ES2215805T3 - Composicion farmaceutica para el tratamiento de los tumores e infecciones por papilomavirus. - Google Patents
Composicion farmaceutica para el tratamiento de los tumores e infecciones por papilomavirus.Info
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Abstract
Composición farmacéutica destinada al tratamiento o a la prevención de una infección o tumor por papilomavirus que, a título de agentes terapéuticos, consiste en uno o diversos polipéptido(s) originario (s) de una región precoz de un papilomavirus y en uno o diversos polipéptido(s) que presentan una actividad inmunoestimuladora seleccionado(s) de entre el grupo constituido por la interleucina-2.
Description
Composición farmacéutica para el tratamiento de
los tumores e infecciones por papilomavirus.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica destinada al tratamiento o a la prevención
de las lesiones asociadas a los papilomavirus y, más
particularmente, a los papilomavirus humanos (HPV) del tipo 16, 18,
31, 33 y 45.
Los papilomavirus son unos virus de ADN que
presentan un genoma circular de aproximadamente 7900 pares de bases
envuelto por una cápsida proteica. Se ha identificado un determinado
número de tipos de papilomavirus bovinos (BPV), humanos (HPV) y se
ha secuenciado su genoma (Pfister, 1987, in The papovaviridae:
The Papillomaviruses (edición Salzman y Howley) Plenum Press,
New York, p 1-38). Comprende una región precoz y una
región tardía. La región tardía contiene dos marcos de lectura L1 y
L2 que codifican para los componentes mayores de la cápsida. La
región precoz contiene por lo menos los marcos de lectura E1, E2,
E4, E5, E6 y E7. Los productos de expresión E1 y E2 regulan la
replicación viral y la expresión de los genes virales mientras que
los de las regiones E5, E6 y E7 están implicados en los procesos de
transformación oncogénica de las células infectadas. En efecto, se
ha demostrado experimentalmente que la proteína E5 de
BPV-1 puede transformar in vitro unas células
(Schlegel et al., 1986, Science 233,
464-467). Las proteínas E6 de BPV y E7 de
HPV-16 están implicadas en la inducción y el
mantenimiento de la transformación oncogénica. Se ha demostrado el
poder transformante de E7 para HPV-16 y
HPV-18 (Kanda et al., 1988, J. Virol.
62, 610-613 ; Vousden et al., 1988,
Oncogene Res. 3, 1-9 ; Bedell et al.,
1987, J. Virol. 61, 3635-3640). No se ha
puesto de manifiesto ninguna función para E4.
En los humanos, los HPV se asocian a unas
patologías que van desde la infección benigna de la piel a las
verrugas y a los tumores malignos. Dichos virus son altamente
específicos de los epitelios de la epidermis de las vías genitales,
orales y respiratorias. Los datos epidemiológicos sugieren
fuertemente el papel de determinadas cepas en el cáncer del cuello
de útero y de las vías bajas, en particular los
HPV-16 y 18 y en un grado menor los
HPV-31, 33 y 45. El cáncer de cuello de útero es la
segunda causa de muerte de cáncer femenino en el mundo. Según la
OMS, se catalogan unos 460000 casos nuevos cada año de los que al
menos 200000 casos están claramente asociados a los HPV. Toda una
serie de estudios demuestra el papel transformante de dichos virus,
su integración específica en el genoma de células neoplásicas, su
actividad genética en las células cancerosas y la importancia de la
expresión de los genes precoces E6 y E7 en el mantenimiento del
fenotipo maligno de las células neoplásicas HPV positivas
(Monsenego, J. Impact Medecin, 11 marzo de 1994).
Las patologías asociadas a los HPV causan un
problema terapéutico debido a su naturaleza persistente y
recurrente. Se han utilizado con anterioridad numerosos enfoques en
el tratamiento de dichas enfermedades como la cirugía, la
quimioterapia, los agentes antivirales y la inmunoterapia.
Con respecto a ello, la patente europea EP 0 462
187 describe un enfoque de vacunación utilizando los genes precoces
de los papilomavirus para establecer una inmunidad frente a unos
tumores resultantes de la integración del genoma HPV en el ADN
celular y en los que las proteínas de la cápsida ya no se
expresan. La solicitud WO 93/02184 presenta un enfoque terapéutico
basado en la utilización de los antígenos de la cápsida a título de
agentes inmunógenos. Dichos documentos no sugieren la posibilidad de
asociar el efecto preventivo suministrado por los polipéptidos
precoces y el efecto curativo conferido por los polipéptidos tardíos
de los papilomavirus para generar unas composiciones adaptadas al
conjunto de las patologías graves debidas a los HPV. Por otra
parte, a lo largo de los últimos años, se ha propuesto utilizar unos
polipéptidos que presentan una actividad inmunoestimuladora con el
fin de activar las células T con un resultado más o menos
beneficioso según las patologías diana (ver, por ejemplo, el
documento WO 96/11279).
La presente invención se refiere más precisamente
a una preparación basada en una mezcla de antígenos originarios de
las regiones precoces y tardías de un papilomavirus o un vector que
las expresa simultáneamente, con el fin de establecer una inmunidad
duradera contra unas células infectadas. Las vacunas candidatas
propuestas en el marco de la presente invención se pueden utilizar
a título preventivo (inmunoprofilaxis) para limitar el desarrollo o
la propagación de la infección viral a los tejidos vecinos o a
título curativo (inmunoterapia) para impedir o reducir una evolución
tumoral en los pacientes infectados. La utilización de los antígenos
de la cápsida inducirá la producción de anticuerpos contra los
epítopos antigénicos localizados en la superficie de las partículas
virales impidiendo que la infección se establezca de forma duradera.
La utilización de las proteínas precoces permitirá inducir una
inmunidad contra unas células infectadas después de la integración
del ADN viral.
La presente invención proporciona asimismo una
preparación que asocia un polipéptido originario de un papilomavirus
y una molécula inmunoestimuladora: Una de las ventajas de tal
composición es que combina la inmunidad específica inducida por los
antígenos virales y la inmunidad no específica inducida por la
molécula inmunoestimuladora y destinada a reforzar la respuesta
específica.
La presente invención proporciona asimismo una
preparación que asocia un polipéptido originario de un papilomavirus
y una molécula inmunoestimuladora. Una de las ventajas de dicha
composición es que combina la inmunidad específica inducida por los
antígenos virales y la inmunidad no específica inducida por la
molécula inmunoestimuladora y destinada a reforzar la respuesta
específica.
El objetivo de la presente invención es poner a
disposición del público unas composiciones farmacéuticas que
permiten el tratamiento de las infecciones por HPV y más
particularmente las patologías graves tales como el cáncer de cuello
de útero, de una eficacia mejorada en relación con las composiciones
de la técnica anterior.
Por esta razón la presente invención tiene como
objeto una composición farmacéutica destinada al tratamiento o a la
prevención de una infección o tumor por papilomavirus que, a título
de agentes terapéuticos, consiste en uno o diversos
polipéptido(s) originario(s) de una región precoz de
un papilomavirus y en uno o diversos polipéptido(s) que
presentan una actividad inmunoestimuladora seleccionado(s)
de entre el grupo constituido por la
interleucina-2, la interleucina-7 y
las moléculas de la adhesión B7.1 y B7.2.
