JP2003505103A - 組換えｈｓｖ−１および生ウイルスワクチン - Google Patents
組換えｈｓｖ−１および生ウイルスワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、単一小型（ＵＳ）８および１２遺伝子内の変異または欠失によりゲノムが改変された組換え単純ヘルペスウイルスに関する。本発明は、さらに該組換え単純ヘルペスウイルスを含んでなるワクチンにも関する。
Description
【０００１】
本発明は、生ウイルスワクチン、具体的には単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
ワクチンの分野である。本発明は、感染目的のための非相同または治療用遺伝子
のウイルスベクターキャリヤーにも関する。
ワクチンの分野である。本発明は、感染目的のための非相同または治療用遺伝子
のウイルスベクターキャリヤーにも関する。
【０００２】
ヘルペスウイルスは、一次感染の後多くの年間にわたる潜伏感染確立の著しい
能力を有する核内二本鎖ＤＮＡウイルスの大きい群である。ヘルペスウイルス群
は、例えば単純ヘルペスおよび角結膜炎（単純ヘルペスウイルスタイプ１）、性
病（単純ヘルペスウイルスタイプ１および２）、水痘（varicella)および帯状疱
疹(Herpes Zoster) 、巨細胞性封入体病（サイトメガロウイルス）、伝染性単核
球症（エプスタイン−バーウイルス）、突発発疹（ばら疹）（ヒトヘルペス６お
よび７）およびカポジ肉腫（ＨＨＶ８）などのヒト疾患の原因である。
能力を有する核内二本鎖ＤＮＡウイルスの大きい群である。ヘルペスウイルス群
は、例えば単純ヘルペスおよび角結膜炎（単純ヘルペスウイルスタイプ１）、性
病（単純ヘルペスウイルスタイプ１および２）、水痘（varicella)および帯状疱
疹(Herpes Zoster) 、巨細胞性封入体病（サイトメガロウイルス）、伝染性単核
球症（エプスタイン−バーウイルス）、突発発疹（ばら疹）（ヒトヘルペス６お
よび７）およびカポジ肉腫（ＨＨＶ８）などのヒト疾患の原因である。
【０００３】
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２は免疫学的に関連しているが、しかし大部分のこ
れらのタンパク質は、これらを区別できる顕著な特性を有する。ＨＳＶは、神経
節内に特異的なその宿主の中枢神経系（ＣＮＳ）内の潜伏感染を確立する能力に
より特性付けられる。感染または再活性化は脳炎をもたらすことがある。
れらのタンパク質は、これらを区別できる顕著な特性を有する。ＨＳＶは、神経
節内に特異的なその宿主の中枢神経系（ＣＮＳ）内の潜伏感染を確立する能力に
より特性付けられる。感染または再活性化は脳炎をもたらすことがある。
【０００４】
生ＨＳＶ−１ワクチンを開発するための数々の試みがあった。
【０００５】
米国特許（ＵＳ）第５，３２８，６８８号は、γI ３４．５と呼ばれる遺伝子
の活性産物の発現を防止することにより非毒性を与えられた単純ヘルペスウイル
スを開示している。
の活性産物の発現を防止することにより非毒性を与えられた単純ヘルペスウイル
スを開示している。
【０００６】
米国特許（ＵＳ）第４，８５９，５８７号は、抗毒性ＨＳＶ−１および抗ＨＳ
Ｖ−２の両方のワクチンとして使用するための組換えヘルペスウイルスを開示し
ている。ウイルスは、神経毒性の原因であるゲノムの部分が欠失したＨＳＶ−１
類似ウイルス組換え体を取り出し、そして免疫誘導性糖タンパク質のコードに責
任があるＨＳＶ−２ゲノムからの遺伝子を変異ウイルスゲノム内に挿入して作製
された。
Ｖ−２の両方のワクチンとして使用するための組換えヘルペスウイルスを開示し
ている。ウイルスは、神経毒性の原因であるゲノムの部分が欠失したＨＳＶ−１
類似ウイルス組換え体を取り出し、そして免疫誘導性糖タンパク質のコードに責
任があるＨＳＶ−２ゲノムからの遺伝子を変異ウイルスゲノム内に挿入して作製
された。
【０００７】
米国特許（ＵＳ）第４，５５４，１５９号は、組換え後代を得るために、２種
の原型的ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２親ウイルス系統の交雑により作製した少な
くとも１種のワクチン種間(intertypic)（ＨＳＶ−１ ｘ ＨＳＶ−２）組換え
ウイルス系統を含む単純ヘルペスウイルスタイプ１および２に対する生ウイルス
ワクチンを開示している。親系統は識別性の遺伝標識を有し、組換え後代を親系
統からこれらの標識に基づいて識別が可能であり、そして少なくとも１種の親系
統も温度感受性である。
の原型的ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２親ウイルス系統の交雑により作製した少な
くとも１種のワクチン種間(intertypic)（ＨＳＶ−１ ｘ ＨＳＶ−２）組換え
ウイルス系統を含む単純ヘルペスウイルスタイプ１および２に対する生ウイルス
ワクチンを開示している。親系統は識別性の遺伝標識を有し、組換え後代を親系
統からこれらの標識に基づいて識別が可能であり、そして少なくとも１種の親系
統も温度感受性である。
【０００８】
米国特許（ＵＳ）第５，６４１，６５１号は、単純ヘルペスウイルスγ遺伝子
プロモーター断片に操作的に５’−連結した単純ヘルペスウイルスα−遺伝子プ
ロモーター断片を含んでなる合成単純ヘルペスウイルスプロモーターを開示して
いる。
プロモーター断片に操作的に５’−連結した単純ヘルペスウイルスα−遺伝子プ
ロモーター断片を含んでなる合成単純ヘルペスウイルスプロモーターを開示して
いる。
【０００９】
米国特許（ＵＳ）第５，８３７，５３２号は、単純ヘルペスウイルスタイプ１
と、Ｖｍｗ６５タンパク質をコードする遺伝子内に変化を有するＤＮＡ配列とを
含んでなるウイルス発現ベクターを開示しており、この変化は１〜７２塩基対一
時的または交互的な変化または３〜７２塩基対の欠失、またはその代わりにオリ
ゴヌクレオチド配列の挿入であり、ここで変化はタンパク質のアミノ酸２８９〜
４１２の間のプローブをコードする遺伝子内の位置で遂行される。ウイルス発現
ベクターは、さらに、ウイルスの培養のために非本質的な領域であるＨＳＶ−１
ゲノムの領域内に挿入される相同遺伝子を、適当なプロモーターと一緒に含んで
なる。典型的には、非相同遺伝子は、ウイルスＴＫ遺伝子（ＵＬ２３）内に挿入
される治療遺伝子である。
と、Ｖｍｗ６５タンパク質をコードする遺伝子内に変化を有するＤＮＡ配列とを
含んでなるウイルス発現ベクターを開示しており、この変化は１〜７２塩基対一
時的または交互的な変化または３〜７２塩基対の欠失、またはその代わりにオリ
ゴヌクレオチド配列の挿入であり、ここで変化はタンパク質のアミノ酸２８９〜
４１２の間のプローブをコードする遺伝子内の位置で遂行される。ウイルス発現
ベクターは、さらに、ウイルスの培養のために非本質的な領域であるＨＳＶ−１
ゲノムの領域内に挿入される相同遺伝子を、適当なプロモーターと一緒に含んで
なる。典型的には、非相同遺伝子は、ウイルスＴＫ遺伝子（ＵＬ２３）内に挿入
される治療遺伝子である。
【００１０】
米国特許（ＵＳ）第５，０６６，４９２号は、ウシ乳頭炎生ウイルスによる接
種を用いるヒトＨＳＶ−１感染の感染の治療または防止するための方法を開示し
ている。
種を用いるヒトＨＳＶ−１感染の感染の治療または防止するための方法を開示し
ている。
【００１１】
米国特許（ＵＳ）第４，０２４，８３６号は、水分約０．５％〜約８％を含ん
でなる凍結乾燥生ヘルペスウイルスワクチンを開示している。
でなる凍結乾燥生ヘルペスウイルスワクチンを開示している。
【００１２】
上記のＨＳＶ−１ウイルスワクチンは、病原性遺伝子（例えば米国特許（ＵＳ
）第５，３２８，６８８号中のγI ３４．５遺伝子および米国特許（ＵＳ）第５
，８３７，５３２号中のＶＭＷ６４）中の変異体またはＨＳＶ−１とＨＳＶ−２
の間の種間組換え体（米国特許（ＵＳ）第４，５５４，１５９号）のいずれかで
ある。しかし、これらの公開特許のいずれもヒトに使用するための単一の抗−Ｈ
ＳＶ−１ワクチンの開発に導かなかった。主要な障害の一つは、免疫化した動物
の神経系内への進入のためおよびこの中で潜伏感染を確立するための、これら公
開特許の生ＨＳＶ−１ワクチンウイルスの性質である。今日まで、ヒトを免疫化
するために使用される唯一の生ヘルペスウイルスワクチンは、水疱帯状疱疹ウイ
ルス（ＶＺＶ）患者から入手した弱毒化ウイルスであるＶＺＶのＯＫＡ系統であ
る。
）第５，３２８，６８８号中のγI ３４．５遺伝子および米国特許（ＵＳ）第５
，８３７，５３２号中のＶＭＷ６４）中の変異体またはＨＳＶ−１とＨＳＶ−２
の間の種間組換え体（米国特許（ＵＳ）第４，５５４，１５９号）のいずれかで
ある。しかし、これらの公開特許のいずれもヒトに使用するための単一の抗−Ｈ
ＳＶ−１ワクチンの開発に導かなかった。主要な障害の一つは、免疫化した動物
の神経系内への進入のためおよびこの中で潜伏感染を確立するための、これら公
開特許の生ＨＳＶ−１ワクチンウイルスの性質である。今日まで、ヒトを免疫化
するために使用される唯一の生ヘルペスウイルスワクチンは、水疱帯状疱疹ウイ
ルス（ＶＺＶ）患者から入手した弱毒化ウイルスであるＶＺＶのＯＫＡ系統であ
る。
【００１３】
本発明は、「ＨＳＶ−１ Ｒ１５」と以下に本明細書中で呼ぶ単一(unique)Ｈ
ＳＶ−１組換えウイルスの開発に基づく。この組換えウイルスは、穏やかなＨＳ
Ｖ−１感染を有する患者からもともと単離したＨＳＶ−１ ＨＦＥＭである親ウ
イルスを入手して作製した。ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭは、ＵＬの内部反復（ＩＲＬ
）中に欠失を有し、このウイルスは成体マウスに対しては非病原性であると知ら
れていた。しかし、このウイルスは、哺乳期のマウスでその病原性を保持するの
で、ヒト免疫化の目的にはまだ不適当であった(1) 。ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え
体は、病原性ウイルスＨＳＶからのＢａｍＨＩ−Ｂ ＤＮＡ断片が組換えにより
挿入されたＨＦＥＭ ＤＮＡゲノムを有する(1) 。
ＳＶ−１組換えウイルスの開発に基づく。この組換えウイルスは、穏やかなＨＳ
Ｖ−１感染を有する患者からもともと単離したＨＳＶ−１ ＨＦＥＭである親ウ
イルスを入手して作製した。ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭは、ＵＬの内部反復（ＩＲＬ
）中に欠失を有し、このウイルスは成体マウスに対しては非病原性であると知ら
れていた。しかし、このウイルスは、哺乳期のマウスでその病原性を保持するの
で、ヒト免疫化の目的にはまだ不適当であった(1) 。ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え
体は、病原性ウイルスＨＳＶからのＢａｍＨＩ−Ｂ ＤＮＡ断片が組換えにより
挿入されたＨＦＥＭ ＤＮＡゲノムを有する(1) 。
【００１４】
本発明のＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体は、下記のような種々の有利な性質を有
する。 （１）成体および哺乳期マウスに非病原性であることが分かった。 （２）免疫化した対象体（マウス）の皮膚または鼻上皮内での本発明の非病原性
ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体の複製は、自己限定性であり、その結果ウイルスＤ
ＮＡは、感染の３〜４日後以内に接種の部位から消失する。 （３）本発明の組換え体は、末梢および中枢神経系内への浸透が不可能であり従
って従来技術で提出された生ウイルスに基づくワクチンの主要な障害の一つを実
際的に克服している。 （４）本発明の組換え体を用いる接種は、免疫化したマウス中で、中枢神経系内
への他の病原性ＨＳＶ−１の進入を防止する。 （５）本発明のＨＳＶ−１組換え体は、高度に免疫原性でありそして免疫化した
マウス内で抗ウイルス体液性免疫反応を誘導する能力がある、 （６）本発明の組換え体は、定位注入の結果として非病原性である。 （７）本発明の組換え体は、マウスおよびラット脳内への注入の後、視床下部下
垂体副腎皮質軸（ＨＰＡ）を活性化せず、プロスタグランジンＥ２の産生を増加
せず、注入部位中の視床下部の外側でＩＬ−１遺伝子発現を誘導せず、これらは
病原性ＨＳＶ−１Ｆにより起きる状態とは反対である。 （８）生体外条件下で本発明の組換え体を用いるマウス星状膠細胞の感染は、Ｉ
Ｌ−１遺伝子の発現を誘導せず、これは感染後３時間以内にＩＬ−１遺伝子を誘
導する病原性ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７を用いて感染が起きる状態とは反対である
。 （９）本発明の組換えＨＳＶ−１ Ｒ１５は、チロシンキナーゼ（ＴＫ）をコー
ドする活性ＵＬ２３遺伝子を有し、従って、ウイルスは抗ヘルペス薬剤アシクロ
ビルを用いる治療に高度に感受性であり、希望する場合にはその感染を制御され
てもよい。
する。 （１）成体および哺乳期マウスに非病原性であることが分かった。 （２）免疫化した対象体（マウス）の皮膚または鼻上皮内での本発明の非病原性
ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体の複製は、自己限定性であり、その結果ウイルスＤ
ＮＡは、感染の３〜４日後以内に接種の部位から消失する。 （３）本発明の組換え体は、末梢および中枢神経系内への浸透が不可能であり従
って従来技術で提出された生ウイルスに基づくワクチンの主要な障害の一つを実
際的に克服している。 （４）本発明の組換え体を用いる接種は、免疫化したマウス中で、中枢神経系内
への他の病原性ＨＳＶ−１の進入を防止する。 （５）本発明のＨＳＶ−１組換え体は、高度に免疫原性でありそして免疫化した
マウス内で抗ウイルス体液性免疫反応を誘導する能力がある、 （６）本発明の組換え体は、定位注入の結果として非病原性である。 （７）本発明の組換え体は、マウスおよびラット脳内への注入の後、視床下部下
垂体副腎皮質軸（ＨＰＡ）を活性化せず、プロスタグランジンＥ２の産生を増加
せず、注入部位中の視床下部の外側でＩＬ−１遺伝子発現を誘導せず、これらは
病原性ＨＳＶ−１Ｆにより起きる状態とは反対である。 （８）生体外条件下で本発明の組換え体を用いるマウス星状膠細胞の感染は、Ｉ
Ｌ−１遺伝子の発現を誘導せず、これは感染後３時間以内にＩＬ−１遺伝子を誘
導する病原性ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７を用いて感染が起きる状態とは反対である
。 （９）本発明の組換えＨＳＶ−１ Ｒ１５は、チロシンキナーゼ（ＴＫ）をコー
ドする活性ＵＬ２３遺伝子を有し、従って、ウイルスは抗ヘルペス薬剤アシクロ
ビルを用いる治療に高度に感受性であり、希望する場合にはその感染を制御され
てもよい。
【００１５】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体は、ワクチンとしての使用において病原性の欠損
および高度免疫原性に貢献する多数の遺伝子の欠失、ゲノム転位および遺伝子発
現における変化を有する。数種の遺伝子欠失および変異が同時に起きる事実は、
自発復帰体変異を防ぎ、従って本発明の組換え体の毒性ウイルス産生への逆行変
異の可能性を防止する。
および高度免疫原性に貢献する多数の遺伝子の欠失、ゲノム転位および遺伝子発
現における変化を有する。数種の遺伝子欠失および変異が同時に起きる事実は、
自発復帰体変異を防ぎ、従って本発明の組換え体の毒性ウイルス産生への逆行変
異の可能性を防止する。
【００１６】
さらに、本発明のＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体中のゲノム欠失が起きる位置は
、非相同遺伝子のこれらのＤＮＡ配列中への挿入のために利用されてもよい。非
相同遺伝子は、他のヒトヘルペスウイルス（すなわちＨＳＶ−２〜ＨＨＶ−８）
からの免疫原性タンパク質をコードする遺伝子、例えばＨＳＶ−２〜ＨＨＶ−８
糖タンパク質前初期遺伝子をコードする遺伝子であってもよい。
、非相同遺伝子のこれらのＤＮＡ配列中への挿入のために利用されてもよい。非
相同遺伝子は、他のヒトヘルペスウイルス（すなわちＨＳＶ−２〜ＨＨＶ−８）
からの免疫原性タンパク質をコードする遺伝子、例えばＨＳＶ−２〜ＨＨＶ−８
糖タンパク質前初期遺伝子をコードする遺伝子であってもよい。
【００１７】
あるいは、非相同遺伝子は、他の病原性ヒトＲＮＡおよびＤＮＡウイルスから
得てもよく、例えばＨＩＶ−１ｇａｇをコードする遺伝子およびエンベロープ遺
伝子およびミニ遺伝子(minigene)、肝炎Ｃウイルス遺伝子または構造タンパク質
、構造タンパク質のためのインフルエンザウイルス遺伝子およびデング熱ウイル
ス遺伝子である。
得てもよく、例えばＨＩＶ−１ｇａｇをコードする遺伝子およびエンベロープ遺
伝子およびミニ遺伝子(minigene)、肝炎Ｃウイルス遺伝子または構造タンパク質
、構造タンパク質のためのインフルエンザウイルス遺伝子およびデング熱ウイル
ス遺伝子である。
【００１８】
上記の２例中で、本発明の組換え体は、該ウイルスに対するワクチン接種の目
的での所望ウイルスの免疫原性タンパク質をコードする遺伝子の効果的キャリヤ
ーとして使用される。
的での所望ウイルスの免疫原性タンパク質をコードする遺伝子の効果的キャリヤ
ーとして使用される。
【００１９】
本発明のＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体は、種々の非相同遺伝子のため、免疫化
以外の目的、例えば遺伝子治療技術を用いる治療目的のためのキャリヤーとして
使用してもよい。その場合に、本発明の組換え体は、発現が有益な治療効果をも
たらす遺伝子のためのキャリヤーとして使用され、例えば遺伝子はサイトカイン
およびケモカインをコードするヒト遺伝子、欠損酵素、欠損代謝産物などをコー
ドする遺伝子、ならびに細胞死に関与する遺伝子である。後者の非相同遺伝子の
例は、アポトーシスおよび腫瘍抑制遺伝子、例えばガン細胞内に挿入されるｐ５
３である。
以外の目的、例えば遺伝子治療技術を用いる治療目的のためのキャリヤーとして
使用してもよい。その場合に、本発明の組換え体は、発現が有益な治療効果をも
たらす遺伝子のためのキャリヤーとして使用され、例えば遺伝子はサイトカイン
およびケモカインをコードするヒト遺伝子、欠損酵素、欠損代謝産物などをコー
ドする遺伝子、ならびに細胞死に関与する遺伝子である。後者の非相同遺伝子の
例は、アポトーシスおよび腫瘍抑制遺伝子、例えばガン細胞内に挿入されるｐ５
３である。
【００２０】
他の選択肢では、脳星状膠細胞培養物内で複写できるが、他方では神経細胞へ
影響できない本発明のＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体の性質は、他方では神経細胞
には感染しないで腫瘍星状膠細胞（星状膠細胞腫）のみに選択的にトランスフェ
クションするために使用できる。この性質は、本発明のＨＳＶ−１ Ｒ１５を腫
瘍にのみ定位的に注入しその生来の複製が腫瘍を破壊するか、または本発明の組
換えウイルスのゲノム内に種々の非相同細胞毒性遺伝子を挿入し、次いでこれが
星状膠細胞腫のみを選択的に破壊でき、神経細胞は損傷を受けないままにするこ
とのいずれかにより、星状膠細胞脳腫瘍を治癒するために使用してもよい。
影響できない本発明のＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体の性質は、他方では神経細胞
には感染しないで腫瘍星状膠細胞（星状膠細胞腫）のみに選択的にトランスフェ
クションするために使用できる。この性質は、本発明のＨＳＶ−１ Ｒ１５を腫
瘍にのみ定位的に注入しその生来の複製が腫瘍を破壊するか、または本発明の組
換えウイルスのゲノム内に種々の非相同細胞毒性遺伝子を挿入し、次いでこれが
星状膠細胞腫のみを選択的に破壊でき、神経細胞は損傷を受けないままにするこ
とのいずれかにより、星状膠細胞脳腫瘍を治癒するために使用してもよい。
【００２１】
従って、本発明は、ゲノムが下記の変化：
非−機能性ｇＥタンパク質の発現またはｇＥタンパク質の非発現のいずれかをも
たらす単一小型（ＵＳ）８遺伝子領域内の欠失または変異、および 非−機能性ＩＣＰ４７タンパク質の発現またはＩＣＰ４７タンパク質の非発現の
いずれかをもたらすＵＳ１２遺伝子領域内の欠失または変異 を有するＨＳＶ−１のゲノムの変異体を含んでなる、組換え単純ヘルペスウイル
スに関する。
たらす単一小型（ＵＳ）８遺伝子領域内の欠失または変異、および 非−機能性ＩＣＰ４７タンパク質の発現またはＩＣＰ４７タンパク質の非発現の
いずれかをもたらすＵＳ１２遺伝子領域内の欠失または変異 を有するＨＳＶ−１のゲノムの変異体を含んでなる、組換え単純ヘルペスウイル
スに関する。
【００２２】
用語「非機能性」は、その正常な生理学的活性を遂行することが不可能なタン
パク質を呼ぶ。ＵＳ８遺伝子の場合に、遺伝子の正常な発現産物は、「末端切除
ｇＥ」と呼ばれるタンパク質であり、そして非機能性産物はｇＩタンパク質と二
量体を形成できないタンパク質である。ＵＳ１２遺伝子の場合には、タンパク質
ＩＣＰ４７の正常発現産物であり、これは感染された細胞の小胞体（ＥＲ）内の
ＴＡＰ１／ＴＡＰ２二量体によりＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩポリペプチドへ結合
しそしてノナペプチドの輸送を阻害する。「非−機能性」ＵＳ１２発現産物は、
輸送の該阻害を遂行できない産物である。
パク質を呼ぶ。ＵＳ８遺伝子の場合に、遺伝子の正常な発現産物は、「末端切除
ｇＥ」と呼ばれるタンパク質であり、そして非機能性産物はｇＩタンパク質と二
量体を形成できないタンパク質である。ＵＳ１２遺伝子の場合には、タンパク質
ＩＣＰ４７の正常発現産物であり、これは感染された細胞の小胞体（ＥＲ）内の
ＴＡＰ１／ＴＡＰ２二量体によりＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩポリペプチドへ結合
しそしてノナペプチドの輸送を阻害する。「非−機能性」ＵＳ１２発現産物は、
輸送の該阻害を遂行できない産物である。
【００２３】
本発明の範囲内には、非機能性タンパク質をもたらすかまたはウイルスタンパ
