NO20023402L

NO20023402L - Blandinger og fremgangsmåter for behandling og diagnose av prostatakreft

Info

Publication number: NO20023402L
Application number: NO20023402A
Authority: NO
Inventors: Jiangchun Xu; Davin C Dillon; Jennifer Lynn Mitcham; Susan L Harlocker; Yuqiu Jiang; Steven G Reed; Michael D Kalos; Gary Richard Fanger; Craig H Day; Marc W Retter; John A Stolk; Yasir A W Skeiky; Aijun Wang; Madeleine Joy Meagher
Original assignee: Corixa Corp
Priority date: 2000-01-14
Filing date: 2002-07-15
Publication date: 2002-08-29
Also published as: BR0107643A; PL356908A1; KR20030016217A; HUP0203968A3; AU3447401A; HUP0203968A2; CZ20022756A3; RU2002121771A; JP2003528591A; WO2001051633A2; CA2397741A1; CN1436234A; WO2001051633A9; IL150732A0; ZA200206400B; EP1261708A2; NO20023402D0; WO2001051633A3; MXPA02006934A

Description

TEKNISK OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse angår generelt terapi og diagnose av kreft, så som prostatakreft. Oppfinnelsen er mer spesifikt relatert til polypeptider, omfattende minst en del av et prostata-spesifikt protein og til polynukleotider som koder for slike polypeptider. Slike polypeptider og polynukleotider er anvendelige i farmasøytiske preparater, f. eks. vaksiner og andre preparater for diagnose og behandling av prostatakreft.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Kreft er et betydelig helseproblem over hele verden. Selv om kreft er et betydelig helseproblem over hele verden. Selv om fremskritt er gjort når det gjelder deteksjon og terapi av kreft, er ingen vaksine eller annen universelt vellykket metode for forebygging eller behandling for tiden tilgjengelig. Aktuelle terapier, som generelt er basert på en kombinasjon av kjemoterapi eller kirurgi og stråling, fortsetter å vise seg utilstrekkelige for mange pasienter.

Prostatakreft er den mest vanlige form for kreft blant menn, med en beregnet forekomst på 30% hos menn over 50 år. Overveldende kliniske bevis viser at human prostatakreft har tilbøyelighet til å metastasere til ben, og sykdommen synes uunngåelig å utvikle seg fra androgen-avhengig til androgen-motstandsdyktig status, hvilket fører til øket pasientdødelighet. Denne utbredte sykdommen er for tiden den andre ledende årsak til kreftdød blant menn i U.S.A.

Til tross for betraktelig forskning på terapier for sykdommen, er prostatakreft fortsatt vanskelig å behandle. Vanligvis er behandling basert på kirurgi og/eller strålingsterapi, men disse metoder er ineffektive for en betydelig prosentdel av tilfellene. To tidligere identifiserte prostata-spesifikke proteiner - prostata-spesifikt antigen (PSA) og prostatisk syrefosfatase (PAP) - har begrenset terapeutisk og diagnostisk potensiale. For eksempel korrelerer PSA-nivåer ikke alltid godt med tilstedeværelse av prostatakreft, idet de er positive i en prosentdel av ikke-prostatakreft-tilfeller, omfattende godartet prostatisk hyperplasi (BPH). Videre korrelerer PSA-målinger med prostata- volum og indikerer ikke nivået av metastase.

Til tross for betraktelig forskning på terapier for disse og andre kreftformer, er prostatakreft fortsatt vanskelig å diagnostisere og behandle effektivt. Følgelig er det et behov på området for forbedrede metoder for å detektere og behandle slik kreft. Foreliggende oppfinnelse oppfyller disse behov og tilveiebringer videre andre relaterte fordeler.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I ett aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polynukleotid-preparater omfattende en sekvens valgt fra gruppen bestående av: (a) sekvenser gitt i SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788; (b) komplementer av sekvensene gitt i SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788; (c) sekvenser bestående av minst 20 påfølgende rester av en sekvens gitt i SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788; (d) sekvenser som hybridiserer til en sekvens gitt i SEKV ID NR: 1-111,115-171,173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788, under moderat stringente betingelser; (e) sekvenser som har minst 75% identitet med en sekvens fra SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788; (f) sekvenser som har minst 90% identitet til en sekvens fra SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326,328,330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788; og (g) degenererte varianter av en sekvens gitt i SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788.

I én foretrukket utførelsesform er polynukleotid-preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse uttrykt i minst ca. 20%, mer foretrukket i minst ca. 30% og mest foretrukket i minst ca. 50% av prostatavev-prøver testet, i et nivå som er minst ca. 2 ganger, fortrinnsvis minst ca. 5 ganger og mest foretrukket minst ca. 10 ganger høyere enn det for annet normalt vev.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i et annet aspekt, polypeptidpreparater omfattende en aminosyresekvens som er kodet for av en polynukleotidsekvens beskrevet ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre polypeptidpreparater omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av sekvenser angitt i SEKV ID NR: 112-114, 172, 176, 178,327, 329, 331,336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 og 789-791.

I visse foretrukne utførelsesformer er polypeptidene og/eller polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse immunogene, dvs. de kan fremkalle en immunrespons, spesielt en humoral og/eller cellulær immunrespons, som ytterligere beskrevet her.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre fragmenter, varianter og/eller derivater av de beskrevne polypeptid- og/eller polynukleotid-sekvenser, hvor fragmenteter, varianter og/eller derivater fortrinnsvis har et nivå av immunogen aktivitet på minst ca. 50%, fortrinnsvis minst ca. 70% og mer foretrukket minst ca. 90% av nivået av immunogen aktivitet til en polypeptidsekvens angitt i SEKV ID NR: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 eller 789-791 eller en polypeptidsekvens kodet for av en polynukleotidsekvens angitt i SEKV ID NR: 1-111,115-171,173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre polynukleotider som koder for et polypeptid beskrevet ovenfor, ekspresjonsvektorer omfattende slike polynukleotider og vertsceller transformert eller transfektert med slike ekspresjonsvektorer.

Innen andre aspekter tilveiebringer foreliggende oppfinnelse farmasøytiske preparater omfattende et polypeptid eller polynukleotid som beskrevet ovenfor og en fysiologisk akseptabel bærer.