De forma general, el término "polipéptido"
hace referencia a todo o parte del polipéptido nativo, a un
polipéptido quimérico que resulta de la fusión de secuencias de
orígenes diferentes o a una variante caracterizada por al menos una
mutación (delección, inserción y/o sustitución) de un aminoácido. De
forma más particular, un polipéptido utilizado en el marco de la
presente invención presenta principalmente una secuencia de
aminoácidos cuyo grado de similitud con la secuencia de la proteína
nativa es superior al 75%, ventajosamente, superior al 85% y,
preferentemente, superior al 95%. El grado de similitud se puede
calcular fácilmente con la ayuda de un programa de ordenador
adecuado o alineando las secuencias de forma que se obtiene el grado
máximo de homología y contabilizando el número de posiciones en las
que los aminoácidos de las dos secuencias resultan idénticos con
respecto al número total de posiciones. La secuencia de los genomas
de HPV-16 y HPV-18 se divulga en el
Genebank con los números de acceso K02718 y X05016,
respectivamente.
Tal como se ha descrito anteriormente, el genoma
de los virus de la familia de los papilomavirus, en particular BPV y
HPV, codifica para por lo menos 8 polipéptidos, dos polipéptidos
tardíos L1 y L2 que componen la cápsida viral y 6 polipéptidos
precoces (E1, E2, E4, E5, E6 y E7) implicados en la regulación, el
mantenimiento del genoma viral y la transformación de las células
infectadas.
A pesar de que el conjunto de las proteínas
precoces de un papilomavirus se pueda utilizar en el marco de la
presente invención, se selecciona ventajosamente utilizar un
polipéptido derivado de la proteína E6, de la proteína E7 o de las
proteínas E6 y E7. Se puede recurrir ventajosamente a una variante
no oncogénica mutada a nivel de las regiones implicadas en el
proceso de transformación de las células infectadas. Tales
variantes están descritas en la literatura (Munger et al.,
1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Crook et
al., 1991, Cell 67, 547-556; Heck et
al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
4442-4446; Phelps et al., 1992, J. Virol.
66, 2418-2427).
Un polipéptido preferido originario de la región
tardía de un papilomavirus deriva de la proteína L1, de la proteína
L2 o de las proteínas L1 y L2.
Por el término "inmunoestimuladora", se
entiende la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria humoral
activando los linfocitos B con el fin de amplificar la producción de
anticuerpos dirigidos contra los antígenos de los papilomavirus o de
estimular una respuesta inmunitaria de mediación celular activando
los linfocitos T con el fin de disparar una respuesta citotóxica
significativa contra las células tumorales o infectadas por un
papilomavirus. A título indicativo, la inmunoestimulación se puede
evaluar en un modelo animal (mediante la comparación de la tasa de
rechazo en un animal al que se ha implantado un tumor que expresa el
antígeno diana, en presencia o en ausencia del inmunoestimulador).
De una forma más general, los medios para poner de manifiesto una
inmunoestimulación se indican en Roitt (en Inmunology, 4ª
edición, Moby Ltd.).
Se puede utilizar una molécula inmunoestimuladora
nativa tal como la que se encuentra en un mamífero y, en particular
en los humanos, una parte de la misma, una molécula quimérica
procedente de la fusión de secuencias de orígenes diversos o un
mutante, sin embargo, con la condición de que conserve la función
inmunoestimuladora. De entre todas las moléculas previsibles, se
preferirá emplear un polipéptido constituido por o derivado de la
interleucina-2, de la
interleucina-7, y de las moléculas de
co-adhesión B7.1 y B7.2, la
interleucina-2 y la molécula B7.1 son
particularmente preferidas en el marco de la presente invención.
Una composición preferida según la invención
comprende:
- (1)
- un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7 de un papilomavirus y un polipéptido derivado de la interleucina-2,
- (2)
- un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7 de un papilomavirus y un polipéptido derivado de la molécula B7.1,
- (3)
- un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7 de un papilomavirus, un polipéptido derivado de la molécula B7.1 y un polipéptido derivado de la interleucina-2.
Teniendo en cuenta las observaciones indicadas
anteriormente sobre la frecuencia de infección por determinados
tipos de HPV en los casos de cáncer de cuello de útero, una
composición según la invención comprende un polipéptido originario
de un papilomavirus de riesgo, del tipo HPV-16,
HPV-18, HPV-31,
HPV-33 y/o HPV-45 y en particular
del virus HPV-16. Por supuesto, en el caso en el que
la composición incluya diversos antígenos de papilomavirus, dichos
antígenos pueden ser de un origen común o diferente.
De forma general, un polipéptido originario de un
papilomavirus o que presenta una actividad inmunoestimuladora se
puede producir mediante los métodos convencionales de síntesis
química o bien mediante las técnicas del ADN recombinante (ver por
ejemplo Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Más
particularmente, un procedimiento de preparación comprende el
cultivo una célula transformada mediante un fragmento de ADN
codificante para el polipéptido en cuestión para generar una célula
productora y la recuperación de dicho polipéptido a partir del
cultivo. La célula productora puede ser de un origen cualquiera y
sin limitaciones, una bacteria, una levadura o bien una célula de
mamífero, en la medida en que el fragmento de ADN considerado está o
bien integrado en su genoma o bien integrado en un vector de
expresión adecuado sea capaz de replicarse. Por supuesto, el
fragmento de ADN se sitúa bajo el control de señales de
transcripción y de traducción que permiten su expresión en la célula
productora. Los vectores de expresión y las señales de control son
conocidos por la persona experta en la técnica.
La presente invención se refiere asimismo a una
composición farmacéutica destinada al tratamiento o a la prevención
de una infección o tumor por papilomavirus que, a título de
agente(s) terapéutico (s), consiste en uno o diversos vector
(es) recombinante(s) en el/los que se insertan unos
fragmentos de ADN codificante para uno o diversos
polipéptido(s) originario (s) de una región precoz de un
papilomavirus y uno o diversos polipéptido(s) que presentan
una actividad inmunoestimuladora seleccionado(s) entre el
grupo constituido por la interleucina-2, la
interleucina-7 y los moléculas de
co-adhesión B-7.1 y
B-7-2. Dichos fragmentos de ADN se
sitúan bajo el control de los elementos necesarios para su
expresión en una célula o un organismo huésped.
Según dicha alternativa por otra parte preferida,
el agente terapéutico es un vector en el que se han insertado los
fragmentos de ADN codificantes para los polipéptidos originarios de
un papilomavirus o inmunoestimuladores tales como se han definido
anteriormente. Dicho tipo de composición presenta la ventaja de una
producción económica y de una gran estabilidad en unas condiciones
ambientales variadas. En particular, las condiciones de conservación
son menos estrictas.
Los fragmentos de ADN codificante para un
polipéptido originario de un papilomavirus se pueden obtener por
clonaje, por PCR (Polymerase Chain Réaction) o por síntesis química
según las técnicas convencionales comúnmente utilizadas a partir de
células papilomavirus obtenidas de los pacientes o de
colecciones.
El gen codificante para un polipéptido que
presenta una actividad inmunoestimuladora se puede asimismo aislar
según las técnicas estándar a partir del genoma de una célula (tipo
genómico) o de los ARN mensajeros de una célula en la que se expresa
(tipo ADN complementario). Por otra parte, el gen en cuestión puede
codificar para (i) una molécula soluble, sea intracelular o bien
secretada en el medio exterior o (ii) una molécula anclada en la
membrana y por lo tanto presente en la superficie de las células
que la expresan.