ク質全体の非発現をもたらす遺伝子中のあらゆる変異または欠失がある。変異ま
たは欠失は、遺伝子のコーディング領域内またはその制御領域内にあってもよく
、上記の非発現または非機能性タンパク質の発現をもたらす。
ク質全体の非発現をもたらす遺伝子中のあらゆる変異または欠失がある。変異ま
たは欠失は、遺伝子のコーディング領域内またはその制御領域内にあってもよく
、上記の非発現または非機能性タンパク質の発現をもたらす。
【００２４】
用語「欠失」は、遺伝子配列の部分的欠失または完全な欠失を呼ぶことができ
る。部分的欠失が起きた場合に、これはタンパク質の発現を避けるために十分な
長さであるかまたは非−機能性タンパク質を産生するために必要な長さでなけれ
ばならない。用語「変異」は、本来のＨＳＶ−１と比較して、少なくとも１個の
核酸の付加、置換または転位を呼び、非−機能性発現産物の産生か、または以上
に説明した発現産物の産生の完全な欠如のいずれかをもたらす。この場合にも、
変異および変化は遺伝子のコーディングまたは非−コーディング領域内にあって
もよい。
る。部分的欠失が起きた場合に、これはタンパク質の発現を避けるために十分な
長さであるかまたは非−機能性タンパク質を産生するために必要な長さでなけれ
ばならない。用語「変異」は、本来のＨＳＶ−１と比較して、少なくとも１個の
核酸の付加、置換または転位を呼び、非−機能性発現産物の産生か、または以上
に説明した発現産物の産生の完全な欠如のいずれかをもたらす。この場合にも、
変異および変化は遺伝子のコーディングまたは非−コーディング領域内にあって
もよい。
【００２５】
好ましくは、本発明の組換えウイルスは、上記の２種の変種に加えて、ＵＳ９
、ＵＳ１０およびＵＳ１１外被タンパク質から成る群から選ばれた遺伝子内で少
なくとも１種の追加の欠失また変異を含むべきであり、該欠失または変異は、こ
れらの遺伝子の発現産物の産生を排除するかまたは以上に説明した非−機能性発
現産物、すなわちその非変異対照物の正常な生理学的活性の遂行が不可能な産物
を産生することのいずれかである。
、ＵＳ１０およびＵＳ１１外被タンパク質から成る群から選ばれた遺伝子内で少
なくとも１種の追加の欠失また変異を含むべきであり、該欠失または変異は、こ
れらの遺伝子の発現産物の産生を排除するかまたは以上に説明した非−機能性発
現産物、すなわちその非変異対照物の正常な生理学的活性の遂行が不可能な産物
を産生することのいずれかである。
【００２６】
最も好ましくは、本発明の組換え体は、ＵＳ９およびＵＳ１０およびＵＳ１１
内に同時に該欠失または変異を有していまければならず、これらの遺伝子の発現
産物のいずれも産生されないか、または産生された発現物が以上に説明した非−
機能性発現産物を産生するかまたは非−発現および非−機能性発現の組み合わせ
である。
内に同時に該欠失または変異を有していまければならず、これらの遺伝子の発現
産物のいずれも産生されないか、または産生された発現物が以上に説明した非−
機能性発現産物を産生するかまたは非−発現および非−機能性発現の組み合わせ
である。
【００２７】
ＵＳ９は、外被リン酸化タンパク質の合成をコードし、ＵＳ１０は他の外被タ
ンパク質をコードする。ＵＳ１１は、感染細胞内の６０Ｓリボソームサブユニッ
トを結合し、そして遺伝子ＵＬ３４（膜−関連リン酸化ビリオンタンパク質）の
ｍＲＮＡ転写物にも結合する外被タンパク質をコードする。
ンパク質をコードする。ＵＳ１１は、感染細胞内の６０Ｓリボソームサブユニッ
トを結合し、そして遺伝子ＵＬ３４（膜−関連リン酸化ビリオンタンパク質）の
ｍＲＮＡ転写物にも結合する外被タンパク質をコードする。
【００２８】
上記の非−機能性産物は、非変異対照物の通常の生理学系活性を遂行できない
産物である。
産物である。
【００２９】
本発明の好ましい態様に従うと、本発明の組換え体は、ＵＳ１２領域、ＵＳ９
領域、ＵＳ１０領域およびＵＳ１１領域を、これらの遺伝子の全配列の欠失によ
り完全に欠失し、そしてＵＳ８領域は、逆スプライシングおよび組換えにより変
異され、１８８アミノ酸（ａａ）を有するｇＥのさらに短い非−機能性産物（Ｈ
ＳＶ−１ Ｓｙｎ１７中で５５０ａａを有する機能性ｇＥと比較して）をコード
し、このタンパク質はＨＳＶ−１Ｓｙｎ１７のｇＥタンパク質のＮ−末端１７０
ａａと一致する。変異したＵＳ８遺伝子の産物、すなわち末端切除したｇＥタン
パク質は、ＵＳ７によりコードされるｇＩとヘテロ二量体を形成せず、そして上
記のヘテロ二量体がないとＨＳＶ−１ Ｒ１５は神経細胞に浸透および感染でき
ない。
領域、ＵＳ１０領域およびＵＳ１１領域を、これらの遺伝子の全配列の欠失によ
り完全に欠失し、そしてＵＳ８領域は、逆スプライシングおよび組換えにより変
異され、１８８アミノ酸（ａａ）を有するｇＥのさらに短い非−機能性産物（Ｈ
ＳＶ−１ Ｓｙｎ１７中で５５０ａａを有する機能性ｇＥと比較して）をコード
し、このタンパク質はＨＳＶ−１Ｓｙｎ１７のｇＥタンパク質のＮ−末端１７０
ａａと一致する。変異したＵＳ８遺伝子の産物、すなわち末端切除したｇＥタン
パク質は、ＵＳ７によりコードされるｇＩとヘテロ二量体を形成せず、そして上
記のヘテロ二量体がないとＨＳＶ−１ Ｒ１５は神経細胞に浸透および感染でき
ない。
【００３０】
別の好ましい態様では、本発明の組換えヘルペスウイルスは、下記の遺伝子：
ＩＰＣ２２をコードするＵＳ１遺伝子（ＩＥ４）およびＯＲＦ２９１ａａをコー
ドするＵＳ２遺伝子の少なくとも１個の複製を含む。２種のＵＳ遺伝子の存在は
、ＨＳＶ−１ Ｒ１５の特別な特徴である。ＩＰＣ２２の機能は、感染性ビリオ
ンの高い力価の産生をウイルスに可能とさせるγ２遺伝子発現およびウイルス遺
伝子転写の調節である。
ＩＰＣ２２をコードするＵＳ１遺伝子（ＩＥ４）およびＯＲＦ２９１ａａをコー
ドするＵＳ２遺伝子の少なくとも１個の複製を含む。２種のＵＳ遺伝子の存在は
、ＨＳＶ−１ Ｒ１５の特別な特徴である。ＩＰＣ２２の機能は、感染性ビリオ
ンの高い力価の産生をウイルスに可能とさせるγ２遺伝子発現およびウイルス遺
伝子転写の調節である。
【００３１】
最も好ましくは、複製は、これらの遺伝子の少なくとも１種、そして好ましく
は両方がＳの内部反復（ＩＲＳ）およびＳの末端反復（ＴＲＳ）内の両方に現れ
るべきである。
は両方がＳの内部反復（ＩＲＳ）およびＳの末端反復（ＴＲＳ）内の両方に現れ
るべきである。
【００３２】
別の好ましい態様では、本発明の組換え体は、ＵＬ５４、および遺伝子産物Ｉ
ＣＰ２７および神経毒性因子であるγ１３４．５遺伝子産物ＩＣＰ３４．５を発
現しない。ＵＳ１２遺伝子近くの欠失または変異が、未知機構による上記の遺伝
子の発現に影響するのではないかと報告された。しかし、これらの産物の非−発
現は、ＵＳ１２内の欠失と独立したイベントであってもよい。
ＣＰ２７および神経毒性因子であるγ１３４．５遺伝子産物ＩＣＰ３４．５を発
現しない。ＵＳ１２遺伝子近くの欠失または変異が、未知機構による上記の遺伝
子の発現に影響するのではないかと報告された。しかし、これらの産物の非−発
現は、ＵＳ１２内の欠失と独立したイベントであってもよい。
【００３３】
さらに別の態様では、本発明の組換え体は、チロシンキナーゼ（ＴＫ）をコー
ドする活性ＵＬ２３遺伝子を有する。これは、抗−ヘルペス薬剤アシクロビルを
用いる処理に対して影響されやすい組換えウイルスをもたらす。従って、本発明
の組換え体の複製を制御することを希望する場合、例えばワクチン接種された個
体が欠乏症候群を示す場合に、制御はアシクロビルの投与により達成されてもよ
い。
ドする活性ＵＬ２３遺伝子を有する。これは、抗−ヘルペス薬剤アシクロビルを
用いる処理に対して影響されやすい組換えウイルスをもたらす。従って、本発明
の組換え体の複製を制御することを希望する場合、例えばワクチン接種された個
体が欠乏症候群を示す場合に、制御はアシクロビルの投与により達成されてもよ
い。
【００３４】
最も好ましい態様では、本発明は図１０、１１および１２中にＲ１５として示
した組換え体に関する。
した組換え体に関する。
【００３５】
本発明は、さらに、活性成分として本発明の組換えＲ１５単純ヘルペスウイル
スを、場合により免疫学的に受容できるキャリヤーと一緒に含んでなる抗ＨＳＶ
−１ワクチンに関する。他の方法では、本発明は、ウイルス糖タンパク質Ｂ遺伝
子を発現するＤＮＡワクチンに関する。ＨＳＶ−１ Ｒ１５の前または同時のＨ
ＳＶ ＤＮＡワクチンを用いる免疫化は、ワクチンの保護を増強する。
スを、場合により免疫学的に受容できるキャリヤーと一緒に含んでなる抗ＨＳＶ
−１ワクチンに関する。他の方法では、本発明は、ウイルス糖タンパク質Ｂ遺伝
子を発現するＤＮＡワクチンに関する。ＨＳＶ−１ Ｒ１５の前または同時のＨ
ＳＶ ＤＮＡワクチンを用いる免疫化は、ワクチンの保護を増強する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、抗−ヘルペス２、ヘルペス３、ヘルペス４、ヘルペ
ス５、ヘルペス６、ヘルペス７またはヘルペス８ワクチンに関し、活性成分とし
て、該ゲノム内にそれぞれウイルス２〜ウイルス８から得た非相同配列を有する
本発明の組換えウイルスを含んでなる、該非相同配列が該ウイルスの免疫原性タ
ンパク質をコードするものに関する。好ましくは、免疫原性タンパク質は、関連
ヘルペス種から得た適当なヘルペスウイルス糖タンパク質であるべきである。
ス５、ヘルペス６、ヘルペス７またはヘルペス８ワクチンに関し、活性成分とし
て、該ゲノム内にそれぞれウイルス２〜ウイルス８から得た非相同配列を有する
本発明の組換えウイルスを含んでなる、該非相同配列が該ウイルスの免疫原性タ
ンパク質をコードするものに関する。好ましくは、免疫原性タンパク質は、関連
ヘルペス種から得た適当なヘルペスウイルス糖タンパク質であるべきである。
【００３７】
本発明は、対象体に免疫学的に有効な量の上記の組換え単純ヘルペスウイルス
を投与して、上記のように単純ヘルペス１またはヘルペスウイルス２〜８のいず
れかに対して該対象体を免疫化するための方法にも関する。例えば、免疫化は、
免疫化した対象体の上腕の皮膚内の表面引っかきに感染させてもよい。
を投与して、上記のように単純ヘルペス１またはヘルペスウイルス２〜８のいず
れかに対して該対象体を免疫化するための方法にも関する。例えば、免疫化は、
免疫化した対象体の上腕の皮膚内の表面引っかきに感染させてもよい。
【００３８】
本発明の別の態様は、本発明の組換え体ＨＳＶ−１ Ｒ１５が脳星状膠細胞内
に選択的に複製可能であり、神経細胞を感染しないという知見に基づく。従って
、本発明は、さらに、活性成分として本発明の組換えウイルスを含んでなる星状
膠細胞脳腫瘍の治療のための薬剤組成物に関する。ＨＳＶ−１ Ｒ１５は、脳腫
瘍内への定位注入により脳に達してもよい。脳内で、本発明の組換えヘルペスウ
イルスは、星状膠細胞腫瘍細胞内でのみ複製し、従って本来の複製によりこれら
を破壊し、一方神経細胞は損傷されないままに維持する。
に選択的に複製可能であり、神経細胞を感染しないという知見に基づく。従って
、本発明は、さらに、活性成分として本発明の組換えウイルスを含んでなる星状
膠細胞脳腫瘍の治療のための薬剤組成物に関する。ＨＳＶ−１ Ｒ１５は、脳腫
瘍内への定位注入により脳に達してもよい。脳内で、本発明の組換えヘルペスウ
イルスは、星状膠細胞腫瘍細胞内でのみ複製し、従って本来の複製によりこれら
を破壊し、一方神経細胞は損傷されないままに維持する。
【００３９】
別の方法では、本発明のＨＳＶ−１ Ｒ１５が、細胞毒として知られている非
相同配列、例えばアポトーシスを誘導する遺伝子も含んでなってもよい。
相同配列、例えばアポトーシスを誘導する遺伝子も含んでなってもよい。
【００４０】
従って、本発明の薬剤組成物は、該細胞毒性を含む組み替えウイルスを含む。
細胞毒性の原因となるこれらの配列は、本発明の組換えウイルスを用いて感染さ
れた細胞、すなわち星状膠細胞内でのみ発現され、一方、ウイルスにより影響を
受けていない他の脳細胞は損傷されない。さらに、本発明の薬剤組成物は、非相
同配列を持たない本発明の組換え、または細胞毒性非相同配列も有するこのよう
な組換え体のいずれかを用いて、皮膚および内蔵内の充実性腫瘍の治療のために
使用できる。
細胞毒性の原因となるこれらの配列は、本発明の組換えウイルスを用いて感染さ
れた細胞、すなわち星状膠細胞内でのみ発現され、一方、ウイルスにより影響を
受けていない他の脳細胞は損傷されない。さらに、本発明の薬剤組成物は、非相
同配列を持たない本発明の組換え、または細胞毒性非相同配列も有するこのよう
な組換え体のいずれかを用いて、皮膚および内蔵内の充実性腫瘍の治療のために
使用できる。
【００４１】
さらに別の態様では、本発明の単純ヘルペス組換え体は、障害、疾患または病
理学的状態の治療のための他の薬剤組成物の調製に使用してもよく、ここで有益
な効果は、細胞内の所望の遺伝子、例えば遺伝子治療においてその場でヒトＰＭ
Ｌ遺伝子を発現することにより腫瘍細胞サイクルを阻害する遺伝子の発現により
明らかとなるであろう。本発明は、さらに、例えば遺伝子治療における発現の際
に、有益な治療効果、例えば腫瘍増殖の阻害を与える、その中に挿入された非相
同配列を有する組換えウイルスにも関する。
理学的状態の治療のための他の薬剤組成物の調製に使用してもよく、ここで有益
な効果は、細胞内の所望の遺伝子、例えば遺伝子治療においてその場でヒトＰＭ
Ｌ遺伝子を発現することにより腫瘍細胞サイクルを阻害する遺伝子の発現により
明らかとなるであろう。本発明は、さらに、例えば遺伝子治療における発現の際
に、有益な治療効果、例えば腫瘍増殖の阻害を与える、その中に挿入された非相
同配列を有する組換えウイルスにも関する。
【００４２】
星状膠細胞腫の治療の目的でまたはその他の遺伝子治療の目的で挿入されたヘ
ルペスウイルスまたはその他のＤＮＡまたはＲＮＡウイルスに対する免疫化のた
めのワクチンの調製のためのいずれかの非相同配列は、遺伝子の欠失の部位（例
えばＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１またはＵＳ１２遺伝子の欠失の部位内またはウ
イルス複製に本質的でない部位）においてＨＳＶ Ｒ１５ゲノム内に好ましくは
挿入するべきである。非相同配列の発現は、既知の制御要素、例えばＨＳＶ−１
またはＣＭＶプロモーターのいずれかの制御下にあることができる。
ルペスウイルスまたはその他のＤＮＡまたはＲＮＡウイルスに対する免疫化のた
めのワクチンの調製のためのいずれかの非相同配列は、遺伝子の欠失の部位（例
えばＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１またはＵＳ１２遺伝子の欠失の部位内またはウ
イルス複製に本質的でない部位）においてＨＳＶ Ｒ１５ゲノム内に好ましくは
挿入するべきである。非相同配列の発現は、既知の制御要素、例えばＨＳＶ−１
またはＣＭＶプロモーターのいずれかの制御下にあることができる。
【００４３】
表の簡単な説明
表１Ａ 成体マウスに対する種々のＨＳＶ−１系統の病原性
表１Ｂ 哺乳期マウスに対する種々のＨＳＶ−１系統の病原性
表２ 鼻内免疫化後の成体マウスの脳組織内のＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡの
分布、非病原性系統ＨＳＶ−１ｖｈｓ（ＵＬ４１）と比較 表３ マウスフットパッド皮膚内感染後の脊髄および副腎内へのＨＳＶ−１
Ｒ１５の浸透 表４ 脳内（５０μｌ／動物）または腹腔内に接種されたマウス系統Ａ／Ｊ内
のＨＳＶ−１の病原性、および 表５ アシクロビルによるＨＳＶ−１ Ｒ１５およびＨＦＥＭプラーク形成の
阻害 表６ Ｒ１５を用いるＩＣＶ接種および攻撃行動、発熱、ＰＧＥ産生および系
統Ｓｙｎ１７+ を用いるチャレンジの測定
分布、非病原性系統ＨＳＶ−１ｖｈｓ（ＵＬ４１）と比較 表３ マウスフットパッド皮膚内感染後の脊髄および副腎内へのＨＳＶ−１
Ｒ１５の浸透 表４ 脳内（５０μｌ／動物）または腹腔内に接種されたマウス系統Ａ／Ｊ内
のＨＳＶ−１の病原性、および 表５ アシクロビルによるＨＳＶ−１ Ｒ１５およびＨＦＥＭプラーク形成の
阻害 表６ Ｒ１５を用いるＩＣＶ接種および攻撃行動、発熱、ＰＧＥ産生および系
統Ｓｙｎ１７+ を用いるチャレンジの測定
【００４４】
【発明の詳細な記述】実験手順
１．マウス
サブラ(Sabra) 系統（異系交配）のマウスは、ヘブライ大学の育種施設から提
供された。それぞれケージ内にマウス１０匹が居住した。これらは、ＨＵＪの動
物飼育施設のＳＰＦ内で標準栄養食餌および水の供給を受けた。
供された。それぞれケージ内にマウス１０匹が居住した。これらは、ＨＵＪの動
物飼育施設のＳＰＦ内で標準栄養食餌および水の供給を受けた。
【００４５】
２．細胞および培地
細胞株ベロ(Vero)（ミドリザル(green monkey)の腎臓上皮細胞）およびＨｅｌ
ａ（ヒト）を１０％ウシ胎児血清(Beit HaEmek) を強化し、ペニシリン４０単位
／ｍｌおよびストレプトマイシン１６０ｍｇ／ｍｌを補足したＤＭＥＭ(GIBCO)
の培地内で増殖させた。細胞は、培養皿（NUNC、デンマーク）中、３７℃で５％
ＣＯ2†を用いてそして１００％相対湿度中で培養した。０．２５％トリプシン
（ｗ／ｖ）および０．２％ＥＤＴＡの１：５溶液中にこれらを浸漬して細胞を皿
から移し、そして上記と同じ条件下で接種しそして集密単層まで増殖させた。
ａ（ヒト）を１０％ウシ胎児血清(Beit HaEmek) を強化し、ペニシリン４０単位
／ｍｌおよびストレプトマイシン１６０ｍｇ／ｍｌを補足したＤＭＥＭ(GIBCO)
の培地内で増殖させた。細胞は、培養皿（NUNC、デンマーク）中、３７℃で５％
ＣＯ2†を用いてそして１００％相対湿度中で培養した。０．２５％トリプシン
（ｗ／ｖ）および０．２％ＥＤＴＡの１：５溶液中にこれらを浸漬して細胞を皿
から移し、そして上記と同じ条件下で接種しそして集密単層まで増殖させた。
【００４６】
一次星状膠細胞培養物は、新生ラット脳半球から調製した。髄膜の切断除去の
後、組織を酵素（トリプシン）的および機械的に分散させ、４％ＢＳＡ層を通し
て遠心分離し、そして３〜３．５ｘ１０7†細胞を、ポリ−Ｄ−リシン被覆した
Ｔ−７５フラスコ上に接種した。１週間増殖の後、ミクログリアおよび乏突起神
経膠細胞系統細胞を振とう法により分離し、そして残った星状膠細胞を一回通過
させて、９５％純粋の星状膠細胞培養物を得た。
後、組織を酵素（トリプシン）的および機械的に分散させ、４％ＢＳＡ層を通し
て遠心分離し、そして３〜３．５ｘ１０7†細胞を、ポリ−Ｄ−リシン被覆した
Ｔ−７５フラスコ上に接種した。１週間増殖の後、ミクログリアおよび乏突起神
経膠細胞系統細胞を振とう法により分離し、そして残った星状膠細胞を一回通過
させて、９５％純粋の星状膠細胞培養物を得た。
【００４７】
３．ウイルス
３．１ ウイルス系統および組換え
本研究に使用したＨＳＶ−１ウイルス系統は、ＫＯＳ、ＨＦＥＭ、Ｆ（ラップ
教授(Prof. Rapp, Pennsylvania, USA) から提供された）、変異ｖｈｓ−１（ニ
ツッア−フレンケル博士(Dr. Nitza Frenkel, Tel Aviv University)から提供さ
れた）、およびＳｙｎ１７（スバク−シャープ教授(Prof. Subak-Sharpe, Glasg
ow, Scotland) から提供された）であった。
教授(Prof. Rapp, Pennsylvania, USA) から提供された）、変異ｖｈｓ−１（ニ
ツッア−フレンケル博士(Dr. Nitza Frenkel, Tel Aviv University)から提供さ
れた）、およびＳｙｎ１７（スバク−シャープ教授(Prof. Subak-Sharpe, Glasg
ow, Scotland) から提供された）であった。
【００４８】
組換えＨＳＶ−１ Ｒ１５およびＲ１９は、Ａ．レーゼン−ヴォルフ博士およ
びＧ．ダライ教授(Dr. A. Roesen-Wolf and Prof. G. Darai, Heidelberg Unive
rsity, Heidelberg,ドイツ）により作製された。これらは、ＨＳＶ−１ Ｆ系統
からのＢａｍＨＩ−Ｂ ＤＮＡ断片（座標１１３，３２２−１２３，４６４）を
ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭ ＤＮＡゲノムを用いて組み換えて作製した。
びＧ．ダライ教授(Dr. A. Roesen-Wolf and Prof. G. Darai, Heidelberg Unive
rsity, Heidelberg,ドイツ）により作製された。これらは、ＨＳＶ−１ Ｆ系統
からのＢａｍＨＩ−Ｂ ＤＮＡ断片（座標１１３，３２２−１２３，４６４）を
ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭ ＤＮＡゲノムを用いて組み換えて作製した。
【００４９】
組換えＨＳＶ−Ｍ−ｌａｃＺ（Ｆブルー）もＡ．レーゼン−ヴォルフ博士によ
りＧ．ダライ教授の実験室内で作製された。ＨＳＶ−１ Ｆ系統のＵＬ５６遺伝
子をコードするＤＮＡ断片（座標１１６，０３０−１２１，７５３）は、ＲＳＶ
プロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼに対する細菌遺伝子を含むＤＮＡ
断片と交換した。
りＧ．ダライ教授の実験室内で作製された。ＨＳＶ−１ Ｆ系統のＵＬ５６遺伝
子をコードするＤＮＡ断片（座標１１６，０３０−１２１，７５３）は、ＲＳＶ
プロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼに対する細菌遺伝子を含むＤＮＡ
断片と交換した。
【００５０】
病原性組換えウイルス系統Ｐ４２およびＰ７１は、Ｙ．ベッカー教授(Prof. Y
. Becker, Jerusalem, Israel)の実験室内においてＴ．ベン−ハー博士(Dr. T.
Ben-Hur)により作製された。これらの系統は、毒性ＨＳＶ−１ Ｒ１９組換え体
からのＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片（座標１１１，２９０−１１３，３２
２）と無毒性ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換えＤＮＡゲノムとの間の組換えの結果であ
った。
. Becker, Jerusalem, Israel)の実験室内においてＴ．ベン−ハー博士(Dr. T.