I et beslektet aspekt ved foreliggende oppfinnelse er farmasøytiske preparater, f. eks. vaksinepreparater, tilveiebragt for profylaktiske eller terapeutiske anvendelser. Slike preparater omfatter generelt et immunogent polypeptid eller polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse og en immunostimulant, så som et adjuvans, sammen med en fysiologisk akseptabel bærer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre farmasøytiske preparater som omfatter: (a) et antistoff eller antigen-bindende fragment derav som spesifikt binder til et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse eller et fragment derav; og (b) en fysiologisk akseptabel bærer.

I ytterligere aspekter tilveiebringer foreliggende oppfinnelse farmasøytiske preparater omfattende: (a) en antigenpresenterende celle som uttrykker et polypeptid som beskrevet ovenfor og (b) en farmasøytisk akseptabel bærer eller adjuvans. Illustrative antigenpresenterende celler omfatter dendrittiske celler, makrofager, monocytter, fibroblaster og B-celler.

I beslektede aspekter er farmasøytiske preparater tilveiebragt som omfatter: (a) en antigenpresenterende celle som uttrykker et polypeptid som beskrevet ovenfor og (b) en immunostimulant.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre, i andre aspekter, fusjonsproteiner som omfatter minst ett polypeptid som beskrevet ovenfor, så vel som polynukleotider som koder for slike fusjonsproteiner, typisk i form av farmasøytiske preparater, f. eks. vaksinepreparater, omfattende en fysiologisk akseptabel bærer og/eller en immunostimulant. Fusjonensproteinene kan omfatte multiple immunogene polypeptider eller deler/varianter derav, som beskrevet her og kan videre omfatte ett eller flere polypeptidsegmenter for å lette og/eller forbedre ekspresjon, rensning og/eller immunogenisitet av polypeptidet (polypeptidene).

I ytterligere aspekter tilveiebringer foreliggende oppfinnelse metoder for å stimulere en immunrespons hos en pasient, fortrinnsvis en T-celle-respons hos en human pasient, omfattende administrering av et farmasøytisk preparat beskrevet her. Pasienten kan være rammet av prostatakreft, i hvilket tilfelle metodene gir behandling for sykdommen, eller en pasient som er betraktet å ha risiko for en slik sykdom, kan behandles profylaktisk.

I ytterligere aspekter tilveiebringer foreliggende oppfinnelse metoder for å hemme utviklingen av kreft hos en pasient, omfattende administrering til en pasient av et farmasøytisk preparat som angitt ovenfor. Pasienten kan være rammet av prostatakreft, i hvilket tilfelle metodene gir behandling for sykdommen, eller en pasient betraktet å ha risiko for en slik sykdom kan behandles profylaktisk.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre, i andre aspekter, metoder for fjerning av tumorceller fra en biologisk prøve, omfattende å bringe en

biologisk prøve i kontakt med T-celler som spesifikt reagerer med et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor kontakttrinnet blir utført under betingelser og i en tid tilstrekkelig til å tillate fjerning av celler som uttrykker polypeptidet fra prøven.

I beslektede aspekter er det gitt metoder for å hemme utvikling av kreft hos en pasient, omfattende administrering til en pasient av en biologisk prøve behandlet som beskrevet ovenfor.

Metoder er videre tilveiebragt, i andre aspekter, for å stimulere og/eller ekspandere T-celler spesifikke for et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, som omfatter å bringe T-celler i kontakt med én eller flere av: (i) et polypeptid som beskrevet ovenfor; (ii) et polynukleotid som koder for et slikt polypeptid; og (iii) en antigenpresenterende celle som uttrykker et slikt polypeptid; under betingelser og i en tid tilstrekkelig til å tillate stimulering og/eller ekspansjon av T-celler. Isolerte T-celle-populasjoner omfattende T-celler fremstilt som beskrevet ovenfor er også gitt.

I ytterligere aspekter tilveiebringer foreliggende oppfinnelse metoder for å hemme utvikling av kreft hos en pasient, omfattende administrering til en pasient av en effektiv mengde av en T-celle-populasjon som beskrevet ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre metoder for å hemme utvikling av kreft hos en pasient, omfattende trinnene: (a) inkubering av CD4<+>og/eller CD8<+>T-celler isolert fra en pasient med én eller flere av: (i) et polypeptid omfattende minst en immunogen del av polypeptidet beskrevet her; (ii) et polynukleotid som koder for et slikt polypeptid; og (iii) en antigenpresenterende celle som uttrykker et slikt polypeptid; og (b) administrering til pasienten av en effektiv mengde av de prolifererte T-celler, for derved å hemme utviklingen av kreft hos pasienten. Prolifererte celler kan, men trenger ikke, være klonet før administrering til pasienten.

Innen ytterligere aspekter tilveiebringer foreliggende oppfinnelse

metoder for å bestemme nærvær eller fravær av kreft, fortrinnsvis prostatakreft, hos en pasient omfattende: (a) å bringe en biologisk prøve tatt fra en pasient i kontakt med et bindemiddel som binder til et polypeptid som angitt ovenfor; (b)

