DE69706825T2 - Pharmazeutische zusammensetzung gegen durch papillomaviren verursachte tumoren und infektionen - Google Patents
Pharmazeutische zusammensetzung gegen durch papillomaviren verursachte tumoren und infektionenInfo
- Publication number
- DE69706825T2 DE69706825T2 DE69706825T DE69706825T DE69706825T2 DE 69706825 T2 DE69706825 T2 DE 69706825T2 DE 69706825 T DE69706825 T DE 69706825T DE 69706825 T DE69706825 T DE 69706825T DE 69706825 T2 DE69706825 T2 DE 69706825T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- papillomavirus
- dna fragment
- polypeptide
- fragment encoding
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 title claims abstract description 141
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 37
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 133
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 133
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 133
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 87
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 128
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 104
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 46
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 claims description 37
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 37
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 26
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 25
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 23
- 101100287463 Vaccinia virus (strain Copenhagen) HR gene Proteins 0.000 claims description 15
- 101100287464 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR032 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 13
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 13
- 101710132594 Protein E6 Proteins 0.000 claims description 12
- 101710132595 Protein E7 Proteins 0.000 claims description 12
- 101710132637 Protein C2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101710132697 Protein L2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101710195626 Transcriptional activator protein Proteins 0.000 claims description 10
- 101710132701 Protein L1 Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 7
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 4
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 4
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 claims description 3
- 231100001222 nononcogenic Toxicity 0.000 claims description 3
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 claims description 2
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 claims description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims description 2
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 claims description 2
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 claims description 2
- 101150065425 7.5K gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 69
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 22
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 20
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 18
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 17
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 13
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 12
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 11
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 101100232904 Homo sapiens IL2 gene Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 241000388186 Deltapapillomavirus 4 Species 0.000 description 2
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 101150019990 H5R gene Proteins 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101100272718 Arabidopsis thaliana BRG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701812 Bovine papillomavirus type 4 Species 0.000 description 1
- 102100033641 Bromodomain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000871850 Homo sapiens Bromodomain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000954493 Human papillomavirus type 16 Protein E6 Proteins 0.000 description 1
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 description 1
- 101150083678 IL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101150039798 MYC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000009432 framing Methods 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 101150111388 pac gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000001173 tumoral effect Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen, die mit Papillomaviren, insbesondere den humanen Papillomaviren (HPV) vom Typ 16, 18, 31, 33 und 45, in Verbindung stehen, bestimmt ist.
- Die Papillomaviren sind DNA-Viren, welche ein zirkuläres Genom von etwa 7900 Basenpaaren, umhüllt von einem Capsidprotein, aufweisen. Es wurden eine Anzahl von bovinen (BPV) und humanen (HPV) Papillomaviren identifiziert und ihr Genom sequenziert (Pfister, 1987, in The papovaviridae: The Papillomaviruses (Edition Salzmann und Howley) Plenum Press, New York, S. 1-38). Es enthält eine frühe Region und eine späte Region. Die späte Region enthält zwei Leseraster L1 und L2, welche für die Hauptbestandteile des Capsids kodieren. Die frühe Region enthält wenigstens die Leseraster E1, E2, E4, E5, E6 und E7. Die Expressionsprodukte E1 und E2 regulieren die virale Replikation und die Expression der viralen Gene, während die der Bereiche E5, E6 und E7 in die onkogenen Transformationsprozesse der infizierten Zellen verwickelt sind. Es konnte experimentell gezeigt werden, dass das Protein E5 von BPV-1 in vitro Zellen transformieren kann (Schlegel et al., 1986, Science 233, 464-467). Die Proteine E6 von BPV-1 und E7 von HPV-16 sind in die Induktion und Aufrechterhaltung der onkogenen Tranformation verwickelt. Das Transformationsvermögen von E7 wurde für HPV-16 und HPV-18 gezeigt (Kanda et al., 1988, J. Virol 62, 610-613, Vousden et. al., 1988, Oncogene Res. 3, 1- 9; Bedell et al., 1987, J. Virol 61, 3635-3640). Die Funktion von E4 wurde nicht aufgeklärt.
- Beim Menschen stehen die HPV in Verbindung mit Pathologien, die von gutartigen Infektionen der Haut über Warzen bis hin zu bösartigen Tumoren gehen. Diese Viren sind hochspezifisch für die Epithelien der Epidermis der Genitalwege, oralen und respiratorischen Wege. Die epidemiologischen Daten zeigen die Rolle bestimmter Stämme bei Krebs des Uterushalses und der darunter liegenden Wege, insbesondere HPV-16 und 18, und, in geringerem Ausmaß, HPV-31, 33 und 45. Uterushalskrebs ist der zweithäufigste weibliche Krebs in der Bevölkerung. Gemäß OMS werden jedes Jahr 460 000 neue Fälle registriert, von denen wenigstens 200 000 Fälle eindeutig mit HPV in Verbindung stehen. Eine Anzahl von Studien zeigt die transformierende Rolle dieser Viren, ihre spezifische Integration in das Genom der neoplastischen Zellen, ihre Genaktivität in den Krebszellen und die Wichtigkeit der Expression dieser frühen Gene E6 und E7 bei der Aufrechterhaltung des bösartigen Phänotyps der neoplastischen HPV-positiven Zellen (Monsenego, J. Impact Medecin, 11. März 1994).
- Die mit den HPV-Viren in Verbindung stehenden Pathologien stellen aufgrund ihrer dauerhaften und rückfälligen Natur ein therapeutisches Problem dar. Es wurden bereits eine Anzahl von Ansätzen bei der Behandlung dieser Erkrankungen verwendet, wie die Chirurgie, die Chemotherapie, antivirale Mittel und die Immuntherapie.
- Das europäische Patent EP 0 462 187 beschreibt einen Ansatz der Impfung, welche die frühen Gene des Papillomavirus verwendet, um eine Immunität hinsichtlich der aus der Integration des HPV-Genoms in die zelluläre DNA resultierenden Tumoren, in denen die Proteine des Capsids nicht mehr exprimiert werden, zuetablieren. Die Anmeldung WO93/02184 beschreibt einen therapeutischen Ansatz basierend auf der Verwendung von Antigenen des Capsids als immunogene Agenzien. Diese Dokumente erwähnen nicht die Möglichkeit, die präventive Wirkung, die durch die frühen Polypeptide hervorgerufen wird, und die kurative Wirkung, die durch die späten Polypeptide der Papillomaviren verursacht werden, zu verbinden, um Zusammensetzungen zu erhalten, die an die Gesamtheit der schweren Pathologien aufgrund von HPV angepasst sind. Außerdem wurde im Verlauf der vergangenen Jahre vorgeschlagen, Polypeptide zu verwenden, die eine immunstimulierende Wirkung aufweisen, mit dem Ziel, die T- Zellen zu aktivieren mit mehr oder weniger zufriedenstellendem Ergebnis bezüglich der anvisierten Pathologien (siehe beispielsweise WO96/11279).
- Außerdem beschreiben WO93/00436 und WO94/23037 immunogene Eigenschaften des Proteins L2 von BPV, welche zur Behandlung oder Vorbeugung von durch Papillomavirus verursachten Tumoren ausgenutzt werden können. Eine besondere Formulierung verbindet die Proteine L2 und E7 von BPV-4, welche auf rekombinantem Weg in E. coli produziert werden. Es wird darauf hingewiesen, dass die antitumorale Wirkung, die durch die Verbindung L2 + E7 hervorgerufen wird, ähnlich der ist, die mit L2 alleine erhalten wird.
- WO96/11274 beschreibt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Vorbeugung oder Behandlung von durch Papillomavirus verursachte Infektionen, die durch Expression des Polypeptids L1 und ein Fusionspolypeptid L2-E7 in einem Baculovirus-System erhalten werden. Die chimären VLP's (Virus Like Particles), welche das Polypeptid E7 an ihrer Oberfläche präsentieren, werden in Insektenzellen Sf9 produziert und durch Zentrifugation auf einem Sucrosegradienten gereinigt. Die durch diese chimären Partikel immunisierten Kaninchen erzeugen Antikörper gegen die viralen Polypeptide L1 und E7. WO96/11274 offenbart ebenso VLP's, welche ein immunostimulierendes Molekül an ihrer Oberfläche aufweisen, und beschreiben dessen Einführung in den Bereich von L2, welcher außen auf dem Capsid exponiert ist.
- Schließlich beschreiben WO96/260912 und WO97/46693 pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Behandlung von durch Papillomavirus verursachten Infektionen oder Tumoren bestimmt sind und ein Polypeptid, welches aus der frühen Region stammt und/oder ein Polypeptid, welches aus der späten Region des Papillomavirus-Genoms stammt, in Verbindung mit einem Protein, welches eine immunostimulierende Wirkung aufweist, enthalten. Insbesondere beschreibt WO96/29091 die vorteilhafte Wirkung von Interleukin-12 zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Papillomavirus in Verbindung stehen, und beabsichtigt die Kombination von Interleukin-12 mit einem Papillomavirus-Antigen, entweder in Form von Polypeptid-Zusammensetzungen oder von rekombinanten Vektoren, welche diese Polypeptide exprimieren, und WO97/46693 beschreibt leere Capside VLP's, welche durch Selbstzusammensetzung der späten Polypeptide L1 oder L1 + L2 als Transfervektor eines genetischen Materials, welches für ein Protein von Interesse kodiert, gebildet werden. Die VLP's werden eingesetzt, um in vivo ein genetisches Material von Interesse, beispielsweise eines, welches für ein Cytokin, wie das Interleukin-2, ein Polypeptid mit einer co-stimulierenden Aktivität, wie das B7.1 und B7.2, oder auch die frühen Polypeptide eines Papillomavirus, kodiert, freizusetzen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Präparat, basierend auf einer Mischung von Antigenen, welche aus den frühen und späten Regionen eines Papillomavirus stammen, oder auf einem Vektor, der diese gleichzeitig exprimiert, mit dem Ziel, eine dauerhafte Immunität gegen die infizierten Zellen zu etablieren. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgeschlagenen Vaccine können präventiv (Immunprophylaxe) zur Begrenzung der Entwicklung oder Ausbreitung von viraler Infektion auf benachbarte Gewebe oder kurativ (Immuntherapie) zum Verhindern oder Reduzieren einer Tumorentwicklung bei infizierten Patienten verwendet werden. Die Verwendung von Capsid-Antigenen induziert die Produktion von Antikörpern gegen die antigenen Epitope, welche auf der Oberfläche der viralen Partikel lokalisiert sind, wodurch eine dauerhafte Etablierung der Infektion verhindert wird. Die Verwendung von frühen Proteinen ermöglicht die Induzierung einer Immunität gegen die infizierten Zellen nach der Integration der viralen DNA.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Präparat, welches ein Polypeptid, das aus einem Papillomavirus stammt, und ein immunstimulierendes Molekül verbindet. Einer der Vorteile einer derartigen Zusammensetzung ist, dass sie die spezifische Immunität, welche durch die viralen Antigene induziert wird, und die unspezifische Immunität, welche durch das immunstimulierende Molekül induziert wird und dazu bestimmt ist, die spezifische Anwort zu verstärken, kombiniert.
- Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, welche die Behandlung von HPV-Infektionen, und insbesondere von schweren Patholien, wie Uterushalskrebs, mit verbesserter Wirksamkeit gegenüber den Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik ermöglicht.
- Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus, welche als therapeutischen Wirkstoff:
- (1) wenigstens ein Polypeptid, welches aus der frühen Region eines Papillomavirus stammt und wenigstens ein Polypeptid, welches aus der späten Region eines Papillomavirus stammt, enthält,
- (2) wenigstens ein Polypeptid, welcher aus der frühen Region eines Papillomavirus stammt, wenigstens ein Polpeptid, welches aus der späten Region eines Papillomavirus stammt, und wenigstens ein Polypeptid, welches eine immunostimulierende Wirkung aufweist, enthält,
- - mit Ausnahme der Kombination, bestehend aus einem Polypeptid, welches aus der frühen Region E7 eines Papillomavirus stammt, und einem Polypeptid, welches aus der späten Region L2 eines Papillomavirus stammt, und
- - wobei das Polypeptid, welches eine immunostimulierende Wirkung aufweist, und/oder das Polypeptid, welches aus der frühen Region stammt, nicht mit dem Polypeptid, welches aus der späten Region stammt, fusioniert ist/sind.
- Der Begriff Polypeptid bezieht sich im allgemeinen insgesamt oder teilweise auf ein natives Polypeptid, ein chimäres Polypeptid, welches aus der Fusion von Sequenzen verschiedenen Ursprungs stammt, oder eine Variante, die durch wenigstens eine Mutation (Deletion, Insertion und/oder Substitution) einer Aminosäure gekennzeichnet ist. Insbesondere weist ein Polypeptid zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz auf, deren Übereinstimmungsgrad mit der Sequenz des nativen Proteins über 75%, vorteilhafterweise über 85% und bevorzugt über 95% liegt. Der Übereinstimmungsgrad kann leicht mit Hilfe eines geeigneten Computerprogramms oder durch Anordnung der Sequenzen derart, dass eine maximale Homologie erhalten wird, und durch Bestimmung der Anzahl der Positionen, in denen die Aminosäuren der zwei Sequenzen identisch sind, im Verhältnis zu der Gesamtzahl an Positionen, berechnet werden. Die Sequenz der Genome von HPV-16 und HPV-18 ist in der Genebank unter den Hinterlegungsnummern K02718 und X05015 veröffentlicht.
- Wie zuvor erwähnt, kodiert das Genom des Virus der Papillomavirusfamilie, insbesondere BPV und HPV, für wenigstens 8 Polypeptide, zwei späte Polypeptide L1 und L2, welche das virale Capsid bilden, und 6 frühe Polypeptide (E1, E2, E4, E5, E6 und E7), welche in die Regulation, die Aufrechterhaltung des viralen Genoms und die Transformation der infizierten Zellen verwickelt sind.
- Obwohl die Gesamtheit der frühen Proteine eines Papillomavirus im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wird vorteilhafterweise ein Polypeptid, welches von dem Protein E6, dem Protein E7 oder den Proteinen E6 und E7 abstammt, verwendet. Es kann vorteilhaft sein, auf eine nicht onkogene Variante, die auf Höhe der Regionen, die in den Transformationensprozess der infizierten Zellen verwickelt sind, mutiert ist, auszuweichen. Derartige Varianten sind in der Literatur beschrieben (Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Crook et al., 1991, Cell 67, 547-556; Heck et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446; Phelps et al., 1992, J. Virol. 66, 2418-2427).
- Ein bevorzugtes Polypeptid aus der späten Region eines Papillomavirus ist von dem Protein L1, dem Protein L2 oder den Proteinen L1 und L2 abgeleitet.
- Gemäß den besonders vorteilhaften Ausführungsformen (2) und (3) enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung außerdem ein Polypeptid mit immunstimulierender Wirkung. Unter "immunstimulierend" wird die Fähigkeit verstanden, eine humorale Immunantwort zu stimulieren, indem B-Lymphozyten aktiviert werden, um die Produktion von Antikörpern, die gegen die Papillomavirus-Antigene gerichtet sind, zu amplifizieren, oder eine Immunantwort als zellulären Vermittler zu stimulieren, indem die T-Lymphozyten aktiviert werden, um eine signifikante cytotoxische Antwort auszulösen, die gegen die tumoralen oder durch ein Papillomavirus infizierten Zellen gerichtet ist. Die Immunstimulation kann im Tiermodell bewertet werden (durch Vergleich der Abstoßungsrate in einem Tier, dem ein Tumor implantiert wurde, welcher das Ziel-Antigen exprimiert, in Gegenwart und Abwesenheit des Immunstimulators). Allgemein sind die Mittel zum Nachweis einer Immunstimulation in Roitt (Immunology, 4. Edition, Moby Ltd.) angegeben.
- Es kann ein immunstimulierendes natives Molekül verwendet werden, welches in einem Säugetier und insbesondere beim Menschen gefunden wird, ein Teil davon, ein chimäres Molekül, welches aus der Fusion von Sequenzen verschiedenen Ursprungs entstanden ist, oder eine Mutante, immer unter der Voraussetzung, dass die immunstimulierende Wirkung beibehalten wird. Unter allen in Betracht kommenden Molekülen wird die Verwendung eines Polypeptids, welches aus Interleukin-2, Interleukin-7, Interleukin-12, den Co-Adhäsionsmolekülen B7.1 und B7.2 besteht oder davon abgeleitet ist, bevorzugt, wobei das Interleukin-2 und das Molekül B7.1 im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt sind.
- Eine bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält:
- (1) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region E7 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region L1 stammt, und ein Polypeptid, welches aus der Region L2 eines Papillomavirus stammt,
- (2) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region E7 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region L1 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region L2 eines Papillomavirus stammt, und ein Polypeptid, welches von Interleukin-2 abgeleitet ist,
- (3) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region E7 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region L1 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region L2 eines Papillomavirus stammt, und ein Polypeptid, welches von dem Molekül B7.1 abgeleitet ist, oder
- (4) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region E7 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region L1 stammt, ein Polypeptid, welches aus der Region L2 eines Papillomavirus stammt, ein Polypeptid, welches von dem Molekül B7.1 abgeleitet ist, und ein Polypeptid, welches von dem Interleukin-2 abgeleitet ist.
- Bei Übertragung der obigen Beobachtungen auf die Infektionsfrequenz durch bestimmte HPV-Typen im Fall von Uterushalskrebs, enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung ein Polypeptid, welches von einem gefährlichen Papillomavirus des Typs HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 und/oder HPV-45, insbesondere vom HPV-16-Virus, abstammt. Wenn die Zusammensetzung mehrere Papillomavirus-Antigene enthält, können diese gleichen oder verschiedenen Ursprungs sein.
- Ein Polypeptid, welches von einem Papillomavirus stammt oder eine immunstimulierende Wirkung aufweist, kann durch die konventionellen Methoden der chemischen Synthese oder auch durch die rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden (siehe beispielsweise Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Insbesondere umfasst ein Herstellungsverfahren das Kultivieren einer Zelle, welche durch ein DNA-Fragment transformiert wurde, welches für das fragliche Polypeptid kodiert, um eine produzierende Zelle zu erzeugen, und das Polypeptid aus der Kultur zu gewinnen. Bei der produzierenden Zelle kann es sich unter anderem um ein Bakterium, eine Hefe oder auch eine Säugetierzelle handeln, wobei das betrachtete DNA-Fragment entweder in das Genom oder in einen geeigneten Expressionsvektor, welcher sich replizieren kann, integriert ist. Das DNA-Fragment wird unter der Kontrolle von Transkriptions- und Translationssignalen platziert, die seine Expression in der produzierenden Zelle ermöglichen. Expressionsvektoren und Regulierungssignale sind dem Fachmann bekannt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus, welche als therapeutische(n) Wirkstoff(e) ein oder mehrere rekombinante Vektoren enthält, in den/die DNA-Fragmente eingefügt sind, welche für
- (1) wenigstens ein Polypeptid, welches aus der frühen Region eines Papillomavirus stammt, und wenigstens ein Polypeptid, welches aus der späten Region eines Papillomavirus stammt, kodieren, oder
- (2) wenigstens ein Polypeptid, welches aus der frühen Region eines Papillomavirus stammt, wenigstens ein Polypeptid, welches aus der späten Region eines Papillomavirus stammt, und wenigstens ein Polypeptid, welches eine immunstimulierende Wirkung aufweist, kodieren;
- wobei die DNA-Fragmente unter der Kontrolle von Elementen platziert sind, die für ihre Expression in einer Wirtzelle oder einem Wirtorganismus notwendig sind.
- Gemäß dieser bevorzugten Alternative ist der therapeutische Wirkstoff ein Vektor, in den die DNA-Fragmente, welche für die Polypeptide kodieren, die von einem Papillomavirus stammen, eingefügt sind, oder die zuvor definierten Immunstimulatoren. Dieser Zusammensetzungstyp weist den Vorteil einer kostengünstigen Produktion und hohen Stabilität bei veränderlichen Umgebungsbedingungen auf. Insbesondere sind die Konservierungsbedingungen günstiger.
- Die DNA-Fragmente, welche für ein Polypeptid kodieren, welches von einem Papillomavirus stammt, können durch Klonierung, durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) oder durch chemische Synthese gemäß den konventionellen Techniken erhalten werden, jeweils unter Verwendung von positiven Papillomaviruszellen, die von Patienten oder Sammlungen erhalten wurden.
- Das Gen, welches für ein Polypeptid mit immunstimulierender Wirkung kodiert, kann ebenso gemäß den Standardtechniken ausgehend von einem Genom einer Zelle (Genomtyp) oder von mRNA einer Zelle, in der es exprimiert wird (cDNA-Typ) isoliert werden. Außerdem kann das fragliche Gen für (i) ein lösliches Molekül, welches entweder intrazellulär ist oder in das äußere Medium sekretiert wird, oder (ii) ein Molekül, welches in der Membran verankert und somit auf der Oberfläche von Zellen, welche es exprimieren, präsentiert wird, kodieren.
- Ein im Rahmen der Erfindung bevorzugter rekombinanter Vektor ist ein viraler Vektor in dessen Genom die zuvor genannten DNA-Fragmente eingefügt wurden, derart, dass ihr Transfer und ihre Expression in einer Wirtzelle oder einen Wirtorganismus ermöglicht wird. Ein im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbarer viraler Vektor kann insbesondere von einem Pockenvirus, einem Adenovirus, einem Retrovirus, einem Herpesvirus oder einem mit einem Adenovirus verbundenen Virus abgeleitet sein. Vorteilhafterweise handelt es sich um einen nichtintegrierenden Vektor mit abgeschwächter Virulenz. Derartige Vektoren sowie ihre Herstellungsverfahren sind dem Fachmann bekannt.