Un vector recombinante preferido en el marco de
la presente invención es un vector viral en cuyo genoma se han
insertado los fragmentos de ADN citados anteriormente de forma que
permite su transferencia y su expresión en una célula o en un
organismo huésped. Un vector viral que se puede emplear en el marco
de la presente invención, se puede derivar principalmente de un
poxvirus, de un adenovirus, de un retrovirus, de un virus del herpes
o de un virus asociado al adenovirus. Ventajosamente, se tratará de
un vector no integrador y de una virulencia atenuada. Tales vectores
así como sus técnicas de preparación son conocidas por la persona
experta en la técnica.
En el caso en el que se emplea un vector
adenoviral, se recurrirá preferentemente a un vector no replicativo
por delección de las regiones esenciales para la replicación y,
principalmente, la mayor parte de la región E1 con el fin de evitar
su propagación en el interior del organismo huésped o en el entorno.
Se entiende que se pueden modificar o delecionar otras regiones del
genoma adenoviral, en la medida en que las funciones esenciales
defectivas se complementen en trans. Un vector adenoviral
preferido según la invención retendrá las secuencias esenciales para
la encapsidación, a saber los ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5' y
3' y la región de encapsidación. Los diferentes vectores
adenovirales así como sus técnicas de preparación son convencionales
y están descritos en Graham y Prevect (1991, en Methods in
Molecular Biology, vol. 7, p 109-128; Ed: E.J.
Murey; The Human Press Inc.) y la solicitud internacional WO
94/28152. Si se trata de un retrovirus, se conservan los LTRs (Long
Terminal Repeat) y las secuencias de encapsidación (ver por ejemplo
Naviaux y Verma, 1992, Current Opinion in Biotechnology 3,
540-547).
Según una forma de realización ventajosa, un
vector viral recombinante según la invención derivado de un poxvirus
y, principalmente, de un poxvirus aviario, tal como el poxvirus del
canario, de un fowlpox o de un virus de la viruela vacuna, se
prefiere dicho último. De entre todos los virus de las vacunas
considerados en el marco de la presente invención, se seleccionan
preferentemente las cepas Copenhague, Wyeth y Ankara modificada
(MVA para Modified Vaccinia Virus Ankara). Las condiciones generales
de obtención de un virus de la viruela vacuna capaz de expresar un
gen heterólogo se muestran en la patente europea EP 83 286 y la
solicitud EP 206 920. En cuanto al virus MVA, resulta más
particularmente descrita en (Mayr et al., 1975, Infection
3, 6-14; Sutter y Moss, 1992, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89, 10847-10851).
Por supuesto, en el marco de la presente
invención, los fragmentos de ADN se sitúan bajo el control de los
elementos necesarios para su expresión. Dichos elementos incluyen
los elementos adecuados de regulación de la transcripción así como
de las señales de inicio y de terminación de la traducción. El
promotor reviste una importancia particular. De forma general, se
recurrirá a un promotor funcional en el organismo o la célula
huésped que se quiere tratar y adaptarlo al vector empleado. Además,
se puede modificar de forma que contenga unas secuencias
reguladoras, por ejemplo un elemento activador de la transcripción o
de las secuencias que responden a determinadas señales celulares.
Con respecto a esto, puede resultar ventajoso utilizar un promotor
tejido-específico ya que las lesiones asociadas a
los papilomavirus están localizados a nivel de las vías genitales o
bien un promotor que responde a unas señales específicamente
tumorales (por ejemplo activado en presencia de factores de
crecimiento generalmente sobre-expresados por las
células tumorales) con el fin de limitar la expresión sólo a las
células tumorales.
De entre los promotores considerados en el marco
de la invención, se pueden citar los promotores SV40 (Virus Simian
40), HMG
(Hydroxy-Methyl-Glutaryl-coenzyme
A), TK (Timidina kinasa) , CMV (cytomegalovirus), RSV (Rous Sarcoma
Virus), el MLP (Amjor Late Promoter) del adenovirus adaptados a los
vectores adenovirales y el LTR del Mo-MLV (Moloney
Murine Leukemia Virus) más específicos para los vectores
retrovirales. Cuando el vector deriva de un poxvirus,
preferentemente el promotor será el promotor de un gen del poxvirus
utilizado, por ejemplo el promotor del gen codificante para la
proteína 7,5K, H5R, TK o K1L del virus de la viruela vacuna. Dichos
últimos están descritos en la literatura y se pueden clonar a partir
del genoma viral mediante las técnicas clásicas.
Por otra parte, los elementos necesarios para la
expresión pueden asimismo presentar unas secuencias que mejoran la
expresión o el mantenimiento en la célula huésped (intrón,
secuencia señal, secuencia terminal de la transcripción, sitio de
inicio de la traducción, secuencias que modifican la presentación
del polipéptido a las células del sistema inmunitario del huésped,
...). Sin embargo, tratándose de un vector derivado de un poxvirus,
se evitará el empleo de intrones.
Una composición según la invención se puede
obtener o bien con diversos vectores recombinantes expresando cada
uno de ellos un polipéptido determinado o bien con un solo vector
expresando los fragmentos de ADN correspondientes a los polipéptidos
seleccionados colocados bajo el control de los elementos
independientes o comunes. Según dicha última opción, se puede
recurrir a unas secuencias que permiten iniciar la traducción de una
forma interna (IRES) o a unas fusiones en fase de los diferentes
genes.
Las condiciones generales de obtención de un
vector recombinante utilizado en la presente invención se describen
ampliamente en el estado de la técnica. Tratándose de un vector
poxviral, se puede referir a la patente europea EP 83 286 cuyo
contenido se incorpora en la presente memoria como referencia.
Dichas condiciones son aplicables a los otros virus aceptables como
vector que presentan una región genómica no esencial en la que los
bloques de expresión pueden estar incorporados. Por supuesto, se
pueden insertar en el mismo locus o en un locus diferente. Por
ejemplo, cuando se utiliza un virus de la viruela vacuna de la cepa
Copenhague, el sitio de inserción es el locus TK y/o el locus K1L.
La inserción a nivel del gen viral TK tiene como efecto inactivarlo
y de este modo facilitar la selección de los recombinantes. En el
marco de un virus de la viruela vacuna de la cepa MVA, la inserción
de los genes de papilomavirus e inmunoestimuladores se puede llevar
a cabo en el seno de una de las escisiones I a VI y,
preferentemente, la zona de escisión II o III (Meyer et al.,
1991, J. Gen. Virol., 72 , 1031-1038; Sutter
et al., 1994, Vaccine 12,
1032-1040).
Según los fines buscados por la presente
invención, un vector recombinante puede además incluir un bloque de
expresión de un gen marcador de selección con el fin de facilitar
las etapas de aislamiento y de purificación del virus recombinante.
Se puede citar principalmente el gen Neo que confiere la
resistencia al antibiótico G418, el gen Pac de resistencia a
la purimicina, el gen TK del virus simplex de tipo I
(HSV-1) que confiere la sensibilidad a determinados
análogos de nucleósidos tales como el ganciclovir o el aciclovir,
los genes bacterianos LacZ que codifican para la
\beta-galactosidasa y gus A que codifica
para la \beta-glucuronidasa. Dichos dos últimos
marcadores enzimáticos permiten localizar los virus recombinantes
por coloración en presencia de los sustratos X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido)
y XglcA
(5-bromo-6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucorónido)
respectivamente.