detektering i prøven av en mengde av polypeptid som binder til bindemidlet; og (c) sammenligning av mengden av polypeptid med en forutbestemt avkuttingsverdi og derfra bestemmelse av nærvær eller fravær av kreft hos pasienten. I foretrukne utførelsesformer er bindemidlet et antistoff, mer foretrukket et monoklonalt antistoff.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også, i andre aspekter, metoder for overvåkning av progresjonen av kreft hos en pasient. Slike metoder omfatter trinnene av: (a) å bringe en biologisk prøve tatt fra en pasient på et første tidspunkt i kontakt med et bindemiddel som binder til et polypeptid som angitt ovenfor; (b) å detektere i prøven en mengde av polypeptid som binder til bindemidlet; (c) å repetere trinn (a) og (b) ved anvendelse av en biologisk prøve tatt fra pasienten på et senere tidspunkt; og (d) å sammenligne mengden av polypeptid detektert i trinn (c) med mengden detektert i trinn (b) og derved overvåke progresjonen av kreften hos pasienten.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre, i andre aspekter, metoder for å bestemme nærvær eller fravær av kreft hos en pasient, omfattende trinnene: (a) å bringe en biologisk prøve tatt fra en pasient i kontakt med et oligonukleotid som hybridiserertil et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse; (b) å detektere i prøven et nivå av et polynukleotid, fortrinnsvis mRNA, som hybridiserertil oligonukleotidet; og (c) å sammenligne nivået av polynukleotid som hybridiserertil oligonukleotidet med en forutbestemt avkuttingsverdi og derved bestemme nærvær eller fravær av kreft hos pasienten. I visse utførelsesformer blir mengden av mRNA detektert via polymerasekjedereaksjon ved anvendelse av, for eksempel minst én oligonukleotid-primer som hybridiserertil et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse eller et komplement av et slikt polynukleotid. I andre utførelsesformer blir mengden av mRNA detektert ved anvendelse av en hybridiseringsteknikk, ved anvendelse av en oligonukleotid-probe som hybridiserer til et nytt polynukleotid eller et komplement av et slikt polynukleotid.

I beslektede aspekter er metoder gitt for overvåkning av progresjonen av kreft hos en pasient, omfattende trinnene: (a) å bringe en biologisk prøve tatt fra en pasient i kontakt med et oligonukleotid som hybridiserertil et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse; (b) å detektere i prøven en mengde av et polynukleotid som hybridiserertil oligonukleotidet; (c) å repetere trinn (a) og (b) ved anvendelse av en biologisk prøve tatt fra pasienten på et senere tidspunkt; og (d) å sammenligne mengden av polynukleotid detektert i trinn (c) med mengden detektert i trinn (b) og derved overvåke progresjonen av kreften hos pasienten.

I ytterligere aspekter tilveiebringer foreliggende oppfinnelse antistoffer, så som monoklonale antistoffer, som binder til et polypeptid som beskrevet ovenfor, så vel som diagnostiske sett omfattende slike antistoffer. Diagnostiske sett omfattende én eller flere oligonukleotid-prober eller -primere som beskrevet ovenfor er også gitt.

Disse og andre aspekter ved foreliggende oppfinnelse vil bli klare med referanse til den følgende detaljerte beskrivelse og vedlagte tegninger. Alle referanser beskrevet her inntas herved ved referanse i deres helhet som om hver var inntatt individuelt.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE OG SEKVENS-IDENTIFIKATORER

Figur 1 illustrerer evnen til T-celler til drepe fibroblaster som uttrykker det representative prostata-spesifikke polypeptid P502S, sammenlignet med kontroll-fibroblaster. Prosentdelen lyse er vist som en serie av effektonmål-forhold, som angitt. Figurer 2A og 2B illustrerer evnen til T-celler til å gjenkjenne celler som uttrykker det representative prostata-spesifikke polypeptid P502S. I hvert tilfelle, er antallet y-interferon-flekker vist for forskjellig antall respondere. I Figur 2A er data presentert for fibroblaster pulset med P2S-12-peptidet, sammenlignet med fibroblaster pulset med et kontroll E75-peptid. I Figur 2B er data presentert for fibroblaster som uttrykker P502S, sammenlignet med fibroblaster som uttrykker HER-2/neu. Figur 3 representerer et peptid-kompetivt bindingsforsøk som viser at P1S#10-peptidet, avledet fra P501S, binder HLA-A2. Peptid P1S#10 hemmer HLA-A2-begrenset presentasjon av fluM58-peptid for CTL-klon D150M58 i TNF frigjørings-bioanalyse. D150M58 CTL er spesifikk for det HLA-A2-bindende influensa matriks-peptid fluM58. Figur 4 illustrerer evnen til T-cellelinjer dannet fra P1S#10-immuniserte mus til spesifikt å lyse P1S#10-pulsede Jurkat A2Kb-mål og P501S-transduserte Jurkat A2Kb-mål, sammenlignet med EGFP-transdusert Jurkat A2Kb. Prosent lyse er vist som en serie av effektor til mål forhold, som angitt. Figur 5 illustrerer evnen til en T-celle-klon til å gjenkjenne og spesifikt lyse Jurkat A2KB-celler som uttrykker det representative prostata-spesifikke polypeptid P501S, som derved demonstrerer at P1S#10-peptidet kan være en naturlig prosessert epitop av P501S-polypeptidet. Figurer 6A og 6B er grafer som illustrerer spesifisiteten av en CD8<+>cellelinje (3A-1) for et representativt prostata-spesifikt antigen (P501S). Figur 6A viser resultatene av et<51>Cr frigjøringsforsøk. Prosent spesifikk lyse er vist som en serie av effektonmål-forhold, som angitt. Figur 6B viser produksjon av interferon-gamma av 3A-1-celler stimulert med autolog B-LCL transdusert med P501S, med varierende effektor:mål-forhold som angitt. Figur 7 er en Western blot som viser ekspresjonen av P501S i baculovirus. Figur 8 illustrerer resultatene av epitop-kartleggings-undersøkelser på P501S. Figur 9 er en skjematisk representasjon av P501S-proteinet som viser lokasjonen av transmembran-domener og forutsagte intracellulære og ekstracellulære domener. Figur 10 er et genomisk kart som viser lokasjonen av prostata-gener P775P, P704P, B305D, P712P og P774P i katteøye-syndrom-regionen av kromosom 22q11.2 Figur 11 viser resultatene av et ELISA-forsøk for å bestemme spesifisiteten av kanin-polyklonale-antisera fremkalt mot P501S.

