CN104357451B

CN104357451B - 针对dd3基因的小干扰rna及其表达载体构建与应用

Info

Publication number: CN104357451B
Application number: CN201410719747.2A
Authority: CN
Inventors: 何金花
Original assignee: Guangzhou Panyu Central Hospital
Current assignee: Guangzhou Panyu Central Hospital
Priority date: 2014-12-02
Filing date: 2014-12-02
Publication date: 2016-09-21
Anticipated expiration: 2034-12-02
Also published as: CN104357451A

Abstract

本发明公开一种针对DD3基因的小干扰RNA及其表达载体构建与应用。其正义链序列为SEQ ID NO.1；反义链序列为SEQ ID NO.2；并成功构建了pGLV3/H1/GFP+Puro Vector‑DD3‑siRNA真核表达载体。本发明将成功构建的真核表达载体感染LNCaP细胞及RWPE‑1细胞，结果显示，DD3基因被干扰后能明显降低LNCaP细胞增殖速率，而对RWPE‑1细胞无明显影响；将成功构建的真核表达载体注射到前列腺癌动物实体瘤中，结果显示，DD3基因被干扰后能有效抑制LNCaP细胞实体瘤的增殖。因此，通过siRNA干扰DD3基因在前列腺癌细胞中的表达，从而抑制了癌细胞的增殖。

Description

针对DD3基因的小干扰RNA及其表达载体构建与应用

技术领域

本发明涉及小干扰RNA技术，特别涉及一种针对DD3基因的小干扰RNA及其表达载体构建与应用。具体地说，涉及一种抗前列腺癌的小干扰RNADD3基因序列及重组慢病毒表达载体，提供了一种重组慢病毒表达载体介导的抗前列腺癌DD3小干扰RNA基因，具有靶向性抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及动物瘤体的生长，从而达到抑制前列腺癌的发展与转移的作用。

背景技术

前列腺癌(carcinoma of prostate)已成为美国男性最常见的肿瘤。在美国男性肿瘤中的致死率中排第二位，仅次于肺癌。在欧盟排第三，次于肺癌和大肠癌。在我国，随着社会人口的老龄化出现，前列腺癌的发病率也逐年增高。因此，对前列腺癌分子发病机制及前列腺癌诊治新技术、新疗法的研究尤为重要和迫切。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)，是指那些由DNA转录却并不翻译成蛋白的RNA，近来还有研究发现，在一些肿瘤组织中，LncRNA有着过表达或者低表达的现象。提示在肿瘤的发生发展过程中，它们可能发挥着重要的作用。细胞增殖、分化以及凋亡的异常导致肿瘤的发生，而LncRNA作为一个重要调控单位，参与调控相关基因的表达，它们的异常表达有可能引起这些现象的发生。

DD3(differential display code 3)是一种长链非编码RNA(>NR_015342.1)，又称为前列腺癌基因3(prostate cancer gene 3，PCA3)，是近年来发现的前列腺癌高度特异性基因，是一个临床潜力很高的前列腺癌标志物。DD3基因仅在前列腺上皮细胞中表达，具有较高的肿瘤特异性。DD3基因定位于9q21–22染色体上，含有4个外显子和3个内含子。目前国外更多研究表明DD3基因的特异性区域位于外显子4中。前列腺癌患者外周血中的DD3基因表达水平较正常对照组升高约34倍。前列腺腺上皮细胞产生的分泌物、脱落的前列腺腺上皮细胞经过导管排泄到尿道，前列腺癌细胞同样可以排到尿道内并且可以检测出来，前列腺按摩后尿液标本可以检测到DD3的高表达。而尿液沉淀物能够包含所有细胞和细胞碎片，更能准确检测DD3的表达。DD3可作为一种潜在的前列腺癌标志物应用到诊断中，甚至在不久的将来有可能会应用到前列腺癌的治疗中。

小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)是生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞内存在与内源性mRNA编码区内同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。由于siRNA能抑制特定基因的表达，应用siRNA进行基因治疗有非常广阔的临床应用前景。目前，各大生物技术公司都在积极开发这类药物，并即将进入临床试验阶段。原癌基因是细胞基因组中的正常组成成分，当受到多种因素的作用使其发生变异时，激活成为癌基因，癌基因与细胞异常增殖及癌的发生有关。可以应用siRNA技术来抑制癌基因的mRNA，从而抑制肿瘤生长，同时，还可通过siRNA技术促进癌细胞凋亡、调控细胞周期以及抑制血管生成等方面来治疗癌症。尽管RNAi技术作为肿瘤基因治疗的新型工具仍然存在着许多急待解决的问题，如怎样提高肿瘤细胞的靶向性等等。但随着科学工作者对RNAi研究的不断深入，siRNA技术将会成为一种非常有前景的肿瘤治疗手段。