Una composición farmacéutica según la invención
con vistas al tratamiento o la prevención de una infección o tumor
por papilomavirus, comprende uno o diversos vector(es)
recombinante (s) derivados de un virus de la viruela vacuna de la
cepa Copenhague o MVA en el/los que se insertan:
- (1)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1,
- (2)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2,
- (3)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1, y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2.
En cambio, una composición farmacéutica según la
invención más particularmente destinada a unos fines de
inmunoprofilaxis, comprende uno o diversos vector(es)
recombinante (s) derivado (s) de un virus de la viruela vacuna de la
cepa Copenhague o MVA en el/los que se insertan:
- (1)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la molécula B 7.1,
- (2)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina -2,
- (3)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2, y un fragmento de ADN que codifica para la molécula B 7.1.
Una composición según la invención se puede
preparar según los procedimientos conocidos en el campo de las
vacunas y las dosis aplicables pueden variar en una gama amplia.
Están en función principalmente de los polipéptidos y del virus
empleados, de la patología a tratar, del estado del paciente y de
otros parámetros que pueden ser evaluados por un médico. Sin
embargo, en general, la dosis de virus por kilo será de 10^{4} a
10^{11}, ventajosamente de 10^{6} a 10^{10} y, preferentemente
de 10^{7} a 10^{9} unidades formantes de las colonias (pfu)
cuando el agente terapéutico es un vector viral y de 0,05 a 500 mg,
ventajosamente de 0,5 a 200 mg y, preferentemente de 1 a 100 mg
cuando el agente terapéutico es de origen polipeptídico.
Una composición según la presente invención se
puede administrar según cualquier vía de administración
convencional, en particular por vía intravenosa, intramuscular,
subcutánea o sub-epitelial o bien por
escarificación. En el caso de un tumor accesible, resulta asimismo
posible recurrir a una inyección directa en el sitio o próximo al
tumor o mediante una aplicación tópica. A título de vacuna, una
composición según la invención se puede administrar según las
prácticas habituales en el campo , por ejemplo en una dosis única o
repetida una o diversas veces después de un determinado intervalo de
tiempo. Por otra parte en el marco de un tratamiento curativo, se
puede administrar frecuentemente durante un periodo de tiempo
suficiente para que el tratamiento sea eficaz. Cuando el agente
terapéutico es un vector viral, dicho virus está preferentemente en
forma viva. Tratándose de un vector poxviral, se preferirá utilizar
una cepa atenuada como la cepa MVA o la cepa Copenhague timidina
quinasa negativa. Por último, un vector viral recombinante se puede
atenuar mediante un tratamiento químico adecuado conocido por la
persona experta en la materia. Sin embargo, se puede asimismo prever
la inyección de un vector recombinante muerto.
Según una forma de realización preferida, una
composición farmacéutica según la invención comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de un vector recombinante en asociación con
un soporte aceptable desde un punto de vista farmacéutico. El
soporte se selecciona de modo que permita su administración por
inyección en los humanos o en animales. Puede asimismo comprender un
vehículo, un diluyente y/o un adyuvante y presentarse en forma
líquida o liofilizada.
La presente invención se refiere asimismo a una
composición farmacéutica según la invención, a título de medicamento
para el tratamiento o la prevención del cáncer del cuello de útero,
de una displasia del cuello de bajo grado y de una infección por
papilomavirus.
Por último, la presente invención se refiere
asimismo a un método de tratamiento o de prevención de las
patologías citadas anteriormente, según el que se administra a un
individuo que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz desde
un punto de vista farmacéutico de una mezcla de polipéptido o de un
vector recombinante utilizado en la presente invención.
La presente invención se ilustra haciendo
referencia a las Figuras siguientes.
La Figura 1 es una representación esquemática del
vector pTG5021 que permite la transferencia al locus TK de la
viruela vacuna Copenhague de los genes tardíos L1 y L2 de
HPV-16 situados bajo el control del promotor 7,5 K,
los dos casetes se encuentran en orientación opuesta uno en relación
con el otro.
La Figura 2 es una representación esquemática del
vector pTG5065 que permite la transferencia al locus K1L de la
viruela vacuna Copenhague de los genes precoces E6 y E7 de
HPV-16 situados bajo el control del promotor pH5R
(los dos casetes se encuentran en orientación opuesta uno en
relación con el otro), del gen IL-2 humano (IL2h)
situado bajo el control del promotor p7,5K y del gen marcador LacZ
(btaGAL) situado bajo el control del promotor pK1L.
La Figura 3 ilustra de forma esquemática la
estrategia que se puede emplear para introducir los genes tardíos L1
y L2 de HPV-16 en el seno de la zona de exclusión II
de un virus de la viruela vacuna MVA, los brazos de recombinación
izquierdo y derecho están indicados (BRG2 y BRD2)
respectivamente.
La presente invención se describe de forma más
completa, sin por ello limitarse, con la ayuda de los ejemplos
siguientes.
Las construcciones descritas a continuación se
realizan según las técnicas generales de ingeniería genética o de
clonaje molecular, detallados en Maniatis et al., (1989,
supra) o según las recomendaciones del fabricante cuando se
utiliza un equipo comercial. La mutagénesis dirigida in vitro
mediante unos oligonucleótidos sintéticos se lleva a cabo con la
ayuda de un equipo distribuido por Amersham. Las técnicas de
amplificación por PCR son conocidas por la persona experta en la
técnica (ver por ejemplo PCR Protocols-A guide to
methods and applications, 1990, editado por Innis, Gelfand, Sninsky
y White, Academic Press Inc.). Tratándose de la reparación de los
sitios de restricción, la técnica empleada consiste en un llenado de
los extremos 5' protuberantes con la ayuda del fragmento mayor de la
ADN polimerasa I de E. coli (Klenow).
Las etapas de clonaje, los bacteriófagos M13
recombinantes se multiplican sobre la cepa E. coli NM522
(Stratagene) en un medio mínimo de agarosa (agar 7,5%) o en un medio
rico LBM líquido. Los plásmidos recombinantes que presentan el gen
de resistencia a la ampicilina se replican en las cepas de E.
coli C600 (Stratagene), BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol.
166, 557-580) y NM522 sobre medio de agarosa
o líquido con un suplemento de 100 \mug/ml de antibiótico. Se
utiliza preferentemente la cepa BJ5183 cuando el clonaje se lleva a
cabo por recombinación homóloga (Bubeck et al., 1993, Nucleic
Acid Res. 21, 3601-3602).
La construcción de los virus de la viruela vacuna
recombinantes se realiza según la tecnología clásica en el marco
divulgado en los documentos descritos anteriormente y en Mackett
et al., (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,
7415-7419) y Mackett et al. (1984, J. Virol.
49, 857-864).
Los fragmentos que codifican para las proteínas
L1 y L2 se aíslan mediante PCR a partir de un ADN genómico de las
células Caski (ATCC 1550) según los métodos generales de la técnica.