Ben-Hur)により作製された。これらの系統は、毒性ＨＳＶ−１ Ｒ１９組換え体
からのＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片（座標１１１，２９０−１１３，３２
２）と無毒性ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換えＤＮＡゲノムとの間の組換えの結果であ
った。
【００５１】
ＴＫ変異体は、ベッカー教授の実験室内でＢＵＤＲ（Ｆ ＴＫ、ＦブルーＴＫ
、Ｒ１５ ＴＫ、ＫＯＳ ＴＫ、Ｓｙｎ−１７ＴＫ）を用いて作製した。
、Ｒ１５ ＴＫ、ＫＯＳ ＴＫ、Ｓｙｎ−１７ＴＫ）を用いて作製した。
【００５２】
ウイルスは、ベロ細胞内で完全な細胞病的効果が得られるまで増殖させた。ウ
イルス力価は、標準のプラークアッセイを用いて試験しそしてウイルスストック
を−７０℃で保存した。非感染細胞（擬似）の音波処理懸濁液は、マウス感染試
験における陰性対照として役立った。 ３．２ ウイルス力価の決定 ベロ細胞を新規に調製したウイルスストックの１０倍希釈物を用いて感染させ
た。１時間吸着の後、ＤＭＥＭ中にアガー０．７％を含む上層を用いて細胞を被
覆し、そしてＣＯ2 インキュベーター中３７℃でインキュベーションした。３日
後、２５％ホルマリン溶液を用いて細胞を固定し、そしてゲンチアナバイオレッ
トを用いて染色した。ウイルスプラークを計数しそして力価をプラーク形成単位
(pfu/ml)として決定した。
イルス力価は、標準のプラークアッセイを用いて試験しそしてウイルスストック
を−７０℃で保存した。非感染細胞（擬似）の音波処理懸濁液は、マウス感染試
験における陰性対照として役立った。 ３．２ ウイルス力価の決定 ベロ細胞を新規に調製したウイルスストックの１０倍希釈物を用いて感染させ
た。１時間吸着の後、ＤＭＥＭ中にアガー０．７％を含む上層を用いて細胞を被
覆し、そしてＣＯ2 インキュベーター中３７℃でインキュベーションした。３日
後、２５％ホルマリン溶液を用いて細胞を固定し、そしてゲンチアナバイオレッ
トを用いて染色した。ウイルスプラークを計数しそして力価をプラーク形成単位
(pfu/ml)として決定した。
【００５３】
４． ウイルスを用いるマウスの感染
３〜４週齢の雄セブラマウスを種々の力価のＨＳＶ−１系統および組換え体を
用いて感染させた。それぞれのマウスは、希釈したウイルスストック３０〜５０
μｌを鼻に導入して受けた。哺乳期マウス（７日齢）は、希釈したウイルススト
ックを用いて同じ方法で感染させた。予備実験において、マウスは、ウイルス感
染前の１０〜２０秒間、ハロセン蒸気を用いて麻酔した。これらのマウス内のウ
イルス感染は、ＣＮＳ内だけでなく肺内にも病理学的変化を起こしたことが認め
られた。従って、マウスは感染の前には麻酔されなかった。疾患の進行は、４〜
６週間監視した。対照群（擬似）のマウスは、同じ方法で処置した。追跡は、独
立した研究者２人が毎日行った。結果を記録し比較した。
用いて感染させた。それぞれのマウスは、希釈したウイルスストック３０〜５０
μｌを鼻に導入して受けた。哺乳期マウス（７日齢）は、希釈したウイルススト
ックを用いて同じ方法で感染させた。予備実験において、マウスは、ウイルス感
染前の１０〜２０秒間、ハロセン蒸気を用いて麻酔した。これらのマウス内のウ
イルス感染は、ＣＮＳ内だけでなく肺内にも病理学的変化を起こしたことが認め
られた。従って、マウスは感染の前には麻酔されなかった。疾患の進行は、４〜
６週間監視した。対照群（擬似）のマウスは、同じ方法で処置した。追跡は、独
立した研究者２人が毎日行った。結果を記録し比較した。
【００５４】
マウスモデル内のＨＳＶ−１ウイルス疾患（ヘルペス脳炎）進行の主要な段階
は、１．脱力−運動の欠如、２．身体のフレキシア、３．毛の逆立ち、４．結膜
炎（眼感染）、５．先端チアノーゼ（身体外肢が青色となる）、６．筋肉痙攣、
７．麻痺、８．死亡。
は、１．脱力−運動の欠如、２．身体のフレキシア、３．毛の逆立ち、４．結膜
炎（眼感染）、５．先端チアノーゼ（身体外肢が青色となる）、６．筋肉痙攣、
７．麻痺、８．死亡。
【００５５】
症候群の重症度は、（−）（疾患兆候なし）から（＋＋＋＋）（最も極端な症
状症候群の現れ）まで段階付けた。
状症候群の現れ）まで段階付けた。
【００５６】
５．感染したマウスから組織試料の採取
マウスを頸部脱臼により屠殺しそして分析に必要な組織を切除して取り出した
。組織試料（鼻上皮、三叉神経節、嗅球、脊髄および副腎）を試験管に移しそし
てその後の分析まで−７０℃で保存した。
。組織試料（鼻上皮、三叉神経節、嗅球、脊髄および副腎）を試験管に移しそし
てその後の分析まで−７０℃で保存した。
【００５７】
６．血清の調製
ＨＳＶ−１感染マウスを頸部脱臼により屠殺しそしてマウスの胸を直ちに外科
的に開きそして心臓を暴露した。血液をパスツールピペットを用いて吸引し、エ
ッペンドルフ試験管に移し、２時間室温でインキュベーションしそして１０分間
、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。抗体を含む液体（血清）の上部をエッペン
ドルフ試験管に移し、そしてその後の分析まで−２０℃で保存した。
的に開きそして心臓を暴露した。血液をパスツールピペットを用いて吸引し、エ
ッペンドルフ試験管に移し、２時間室温でインキュベーションしそして１０分間
、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。抗体を含む液体（血清）の上部をエッペン
ドルフ試験管に移し、そしてその後の分析まで−２０℃で保存した。
【００５８】
７．感染および免疫化されたマウスからの血清中の中和抗体の力価の決定
１００μｌ血清（適当に希釈）を１００μｌウイルスストック（１０3 ｐｆｕ
／ｍｌの力価）および増殖媒体ＤＭＥＭ５０μｌと混合しそして２時間、４℃で
インキュベーションした。この混合物を、３７℃で５％ＣＯ2 を用いてインキュ
ベーションしたベロ細胞単層に加えそして標準プラークアッセイを行った。
／ｍｌの力価）および増殖媒体ＤＭＥＭ５０μｌと混合しそして２時間、４℃で
インキュベーションした。この混合物を、３７℃で５％ＣＯ2 を用いてインキュ
ベーションしたベロ細胞単層に加えそして標準プラークアッセイを行った。
【００５９】
中和抗体のレベルは、ウイルスプラーク阻害の百分率に従って算出した。
【００６０】
８．マウス組織中の感染性ウイルスの検出
組織試料をダウンス(Dounce)ホモジナイザー中、１ｍｌＰＢＳ中でホモジナイ
ズした。ホモジナイゼーションの後、試料２００μｌを音波処理し、そしてベロ
細胞単層に加えた。細胞を３７℃で５％ＣＯ2を用いて数日間インキュベーショ
ンしそしてウイルスの細胞病理効果を観察した。
ズした。ホモジナイゼーションの後、試料２００μｌを音波処理し、そしてベロ
細胞単層に加えた。細胞を３７℃で５％ＣＯ2を用いて数日間インキュベーショ
ンしそしてウイルスの細胞病理効果を観察した。
【００６１】
９．高分子量ＨＳＶ−１ ＤＮＡの作製
９．１ 精製したＨＳＶ−１ビリオンの作製
ウイルス−感染細胞（１０9）をＴＢＳ緩衝液中で洗浄し、緩衝液の最小体積
中にかき落とし、２分間音波処理しそしてニトロセルロース試験管中のスクロー
ス勾配（ＴＢＳ緩衝液中のスクロース１２％〜５２％ｗ／ｗ）上に配置した。勾
配を１時間、ローターＴＳＴ−２８内、２５０００ｒｐｍで遠心分離した。ビリ
オンのバンドをポリアロマー管に移しそしてＴＢＳ中で希釈した。管を同じ条件
下で再び遠心分離しそしてビリオンペレットを１ｍｌ ＴＥ緩衝液中に再懸濁し
た。 ９．２ 精製ウイルス（９．１）から、ウイルス感染細胞からまたは組織試料か らの高分子量ウイルスＤＮＡの作製 ＴＥ緩衝液０．５ｍｌまたは１．０ｍｌを、プロテイナーゼＫ(Sigma) （最終
濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）および１％ＳＤＳ(Sigma) の存在下で試料に加えた。試
料を５５℃で２時間、または室温（Ｒ．Ｔ．）で一晩、おだやかに振とうしてイ
ンキュベーションした。試料溶解物をフェノールを用いて２回、次いで４％イソ
アミルアルコールを含むクロロホルムを用いて抽出した。ＤＮＡはエタノールを
用いて水相から沈降させ、ＴＥ緩衝液４００ｍｌ中に溶解しそして４℃で保存し
た。
中にかき落とし、２分間音波処理しそしてニトロセルロース試験管中のスクロー
ス勾配（ＴＢＳ緩衝液中のスクロース１２％〜５２％ｗ／ｗ）上に配置した。勾
配を１時間、ローターＴＳＴ−２８内、２５０００ｒｐｍで遠心分離した。ビリ
オンのバンドをポリアロマー管に移しそしてＴＢＳ中で希釈した。管を同じ条件
下で再び遠心分離しそしてビリオンペレットを１ｍｌ ＴＥ緩衝液中に再懸濁し
た。 ９．２ 精製ウイルス（９．１）から、ウイルス感染細胞からまたは組織試料か らの高分子量ウイルスＤＮＡの作製 ＴＥ緩衝液０．５ｍｌまたは１．０ｍｌを、プロテイナーゼＫ(Sigma) （最終
濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）および１％ＳＤＳ(Sigma) の存在下で試料に加えた。試
料を５５℃で２時間、または室温（Ｒ．Ｔ．）で一晩、おだやかに振とうしてイ
ンキュベーションした。試料溶解物をフェノールを用いて２回、次いで４％イソ
アミルアルコールを含むクロロホルムを用いて抽出した。ＤＮＡはエタノールを
用いて水相から沈降させ、ＴＥ緩衝液４００ｍｌ中に溶解しそして４℃で保存し
た。
【００６２】
１０． 間接免疫蛍光染色
カバースライド上で培養した亜集密(subconfluent)単層細胞培養物をＨＳＶ−
１ウイルスを用いて感染させた（または別の方法で処理した）。懸濁培養物をポ
リ−Ｌ−リシン溶液１：１０(Sigma) を用いてカバースライドに付着させた。細
胞を４％ホルムアルデヒドを用いて固定し（１０分間、室温）そしておだやかに
振とうしてＰＢＳを用いて再水和した（５分間、２回、室温）。細胞を５０ｍＭ
ＮＨ4 Ｃｌを用い（５分間、室温）、その後†ＰＢＳを用いて（５分間、２回
、室温）洗浄した（この段階で操作を中断してもよく、そしてスライドは−２０
℃で冷凍できる）。
１ウイルスを用いて感染させた（または別の方法で処理した）。懸濁培養物をポ
リ−Ｌ−リシン溶液１：１０(Sigma) を用いてカバースライドに付着させた。細
胞を４％ホルムアルデヒドを用いて固定し（１０分間、室温）そしておだやかに
振とうしてＰＢＳを用いて再水和した（５分間、２回、室温）。細胞を５０ｍＭ
ＮＨ4 Ｃｌを用い（５分間、室温）、その後†ＰＢＳを用いて（５分間、２回
、室温）洗浄した（この段階で操作を中断してもよく、そしてスライドは−２０
℃で冷凍できる）。
【００６３】
細胞上のＦｃ受容体の遮断のために、スライドを５％正常ヤギ血清を用いてイ
ンキュベーションし（２０分間、室温）、次いでＰＢＳを用いて洗浄した（５分
間、室温、３回）。次いで細胞を一次抗体と一緒にインキュベーションし（一時
間、室温）、ＰＢＳを用いて洗浄し（５分間、室温、３回）、二次抗体と一緒に
インキュベーションし（４５分間、室温、暗所）、そしてＰＢＳを用いて洗浄し
た（５分間、室温、暗所）。抗脱色(antibleaching) 媒体（４５ｍｌグリセロー
ルｐＨ８．５、５ｍｌ ＰＢＳ ｐＨ７．４〜ｐＨ７．５、０．５ｇ ＤＡＢＣ
Ｏ(Sigma) および０．０５ｇ ＮａＮ3）を用いてスライドを調製しそして＋４
℃、暗所で保存した。
ンキュベーションし（２０分間、室温）、次いでＰＢＳを用いて洗浄した（５分
間、室温、３回）。次いで細胞を一次抗体と一緒にインキュベーションし（一時
間、室温）、ＰＢＳを用いて洗浄し（５分間、室温、３回）、二次抗体と一緒に
インキュベーションし（４５分間、室温、暗所）、そしてＰＢＳを用いて洗浄し
た（５分間、室温、暗所）。抗脱色(antibleaching) 媒体（４５ｍｌグリセロー
ルｐＨ８．５、５ｍｌ ＰＢＳ ｐＨ７．４〜ｐＨ７．５、０．５ｇ ＤＡＢＣ
Ｏ(Sigma) および０．０５ｇ ＮａＮ3）を用いてスライドを調製しそして＋４
℃、暗所で保存した。
【００６４】
パラフィン埋め込みスライドを用いて作業する場合には、脱パラフィン操作が
固定の前に必要である。スライドをキシレン（５分間、室温、３回）、次いで１
００％エタノール（５分間、室温、２（３）回）、次いで９６％エタノール（５
分間、室温、２（３）回）そして最後に２回蒸留水（ＤＤＷ）（５分間、室温、
１回）を用いて洗浄した。
固定の前に必要である。スライドをキシレン（５分間、室温、３回）、次いで１
００％エタノール（５分間、室温、２（３）回）、次いで９６％エタノール（５
分間、室温、２（３）回）そして最後に２回蒸留水（ＤＤＷ）（５分間、室温、
１回）を用いて洗浄した。
【００６５】
ある場合には、一次抗体と一緒のインキュベーションの前に０．０１％トリト
ンｘ１００溶液の使用が推奨される。
ンｘ１００溶液の使用が推奨される。
【００６６】
１１．細胞中のＲＮＡ発現の研究
１１．１ ＣｓＣｌ法を用いる細胞から全ＲＮＡの抽出
ＲＮＡを、感染細胞または非感染細胞から２５ｍＭクエン酸ナトリウム、４．
５Ｍチオシアン酸グアニジウム(guanidiumu thiocyanate)、０．５％ラウリルサ
ルコシンナトリウム、０．１％消泡剤、および４７ｍＭメルカプトエタノールを
含む溶液中に細胞ペレットを懸濁させて抽出した。細胞溶解物を１４時間、３６
０００ｒｐｍ、ベックマーン(Beckman) 分取遠心分離機のローターＴＳＴ−５５
．５中でＣｓＣｌ層を通し、濃度５．７ｍで遠心分離した。試験管の底に遠心分
離されたＲＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウム中に懸濁し、エタノールを用いて沈降
させ、そしてＲＮアーゼを含まないＤＤＭ中に溶解させた。 １１．２ グリオキサールゲル中のＲＮＡの電気泳動 １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、５０％ＤＭＳＯ、１Ｍ脱イオングリ
オキサールを含む溶液中にＲＮＡを加え、そして３０分間、５０℃でインキュベ
ーションした。ｐＨ６．５の１０ｍＭリン酸ナトリウムを含むアガロースゲル（
１．５％）中の負荷緩衝液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノール
ブルーおよび６０％グリセロール）の存在下でＲＮＡを電気泳動した。ゲルは、
ｐＨ６．５でリン酸ナトリウム緩衝液中を流した。分子量マーカーとして１８Ｓ
および２８Ｓ ＲＮＡの位置を決定するために、それぞれのゲルは臭化エチジウ
ム（ＥｔＢｒ）を含むＲＮＡの試料を含んでいた。 １１．３ ナイロンフィルターへのＲＮＡ固定（ノーザンブロット） ゲルからのＲＮＡを、ｐＨ６．５で２５ｍＭリン酸ナトリウム中に含浸した吸
収紙（ウオットマン(Whatman) ３ＭＭ）上にゲルを配置して、ナイロンフィルタ
ー（０．２μｍ）へ毛管ブロット法により移行させた。ナイロンフィルター、リ
ン酸緩衝液中の吸収紙８層、乾燥吸収紙８層、紙タオル数層および重り１ｋｇを
ゲルの上に置いた。１２〜１８時間後にナイロンフィルターを乾燥し、そして８
０℃オーブン中で１．５時間焼き固めた。 １１．４ 特異性ＤＮＡプローブの作製 １１．４．１ アガロースからＤＮＡの精製 プラスミド内にクローンしたウイルスＤＮＡ断片は、分子プローブ作製のため
の起源として役立った。プラスミドＤＮＡを（クローニングに使用した）制限酵
素により切断しそしてＤＮＡをアガロースゲル内で電気泳動した。プローブとし
て使用するウイルスＤＮＡ断片を含むバンドを切除しそしてエッペンドルフ管に
移した。アガロースを含まないＤＮＡ断片を得るために、ＤＮＡをゲル抽出キッ
ト(Jetsorb, Promega)により精製し、ＴＥ緩衝液中に懸濁し、そして−２０℃で
保存した。 １１．４．２ ニックトランスレーションによる放射性リン酸塩を用いるＤＮＡ の標識 ハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして役立つウイルスＤＮＡを
ＢＲＬキットを用いるニックトランスレーション法により標識した。反応は、他
の３非標識デオキシリボヌクレオチドと一緒のｄＣＴＰ（α32Ｐ）の１００μｃ
ｉの存在下で行った。９０分間、１４℃におけるインキュベーションの後、反応
を停止し、そして標識したＤＮＡをＴＥ緩衝液を用いて洗浄したＧ−５０セファ
デックスカラム上で遊離ヌクレオチドから分離した。反応生成物をカラムに負荷
し、標識されたプローブの画分を集めた。放射能は、シンチレーションカウンタ
ーを用いて測定した。標識したプローブは、サザンまたはノーザンハイブリダイ
ゼーション実験に使用した。 １１．５ ＤＮＡプローブを用いるＲＮＡのハイブリダイゼーション ナイロンフィルターを、バッグまたはハイブリダイゼーションビン内に入れ、
そして３時間、４２℃で、５０％ホルムアルデヒド、５ｘデンハート緩衝液、５
０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ピロリン酸
ナトリウム、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、変性したサケ精子ＤＮＡ４
００ｍｇ／ｍｌの存在下ででインキュベーションした。標識したＤＮＡプローブ
（２ｘ１０6 ｃｐｍ）をバッグまたはビンに加えそしてフィルターをさらに１６
時間インキュベーションした。フィルターを、１０分間、室温で、２ｘＳＳＣお
よび０．１％ピロリン酸ナトリウムの溶液中で２回、３０分間、６０℃で、２ｘ
ＳＳＣ、０．１％ピロリン酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳの溶液中で１回、
そして３０分間、６０℃で、２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液中で１回洗
浄した。フィルターを増感スクリーンを備えたカセット中のアグファ(Agfa)Ｘ線
フィルムに暴露し、−７０℃で数時間保持した。
５Ｍチオシアン酸グアニジウム(guanidiumu thiocyanate)、０．５％ラウリルサ
ルコシンナトリウム、０．１％消泡剤、および４７ｍＭメルカプトエタノールを
含む溶液中に細胞ペレットを懸濁させて抽出した。細胞溶解物を１４時間、３６
０００ｒｐｍ、ベックマーン(Beckman) 分取遠心分離機のローターＴＳＴ−５５
．５中でＣｓＣｌ層を通し、濃度５．７ｍで遠心分離した。試験管の底に遠心分
離されたＲＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウム中に懸濁し、エタノールを用いて沈降
させ、そしてＲＮアーゼを含まないＤＤＭ中に溶解させた。 １１．２ グリオキサールゲル中のＲＮＡの電気泳動 １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、５０％ＤＭＳＯ、１Ｍ脱イオングリ
オキサールを含む溶液中にＲＮＡを加え、そして３０分間、５０℃でインキュベ
ーションした。ｐＨ６．５の１０ｍＭリン酸ナトリウムを含むアガロースゲル（
１．５％）中の負荷緩衝液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノール
ブルーおよび６０％グリセロール）の存在下でＲＮＡを電気泳動した。ゲルは、
ｐＨ６．５でリン酸ナトリウム緩衝液中を流した。分子量マーカーとして１８Ｓ
および２８Ｓ ＲＮＡの位置を決定するために、それぞれのゲルは臭化エチジウ
ム（ＥｔＢｒ）を含むＲＮＡの試料を含んでいた。 １１．３ ナイロンフィルターへのＲＮＡ固定（ノーザンブロット） ゲルからのＲＮＡを、ｐＨ６．５で２５ｍＭリン酸ナトリウム中に含浸した吸
収紙（ウオットマン(Whatman) ３ＭＭ）上にゲルを配置して、ナイロンフィルタ
ー（０．２μｍ）へ毛管ブロット法により移行させた。ナイロンフィルター、リ
ン酸緩衝液中の吸収紙８層、乾燥吸収紙８層、紙タオル数層および重り１ｋｇを
ゲルの上に置いた。１２〜１８時間後にナイロンフィルターを乾燥し、そして８
０℃オーブン中で１．５時間焼き固めた。 １１．４ 特異性ＤＮＡプローブの作製 １１．４．１ アガロースからＤＮＡの精製 プラスミド内にクローンしたウイルスＤＮＡ断片は、分子プローブ作製のため
の起源として役立った。プラスミドＤＮＡを（クローニングに使用した）制限酵
素により切断しそしてＤＮＡをアガロースゲル内で電気泳動した。プローブとし
て使用するウイルスＤＮＡ断片を含むバンドを切除しそしてエッペンドルフ管に
移した。アガロースを含まないＤＮＡ断片を得るために、ＤＮＡをゲル抽出キッ
ト(Jetsorb, Promega)により精製し、ＴＥ緩衝液中に懸濁し、そして−２０℃で
保存した。 １１．４．２ ニックトランスレーションによる放射性リン酸塩を用いるＤＮＡ の標識 ハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして役立つウイルスＤＮＡを
ＢＲＬキットを用いるニックトランスレーション法により標識した。反応は、他
の３非標識デオキシリボヌクレオチドと一緒のｄＣＴＰ（α32Ｐ）の１００μｃ
ｉの存在下で行った。９０分間、１４℃におけるインキュベーションの後、反応
を停止し、そして標識したＤＮＡをＴＥ緩衝液を用いて洗浄したＧ−５０セファ
デックスカラム上で遊離ヌクレオチドから分離した。反応生成物をカラムに負荷
し、標識されたプローブの画分を集めた。放射能は、シンチレーションカウンタ
ーを用いて測定した。標識したプローブは、サザンまたはノーザンハイブリダイ
ゼーション実験に使用した。 １１．５ ＤＮＡプローブを用いるＲＮＡのハイブリダイゼーション ナイロンフィルターを、バッグまたはハイブリダイゼーションビン内に入れ、
そして３時間、４２℃で、５０％ホルムアルデヒド、５ｘデンハート緩衝液、５
０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ピロリン酸
ナトリウム、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、変性したサケ精子ＤＮＡ４
００ｍｇ／ｍｌの存在下ででインキュベーションした。標識したＤＮＡプローブ
（２ｘ１０6 ｃｐｍ）をバッグまたはビンに加えそしてフィルターをさらに１６
時間インキュベーションした。フィルターを、１０分間、室温で、２ｘＳＳＣお
よび０．１％ピロリン酸ナトリウムの溶液中で２回、３０分間、６０℃で、２ｘ
ＳＳＣ、０．１％ピロリン酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳの溶液中で１回、
そして３０分間、６０℃で、２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液中で１回洗
浄した。フィルターを増感スクリーンを備えたカセット中のアグファ(Agfa)Ｘ線
フィルムに暴露し、−７０℃で数時間保持した。
【００６７】
１２．ＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションによる特異性ＤＮＡの同定
１２．１ アガロースゲル中のＤＮＡ電気泳動 ＨＳＶ−１感染細胞からまたはＨＳＶ−１精製ビリオンから作製した高分子Ｄ
ＮＡ（８μｇ）を５単位／μｇＤＮＡ制限酵素を用いて、最終体積１００μｌで
一晩、３７℃でインキュベーションした。制限したＤＮＡの試料をＴＥＡＮ緩衝
液中の０．８％アガロースゲル中、２５ボルト（３５ｖ／１５０ｍＡｍｐ）で一
晩電気泳動した。 １２．２ 変性および中和 ゲルをボウル中のガラス上に配置しそして０．５Ｎ ＮａＯＨおよび１．５Ｍ
ＮａＣｌの溶液を用いて室温で１時間穏やかに振とうした。中和は、アルカリ
性溶液を１Ｍ トリス、ｐＨ８．０および１．５Ｍ ＮａＣｌの中和溶液を用い
る置換により、室温で穏やかに３０分間振とうして行った。 １２．３ ナイロンフィルターへのＤＮＡの固定（サザンブロット） ＲＮＡの場合と同様の操作。 １２．４ ＤＮＡプローブを用いるＤＮＡのハイブリダイゼーション 下記の変更以外はＲＮＡの場合と同様の操作： ａ）ハイブリダイゼーション緩衝液は、５０％ホルムアルデヒド、１０ｘデンハ
ート、５ｘＳＳＰＥ、１％ＳＤＳおよび４００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを
含んでいた。 ｂ）フィルターは、１５分間、室温で２ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳの溶液中で２
回、および２時間、６５℃で０．１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳの溶液中で１回洗
浄した。
１２．１ アガロースゲル中のＤＮＡ電気泳動 ＨＳＶ−１感染細胞からまたはＨＳＶ−１精製ビリオンから作製した高分子Ｄ
ＮＡ（８μｇ）を５単位／μｇＤＮＡ制限酵素を用いて、最終体積１００μｌで
一晩、３７℃でインキュベーションした。制限したＤＮＡの試料をＴＥＡＮ緩衝
液中の０．８％アガロースゲル中、２５ボルト（３５ｖ／１５０ｍＡｍｐ）で一
晩電気泳動した。 １２．２ 変性および中和 ゲルをボウル中のガラス上に配置しそして０．５Ｎ ＮａＯＨおよび１．５Ｍ
ＮａＣｌの溶液を用いて室温で１時間穏やかに振とうした。中和は、アルカリ
性溶液を１Ｍ トリス、ｐＨ８．０および１．５Ｍ ＮａＣｌの中和溶液を用い