SEKV ID NR: 1 er den bestemte cDNA-sekvens for F1-13

SEKV ID NR: 2 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for F1-12

SEKV ID NR: 3 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for F1-12

SEKV ID NR: 4 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for F1-16

SEKV ID NR: 5 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for H1-1

SEKV ID NR: 6 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for H1-9

SEKV ID NR: 7 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for H1-4

SEKV ID NR: 8 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for J1-17 SEKV ID NR: 9 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for J1-17 SEKV ID NR: 10 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for L1-12 SEKV ID NR: 11 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for L1-12 SEKV ID NR: 12 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for N1-1862 SEKV ID NR: 13 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for N1-1862 SEKV ID NR: 14 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for J1-13 SEKV ID NR: 15 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for J1-13 SEKV ID NR: 16 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for J1-19 SEKV ID NR: 17 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for J1-19 SEKV ID NR: 18 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for J1-25 SEKV ID NR: 19 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for J1-25 SEKV ID NR: 20 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for J1-24 SEKV ID NR: 21 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for J1-24 SEKV ID NR: 22 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for K1-58 SEKV ID NR: 23 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for K1-58 SEKV ID NR: 24 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for K1-63 SEKV ID NR: 25 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for K1-63 SEKV ID NR: 26 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for L1-4 SEKV ID NR: 27 er den bestemte 3"-cDNA-sekvens for L1-4 SEKV ID NR: 28 er den bestemte 5'-cDNA-sekvens for L1-14 SEKV ID NR: 29 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for L1-14 SEKV ID NR: 30 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for J1-12 SEKV ID NR: 31 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for J1-16 SEKV ID NR: 32 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for J1-21 SEKV ID NR: 33 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for K1-48 SEKV ID NR: 34 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for K1-55 SEKV ID NR: 35 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for L1-2 SEKV ID NR: 36 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for L1-6 SEKV ID NR: 37 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for N1-1858 SEKV ID NR: 38 er den bestemte 3-cDNA-sekvens for N1-1860 SEKV ID NR: 39 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for N1-1861 SEKV ID NR: 40 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens for N1-1864

SEKV ID NR: 41 er den bestemte cDNA-sekvens for P5

SEKV ID NR: 42 er den bestemte cDNA-sekvens for P8

SEKV ID NR: 43 er den bestemte cDNA-sekvens for P9

SEKV ID NR: 44 er den bestemte cDNA-sekvens for P18 SEKV ID NR: 45 er den bestemte cDNA-sekvens for P20 SEKV ID NR: 46 er den bestemte cDNA-sekvens for P29 SEKV ID NR: 47 er den bestemte cDNA-sekvens for P30 SEKV ID NR: 48 er den bestemte cDNA-sekvens for P34 SEKV ID NR: 49 er den bestemte cDNA-sekvens for P36 SEKV ID NR: 50 er den bestemte cDNA-sekvens for P38 SEKV ID NR: 51 er den bestemte cDNA-sekvens for P39 SEKV ID NR: 52 er den bestemte cDNA-sekvens for P42 SEKV ID NR: 53 er den bestemte cDNA-sekvens for P47 SEKV ID NR: 54 er den bestemte cDNA-sekvens for P49 SEKV ID NR: 55 er den bestemte cDNA-sekvens for P50 SEKV ID NR: 56 er den bestemte cDNA-sekvens for P53 SEKV ID NR: 57 er den bestemte cDNA-sekvens for P55 SEKV ID NR: 58 er den bestemte cDNA-sekvens for P60 SEKV ID NR: 59 er den bestemte cDNA-sekvens for P64 SEKV ID NR: 60 er den bestemte cDNA-sekvens for P65 SEKV ID NR: 61 er den bestemte cDNA-sekvens for P73 SEKV ID NR: 62 er den bestemte cDNA-sekvens for P75 SEKV ID NR: 63 er den bestemte cDNA-sekvens for P76 SEKV ID NR: 64 er den bestemte cDNA-sekvens for P79 SEKV ID NR: 65 er den bestemte cDNA-sekvens for P84 SEKV ID NR: 66 er den bestemte cDNA-sekvens for P68

SEKV ID NR: 67 er den bestemte cDNA-sekvens for P80 (også referert til som P704P)

SEKV ID NR: 68 er den bestemte cDNA-sekvens for P82 SEKV ID NR: 69 er den bestemte cDNA-sekvens for U1-3064 SEKV ID NR: 70 er den bestemte cDNA-sekvens for U1-3065 SEKV ID NR: 71 er den bestemte cDNA-sekvens for V1-3692 SEKV ID NR: 72 er den bestemte cDNA-sekvens i 1A-3905 SEKV ID NR: 73 er den bestemte cDNA-sekvens for V1-3686 SEKV ID NR: 74 er den bestemte cDNA-sekvens for R1-2330 SEKV ID NR: 75 er den bestemte cDNA-sekvens i 1B-3976 SEKV ID NR: 76 er den bestemte cDNA-sekvens for V1-3679 SEKV ID NR: 77 er den bestemte cDNA-sekvens i 1 G-4736 SEKV ID NR: 78 er den bestemte cDNA-sekvens i 1 G-4738 SEKV ID NR: 79 er den bestemte cDNA-sekvens i 1 G-4741 SEKV ID NR: 80 er den bestemte cDNA-sekvens i 1 G-4744 SEKV ID NR: 81 er den bestemte cDNA-sekvens i 1 G-4734 SEKV ID NR: 82 er den bestemte cDNA-sekvens i 1H-4774 SEKV ID NR: 83 er den bestemte cDNA-sekvens i 1H-4781 SEKV ID NR: 84 er den bestemte cDNA-sekvens i 1H-4785 SEKV ID NR: 85 er den bestemte cDNA-sekvens i 1H-4787 SEKV ID NR: 86 er den bestemte cDNA-sekvens i 1H-4796 SEKV ID NR: 87 er den bestemte cDNA-sekvens i 11-4807 SEKV ID NR: 88 er den bestemte cDNA-sekvens i 11-4810 SEKV ID NR: 89 er den bestemte cDNA-sekvens i 11-4811 SEKV ID NR: 90 er den bestemte cDNA-sekvens i 1J-4876 SEKV ID NR: 91 er den bestemte cDNA-sekvens i 1K-4884 SEKV ID NR: 92 er den bestemte cDNA-sekvens i 1K-4896 SEKV ID NR: 93 er den bestemte cDNA-sekvens i 1 G-4761 SEKV ID NR: 94 er den bestemte cDNA-sekvens i 1 G-4762 SEKV ID NR: 95 er den bestemte cDNA-sekvens i 1H-4766 SEKV ID NR: 96 er den bestemte cDNA-sekvens i 1H-4770 SEKV ID NR: 97 er den bestemte cDNA-sekvens i 1H-4771 SEKV ID NR: 98 er den bestemte cDNA-sekvens i 1H-4772 SEKV ID NR: 99 er den bestemte cDNA-sekvens i 1D-4297 SEKV ID NR: 100 er den bestemte cDNA-sekvens i 1D-4309 SEKV ID NR: 101 er den bestemte cDNA-sekvens i 1D.1-4278 SEKV ID NR: 102 er den bestemte cDNA-sekvens i 1D-4288 SEKV ID NR: 103 er den bestemte cDNA-sekvens i 1D-4283 SEKV ID NR: 104 er den bestemte cDNA-sekvens i 1D-4304 SEKV ID NR: 105 er den bestemte cDNA-sekvens i 1D-4296

