飾 Ankara
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG7635(PCR zone III)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 7:
(2)SEQ ID NO:8の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 30塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: YES
(vi)起源:
(A)生物名: Vaccinia virus
(B)株名: 修飾 Ankara
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG7636(PCR zone III)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 8:
(2)SEQ ID NO:9の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 78塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: NO
(vi)起源:
(C):個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG10451
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 9:
(2)SEQ ID NO:10の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 86塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: YES
(vi)起源:
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG10450
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 10:
(2)SEQ ID NO:11の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 39塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: NO
(vi)起源:
(A)生物名: Vaccinia virus
(B)株名: 修飾 Ankara
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG7665(PCR zone II)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 11:
(2)SEQ ID NO:12の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 41塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: YES
(vi)起源:
(A)生物名: Vaccinia virus
(B)株名: 修飾Ankara
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG7584(PCR zone II)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 12:
(2)SEQ ID NO:13の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 32塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: NO
(vi)起源:
(A)生物名: Vaccinia virus
(B)株名: 修飾 Ankara
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG7639(PCR zone II)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 13:
(2)SEQ ID NO:14の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 33塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: YES
(vi)起源:
(A)生物名: Vaccinia virus
(B)株名 : 修飾 Ankara
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG7640(PCR zone II)
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 14:
(2)SEQ ID NO:15の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 69塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: NO
(vi)起源:
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG10503
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 15:
(2)SEQ ID NO:16の情報:
(i)配列特性:
(A)配列の長さ: 77塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 1本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル: NO
(iii)アンチセンス: YES
(vi)起源:
(C)個体・単離クローン名: 合成オリゴヌクレオチド
oTG10502
(xi)配列の記載: SEQ ID NO: 16:
Claims (20)
- パピローマウイルス感染または腫瘍の治療または予防を意図した医療組成物であって、治療剤として、パピローマウイルスの(i)初期E6領域からの1種のポリペプチド、(ii)初期E7領域からの1種のポリペプチド、(iii)後期L1領域からの1種のポリペプチド、(iv)後期L2領域からの1種のポリペプチド、および(v)インターロイキン−2、インターロイキン−7、および共付着分子B7.1およびB7.2からなる群から選択される免疫刺激活性を有する少なくとも1種のポリペプチドを含んでなり、
該免疫刺激活性を有するポリペプチドおよび初期領域からのポリペプチドが後期領域からのポリペプチドに融合していない医薬組成物。 - パピローマウイルスの初期領域からのポリペプチドがパピローマウイルスのE6および/またはE7タンパク質の非発がん性変異体であることを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。