る置換により、室温で穏やかに３０分間振とうして行った。 １２．３ ナイロンフィルターへのＤＮＡの固定（サザンブロット） ＲＮＡの場合と同様の操作。 １２．４ ＤＮＡプローブを用いるＤＮＡのハイブリダイゼーション 下記の変更以外はＲＮＡの場合と同様の操作： ａ）ハイブリダイゼーション緩衝液は、５０％ホルムアルデヒド、１０ｘデンハ
ート、５ｘＳＳＰＥ、１％ＳＤＳおよび４００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを
含んでいた。 ｂ）フィルターは、１５分間、室温で２ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳの溶液中で２
回、および２時間、６５℃で０．１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳの溶液中で１回洗
浄した。
【００６８】
１３．ウイルスＤＮＡのクローニングおよび配列解析
１３．１ ウイルスＤＮＡ断片およびプラスミドベクターの作製
適当な制限酵素を用いて切断したウイルスＤＮＡ断片およびプラスミドをアガ
ロースゲルから精製した（１１．４項も参照）。 １３．２ 連結 プラスミドおよびウイルスＤＮＡをモル比１：１０で、酵素Ｔ4 ＤＮＡリガー
ゼ(Promega) 、適当な緩衝液の存在下で混合しそして１６℃で一晩インキュベー
ションした。 １３．３ 細菌形質転換 ｄＨα５系統またはＪＭ１０９系統の大腸菌コロニーを一晩、３７℃でＬＢ培
地内で培養した。次の日に、コンピテント細菌の培養物をＣａＣｌ2／ＲｕＣｌ2 法(Kushner, 1978) により作製した。連結後のプラスミドＤＮＡの５０ｎｇを１
００μｌコンピテント細胞培養物に、２０分間、氷上に包んで加えた。細菌を４
２℃で１分間移行し、次いで氷に２分間およびその直後に１ｍｌ ＬＢを加えそ
して細菌を１時間、３７℃でインキュベーションした。細菌を、１．５％アガー
およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート上に接種した。必要な
場合には、２％Ｘ−Ｇａｌ(Sigma) 溶液４０μｌおよび２％ＩＰＴＧ(Sigma)４
０μｌを接種の間に細菌に加えた。プレートを一晩、３７℃でインキュベーショ
ンした。 １３．４ コロニーハイブリダイゼーション 細菌形質転換コロニーをニトロセルロースフィルター、ＢＡ−８５ ０．４μ
ｍ、８０ｍｍ直径(Schleicher and Schnell)に転移した。アガープレート上の特
異性プローブおよび同じコロニーにより示されるフィルター上のコロニーの間の
適合を可能とするために、フィルターおよびプレートを同じ方法で指定した。第
三番ウオットマン紙の４層を下記の４種の溶液の一つを用いて含浸して載せた４
枚のトレイを作製した。
ロースゲルから精製した（１１．４項も参照）。 １３．２ 連結 プラスミドおよびウイルスＤＮＡをモル比１：１０で、酵素Ｔ4 ＤＮＡリガー
ゼ(Promega) 、適当な緩衝液の存在下で混合しそして１６℃で一晩インキュベー
ションした。 １３．３ 細菌形質転換 ｄＨα５系統またはＪＭ１０９系統の大腸菌コロニーを一晩、３７℃でＬＢ培
地内で培養した。次の日に、コンピテント細菌の培養物をＣａＣｌ2／ＲｕＣｌ2 法(Kushner, 1978) により作製した。連結後のプラスミドＤＮＡの５０ｎｇを１
００μｌコンピテント細胞培養物に、２０分間、氷上に包んで加えた。細菌を４
２℃で１分間移行し、次いで氷に２分間およびその直後に１ｍｌ ＬＢを加えそ
して細菌を１時間、３７℃でインキュベーションした。細菌を、１．５％アガー
およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート上に接種した。必要な
場合には、２％Ｘ−Ｇａｌ(Sigma) 溶液４０μｌおよび２％ＩＰＴＧ(Sigma)４
０μｌを接種の間に細菌に加えた。プレートを一晩、３７℃でインキュベーショ
ンした。 １３．４ コロニーハイブリダイゼーション 細菌形質転換コロニーをニトロセルロースフィルター、ＢＡ−８５ ０．４μ
ｍ、８０ｍｍ直径(Schleicher and Schnell)に転移した。アガープレート上の特
異性プローブおよび同じコロニーにより示されるフィルター上のコロニーの間の
適合を可能とするために、フィルターおよびプレートを同じ方法で指定した。第
三番ウオットマン紙の４層を下記の４種の溶液の一つを用いて含浸して載せた４
枚のトレイを作製した。
【００６９】
トレイ１−０．２Ｎ ＮａＯＨ、 １．５ＮａＣｌ
トレイ２−０．４Ｍトリス ｐＨ７．６、ＳＳＣｘ２
トレイ３−０．４Ｍトリス ｐＨ７．０、ＳＳＣｘ２
トレイ４−ＳＳＣｘ２
第一段階で、フィルターを細菌プレート上に１分間置き次いで上記の数の順序
でトレイ毎に１分間で４枚のトレイに移行させた。フィルターをそれぞれのトレ
イ上で湿ったウオットマン紙上のコロニー側を上にして配置した。フィルターを
空気乾燥し次いで減圧オーブン内で８０℃、２時間焼き固めた。この時点で、手
順はサザンブロッティングと同様である。プローブのニックトランスレーション
、ハイブリダイゼーション、および規定の通りに、室温、ＳＳＣｘ２＋１％ＳＤ
Ｓ中で１．５時間および室温、ＳＳＣｘ０．５＋１％ＳＤＳ中６５℃で１０分間
で２回洗浄した。 １３．５ プラスミドＤＮＡの迅速作製 細菌コロニーをＬＢ液体培地内で一晩培養し、次いで沈降させそして５０ｍＭ
グルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭトリスｐＨ８．０および４ｍｇ／ｍ
ｌリソソームの１００μｌ溶液内に懸濁した。５分後に、０．２Ｍ ＮａＯＨお
よび１％ＳＤＳの２００μｌ溶液を加えそして５分間氷上でインキュベーション
した。５Ｍ ＫＡｃ、ｐＨ５．６の１５０μｌ溶液をさらに５分間で加え、次い
で遠心分離しそしてＤＮＡをフェノール／クロロホルムを用いて抽出した。水相
をエタノールを用いて沈降させそしてＤＮＡをＴＥ緩衝液中に溶解させた。 １３．６ ＤＮＡヌクレオチド配列の決定 プラスミドＤＮＡをＰｒｏｍｅｇａのウイザードプラスｓｖミニプレプＤＮＡ
精製系(Wizard plus sv miniprep DNA purification system, Promega)を用いて
精製した。配列の決定は、イェサレムのヘブライ大学のライフサイエンス研究所
のＤＮＡ分析装置(ABI-PRISM、モデル377)内でＤＮＡ１０μｇに関して行う。ク
ローンしたＨＳＶ−１を含む数種のプラスミドを配列決定のためにＧ．ダライ教
授(Prof. G. Darai, Heidelberg 、ドイツ) の研究所に送った。 １３．７ ＤＮＡ配列のコンピューター分析 アミノ酸配列およびタンパク質のコンピューター分析は、ウイスコンシン大学
のプログラムパッケージＵＷＧＣＧを用いて行った。ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７ ＤＮＡのヌクレオチド配列は、ジーンバンク(Genbank) から入手した。
でトレイ毎に１分間で４枚のトレイに移行させた。フィルターをそれぞれのトレ
イ上で湿ったウオットマン紙上のコロニー側を上にして配置した。フィルターを
空気乾燥し次いで減圧オーブン内で８０℃、２時間焼き固めた。この時点で、手
順はサザンブロッティングと同様である。プローブのニックトランスレーション
、ハイブリダイゼーション、および規定の通りに、室温、ＳＳＣｘ２＋１％ＳＤ
Ｓ中で１．５時間および室温、ＳＳＣｘ０．５＋１％ＳＤＳ中６５℃で１０分間
で２回洗浄した。 １３．５ プラスミドＤＮＡの迅速作製 細菌コロニーをＬＢ液体培地内で一晩培養し、次いで沈降させそして５０ｍＭ
グルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭトリスｐＨ８．０および４ｍｇ／ｍ
ｌリソソームの１００μｌ溶液内に懸濁した。５分後に、０．２Ｍ ＮａＯＨお
よび１％ＳＤＳの２００μｌ溶液を加えそして５分間氷上でインキュベーション
した。５Ｍ ＫＡｃ、ｐＨ５．６の１５０μｌ溶液をさらに５分間で加え、次い
で遠心分離しそしてＤＮＡをフェノール／クロロホルムを用いて抽出した。水相
をエタノールを用いて沈降させそしてＤＮＡをＴＥ緩衝液中に溶解させた。 １３．６ ＤＮＡヌクレオチド配列の決定 プラスミドＤＮＡをＰｒｏｍｅｇａのウイザードプラスｓｖミニプレプＤＮＡ
精製系(Wizard plus sv miniprep DNA purification system, Promega)を用いて
精製した。配列の決定は、イェサレムのヘブライ大学のライフサイエンス研究所
のＤＮＡ分析装置(ABI-PRISM、モデル377)内でＤＮＡ１０μｇに関して行う。ク
ローンしたＨＳＶ−１を含む数種のプラスミドを配列決定のためにＧ．ダライ教
授(Prof. G. Darai, Heidelberg 、ドイツ) の研究所に送った。 １３．７ ＤＮＡ配列のコンピューター分析 アミノ酸配列およびタンパク質のコンピューター分析は、ウイスコンシン大学
のプログラムパッケージＵＷＧＣＧを用いて行った。ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７ ＤＮＡのヌクレオチド配列は、ジーンバンク(Genbank) から入手した。
【００７０】
１４．ＰＣＲ法によるウイルスＤＮＡの同定
１４．１ ＰＣＲによるＨＳＶ−１ウイルスＤＮＡの同定
ＰＣＲ実験に使用したプライマーは、ＨＳＶ−１ ＵＬ５３（ｇＫ）必須遺伝
子の配列に従って合成した。 正方向プライマー ５’ＴＣＡＴＣＧＴＡＧＧＣＴＧＣＧＡＧＴＴＧＡＴ３’（
２２塩基体） 逆方向プライマー ５’ＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＴ３’（
２２塩基体） 配列の起源：ＨＳＶ−１のＳｙｎ１７系統。断片の大きさ３５３ｂｐ。ＰＣＲ
反応は、プログラム可能な熱コントローラー(M.J. Research Inc. USA)内で、そ
れぞれのプライマー５μＭ、それぞれのデオキシリボヌクレオチド５０Ｍ、およ
び１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 の存在下、試料ＤＮＡの鋳型上で行った。反応は、５
０μｌの体積内で行い、ＤＮＡを変性し（９８℃、１０分間）、次いで温度を６
５℃に１０分間低下させ、そしてＴａｑ 緩衝液ｘ１０(Bioline) ５μｌ中のＴ
ａｑポリメラーゼ・ダイアモンド(Diamond, Bioline)の２．５単位を加えた。反
応の段階は、融解（９５℃、３０秒間）、アニーリング（６５℃、３０秒間）お
よび伸長（７２℃、１分間）であった。全体で３５サイクルおよび伸長の最終段
階（７２℃、１０分間）であった。ＰＣＲ反応の産物をＰＣＲマーカー(Promega
) の存在下で１．８％アガロースゲル上で行った。ＰＣＲ実験に使用した追加の
プライマーは、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）をコードするＨＳＶ−１（ＵＳ６）遺伝
子の配列に従って合成した。 正方向プライマー ５’ＴＴＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＧＴＧＡＴ ３’（２４塩基体） 逆方向プライマー ５’ＧＣＣＧＴＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＣＧＴＣＣＡＴＡＣ３
’（２４塩基体）。
子の配列に従って合成した。 正方向プライマー ５’ＴＣＡＴＣＧＴＡＧＧＣＴＧＣＧＡＧＴＴＧＡＴ３’（
２２塩基体） 逆方向プライマー ５’ＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＴ３’（
２２塩基体） 配列の起源：ＨＳＶ−１のＳｙｎ１７系統。断片の大きさ３５３ｂｐ。ＰＣＲ
反応は、プログラム可能な熱コントローラー(M.J. Research Inc. USA)内で、そ
れぞれのプライマー５μＭ、それぞれのデオキシリボヌクレオチド５０Ｍ、およ
び１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 の存在下、試料ＤＮＡの鋳型上で行った。反応は、５
０μｌの体積内で行い、ＤＮＡを変性し（９８℃、１０分間）、次いで温度を６
５℃に１０分間低下させ、そしてＴａｑ 緩衝液ｘ１０(Bioline) ５μｌ中のＴ
ａｑポリメラーゼ・ダイアモンド(Diamond, Bioline)の２．５単位を加えた。反
応の段階は、融解（９５℃、３０秒間）、アニーリング（６５℃、３０秒間）お
よび伸長（７２℃、１分間）であった。全体で３５サイクルおよび伸長の最終段
階（７２℃、１０分間）であった。ＰＣＲ反応の産物をＰＣＲマーカー(Promega
) の存在下で１．８％アガロースゲル上で行った。ＰＣＲ実験に使用した追加の
プライマーは、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）をコードするＨＳＶ−１（ＵＳ６）遺伝
子の配列に従って合成した。 正方向プライマー ５’ＴＴＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＧＴＧＡＴ ３’（２４塩基体） 逆方向プライマー ５’ＧＣＣＧＴＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＣＧＴＣＣＡＴＡＣ３
’（２４塩基体）。
【００７１】
配列の起源：ＨＳＶ−１のＳｙｎ１７系統。断片の大きさ６２０ｂｐ。ＰＣ
Ｒ反応は、上記と同様にして行った。 １４．２ ＰＣＲによるＲ１５組換えＤＮＡの同定 プライマーは、ＵＳ領域の右部分中のＲ１５の単一配列に従って合成した。 正方向プライマー ５’ＴＣＡＧＣＡＣＧＡＡＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣ３’（２０
塩基体） 逆方向プライマー ５’ＧＡＡＣＣＴＣＴＣＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＣＡ３’（２
１塩基体） 配列の起源：ＨＳＶ−１のＲ１５系統。断片の大きさは３１９ｂｐである。Ｐ
ＣＲ反応は、同じ条件下で行ったが（１４．１参照）ただし、デオキシリボヌク
レオチドを最終濃度２００μＭで使用した。反応の段階は、融解（９４℃、１分
間）、アニーリング（６５℃、１分間）および伸長（７２℃、１分間）であった
。全体で２５サイクルおよび伸長の最終段階（７２℃、１０分間）であった。
Ｒ反応は、上記と同様にして行った。 １４．２ ＰＣＲによるＲ１５組換えＤＮＡの同定 プライマーは、ＵＳ領域の右部分中のＲ１５の単一配列に従って合成した。 正方向プライマー ５’ＴＣＡＧＣＡＣＧＡＡＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣ３’（２０
塩基体） 逆方向プライマー ５’ＧＡＡＣＣＴＣＴＣＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＣＡ３’（２
１塩基体） 配列の起源：ＨＳＶ−１のＲ１５系統。断片の大きさは３１９ｂｐである。Ｐ
ＣＲ反応は、同じ条件下で行ったが（１４．１参照）ただし、デオキシリボヌク
レオチドを最終濃度２００μＭで使用した。反応の段階は、融解（９４℃、１分
間）、アニーリング（６５℃、１分間）および伸長（７２℃、１分間）であった
。全体で２５サイクルおよび伸長の最終段階（７２℃、１０分間）であった。
【００７２】
ＰＣＲ反応の産物をＰＣＲマーカー(Promega) の存在下で１．８％アガロース
ゲル中の電気泳動により同定した。
ゲル中の電気泳動により同定した。
【００７３】
１５．ＲＴ−ＰＣＴ
ＲＮＡをラット脳組織および星状膠細胞から、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて精
製し、ＭｕＬＶ ＲＴを用いて逆転写し、次いでＰＣＲを種々の遺伝子特異性プ
ライマーを用いて行った。
製し、ＭｕＬＶ ＲＴを用いて逆転写し、次いでＰＣＲを種々の遺伝子特異性プ
ライマーを用いて行った。
【００７４】
１６．血清コルチコステロンおよびＡＣＴＨレベルおよびプロスタグランジン
合成の決定 血清コルチコステロンおよびＡＣＴＨは、市販の抗体を用いてＲＩＡにより決
定した。プロスタグランジンＥ２（ＰＥＧ２）合成は生体外脳スライス内ＲＩＡ
により決定した。
合成の決定 血清コルチコステロンおよびＡＣＴＨは、市販の抗体を用いてＲＩＡにより決
定した。プロスタグランジンＥ２（ＰＥＧ２）合成は生体外脳スライス内ＲＩＡ
により決定した。
【００７５】
実施例１ ＨＳＶ−１単離物のスクリーニング
表１Ａに示したＨＳＶ−１系統のどのＨＳＶ−１ウイルスが成体マウスに対す
る病原性を欠失しているかを決定するために、それぞれのマウスの鼻孔内に１０ 7 ｐｆｕ／ｍｌウイルスストックの５０μｌを滴下して、それぞれのウイルスを
４週齢サブラマウス感染のために使用した。感染および対照マウスを２〜４週間
監視し、そして感染したマウスの死亡率を記録した。５種のウイルス系統（Ｆ、
ＫＯＳ、Ｓｙｎ１７、および組換え体Ｐ４２、およびＰ７１）がサブラマウスに
対して高度に病原性でありそしてすべての感染マウスを殺したことが見いだされ
た。４種のＴＫ−変異体（Ｆ ＴＫ- 、ＦブルーＴＫ- 、Ｒ１５ＴＫ- 、および
Ｓｙｎ１７ＴＫ- ）は、成体マウスに対する病原性がなかった。３種の追加のＨ
ＳＶ−１単離物：ＨＦＥＭ、ＨＳＶ−１Ｒ１５およびＨＳＶ−１ｖｈｓ（ＵＬ４
１遺伝子内の変異を有する変異体）は成体マウスに対して非病原性であった。Ｔ
Ｋ−ウイルス変異体は、これらがアシスロビルに対して耐性であるために、ワク
チン開発のために使用できない。ＨＳＶ−１ ＴＫ- 変異体が、新生マウスに対
する病原性を保持していることが報告された。表１Ａおよび表１Ｂ内に示した実
験の結果は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体が生ＨＳＶ−１ウイルスワクチンの開
発のために必要な性質を有しているであろうという結論に導いた。同じ組換えイ
ベントから単離されたその他のＨＳＶ−１組換え体、例えばＨＳＶ−１ Ｒ１９
は、成体マウスに対して高度に病原性であった。
る病原性を欠失しているかを決定するために、それぞれのマウスの鼻孔内に１０ 7 ｐｆｕ／ｍｌウイルスストックの５０μｌを滴下して、それぞれのウイルスを
４週齢サブラマウス感染のために使用した。感染および対照マウスを２〜４週間
監視し、そして感染したマウスの死亡率を記録した。５種のウイルス系統（Ｆ、
ＫＯＳ、Ｓｙｎ１７、および組換え体Ｐ４２、およびＰ７１）がサブラマウスに
対して高度に病原性でありそしてすべての感染マウスを殺したことが見いだされ
た。４種のＴＫ−変異体（Ｆ ＴＫ- 、ＦブルーＴＫ- 、Ｒ１５ＴＫ- 、および
Ｓｙｎ１７ＴＫ- ）は、成体マウスに対する病原性がなかった。３種の追加のＨ
ＳＶ−１単離物：ＨＦＥＭ、ＨＳＶ−１Ｒ１５およびＨＳＶ−１ｖｈｓ（ＵＬ４
１遺伝子内の変異を有する変異体）は成体マウスに対して非病原性であった。Ｔ
Ｋ−ウイルス変異体は、これらがアシスロビルに対して耐性であるために、ワク
チン開発のために使用できない。ＨＳＶ−１ ＴＫ- 変異体が、新生マウスに対
する病原性を保持していることが報告された。表１Ａおよび表１Ｂ内に示した実
験の結果は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体が生ＨＳＶ−１ウイルスワクチンの開
発のために必要な性質を有しているであろうという結論に導いた。同じ組換えイ
ベントから単離されたその他のＨＳＶ−１組換え体、例えばＨＳＶ−１ Ｒ１９
は、成体マウスに対して高度に病原性であった。
【００７６】
組換え体実験に使用された親系統ＨＳＶ−１（ＨＦＥＭ）は、表１Ｂに示すよ
うに、成体マウスに対して非病原性であるがしかし哺乳期マウスに対しては病原
性であり、そしてそのＴＫ- 変異体は哺乳期マウスに対して残留病原性を有し、
この親系統はヒトワクチンのために不適当であることが分かった。ＨＳＶ−１ Ｒ１５、ＦブルーおよびＦブルーＴＫ- は、哺乳期マウスに対して非病原性であ
った（表１Ｂ）。
うに、成体マウスに対して非病原性であるがしかし哺乳期マウスに対しては病原
性であり、そしてそのＴＫ- 変異体は哺乳期マウスに対して残留病原性を有し、
この親系統はヒトワクチンのために不適当であることが分かった。ＨＳＶ−１ Ｒ１５、ＦブルーおよびＦブルーＴＫ- は、哺乳期マウスに対して非病原性であ
った（表１Ｂ）。
【００７７】
上記の結果に基づいて、ＨＳＶ Ｒ１５組換え体が、その生物学的、免疫学的
、および分子的性質を決定する以後の研究のために選ばれた。
、および分子的性質を決定する以後の研究のために選ばれた。
【００７８】
実施例２ ＨＳＶ−１ Ｒ１５接種によるＨＳＶ−１ Ｆを用いるチャレンジ
からの保護 成体マウス１０匹の群を非病原性ウイルス（ＨＳＶ−１ Ｒ１５、ＨＳＶ−１
Ｒ１５ ＴＫ、ＨＳＶ−１ ｖｈｓ、ＨＳＶ−１ Ｆブルー）のそれぞれを用
いて鼻内（ｉ．ｎ．）接種し、別の群を対照として使用した。感染の１４日後、
マウスを病原性ウイルスＨＳＶ−１ Ｆを用いて鼻内経路により感染させた。結
果を図１Ａに示す。これから分かるように、非免疫化対照マウスの９０％は感染
後（ｐ．ｉ．）２３日までにウイルス感染により死亡した。４種の非病原性ＨＳ
Ｖ−１系統を用いて免疫化された４群のマウスすべては、病原性ＨＳＶ−１（Ｆ
）ウイルスを用いるチャレンジから生き残った（図１Ａ）。
からの保護 成体マウス１０匹の群を非病原性ウイルス（ＨＳＶ−１ Ｒ１５、ＨＳＶ−１
Ｒ１５ ＴＫ、ＨＳＶ−１ ｖｈｓ、ＨＳＶ−１ Ｆブルー）のそれぞれを用
いて鼻内（ｉ．ｎ．）接種し、別の群を対照として使用した。感染の１４日後、
マウスを病原性ウイルスＨＳＶ−１ Ｆを用いて鼻内経路により感染させた。結
果を図１Ａに示す。これから分かるように、非免疫化対照マウスの９０％は感染
後（ｐ．ｉ．）２３日までにウイルス感染により死亡した。４種の非病原性ＨＳ
Ｖ−１系統を用いて免疫化された４群のマウスすべては、病原性ＨＳＶ−１（Ｆ
）ウイルスを用いるチャレンジから生き残った（図１Ａ）。
【００７９】
哺乳期マウスの免疫化は、ＨＳＶ−１の４種の非病原性株（ＨＳＶ−１ Ｒ１
５、Ｆブルー、ＦブルーＴＫ- 、ＨＦＥＭ ＴＫ- ）を用いて行った。哺乳期マ
ウスの同腹子を非病原性ウイルス系統を用いて鼻内経路により免疫化しそして２
週間後に哺乳期マウスを病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）を用いてチャレンジしそして２
週間追跡した。図１Ｂに示した結果は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体を用いて免
疫化された哺乳期マウスのすべて（１００％）が、病原性ウイルスを用いるチャ
レンジ感染を生き残り、ＨＳＶ−１ Ｆブルーを用いて免疫化した哺乳期マウス
の９０％がチャレンジ感染を生き残ったが、しかしＦブルーＴＫ- を用いて免疫
化したマウスの４０％だけが感染を生き残ったことを示す。ＨＳＶ−１ ＨＦＥ
Ｍ ＴＫ- を用いて免疫化されたすべての哺乳期マウスは、対照マウスと同様に
病原性ウイルスを用いる感染のために死亡した。
５、Ｆブルー、ＦブルーＴＫ- 、ＨＦＥＭ ＴＫ- ）を用いて行った。哺乳期マ
ウスの同腹子を非病原性ウイルス系統を用いて鼻内経路により免疫化しそして２
週間後に哺乳期マウスを病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）を用いてチャレンジしそして２
週間追跡した。図１Ｂに示した結果は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体を用いて免
疫化された哺乳期マウスのすべて（１００％）が、病原性ウイルスを用いるチャ
レンジ感染を生き残り、ＨＳＶ−１ Ｆブルーを用いて免疫化した哺乳期マウス
の９０％がチャレンジ感染を生き残ったが、しかしＦブルーＴＫ- を用いて免疫
化したマウスの４０％だけが感染を生き残ったことを示す。ＨＳＶ−１ ＨＦＥ
Ｍ ＴＫ- を用いて免疫化されたすべての哺乳期マウスは、対照マウスと同様に
病原性ウイルスを用いる感染のために死亡した。
【００８０】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５が、分子構造およびその非病原性の理由を決定するために
試験すべきであると結論された。
試験すべきであると結論された。
【００８１】
実施例３ 神経細胞内へのＨＳＶ−１ Ｒ１５の浸透の決定
成体サブラマウス（４週齢）を鼻内経路により２種の非病原性ウイルス：ＨＳ
Ｖ−１ Ｒ１５およびＨＳＶ−１ ｖｈｓ（ＵＬ４１−）を用いて免疫化した。
感染の２、４および７日後にマウスを屠殺し、そして鼻上皮（ＮＥ）、鼻球（Ｏ
Ｂ）、扁桃（ＡＭ）および三叉神経節（ＴＧ）から組織試料を採取し、そしてそ
れぞれの時点においてマウス４匹についてプールした。ＤＮＡをそれぞれの組織
試料から抽出しそしてＨＳＶ−１ ＤＮＡの存在を検出するプライマーを用いて
ＰＣＲ試験を行った。表２Ａ記載の結果は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体を用い