El fragmento de amplificación que presenta las secuencias L1 se
encuentra sub-clonado en el vector M13TG130 (Kieny
et al., 1983, Gene 26, 91-99) para
proporcionar la construcción M13TG8171. La secuencia del gen L1
clonado revela diversas mutaciones en relación con la secuencia
contenida en Genebank (acceso K02718): C en lugar de una A en
posición 248, C en lugar de una A en posición 253, G en lugar de una
A en posición 537, G en lugar de una C en posición 682, G en lugar
de una A en posición 874, inserción de un triplete ACT en posición
1393, delección de un triplete GAT en posición 1390. La inserción
del fragmento de PCR que presenta las secuencias L2 en el vector
M13TG6131 conduce a M13TG9126. Se enumeran 5 mutaciones puntuales en
relación con la secuencia divulgada en Genebank: C en lugar de una T
en posición 378, A en lugar de una G en posición 691, A en lugar de
una G en posición 702, G en lugar de una A en posición 990 y C en
lugar de una A en posición 1092. A título indicativo, el vector
M13TG6131 deriva de M13TG131 (Kieny et al., 1983,
supra) mediante la mutación del sitio BglII interno
situado fuera de los múltiples sitios de clonaje.
El gen que codifica para la proteína L1 se
modifica por creación de un sitio BglII anterior al ATG
iniciador. El gen mutado se escinde del vector anterior (M13TG8185)
mediante digestión BglII-SacI y se inserta entre los
sitios BamHI y SacI del pTG186-poly.
La construcción resultante se denomina pTG4019. El vector de
transferencia pTG186-poly se describe con detalle en
la patente francesa 2 583 429. Presenta 10 sitios de restricción
para la inserción del gen a transferir y el promotor p7,5K para el
control de su expresión.
El gen que codifica para la proteína L2 se aísla
de M13TG9126 mediante digestión BglII-HindIII y
posteriormente se clona entre los sitios BamHI y
HindIII en 3' del promotor 7,5K. Se obtiene M13TG9127 en el
que se introduce por mutagénesis localizada en un sitio SalI
antes del promotor. El bloque de expresión
"p7,5K-gen L2" se aísla del vector mutado
M13TG9129 y se clona en el sitio SacI del vector de
transferencia pTG4019 de tal manera que los dos casetes
p7,5K-L1 y p7,5K-L2 se encuentren en
orientación inversa. La construcción obtenida de este modo pTG5021
está representada en la Figura 1. Los bloques de expresión se
transfieren al genoma del virus de la viruela vacuna de la cepa
Copenhague por recombinación homóloga. El virus recombinante
denominado VVTG5021 se aísla por selección con la
5-bromodesoxiuridina (5BUDR).
Los genes E6 y E7 se aíslan a partir de la línea
celular Caski tal como se describe en los ejemplos 2 y 3 de la
patente europea EP 0 462 187. Se han derivado dos construcciones del
clon M13E7/E6 que contienen los genes E6 y E7 del
HPV-16 con el fin de facilitar las etapas
posteriores del clonaje. La primera denominada M13TG8188 resulta de
la introducción por mutagénesis dirigida de los sitios PstI y
BamHI respectivamente antes y después del gen E7 y la
segunda, M13TG8189 presenta un sitio PstI anterior al gen E6.
La introducción de mutaciones puntuales antes de un ATG iniciador y
después de un codón stop se encuentra al alcance de la persona
experta de la técnica.
Se ha demostrado, por diversos autores, la
asociación de la proteína E7 de HPV-16 con el
producto del gen de retinoblastoma (ver por ejemplo Munger et
al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105) y
correlacionado con su poder transformante. Debido a unas razones
evidentes de seguridad, se genera un mutante no oncogénico
delecionado de las secuencias que codifican para los aminoácidos 21
a 26 de la proteína E7 nativa implicados en la función de
transformación por mutagénesis dirigida del vector M13TG8188 con la
ayuda del oligonucleótido oTG5118 (SEC ID Nº: 1). Se obtiene
M13TG9104. El gen E7 mutado se nombrará a continuación como E7*.
Del mismo modo, se ha demostrado que la proteína
E6 del HPV-16 podía interaccionar con el producto de
expresión del gen supresor del tumor p53 (Crook et
al., 1991, Cell 67, 547-556). Se ha
definido claramente el dominio implicado en dicha interacción y se
sitúa entre los residuos 111 y 115 de la proteína nativa. El vector
M13TG9125 se genera por mutagénesis de M13TG8189 con la ayuda del
oligonucleótido oTG5377 (SEC ID Nº:2). El gen E6 mutado se nombrará
a continuación como E6*.
El fragmento EcoRI de 5,2 kb del extremo
izquierdo del genoma del virus de la viruela vacuna Copenhague
(Guillard et al., 1985, J. Virol. 53,
316-318) se clona en el plásmido pUC8 (Gibco BRL)
linealizado por EcoRI. El vector obtenido de este modo se
somete a continuación a una digestión realizada por BglII
seguida de una ligación con el fin de delecionar un fragmento de 855
pb que codifica para el gen de restricción del huésped K1L (Guillard
et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83,
5573-5577). El fragmento BglII de 3,4 kb se
aísla de dicha construcción intermediaria denominada pUC8Khr y
posteriormente se clona en el sitio BamHI del plásmido pUC7
(Gibco BRL). Se genera pBAC1 en el que se introduce un adaptador
XhoI a la izquierda del sitio BglII único. Después de
la digestión con XhoI y BglII, se inserta un fragmento
SalI-BglII que presenta el promotor de la viruela
vacuna p7,5K. Los dos sitios EcoRI se eliminan por digestión
EcoRI seguido de un tratamiento con Klenow y de una
religación. El vector pTG2147 se obtiene mediante la introducción en
el sitio único BglII de un sitio múltiple de clonaje aislado
del vector p poly II (Lathe et al., 187, Gene 57,
193-201) asilado en forma de un fragmento
BglII-BamHI. Comprende por lo tanto los brazos de
recombinación que permiten la inserción del locus K1L que rodea al
promotor p7,5 K seguido de unos sitios de restricción.
Los genes E6* y E7* se clonan después del
promotor de la viruela vacuna pH5R contenido en el vector M13TG9132
para proporcionar respectivamente M13TG9138 y M13TG9139. A título
indicativo, le vector M13TG9132 proviene de la inserción del
promotor del gen H5R aislado por PCR del genoma viral en el fago
M13TG6131.
Por otra parte, el ADNc que codifica para la
interleucina-2 humana se aísla del plásmido pTG36
(patente francesa 2 583 770), se introduce en un vector
intermediario y recuperado por digestión SalI-BamHI
para insertarlo en el vector de transferencia pTG2147 marcando el
locus K1L. La inserción se lleva a cabo a nivel de los sitios
PstI y XbaI situados después del promotor p7,5K, con
la ayuda de adaptadores del clonaje. Se obtiene pTG5056.
El bloque de expresión pH5R-E6*
se aísla del vector M13TG9139 en forma de un fragmento
BglII-BamHI que se introduce en el sitio BamHI
del vector pTG5056. Se genera el vector pTG5060. El bloque de
expresión pH5R-E7* se purifica de M13TG9138 y se
inserta en el sitio BamHI del vector pTG5060, para
proporcionar pTG5062. Se indica que la inserción en el locus K1L
conduce a unos virus recombinantes que presentan una capacidad de
replicación reducida incluso destruida en determinados tipos
celulares. Debido a dichas razones, se introduce un marcador de
selección positiva para facilitar la identificación de los virus
recombinantes. El vector pTG5065 resulta del clonaje en el sitio
BamHI de pTG5062 de un casete de expresión
"pK1L-gen LacZ" aislado del plásmido pIV75
(Chen et al., 1993, Virology 196,
682-693) por separación BglII-BamHI.
Tal como se puede observar en la Figura 2, permite la transferencia
de los bloques E6*, E7* y IL-2 en el seno del locus
K1L del virus de la viruela vacuna.