SEKV ID NR: 106 er den bestemte cDNA-sekvens i 1D-4280

SEKV ID NR: 107 er den bestemte full-lengde cDNA-sekvens for F1-12

(også referert til som P504S)

SEKV ID NR: 108 er den antatte aminosyresekvens for F1-12 SEKV ID NR: 109 er den bestemte full-lengde cDNA-sekvens for J1-17

SEKV ID NR: 110 er den bestemte full-lengde cDNA-sekvens for L1-12

(også referert til som P501S)

SEKV ID NR: 111 er den bestemte full-lengde cDNA-sekvens for N1-1862 (også referert til som P503S)

SEKV ID NR: 112 er den antatte aminosyresekvens for J1-17

SEKV ID NR: 113 er den antatte aminosyresekvens for L1-12 (også referert til som P501S)

SEKV ID NR: 114 er den antatte aminosyresekvens for N1-1862 (også referert til som P503S)

SEKV ID NR: 115 er den bestemte cDNA-sekvens for P89 SEKV ID NR: 116 er den bestemte cDNA-sekvens for P90 SEKV ID NR: 117 er den bestemte cDNA-sekvens for P92 SEKV ID NR: 118 er den bestemte cDNA-sekvens for P95 SEKV ID NR: 119 er den bestemte cDNA-sekvens for P98 SEKV ID NR: 120 er den bestemte cDNA-sekvens for P102 SEKV ID NR: 121 er den bestemte cDNA-sekvens for P110 SEKV ID NR: 122 er den bestemte cDNA-sekvens for P111 SEKV ID NR: 123 er den bestemte cDNA-sekvens for P114 SEKV ID NR: 124 er den bestemte cDNA-sekvens for P115 SEKV ID NR: 125 er den bestemte cDNA-sekvens for P116 SEKV ID NR: 126 er den bestemte cDNA-sekvens for P124 SEKV ID NR: 127 er den bestemte cDNA-sekvens for P126 SEKV ID NR: 128 er den bestemte cDNA-sekvens for P130 SEKV ID NR: 129 er den bestemte cDNA-sekvens for P133 SEKV ID NR: 130 er den bestemte cDNA-sekvens for P138 SEKV ID NR: 131 er den bestemte cDNA-sekvens for P143 SEKV ID NR: 132 er den bestemte cDNA-sekvens for P151 SEKV ID NR: 133 er den bestemte cDNA-sekvens for P156 SEKV ID NR: 134 er den bestemte cDNA-sekvens for P157 SEKV ID NR: 135 er den bestemte cDNA-sekvens for P166 SEKV ID NR: 136 er den bestemte cDNA-sekvens for P176 SEKV ID NR: 137 er den bestemte cDNA-sekvens for P178 SEKV ID NR: 138 er den bestemte cDNA-sekvens for P179 SEKV ID NR: 139 er den bestemte cDNA-sekvens for P185 SEKV ID NR: 140 er den bestemte cDNA-sekvens for P192 SEKV ID NR: 141 er den bestemte cDNA-sekvens for P201 SEKV ID NR: 142 er den bestemte cDNA-sekvens for P204 SEKV ID NR: 143 er den bestemte cDNA-sekvens for P208 SEKV ID NR: 144 er den bestemte cDNA-sekvens for P211 SEKV ID NR: 145 er den bestemte cDNA-sekvens for P213 SEKV ID NR: 146 er den bestemte cDNA-sekvens for P219 SEKV ID NR: 147 er den bestemte cDNA-sekvens for P237 SEKV ID NR: 148 er den bestemte cDNA-sekvens for P239 SEKV ID NR: 149 er den bestemte cDNA-sekvens for P248 SEKV ID NR: 150 er den bestemte cDNA-sekvens for P251 SEKV ID NR: 151 er den bestemte cDNA-sekvens for P255 SEKV ID NR: 152 er den bestemte cDNA-sekvens for P256 SEKV ID NR: 153 er den bestemte cDNA-sekvens for P259 SEKV ID NR: 154 er den bestemte cDNA-sekvens for P260 SEKV ID NR: 155 er den bestemte cDNA-sekvens for P263 SEKV ID NR: 156 er den bestemte cDNA-sekvens for P264 SEKV ID NR: 157 er den bestemte cDNA-sekvens for P266 SEKV ID NR: 158 er den bestemte cDNA-sekvens for P270 SEKV ID NR: 159 er den bestemte cDNA-sekvens for P272 SEKV ID NR: 160 er den bestemte cDNA-sekvens for P278 SEKV ID NR: 161 er den bestemte cDNA-sekvens for P105 SEKV ID NR: 162 er den bestemte cDNA-sekvens for P107 SEKV ID NR: 163 er den bestemte cDNA-sekvens for P137 SEKV ID NR: 164 er den bestemte cDNA-sekvens for P194 SEKV ID NR: 165 er den bestemte cDNA-sekvens for P195 SEKV ID NR: 166 er den bestemte cDNA-sekvens for P196