て免疫化したウイルスＤＮＡが感染の２および４日後に採取した試料中の鼻上皮
内にのみ検出されたことを示す。ウイルスＤＮＡは、感染７日後の鼻上皮内には
見いだせなかった。ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換えＤＮＡは、免疫化したマウスの鼻
球（ＯＢ）、扁桃（ＡＭ）および三叉神経節（ＴＧ）中には見いだされなかった
。ＨＳＶ−１は免疫化マウスの神経系内に浸透できないことが結論された。
Ｖ−１ Ｒ１５およびＨＳＶ−１ ｖｈｓ（ＵＬ４１−）を用いて免疫化した。
感染の２、４および７日後にマウスを屠殺し、そして鼻上皮（ＮＥ）、鼻球（Ｏ
Ｂ）、扁桃（ＡＭ）および三叉神経節（ＴＧ）から組織試料を採取し、そしてそ
れぞれの時点においてマウス４匹についてプールした。ＤＮＡをそれぞれの組織
試料から抽出しそしてＨＳＶ−１ ＤＮＡの存在を検出するプライマーを用いて
ＰＣＲ試験を行った。表２Ａ記載の結果は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体を用い
て免疫化したウイルスＤＮＡが感染の２および４日後に採取した試料中の鼻上皮
内にのみ検出されたことを示す。ウイルスＤＮＡは、感染７日後の鼻上皮内には
見いだせなかった。ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換えＤＮＡは、免疫化したマウスの鼻
球（ＯＢ）、扁桃（ＡＭ）および三叉神経節（ＴＧ）中には見いだされなかった
。ＨＳＶ−１は免疫化マウスの神経系内に浸透できないことが結論された。
【００８２】
ＨＳＶ−１ ＵＬ−４１−（ｖｈｓ）変異体を用いて鼻内経路により免疫化し
たマウスから採取した組織試料中に、ウイルスＤＮＡは感染の２および４日後の
鼻上皮中に検出されたが、然し感染７日後には検出されなかった。しかし、感染
の２、４および７日後に、ウイルスＤＮＡは、鼻球（ＯＢ）および三叉神経節（
ＴＧ）内に検出されそしてウイルスＤＮＡはこれらの組織中で４および７日後ま
で持続された。このウイルス変異体は、表２Ｂに示すように感染されたマウスの
鼻球および三叉神経節内には浸透できるが、中枢神経系（ＣＮＳ）中の扁桃には
できないことが結論される。
たマウスから採取した組織試料中に、ウイルスＤＮＡは感染の２および４日後の
鼻上皮中に検出されたが、然し感染７日後には検出されなかった。しかし、感染
の２、４および７日後に、ウイルスＤＮＡは、鼻球（ＯＢ）および三叉神経節（
ＴＧ）内に検出されそしてウイルスＤＮＡはこれらの組織中で４および７日後ま
で持続された。このウイルス変異体は、表２Ｂに示すように感染されたマウスの
鼻球および三叉神経節内には浸透できるが、中枢神経系（ＣＮＳ）中の扁桃には
できないことが結論される。
【００８３】
これらの研究から、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体が、鼻上皮内のタイプＣ繊維
内への浸透を不可能とする遺伝変化を有し、その結果、ウイルスＤＮＡが三叉神
経節、鼻球およびＣＮＳ内の扁桃中には浸透できないことが結論される。ＨＳＶ
−１ Ｒ１５は鼻上皮内に接種４日後までしか持続されず、そして感染７日後に
は検出されない。
内への浸透を不可能とする遺伝変化を有し、その結果、ウイルスＤＮＡが三叉神
経節、鼻球およびＣＮＳ内の扁桃中には浸透できないことが結論される。ＨＳＶ
−１ Ｒ１５は鼻上皮内に接種４日後までしか持続されず、そして感染７日後に
は検出されない。
【００８４】
実施例４ ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体の注入による成体マウスの免疫化
それぞれマウス１０匹の３群を使用した：群ＡおよびＢはマウスフットパッド
(footpad) 内へのＨＳＶ−１ Ｒ１５注入により免疫化し、そして群Ｃは免疫化
しなかった。２週間後、群ＢおよびＣをＨＳＶ−１ Ｆを用いてチャレンジしそ
して群Ａは非感染細胞ホモジネート（擬似）を注入した。チャレンジの１４日後
、マウスを屠殺し、そして鼻球（ＯＢ）、扁桃（ＡＭ）および三叉神経節（ＴＧ
）の組織を感染の２および４日後に採取し、ＤＮＡを抽出し、そしてＨＳＶ−１
ＤＮＡを検出するプライマーを用いるＰＣＲ技術により分析した。
(footpad) 内へのＨＳＶ−１ Ｒ１５注入により免疫化し、そして群Ｃは免疫化
しなかった。２週間後、群ＢおよびＣをＨＳＶ−１ Ｆを用いてチャレンジしそ
して群Ａは非感染細胞ホモジネート（擬似）を注入した。チャレンジの１４日後
、マウスを屠殺し、そして鼻球（ＯＢ）、扁桃（ＡＭ）および三叉神経節（ＴＧ
）の組織を感染の２および４日後に採取し、ＤＮＡを抽出し、そしてＨＳＶ−１
ＤＮＡを検出するプライマーを用いるＰＣＲ技術により分析した。
【００８５】
図２に示す結果は、フットパッド経路によりＨＳＶ−１ Ｒ１５を用いて免疫
化されそして擬似チャレンジされた群Ａマウスは、これらの鼻球、扁桃または三
叉神経節中にＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡを持たなかった（図２、レーン１〜３
）。Ｒ１５を用いて免疫化されそしてＨＳＶ−１ Ｆ ＤＮＡを用いて鼻内経路
によりチャレンジされた群Ｂのマウスは病原性ウイルスを用いるチャレンジを生
き残ったが、しかしＨＳＶ−１ Ｆ ＤＮＡは鼻球、三叉神経節およびＣＮＳ扁
桃内に検出できなかった（図２、レーン４〜６）。
化されそして擬似チャレンジされた群Ａマウスは、これらの鼻球、扁桃または三
叉神経節中にＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡを持たなかった（図２、レーン１〜３
）。Ｒ１５を用いて免疫化されそしてＨＳＶ−１ Ｆ ＤＮＡを用いて鼻内経路
によりチャレンジされた群Ｂのマウスは病原性ウイルスを用いるチャレンジを生
き残ったが、しかしＨＳＶ−１ Ｆ ＤＮＡは鼻球、三叉神経節およびＣＮＳ扁
桃内に検出できなかった（図２、レーン４〜６）。
【００８６】
ＨＳＶ−１ Ｆを鼻内経路により感染された非免疫化マウス（群Ｃ）は感染の
結果死亡し、そして鼻球および扁桃内のウイルスＤＮＡの存在および三叉神経節
中には存在しないことをＰＣＲ分析が明らかにした（図２、レーン７〜９）。
結果死亡し、そして鼻球および扁桃内のウイルスＤＮＡの存在および三叉神経節
中には存在しないことをＰＣＲ分析が明らかにした（図２、レーン７〜９）。
【００８７】
この研究は、フットパッド内のＨＳＶ−１ Ｒ１５を用いるマウスの免疫化は
鼻内経路により野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）を用いる感染に対して効果的に保護しそ
してマウスの神経系内への病原性ウイルスの浸透を防止することを明らかにした
。
鼻内経路により野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）を用いる感染に対して効果的に保護しそ
してマウスの神経系内への病原性ウイルスの浸透を防止することを明らかにした
。
【００８８】
実施例５ 脊髄および副腎に対するＨＳＶ−１ Ｒ１５浸透の決定
成体サブラマウス１０匹の１群をフットパッド皮膚内にＨＳＶ−１ Ｒ１５を
用いて皮下（ｓ．ｃ．）注入しそして第二の群は病原性ＨＳＶ−１ Ｆを用いて
感染させた。感染の２および４日後にマウスを屠殺しそしてフットパッド皮膚、
脊髄および副腎を取り出し、ＤＮＡをそれぞれのプールした組織試料から抽出し
、ＰＣＲにより試験してＨＳＶ−１ ＤＮＡの存在を検出した。表３は、ＨＳＶ
−１ Ｒ１５が感染されたマウスのフットパッド皮膚から感染の２日後に検出さ
れたがしかし４日後には検出されなかったことを示す。ＨＳＶ−１ ＤＮＡは、
脊髄および副腎中には検出されなかった。ＨＳＶ−１ Ｒ１５がマウスの脊髄中
に浸透できず従ってマウスの副腎は感染されなかったと結論された。
用いて皮下（ｓ．ｃ．）注入しそして第二の群は病原性ＨＳＶ−１ Ｆを用いて
感染させた。感染の２および４日後にマウスを屠殺しそしてフットパッド皮膚、
脊髄および副腎を取り出し、ＤＮＡをそれぞれのプールした組織試料から抽出し
、ＰＣＲにより試験してＨＳＶ−１ ＤＮＡの存在を検出した。表３は、ＨＳＶ
−１ Ｒ１５が感染されたマウスのフットパッド皮膚から感染の２日後に検出さ
れたがしかし４日後には検出されなかったことを示す。ＨＳＶ−１ ＤＮＡは、
脊髄および副腎中には検出されなかった。ＨＳＶ−１ Ｒ１５がマウスの脊髄中
に浸透できず従ってマウスの副腎は感染されなかったと結論された。
【００８９】
反対に、病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）ＤＮＡは、アンチセンス線４日後にフットパ
ッド皮膚組織内に存在することが見いだされ、そして４日目にはウイルスＤＮＡ
は感染マウスの脊髄および副腎中に検出された（表３）。
ッド皮膚組織内に存在することが見いだされ、そして４日目にはウイルスＤＮＡ
は感染マウスの脊髄および副腎中に検出された（表３）。
【００９０】
これらの実験は、フットパッド皮膚内で、ＨＳＶ−１ Ｒ１５が注入の部位で
２〜３日間のみ複製されそして病原性ウイルスのようには脊髄および副腎中に浸
透できないことを明らかにした。この実験の結果は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５が皮膚
表皮内の末梢タイプＣ繊維内に浸透する能力を失い、従って、感染された成体マ
ウス内の脊髄神経系および副腎の浸透および感染が不可能となることの現れと考
えられる。
２〜３日間のみ複製されそして病原性ウイルスのようには脊髄および副腎中に浸
透できないことを明らかにした。この実験の結果は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５が皮膚
表皮内の末梢タイプＣ繊維内に浸透する能力を失い、従って、感染された成体マ
ウス内の脊髄神経系および副腎の浸透および感染が不可能となることの現れと考
えられる。
【００９１】
実施例６ 脳内または腹腔内接種された系統Ａ／ＪマウスへのＨＳＶ−１ Ｒ
１５の非病原性 ＨＳＶ−１ Ｒ１５（５０μｌ／動物）を、１０6 ｐｆｕ／マウス〜１０1 ｐ
ｆｕ／マウスの範囲内の種々の濃度でＡ／Ｊマウス（４週齢）の脳内に脳内（ｉ
．ｃ．）接種した。結果を表４に示す。すべてのマウスが感染を生き残ったが、
一方ＨＳＶ−１（Ｆ）またはＨＳＶ−１ ＨＦＥＭを１ｘ１０2 ｐｆｕ／ｍｌで
接種されたマウスは死亡したことが見いだされた（表４）。
１５の非病原性 ＨＳＶ−１ Ｒ１５（５０μｌ／動物）を、１０6 ｐｆｕ／マウス〜１０1 ｐ
ｆｕ／マウスの範囲内の種々の濃度でＡ／Ｊマウス（４週齢）の脳内に脳内（ｉ
．ｃ．）接種した。結果を表４に示す。すべてのマウスが感染を生き残ったが、
一方ＨＳＶ−１（Ｆ）またはＨＳＶ−１ ＨＦＥＭを１ｘ１０2 ｐｆｕ／ｍｌで
接種されたマウスは死亡したことが見いだされた（表４）。
【００９２】
ウイルス力価１ｘ†１０7† または１ｘ１０6 ｐｆｕ／ｍｌでＨＳＶ−１ １
５を用いて腹腔内感染されたマウスは、１ｘ１０7 ｐｆｕ／ｍｌでＨＳＶ−１（
ＨＦＥＭ）で感染されたマウスと同様に生き残った。１ｘ１０6 ｐｆｕ／ｍｌの
ＨＳＶ−１（Ｆ）は、マウス１０匹の内９匹を殺した（表４）。
５を用いて腹腔内感染されたマウスは、１ｘ１０7 ｐｆｕ／ｍｌでＨＳＶ−１（
ＨＦＥＭ）で感染されたマウスと同様に生き残った。１ｘ１０6 ｐｆｕ／ｍｌの
ＨＳＶ−１（Ｆ）は、マウス１０匹の内９匹を殺した（表４）。
【００９３】
本実験の結果は、感染の脳内および腹腔内経路において、Ａ／Ｊマウスに対す
るＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体（ＨＳＶ−Ｒ−Ｆｅｈｘ−Ｃ１５）の非病原性を
明らかにした。
るＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体（ＨＳＶ−Ｒ−Ｆｅｈｘ−Ｃ１５）の非病原性を
明らかにした。
【００９４】
実施例７ ＨＳＶ−１ Ｋ１５の神経毒性の決定
鼻または角膜経路による５ｘ１０7 ｐｆｕ／ｍｌの接種またはＨＳＶ−１ １
５の１０7 ｐｆｕまでの直接脳室内接種は、疾患または発熱の臨床徴候を誘導し
なかった。低いウイルス力価は、視床下部への定位注入の３日後に感染の部位で
見いだされたが、しかし毒性系統の伝搬と比較して、他の脳領域内では感染ウイ
ルスは単離できなかった。この非毒性表現型はウイルスの多くの経路で安定であ
った。これは、自発性神経毒性復帰変異体が実存的ではなく、または１より低い
頻度で起きることを示唆する。
５の１０7 ｐｆｕまでの直接脳室内接種は、疾患または発熱の臨床徴候を誘導し
なかった。低いウイルス力価は、視床下部への定位注入の３日後に感染の部位で
見いだされたが、しかし毒性系統の伝搬と比較して、他の脳領域内では感染ウイ
ルスは単離できなかった。この非毒性表現型はウイルスの多くの経路で安定であ
った。これは、自発性神経毒性復帰変異体が実存的ではなく、または１より低い
頻度で起きることを示唆する。
【００９５】
ＩＣＶ接種の後、神経毒性ＨＳＶ−１系統は、血清コルチコステロンおよびＡ
ＤＴＨにより測定される（ＲＩＡによる）視床下部−下垂体−副腎軸の活性化を
起こす。さらに、ウイルスは、脳内のプロスタグランジンＥ２の合成の増加を誘
導し、これは種々の領域からの脳スライス内の生体外産生により測定される。神
経毒性系統は、種々の脳領域内でインターロイキン−１遺伝子の発現を誘導する
。非神経毒性系統としてのＨＳＶ−１ Ｒ１５は、ＨＰＡ軸（視床下部−下垂体
−副腎軸）を活性化せず、ＰＧＥ２産生を増加せず、そして接種の部位であった
視床下部から外側のＩＬ−１遺伝子発現を誘導しなかった(2) 。
ＤＴＨにより測定される（ＲＩＡによる）視床下部−下垂体−副腎軸の活性化を
起こす。さらに、ウイルスは、脳内のプロスタグランジンＥ２の合成の増加を誘
導し、これは種々の領域からの脳スライス内の生体外産生により測定される。神
経毒性系統は、種々の脳領域内でインターロイキン−１遺伝子の発現を誘導する
。非神経毒性系統としてのＨＳＶ−１ Ｒ１５は、ＨＰＡ軸（視床下部−下垂体
−副腎軸）を活性化せず、ＰＧＥ２産生を増加せず、そして接種の部位であった
視床下部から外側のＩＬ−１遺伝子発現を誘導しなかった(2) 。
【００９６】
１段複製実験において、系統ＨＳＶ−１ Ｒ１５は神経毒性ＨＦＥＭ系統より
も１０〜１００倍低い力価で培養星状膠細胞内で感染および複製した。感染した
星状膠細胞内のＨＳＶ−１ Ｒ１５力価は、病原性組換え体Ｒ−１９およびｐ７
１の１０7 〜１０8 ｐｆｕ／ｍｌと比較して、１０6 ｐｆｕ／ｍｌでピークに達
した。神経毒性系統Ｓｙｎ１７による星状膠細胞の感染は、ＩＬ−１遺伝子の迅
速な発現を誘導し（感染後３時間以内）、これはＲＴ−ＰＣＲにより検出された
。ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体は同じ時点で星状膠細胞内にＩＬ−１発現を誘導
しなかった。
も１０〜１００倍低い力価で培養星状膠細胞内で感染および複製した。感染した
星状膠細胞内のＨＳＶ−１ Ｒ１５力価は、病原性組換え体Ｒ−１９およびｐ７
１の１０7 〜１０8 ｐｆｕ／ｍｌと比較して、１０6 ｐｆｕ／ｍｌでピークに達
した。神経毒性系統Ｓｙｎ１７による星状膠細胞の感染は、ＩＬ−１遺伝子の迅
速な発現を誘導し（感染後３時間以内）、これはＲＴ−ＰＣＲにより検出された
。ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体は同じ時点で星状膠細胞内にＩＬ−１発現を誘導
しなかった。
【００９７】
実施例８ ＨＳＶ−１ Ｒ１５を用いる成体マウスの免疫化後の抗体の決定
ＨＳＶ−１ Ｒ１５による免疫化に対する成体マウスの免疫反応を研究するた
めに、マウスを鼻内経路により感染させそして種々の時間間隔（感染の２、４、
７、１４および１６日後）でマウス２匹を屠殺し、血液を集めそして血清を作製
した。血清中の抗ウイルス中和抗体の含有量を測定した。１４日目に免疫化した
マウスを病原性ＨＳＶ−１ Ｆを用いてチャレンジした。
めに、マウスを鼻内経路により感染させそして種々の時間間隔（感染の２、４、
７、１４および１６日後）でマウス２匹を屠殺し、血液を集めそして血清を作製
した。血清中の抗ウイルス中和抗体の含有量を測定した。１４日目に免疫化した
マウスを病原性ＨＳＶ−１ Ｆを用いてチャレンジした。
【００９８】
図３は、感染の７日後においてＨＳＶ−１ Ｒ１５免疫化マウスは抗ウイルス
中和抗体の合成でまだ反応していないが、しかし感染の１４日後には中和抗体が
１：１２８まで希釈した免疫化マウスの血清中に存在していた。１：８の血清希
釈の場合に、ＨＳＶ−１ Ｆプラークの３３・阻害が見いだされた。感染の１６
日後には中和抗体の力価が低下した。しかし、感染の２１日後（病原性ＨＳＶ−
１ Ｆを用いるチャレンジ感染の１週間後）に、ウイルスプラークの１００％が
血清希釈１：１６で血清抗ウイルス抗体により中和された。
中和抗体の合成でまだ反応していないが、しかし感染の１４日後には中和抗体が
１：１２８まで希釈した免疫化マウスの血清中に存在していた。１：８の血清希
釈の場合に、ＨＳＶ−１ Ｆプラークの３３・阻害が見いだされた。感染の１６
日後には中和抗体の力価が低下した。しかし、感染の２１日後（病原性ＨＳＶ−
１ Ｆを用いるチャレンジ感染の１週間後）に、ウイルスプラークの１００％が
血清希釈１：１６で血清抗ウイルス抗体により中和された。
【００９９】
実施例９ ＨＳＶ−１ Ｒ１５はウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコード
するＵＬ２３遺伝子を発現しそしてアシクロビルに感受性である。
するＵＬ２３遺伝子を発現しそしてアシクロビルに感受性である。
【０１００】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５は、ウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする活性
ＵＬ２３遺伝子を有し、従って抗ウイルス薬剤のアシクロビルにより阻害できる
。
ＵＬ２３遺伝子を有し、従って抗ウイルス薬剤のアシクロビルにより阻害できる
。
【０１０１】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５（１００ｐｆｕ／プレート）を、種々の濃度のアシクロビ
ルの存在または非存在においてベロ細胞培養物を感染するために使用した。１０
、５０および１００μｇ／ｍｌの濃度のアシクロビルはＨＳＶ−１ Ｒ１５複製
を効果的に阻害することが見いだされた（表５）。ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７ ＤＮＡ内の遺伝子配列と比較したＨＳＶ−１ Ｒ１５ ゲノム内のＩＲＳ−ＵＳ−ＴＲＳ ＤＮＡの分子分析 ＨＳＶ−１ Ｒ１５の生物学的性質は、変化がウイルスＤＮＡゲノム中に起き
そしてこのウイルス組換え体の病原性に関係するウイルス遺伝子のある一部に影
響するであろうことを示した。ＨＳＶ−１ Ｒ１５ゲノムＤＮＡのウイルスの単
一小型（ＵＳ）ＤＮＡおよびその近接反復および単一長型（ＵＬ）ＤＮＡ中の遺
伝子の部分およびその区間反復（interval repeat 、ＩＲＬ）の分子分析を行っ
た。
ルの存在または非存在においてベロ細胞培養物を感染するために使用した。１０
、５０および１００μｇ／ｍｌの濃度のアシクロビルはＨＳＶ−１ Ｒ１５複製
を効果的に阻害することが見いだされた（表５）。ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７ ＤＮＡ内の遺伝子配列と比較したＨＳＶ−１ Ｒ１５ ゲノム内のＩＲＳ−ＵＳ−ＴＲＳ ＤＮＡの分子分析 ＨＳＶ−１ Ｒ１５の生物学的性質は、変化がウイルスＤＮＡゲノム中に起き
そしてこのウイルス組換え体の病原性に関係するウイルス遺伝子のある一部に影
響するであろうことを示した。ＨＳＶ−１ Ｒ１５ゲノムＤＮＡのウイルスの単
一小型（ＵＳ）ＤＮＡおよびその近接反復および単一長型（ＵＬ）ＤＮＡ中の遺
伝子の部分およびその区間反復（interval repeat 、ＩＲＬ）の分子分析を行っ
た。
【０１０２】
実施例１０ ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭゲノムＤＮＡを用いる病原性ＨＳＶ−１
ＦからのＢａｍＨＩ−Ｂ ＤＮＡ断片間の組換えイベントは、非病原性ＨＳＶ−
１ Ｒ１５組換え体を産生する。
ＦからのＢａｍＨＩ−Ｂ ＤＮＡ断片間の組換えイベントは、非病原性ＨＳＶ−
１ Ｒ１５組換え体を産生する。
【０１０３】
ＨＦＥＭ ＤＮＡゲノムは ＢａｍＨＩ−Ｂ配列（座標１１３３２２−１２３
４５６）中で４Ｋｂｐ欠失（座標１１７０８８−１２０６４１）を内包しこれは
感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）０（ＩＥ１１０）をコードする前初期１（ＩＥ１
）遺伝子のエキソン３に影響し、またＵＬ５６遺伝子のプロモーター配列も欠失
する。
４５６）中で４Ｋｂｐ欠失（座標１１７０８８−１２０６４１）を内包しこれは
感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）０（ＩＥ１１０）をコードする前初期１（ＩＥ１
）遺伝子のエキソン３に影響し、またＵＬ５６遺伝子のプロモーター配列も欠失
する。
【０１０４】
ＨＦＥＭゲノムＤＮＡとＨＳＶ−１ Ｆ ＢａｍＨＩ−Ｂ ＤＮＡ断片とを一
緒に細胞をトランスフェクションしそしてトランスフェクションの後代を集めた
。結果を図４に示す。多数のウイルスプラークが組換え実験のウイルス後代から
単離されそしてＨＳＶ−１ Ｒ１５を除くすべてのプラークは病原性ウイルスを
産生した。
緒に細胞をトランスフェクションしそしてトランスフェクションの後代を集めた
。結果を図４に示す。多数のウイルスプラークが組換え実験のウイルス後代から
単離されそしてＨＳＶ−１ Ｒ１５を除くすべてのプラークは病原性ウイルスを
産生した。
【０１０５】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体（ＨＳＶ−Ｒ−Ｆｅｈｘ−Ｃ１５）は、成体およ
び哺乳期サブラマウスおよびＡ／Ｊマウスに対して非病原性であり、他方、他の
組換え体（例えばＨＳＶ−１ Ｒ１９）はマウスに高度に病原性であることが見
いだされた。ＨＳＶ−１ ＦのＢａｍＨＩ Ｂ ＤＮＡ断片をＨＦＥＭゲノムの
ＢａｍＨＩ−Ｂ ＤＮＡ配列内に導入する組換えイベントは、ＢａｍＨＩ Ｂ ＤＮＡ組換え部位に隣接するＨＳＶ−１ Ｒ１５遺伝子内に複数の変化を導入し
たであろう。
び哺乳期サブラマウスおよびＡ／Ｊマウスに対して非病原性であり、他方、他の
組換え体（例えばＨＳＶ−１ Ｒ１９）はマウスに高度に病原性であることが見
いだされた。ＨＳＶ−１ ＦのＢａｍＨＩ Ｂ ＤＮＡ断片をＨＦＥＭゲノムの
ＢａｍＨＩ−Ｂ ＤＮＡ配列内に導入する組換えイベントは、ＢａｍＨＩ Ｂ ＤＮＡ組換え部位に隣接するＨＳＶ−１ Ｒ１５遺伝子内に複数の変化を導入し
たであろう。
【０１０６】
実施例１１ ＨＳＶ−１ Ｒ１５のＵＳ ＤＮＡ内に存在する遺伝子の発現に
おける変化 本研究のモデルとして役立つＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７のＵＳ ＤＮＡ内のＵＳ
１〜ＵＳ１２遺伝子の構成地図は、その公開された完全なヌクレオチド配列に基
づき、図５に示す。ＵＳ遺伝子のそれぞれに対して、ＲＮＡ転写物も示す。
おける変化 本研究のモデルとして役立つＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７のＵＳ ＤＮＡ内のＵＳ
１〜ＵＳ１２遺伝子の構成地図は、その公開された完全なヌクレオチド配列に基
づき、図５に示す。ＵＳ遺伝子のそれぞれに対して、ＲＮＡ転写物も示す。
【０１０７】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞内のＵＳ遺伝子の発現を研究するために、感染細
胞からＲＮＡを単離しそしてＨＳＶ−１ ＵＳ ＤＮＡの制限酵素切断ＤＮＡ断
片にハイブリダイゼーションして同定し（ノーザンブロット分析）そして結果を
図６に示す。ハイブリダイゼーションのためにプローブとして使用したＨＳＶ−
１ ＤＮＡ断片を図７に示す。
胞からＲＮＡを単離しそしてＨＳＶ−１ ＵＳ ＤＮＡの制限酵素切断ＤＮＡ断
片にハイブリダイゼーションして同定し（ノーザンブロット分析）そして結果を
図６に示す。ハイブリダイゼーションのためにプローブとして使用したＨＳＶ−
１ ＤＮＡ断片を図７に示す。
【０１０８】
前初期タンパク質ＩＥ−５をコードするＵＳ遺伝子のＵＳ４（ｇＧ）、ＵＳ８
（ｇＥ）、およびＵＳ１２が、ＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞内に発現されなかっ
たことを見いだした（図６）。
（ｇＥ）、およびＵＳ１２が、ＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞内に発現されなかっ
たことを見いだした（図６）。
【０１０９】
これらの知見は、主要な変化がＵＳ（ＴＲＳ）ＤＮＡの末端反復に近いウイル