- Im Fall der Verwendung eines adenoviralen Vektors wird bevorzugt ein durch Deletion der für die Replikation wesentlichen Regionen und, insbesondere des Hauptteils der Region E1, nicht-replikativer Vektor verwendet, um seine Ausbreitung im Blut des Wirtorganismus oder der Umgebung zu verhindern. Es versteht sich von selbst, dass man andere Regionen des adenoviralen Genoms modifizieren oder deletieren kann, in dem Maß, in dem die defekten wesentlichen Funktionen in trans komplimentiert werden. Ein gemäß der Erfindung bevorzugter viraler Vektor enthält die für die Einkapselung wesentlichen Sequenzen, dass heißt, die ITR's (Inverted Terminal Repeat) 5' und 3' und die Einkapselungsregion. Die verschiedenen adenovirlanen Vektoren sowie ihre Herstellungsverfahren sind konventionell und in Graham et Pretect (1991, in Methods in Molecular Biology, Vol 7, S. 109-128; Ed: E. J. Murey, The Human Press Inc.) und der internationalen Anmeldung WO94/28152 beschrieben. Wenn es sich um ein Retrovirus handelt, werden die LTR's (Long Terminal Repeat) und die Einkapselungssequenzen (siehe beispielsweise Naviaux und Verma, 1992, Current Opinion in Biotechnology 3, 540-547) konserviert.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßer rekombinanter viraler Vektor von einem Pockenvirus und, insbesondere einem Vogel-Pockenvirus wie dem Canaripockenvirus, einem Geflügelpockenvirus oder einem Kuhpockenvirus, wobei der letztere bevorzugt ist, abgeleitet. Unter den Kuhpockenviren, die im Rahmen den vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, werden bevorzugt die Stämme Kopenhagen, Wyeth und modifizierter Ankara (MVA für Modified Vaccinia Virus Ankara) ausgewählt. Die allgemeinen Bedingungen zum Erhalt eines Kuhpockenvirus, der ein heterologes Gen exprimieren kann, sind im europäischen Patent EP 83 286 und der Anmeldung EP 206 920 geschildert. Das MVA-Virus ist insbesondere in (Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-14; Sutter et Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USD 89, 10847-10851) beschrieben.
- Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die DNA-Fragmente unter der Kontrolle von Elementen platziert, die für ihre Expression notwendig sind. Dazu zählen die entsprechenden Elemente der Transkriptionsregulation sowie die Initiations- und Terminationssignale der Translation. Dem Promotor kommt eine besondere Bedeutung zu. Allgemein greift man auf einen Promotor zurück, der im dem Organismus oder der Wirtzelle, die behandelt werden soll, funktionell und an den verwendeten Vektor angepasst ist. Außerdem kann er derart modifiziert sein, dass er regulatorische Sequenzen enthält, beispielsweise ein Aktivierungselement der Transkription oder Sequenzen, die auf bestimmte zelluläre Signale antworten. Aus dieser Sicht kann es vorteilhaft sein, einen gewebespezifischen Promotor zu verwenden, da die mit Papillomavirus in Verbindung stehenden Erkrankungen im Bereich der Genitalwege lokalisiert sind, wo ein Promotor auf spezifische tumorale Signale antwortet (beispielsweise aktiviert in Gegenwart von Wachstumsfaktoren, die allgemein durch die Tumorzellen überexprimiert werden), um die Expression ausschließlich auf die Tumorzellen zu begrenzen.
- Von den im Rahmen der Erfindung geeigneten Promotoren seien die Promotoren SV40 (Virus Simian 40), HMG (Hydroxy-Methyl- Glutarylcoenzym A), TK (Thymidin-Kinase), CMV (Cytomegalovirus), RSV (Rous Sarcoma Virus), MLP (Major Late Promotor) von Adenoviren, die an den adenoviralen Vektor angepasst sind, und die LTR von Mo-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus), welche spezifischer zu den retroviralen Vektoren ist, genannt. Wenn der Vektor von einem Pockenvirus abgeleitet ist, handelt es sich bevorzugt bei dem Promotor um den Promotor eines Gens des verwendeten Pockenvirus, beispielsweise den Promotor des Gens, welches für das Protein 7,5K, HSR, TK oder K1L des Kuhpockenvirus kodiert. Diese Letzteren sind in der Literatur beschrieben und können ausgehend von dem viralen Genom durch klassische Techniken kloniert werden.
- Außerdem können die für die Expression notwendigen Elemente Sequenzen tragen, die die Expression verbessern oder in der Wirtzelle aufrechterhalten (Intron, Signalsequenz, Transkriptions-Terminationssequenz, Translations-Initiationsstelle, Sequenzen, die die Präsentation des Polypeptids den Zellen des Immunsystems des Wirts modifizieren....). Wenn es sich jedoch um einen von einem Pockenvirus abgeleiteten Vektor handelt, wird die Verwendung von Introns vermieden.
- Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann entweder mit mehreren rekombinanten Vektoren, von denen jeder ein gegebenes Polypeptid exprimiert, oder mit einem einzigen Vektor, welcher die DNA-Fragmente, die den ausgewählten Polypeptiden entsprechen, exprimiert, platziert unter der Kontrolle von unabhängigen oder gemeinsamen Elementen, erhalten werden. Im letzten Fall kann man auf Sequenzen zurückgreifen, die die Initiation der Translation auf interne Weise ermöglichen (IRES) oder auf In-Phasen-Fusionen verschiedener Gene.
- Die allgemeinen Bedingungen zum Erhalt eines rekombinanten Vektors unter Verwendung der vorliegenden Erfindung sind ausführlich im Stand der Technik beschrieben. Wenn es sich um einen pockenviralen Vektor handelt, kann auf das europäische Patent EP 83 286 Bezug genommen werden. Diese Bedingungen sind auf andere als Vektor geeignete Viren übertragbar, die einen nicht-essentiellen genomischen Bereich aufweisen, in den die Expressionsblöcke eingebaut werden können. Sie können in den gleichen Lokus oder in verschiedene Loci eingefügt werden. Beispielsweise ist, wenn ein Kuhpockenvirus des Stammes Kopenhagen verwendet wird, die bevorzugte Insertionsstelle der TK- Lokus und/oder der K1L-Lokus. Die Insertion auf Höhe des viralen TK-Gens bewirkt die Inaktivierung des Gens, wodurch die Selektion der Rekombinanten erleichtert wird. Bei einem Kuhpockenvirus des Stammes MVA kann die Insertion der Papillomavirus-Gene und Immunostimulatoren inmitten einer der Ausschnitte I bis VI und, bevorzugt des Ausschnittsbereichs II oder III durchgeführt werden (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032- 1040)
- In Übereinstimmung mit den durch die vorliegende Erfindung verfolgten Zielen kann ein rekombinanter Vektor außerdem einen Expressionsblock eines Sektionsmarkergens enthalten, um die Stufen der Isolierung und Aufreinigung des rekombinanten Virus zu erleichtern. Insbesondere seien das Gen Neo, welches eine Resistenz gegen das Antibiotikum G418 verleiht, das Gen Pac, welches Puromycinresistenz verleiht, das TK-Gen des Herpes- Simplexvirus vom Typ I (HSV-1), welches eine Empfindlichkeit auf bestimmte Nukleosidanalogen, wie das Ganciclovir oder Acyclovir verleiht, die bakteriellen Gene LacZ, welches für die β-Galactosidase kodiert, und gus A, welches für die β- Glucuronidase kodiert, genannt. Diese zwei letztgenannten enzymatischen Marker markieren die rekombinanten Viren durch Anfärbung in Gegenwart der Substrate X-Gal (5-Brom-4-chlor-3- indolyl-β-D-galactopyranosid) bzw. XglcA (5-Brom-6-chlor-3- indolyl-β-D-glucoronid).
- Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus, enthält einen oder mehrere rekombinante Vektoren, der/die von einem Kuhpockenvirus abgeleitet ist/sind, in den/die
- (1) wenigstens ein DNA-Fragment, welches für wenigstens ein Polypeptid kodiert, welches aus der späten Region eines Papillomavirus stammt, und ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert,
- (2) wenigstens ein DNA-Fragment, welches für wenigstens ein Polypeptid aus späten Region eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA- Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert,
- (3) wenigstens ein DNA-Fragment, welches für wenigstens ein Polypeptid der späten Region eines Papillomavirus kodiert und ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert,
- (4) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines Papillomavirus kodiert,
- (5) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 ein Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA- Fragment, welches für das Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert,
- (6) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert, oder
- (7) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert,
- eingefügt sind.
- Dagegen enthält eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung, die insbesondere zur Immunprophylaxe bestimmt ist, ein oder mehrere rekombinante Vektoren, der/die von einem Kuhpockenvirus abgeleitet ist/sind, in den/die wenigstens ein DNA-Fragment, welches für wenigstens ein Polypeptid kodiert, welches aus der frühen Region eines Papillomavirus stammt, und
- (1) ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert,
- (2) ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert, oder
- (3) ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert,
- eingefügt sind.
- Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann gemäß den auf dem Gebiet der Impfstoffe bekannten Verfahren hergestellt werden, und die verabreichbaren Dosen können in einem großen Bereich variieren. Sie sind insbesondere abhängig von den Polypeptiden und den verwendeten Viren, der zu behandelnden Pathologie, dem Zustand des Patienten und anderen Parametern, die durch die Kliniker festgestellt werden. Jedoch ist im Allgemeinen die Virusdosis pro Kilo 10&sup4; bis 10¹¹, vorteilhafterweise 10&sup6; bis 10¹&sup0;, und bevorzugt 10&sup7; bis 10&sup9; plaquebildende Einheiten (ufp), wenn das therapeutische Agents ein viraler Vektor ist, und 0,05 bis 500 mg, vorteilhafterweise 0,5 bis 200 mg, und bevorzugt 1 bis 100 mg, wenn das therapeutische Agens seinen Ursprung in einem Polypeptid hat.
- Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auf jedem beliebigem konventionellen Verabreichungsweg, insbesondere intravenös, intramuskulär, subkutan oder subepithelial, oder durch Skarifikation verabreicht werden. Im Fall eines zugänglichen Tumors ist es auch möglich, eine direkte Injektion in die Stelle oder den angrenzenden Bereich des Tumors oder eine topische Anwendung durchzuführen. Als Impfstoff kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung gemäß den auf dem Gebiet üblichen Praktiken, beispielsweise in einer einzelnen Dosis oder einer oder mehreren wiederholten Dosen nach einem bestimmten Unterbrechungsintervall verabreicht werden. Im Gegensatz dazu kann sie bei einer kurativen Behandlung regelmäßig innerhalb eines für eine wirksame Behandlung ausreichenden Zeitraums verabreicht werden. Wenn das therapeutische Agens ein viraler Vektor ist, liegt dieses Virus bevorzugt in lebender Form vor. Wenn es sich um einen Pockenvirus-Vektor handelt, ist die Verwendung eines abgeschwächten Stammes, wie des Stammes MVA oder des Thymidinkinase-negativen Stammes Kopenhagen bevorzugt. Ein viraler rekombinanter Vektor kann durch eine geeignete, dem Fachmann geläufige chemische Behandlung abgeschwächt werden. Jedoch kann auch die Injektion eines abgetöteten rekombinanten Vektors in Betracht gezogen werden.
- In einer bevorzugten Ausführungsform enthält eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eine wirksame therapeutische Menge eines rekombinanten Vektors in Verbindung mit einem aus pharmazeutischer Sicht geeigneten Träger. Der Träger wird derart ausgewählt, dass seine Verabreichnung durch Injektion beim Menschen oder Tier ermöglicht wird. Sie kann außerdem einen Trägerstoff, ein Lösungsmittel und/oder einen Zusatzstoff enthalten und in flüssiger oder lyophilisierter Form vorliegen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung als Medikament zur Behandlung oder Vorbeugung von Gebärmutterhalskrebs, einer Dysplasie des Halses niederen Grads- und einer Papillomavirus-Infektion.
- Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung der oben zitierten Erkrankungen, wobei einem Individium, welches einer derartiger Behandlung bedarf, eine aus pharmazeutischer Sicht wirksame Menge einer Mischung des Polypeptids oder eines rekombinanten Vektors unter Anwendung der vorliegenden Erfindung verabreicht wird.
- Die vorliegende Erfindung wird in Bezug auf die folgenden Figuren veranschaulicht.
- Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG5021, welcher den Transfer der späten Gene L1 und L2 von HPV-16, platziert unter der Kontrolle des Promotors p7,5K, wobei die beiden Kassetten entgegengesetzte Orientierung zueinander haben, in den TK-Lokus des Kopenhagen-Inpfstoffs ermöglicht.
- Fig. 2 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG5065, welcher den Transfer der frühen Gene E6 und E7 von HPV-16, platziert unter der Kontrolle des Promotors pHSR (die beiden Kassetten haben eine zueinander entgegengesetzte Orientierung), des humanen IL-2-Gens (IL2h), platziert unter der Kontrolle des Promotors p7,5K, und des Markengens LacZ (btaGAL), platziert unter der Kontrolle des Promotors pK1L, in den K1L-Lokus des Kopenhagen-Kuhpockenvirus ermöglicht.
- Fig. 3 veranschaulicht schematisch die Strategie, die verwendet werden kann, um die späten Gene L1 und L2 von HPV-16 inmitten des Ausschnittsbereichs II eines Kuhpockenvirus MVA einzufügen, wobei die linken und rechten Rekombinationsarme jeweils gekennzeichnet sind (BRG2 und BRD2).
- Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der vorliegenden Beispiele beschrieben, ohne dadurch eingeschränkt zu werden.
- Die unten beschriebenen Konstrukte werden gemäß der allgemeinen Verfahren der Gentechnik und der molekularen Klonierung, die detailliert in Maniatis et al. (1989, supra) beschrieben sind, oder gemäß den Empfehlungen des Herstellers bei Verwendung eines kommerziellen Kits, hergestellt. Die gerichtete in-vitro-Mutagenese durch synthetische Oligonucleotide wird mit Hilfe eines Kits von Amersham durchgeführt. Die Techniken der PCR-Amplifikation sind dem Fachmann bekannt (siehe beispielweise PCR Protocols-A Guide to Methods and Applications, 1990, editiert von Innis, Gelfand, Sninsky et White, Academic Press Inc). Wenn eine Reparatur der Restriktionsstellen durchgeführt werden muss, besteht die angewandte Technik in einem Auffüllen der vorstehenden 5'-Enden mit Hilfe des großen Fragments der DNA-Polymerase I von E. coli (Klenow).
- Bei den Klonierungsstufen werden die rekombinanten M13- Bateriophagen in dem Stamm E. coli NM522 (Stratagene) in einem Gelose-Minimalmedium (Agar 7,5%) oder in einem LBM-reichen Flüssigmedium vervielfältigt. Die rekombinaten Plasmide, welche das Ampicillin-Resistenzgen tragen, werden in den Stämmen E. Coli C600 (Stratagene), BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580) und NM522 auf mit 100 ug/ml Antibiotikum supplementiertem Nährboden oder Flüssigmedium repliziert. Bevorzugt wird der Stamm BJ5183 verwendet, da die Klonierung durch humologe Rekombination bewirkt wird (Bubeck et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21, 3601-3602).
- Die Konstruktion der rekombinanten Kuhpockenviren wird gemäß den klassischen Technologien, die in den bereits genannten Dokumenten und in Meckett et al. (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419) und Mackett et al. (1984, J. Virol. 49, 857-864) beschrieben sind, durchgeführt.
- Die für die Proteine L1 und L2 kodierenden Fragmente werden durch PCR ausgehend von genomischer DNA von Caski-Zellen (ATCC 1550) gemäß der auf dem Gebiet üblichen Techniken isoliert. Das Amplifikationsfragment, welches die Sequenzen L1 trägt, wird in den Vektor M13TG130 (Kienly et al., 1983, Gene 26, 91- 99) subkloniert, wobdurch das Konstrukt M13TG8171 entsteht. Die Sequenz des klonierten L1-Gens weist mehrere Mutationen im Vergleich zu der in der Genebank enthaltenen Sequenz auf (Hinterlegung K02718): C anstelle von A an Position 248, C anstelle von A an Position 253, G anstelle von A an Position 537, G anstelle von C an Position 682, G anstelle von A an Position 874, Insertion eines Triplets ACT an Position 1393, Deletion eines Triplets GAT an Position 1390. Die Insertion des PCR- Fragments, welches die L2-Sequenzen trägt, in den Vektor M13TG6131 ergibt M14TG9126. Es werden 5 Punktmutationen im Vergleich zu der in der Genebank veröffentlichten Sequenz gezählt: C anstelle von T an Position 378, A anstelle von G an Position 691, A anstelle von G an Position 702, G anstelle von A an Position 990 und C anstelle von A an Position 1092. Der Vektor M13TG6131 ist von M13TG131 (Kieny et al., 1983, supra) durch Mutation der internen BglII-Stelle, welche außerhalb der multiplen Klonierungsstellen liegt, abgeleitet.
- Das für das Protein L1 kodierende Gen wird durch Erzeugung einer BglII-Stelle stromaufwärts des ATG-Initiators modifiziert. Das mutierte Gen wird aus dem Vektor M13TG8185 durch BglII-SacI-Verdau ausgeschnitten und zwischen die BamHI- und SacI-Stellen von pTG186-poly eingefügt. Das entstandene Konstrukt wird pTG4019 genannt. Der Transfervektor pTG186-poly ist detailliert in dem französischen Patent 2 583 429 beschrieben. Er trägt 10 Restriktionsstellen für die Insertion des zu überführenden Gens und den Promotor p7,5K für die Kontrolle seiner Expression.
- Das für das Protein L2 kodierende Gen wird durch BglII- HindIII-Verdau aus M13TG9126 isoliert und anschließend zwischen die BamHI- und HindIII-Stellen 3' des Promotors 7,5K kloniert. Es wird M13TG9127 erhalten, in den durch gerichtete Mutagenese eine SalI-Stelle stromaufwärts des Promotors eingefügt wird. Der Expressionsblock "p7,5K-Gen L2" wird aus dem mutierten Vektor M13TG9129 isoliert und in die Sacl-Stelle des Transfervektors pTG4019 derart kloniert, dass die zwei Kassetten p7,5K-L1 und p7,5K-L2 in entgegengesetzter Orientierung liegen. Das so erhaltene Konstrukt pTG5021 ist in Fig. 1 dargestellt. Die Expressionsblöcke werden in das Genoms des Kuhpockenvirus vom Stamm Kopenhagen durch homologe Rekombination überführt. Das als VVTG5021 bezeichnete rekombinante Virus wird durch Selektion auf 5-Bromdeoxyuridin (5BUDR) isoliert.
- Die Gene E6 und E7 werden ausgehend von der Caski-Zelllinie wie in den Beispielen 2 und 3 des europäischen Patents EP 0 462 187 beschrieben isoliert. Es werden zwei Konstrukte von dem Klon M13E7/E6, welcher die Gene E6 und E7 von HPV-16 enthält, abgeleitet, um die späteren Klonierungsstufen zu vereinfachen. Das erste, bezeichnet als M13TG8188, stammt aus der Einführung der PstI- bzw. BamHI-Stellen stromaufwärts und stromabwärts des E7-Gens, und das zweite, M13TG8189, trägt eine PstI-Stelle stromaufwärts des E6-Gens. Die Einführung der Punktmutationen stromaufwärts eines ATG-Initiators und stromabwärts eines Stoppkodons sind dem Fachmann geläufig.
- Die Verbindung des Proteins E7 von HPV-16 mit dem Produkt des Retinoblastom-Gens wurde von verschiedenen Autoren gezeigt (siehe beispielsweise Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099- 4105) und korreliert mit seinem Transformationsvermögen. Aus offensichtlichen Sicherheitsgründen wird eine nicht onkogene Mutante erzeugt, bei der Sequenzen, die für die Aminosäuren 21 bis 26 des nativen E7-Proteins kodieren und in die Transformationsfunktion verwickelt sind, durch gerichtete Mutagenese des Vektors M13TG8188 mit Hilfe des Oligonucleotids oTG5118 (SEQ ID NO: 1) deletiert ist. Es wird M13TG9104 erhalten. Das mutierte E7-Gen wird im Folgenden als E7* bezeichnet.
- Gleichermaßen wurde gezeigt, dass das Protein E6 von HPV-16 mit dem Expressionsprodukt des Tumorsuppressorgens p53 interagieren kann (Crook et al., 1991, Cell 67, 547-556). Der in diese Interaktion verwickelte Bereich ist eindeutig identifiziert und befindet sich zwischen den Resten 111 bis 115 des nativen Proteins. Der Vektor M13TG9125 wird durch Mutagenese von M13TG8189 mit Hilfe des Oligonucleotids oTG5377 (SEQ ID NO: 2) erzeugt. Das mutierte E6-Gen wird im Folgenden als E6* bezeichnet.
- Das EcoRI-K-Fragment von 5,2 kb vom linken Ende des Genoms des Kuhpockenvirus Kopenhagen (Guillard et al., 1985, J. Virol. 53, 316-318) wird in das Plasmid pUC8 (Gibco BRL), welches durch EcoRI linearisiert wurde, kloniert. Der so erhaltene Vektor wird anschließend einem BglII-Verdau und dann einer Ligation unterzogen, um ein Fragment von 855 bp, welches für das Restriktionsgen des Wirts K1L kodiert, zu deletieren (Guillard et al., 1986, Proc. Natl. Acad, Sci., USA 83, 5573- 5577). Das BglII-Fragment von 3, 4 kb wird aus diesem Zwischenkonstrukt, welches als pUC8Khr bezeichnet wird, isoliert und anschließend in die BamHI-Stelle des Plasmids pUC7 (Gibco BRL) kloniert. Es wird pBAC1 erzeugt, in den ein XhoI-Adapter links der einzigen Bglil-Stelle eingeführt wird. Nach Verdau mit XhoI und BglII wird ein SalI-BglII-Fragment, welches den Vaccinpromotor p7,5K trägt, eingefügt. Die zwei EcoRI-Stellen werden durch EcoRI-Verdau und anschließende Klenow-Behandlung und Religation eliminiert. Der Vektor pTG2147 wird durch Einführen einer multiplen Klonierungsstelle, die aus dem Vektor p poly II (Lathe et al., 187, Gene 57, 193-201) isoliert und in Form eines BglII-BamHI-Fragments isoliert worden war, in die einzige Bglil-Stelle erhalten. Er enthält somit die Rekombinationsarme, die die Insertion in den Lokus K1L, welcher den Promotor p7,5K gefolgt von Restriktionsstellen einrahmt, ermöglichen.
- Die Gene E6* und E7* werden stromabwärts des Vaccinpromotors pHSR, welcher in dem Vektor M13TG9132 enthalten ist, kloniert, um M13TG9138 bzw. M13TG9139 zu ergeben. Der Vektor M13TG9132 entsteht durch die Insertion des Promotors des H5R- Gens, welches durch PCR aus dem viralen Genom isoliert wurde, in den Phagen M13TG6131.