- 免疫刺激活性を有するポリペプチドが、インターロイキン−2から誘導されることを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。
- 免疫刺激活性を有するポリペプチドが、上記分子B7.1から誘導されることを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。
- 次の:
(1)パピローマウイルスのE6領域からのポリペプチド、E7領域からのポリペプチド、L1領域からのポリペプチド、L2領域からのポリペプチド、およびインターロイキン−2から誘導されるポリペプチド、
(2)パピローマウイルスのE6領域からのポリペプチド、E7領域からのポリペプチド、L1領域からのポリペプチド、L2領域からのポリペプチド、および上記分子B7.1から誘導されるポリペプチド、または
(3)パピローマウイルスのE6領域からのポリペプチド、E7領域からのポリペプチド、L1領域からのポリペプチド、L2領域からのポリペプチド、上記分子B7.1から誘導されるポリペプチド、およびインターロイキン−2から誘導されるポリペプチド、
を含むことを特徴とする、請求項1から4のいずれか1項に記載の医薬組成物。 - パピローマウイルスが、HPV−16、HPV−18、HPV−31、および/またはHPV−45の型から選択されることを特徴とする、請求項1から5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 次の:
(1)パピローマウイルスの(i)初期E6領域からのポリペプチド、(ii)初期E7領域からのポリペプチド、(iii)L1領域からのポリペプチド、および(iv)L2領域からのポリペプチド、または
(2)パピローマウイルスの(i)初期E6領域からのポリペプチド、(ii)初期E7領域からのポリペプチド、(iii)後期L1領域からのポリペプチド、(iv)後期L2領域からのポリペプチド、および(v)インターロイキン−2、インターロイキン−7、および共付着分子B7.1およびB7.2からなる群から選択される免疫刺激活性を有する少なくとも1種のポリペプチド、
をコードするDNAフラグメントが挿入される1種以上の組み換えベクターを治療剤として含み、上記DNAフラグメントが、宿主細胞または生物中でのそれらの発現に必要な諸要素の統制下に置かれる、パピローマウイルス感染または腫瘍の治療または予防を意図した医薬組成物。 - 上記ポリペプチドが請求項2から6に定義した特性を有することを特徴とする、請求項7記載の医薬組成物。
- 組み換えベクターが、ウイルスベクターであることを特徴とする、請求項7または8記載の医薬組成物。
- 組み換えベクターがポックスウイルスから誘導されることを特徴とする、請求項9に記載の医薬組成物。
- ポックスウイルスが、ワクシニアウイルス・カナリヤポックスウイルスおよび禽痘ポックスウイルスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項10記載の医薬組成物。
- 組み換えベクターが、Copenhagen、Wyethおよび修飾Ankara(MVA)株から選択されるワクシニアウイルスから誘導されることを特徴とする、請求項9または10記載の医薬組成物。
- 上記ポリペプチドをコードするDNAフラグメントの発現に必須な諸要素が、チミジンキナーゼ(TK)、7.5K、H5RおよびK1L遺伝子のプロモーターから選択されたワクシニアウイルスの遺伝子のプロモーターを含むことを特徴とする、請求項10〜12のいずれか1項記載の医薬組成物。
- 組み換えベクターが、Copenhagen株のワクシニアウイルスから誘導され、かつ上記ポリペプチドをコードするDNAフラグメンが上記ワクシニアウイルスのTK遺伝子座および/またはK1L遺伝子座中に挿入されることを特徴とする、請求項12または13記載の医薬組成物。
- 組み換えベクターが、MVA株のワクシニアウイルスから誘導され、かつ上記ポリペプチドをコードするDNAフラグメントが、上記ワクシニアウイルスのI、II、III、IV、VおよびVI切除から選択された切除帯域のいずれかのレベルで挿入されることを特徴とする、請求項12または13記載の医薬組成物。
- 次の:
(i)パピローマウイルスのE6タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのE7タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL1タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL2タンパク質をコードするDNAフラグンメント、および上記分子B7.1をコードするDNAフラグメント、
(2)パピローマウイルスのE6タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのE7タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL1タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL2タンパク質をコードするDNAフラグメント、およびインターロイキン−2をコードするDNAフラグメント、または
(3)パピローマウイルスのE6タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのE7タンパク質をコードするDNAフラグメント、パピローマウイルスのL1タンパク質をコードするDNAフラグンメント、パピローマウイルスのL2タンパク質をコードするDNAフラグメント、上記分子B7.1をコードするDNAフラグメント、およびインターロイキン−2をコードするDNAフラグメント、
が挿入されるワクシニアウイルスから誘導された1種以上の組み換えベクターを含むことを特徴とする、パピローマウイルス感染または腫瘍の治療または予防を意図した、請求項7から15のいずれか1項に記載の医薬組成物。 - 治療剤として、パピローマウイルスの上記ポリペプチドをコードするDNAフラグメントが挿入された第1の組換えベクター、および免疫刺激活性を有する上記ポリペプチドをコードする1種以上のDNAフラグメントが挿入された第2の組換えベクターを含むことを特徴とする、請求項7に記載の医薬組成物。
- 第1のベクターに挿入されるDNAフラグメントがE6、E7、L1およびL2をコードし、第2のベクターに挿入されるDNAフラグメントがIL−2をコードするものであることを特徴とする、請求項17に記載の医薬組成物。
- ヒトまたは動物中への注射による投与を可能にする、薬剤的に許容される担体を含むことを特徴とする、請求項1から18のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 子宮頚部がん、低い等級の頚部の異形成、およびパピローマウイルス感染の治療または予防のための医薬物としての、請求項1から19のいずれか1項に記載の医薬組成物。
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