ス遺伝子（図５で暗く示す）内に起きたことを示すと考えられる。
ス遺伝子（図５で暗く示す）内に起きたことを示すと考えられる。
【０１１０】
実施例１２ ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＵＳ ＤＮＡのサザンブロット分析
ＴＲＳの近くのＨＳＶ−１ Ｒ１５のＵＳゲノムＤＮＡ内に起きた変化の性質
を決定するために、プローブ２種を使用した：ＵＳ１２遺伝子プローブ（座標１
４５３１２−１４５５７６）およびＤＮＡ反復の開始点を含むＯｒｉＳプローブ
（座標１４６００８−１４６５９２）（図７Ａに示す）。ハイブリダイゼーショ
ン分析のために、数種のＨＳＶ−１系統のＤＮＡゲノムをＢａｍＨＩ制限酵素を
用いて切断した。
を決定するために、プローブ２種を使用した：ＵＳ１２遺伝子プローブ（座標１
４５３１２−１４５５７６）およびＤＮＡ反復の開始点を含むＯｒｉＳプローブ
（座標１４６００８−１４６５９２）（図７Ａに示す）。ハイブリダイゼーショ
ン分析のために、数種のＨＳＶ−１系統のＤＮＡゲノムをＢａｍＨＩ制限酵素を
用いて切断した。
【０１１１】
ＯｒｉＳプローブはＳｙｎ１７ ＤＮＡ（図７Ｂａ）中に断片２個を検出した
：ＴＲＳ配列内に存在するＯｒｉＳヌクレオチドを含むＢａｍＨＩ−Ｘ ＤＮＡ
断片である１９５３ｂｐの１個。４８４０ｂｐの第二のＤＮＡバンドは、ＵＳ（
ＩＲＳ）の内部反復内に存在するＯｒｉＳ配列を含むＢａｍＨＩ−Ｎ断片である
。
：ＴＲＳ配列内に存在するＯｒｉＳヌクレオチドを含むＢａｍＨＩ−Ｘ ＤＮＡ
断片である１９５３ｂｐの１個。４８４０ｂｐの第二のＤＮＡバンドは、ＵＳ（
ＩＲＳ）の内部反復内に存在するＯｒｉＳ配列を含むＢａｍＨＩ−Ｎ断片である
。
【０１１２】
ＨＦＥＭ ＤＮＡ中で、ＯｒｉＳプローブは、かすかなＢａｍＨＩ−Ｘバンド
およびラダー状のバンドを検出した（図７Ｂａ）。ラダー内のバンドはＢａｍＨ
Ｉ−Ｘ ＤＮＡ断片およびＴＲＳからのＯｒｉＳを含む４７２ｂｐ配列の複数の
反復を含む（図９）。ＢａｍＨＩ−ＮはＯｒｉＳプローブにより検出されそして
ＢａｍＨＩ−Ｎ配列およびＩＲＳ中に存在する断片を含む４７２ｂｐＯｒｉＳの
複数の反復を含むバンドのラダーも検出した。
およびラダー状のバンドを検出した（図７Ｂａ）。ラダー内のバンドはＢａｍＨ
Ｉ−Ｘ ＤＮＡ断片およびＴＲＳからのＯｒｉＳを含む４７２ｂｐ配列の複数の
反復を含む（図９）。ＢａｍＨＩ−ＮはＯｒｉＳプローブにより検出されそして
ＢａｍＨＩ−Ｎ配列およびＩＲＳ中に存在する断片を含む４７２ｂｐＯｒｉＳの
複数の反復を含むバンドのラダーも検出した。
【０１１３】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ中で、ＯｒｉＳプローブは、ＢａｍＨＩ−Ｘ Ｄ
ＮＡ断片（１９５３ｂｐ) を検出しなかったがしかし約１０，０００ｂｐの新し
く幅広いバンドを検出した。この結果は、ＢａｍＨＩ−Ｘ中に存在するＯｒｉＳ
４７２ｂｐ断片が大型のＢａｍＨＩ ＤＮＡの断片の部分であろうことを示す。
４７２ｂｐＯｒｉＳの複数の反復を含むＢａｍＨＩ−Ｎ断片のラダーパターンは
、ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭの場合と同様である（図７Ｂａ）。
ＮＡ断片（１９５３ｂｐ) を検出しなかったがしかし約１０，０００ｂｐの新し
く幅広いバンドを検出した。この結果は、ＢａｍＨＩ−Ｘ中に存在するＯｒｉＳ
４７２ｂｐ断片が大型のＢａｍＨＩ ＤＮＡの断片の部分であろうことを示す。
４７２ｂｐＯｒｉＳの複数の反復を含むＢａｍＨＩ−Ｎ断片のラダーパターンは
、ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭの場合と同様である（図７Ｂａ）。
【０１１４】
ＵＳ１２プローブ（ＵＳ ＤＮＡ中に存在）は、ＨＳＶ−１ Ｆ中のＢａｍＨ
Ｉ−Ｘバンドおよびその組換え体６０１および６０２のみを検出した（図７Ｂｂ
）。このプローブはＨＦＥＭ中のバンドのラダーおよび組換え体Ｒ１９を検出し
た。しかし、ＵＳ１２遺伝子はＨＳＶ−１ Ｒ１５中には検出されなかった。
Ｉ−Ｘバンドおよびその組換え体６０１および６０２のみを検出した（図７Ｂｂ
）。このプローブはＨＦＥＭ中のバンドのラダーおよび組換え体Ｒ１９を検出し
た。しかし、ＵＳ１２遺伝子はＨＳＶ−１ Ｒ１５中には検出されなかった。
【０１１５】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５のＵＳおよびＴＲＳ ＤＮＡ中の分子変化を研究するため
に、プローブＹ、Ｘ、Ｚ、Ｊ１１３５、およびＪ１をサザンブロット分析に利用
した（図８Ａ、Ｂ）。図８Ｂに示した結果は下記を示す。 （ａ）プローブＹはＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７、ＨＦＥＭおよびＲ１５ ＤＮＡ中
に１８４０ｂｐ断片を検出した。 （ｂ）プローブＸはＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＨＦＥＭ中に１９５３ｂｐ断
片を検出したが、Ｒ１５中には検出しなかった。 （ｃ）プローブＺはＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＨＦＥＭ中に１８４１ｂｐ断
片を検出したが、Ｒ１５中には検出しなかった。 （ｄ）プローブＪ１１３５はＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＨＦＥＭ中に６４０
０ｂｐ断片を検出したが、ＨＳＶ−１ Ｒ１５中には約１００００ｂｐ断片を検
出した。 （ｅ）プローブＪ１はＳｙｎ１７、ＨＦＥＭおよびＲ１５ ＤＮＡ中に２０５５
ｂｐ断片を検出した。
に、プローブＹ、Ｘ、Ｚ、Ｊ１１３５、およびＪ１をサザンブロット分析に利用
した（図８Ａ、Ｂ）。図８Ｂに示した結果は下記を示す。 （ａ）プローブＹはＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７、ＨＦＥＭおよびＲ１５ ＤＮＡ中
に１８４０ｂｐ断片を検出した。 （ｂ）プローブＸはＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＨＦＥＭ中に１９５３ｂｐ断
片を検出したが、Ｒ１５中には検出しなかった。 （ｃ）プローブＺはＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＨＦＥＭ中に１８４１ｂｐ断
片を検出したが、Ｒ１５中には検出しなかった。 （ｄ）プローブＪ１１３５はＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＨＦＥＭ中に６４０
０ｂｐ断片を検出したが、ＨＳＶ−１ Ｒ１５中には約１００００ｂｐ断片を検
出した。 （ｅ）プローブＪ１はＳｙｎ１７、ＨＦＥＭおよびＲ１５ ＤＮＡ中に２０５５
ｂｐ断片を検出した。
【０１１６】
これらの知見は、断片ＢａｍＨＩ−Ｘ＋ＺがＨＳＶ−１ Ｒ１５のＵＳおよび
ＴＲＳ ＤＮＡを欠損していることを明らかにした。ＨｐａＩ−ＥｃｏＲ１断片
（座標１４１６１１−１４６６９３）をｐＧＥＭ−７ベクター(Promega) 中にク
ローンした。ｐＧＥＭ−２中にクローンしたＤＮＡ断片は、プローブＪ１１３５
およびＯｒｉＳを用いて細菌抽出物内で同定されそしてクローンしたウイルスＤ
ＮＡを自動配列決定装置で配列決定した。
ＴＲＳ ＤＮＡを欠損していることを明らかにした。ＨｐａＩ−ＥｃｏＲ１断片
（座標１４１６１１−１４６６９３）をｐＧＥＭ−７ベクター(Promega) 中にク
ローンした。ｐＧＥＭ−２中にクローンしたＤＮＡ断片は、プローブＪ１１３５
およびＯｒｉＳを用いて細菌抽出物内で同定されそしてクローンしたウイルスＤ
ＮＡを自動配列決定装置で配列決定した。
【０１１７】
実施例１３ ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ断片Ｈｐａ１−ＥｃｏＲＩ（座標１
４１６１１−１４６６９３）のヌクレオチド配列は転位を明らかにした。
４１６１１−１４６６９３）のヌクレオチド配列は転位を明らかにした。
【０１１８】
４１８２ｂｐのＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を図９に
示す。ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７ ＵＳおよびＴＲＳ ＤＮＡのヌクレオチド配列
と比較して、図１０に示す下記のようなＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ中の分子転
位を同定することができた。 （ａ）Ｓｙｎ１７内のＴＲＳ配列（１４５５８３）の開始点近くの配列ＥｃｏＲ
１（座標１４６６９３）が、ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ断片中で変化していな
い。この配列は、ＩＲＳ座標１３１５３４−１３２６０５中の配列と一致するが
反対方向である。 （ｂ）ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７座標１３２６０５−１３４８９２のＵＳ ＤＮＡ
からのＤＮＡ断片は、ＴＲＳ座標１４５５８３−１４２０４６の開始点に連結し
た反対方向のＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ断片中に見いだされた。 （ｃ）ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７ ＤＮＡ配列、座標１４１６１１−１４２０４は
、ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡに変化している。 （ｄ）ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡは、ＯｒｉＳ配列を含む４７２ｂｐ配列の２
個の縦列反復を含む。
示す。ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７ ＵＳおよびＴＲＳ ＤＮＡのヌクレオチド配列
と比較して、図１０に示す下記のようなＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ中の分子転
位を同定することができた。 （ａ）Ｓｙｎ１７内のＴＲＳ配列（１４５５８３）の開始点近くの配列ＥｃｏＲ
１（座標１４６６９３）が、ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ断片中で変化していな
い。この配列は、ＩＲＳ座標１３１５３４−１３２６０５中の配列と一致するが
反対方向である。 （ｂ）ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７座標１３２６０５−１３４８９２のＵＳ ＤＮＡ
からのＤＮＡ断片は、ＴＲＳ座標１４５５８３−１４２０４６の開始点に連結し
た反対方向のＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ断片中に見いだされた。 （ｃ）ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７ ＤＮＡ配列、座標１４１６１１−１４２０４は
、ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡに変化している。 （ｄ）ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡは、ＯｒｉＳ配列を含む４７２ｂｐ配列の２
個の縦列反復を含む。
【０１１９】
ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７のＨｐａＩ−ＥｃｏＲ１（座標１４１６１１−１４６
６９３）の配列は５０８２ｂｐであり、一方ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ断片Ｈ
ｐａＩ−ＥｃｏＲ１は３７１０ｂｐであり、ＨＳＶ−１ Ｒ１５のクローンした
ＤＮＡ断片は、４７２ｂｐの反復２個を有する４１８２ｂｐである。ＨＳＶ−１
Ｓｙｎ１７は１個の４７２ｂｐ配列のみを有するので、クローンしたＨＳＶ−
１ Ｒ１５断片の関連サイズは３７１０ｂｐである。従って、ＨＳＶ−１ Ｒ１
５ ＵＳ配列は、ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７ ＵＳ ＤＮＡ中の同じ配列より１３
７２ヌクレオチドだけ短い（図１１）。
６９３）の配列は５０８２ｂｐであり、一方ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ断片Ｈ
ｐａＩ−ＥｃｏＲ１は３７１０ｂｐであり、ＨＳＶ−１ Ｒ１５のクローンした
ＤＮＡ断片は、４７２ｂｐの反復２個を有する４１８２ｂｐである。ＨＳＶ−１
Ｓｙｎ１７は１個の４７２ｂｐ配列のみを有するので、クローンしたＨＳＶ−
１ Ｒ１５断片の関連サイズは３７１０ｂｐである。従って、ＨＳＶ−１ Ｒ１
５ ＵＳ配列は、ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７ ＵＳ ＤＮＡ中の同じ配列より１３
７２ヌクレオチドだけ短い（図１１）。
【０１２０】
実施例１４ ＨＳＶ−１ Ｒ１５のＩＲＳ−ＵＳ−ＴＲＳ ＤＮＡ中の遺伝子
の転位 ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ中に同定された分子変化は、ウイルス遺伝子の構
成を変化し、これを図１２に示しそして下記である。 （ａ）ＵＳ１遺伝子（核リンタンパク質をコードするＩＥ−４遺伝子）は重複し
そしてＩＲＳおよびＴＲＳ中に現れる。 （ｂ）ＵＳ２遺伝子（ＯＲＦ２９１ａａ）は重複しそしてＩＲＳおよびＴＲＳ中
有に現れる。 （ｃ）ＨＳＶ−１ Ｒ１５中のＵＳ８遺伝子（ｇＥ、ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７中
の５５０ａａ）は１８８ａａのさらに短いポリペプチドをコードし、ＨＳＶ−１
Ｓｙｎ１７のｇＥタンパク質のＮ−末端１７０ａａと一致する。ＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞中の末端切除ｇＥタンパク質は、ＵＳ７によりコードされるｇＩ
とヘテロ二量体を形成せず従ってＨＳＶ−１ Ｒ１５は神経細胞を感染できない (3) 。 （ｄ）ＵＳ９、１０および１１遺伝子（外被タンパク質をコードする）は欠失し
ている。 （ｅ）ＵＳ１２遺伝子（ＩＥ５）は欠失している。
の転位 ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ中に同定された分子変化は、ウイルス遺伝子の構
成を変化し、これを図１２に示しそして下記である。 （ａ）ＵＳ１遺伝子（核リンタンパク質をコードするＩＥ−４遺伝子）は重複し
そしてＩＲＳおよびＴＲＳ中に現れる。 （ｂ）ＵＳ２遺伝子（ＯＲＦ２９１ａａ）は重複しそしてＩＲＳおよびＴＲＳ中
有に現れる。 （ｃ）ＨＳＶ−１ Ｒ１５中のＵＳ８遺伝子（ｇＥ、ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７中
の５５０ａａ）は１８８ａａのさらに短いポリペプチドをコードし、ＨＳＶ−１
Ｓｙｎ１７のｇＥタンパク質のＮ−末端１７０ａａと一致する。ＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞中の末端切除ｇＥタンパク質は、ＵＳ７によりコードされるｇＩ
とヘテロ二量体を形成せず従ってＨＳＶ−１ Ｒ１５は神経細胞を感染できない (3) 。 （ｄ）ＵＳ９、１０および１１遺伝子（外被タンパク質をコードする）は欠失し
ている。 （ｅ）ＵＳ１２遺伝子（ＩＥ５）は欠失している。
【０１２１】
実施例１５ ＰＣＲ試験
ＨＳＶ−１ Ｒ１５と病原性ウイルスの間を区別できるように、Ｒ１５ ＵＳ
ＤＮＡ内の荷電ヌクレオチド配列に従って設計されたプライマーを用いてＰＣ
Ｒ試験を開発した。図１３に示した結果は、反応の条件下で、プライマーはＨＳ
Ｖ−１ Ｒ１５ ＤＮＡからの３１９ｂｐＤＮＡのみを増幅することを明らかに
する。ＨＳＶ−１ Ｒ１５のＩＲＳ−ＵＳ−ＴＲＳ ＤＮＡ内の遺伝子転位の生物学的 意味
Ｒ試験を開発した。図１３に示した結果は、反応の条件下で、プライマーはＨＳ
Ｖ−１ Ｒ１５ ＤＮＡからの３１９ｂｐＤＮＡのみを増幅することを明らかに
する。ＨＳＶ−１ Ｒ１５のＩＲＳ−ＵＳ−ＴＲＳ ＤＮＡ内の遺伝子転位の生物学的 意味
【０１２２】
遺伝子内の分子変化は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５の生物学的性質を著しく変化させ
、非病原性に導く。
、非病原性に導く。
【０１２３】
実施例１６ マウスにおけるＨＳＶ−１ Ｒ１５の免疫原性に対するＵＳ１２
の欠失の影響 ＵＳ１２遺伝子は、感染細胞の小胞体（ＥＲ）中でＴＡＰ１／ＴＡＰ２により
ノナペプチドに結合してＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩポリペプチドへの輸送を阻害
するＩＣＰ４７をコードする(4) 。ＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞中にＩＣＰ４７
が存在しない場合に、ＨＬＡクラスＩ分子へのノナペプチドの輸送は影響されず
、従って宿主（ヒト）免疫系の誘導は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５を用いる免疫化の直
後に開始する。
の欠失の影響 ＵＳ１２遺伝子は、感染細胞の小胞体（ＥＲ）中でＴＡＰ１／ＴＡＰ２により
ノナペプチドに結合してＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩポリペプチドへの輸送を阻害
するＩＣＰ４７をコードする(4) 。ＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞中にＩＣＰ４７
が存在しない場合に、ＨＬＡクラスＩ分子へのノナペプチドの輸送は影響されず
、従って宿主（ヒト）免疫系の誘導は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５を用いる免疫化の直
後に開始する。
【０１２４】
図１４は、蛍光抗−ＨＬＡ抗体を用いて染色された細胞の蛍光を測定するＦＡ
ＣＳ分析の結果を比較する。ヒト繊維芽細胞およびＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７また
はＨＳＶ−１ Ｒ１５系統を用いて感染された繊維芽細胞の細胞表面上に存在す
るＨＬＡクラスＩ分子の蛍光は、ウイルス感染の初期段階の間に細胞質から細胞
表面へのＨＬＡクラスＩ分子の輸送を決定する。感染の２時間後〜４．５時間後
（ＩＣＰ４７活性の時間）の間に、ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７を感染された繊維芽
細胞の細胞外面上のＨＬＡクラスＩ分子の蛍光は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５を用いて
感染された細胞より約５０％低かったことが見いだされた。この結果は、ＵＳ１
２遺伝子が欠失したＨＳＶ−１ Ｒ１５が、細胞表面へのＨＬＡクラスＩトラン
スロケーションを阻害できないことを示す。従って、免疫系へのＨＬＡクラスＩ
分子によるウイルスノナペプチド抗原の存在は影響を受けず、これは細胞膜への
ＨＬＡクラスＩ分子のトランスロケーションを阻害する病原性ＨＳＶ−１ Ｓｙ
ｎ１７とは反対である。
ＣＳ分析の結果を比較する。ヒト繊維芽細胞およびＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７また
はＨＳＶ−１ Ｒ１５系統を用いて感染された繊維芽細胞の細胞表面上に存在す
るＨＬＡクラスＩ分子の蛍光は、ウイルス感染の初期段階の間に細胞質から細胞
表面へのＨＬＡクラスＩ分子の輸送を決定する。感染の２時間後〜４．５時間後
（ＩＣＰ４７活性の時間）の間に、ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７を感染された繊維芽
細胞の細胞外面上のＨＬＡクラスＩ分子の蛍光は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５を用いて
感染された細胞より約５０％低かったことが見いだされた。この結果は、ＵＳ１
２遺伝子が欠失したＨＳＶ−１ Ｒ１５が、細胞表面へのＨＬＡクラスＩトラン
スロケーションを阻害できないことを示す。従って、免疫系へのＨＬＡクラスＩ
分子によるウイルスノナペプチド抗原の存在は影響を受けず、これは細胞膜への
ＨＬＡクラスＩ分子のトランスロケーションを阻害する病原性ＨＳＶ−１ Ｓｙ
ｎ１７とは反対である。
【０１２５】
ＨＳＶ−１Ｆ、ＨＦＥＭおよびＲ１５で感染され、感染の３および６時間後に
固定し、そしてヒトＨＬＡクラスＩ分子に対する抗体を用いて染色されたＨｅＬ
ａ細胞の共焦点顕微鏡試験は、ＨＳＶ−１ＦまたはＨＦＥＭを用いて感染された
ＨｅＬａ細胞中でＨＬＡクラスＩ分子が、細胞の細胞質内で保持されそして細胞
外膜にはほとんど存在しないことを明らかにした。Ｒ１５感染された細胞中で、
ＨＬＡクラスＩ分子は、細胞外膜上に均等に分布していた（図示せず）。
固定し、そしてヒトＨＬＡクラスＩ分子に対する抗体を用いて染色されたＨｅＬ
ａ細胞の共焦点顕微鏡試験は、ＨＳＶ−１ＦまたはＨＦＥＭを用いて感染された
ＨｅＬａ細胞中でＨＬＡクラスＩ分子が、細胞の細胞質内で保持されそして細胞
外膜にはほとんど存在しないことを明らかにした。Ｒ１５感染された細胞中で、
ＨＬＡクラスＩ分子は、細胞外膜上に均等に分布していた（図示せず）。
【０１２６】
ＨＦＥＭ、Ｓｙｎ１７またはＨＳＶ−１ Ｒ１５を用いて感染され、そしてＩ
ＣＰ４７アミノ酸配列から誘導された合成ポリペプチドに対して調製されたラビ
ット抗体を用いて処理されたＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡試験は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞にＩＣＰ４７が存在しないことを明らかにした。ＨＬＡクラスＩ
トランスロケーションの阻害は、ＨＦＥＭまたはＳｙｎ１７を用いて感染された
細胞内で起きる（図示せず）。
ＣＰ４７アミノ酸配列から誘導された合成ポリペプチドに対して調製されたラビ
ット抗体を用いて処理されたＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡試験は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞にＩＣＰ４７が存在しないことを明らかにした。ＨＬＡクラスＩ
トランスロケーションの阻害は、ＨＦＥＭまたはＳｙｎ１７を用いて感染された
細胞内で起きる（図示せず）。
【０１２７】
実施例１７ ＵＳ８遺伝子中の欠失はマウスにおける感染神経細胞からＨＳＶ
−１ Ｒ１５を防ぐ。
−１ Ｒ１５を防ぐ。
【０１２８】
ＵＳ８遺伝子発現がない場合に、ＨＳＶ−１ Ｒ１５が感染マウスの神経系中
に浸透できないので、複合体ｇＥ／ｇＩは形成できない。糖タンパク質ｇＥ／ｇ
Ｉヘテロ二量体は、病原性ＨＳＶ−１系統の神経細胞から神経細胞への拡散を容
易にすることが報告されている(3) 。感染マウスの神経系感染に対するＨＳＶ−
１ Ｒ１５の不能性は、この組換え体の非病原性の原因である分子変化の一つで
ある。
に浸透できないので、複合体ｇＥ／ｇＩは形成できない。糖タンパク質ｇＥ／ｇ
Ｉヘテロ二量体は、病原性ＨＳＶ−１系統の神経細胞から神経細胞への拡散を容
易にすることが報告されている(3) 。感染マウスの神経系感染に対するＨＳＶ−
１ Ｒ１５の不能性は、この組換え体の非病原性の原因である分子変化の一つで
ある。
【０１２９】
実施例１８ ＵＳ９、ＵＳ１０およびＵＳ１１遺伝子の欠失はマウス鼻上皮、
皮膚およびＣＮＳ中におけるＨＳＶ−１ Ｒ１５の複製に影響しない これらの遺伝子はγ1 外被タンパク質をコードする。 （ａ）ＵＳ９は、外被リン酸化タンパク質の合成をコードし、 （ｂ）ＵＳ１０は、別の外被タンパク質をコードする。ＵＳ１１は感染細胞中の
６０Ｓリボソームサブユニットに結合しそして遺伝子ＵＬ３４（膜関連リン酸化
ビリオンタンパク質）のｍＲＮＡ転写物にも結合する外被タンパク質をコードす
る。
皮膚およびＣＮＳ中におけるＨＳＶ−１ Ｒ１５の複製に影響しない これらの遺伝子はγ1 外被タンパク質をコードする。 （ａ）ＵＳ９は、外被リン酸化タンパク質の合成をコードし、 （ｂ）ＵＳ１０は、別の外被タンパク質をコードする。ＵＳ１１は感染細胞中の
６０Ｓリボソームサブユニットに結合しそして遺伝子ＵＬ３４（膜関連リン酸化
ビリオンタンパク質）のｍＲＮＡ転写物にも結合する外被タンパク質をコードす
る。
【０１３０】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５が１０8 ｐｆｕ／ｍｌの力価に生体内で細胞を複製し、こ
れは３種の外被遺伝子の欠失が細胞培養物中のウイルス複製に影響しないことを