El virus de la viruela vacuna recombinante,
denominado VVTG5065, se genera por recombinación homóloga después de
la transfección del vector pTG5065 en las células embrionarias de
pollo infectado con la viruela vacuna Copenhague salvaje y
localizadas por coloración en gel con X-Gal. Los
virus de la viruela vacuna VVTG5021 y VVTG5065 se utilizan en unos
ensayos de infecciones dobles. Los dobles recombinantes se
seleccionan según los dos marcadores: formación de colonias azules
en presencia de X-Gal y delección del marcador TK.
Dichos recombinantes, denominados VVTG5021&5065, expresan los
bloques p7,5K-IL-2,
pH5R-E6* y pH5R-E7* integrados en
los locus K1L y los bloques p7,5K-L1 y
p7,5K-L2 integrados en el locus TK.
La expresión de los genes de HPV se puede
comprobar mediante análisis en Western Blot con la ayuda de
anticuerpos monoclonales o policlonales adecuados o mediante PCR
inversa. La producción de IL-2 se puede evaluar
mediante un ensayo de ELISA o un ensayo CTL tal como se describe en
la literatura. A título indicativo, el nivel de expresión in
vitro es del orden de 60 ng/ml/10^{6} células infectadas a 1
pfu/célula y 24h.
El ADNc que codifica para la
interleucina-2 humana se aísla del plásmido pTG36
por digestión PstI y se inserta en el sitio PstI del
plásmido pTG186, dando lugar a pTG188. El virus obtenido por
recombinación homóloga se denomina VVTG188.
El gen E6* se aísla de M13TG9125 en forma de un
fragmento PstI-BamHI y se inserta después del promotor
7,5K entre los sitios PstI y XbaI del pTG2147 en
presencia de un adaptador BamHI-XbaI, dando lugar a
pTG5057. El gen E7* se sitúa bajo el control del promotor de la
viruela vacuna H5R produciendo MT13TG9138 y el casete flanqueado por
los sitios BamHI-BglII se sub-clona en
el sitio BamHI de pTG5057. Se obtiene pTG5059, en le sitio
BamHI en el que se inserta el marcador de selección
LacZ bajo la dependencia del promotor del gen de la viruela
vacuna K1L aislado por digestión BglII - BamHI del
vector pIV75. La construcción resultante se denomina pTG5061 y el
virus generado por recombinación homóloga con el genoma de la
viruela vacuna VVTG5061.
Se obtiene un virus de la viruela vacuna
recombinante que expresa los genes E6* y E7* integrados en el locus
K1L y el gen de la IL-2 humana integrado en el locus
TK por coinfección de células embrionarias de pollo por los virus
VVTG5061 y VVTG188. A título indicativo, dicho último producto
aproximadamente una cantidad de IL-2 superior a 400
ng por 10^{6} células infectadas a 1 pfu por célula durante 24 h.
El virus doblemente recombinante se denomina VVTG5061&188.
El ADNc que codifica para B7.1 se aísla de una
preparación de ARNm obtenido de la línea celular Daudi (ATCC
CCL-213) mediante PCR inversa utilizando los moldes
oTG6353 y oTG6352 (SEC ID Nº: 3 y 4). Se indica que la secuencia del
gen se divulga en Genebank bajo el número de acceso M27533. El
fragmento amplificado se clona entre los sitios BglI y
EcoRI del M13TG6131 conduciendo al M13TG9149 y posteriormente
entre los sitios BamHI y EcoRI del pTG186. La
construcción se denomina pTG5090 y el virus obtenido por
recombinación homóloga VVTG5090. Se puede obtener un virus de la
viruela vacuna que expresa los genes E6* y E7* de
HPV-16 integrados en el locus K1L y el gen B7.1
humano integrado en el locus TK mediante la cotransfección de
células embrionarias de pollo por los virus VVTG5061 y VVTG5090. El
virus recombinante se denomina VVTG5061&5090.
El virus MVA deriva de la cepa de virus de la
viruela vacuna Ankara. No es capaz de generar unas partículas
infecciosas sobre las células de mamíferos pero se desarrolla
correctamente sobre unos fibroblastos embrionarios de pollo. Su
adaptación a dichas células ha provocado la escisión de 6 regiones
no esenciales para su desarrollo y su ciclo infeccioso sobre dicho
tipo de células (desaparición de aproximadamente 15% del genoma
viral, Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72,
1031-1038). La integración del material genético
exógeno se puede llevar a cabo a nivel de cualquiera de dichas zonas
de escisión. En el marco de la presente invención, se utilizan las
escisiones II y III localizadas a nivel de los fragmentos de
restricción HindIII N y A respectivamente (Altenburger et
al., 1989, Arch Virol. 105, 15-27).
En un primer momento, se construye el vector
pTG6019 que permite la inserción en la zona de escisión III del
virus MVA. Los brazos de recombinación homóloga de una parte y de la
otra de la zona de escisión III se aíslan por PCR a partir del
genoma viral (ver la patente americana US 5.185.146) y unos moldes
oTG7637 y oTG7638 (SEC ID Nº 5 y 6) para el brazo izquierdo y
oTG7635 y oTG7636 (SEC ID Nº: 7 y 8) para el brazo derecho. Los
fragmentos amplificados se clonan en el sitio EcoRI del
vector pTG1E, para proporcionar pTG6019. El material genético a
transferir se inserta entre los dos brazos de recombinación. El
vector pTG1E es similar a pTG1H (patente francesa 2 583 429) aparte
de la presencia de un adaptador EcoRI en lugar de sitios
múltiples de clonaje.
Se inserta en primer lugar un casete de expresión
del gen marcador gus A. El promotor 7,5K se clona primero en
el sitio BamHI de pTG6019. Se obtiene pTG6021 en el sitio
BamHI del que se inserta el gen gus A generado bajo la
forma de un fragmento BglI-BamHI. Este se puede
obtener a partir de la secuencia divulgada en la literatura. La
construcción resultante se denomina pTG6022. La presencia del
marcador permitirá discriminar los virus salvajes de los virus
recombinantes mediante la detección de la actividad enzimática GUS
por el sustrato XglcA. Una coloración roja revela la actividad
\beta-glucuronidasa. Sin embargo, en la óptica de
una aplicación clínica, puede resultar útil ser capaz de eliminar
dicho marcador bacteriano del producto final después de la selección
de los virus recombinantes. Por ello, se aprovecha la capacidad de
la viruela vacuna para delecionar las secuencias comprendidas entre
dos sitios homólogos. Es por ello que se inserta un segundo promotor
p7,5K después del gen gus A en una orientación sentido en
relación con el que dirige la expresión de dicho último. El vector
pTG6022 se modifica por inserción entre los sitios BamHI y
SacI de un fragmento p7,5K provisto de extremos cohesivos,
para proporcionar pTG6025.
Dicho último se completa por la inserción de los
casetes de expresión de los genes E6* y E7* mutados. Se empieza
introduciendo una nueva secuencia promotora p7,5K esta vez en
orientación antisentido en relación con las anteriores. Dicha
construcción denominada pTG6039 comprende por lo tanto un casete GUS
lábil "p7,5K\rightarrowgus
A\rightarrowp7,5K\rightarrow" seguido de p7,5K en la
orientación opuesta. En paralelo, los genes E6* y E7* se aíslan
respectivamente de los vectores M13TG9104 y M13TG9125 por digestión
BamHI y PstI y se ensamblan en orientación opuesta el
uno al otro en el sitio PstI de M13TG6131. El conjunto se
recupera en forma de un fragmento PstI que se inserta en
pTG6039 linealizado por dicho mismo enzima. Se obtiene el vector
pTG5056 que contiene las secuencias siguientes
"p7,5K\rightarrowgus
A-p7,5K\rightarrowE7*-E6*\leftarrowp7,5K".