SEKV ID NR: 167 er den bestemte cDNA-sekvens for P220

SEKV ID NR: 168 er den bestemte cDNA-sekvens for P234

SEKV ID NR: 169 er den bestemte cDNA-sekvens for P235

SEKV ID NR: 170 er den bestemte cDNA-sekvens for P243

SEKV ID NR: 171 er den bestemte cDNA-sekvens for P703P-DE1 SEKV ID NR: 172 er den antatte aminosyresekvens for P703P-DE1 SEKV ID NR: 173 er den bestemte cDNA-sekvens for P703P-DE2 SEKV ID NR: 174 er den bestemte cDNA-sekvens for P703P-DE6 SEKV ID NR: 175 er den bestemte cDNA-sekvens for P703P-DE13 SEKV ID NR: 176 er den antatte aminosyresekvens for P703P-DE13 SEKV ID NR: 177 er den bestemte cDNA-sekvens for P703P-DE14 SEKV ID NR: 178 er den antatte aminosyresekvens for P703P-DE14 SEKV ID NR: 179 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1G-4736 SEKV ID NR: 180 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1G-4738 SEKV ID NR: 181 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1G-4741 SEKV ID NR: 182 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1G-4744 SEKV ID NR: 183 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1H-4774 SEKV ID NR: 184 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1H-4781 SEKV ID NR: 185 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1H-4785 SEKV ID NR: 186 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1H-4787 SEKV ID NR: 187 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1H-4796 SEKV ID NR: 188 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 11-4807 SEKV ID NR: 189 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens i 11-4810 SEKV ID NR: 190 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens i 11-4811

SEKV ID NR: 191 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1J-4876 SEKV ID NR: 192 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1K-4884 SEKV ID NR: 193 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1K-4896 SEKV ID NR: 194 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1 G-4761 SEKV ID NR: 195 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1 G-4762 SEKV ID NR: 196 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1H-4766 SEKV ID NR: 197 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens i 1H-4770 SEKV ID NR: 198 er den bestemte 3'-cDNA-sekvens i 1H-4771 SEKV ID NR: 199 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1H-4772 SEKV ID NR: 200 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1D-4309 SEKV ID NR: 201 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1D,1-4278 SEKV ID NR: 202 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1D-4288 SEKV ID NR: 203 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1D-4283 SEKV ID NR: 204 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1D-4304 SEKV ID NR: 205 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1D-4296 SEKV ID NR: 206 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens i 1D-4280 SEKV ID NR: 207 er den bestemte cDNA-sekvens i 10-d8fwd

SEKV ID NR: 208 er den bestemte cDNA-sekvens i 10-H10con

SEKV ID NR: 209 er den bestemte cDNA-sekvens i 11-C8rev

SEKV ID NR: 210 er den bestemte cDNA-sekvens i 7.g6fwd

SEKV ID NR: 211 er den bestemte cDNA-sekvens i 7.g6rev

SEKV ID NR: 212 er den bestemte cDNA-sekvens i 8-b5fwd

SEKV ID NR: 213 er den bestemte cDNA-sekvens i 8-b5rev

SEKV ID NR: 214 er den bestemte cDNA-sekvens i 8-b6fwd

SEKV ID NR: 215 er den bestemte cDNA-sekvens i 8-b6 rev

SEKV ID NR: 216 er den bestemte cDNA-sekvens i 8-d4fwd

SEKV ID NR: 217 er den bestemte cDNA-sekvens i 8-d9rev

SEKV ID NR: 218 er den bestemte cDNA-sekvens i 8-g3fwd

SEKV ID NR: 219 er den bestemte cDNA-sekvens i 8-g3rev

SEKV ID NR: 220 er den bestemte cDNA-sekvens i 8-h11rev

SEKV ID NR: 221 er den bestemte cDNA-sekvens for g-f12fwd

SEKV ID NR: 222 er den bestemte cDNA-sekvens for g-f3rev

SEKV ID NR: 223 er den bestemte cDNA-sekvens for P509S

SEKV ID NR: 224 er den bestemte cDNA-sekvens for P510S

SEKV ID NR: 225 er den bestemte cDNA-sekvens for P703DE5 SEKV ID NR: 226 er den bestemte cDNA-sekvens i 9-A11

SEKV ID NR: 227 er den bestemte cDNA-sekvens i 8-C6

SEKV ID NR: 228 er den bestemte cDNA-sekvens i 8-H7

SEKV ID NR: 229 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN13 SEKV ID NR: 230 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN14 SEKV ID NR: 231 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN23 SEKV ID NR: 232 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN24 SEKV ID NR: 233 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN25 SEKV ID NR: 234 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN30 SEKV ID NR: 235 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN34 SEKV ID NR: 236 er den bestemte cDNA-sekvens for PTPN35 SEKV ID NR: 237 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN36 SEKV ID NR: 238 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN38 SEKV ID NR: 239 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN39 SEKV ID NR: 240 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN40 SEKV ID NR: 241 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN41 SEKV ID NR: 242 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN42 SEKV ID NR: 243 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN45 SEKV ID NR: 244 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN46 SEKV ID NR: 245 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN51 SEKV ID NR: 246 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN56 SEKV ID NR: 247 er den bestemte cDNA-sekvens for PTPN64 SEKV ID NR: 248 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN65 SEKV ID NR: 249 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN67 SEKV ID NR: 250 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN76 SEKV ID NR: 251 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN84 SEKV ID NR: 252 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN85 SEKV ID NR: 253 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN86 SEKV ID NR: 254 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN87 SEKV ID NR: 255 er den bestemte cDNA-sekvens for JPTPN88 SEKV ID NR: 256 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1F1 SEKV ID NR: 257 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1F2 SEKV ID NR: 258 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1C2 SEKV ID NR: 259 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1B1 SEKV ID NR: 260 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1B2 SEKV ID NR: 261 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1D3 SEKV ID NR: 262 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1A4 SEKV ID NR: 263 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1F5 SEKV ID NR: 264 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1E6 SEKV ID NR: 265 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1D6 SEKV ID NR: 266 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1B5 SEKV ID NR: 267 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1A6 SEKV ID NR: 268 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1E8 SEKV ID NR: 269 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1D7 SEKV ID NR: 270 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1D9 SEKV ID NR: 271 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1C10 SEKV ID NR: 272 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1A9 SEKV ID NR: 273 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1F12 SEKV ID NR: 274 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1E12 SEKV ID NR: 275 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1D11 SEKV ID NR: 276 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1C11 SEKV ID NR: 277 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1C12 SEKV ID NR: 278 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1B12 SEKV ID NR: 279 er den bestemte cDNA-sekvens for JP1A12 SEKV ID NR: 280 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8 G2 SEKV ID NR: 281 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8H1 SEKV ID NR: 282 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8H2 SEKV ID NR: 283 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8A3 SEKV ID NR: 284 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8A4 SEKV ID NR: 285 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8C3 SEKV ID NR: 286 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8 G4 SEKV ID NR: 287 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8B6 SEKV ID NR: 288 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8D6 SEKV ID NR: 289 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8F5 SEKV ID NR: 290 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8A8 SEKV ID NR: 291 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8C7 SEKV ID NR: 292 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8D7 SEKV ID NR: 293 er den bestemte cDNA-sekvens for P8D8 SEKV ID NR: 294 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8E7 SEKV ID NR: 295 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8F8