示し、公開文献(5) とも一致することが観察された。培養細胞中で高い力価へ複
製するＨＳＶ−１ Ｒ１５の能力は、ワクチンを目的とするこのウイルスの産生
を確認する。
れは３種の外被遺伝子の欠失が細胞培養物中のウイルス複製に影響しないことを
示し、公開文献(5) とも一致することが観察された。培養細胞中で高い力価へ複
製するＨＳＶ−１ Ｒ１５の能力は、ワクチンを目的とするこのウイルスの産生
を確認する。
【０１３１】
実施例１９ ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡのＵＬおよびＵＬの内部反復（ＩＵ
Ｌ）におけるそれぞれＵＬ５４およびγ1 ３４．５遺伝子の発現における変性 図１５は、ＢａｍＨＩ Ｂ ＤＮＡ断片：ＬＡＴｓ ｍＲＮＡをコードするＵ
Ｌ５３、ＵＬ５４、ＵＬ５５およびＵＬ５６潜在性遺伝子、ＩＣＰ３４．５をコ
ードするＩＥ１１０遺伝子およびγ1 ３４．５遺伝子の近傍およびその中に位置
するＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７遺伝子の地図を示す。
Ｌ）におけるそれぞれＵＬ５４およびγ1 ３４．５遺伝子の発現における変性 図１５は、ＢａｍＨＩ Ｂ ＤＮＡ断片：ＬＡＴｓ ｍＲＮＡをコードするＵ
Ｌ５３、ＵＬ５４、ＵＬ５５およびＵＬ５６潜在性遺伝子、ＩＣＰ３４．５をコ
ードするＩＥ１１０遺伝子およびγ1 ３４．５遺伝子の近傍およびその中に位置
するＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７遺伝子の地図を示す。
【０１３２】
ＩＲＬの５’末端における４Ｋｂｐ欠失が、ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭ（ＨＳＶ−
１ Ｒ１５の親ウイルス）のＤＮＡゲノム内に同定された。ＨＳＶ−１ Ｒ１５
ＤＮＡゲノムは、ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭ ＤＮＡとＨＳＶ−１ ＦからのＢａ
ｍＨＩ Ｂ ＤＮＡ断片との間の組換えからもたらされたので、ＨＳＶ−１の病
原性に重要な組換え部位に近い２種の遺伝子：ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ中の
ＵＬ５４およびγ1 ３４．５遺伝子を研究することに決定した（図１５）。
１ Ｒ１５の親ウイルス）のＤＮＡゲノム内に同定された。ＨＳＶ−１ Ｒ１５
ＤＮＡゲノムは、ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭ ＤＮＡとＨＳＶ−１ ＦからのＢａ
ｍＨＩ Ｂ ＤＮＡ断片との間の組換えからもたらされたので、ＨＳＶ−１の病
原性に重要な組換え部位に近い２種の遺伝子：ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ中の
ＵＬ５４およびγ1 ３４．５遺伝子を研究することに決定した（図１５）。
【０１３３】
実施例２０ ＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞内でＵＬ５４によりコードされる検
出可能なＩＣＰ２７（ＩＥ−２タンパク質）の不在 ＵＬ５４は、感染細胞の細胞質と核の間を往復するＨＳＶ−１のＩＣＰ２７（
ＩＥ−２）タンパク質をコードする(6) 。
出可能なＩＣＰ２７（ＩＥ−２タンパク質）の不在 ＵＬ５４は、感染細胞の細胞質と核の間を往復するＨＳＶ−１のＩＣＰ２７（
ＩＥ−２）タンパク質をコードする(6) 。
【０１３４】
抗−ＩＣＰ２７ラビット抗体を実験室内で調製しそして共焦点顕微鏡試験によ
るＨＳＶ−１感染細胞内のＩＣＰ２７タンパク質の検出に使用した。ＨＳＶ−１
Ｆ感染しかしＨＳＶ−１ Ｒ１５非感染のＨｅＬａ細胞は、感染細胞中のＩＣ
Ｐ２７タンパク質細胞質および核の存在を明らかにした（図示せず）。
るＨＳＶ−１感染細胞内のＩＣＰ２７タンパク質の検出に使用した。ＨＳＶ−１
Ｆ感染しかしＨＳＶ−１ Ｒ１５非感染のＨｅＬａ細胞は、感染細胞中のＩＣ
Ｐ２７タンパク質細胞質および核の存在を明らかにした（図示せず）。
【０１３５】
ＩＣＰ２７タンパク質はＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞中には検出されなかった
ので、我々はｐＣｉ発現ベクター(Promega) 中のＵＬ５４遺伝子をクローンした
。ｐＣｉ−ＵＬ５４プラスミドを細胞株２９３内にトランスフェクションしそし
て抗−ＩＣＰ２７抗体を用いて染色した。トランスフェクションされた細胞中で
、ＨＳＶ−１ Ｒ１５のＵＬ５４遺伝子が発現されそしてＩＣＰ２７がラビット
抗−ＩＣＰ２７抗体により検出されたことが見いだされた。さらに、ＵＬ５４遺
伝子プロモーターのヌクレオチド配列をクローン、配列決定して、ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７中のＵＬ５４遺伝子プロモーターのプロモーター配列と一致すること
を見いだした。
ので、我々はｐＣｉ発現ベクター(Promega) 中のＵＬ５４遺伝子をクローンした
。ｐＣｉ−ＵＬ５４プラスミドを細胞株２９３内にトランスフェクションしそし
て抗−ＩＣＰ２７抗体を用いて染色した。トランスフェクションされた細胞中で
、ＨＳＶ−１ Ｒ１５のＵＬ５４遺伝子が発現されそしてＩＣＰ２７がラビット
抗−ＩＣＰ２７抗体により検出されたことが見いだされた。さらに、ＵＬ５４遺
伝子プロモーターのヌクレオチド配列をクローン、配列決定して、ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７中のＵＬ５４遺伝子プロモーターのプロモーター配列と一致すること
を見いだした。
【０１３６】
ＩＣＰ２７はＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞中では検出されず、一方ＵＬ５４遺
伝子は発現ベクター内にクローンした場合に発現される。感染細胞中のＵＬ５４
遺伝子発現が他の遺伝子による影響または調節下にある可能性がある。
伝子は発現ベクター内にクローンした場合に発現される。感染細胞中のＵＬ５４
遺伝子発現が他の遺伝子による影響または調節下にある可能性がある。
【０１３７】
実施例２１ 病原性ウイルスＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＨＦＥＭと比較し
たＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞中のγ1 ３４．５遺伝子の発現 ＨＳＶ−１ ＤＮＡのＩＲＬ中のγ1 ３４．５遺伝子は２種のタンパク質：Ｉ
ＣＰ３４．５およびＯＲＦ Ｂをコードする（図１５）。ＩＣＰ３４．５は脳内
注入された場合にＨＳＶ−１のＣＮＳ病原性の原因となる(7) 。感染細胞中のＩ
ＣＰ３４．５を検出するために、γ1 ３４．５遺伝子によりコードされたタンパ
ク質のアミノ酸配列から誘導したペプチドに対してラビット抗体を作製した。ウ
エスタンブロット分析により、ＩＣＰ３４．５（４３ＫＤａ）がＨＳＶ−１ Ｆ
感染細胞内で検出され、一方ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＨＦＥＭ感染細胞中
では、ＩＣＰ３４．５は３７ＫＤａの分子量を有していた（図１６）。ＴＲＬお
よびＩＲＬ中にγ1 ３４．５遺伝子の２個の対立遺伝子中の細菌性ＬａｃＺ遺伝
子の挿入物を含むＨＳＶ−１組換え体６０１および６０２は、γ1 ３４．５遺伝
子を発現しなかった。
たＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞中のγ1 ３４．５遺伝子の発現 ＨＳＶ−１ ＤＮＡのＩＲＬ中のγ1 ３４．５遺伝子は２種のタンパク質：Ｉ
ＣＰ３４．５およびＯＲＦ Ｂをコードする（図１５）。ＩＣＰ３４．５は脳内
注入された場合にＨＳＶ−１のＣＮＳ病原性の原因となる(7) 。感染細胞中のＩ
ＣＰ３４．５を検出するために、γ1 ３４．５遺伝子によりコードされたタンパ
ク質のアミノ酸配列から誘導したペプチドに対してラビット抗体を作製した。ウ
エスタンブロット分析により、ＩＣＰ３４．５（４３ＫＤａ）がＨＳＶ−１ Ｆ
感染細胞内で検出され、一方ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＨＦＥＭ感染細胞中
では、ＩＣＰ３４．５は３７ＫＤａの分子量を有していた（図１６）。ＴＲＬお
よびＩＲＬ中にγ1 ３４．５遺伝子の２個の対立遺伝子中の細菌性ＬａｃＺ遺伝
子の挿入物を含むＨＳＶ−１組換え体６０１および６０２は、γ1 ３４．５遺伝
子を発現しなかった。
【０１３８】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５感染細胞ホモジネート中のＩＣＰ３４．５のウエスタンブ
ロットは、細胞タンパク質の非特異性染色による不明瞭な結果となった。γ1 ３
４．５は、ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭまたはＳｙｎ１７により感染された細胞中より
も低いレベルで発現されたことが示唆される。
ロットは、細胞タンパク質の非特異性染色による不明瞭な結果となった。γ1 ３
４．５は、ＨＳＶ−１ ＨＦＥＭまたはＳｙｎ１７により感染された細胞中より
も低いレベルで発現されたことが示唆される。
【０１３９】
実施例２２ 病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）を用いるチャレンジ後の眼皮膚または肺
経路を通じるＨＳＶ−１Ｒ１組換え体を用いて免疫化したマウスの生存率 セブラマウスをＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体（１０7 ｐｆｕ／ｍｌのストック
からの３０μｌ）を用いて３種の異なる経路：（１）眼の感染（マウス１０匹）
、（２）皮膚中の皮下感染（マウス１０匹）、および（３）軽く麻酔したマウス
１０匹の肺への感染により免疫化した。
経路を通じるＨＳＶ−１Ｒ１組換え体を用いて免疫化したマウスの生存率 セブラマウスをＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体（１０7 ｐｆｕ／ｍｌのストック
からの３０μｌ）を用いて３種の異なる経路：（１）眼の感染（マウス１０匹）
、（２）皮膚中の皮下感染（マウス１０匹）、および（３）軽く麻酔したマウス
１０匹の肺への感染により免疫化した。
【０１４０】
２週間後にマウスのすべての３群を病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）（１０7 ｐｆｕ／
ｍｌのストックからの３０μｌ）を用いて鼻経路で感染させた。動物を３週間追
跡しそして免疫化したマウスおよび対照マウス（免疫化したマウスと同様に感染
の同じ経路により非感染細胞ホモジネート３０μｌを注入）の生存率を記録し、
結果を図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃに示す。 結果 ２２．１ 眼経路によるサブラマウスの免疫化 図１７Ａは、Ｒ１５免疫化マウスの９０％がＨＳＶ−１（Ｆ）を用いたチャレ
ンジを生き残ったことを明らかにした。対照マウスの約５０％がチャレンジウイ
ルスを生き残った。これは、２群の追加の対照マウス群内で生存率が３０％（図
１７Ｃ参照）および２０％（図１７Ｄ参照）であったので、チャレンジウイルス
ＨＳＶ−１（Ｆ）がマウスの半分を感染しなかったことを示すと考えられる。 ２２．２ 皮下経路によるサブラマウスの免疫化 図１７Ｂは、マウス皮膚へのＲ１５皮下注入が、病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）を用
いるチャレンジからマウスを完全（１００％）に保護することを示す。対照群中
で、マウスの３０％のみが生き残った。 ２２．３ 肺経路によるマウスの免疫化 図１７Ｃは、麻酔したマウス中へのＲ１５の吸入がＨＳＶ−１（Ｆ）を用いる
鼻内チャレンジからマウスを完全に保護することを明らかにした。対照群は感染
に負けそしてマウスの２０％のみが生き残った。結論 眼、皮膚および肺経路により免疫化された場合に、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え
体が、ＨＳＶ−１ Ｆを用いるチャレンジに対してマウスを保護すると結論され
る。
ｍｌのストックからの３０μｌ）を用いて鼻経路で感染させた。動物を３週間追
跡しそして免疫化したマウスおよび対照マウス（免疫化したマウスと同様に感染
の同じ経路により非感染細胞ホモジネート３０μｌを注入）の生存率を記録し、
結果を図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃに示す。 結果 ２２．１ 眼経路によるサブラマウスの免疫化 図１７Ａは、Ｒ１５免疫化マウスの９０％がＨＳＶ−１（Ｆ）を用いたチャレ
ンジを生き残ったことを明らかにした。対照マウスの約５０％がチャレンジウイ
ルスを生き残った。これは、２群の追加の対照マウス群内で生存率が３０％（図
１７Ｃ参照）および２０％（図１７Ｄ参照）であったので、チャレンジウイルス
ＨＳＶ−１（Ｆ）がマウスの半分を感染しなかったことを示すと考えられる。 ２２．２ 皮下経路によるサブラマウスの免疫化 図１７Ｂは、マウス皮膚へのＲ１５皮下注入が、病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）を用
いるチャレンジからマウスを完全（１００％）に保護することを示す。対照群中
で、マウスの３０％のみが生き残った。 ２２．３ 肺経路によるマウスの免疫化 図１７Ｃは、麻酔したマウス中へのＲ１５の吸入がＨＳＶ−１（Ｆ）を用いる
鼻内チャレンジからマウスを完全に保護することを明らかにした。対照群は感染
に負けそしてマウスの２０％のみが生き残った。結論 眼、皮膚および肺経路により免疫化された場合に、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え
体が、ＨＳＶ−１ Ｆを用いるチャレンジに対してマウスを保護すると結論され
る。
【０１４１】
実施例２３ ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＵＬ５４遺伝子は感染細胞中に発現されな
い 病原性ＨＳＶ−１系統ＦおよびＳｙｎ１７のＵＬ５４遺伝子は、早期に発現さ
れ（感染の２〜４時間後）、そしてＩＣＰ２７と呼ばれるウイルス前初期タンパ
ク質をコードする。このタンパク質は、感染細胞の核内で分子の転位を起こす。
これまでの実施例中で、ＨＳＶ−１ Ｒ１５中でＵＬ５４遺伝子が機能性ではな
いことが証明された。
い 病原性ＨＳＶ−１系統ＦおよびＳｙｎ１７のＵＬ５４遺伝子は、早期に発現さ
れ（感染の２〜４時間後）、そしてＩＣＰ２７と呼ばれるウイルス前初期タンパ
ク質をコードする。このタンパク質は、感染細胞の核内で分子の転位を起こす。
これまでの実施例中で、ＨＳＶ−１ Ｒ１５中でＵＬ５４遺伝子が機能性ではな
いことが証明された。
【０１４２】
本実験中で、ＨＥＫ２９３細胞を非感染細胞ホモジネートを用いて処理し（図
１８、擬似）、そして感染ＨＥＫ２９３細胞をＨＳＶ−１ Ｒ１５（図１８、Ｒ
１５）またはＨＳＶ−１（Ｆ）（図１７Ｆ）を用いて処理した。ＫＬＨに付着し
た合成ペプチドに対してラビット中で抗体を産生させた。ラビットの血清が得ら
れそして抗ＩＣＰ２７抗体を対照およびウイルス感染細胞を染色するために使用
した。結果 ＨＳＶ−１（Ｆ）を用いて感染させたＨＥＫ細胞中で、細胞を免疫血清を用い
て染色し、ＩＣＰ２７タンパク質がＵＬ５４遺伝子転写物から合成されたことを
示すことが図１８から分かる。しかし、ＨＳＶ−１ Ｒ１５を用いて感染された
細胞内には、ウイルスタンパク質ＩＣＰ２７が欠損している。対照細胞は陰性で
あった。この結果は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体が前初期遺伝子ＵＬ５４から
ｍＲＮＡを合成できないことを示す。
１８、擬似）、そして感染ＨＥＫ２９３細胞をＨＳＶ−１ Ｒ１５（図１８、Ｒ
１５）またはＨＳＶ−１（Ｆ）（図１７Ｆ）を用いて処理した。ＫＬＨに付着し
た合成ペプチドに対してラビット中で抗体を産生させた。ラビットの血清が得ら
れそして抗ＩＣＰ２７抗体を対照およびウイルス感染細胞を染色するために使用
した。結果 ＨＳＶ−１（Ｆ）を用いて感染させたＨＥＫ細胞中で、細胞を免疫血清を用い
て染色し、ＩＣＰ２７タンパク質がＵＬ５４遺伝子転写物から合成されたことを
示すことが図１８から分かる。しかし、ＨＳＶ−１ Ｒ１５を用いて感染された
細胞内には、ウイルスタンパク質ＩＣＰ２７が欠損している。対照細胞は陰性で
あった。この結果は、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体が前初期遺伝子ＵＬ５４から
ｍＲＮＡを合成できないことを示す。
【０１４３】
実施例２４ 感染ラットの脳機能および挙動に対する脳内経路により注入され
た非病原性ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体の影響挙動試験 ケージの開口およびケージ内への手袋をした手の挿入に対する動物の反応性を
試験して、感染の３日後の攻撃性挙動を評価した。攻撃は、下記の０〜２の段階
で評価した：０＝反応なし；１＝明白な驚愕反応および手を用いる攻撃の試み；
２＝極端な刺激反応、激しい攻撃および手を噛むおよび／またはケージを飛び出
る試み。驚愕反応は、ケージの引っかきに対する反応として観察された。
た非病原性ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体の影響挙動試験 ケージの開口およびケージ内への手袋をした手の挿入に対する動物の反応性を
試験して、感染の３日後の攻撃性挙動を評価した。攻撃は、下記の０〜２の段階
で評価した：０＝反応なし；１＝明白な驚愕反応および手を用いる攻撃の試み；
２＝極端な刺激反応、激しい攻撃および手を噛むおよび／またはケージを飛び出
る試み。驚愕反応は、ケージの引っかきに対する反応として観察された。
【０１４４】
Ｒ１５を用いる免疫化が毒性系統の致死量投与からマウスおよびラットの両方
を完全に保護することが以前に示された。この実験では、Ｒ−１５を用いる免疫
化が、毒性ＨＳＶ−１を用いる急性感染の臨床的徴候からラットを保護するかど
うかおよびＲ−１５を用いる急性または慢性感染がなんらかの臨床的意義を有す
るかどうかを試験した。この目的で、下記のパラメーター：体温、攻撃的挙動、
および脳プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）合成、を下記の５群の実験群で測
定した。 Ｉ．対照非感染ラット、 ＩＩ．５ｘ１０5 ｐｆｕのＨＳＶ−１系統Ｓｙｍ１７＋を用いて脳室内（ＩＣＶ
）に接種したラット、 ＩＩＩ．５ｘ１０5 ｐｆｕのＲ−１５を用いてＩＣＶ接種したラット、 ＩＶ．５ｘ１０5 ｐｆｕのＲ−１５を用いて２週間の間隔をおける２回の皮下接
種により免疫化、そして第二回免疫化の２週間後に観察したラット、 Ｖ．５ｘ１０5 ｐｆｕのＲ−１５を用いて２週間の間隔をおける２回の皮下接種
により免疫化、次いで高度に致死性の１０6 ｐｆｕ Ｓｙｎ１７＋のＩＣＶ投与
を用いてチャレンジしたラット。結果 実験の結果を表６に示す。これから分かるように、ｓｙｎ１７＋を用いる急性
ＩＣＶ接種は、著しい高熱および攻撃挙動、ならびに脳内で増加したＰＧＥ2 産
生を起こした。Ｒ−１５を用いる急性ＩＣＶ接種またはＲ−１５を用いる免疫化
は、対照動物に観察されるものと異なったいかなる体温上昇、またはＰＧＥ2 産
生または攻撃挙動も誘導しなかった。Ｒ−１５を用いる免疫化は、Ｓｙｎ１７＋
誘導攻撃挙動から動物を完全に保護した。これらの動物は、ｓｙｎ１７＋を用い
る最終的なＩＣＶチャレンジに対して、対照とＳｙｎ１７＋感染動物との中間程
度の体温およびＰＧＥ2 産生の値で反応した。結論 ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体は、脳内注入された場合に脳内で複製されるけれ
ども、これは感染したラットの正常な挙動に影響せずそしてこれらを殺しもしな
い。これはＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体の非病原性の別の標識であり、それとい
うのも病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）を用いる感染はラットが感染で死亡するまでこれ
を著しく攻撃的とするからである。
を完全に保護することが以前に示された。この実験では、Ｒ−１５を用いる免疫
化が、毒性ＨＳＶ−１を用いる急性感染の臨床的徴候からラットを保護するかど
うかおよびＲ−１５を用いる急性または慢性感染がなんらかの臨床的意義を有す
るかどうかを試験した。この目的で、下記のパラメーター：体温、攻撃的挙動、
および脳プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）合成、を下記の５群の実験群で測
定した。 Ｉ．対照非感染ラット、 ＩＩ．５ｘ１０5 ｐｆｕのＨＳＶ−１系統Ｓｙｍ１７＋を用いて脳室内（ＩＣＶ
）に接種したラット、 ＩＩＩ．５ｘ１０5 ｐｆｕのＲ−１５を用いてＩＣＶ接種したラット、 ＩＶ．５ｘ１０5 ｐｆｕのＲ−１５を用いて２週間の間隔をおける２回の皮下接
種により免疫化、そして第二回免疫化の２週間後に観察したラット、 Ｖ．５ｘ１０5 ｐｆｕのＲ−１５を用いて２週間の間隔をおける２回の皮下接種
により免疫化、次いで高度に致死性の１０6 ｐｆｕ Ｓｙｎ１７＋のＩＣＶ投与
を用いてチャレンジしたラット。結果 実験の結果を表６に示す。これから分かるように、ｓｙｎ１７＋を用いる急性
ＩＣＶ接種は、著しい高熱および攻撃挙動、ならびに脳内で増加したＰＧＥ2 産
生を起こした。Ｒ−１５を用いる急性ＩＣＶ接種またはＲ−１５を用いる免疫化
は、対照動物に観察されるものと異なったいかなる体温上昇、またはＰＧＥ2 産
生または攻撃挙動も誘導しなかった。Ｒ−１５を用いる免疫化は、Ｓｙｎ１７＋
誘導攻撃挙動から動物を完全に保護した。これらの動物は、ｓｙｎ１７＋を用い
る最終的なＩＣＶチャレンジに対して、対照とＳｙｎ１７＋感染動物との中間程
度の体温およびＰＧＥ2 産生の値で反応した。結論 ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体は、脳内注入された場合に脳内で複製されるけれ
ども、これは感染したラットの正常な挙動に影響せずそしてこれらを殺しもしな
い。これはＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体の非病原性の別の標識であり、それとい
うのも病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）を用いる感染はラットが感染で死亡するまでこれ
を著しく攻撃的とするからである。
【０１４５】
実施例２５ ＨＳＶ−１ Ｒ１５が複製するラット脳内の標的細胞の決定
精製した一次新生ラットグリア培養物内のＲ−１５の一段複製：図１９は、Ｒ
−１５が毒性系統よりも１〜２桁低い力価に複製することを示す。脳細胞中のこ
の減衰した複製は、他の細胞タイプの場合と同程度である。
−１５が毒性系統よりも１〜２桁低い力価に複製することを示す。脳細胞中のこ
の減衰した複製は、他の細胞タイプの場合と同程度である。
【０１４６】
毒性ＨＳＶ−１系統Ｓｙｎ１７＋は、ＲＴ−ＰＣＲで測定して感染された星状
膠細胞内にインターロイキン−１β遺伝子発現を誘導する（図２０左から最初の
線）。これに関連して、この毒性系統は星状膠細胞内の核に対するＨＦκＢのト
ランスロケーションを起こす。これと比較して、系統Ｒ−１５は、ＩＬ−１β遺
伝子発現を誘導しなかった（図２０）。結論 ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体および脳細胞からの後代は、病原性ＨＳＶ−１の
後代よりも２桁低い。後者はＩＬ−１βの遺伝子の転写を誘導するが、ＨＳＶ−
２ Ｒ１５はＩＬ−１β遺伝子を誘導できない。
膠細胞内にインターロイキン−１β遺伝子発現を誘導する（図２０左から最初の
線）。これに関連して、この毒性系統は星状膠細胞内の核に対するＨＦκＢのト
ランスロケーションを起こす。これと比較して、系統Ｒ−１５は、ＩＬ−１β遺
伝子発現を誘導しなかった（図２０）。結論 ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体および脳細胞からの後代は、病原性ＨＳＶ−１の
後代よりも２桁低い。後者はＩＬ−１βの遺伝子の転写を誘導するが、ＨＳＶ−
２ Ｒ１５はＩＬ−１β遺伝子を誘導できない。
【０１４７】
【表１】
【０１４８】
【表２】
【０１４９】
【表３】
【０１５０】
【表４】
【０１５１】
【表５】
【０１５２】
【表６】
【０１５３】
【表７】
【０１５４】
【表８】
【配列表】
本発明を理解しそしてこれが実際に行われる方法を理解するために、限定では
ない例のみを用いて、添付の図を参照して好ましい態様を説明する。
ない例のみを用いて、添付の図を参照して好ましい態様を説明する。