El gen inmunoestimulador B7.1 se integra en dicha
última construcción. Para ello, el vector pTG6056 se separa por
HindIII y KpnI antes de ponerse en ligación en
presencia de los oligonucleótidos oTG10451 y oTG10450 (SEC ID Nº: 9
y 10), para generar pTG6070. Dichos últimos van a permitir el
clonaje del casete de expresión "pH5R-B7.1"
mediante recombinación homóloga. Con dicho fin, las secuencias B7.1
aisladas de M13TG9149 se clonan después del promotor de la viruela
vacuna pH5R, para formar M13TG9184. El fragmento
BglII-EcoRI que presenta el casete se integra en el
vector pTG6070 linealizado por XhoI por recombinación
homóloga en E. coli. Se obtiene el vector pTG6079 que en
total presenta el gen marcador gus A en una forma
"lábil" y los casetes de expresión de los genes precoces de
HPV-16 así como un casete del gen de coestimulación
B7.1. El virus generado por recombinación homóloga con el genoma MVA
se denomina MVATG6079.
Los bloques de expresión de los genes tardíos del
HPV-16 pueden ser insertados en el núcleo de la zona
de escisión II con la ayuda del vector de transferencia pTG6018.
Dicho último se construye por inserción en el sitio EcoRI de
PTG1E de los brazos de recombinación derecho e izquierdo que
flanquean la escisión II, generados por PCR utilizando los moldes
oTG7665 y oTG7584 (SEC ID Nº: 11 y 12) y oTG7639 y oTG7640 (SEC ID
Nº: 13 y 14). Tal como se ha indicado anteriormente, se integra
entre los dos brazos un casete de expresión de un marcador positivo
para facilitar la detección de los virus recombinantes, dicho último
se puede eliminar después de la etapa de selección (Spehner et
al., 1990, J. Virol. 64, 527-533). El
vector pTG6020 resulta del clonaje del gen LacZ situado
después del promotor p7,5K en el vector pTG6018 linealizado por
BamHI. El pTG6020 se modifica por la inserción de una
secuencia p7,5K entre sus sitios BamHI y SacI situados
después del gen LacZ. Se obtiene pTG6024. Los casetes L1 y L2
se pueden introducir a continuación según una estrategia tal como
se muestra en la Figura 3.
Se utiliza la misma estrategia empleada
anteriormente para introducir el gen IL-2 en el
vector pTG6056. Después del clonaje de los oligonucleótidos de
recombinación oTG10503 y oTG10502 (SEC ID Nº: 15 y 16) para producir
pTG6076, dicho último se separa con XhoI y el fragmento
BglII-EcoRI preparado a partir de M13TG9185
\hbox{(pH5R-IL-2)} se
inserta por recombinación homóloga. El vector pTG6090 obtenido de
este modo comprende el gen marcador gus A en forma
"lábil", los casetes de expresión de los genes precoces de
HPV-16 así como un casete del gen
IL-2 humano. El virus recombinante obtenido por
recombinación homóloga con el genoma MVA se denomina MVATG6090. Los
genes tardíos se pueden integrar en la zona de escisión II
utilizando el pTG6018, tal como se ha indicado anteriormente.
Unos ratones nude recibieron 10^{7} pfu
de VVTG5021&5065 ó 10^{7} pfu del virus de la viruela vacuna
salvaje por vía intravenosa, intramuscular,
sub-cutánea o intracraneal. Se constituyeron unos
lotes de 5 ratones según el tipo de virus inyectado y la vía de
administración y se evaluarn 26 días después de la inyección, el
número de animales que presentan unas lesiones ligadas a la viruela
vacuna. Los ratones que han recibido el virus recombinante no
muestran ninguna lesión sea cual sea la vía de administración
utilizada mientras que la mayoría de los animales tratados con la
viruela vacuna salvaje presentan unas lesiones con una frecuencia y
una gravedad en función de la vía de administración. Además, se
registran unas muertes en el caso de una inyección intravenosa e
intracraneal. Dichos datos muestran que el VVTG5021&5065 se
encuentra atenuado con respecto al virus salvaje y que no implica
lesiones incluso después de una inyección intracraneal.
Se vacunan unos ratones C57BL6 en tres veces por
vía subcutánea con 10^{7} pfu de VVTG5021&5065. Tres días
después de la última inmunización, dichos animales se ensayan con
10^{3} células E7W1 implantadas subcutáneamente. A título
indicativo, las células E7W1 proceden de una línea de linfoma murino
transfectada con un vector que expresa el gen E7 oncogénico de
HPV-16. El porcentaje de supervivencia de los
animales en función del tiempo se compara con el obtenido en unos
ratones controles tratados con 10^{7} pfu de un virus de la
viruela vacuna no recombinante VVTG186 (derivado del vector TG186
descrito anteriormente). El seguimiento de la mortalidad muestra una
diferencia entre los dos grupos. En el grupo control, el 100% de
los animales murieron al D36 mientras que el 40% de los animales
vacunados con VVTG5021&5065 permanecen vivos al D36 y más del
30% al D51.
De este modo los virus recombinantes que
expresan unos antígenos de HPV y un gen inmunoestimulador presentan
una actividad antitumoral contra las células tumorales que expresan
el oncogen E7 de HPV-16.
Se inocularon unos ratones C57BL6 con 10^{3}
células E7W1 implantadas subcutáneamente (D0). Se administraron a
continuación 10^{7} pfu de virus recombinantes asimismo
subcutáneamente a D3 y después D6 y se determinó el porcentaje de
supervivencia de los animales en relación con los animales control
que han recibido un virus no recombinante. Mientras que el 100% de
los animales control murieron, se observa un aumento notable en la
supervivencia de los animales inyectados con una mezcla de
VVTG5061&5021 y de VVTG188. Se obtuvieron unos resultados
similares después de la administración de VVTG5065&5021 y
VVTG188.
Dichos experimentos de inmunoterapia fueron
reproducidos utilizando un modelo tumoral diferente, unas células
BMK16 myc sustituyendo a las células E7w1. Las células BMK16myc son
unas células de riñón de ratón recién nacido transfectadas con el
genoma de HPV-16 y el gen c myc murino. Los animales
se tratan con 10^{7} virus MVA TG6090 que expresan los genes E6*,
E7* de HPV-16 y la IL-2 humana. En
relación con los controles, los ratones tratados presentan un
retraso en el crecimiento tumoral hasta el D15.
(I) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: TRANSGENE SA
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11 rue de Molsheim
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Strasbourg
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Francia
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 67082
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (33) 88 27 91 00
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- FAX: (33) 88 27 91 11
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composición farmacéutica para el tratamiento de los tumores e infecciones por papilomavirus.