- Die cDNA, welche für das humane Interleukin-2 kodiert, wird aus dem Plasmid pTG36 (französisches Patent 2 583 770) isoliert, in einen Zwischenvektor eingeführt und durch SalI- BamHI-Verdau ausgeschnitten, um in den Transfervektor pTG2147 gezielt in den Lokus K1L eingefügt zu werden. Die Insertion findet auf Höhe der PstI- und XbaI-Stellen, die stromabwärts des Promotors p7,5K gelegen sind, mit Hilfe von Klonierungsadaptern statt. Es wird pTG5056 erhalten.
- Der Expressionsblock pHSR-E6* wird aus dem Vektor M13TG9139 in Form eines BglII-BamHI-Fragments, welches in die BamHI- Stelle des Vektors pTG5056 eingefügt wird, isoliert. Es wird der Vektor pTG5060 erzeugt. Der Expressionsblock pHSR-E7* wird aus M13TG9138 herausgeschnitten und in die BamHI-Stelle des Vektors pTG5060 eingefügt, wodurch pTG5062 erhalten wird. Die Insertion in den K1L-Lokus führt zu rekombinanten Viren, die eine reduzierte oder sogar zerstörte Replikationsfähigkeit in bestimmten Zelltypen aufweisen. Aus diesen Gründen wird ein positiver Selektionsmarker eingeführt, um die Identifikation der rekombinanten Viren zu erleichtern. Der Vektor pTG5065 resultiert aus der Klonierung einer Expressionskassette "pK1L- LacZ-Gen", welche aus dem Plasmid pIV75 (Chen et al., 1993, Virology 196, 682-693) durch BglII-BamHI-Spaltung isoliert wurde, in die BamHI-Stelle von pTG5062. Wie in Fig. 2 dargestellt, ermöglicht er den Transfer der Blöcke E6*, E7* und IL- 2 in den Lokus K1L des Kuhpockenvirus.
- Das rekombinante Kuhpockenvirus, als VVTG5065 bezeichnet, wird durch homologe Rekombination nach Transfektion des Vektors pTG5065 in embryonale Hühnchenzellen, die mit dem Kopenhagen-Wildtyp-Kuhpockenvirus infiziert und durch Anfärbung auf Gelose mit X-Gal markiert worden waren, erzeugt. Die Kuhpockenviren VVTG5021 und VVTG5065 werden in doppelten Infektionsessais verwendet. Die doppelten Rekombinanten werden anhand der zwei Marker, Bildung von blauen Plaques in Gegenwart von X-Gal und Deletion des TK-Markers, selektiert. Diese, als VVTG5021&5065 bezeichnet, exprimieren die Blöcke p7,5K-IL-2, pH5R-E6* und pHSR-E7*, integriert in den Lokus K1L, und die Blöcke p7,5K-L1 und p7,5K-L2, integriert in den TK-Lokus.
- Die Expression der HPV-Gene kann durch Analyse im Western- Blot mit Hilfe von geeigneten monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern oder durch reverse PCR verifiziert werden. Die Produktion von IL-2 kann durch einen ELISA- oder CTL-Test, wie in der Literatur beschrieben, bewertet werden. Das Expressionsniveau in vitro liegt in der Größenordnung von 60 ng/ml/106 infizierte Zellen bei 1 pfu/Zelle und 24 Stunden.
- Die für das humane Interleukin-2 kodierende cDNA wird aus dem Plasmid pTG36 durch PstI-Verdau isoliert und in die PstI- Stelle des Plasmids pTG186 eingefügt, wodurch pTG188 erhalten wird. Das durch homologe Rekombaniation erhaltene Virus wird als VVTG188 bezeichnet.
- Das Gen E6* wird in Form eines PstI-BamHI-Fragments aus M13TG9125 isoliert und stromabwärts des Promotors 7,5K zwischen die PstI- und XbaI-Stellen von pTG2147 in Gegenwart eines BamHI-XbaI-Adapters eingefügt, wodurch pTG5057 erhalten wird. Das Gen E7* wird unter der Kontrolle des Vaccin- Promotors H5R platziert, wodurch M13TG9138 erzeugt wird und die durch die BamHI-BglII-Stellen eingerahmte Kassette in die BamHI-Stelle von pTG5057 subkloniert. Es wird pTG5059 erhalten, in dessen BamHI-Stelle der Selektionsmarker LacZ unter der Kontrolle des Promotors des Vaccin-Gens K1L, welches durch BglII-BamHI-Verdau aus dem Vektor pIV75 isoliert worden war, eingefügt wird. Das entstehende Konstrukt wird als pTG5061 bezeichnet und durch homologe Rekombination wird mit dem Vaccin- Genom VVTG5061 erzeugt.
- Ein rekombinantes Kuhpockenvirus, welches die Gene E6* und E7* integriert in den Lokus K1L und das humane IL-2-Gen integriert in den TK-Lokus exprimiert, wird durch Co-Infektion von embryonalen Hühnchenzellen durch die Viren VVTG5061 und VVTG188 erhalten. Das letztgenannte produziert IL2 in einer Menge von über 400 ng pro 106 infizierten Zellen bei 1 pfu pro Zelle über 24 Stunden. Das doppelt rekombinante Virus wird als VVTG5061&188 bezeichnet.
- Die für B7.1 kodierende cDNA wird aus einer mRNA- Präparation, welche aus der Zelllinie Daudi (ATCC CCL-213) durch reverse PCR erhalten worden war, unter Verwendung der Primer oTG6353 und oTG6352 (SEQ ID NO: 3 und 4) erhalten. Die Gensequenz ist in der Genebank unter der Hinterlegungsnummer M27533 hinterlegt. Das amplifizierte Fragment wird zwischen die Bglil- und EcoRI-Stellen von M13TG6131 kloniert, wodurch M13TG9149 entsteht, und anschließend zwischen die BamHI- und EcoRI-Stellen von pTG186 platziert. Das Konstrukt wird pTG5090 und das durch homologe Rekombination erhaltene Virus VVTG5090 genannt. Ein Kuhpockenvirus, welches die Gene E6* und E7* von HPV-16 integriert in den K1L-Lokus und das humane Gen B7.1 integriert in den TK-Lokus exprimiert, kann durch Co-Infektion von embryonalen Hühnchenzellen durch die Viren VVTG5061 und VVTG5090 erhalten werden. Das rekombinante Virus wird als VVTG5061&5090 bezeichnet.
- Das MVA-Virus ist von dem Stamm des Kuhpockenvirus Ankara abgeleitet. Es ist nicht mehr im Stande, infektiöse Partikel in den Säugetierzellen zu erzeugen, entwickelt sich jedoch bei embryonalen Hühnchenfibroblasten korrekt. Seine Adaption an diese Zellen bewirkt das Ausschneiden von 6 Regionen, die für seine Entwicklung und seinen infektiösen Zyklus bei diesem Zelltyp nicht essentiell sind (Verschwinden von etwa 15% des viralen Genoms; Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031- 1038). Die Integration des exogenen genetischen Materials kann auf Höhe irgendeiner dieser Ausschnittsbereiche bewirkt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Ausschnitte II und III, die auf Höhe der Restriktionsfragmente Hindlil N bzw. A lokalisiert sind, verwendet (Altenburger et al., 1989, Arch. Virol. 105, 15-27).
- In einem ersten Schritt wird der Vektor pTG6019, der die Isertion des MVA-Virus in den Ausschnittsbereich III ermöglicht, konstruiert. Die homologen Rekombinationsarme auf beiden Seiten des Ausschnittsbereichs III werden durch PCR ausgehend von dem viralen Genom (siehe amerikanisches Patent US 5,185,146) unter Verwendung der Primer oTG7637 und pTG7638 (SEQ ID NO: 5 und 6) für den linken Arm und oTG7635 und oTG7636 (SEQ ID NO: 7 und 8) für den rechten Arm isoliert. Die amplifizierten Fragmente werden in die EcoRI-Stelle des Vektors pTG1E kloniert, wodurch pTG6019 erzeugt wird. Das zu überführende genetische Material wird zwischen die beiden Rekombinationsarme eingefügt. Der Vektor pTG1E ist ähnlich dem pTG1H (französisches Patent 2 583 429), abgesehen von der Gegenwart eines EcoRI-Adapters anstelle der multiplen Klonierungsstellen.
- Zunächst wird eine Expressionskassette des Markergens gus A eingefügt. Zuvor wird der Promotor 7,5K in die BamHI-Stelle von pTG6019 kloniert. Es wird pTG6021 erhalten, in dessen Bam- HI-Stelle das Gen gus A, welches in Form eines BglII-BamHI- Fragments erzeugt wurde, eingefügt wird. Dieses kann ausgehend von der in der Literatur veröffentlichten Sequenz erhalten werden. Das entstehenden Konstrukt wird pTG6022 genannt. Die Gegenwart des Markers ermöglicht das Unterscheiden der Wildtyp-Viren von den rekombinanten Viren durch Detektion der enzymatischen GUS-Aktivität durch das Substrat XglcA. Eine rote Anfärbung zeigt die Aktivität der β-Glucuronidase. Jedoch kann es im Hinblick auf eine klinische Anwendung nützlich sein, diesen bakteriellen Marker aus dem Endprodukt nach der Selektion der rekombinaten Viren zu entfernen. Dazu wird die Fähigkeit des Virus ausgenutzt, diese Sequenzen, die sich zwischen zwei homologen Stellen befinden, zu deletieren. Aus diesem Grund wird ein zweiter Promotor p7,5K stromabwärts des gus-A- Gens in Sinn-Orientierung im Hinblick auf die Sequenzen, die die Expression des gus-A-Gens steuern, eingefügt. Der Vektor pTG6022 wird durch Insertion eines p7,5K-Fragments, welches mit kohäsiven Enden versehen ist, zwischen die BamHI- und SacI-Stellen modifiziert, wodurch pTG6025 entsteht.
- Dieser wird durch Insertion der Expressionskassetten der mutierten E6*- und E7*-Gene vervollständigt. Anschließend wird eine neue Promotorsequenz p7,5K, dieses Mal in Antisense- Orientierung hinsichtlich der vorausgegangenen Gene, eingeführt. Dieses Konstrukt, genannt pTG6039, enthält somit die instabile GUS-Kassette "p7,5K→gusA-p7,5K→", gefolgt von p7,5K in entgegengesetzter Orientierung. Parallel dazu werden die Gene E6* und E7* jeweils aus den Vektoren M13TG9104 und M13TG9125 durch BamHI- und PstI-Verdau isoliert und in entgegengesetzter Orientierung zueinander in die PstI-Stelle von M13TG6131 zusammengefügt. Das Ganze wird in Form eines PstI- Fragments ausgeschnitten, welches in pTG6039, welcher mit dem gleichen Enzym linearisiert wurde, eingefügt wird. Es wird der Vektor pTG6056 erhalten, welcher die folgenden Sequenzen p7,5K→gusA-p7,5K→E7*-E6*←p7,5K" enthält.