SEKV ID NR: 296 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8 G8 SEKV ID NR: 297 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8B10 SEKV ID NR: 298 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8C10 SEKV ID NR: 299 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8E9 SEKV ID NR: 300 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8E10 SEKV ID NR: 301 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8F9 SEKV ID NR: 302 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8H9 SEKV ID NR: 303 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8C12 SEKV ID NR: 304 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8E11 SEKV ID NR: 305 er den bestemte cDNA-sekvens for JP8E12 SEKV ID NR: 306 er aminosyresekvensen for peptidet PS2#12 SEKV ID NR: 307 er den bestemte cDNA-sekvens for P711P SEKV ID NR: 308 er den bestemte cDNA-sekvens for P712P SEKV ID NR: 309 er den bestemte cDNA-sekvens for CLONE23 SEKV ID NR: 310 er den bestemte cDNA-sekvens for P774P SEKV ID NR: 311 er den bestemte cDNA-sekvens for P775P SEKV ID NR: 312 er den bestemte cDNA-sekvens for P715P SEKV ID NR: 313 er den bestemte cDNA-sekvens for P710P SEKV ID NR: 314 er den bestemte cDNA-sekvens for P767P SEKV ID NR: 315 er den bestemte cDNA-sekvens for P768P

SEKV ID NR: 316-325 er de bestemte cDNA-sekvenser av tidligere isolerte gener

SEKV ID NR: 326 er den bestemte cDNA-sekvens for P703PDE5 SEKV ID NR: 327 er den antatte aminosyresekvens for P703PDE5 SEKV ID NR: 328 er den bestemte cDNA-sekvens for P703P6.26 SEKV ID NR: 329 er den antatte aminosyresekvens for P703P6.26 SEKV ID NR: 330 er den bestemte cDNA-sekvens for P703PX-23 SEKV ID NR: 331 er den antatte aminosyresekvens for P703PX-23 SEKV ID NR: 332 er den bestemte full-lengde cDNA-sekvens for P509S

SEKV ID NR: 333 er den bestemte utvidede cDNA-sekvens for P707P

(også referert til som 11-C9)

SEKV ID NR: 334 er den bestemte cDNA-sekvens for P714P

SEKV ID NR: 335 er den bestemte cDNA-sekvens for P705P (også referert til som 9-F3)

SEKV ID NR: 336 er den antatte aminosyresekvens for P705P SEKV ID NR: 337 er aminosyresekvensen av peptidet P1S#10

SEKV ID NR: 338 er aminosyresekvensen av peptidet p5

SEKV ID NR: 339 er den antatte aminosyresekvens av P509S

SEKV ID NR: 340 er den bestemte cDNA-sekvens for P778P

SEKV ID NR: 341 er den bestemte cDNA-sekvens for P786P

SEKV ID NR: 342 er den bestemte cDNA-sekvens for P789P

SEKV ID NR: 343 er den bestemte cDNA-sekvens for en klon som viser homologi med Homo sapiens MM46 mRNA

SEKV ID NR: 344 er den bestemte cDNA-sekvens for en klon som viser homologi med Homo sapiens TNF-alfa-stimulert ABC-protein (ABC50) mRNA

SEKV ID NR: 345 er den bestemte cDNA-sekvens for en klon som viser homologi med Homo sapiens mRNA for E-cadherin

SEKV ID NR: 346 er den bestemte cDNA-sekvens for en klon som viser homologi med human nukleær-kodet mitokondrien serin-hydroksymetyltransferase (SHMT)

SEKV ID NR: 347 er den bestemte cDNA-sekvens for en klon som viser homologi med Homo sapiens naturlig resistens-assosiert makrofag protein2

(NRAMP2)

SEKV ID NR: 348 er den bestemte cDNA-sekvens for en klon som viser homologi med Homo sapiens fosfoglukomutase-beslektet protein (PGMRP)

SEKV ID NR: 349 er den bestemte cDNA-sekvens for en klon som viser homologi med Human mRNA for proteosom subenhet p40

SEKV ID NR: 350 er den bestemte cDNA-sekvens for P777P

SEKV ID NR: 351 er den bestemte cDNA-sekvens for P779P

SEKV ID NR: 352 er den bestemte cDNA-sekvens for P790P

SEKV ID NR: 353 er den bestemte cDNA-sekvens for P784P

SEKV ID NR: 354 er den bestemte cDNA-sekvens for P776P

SEKV ID NR: 355 er den bestemte cDNA-sekvens for P780P

SEKV ID NR: 356 er den bestemte cDNA-sekvens for P544S

SEKV ID NR: 357 er den bestemte cDNA-sekvens for P745S

SEKV ID NR: 358 er den bestemte cDNA-sekvens for P782P

SEKV ID NR: 359 er den bestemte cDNA-sekvens for P783P

SEKV ID NR: 360 er den bestemte cDNA-sekvens for ukjent 17984 SEKV ID NR: 361 er den bestemte cDNA-sekvens for P787P

SEKV ID NR: 362 er den bestemte cDNA-sekvens for P788P SEKV ID NR: 363 er den bestemte cDNA-sekvens for ukjent 17994 SEKV ID NR: 364 er den bestemte cDNA-sekvens for P781P SEKV ID NR: 365 er den bestemte cDNA-sekvens for P785P

SEKV ID NR: 366-375 er de bestemte cDNA-sekvenser for spleisevarianter av B305D.

SEKV ID NR: 376 er den antatte aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 366.