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

因此，如果能利用RNAi技术，涉及特异性针对DD3基因的siRNA，彻底研究清楚DD3和前列腺癌转移的组织间的关系，将会为前列腺癌癌相关的癌症的治疗提供一种有益的途径。因此，本发明的技术目的在于利用RNAi技术研究清楚DD3与前列腺癌的关系。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种针对DD3基因的siRNA。本发明通过大量筛选和实验工作得到针对DD3基因的siRNA。

本发明的另一目的在于提供所述的针对DD3基因的siRNA的编码基因。

本发明的另一目的在于提供一种载有针对DD3基因的siRNA重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供所述的siRNA及载有针对DD3基因的siRNA重组表达载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种针对DD3基因的siRNA(本发明的名称为DD3-siRNA)，所述的siRNA的正义链序列为：5'-GCUCAGGUGCUUUCACUAAUG-3'(SEQ IDNO.1)；反义链序列为：5'-CAUUAGUGAAAGCACCUGAGC-3'(SEQ ID NO.2)；

本发明提供上述的针对DD3基因的siRNA的编码基因，其核苷酸序列分别为：5'-GCTCAGGTGCTTTCACTAATG-3'(SEQ ID NO.3)，或5'-CATTAGTGAAAGCACCTGAGC-3'(SEQ IDNO.4)；

上述siRNA经Blast Search检索确认与DD3以外的人类已知基因序列无同源性；

siRNA是一种段片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA；

上述siRNA干扰的靶序列位于DD3基因的mRNA编码序列的第2368到2388个碱基之间，即5'-GCUCAGGUGCUUUCACUAAUG-3'；

进一步，本发明提供上述siRNA的siRNA重组表达载体；优选地，所述表达载体为原核表达载体或真核表达载体，更优选地，所述表达载体为真核表达载体，最优选地，所述真核表达载体为重组慢病毒表达载体；

上述siRNA的siRNA重组表达载体；所述表达载体为pGLV3/H1/GFP+Puro Vector，购自上海吉玛制药技术有限公司；构建得到的慢病毒表达载体为pGLV3/H1/GFP+PuroVector-DD3-siRNA；

本发明提供上述siRNA及siRNA重组表达载体在抑制DD3基因表达中的应用。

本发明提供上述siRNA及siRNA重组表达载体在制备治疗前列腺癌药物中的应用。

将上述siRNA重组表达载体转染宿主细胞，优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，更优选地，所述宿主细胞为真核细胞，更优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，最优选地，所述宿主细胞为前列腺癌细胞LNCaP或RWPE-1细胞(人正常前列腺上皮细胞RWPE-1)。

换言之，在本发明中，分别针对在前列腺癌高转录的DD3基因的靶位点，委托上海吉玛制药技术有限公司化学合成一段siRNA序列，并构建其慢病毒表达载体。本发明的研究发现，通过感染这种siRNA片段，可以敲除DD3mRNA在前列腺癌细胞系中的内源性RNA高表达，从而抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭。因此，本发明首次证实DD3mRNA表达的敲除与前列腺癌细胞增殖、侵袭以存在直接对应的关系，DD3基因完全可以作为前列腺癌的治疗靶点，本发明的siRNA也有望作为一种生物治疗技术应用到前列腺癌的治疗中。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明使用RNA干扰技术，成功获得针对DD3基因的siRNA，所述siRNA与载体pGLV3/H1/GFP+Puro Vector连接，与包装质粒、包膜质粒共感染LNCaP细胞能有效地干扰DD3基因的表达，通过RT-PCR检测，在稳定干扰DD3的细胞系中，DD3基因的干扰效率达到(80.25士0.96)％。

(2)本发明将成功构建的针对DD3-siRNA慢病毒表达载体感染前列腺癌LNCaP细胞及正常前列腺上皮细胞RWPE-1，结果显示，DD3基因被干扰后能明显降低LNCaP细胞增殖速率，而对前列腺上皮细胞RWPE-1无明显影响。