- Das immunstimulierende Gen B7.1 wird in dieses Konstrukt inetgriert. Dazu wird der Vektor pTG6056 mit Hindlil und KpnI gespalten, bevor er in Gegenwart der Oligonucleotide oTG10451 und oTG10450 (SEQ ID NO: 9 und 10) ligiert wird, um pTG6070 zu erzeugen. Die Oligonucleotide ermöglichen die Klonierung der Expressionskassette "pHSR-B7.1" durch homologe Rekombination. Zu diesem Zweck werden die aus M13TG9149 isolierten Sequenzen B7.1 stromabwärts des Vaccin-Promotors pHSR kloniert, um M13TG9184 zu bilden. Das BglII-EcoRI-Fragment, welches die Kassette trägt, wird in den durch XhoI linearisierten Vektor pTG6070 durch homologe Rekombaniation in E. coli integriert. Es wird der Vektor pTG79 erhalten, der insgesamt das Markergen gus A in einer "labilen" Form und die Expressionskassetten der frühen Gene von HPV-16 sowie eine Kassette des Costimulierungsgens B7.1 trägt. Das durch homologe Rekombination mit dem MVA-Genom erzeugte Virus wird als MVATG6079 bezeichnet.
- Die Expressionsblöcke der späten Gene von HPV-16 können in den Ausschnittsbereich II mit Hilfe des Transfervektors pTG5018 eingefügt werden. Dieser wird durch Insertion von linken und rechten Rekombinationsarmen, die den Ausschnitt II umrahmen, erzeugt durch PCR unter Verwendung der Primer oTG7665 und pTG7584 (SEQ ID NO: 11 und 12) und oTG7639 und opTG7640 (SEQ ID NO: 13 und 14), durch Insertion in die EcoRI-Stelle von pTG1E konstruiert. Wie zuvor werden die beiden Arme einer Expressionskassette eines positiven Markers integriert, um die Detektion der rekombinanten Viren zu vereinfachen; dieser kann nach der Selektionsstufe entfernt werden (Spehner et al., 1990, J. Virol. 64, 527-533). Der Vektor pTG6020 resultiert aus der Klonierung des Gens LacZ, platziert stromabwärts des Promotors p7,5K in den durch BamHI linearisierten Vektor pTG6018. Der Vektor pTG6020 wird durch Insertion einer Sequenz p7,5K zwischen seine BamHI- und SacI-Stellen stromabwärts des Gens LacZ modifiziert. Es wird pTG6024 erhalten. Die Kassetten L1 und L2 können anschließend gemäß einer in Fig. 3 gezeigten Strategie eingeführt werden.
- Es wird die gleiche Strategie wie zuvor verwendet, um das Gen IL-2 in den Vektor pTG6056 einzuführen. Nach Klonierung der Rekombinations-Oligonucleotide oTG10503 und oTG10502 (SEQ ID NO: 15 und 16) zur Erzeugung von pTG6076 wird dieser mit XhoI gespalten und das BglII-EcoRI-Fragment, welches ausgehend von M13TG9185 erzeugt wurde (pHSR-IL-2) durch homologe Rekombination eingefügt. Der so erhaltene Vektor pTG6090 enthält das Markergen gus A in einer "labilen" Form, die Expressionskassetten der frühen Gene von HPV-16 sowie eine Kassette des humanen IL-2-Gens. Das durch homologe Rekombination mit dem MVA-Genom erhaltene Virus wird als MVATG6090 bezeichnet. Die späten Gene können in den Ausschnittsbereich II unter Verwendung von pTG6018, wie oben beschrieben, integriert werden.
- Nacktmäuse erhielten 10&sup7; pfu von VVTG5021&5065 oder 10&sup7; pfu des Wildtyp-Kuhpockenvirus auf intravenösem, intramuskulärem, subkutanem oder intracranialem Weg. Es wurden Gruppen zu je 5 Mäusen gemäß dem injizierten Virustyp und dem Verabreichungsweg gebildet und 26 Tage nach der Injektion die Anzahl der Tiere, die Erkrankungen in Verbindung mit dem Vaccin aufweisen, festgestellt. Die Mäuse, die das rekombinante Virus erhalten hatten, zeigten keinerlei Erkrankungen, wie der verwendete Verabreichungsweg auch war, während die Mehrzahl der mit dem Wildvirus behandelten Tiere Erkrankungen mit einer Häufigkeit und einer Schwere in Abhängigkeit des Verabreichungsweges zeigten. Außerdem wurden im Fall einer intravenösen und intracranialen Injektion Todesfälle registriert. Diese Daten zeigen, dass VVTG5021&5065 in Bezug auf das Wildvirus abgeschwächt ist und auch nach intercranialer Injektion keine Erkrankungen hervorruft.
- C57BL6-Mäuse wurden dreimal auf subkutanem Weg mit 10&sup7; pfu von VVTG5021&5065 geimpft. Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurden diese Tiere mit 103-Zellen E7W1, die subkutan implantiert wurden, überprüft. Diese E7W1-Zellen stammen aus einer murinen Lymphomlinie, die mit einem Vektor transfiziert ist, welcher das onkogene E7-Gen von HPV-16 exprimiert. Der prozentuale Anteil der überlebenden Tiere in Abhängigkeit der Zeit wird mit dem verglichen, der mit Vergleichmäusen, die mit 10&sup7; pfu eines nicht-rekombinanten Kuhpockenvirus VVTG186 (erhalten aus dem obigen Vektor TG186) behandelt worden waren, erhalten wurden. Das Verfolgen der Sterblichkeit zeigt einen Unterschied zwischen den beiden Gruppen. In der Vergleichsgruppe sind 100% der Tiere am Tag 36 gestorben, während 40% der mit VVTG5021&5065 geimpften Tiere noch am Tag 36 und mehr als 30% am Tag 51 leben.
- Folglich weisen die rekombinanten Viren, die die Antigene von HPV und ein immunstimulierendes Gen exprimieren, eine antitumorale Wirkung gegen die Tumorzellen, die das Onkogen E7 von HP-16 exprimieren, auf.
- C57BL6-Mäuse werden mit 10³-Zellen E7W1, welche subkutan implantiert werden, geimpft (Tag 0). 10&sup7; pfu des rekombinanten Virus werden anschließend subkutan an Tag 3, Tag 6 und Tag 9 verabreicht, und der prozentuale Anteil der überlebenden Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren, die das nicht-rekombinante Virus erhalten hatten, bestimmt. Während 100% der Kontrolltiere gestorben sind, beobachtet man einen bemerkenswerten Anstieg an überlebenden Tieren, die mit einer Mischung von VVTG5061&5021 und VVTG188 injiziert worden waren. Ähnliche Ergebnisse werden nach Verabreichung von VVTG5065&5021 und VVTG188 erhalten.
- Diese Immuntherapie-Versuche wurden unter Verwendung eines anderen Tumormodells reproduziert, wobei BMK-16-myc-Zellen die E7w1-Zellen ersetzten. Bei BMK-16-myc-Zellen handelt es sich um Nierenzellen von neugeborenen Mäusen, die mit dem Genom von HPV-16 und dem murinen Gen c myc transfiziert worden sind. Die Tiere werden mit 10&sup7; Viren MVATG6090, welche die Gene E6*, E7* von HPV-16 und das humane IL-2 exprimieren, behandelt. Im Vergleich zu den Kontrollen weisen die behandelten Mäuse eine Verzögerung des Tumorwachstums bis zum Tag 15 auf.
- (1) Allgemeine Information:
- (i) Anmelder:
- (A) Name: Transgene SA
- (B) Straße: 11 Rue de Molsheim
- (C) Stadt: Straßburg
- (E) Land: Frankreich
- (F) Postleitzahl: 67082
- (G) Telefon: (33) 88 27 91 00
- (H) Telekopie: (33) 88 27 91 11
- (ii) Titel der Erfindung: Pharmazeutische Zusammensetzung gegen von Papillomavirus verursachte Tumoren und Infektionen
- (iii) Anzahl der Sequenzen: 16
- (iv) Computerlesbare Form:
- (A) Trägertyp: Tape
- (B) Computer: IBM PC kompatibel
- (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
- (D) Software: Patentln Release # 1.0, Version # 1,25 (OEB)
- (2) Information für die SEQ ID NO: 1:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 36 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: nein
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: humanes Papillomavirus
- (B) Stamm: HPV-16
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG5118 (E7 deletiert 21 bis 26)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 1:
- TCTGAGCTGT CATTTAATTG AGTTGTCTCT GGTTGC
- (2) Information für die SEQ ID NO: 2:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 32 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: nein
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: humanes Papillomavirus
- (B) Stamm: HPV-16
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG5377 (E6 deletiert 111 bis 115)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 2:
- TGTCCAGATG TCTTTGCAGT GGCTTTTGAC AG
- (2) Information für die SEQ ID NO: 3:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 35 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: cDNA
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: nein
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: Homo sapiens
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG6353 (PCR-Gen B7.1)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 3:
- TCAGCCCCTG AATTCTGCGG ACACTGTTAT ACAGG
- (2) Information für die SEQ ID NO: 4:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 33 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: cDNA
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: ja
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: Homo sapiens
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG6352 (PCR-Gen B7.1)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 4:
- TTGACCCTAA AGATCTGAAG CCATGGGCCA CAC
- (2) Information für die SEQ ID NO: 5:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 32 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: nein
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: Vaccinia-Virus
- (B) Stamm: modifizierter Ankara
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG7637 (PCR-Bereich III)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 5:
- GGGGGGGAAT TCAGTAAACT TGACTAAATC TT
- (2) Information für die SEQ ID NO: 6:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 39 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: ja
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: Vaccinia-Virus
- (B) Stamm: modifizierter Ankara
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG7638 (PCR-Bereich III)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 6:
- GGGGGGGGAT CCGAGCTCAC CAGCCACCGA AAGAGCAAT
- (2) Information für die SEQ ID NO: 7
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 32 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: nein
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: Vaccinia-Virus
- (B) Stamm: modifizierter Ankara
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG7635 (PCR-Bereich III)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 7:
- GGGGGGGGAT CCGGAAAGTT TTATAGGTAG TT
- (2) Information für die SEQ ID NO: 8;
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 30 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: ja
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: Vaccinia-Virus
- (B) Stamm: modifizierter Ankara
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG7636(PCR-Bereich III)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 8:
- GGGGGGGAAT TCTTTGTATT TACGTGAACG
- (2) Information für die SEQ ID NO: 9:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 78 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: nein
- (vi) Ursprung:
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG10451
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 9:
- CTTATACAGG GCGTACACTT TCCCTTCTCA ATCTCTCTCG
- AGTTGTATTT ATTTTCATTT TTTAAGTATA GAATAAAA
- (2) Information für die SEQ ID NO: 10:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 86 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: ja
- (vi) Ursprung:
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG10450
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 10:
- AGCTTTTTAT TCTATACTTA AAAAATGAAA ATAAATACAA
- CTCGAGAGAG ATTGAGAAGG GAAAGTGTAC GCCCTGTATA AGGTAC
- (2) Information für die SEQ ID NO: 11:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 39 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: nein
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: Vaccinia-Virus
- (B) Stamm: modifizierter Ankara
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG7665 (PCR-Bereich II)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 11:
- ATGGTACCGA ATTCCATCTA CCAATTCATC CAACAACAT
- (2) Information für die SEQ ID NO: 12:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 41 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: ja
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: Vaccinia-Virus
- (B) Stamm: modifizierter Ankara
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG7584 (PCR-Bereich II)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 12:
- GGCTGCAGGA TCCGAGCTCA TCATGACGTC CTCTGCAATG G
- (2) Information für die SEQ ID NO: 13:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 32 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: nein
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: Vaccinia-Virus
- (B) Stamm: modifizierter Ankara
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG7639 (PCR-Bereich II)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 13:
- GGGGGGGGAT CCTGTGAATC ATCCATTCCA CT
- (2) Information für die SEQ ID NO: 14:
- (i) - Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 33 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: ja
- (vi) Ursprung:
- (A) Organismus: Vaccinia-Virus
- (B) Stamm: modifizierter Ankara
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG7640 (PCR-Bereich II)
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 14:
- GGGGGGGAAT TCGTTACTAA ATTGCAAGGA AAT