【図１Ａ】
Ａは、病原性ＨＳＶ−１ Ｆを用いてチャレンジした後に非病原性ＨＳＶ−１
系統を用いて免疫化した成体サブラマウスの生存率を示す。
系統を用いて免疫化した成体サブラマウスの生存率を示す。
【図１Ｂ】
Ｂは、病原性ＨＳＶ−１ Ｆを用いてチャレンジした後に非病原性ＨＳＶ−１
系統を用いて免疫化した哺乳期サブラマウスの生存率を示す。
系統を用いて免疫化した哺乳期サブラマウスの生存率を示す。
【図２】
フットパッド経路によりＨＳＶ−１ Ｒ１５を用いて免疫化した鼻内感染マウ
スの嗅球、扁桃および三叉神経節中のＨＳＶ−１ Ｆ ＤＮＡの存在を検出する
ためのＰＣＲ試験を示す。
スの嗅球、扁桃および三叉神経節中のＨＳＶ−１ Ｆ ＤＮＡの存在を検出する
ためのＰＣＲ試験を示す。
【図３】
病原性ＨＳＶ−１ Ｆを用いるチャレンジの前後においてＨＳＶ−１ Ｒ１５
を用いて免疫化したマウスの血清内の中和抗ＨＳＶ−１抗体を示す。
を用いて免疫化したマウスの血清内の中和抗ＨＳＶ−１抗体を示す。
【図４】
病原性ＨＳＶ−１ ＦからのＢａｍＨＩＢ ＤＮＡ断片がＨＳＶ−１ ＨＦＥ
ＭゲノムＤＮＡと組換えられる組換え実験の経路を示す。この実験からＨＳＶ−
１ Ｒ１５が単離された。
ＭゲノムＤＮＡと組換えられる組換え実験の経路を示す。この実験からＨＳＶ−
１ Ｒ１５が単離された。
【図５】
ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＨＳＶ−１ Ｒ１５のＩＲＳ−ＵＳ−ＴＲＳ
ＤＮＡ内の遺伝子およびそのＲＮＡ転写物の地図を示す。
ＤＮＡ内の遺伝子およびそのＲＮＡ転写物の地図を示す。
【図６】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５のＩＲＳ−ＵＳ−ＴＲＳ ＤＮＡ内の遺伝子のＲＮＡ転写
物のノーザンブロット分析を示す。
物のノーザンブロット分析を示す。
【図７】
ＯｒｉＳおよびＵＳ１２プローブを用いたＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７、ＨＦＥＭ
およびＲ１５ ＩＲＳ−ＵＳ−ＴＲＳ ＤＮＡのサザンブロット分析を示す。
およびＲ１５ ＩＲＳ−ＵＳ−ＴＲＳ ＤＮＡのサザンブロット分析を示す。
【図８】
ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７、Ｒ１５およびＨＦＥＭ ＤＮＡからのＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片のサザンブロット分析を示す。
ＤＮＡ断片のサザンブロット分析を示す。
【図９】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡ断片Ｈｐａｌ−ＥｃｏＲＩ（座標１４１６１１−
１４６６９３）の４１８２ｂｐのヌクレオチド配列分析を示す。
１４６６９３）の４１８２ｂｐのヌクレオチド配列分析を示す。
【図１０】
ＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＩＲＳ−ＵＳ−ＴＲＳ ＤＮＡ内の転位を示す。
【図１１】
ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＵＳ ＤＮＡのＩＲＳ−
ＵＳ−ＴＲＳ領域の比較地図を示す。
ＵＳ−ＴＲＳ領域の比較地図を示す。
【図１２】
ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７ ＤＮＡ中の遺伝子配列と比較したＨＳＶ−１Ｒ１５
ＩＲＳ−ＵＳ−ＴＲＳ ＤＮＡ内の遺伝子の転位を示す。
【図１３】
病原性ＨＳＶ−１系統のＤＮＡからＨＳＶ−１ Ｒ１５ ＤＮＡを分画するた
めのＰＣＲ試験を示す。
めのＰＣＲ試験を示す。
【図１４】
ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７およびＲ１５を用いた感染後のヒト繊維芽細胞の細胞
膜上のＨＬＡクラスＩ分子のＦＡＣＳ分析を示す。
膜上のＨＬＡクラスＩ分子のＦＡＣＳ分析を示す。
【図１５】
ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７のＵＬ−ＩＲＬ−ＩＲＳの部分およびＨＦＥＭ Ｂａ
ｍＨＩ−Ｂ ＤＮＡ内の欠失の地図を示す。
ｍＨＩ−Ｂ ＤＮＡ内の欠失の地図を示す。
【図１６】
ＨＳＶ−１株で感染された細胞中でＩＣＰ３４．５タンパク質を検出するため
のウエスタンブロット分析を示す。
のウエスタンブロット分析を示す。
【図１７】
Ａ、ＢおよびＣは、ＨＳＦ−１ 野生型Ｆを用いてチャレンジされそして眼経
路（１７Ａ）、皮膚経路（１７Ｂ）または肺経路（１７Ｃ）により免疫化された
マウスの生存率を示す。
路（１７Ａ）、皮膚経路（１７Ｂ）または肺経路（１７Ｃ）により免疫化された
マウスの生存率を示す。
【図１８】
ＨＳＦ−１ Ｆ；Ｒ１５および擬似を用いて感染されたＨＥＫ２９３細胞中の
ＩＣＰ２７タンパク質検出を示す。
ＩＣＰ２７タンパク質検出を示す。
【図１９】
星状膠細胞内のＲ１５、Ｐ−１７、Ｒ−１９の複製速度を示す。
【図２０】
星状膠細胞内においてＨＳＶ−１系統Ｓｙｎ１７+ およびＲ−１５によるＩＬ
−ＩＢ遺伝子発現の誘導（ＲＴ−ＰＣＲ誘導により測定）を示す。
−ＩＢ遺伝子発現の誘導（ＲＴ−ＰＣＲ誘導により測定）を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年９月１８日（２００１．９．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明のＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体は、下記のような種々の有利な性質を有
する。 （１）成体および哺乳期マウスに非病原性であることが分かった。 （２）免疫化した対象体（マウス）の皮膚または鼻上皮内での本発明の非病原性
ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体の複製は、自己限定性であり、その結果ウイルスＤ
ＮＡは、感染の３〜４日後以内に接種の部位から消失する。 （３）本発明の組換え体は、末梢および中枢神経系内への浸透が不可能であり従
って従来技術で提出された生ウイルスに基づくワクチンの主要な障害の一つを実
際的に克服している。 （４）本発明の組換え体を用いる接種は、免疫化したマウス中で、中枢神経系内
への他の病原性ＨＳＶ−１の進入を防止する。 （５）本発明のＨＳＶ−１組換え体は、高度に免疫原性でありそして免疫化した
マウス内で抗ウイルス体液性免疫反応を誘導する能力がある、 （６）本発明の組換え体は、定位注入の結果として非病原性である。 （７）本発明の組換え体は、マウスおよびラット脳内への注入の後、視床下部下
垂体副腎皮質軸（ＨＰＡ）を活性化せず、プロスタグランジンＥ２の産生を増加
せず、注入部位中の視床下部の外側でＩＬ−１遺伝子発現を誘導せず、これらは
病原性ＨＳＶ−１Ｆにより起きる状態とは反対である。 （８）生体外条件下で本発明の組換え体を用いるマウス星状膠細胞の感染は、Ｉ
Ｌ−１遺伝子の発現を誘導せず、これは感染後３時間以内にＩＬ−１遺伝子を誘
導する病原性ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７を用いて感染が起きる状態とは反対である
。 （９）本発明の組換えＨＳＶ−１ Ｒ１５は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコー
ドする活性ＵＬ２３遺伝子を有し、従って、ウイルスは抗ヘルペス薬剤アシクロ
ビルを用いる治療に高度に感受性であり、希望する場合にはその感染を制御され
てもよい。
する。 （１）成体および哺乳期マウスに非病原性であることが分かった。 （２）免疫化した対象体（マウス）の皮膚または鼻上皮内での本発明の非病原性
ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体の複製は、自己限定性であり、その結果ウイルスＤ
ＮＡは、感染の３〜４日後以内に接種の部位から消失する。 （３）本発明の組換え体は、末梢および中枢神経系内への浸透が不可能であり従
って従来技術で提出された生ウイルスに基づくワクチンの主要な障害の一つを実
際的に克服している。 （４）本発明の組換え体を用いる接種は、免疫化したマウス中で、中枢神経系内
への他の病原性ＨＳＶ−１の進入を防止する。 （５）本発明のＨＳＶ−１組換え体は、高度に免疫原性でありそして免疫化した
マウス内で抗ウイルス体液性免疫反応を誘導する能力がある、 （６）本発明の組換え体は、定位注入の結果として非病原性である。 （７）本発明の組換え体は、マウスおよびラット脳内への注入の後、視床下部下
垂体副腎皮質軸（ＨＰＡ）を活性化せず、プロスタグランジンＥ２の産生を増加
せず、注入部位中の視床下部の外側でＩＬ−１遺伝子発現を誘導せず、これらは
病原性ＨＳＶ−１Ｆにより起きる状態とは反対である。 （８）生体外条件下で本発明の組換え体を用いるマウス星状膠細胞の感染は、Ｉ
Ｌ−１遺伝子の発現を誘導せず、これは感染後３時間以内にＩＬ−１遺伝子を誘
導する病原性ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７を用いて感染が起きる状態とは反対である
。 （９）本発明の組換えＨＳＶ−１ Ｒ１５は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコー
ドする活性ＵＬ２３遺伝子を有し、従って、ウイルスは抗ヘルペス薬剤アシクロ
ビルを用いる治療に高度に感受性であり、希望する場合にはその感染を制御され
てもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
配列の起源：ＨＳＶ−１のＳｙｎ１７系統。断片の大きさ６２０ｂｐ。ＰＣ
Ｒ反応は、上記と同様にして行った。 １４．２ ＰＣＲによるＲ１５組換えＤＮＡの同定 プライマーは、ＵＳ領域の右部分中のＲ１５の単一配列に従って合成した。 正方向プライマー ５’ＡＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧ３’（２ １塩基体） 逆方向プライマー ５’ＴＣＡＧＣＡＣＧＡＡＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣ３’（２０ 塩基体） 配列の起源：ＨＳＶ−１のＲ１５系統。断片の大きさは３１９ｂｐである。Ｐ
ＣＲ反応は、同じ条件下で行ったが（１４．１参照）ただし、デオキシリボヌク
レオチドを最終濃度２００μＭで使用した。反応の段階は、融解（９４℃、１分
間）、アニーリング（６５℃、１分間）および伸長（７２℃、１分間）であった
。全体で２５サイクルおよび伸長の最終段階（７２℃、１０分間）であった。
Ｒ反応は、上記と同様にして行った。 １４．２ ＰＣＲによるＲ１５組換えＤＮＡの同定 プライマーは、ＵＳ領域の右部分中のＲ１５の単一配列に従って合成した。 正方向プライマー ５’ＡＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧ３’（２ １塩基体） 逆方向プライマー ５’ＴＣＡＧＣＡＣＧＡＡＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣ３’（２０ 塩基体） 配列の起源：ＨＳＶ−１のＲ１５系統。断片の大きさは３１９ｂｐである。Ｐ
ＣＲ反応は、同じ条件下で行ったが（１４．１参照）ただし、デオキシリボヌク
レオチドを最終濃度２００μＭで使用した。反応の段階は、融解（９４℃、１分
間）、アニーリング（６５℃、１分間）および伸長（７２℃、１分間）であった
。全体で２５サイクルおよび伸長の最終段階（７２℃、１０分間）であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
１５．ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡをラット脳組織および星状膠細胞から、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて精
製し、ＭｕＬＶ ＲＴを用いて逆転写し、次いでＰＣＲを種々の遺伝子特異性プ
ライマーを用いて行った。
製し、ＭｕＬＶ ＲＴを用いて逆転写し、次いでＰＣＲを種々の遺伝子特異性プ
ライマーを用いて行った。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年８月２２日（２００２．８．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
実施例２２ 病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）を用いるチャレンジ後の眼皮膚または肺
経路を通じるＨＳＶ−１Ｒ１５組換え体を用いて免疫化したマウスの生存率 セブラマウスをＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体（１０７ ｐｆｕ／ｍｌのストッ
クからの３０μｌ）を用いて３種の異なる経路：（１）眼の感染（マウス１０匹
）、（２）皮膚中の皮下感染（マウス１０匹）、および（３）軽く麻酔したマウ
ス１０匹の肺への感染により免疫化した。
経路を通じるＨＳＶ−１Ｒ１５組換え体を用いて免疫化したマウスの生存率 セブラマウスをＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え体（１０７ ｐｆｕ／ｍｌのストッ
クからの３０μｌ）を用いて３種の異なる経路：（１）眼の感染（マウス１０匹
）、（２）皮膚中の皮下感染（マウス１０匹）、および（３）軽く麻酔したマウ
ス１０匹の肺への感染により免疫化した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
２週間後にマウスのすべての３群を病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）（１０７ ｐｆｕ
／ｍｌのストックからの３０μｌ）を用いて鼻経路で感染させた。動物を３週間
追跡しそして免疫化したマウスおよび対照マウス（免疫化したマウスと同様に感
染の同じ経路により非感染細胞ホモジネート３０μｌを注入）の生存率を記録し
、結果を図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃに示す。 結果 ２２．１ 眼経路によるサブラマウスの免疫化 図１７Ａは、Ｒ１５免疫化マウスの９０％がＨＳＶ−１（Ｆ）を用いたチャレ
ンジを生き残ったことを明らかにした。対照マウスの約５０％がチャレンジウイ
ルスを生き残った。これは、２群の追加の対照マウス群内で生存率が３０％（図
１７Ｂ参照）および２０％（図１７Ｃ参照）であったので、チャレンジウイルス
ＨＳＶ−１（Ｆ）がマウスの半分を感染しなかったことを示すと考えられる。 ２２．２ 皮下経路によるサブラマウスの免疫化 図１７Ｂは、マウス皮膚へのＲ１５皮下注入が、病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）を用
いるチャレンジからマウスを完全（１００％）に保護することを示す。対照群中
で、マウスの３０％のみが生き残った。 ２２．３ 肺経路によるマウスの免疫化 図１７Ｃは、麻酔したマウス中へのＲ１５の吸入がＨＳＶ−１（Ｆ）を用いる
鼻内チャレンジからマウスを完全に保護することを明らかにした。対照群は感染
に負けそしてマウスの２０％のみが生き残った。 結論 眼、皮膚および肺経路により免疫化された場合に、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え
体が、ＨＳＶ−１ Ｆを用いるチャレンジに対してマウスを保護すると結論され
る。
／ｍｌのストックからの３０μｌ）を用いて鼻経路で感染させた。動物を３週間
追跡しそして免疫化したマウスおよび対照マウス（免疫化したマウスと同様に感
染の同じ経路により非感染細胞ホモジネート３０μｌを注入）の生存率を記録し
、結果を図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃに示す。 結果 ２２．１ 眼経路によるサブラマウスの免疫化 図１７Ａは、Ｒ１５免疫化マウスの９０％がＨＳＶ−１（Ｆ）を用いたチャレ
ンジを生き残ったことを明らかにした。対照マウスの約５０％がチャレンジウイ
ルスを生き残った。これは、２群の追加の対照マウス群内で生存率が３０％（図
１７Ｂ参照）および２０％（図１７Ｃ参照）であったので、チャレンジウイルス
ＨＳＶ−１（Ｆ）がマウスの半分を感染しなかったことを示すと考えられる。 ２２．２ 皮下経路によるサブラマウスの免疫化 図１７Ｂは、マウス皮膚へのＲ１５皮下注入が、病原性ＨＳＶ−１（Ｆ）を用
いるチャレンジからマウスを完全（１００％）に保護することを示す。対照群中
で、マウスの３０％のみが生き残った。 ２２．３ 肺経路によるマウスの免疫化 図１７Ｃは、麻酔したマウス中へのＲ１５の吸入がＨＳＶ−１（Ｆ）を用いる
鼻内チャレンジからマウスを完全に保護することを明らかにした。対照群は感染
に負けそしてマウスの２０％のみが生き残った。 結論 眼、皮膚および肺経路により免疫化された場合に、ＨＳＶ−１ Ｒ１５組換え
体が、ＨＳＶ−１ Ｆを用いるチャレンジに対してマウスを保護すると結論され
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 7/00
//(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:93
Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(71)出願人 ハダジツト・メデイカル・リサーチ・サー
ビシズ・アンド・デベロツプメント・カン
パニー・リミテツド
イスラエル・エルサレム91120・キルヤト
ハダサー・ピーオーボツクス12000
(72)発明者 ベツカー，イエシール
イスラエル・94445エルサレム・シユマリ
アフレバインストリート45
(72)発明者 アシエル，ヤエル
イスラエル・90805メバセレトジオン・ハ
ザミルストリート20／３
(72)発明者 ブジヤノバー，セルゲイ
イスラエル・93826エルサレム・ベン−エ
リーザーアリーストリート90／34
(72)発明者 ベン−フル，タミル
イスラエル・96920エルサレム・モシエシ
ヤレツトブールバード９／39
(72)発明者 ダライ，ゴラムレツア
ドイツ・デー−69117ハイデルベルク・イ
ンステイテユトフアメデイツイニシエフイ
ロロギー・ルプレヒトカールスウニベルシ
テートハイデルベルク
(72)発明者 ケーム，ローラント
ドイツ・デー−69117ハイデルベルク・イ
ンステイテユトフアメデイツイニシエフイ
ロロギー・ルプレヒトカールスウニベルシ
テートハイデルベルク
(72)発明者 モヤル，ミカル
イスラエル・96920エルサレム・ペレツベ
ルンスタインストリート９／５
(72)発明者 ローゼン−ボルフ，アンジエラ
ドイツ・01326ドレスデン・ジールクスス
トラベ17
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 DA02 DA03 EA02
EA04 HA08 HA17
4B065 AA95X AA95Y AB01 BA02
CA24 CA44 CA45
4C085 AA03 BA78 CC08 DD62 EE01
4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12
CA16 NA14 ZB26 ZB33
Claims (24)
- 【請求項１】 ゲノムが下記の変化： 非−機能性ｇＥタンパク質の発現またはｇＥタンパク質の非発現のいずれかをも
たらす単一小型（ＵＳ）８遺伝子領域内の欠失または変異、および 非−機能性ＩＣＰ４７タンパク質の発現またはＩＣＰ４７タンパク質の非発現の
いずれかをもたらすＵＳ１２遺伝子（ＩＥ−５）領域内の欠失または変異 を有するＨＳＶ−１のゲノムの変異体を含んでなる、組換え単純ヘルペスウイル
ス。 - 【請求項２】 ＵＳ９、ＵＳ１０またはＵＳ１１の少なくとも１種に変異ま
たは欠失をさらに含んでなり、該変異または欠失はそれぞれの遺伝子の非−機能
性発現産物の産生または産物の非発現のいずれかをもたらす、請求項１記載の組
換えウイルス。 - 【請求項３】 ＵＳ９、ＵＳ１０およびＵＳ１１中に変異または欠失を含ん
でなる、請求項２記載の組換えウイルス。 - 【請求項４】 ＵＳ９、ＵＳ１０およびＵＳ１１の全配列の欠失を含んでな
る、請求項３記載の組換えウイルス。 - 【請求項５】 ＵＳ１２の全配列の欠失を含んでなる、請求項１記載の組換
えウイルス。 - 【請求項６】 ＵＳ８領域が逆スプライシングおよび組換えにより変異され
、ＨＳＶ−１ Ｓｙｎ１７のｇＥタンパク質のＮ’−末端アミノ酸と一致する非
−機能性発現産物である該領域の発現産物をもたらす、請求項１記載の組換えウ
イルス。 - 【請求項７】 ＵＳ１またはＵＳ２の少なくとも１種の配列の重複を含んで
なる、上記請求項のいずれか１項記載の組換えウイルス。 - 【請求項８】 ＵＳ１およびＵＳ２遺伝子の両方の重複を含んでなる、請求
項７記載の組換えウイルス。 - 【請求項９】 ＵＳ１およびＵＳ２がＴＲＳおよびＴＲ５領域内の両方に現
れる、請求項８記載の組換えウイルス。 - 【請求項１０】 タンパク質：ＩＣＰ２７またはＩＣＰ３４．５の少なくと
も１種の非−機能性を有するかまたは非−発現を特徴とする、上記請求項のいず
れか１項記載の組換えウイルス。 - 【請求項１１】 ＩＣＰ２７およびＩＣＰ３４．５の本質的な非発現を特徴
とする、請求項１０記載の組換えウイルス。 - 【請求項１２】 生理学的に活性のチロシンキナーゼ（ＴＫ）をコードする
ＵＬ２３を有する、上記請求項のいずれか１項記載の組換えウイルス。 - 【請求項１３】 図１０に記載と同様の、請求項１から１２までに記載の組
換えウイルス。 - 【請求項１４】 さらに非相同配列を含んでなる、請求項１から１３までに
記載の組換えウイルス。 - 【請求項１５】 非相同配列が、遺伝子ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１または
ＵＳ１２の位置内に挿入される、請求項１４記載の組換えウイルス。 - 【請求項１６】 非相同配列が、 （ａ）ヒトヘルペスウイルス２からの免疫原性タンパク質をコードする配列、 （ｂ）ヒトヘルペスウイルス３からの免疫原性タンパク質をコードする配列、 （ｃ）ヒトヘルペスウイルス４からの免疫原性タンパク質をコードする配列、 （ｄ）ヒトヘルペスウイルス５からの免疫原性タンパク質をコードする配列、 （ｅ）ヒトヘルペスウイルス６からの免疫原性タンパク質をコードする配列、 （ｆ）ヒトヘルペスウイルス７からの免疫原性タンパク質をコードする配列、お
よび （ｇ）ヒトヘルペスウイルス８からの免疫原性タンパク質をコードする配列 からなる群から選択される、請求項１４記載の組換えウイルス。 - 【請求項１７】 非相同配列として細胞毒性遺伝子を含んでなる、請求項１
４記載の組換えウイルス。 - 【請求項１８】 非相同配列としてアポトーシス遺伝子を含んでなる、請求
項１４記載の組換えウイルス。 - 【請求項１９】 活性成分として、請求項１から１３までのいずれか１項記
載の組換えウイルスを、場合により免疫学的に許容できるキャリヤーと一緒に含
んでなる、抗ＨＳＶ−１ワクチン。 - 【請求項２０】 さらに請求項１４から１８までに記載の組換えウイルスを
含んでなる、請求項１９記載の抗ＨＳＶ−１ワクチン。 - 【請求項２１】 さらに請求項１６記載の組換えウイルスを含んでなる、請
求項２０記載の抗ＨＳＶ−１ワクチン。 - 【請求項２２】 活性成分として、請求項１６記載の組換えウイルスを含ん
でなる、抗ウヘルペスワクチン。 - 【請求項２３】 活性成分として、請求項１４、１７または１８記載の組換
えウイルスを含んでなる、遺伝子治療の薬剤組成物。 - 【請求項２４】 活性成分として、請求項１から１４まで、１６または１７
の組換えウイルスのいずれか１種を含んでなる、星状膠細胞腫、脳腫瘍および／
またはその他の臓器内の充実性腫瘍の治療のための薬剤組成物。
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|---|---|---|---|
| IL131212 | 1999-08-03 | ||
| IL13121299A IL131212A0 (en) | 1999-08-03 | 1999-08-03 | Recombinant virus and live-virus vaccines |
| PCT/IL2000/000469 WO2001009361A1 (en) | 1999-08-03 | 2000-08-03 | Recombinant hsv-1 and live viral vaccines |
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|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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