(3)本发明将成功构建的针对DD3-siRNA慢病毒表达载体注射到前列腺癌动物实体瘤中，结果显示，DD3基因被干扰后能有效抑制LNCaP细胞实体瘤的增殖。

(4)本发明明确了DD3基因是一种癌基因，并且通过siRNA干扰DD3基因在前列腺癌细胞中的表达，从而抑制了癌细胞的增殖。

附图说明

图1是RT-PCR检测前列腺癌细胞LNCaP，PC-3M，DU145，人正常前列腺上皮细胞RWPE-1共4株细胞系中DD3mRNA的表达水平的结果图。

图2是重组DD3-siRNA慢病毒表达载体的构建的结果图；其中，图2A是经测序获得正确的DD3-siRNA的编码序列；图2B是慢病毒滴度测定图；图2B中10^-1、10^-2、10^-3、10^-4分别代表慢病毒滴度稀释倍数。

图3是转染DD3-siRNA后，LNCaP细胞内DD3mRNA的相对表达水平的结果图。

图4是转染DD3-siRNA后细胞的增殖抑制率的结果图；其中。图4A是DD3-siRNA对细胞株LNCaP细胞增殖的影响的结果图；图4B是DD3-siRNA对细胞株RWPE-1细胞增殖的影响的结果图。

图5是转染DD3-siRNA后细胞侵袭迁移实验结果图；其中，图5A是DD3-siRNA对LNCaP细胞迁移实验照片及柱状图；图5B是DD3-siRNA对LNCaP细胞侵袭实验照片及柱状图；图5C是DD3-siRNA对RWPE-1细胞迁移实验照片及柱状图；图5D是DD3-siRNA对RWPE-1细胞侵袭实验照片及柱状图。

图6是转染DD3-siRNA后对动物实体瘤生长的影响的结果图；其中，图6A是动物瘤体生长曲线图；图6B是动物瘤体拍照图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1DD3mRNA高表达细胞系的筛选

RT-PCR及所采用的引物如下：

DD3上游引物F：5'-CAACAGCAGGACCCAACGCA-3'；

DD3下游引物R：5'-AGCAACAGAGCAGAGAGAG-3'；

产物大小：200bp；

18S上游引物F：5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'；

18S下游引物R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；

产物大小：275bp；

RT(逆转录)的条件：各取5μg细胞总RNA用First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR Kit(Invitrogen公司产品)完成cDNA第一链合成。

PCR条件：取5μL逆转录合成的cDNA第一链作为模板，20μL PCR反应体系：模板5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10μL、ddH₂O 4.0μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸32s，循环数40cycles；72℃延伸10min。运用ABI7500Sequence Detection System进行检测。

利用qRT-PCR(实时荧光定量RT-PCR)的方法，检测DD3mRNA高表达细胞系。在LNCaP，PC-3M(人前列腺癌细胞系PC-3M)，DU145(前列腺癌细胞DU145)三种肿瘤细胞系及人正常前列腺上皮细胞RWPE-1中，上述细胞均为商业化的细胞系，LNCaP细胞系DD3的mRNA表达量较其它细胞系高(见图1)。故选择其作为干扰RNA的研究对象。

实施例2重组DD3-siRNA慢病毒表达载体的构建

分别针对该DD3基因的靶位点，委托上海吉玛制药技术有限公司化学合成所述针对DD3基因的siRNA的编码基因，其核苷酸序列如下：

5'-GCTCAGGTGCTTTCACTAATG-3'(SEQ ID NO.3)；

根据shRNA设计原则，将上述siRNA设计成发夹shRNA插入片段以使其插入载体中从而稳定表达siRNA，编码发夹shRNA的shDNA的核苷酸序列如下：

shRNA的正义链：5'-GATCCGCTCAGGTGCTTTCACTAATGTTCAAGAGACATTAGTGAAAGCACCTGAGCTTTTTTG-3'；(SEQ ID NO.9)

shRNA的反义链：5'-AATTCAAAAAAGCTCAGGTGCTTTCACTAATGTCTCTTGAACATTAGTGAAAGCACCTGAGCG-3'；(SEQ ID NO.10)

上述发夹shRNA插入片段包含有21个碱基对的siRNA作用片段；shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号；shRNA的转录终止序列采用T6结构(序列为TTTTTTG)。正义链模板的5'端添加了GATCC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5'端添加了AATTC，与EcoRI酶切后形成的粘端互补，3'端引入接头序列G。

并将上述发夹shRNA定向连接至用BamHI和EcoRI双酶切后的pGLV3/H1/GFP+PuroVector载体质粒上，克隆至DH5α感受态细胞转化，将重组质粒、包装质粒、包膜质粒共转染293T细胞(293T细胞是表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系)72小时后，收集病毒并测定病毒的滴度。

成功构建DD3-siRNA的慢病毒表达载体pGLV3/H1/GFP+Puro Vector-DD3-siRNA。经测序获得正确的DD3-siRNA的编码序列(见图2A)，收集病毒，测到病毒滴度为1×10⁹TU/mL(见图2B)。