- (2) Information für die SEQ ID NO: 15:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 69 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: nein
- (vi) Ursprung:
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG10503
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 15:
- CTCAAGTCAG TGTTGAGATG ATGCTTTGAC AACTCGAGTT
- TATTTTCATT TTTTAAGTAT AGAATAAAA
- (2) Information für die SEQ ID NO: 16:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 77 Basenpaare
- (B) Typ: Nukleinsäure
- (C) Anzahl der Stränge: einfach
- (D) Konfiguration: linear
- (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
- (iii) Hypothetisch: nein
- (iii) Antisense: ja
- (vi) Ursprung:
- (C) Individuell isoliert: Syntheseoligonukleotid oTG10502
- (xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 16:
- AGCTTTTTAT TCTATACTTA AAAAATGAAA ATAAACTCGA
- GTTGTCAAAG CATCATCTCA ACACTGACTT GAGGTAC
Claims (25)
1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder
Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors, verursacht durch
ein Papillomavirus, welche als therapeutischen Wirkstoff:
(1) wenigstens ein Polypeptid, welches aus der frühen Region
eines Papillomavirus stammt, und wenigstens ein Polypeptid,
welches aus der späten Region eines Papillomavirus stammt,
enthält, oder
(2) wenigstens ein Polypeptid, welches aus der frühen Region
eines Papillomavirus stammt, wenigstens ein Polypeptid,
welches aus der späten Region eines Papillomavirus stammt,
und wenigstens ein Polypeptid, welches eine
immunstimulierende Wirkung aufweist, enthält,
- mit Ausnahme der Kombination, bestehend aus einem
Polypeptid, welches aus der frühen Region E7 eines Papillomavirus
stammt, und einem Polypeptid, welches aus der späten Region L2
eines Papilliomavirus stammt, und
- wobei das Polypeptid, welches eine immunstimulierende
Wirkung aufweist, und/oder das Polypeptid, welches aus der frühen
Region stammt, nicht mit dem Polypeptid, welches aus der
späten Region stammt, fusioniert ist/sind.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, welches aus der
frühen Region eines Papillomavirus stammt, von dem Protein E6,
dem Protein E7 oder den Proteinen E6 und E7 eines
Papillomavirus abgeleitet ist.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, welches aus der
frühen Region eines Papillomavirus stammt, eine nicht onkogene
Variante des Proteins E6 und/oder E7 eines Papillomavirus ist.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid,
welches aus der späten Region eines Papillomavirus stammt, von
dem Protein L1, dem Protein L2 oder den Proteinen L1 und L2
abgeleitet ist.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid,
welches eine immunstimulierende Wirkung aufweist, Interleukin-
2, Interleukin-7, Interleukin-12 und/oder eines der Co-
Adhäsionsmoleküle B7.1 und B7.2 ist.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, welches eine
immunstimulierende Wirkung aufweist, vom Interleukin-2 abgeleitet
ist.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 oder
6, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, welches eine
immunstimulierende Wirkung aufweist, von dem Molekül B7.1
abgeleitet ist.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie:
(1) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein
Polypeptid, welches aus der Region E7 stammt, ein
Polypeptid, welches aus der Region L1 stammt, und ein Polypeptid,
welches aus der Region L2 eines Papillomavirus stammt,
enthält,
(2) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein
Polypeptid, welches aus der Region E7 stammt, ein
Polypeptid, welches aus der Region L1 stammt, ein Polypeptid,
welches aus der Region L2 eines Papillomavirus stammt, und
ein Polypeptid, welches vom Interleukin-2 abgeleitet ist,
enthält,
(3) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein
Polypeptid, welches aus der Region E7 stammt, ein
Polypeptid, welches aus der Region L1 stammt, ein Polypeptid,
welches aus der Region L2 eines Papillomavirus stammt, und
ein Polypeptid, welches von dem Molekül B7.1 abgeleitet
ist, enthält, oder
(4) ein Polypeptid, welches aus der Region E6 stammt, ein
Polypeptid, welches aus der Region E7 stammt, ein
Polypeptid, welches aus der Region L1 stammt, ein Polypeptid,
welches aus der Region L2 eines Papillomavirus stammt, ein
Polypeptid, welches von dem Molekül B7.1 abgeleitet ist,
und ein Polypeptid, welches vom Interleukin-2 abgeleitet
ist, enthält.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das
Papillomavirus unter den Typen HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 und/oder
HPV-45 ausgewählt wird.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder
Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors, verursacht durch
ein Papillomavirus, welche als therapeutische(n) Wirkstoff(e)
ein oder mehrere rekombinante Vektoren enthält, in den/die
DNA-Fragmente eingefügt sind, welche für:
(1) wenigstens ein Polypeptid, welches aus der frühen Region
eines Papillomavirus stammt, und wenigstens ein
Polypeptid, welches aus der späten Region eines Papillomavirus
stammt, kodieren, oder
(2) wenigstens ein Polypeptid, welches aus der frühen Region
eines Papillomavirus stammt, wenigstens ein Polypeptid,
welches aus der späten Region eines Papillomavirus stammt,
und wenigstens ein Polypeptid, welches eine
immunstimulierende Wirkung aufweist, kodieren,
wobei die DNA-Fragmente unter der Kontrolle von für ihre
Expression in einer Wirtzelle oder einem Wirtorganismus
notwendigen Elementen platziert sind.
11, Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptide die in den
Ansprüchen 2 bis 9 definierten Eigenschaften aufweisen.
12. Pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 10
oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor
ein viraler Vektor ist.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor von einem
Pockenvirus abgeleitet ist.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, dass das Pockenvirus ein
Kuhpockenvirus, ein Kanarienpockenvirus und/oder ein Geflügelpockenvirus
ist.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12
oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor
von einem Kuhpockenvirus des Stammes Kopenhagen, Wyeth
und/oder modifizierter Ankara (MVA) abgeleitet ist.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der
Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Elemente,
die für die Expression der für die Polypeptide kodierenden
DNA-Fragmente notwendig sind, einen Promotor eines
Kuhpockenvirusgens enthält, wobei es sich um den Promotor des Thymidinkinase(TK)-Gens,
7,5K-Gens, HSR-Gens und/oder K1L-Gens
handelt.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 15
oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor
von einem Kuhpockenvirus des Stammes Kopenhagen abgeleitet
ist, und dass die DNA-Fragmente, welche für die Polypeptide
kodieren, in den TK-Lokus und/oder den K1L-Lokus des
Kuhpockenvirus eingefügt sind.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 15
oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor
von einem Kuhpockenvirus des Stammes MVA abgeleitet ist, und
dass die DNA-Fragmente, welche für die Polypeptide kodieren,
auf Höhe eines der Ausschnittbereiche I, II, III, IV, V
und/oder VI des Kuhpockenvirus eingefügt sind.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der
Ansprüche 10 bis 18 zur Behandlung oder Vorbeugung einer
Infektion oder eines Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus,
dadurch gekennzeichnet, dass sie einen oder mehrere
rekombinante Vektoren enthält, der/die von einem Kuhpockenvirus
abgeleitet ist/sind, in den/die:
(1) wenigstens ein DNA-Fragment, welches für wenigstens ein
Polypeptid kodiert, welches aus der späten Region eines
Papillomavirus stammt, und ein DNA-Fragment, welches für
das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-
Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus
kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das Molekül
B7.1 kodiert,
(2) wenigstens ein DNA-Fragment, welches für wenigstens ein
Polypeptid kodiert, welches aus der späten Region eines
Papillomavirus stammt, und ein DNA-Fragment, welches für
das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-
Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus
kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das
Interleukin-2 kodiert,
(3) wenigstens ein DNA-Fragment, welches für wenigstens ein
Polypeptid kodiert, welches aus der späten Region eines
Papillomavirus stammt, und ein DNA-Fragment, welches für
das Protein E6 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-
Fragment, welches für das Protein E7 eines Papillomavirus
kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das Molekül B7.1
kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das
Interleukin-2 kodiert,
(4) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines
Papillomavirus kodiert, eine DNA-Fragment, welches für das
Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment
welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert,
und ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines
Papillomavirus kodiert,
(5) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines
Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das
Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment,
welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert,
ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines
Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das
Molekül B7.1 kodiert,
(6) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines
Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das
Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment,
welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert,
ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines
Papillomavirus kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das
Interleukin-2 kodiert, oder
(7) ein DNA-Fragment, welches für das Protein E6 eines
Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das
Protein E7 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment,
welches für das Protein L1 eines Papillomavirus kodiert,
ein DNA-Fragment, welches für das Protein L2 eines
Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das
Molekül B7.1 kodiert, und ein DNA-Fragment, welches für das
Interleukin-2 kodiert,
eingefügt sind.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der
Ansprüche 10 bis 18 zur Prävention einer Infektion oder eines
Tumors, verursacht durch ein Papillomavirus, dadurch
gekennzeichnet, dass sie ein oder mehrere rekombinante Vektoren
enthält, der/die von einem Kuhpockenvirus abgeleitet ist/sind,
und in den/die wenigstens ein DNA-Fragment, welches für
wenigstens ein Polypeptid kodiert, welches aus der frühen Region
eines Papillomavirus stammt, und:
(1) ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines
Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das
Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-
Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert,
(2) ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines
Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das
Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, und ein DNA-
Fragment, welches für das Interleukin-2 kodiert, oder
(3) ein DNA-Fragment, welches für das Protein L1 eines
Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment, welches für das
Protein L2 eines Papillomavirus kodiert, ein DNA-Fragment,
welches für das Interleukin-2 kodiert, und ein DNA-
Fragment, welches für das Molekül B7.1 kodiert, eingefügt
sind.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der
Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-
Fragmente unter der Kontrolle von unabhängigen oder
gemeinsamen Elementen platziert sind.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet, dass sie als therapeutische Wirkstoffe
einen ersten rekombinanten Vektor, in den ein oder mehrere
DNA-Fragmente, die für wenigstens ein Polypeptid kodieren,
welches aus der frühen Region eines Papillomavirus stammt, und
ein oder mehrere DNA-Fragmente, welche für wenigstens ein
Polypeptid kodieren, welches aus der späten Region eines
Papillomavirus stammt, eingefügt sind, und einen zweiten
rekombinanten Vektor, in den ein oder mehrere DNA-Fragmente eingefügt
sind, welche für ein Polypeptid kodieren, welches
immunstimulierende Wirkung aufweist, enthält.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 22,
dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Fragmente, welche in den
ersten Vektor eingefügt sind, für E6, E7, L1 und L2 kodieren,
und dass das DNA-Fragment, welches in den zweiten Vektor
eingefügt ist, für IL-2 kodiert.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen
pharmazeutisch geeigneten Träger enthält.
25. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 24 als Medikament zur Behandlung oder Vorbeugung
von Gebärmutterhalskrebs, einer Dysplasie des Halses niederen
Grads und einer Papillomavirus-Infektion.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9609584 | 1996-07-30 | ||
| FR9609584A FR2751879B1 (fr) | 1996-07-30 | 1996-07-30 | Composition pharmaceutique contre les tumeurs et infections a papillomavirus |
| PCT/FR1997/001412 WO1998004705A1 (fr) | 1996-07-30 | 1997-07-29 | Composition pharmaceutique contre les tumeurs et infections a papillomavirus |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69706825D1 DE69706825D1 (de) | 2001-10-25 |
| DE69706825T2 true DE69706825T2 (de) | 2002-05-02 |
| DE69706825T3 DE69706825T3 (de) | 2006-08-24 |
Family
ID=9494633
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69706825T Expired - Lifetime DE69706825T3 (de) | 1996-07-30 | 1997-07-29 | Pharmazeutische zusammensetzung gegen durch papillomaviren verursachte tumoren und infektionen |
| DE69728914T Expired - Lifetime DE69728914T2 (de) | 1996-07-30 | 1997-07-29 | Pharmazeutische Zusammensetzung gegen durch Papillomaviren verursachte Tumoren und Infektionen |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69728914T Expired - Lifetime DE69728914T2 (de) | 1996-07-30 | 1997-07-29 | Pharmazeutische Zusammensetzung gegen durch Papillomaviren verursachte Tumoren und Infektionen |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0862634B2 (de) |
| JP (2) | JP4070815B2 (de) |
| AT (2) | ATE265535T1 (de) |
| AU (1) | AU736720B2 (de) |
| CA (1) | CA2234263C (de) |
| DE (2) | DE69706825T3 (de) |
| DK (2) | DK1149910T3 (de) |
| ES (2) | ES2163795T5 (de) |
| FR (1) | FR2751879B1 (de) |
| HK (1) | HK1043809B (de) |
| PT (2) | PT1149910E (de) |
| WO (1) | WO1998004705A1 (de) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7494658B2 (en) | 1998-02-20 | 2009-02-24 | Medigene Ag | Papilloma virus truncated L1 protein and fusion protein constructs |
| US20020039584A1 (en) | 1998-02-20 | 2002-04-04 | Medigene Ag | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use |
| US7182947B2 (en) | 1998-02-20 | 2007-02-27 | Medigene Ag | Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs |
| CA2229955C (en) | 1998-02-20 | 2003-12-09 | Medigene Gmbh | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use |
| US6926897B1 (en) | 1998-03-24 | 2005-08-09 | Medigene Aktiengesellschaft | Medicament for the avoidance or treatment of papillomavirus-specific tumour |
| CA2335506A1 (en) * | 1998-06-26 | 2000-01-06 | Aventis Pasteur | Mucosal targeting immunisation |
| RU2489486C2 (ru) | 2006-06-20 | 2013-08-10 | Трансжене С.А. | Процесс получения поксвирусов и композиции поксвирусов |
| EP2382474B1 (de) | 2009-01-20 | 2015-03-04 | Transgene SA | Lösliches icam-1 als biomarker zur vorhersage einer therapeutischen antwort |
| WO2010108908A1 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Transgene Sa | Biomarker for monitoring patients |
| NZ594896A (en) | 2009-04-17 | 2013-07-26 | Transgene Sa | Biomarker for monitoring patients |
| US8445270B2 (en) | 2009-05-12 | 2013-05-21 | Transgene S.A. | Immortalized avian cell lines and use thereof |
| RU2552292C2 (ru) | 2009-07-10 | 2015-06-10 | Трансжене Са | Биомаркер для отбора пациентов и связанные с ним способы |
| IN2012DN01577A (de) | 2009-07-21 | 2015-06-05 | Transgene Sa | |
| TWI690322B (zh) | 2012-10-02 | 2020-04-11 | 法商傳斯堅公司 | 含病毒的調配物及其使用 |
| JP6655618B2 (ja) | 2014-12-01 | 2020-02-26 | トランジェーヌＴｒａｎｓｇｅｎｅ | 安定な液体ワクシニアウイルス処方物 |
| FR3042121A1 (fr) * | 2015-10-08 | 2017-04-14 | Jean-Marc Limacher | Composition anti-tumorale |
| JP2020519666A (ja) | 2017-05-15 | 2020-07-02 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． | 安定性のウイルス含有組成物 |
| CA3062549A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| EP3847246A1 (de) | 2018-09-06 | 2021-07-14 | Bavarian Nordic A/S | Pockenviruszusammensetzungen mit verbesserter lagerung |
| AU2021233167A1 (en) | 2020-03-12 | 2022-09-22 | Bavarian Nordic A/S | Compositions improving poxvirus stability |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2643817B1 (fr) * | 1989-03-06 | 1993-12-17 | Transgene Sa | Composition pharmaceutique, utile a titre preventif ou curatif contre les tumeurs induites par les papillomavirus |
| CA2038581A1 (en) † | 1990-03-20 | 1991-09-21 | Martin Muller | Seroreactive epitopes of human papillomavirus (hpv) 16 proteins |
| GB9113809D0 (en) * | 1991-06-26 | 1991-08-14 | Cancer Res Campaign Tech | Papillomavirus l2 protein |
| US7476389B1 (en) * | 1991-07-19 | 2009-01-13 | The University Of Queensland | Papillomavirus vaccines |
| US5618536A (en) * | 1992-09-03 | 1997-04-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Chimeric papillomavirus-like particles |
| GB9306731D0 (en) * | 1993-03-31 | 1993-05-26 | Cancer Res Campaign Tech | Vaccines |
| IL113817A (en) * | 1994-06-30 | 2001-03-19 | Merck & Co Inc | Polynucleotide for vaccination against the umbilical cord virus |
| CA2201592A1 (en) * | 1994-10-03 | 1996-04-18 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secre Tary, Department Of Health And Human Services | Enhanced immune response by introduction of cytokine gene and/or costimulatory molecule b7 gene in a recombinant virus expressing system |
| GB9505784D0 (en) * | 1995-03-22 | 1995-05-10 | Lynxvale Ltd | Anti-tumour treatment |
| FR2749323B1 (fr) * | 1996-06-04 | 1998-07-10 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Pseudo-particules virales utiles en tant que vecteur de delivrance d'acide nucleique |
-
1996
- 1996-07-30 FR FR9609584A patent/FR2751879B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-07-29 WO PCT/FR1997/001412 patent/WO1998004705A1/fr active IP Right Grant
- 1997-07-29 DK DK01109013T patent/DK1149910T3/da active
- 1997-07-29 DE DE69706825T patent/DE69706825T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-29 PT PT01109013T patent/PT1149910E/pt unknown
- 1997-07-29 AT AT01109013T patent/ATE265535T1/de active
- 1997-07-29 ES ES97935646T patent/ES2163795T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-29 DE DE69728914T patent/DE69728914T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-29 AU AU38552/97A patent/AU736720B2/en not_active Ceased
- 1997-07-29 DK DK97935646T patent/DK0862634T4/da active
- 1997-07-29 AT AT97935646T patent/ATE205881T1/de active
- 1997-07-29 JP JP50856898A patent/JP4070815B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-29 CA CA002234263A patent/CA2234263C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-29 PT PT97935646T patent/PT862634E/pt unknown
- 1997-07-29 EP EP97935646A patent/EP0862634B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-29 ES ES01109013T patent/ES2215805T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-29 EP EP01109013A patent/EP1149910B1/de not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-04-30 HK HK02103266.9A patent/HK1043809B/zh not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-03-30 JP JP2007092639A patent/JP4198735B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1998004705A1 (fr) | 1998-02-05 |
| HK1043809A1 (en) | 2002-09-27 |
| DK0862634T3 (da) | 2002-01-21 |
| FR2751879B1 (fr) | 1998-10-30 |
| EP0862634B1 (de) | 2001-09-19 |
| HK1043809B (zh) | 2004-12-03 |
| DK1149910T3 (da) | 2004-08-02 |
| DK0862634T4 (da) | 2006-05-08 |
| DE69728914D1 (de) | 2004-06-03 |
| ES2163795T5 (es) | 2006-07-16 |
| JP4198735B2 (ja) | 2008-12-17 |
| ATE205881T1 (de) | 2001-10-15 |
| CA2234263C (fr) | 2009-10-13 |
| ES2163795T3 (es) | 2002-02-01 |
| PT862634E (pt) | 2002-03-28 |
| JP2000500662A (ja) | 2000-01-25 |
| DE69728914T2 (de) | 2005-04-07 |
| JP4070815B2 (ja) | 2008-04-02 |
| DE69706825T3 (de) | 2006-08-24 |
| CA2234263A1 (fr) | 1998-02-05 |
| AU736720B2 (en) | 2001-08-02 |
| EP0862634A1 (de) | 1998-09-09 |
| EP0862634B2 (de) | 2006-03-01 |
| ATE265535T1 (de) | 2004-05-15 |
| EP1149910A1 (de) | 2001-10-31 |
| EP1149910B1 (de) | 2004-04-28 |
| JP2007254474A (ja) | 2007-10-04 |
| FR2751879A1 (fr) | 1998-02-06 |
| DE69706825D1 (de) | 2001-10-25 |
| ES2215805T3 (es) | 2004-10-16 |
| PT1149910E (pt) | 2004-09-30 |
| AU3855297A (en) | 1998-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69706825T2 (de) | Pharmazeutische zusammensetzung gegen durch papillomaviren verursachte tumoren und infektionen | |
| DE69826661T2 (de) | Antitumorale zusammenstellung von immunogene polypetiden mit veränderter zellokalisierung | |
| US7670607B2 (en) | Pharmaceutical compositions for treating papillomavirus tumors and infection | |
| DE60016765T2 (de) | Synthetische papillomavirus gene, welche für expression in menschlichen zellen optimiert sind | |
| DE69002325T2 (de) | Pharmazeutische zusammensetzung zur verhütung oder heilung von durch den papillomavirus induzierten tumoren. | |
| DE69931391T2 (de) | Trans-aktivierung und cis-aktivierung um die dauer der expression eines transgens zu modulieren | |
| WO1996011272A2 (de) | Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung | |
| DE60314541T2 (de) | Mindestens zwei ati promotoren enthaltendes rekombinantes pockenvirus | |
| DE602004009743T2 (de) | Promotoren zur Expression in modifiziertem Vaccinia Virus Ankara | |
| DE60129358T2 (de) | Genetische immunisierung gegen zervixkarzinom | |
| DE60302848T2 (de) | Expression von genen im modifizierten vaccinia virus ankara durch verwendung eines cowpox ati promoter | |
| DE10059631A1 (de) | T-Zellepitope des Papillomavirus L1-und E7-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie | |
| EP1181381B1 (de) | Organ-, gewebs- und zellspezifisches immuntherapeutikum für chronische virale infektionen, sowie entzündliche, degenerative und proliferative erkrankungen insbesondere der leber sowie krebs auf der basis von rekombinantem parapoxvirus | |
| EP1064014B1 (de) | Arzneimittel zur vermeidung oder behandlung von papillomavirus-spezifischem tumor | |
| EP1188834B1 (de) | Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression des HER-2/neu-Gens | |
| AU781653B2 (en) | Pharmaceutical composition for treating papollomavirus tumour and infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8363 | Opposition against the patent | ||
| 8366 | Restricted maintained after opposition proceedings |