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTME DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Versión # 1.25 (OEB)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: papilomarivus humano
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: HPV-16
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG5118 (E7 delecionado 21 a 26)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGAGCTGT CATTTAATTG AGTTGTCTCT GGTTGC
\hfill36
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: papilomarivus humano
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: HPV-16
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG5377 (E6 delecionado 111 a 115)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCCAGATG TCTTTGCAGT GGCTTTTGAC AG
\hfill32
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG6353 (PCR gen B7.1)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGCCCCTG AATTCTGCGG ACACTGTTAT ACAGG
\hfill35
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SI
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG6352 (PCR gen B7.1)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGACCCTAA AGATCTGAAG CCATGGGCCA CAC
\hfill33
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7637 (PCR zona III)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGAAT TCAGTAAACT TGACTAAATC TT
\hfill32
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SI
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7638 (PCR zona III)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGAT CCGAGCTCAC CAGCCACCGA AAGAGCAAT
\hfill39
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7635 (PCR zona III)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGAT CCGGAAAGTT TTATAGGTAG TT
\hfill32
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SI
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7636 (PCR zona III)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGAAT TCTTTGTATT TACGTGAACG
\hfill30
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG10451
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTATACAGG GCGTACACTT TCCCTTCTCA ATCTCTCTCG AGTTGTATTT ATTTTCATTT
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTAAGTATA GAATAAAA
\hfill78
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 86 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SI
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG10450
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTTTTAT TCTATACTTA AAAAATGAAA ATAAATACAA CTCGAGAGAG ATTGAGAAGG
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAAGTGTAC GCCCTGTATA AGGTAC
\hfill86
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7665 (PCR zona II)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGTACCGA ATTCCATCTA CCAATTCATC CAACAACAT
\hfill39
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SI
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7584 (PCR zona II)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTGCAGGA TCCGAGCTCA TCATGACGTC CTCTGCAATG G
\hfill41
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7639 (PCR zona II)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGAT CCTGTGAATC ATCCATTCCA CT
\hfill32
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SI
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7640 (PCR zona II)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGAAT TCGTTACTAA ATTGCAAGGA AAT
\hfill33
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG10503
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCAAGTCAG TGTTGAGATG ATGCTTTGAC AACTCGAGTT TATTTTCATT TTTTAAGTAT
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAATAAAA
\hfill69
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SI
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG10502
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTTTTAT TCTATACTTA AAAAATGAAA ATAAACTCGA GTTGTCAAAG CATCATCTCA
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACACTGACTT GAGGTAC
\hfill77
Claims (19)
1. Composición farmacéutica destinada al
tratamiento o a la prevención de una infección o tumor por
papilomavirus que, a título de agentes terapéuticos, consiste en uno
o diversos polipéptido(s) originario (s) de una región precoz
de un papilomavirus y en uno o diversos polipéptido(s) que
presentan una actividad inmunoestimuladora seleccionado(s) de
entre el grupo constituido por la interleucina-2,
la interleucina-7 y las moléculas de
co-adhesión B7.1 y B7.2.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido
originario de la región precoz de un papilomavirus deriva de la
proteína E6, de la proteína E7 o de las proteínas E6 y E7 de un
papilomavirus.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido
originario de la región precoz de un papilomavirus es una variante
no oncogénica de la proteína E6 y/o E7 de un papilomavirus.
4. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el
polipéptido que presenta una actividad inmunoestimuladora deriva de
la interleucina-2.
5. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el
polipéptido que presenta una actividad inmunoestimuladora deriva de
la molécula B7.1.
6. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque
comprende:
- (1) un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7 de un papilomavirus y un polipéptido derivado de la interleucina-2,
- (2) un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7 de un papilomavirus y un polipéptido derivado de la molécula B7.1, o
- (3) un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7 de un papilomavirus, un polipéptido derivado de la molécula B7.1 y un polipéptido derivado de la interleucina-2.
7. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el
papilomavirus se selecciona de entre los tipos
HPV-16, HPV-18,
HPV-31, HPV-33 y/o
HPV-45.
8. Composición farmacéutica destinada al
tratamiento o a la prevención de una infección o tumor por
papilomavirus que, a título de agentes terapéuticos, consiste en uno
o diversos vector(es) recombinante(s) en el/los que se
insertan unos fragmentos de ADN codificante para uno o diversos
polipéptido(s) originario(s) de una región precoz de
un papilomavirus y uno o diversos polipéptido(s) que
presentan una actividad inmunoestimuladora seleccionado(s) de
entre el grupo constituido por la interleucina-2, la
interleucina 7 y las moléculas de co-adhesión B7.1 y
B7.2; estando dichos fragmentos de ADN situados bajo el control de
los elementos necesarios para su expresión en una célula o un
organismo huésped.
9. Composición farmacéutica según la
reivindicación 8, caracterizada porque dichos polipéptidos
presentan las características definidas en las reivindicaciones 2 a
7.
10. Composición farmacéutica según la
reivindicación 8 ó 9, caracterizada porque el vector
recombinante es un vector viral que deriva del genoma de un virus
seleccionado de entre los poxvirus, los adenovirus, los retrovirus,
los virus del herpes y los virus asociados al adenovirus.
11. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10, caracterizada porque el vector
recombinante deriva de un poxvirus seleccionado de entre el grupo
constituido por el virus de la viruela vacuna, el canaripox y el
fowlpox.
12. Composición farmacéutica según la
reivindicación 11, caracterizada porque el vector
recombinante deriva de un virus de la viruela vacuna seleccionado de
entre las cepas Copenhague, Wyeth y Ankara modificada (MVA).
13. Composición farmacéutica según la
reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque los elementos
esenciales para la expresión de los fragmentos de ADN codificante
para dichos polipéptidos comprenden un promotor de un gen de un
virus de la viruela vacuna seleccionado de entre los promotores de
los genes timidina Kinasa (TK), 7,5K, H5R y K1L.
14. Composición farmacéutica según la
reivindicación 12 ó 13, caracterizada porque el vector
recombinante deriva de un virus de la viruela vacuna de la cepa
Copenhague y porque los fragmentos de ADN que codifican para dichos
polipéptidos se insertan en el locus TK y/o el locus K1L de dicho
virus de la viruela vacuna.
15. Composición farmacéutica según la
reivindicación 12 ó 13, caracterizada porque el vector
recombinante deriva de un virus de la viruela vacuna de la cepa MVA
y porque los fragmentos de ADN que codifica para dichos polipéptidos
se insertan a nivel de cualquiera de las zonas de escisión
seleccionadas de entre las escisiones I, II, III, IV, V y VI de
dicho virus de la viruela vacuna.
16. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 8 a 15, destinada al tratamiento o a la
prevención de una infección o tumor por papilomavirus,
caracterizada porque comprende uno o diversos
vector(es) recombinante(s) derivados de un virus de
la viruela vacuna de la cepa Copenhague o MVA en el/los que se
insertan:
- (1)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la molécula B 7.1,
- (2)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2, o
- (3)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la molécula B 7.1, y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2.
17. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 8 a 16, caracterizada porque el vector
recombinante está vivo o muerto.
18. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada porque comprende
un soporte aceptable desde un punto de vista farmacéutico que
permite su administración por inyección en humanos o animales.
19. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 18, a título de medicamento para el
tratamiento o la prevención del cáncer del cuello de útero, de una
displasia del cuello de bajo grado o de una infección por
papilomavirus.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9609584A FR2751879B1 (fr) | 1996-07-30 | 1996-07-30 | Composition pharmaceutique contre les tumeurs et infections a papillomavirus |
| FR9609584 | 1996-07-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2215805T3 true ES2215805T3 (es) | 2004-10-16 |
Family
ID=9494633
Family Applications (2)
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