实施例3感染DD3-siRNA后，细胞株内DD3的mRNA表达水平。

RT-PCR反应以及引物同实施例1。

NC(negative control，购自上海吉玛制药技术有限公司，为通用阴性对照，货号为A08DZ)。在本实验中，该序列的转染不会敲降DD3以及任何其他的基因，从而起到阴性对照的作用。DD3-siRNA感染细胞后，DD3mRNA的表达量为8.23％士0.21％，表明这种siRNA片段都能够有效的降低DD3mRNA表达水平(见图3)。

实施例4DD3-siRNA对细胞株增殖的影响

将LNCaP细胞以每孔1×10⁴个细胞接种96孔板，分别感染DD3-siRNA、NC及设立空白对照组(control)，然后继续培养约24小时、48小时、72小时，每孔加50μL 1×MTT溶液，置入孵箱孵育4h，使MTT还原为甲臢。吸出上清液，每孔加150μL DMSO(二甲基亚砜)，使甲臢溶解，用平板摇床摇匀。用酶标仪在490nm处测每孔的光密度，进而计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率(％)＝[(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值]×100％。

DD3-siRNA感染细胞(24、48、72小时)后，能有效抑制LNCaP细胞增殖，其增殖抑制率分别为(12士3.6％、35士2.1％、59士6.3％)(见图4A)。而对人正常前列腺上皮细胞RWPE-1作用不明显(见图4B)。

实施例5DD3-siRNA对细胞株侵袭、迁移的影响

用预冷的DMEM/F12(Gibco公司)以1:3的体积比稀释Matrigel，取40μL加入预冷的Transwell小室中，37℃孵育2h使Matrigel凝固。吸走小室中多余的液体，并在上室、下室分别加入100μL、600μL DMEM/F12，37℃平衡过夜。细胞转染第二天，计数1×10⁵个细胞，用100μL DMEM/F12培养基重悬，加入Transwell小室上室，在下室加入600μL完全培养基。在37℃，5％(v/v)CO₂孵育48小时后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，倒置显微镜下观察小室中细胞并拍照。

Transwell检测表明降低表达DD3-siRNA后细胞株侵袭、迁移能力明显低于转染阴性对照组RNA的细胞株(分别见图5A、图5B)，说明降低DD3-siRNA可抑制肿瘤细胞的恶性度以及肿瘤细胞的转移能力。而DD3-siRNA对人正常前列腺上皮细胞RWPE-1作用不明显(分别见图5C、图5D)。

实施例6DD3-siRNA对动物实体瘤生长的影响

雄激素BALB/c裸小鼠(购自广东省实验动物中心)15只，体重量18～20g，对数生长期LNCaP细胞，胰酶消化，洗涤，台盼蓝染色计数，调整浓度为1×10⁷个/mL，每次取0.1mL，与基质Matrigel混合后，分别皮下注射到6～8周雄性裸鼠的肋腹部，待瘤体生长到约120mm³，裸小鼠随机分成空白对照组(PBS，100μL)，DD3-siRNA(500nM)组、NC组(16μg)，分别皮下注射，观察瘤体生成情况，并记录生长曲线。

给祼鼠分别注射不同剂量的PBS、DD3-siRNA、NC后，记录瘤体生长曲线，继续饲养至18天，无一祼鼠死亡，断头处死，取出瘤体，并计算瘤体平均体积。空白对照组瘤体平均体积2300.46士163mm³、NC组瘤体平均体积1003.60士135mm³、DD3-siRNA组瘤体平均体积509.74士56mm³，说明降低表达DD3mRNA后可抑制实体瘤的生长(图6A、B)。

所述的PBS(磷酸盐缓冲液)是10mM、pH 7.2～7.4的PBS。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种针对DD3基因的siRNA，其特征在于：所述的siRNA的正义链序列为SEQ ID NO.1；反义链序列为SEQ ID NO.2；

所述的siRNA干扰的靶序列位于DD3基因的mRNA编码序列的第2368到2388个碱基之间。

2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述的针对DD3基因的s iRNA的编码基因，其核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。

3.一种含有权利要求1或2所述的siRNA的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述的表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述的表达载体为真核表达载体。

6.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体为pGLV3/H1/GFP+Puro Vector-DD3-siRNA。

7.权利要求1或2所述的siRNA在制备治疗前列腺癌药物中的应用。

8.权利要求3～6任一项所述的重组表达载体在制备治疗前列腺癌药物中的应用。