SEKV ID NR: 377 er den antatte aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 372.

SEKV ID NR: 378 er den antatte aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 373.

SEKV ID NR: 379 er den antatte aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 374.

SEKV ID NR: 380 er den antatte aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 375.

SEKV ID NR: 381 er den bestemte cDNA-sekvens for B716P. SEKV ID NR: 382 er den bestemte full-lengde cDNA-sekvens for P711P. SEKV ID NR: 383 er den antatte aminosyresekvens for P711P. SEKV ID NR: 384 er cDNA-sekvensen for P1000C.

SEKV ID NR: 385 er cDNA-sekvensen for CGI-82.

SEKV ID NR: 386 er cDNA-sekvensen i 23320.

SEKV ID NR: 387 er cDNA-sekvensen for CGI-69.

SEKV ID NR: 388 er cDNA-sekvensen for L-iditol-2-dehydrogenase. SEKV ID NR: 389 er cDNA-sekvensen i 23379.

SEKV ID NR: 390 er cDNA-sekvensen i 23381.

SEKV ID NR: 391 er cDNA-sekvensen for KIAA0122.

SEKV ID NR: 392 er cDNA-sekvensen i 23399.

SEKV ID NR: 393 er cDNA-sekvensen for et tidligere identifisert gen. SEKV ID NR: 394 er cDNA-sekvensen for HCLBP.

SEKV ID NR: 395 er cDNA-sekvensen fortransglutaminase. SEKV ID NR: 396 er cDNA-sekvensen for et tidligere identifisert gen. SEKV ID NR: 397 er cDNA-sekvensen for PAP.

SEKV ID NR: 398 er cDNA-sekvensen for Ets transkripsjonsfaktor

PDEF.

SEKV ID NR: 399 er cDNA-sekvensen for hTGR.

SEKV ID NR: 400 er cDNA-sekvensen for KIAA0295. SEKV ID NR: 401 er cDNA-sekvensen i 22545.

SEKV ID NR: 402 er cDNA-sekvensen i 22547.

SEKV ID NR: 403 er cDNA-sekvensen i 22548.

SEKV ID NR: 404 er cDNA-sekvensen i 22550.

SEKV ID NR: 405 er cDNA-sekvensen i 22551.

SEKV ID NR: 406 er cDNA-sekvensen i 22552.

SEKV ID NR: 407 er cDNA-sekvensen i 22553 (også kjent som P1020C).

SEKV ID NR: 408 er cDNA-sekvensen i 22558.

SEKV ID NR: 409 er cDNA-sekvensen i 22562.

SEKV ID NR: 410 er cDNA-sekvensen i 22565.

SEKV ID NR: 411 er cDNA-sekvensen i 22567.

SEKV ID NR: 412 er cDNA-sekvensen i 22568.

SEKV ID NR: 413 er cDNA-sekvensen i 22570.

SEKV ID NR: 414 er cDNA-sekvensen i 22571.

SEKV ID NR: 415 er cDNA-sekvensen i 22572.

SEKV ID NR: 416 er cDNA-sekvensen i 22573.

SEKV ID NR: 417 er cDNA-sekvensen i 22573.

SEKV ID NR: 418 er cDNA-sekvensen i 22575.

SEKV ID NR: 419 er cDNA-sekvensen i 22580.

SEKV ID NR: 420 er cDNA-sekvensen i 22581.

SEKV ID NR: 421 er cDNA-sekvensen i 22582.

SEKV ID NR: 422 er cDNA-sekvensen i 22583.

SEKV ID NR: 423 er cDNA-sekvensen i 22584.

SEKV ID NR: 424 er cDNA-sekvensen i 22585.

SEKV ID NR: 425 er cDNA-sekvensen i 22586.

SEKV ID NR: 426 er cDNA-sekvensen i 22587.

SEKV ID NR: 427 er cDNA-sekvensen i 22588.

SEKV ID NR: 428 er cDNA-sekvensen i 22589.

SEKV ID NR: 429 er cDNA-sekvensen i 22590.

SEKV ID NR: 430 er cDNA-sekvensen i 22591.

SEKV ID NR: 431 er cDNA-sekvensen i 22592.

SEKV ID NR: 432 er cDNA-sekvensen i 22593.

SEKV ID NR: 433 er cDNA-sekvensen i 22594.

SEKV ID NR: 434 er cDNA-sekvensen i 22595.

SEKV ID NR: 435 er cDNA-sekvensen i 22596.

SEKV ID NR: 436 er cDNA-sekvensen i 22847.

SEKV ID NR: 437 er cDNA-sekvensen i 22848.

SEKV ID NR: 438 er cDNA-sekvensen i 22849.

SEKV ID NR: 439 er cDNA-sekvensen i 22851.

SEKV ID NR: 440 er cDNA-sekvensen i 22852.

SEKV ID NR: 441 er cDNA-sekvensen i 22853.

SEKV ID NR: 442 er cDNA-sekvensen i 22854.

SEKV ID NR: 443 er cDNA-sekvensen i 22855.

SEKV ID NR: 444 er cDNA-sekvensen i 22856.

SEKV ID NR: 445 er cDNA-sekvensen i 22857.

SEKV ID NR: 446 er cDNA-sekvensen i 23601.

SEKV ID NR: 447 er cDNA-sekvensen i 23602.

SEKV ID NR: 448 er cDNA-sekvensen i 23605.

SEKV ID NR: 449 er cDNA-sekvensen i 23606.

SEKV ID NR: 450 er cDNA-sekvensen i 23612.

SEKV ID NR: 451 er cDNA-sekvensen i 23614.

SEKV ID NR: 452 er cDNA-sekvensen i 23618.

SEKV ID NR: 453 er cDNA-sekvensen i 23622.

SEKV ID NR: 454 er cDNA-sekvensen for folat-hydrolase.

SEKV ID NR: 455 er cDNA-sekvensen for LIM-protein.

SEKV ID NR: 456 er cDNA-sekvensen for et kjent gen.

SEKV ID NR: 457 er cDNA-sekvensen for et kjent gen.

SEKV ID NR: 458 er cDNA-sekvensen for et tidligere identifisert gen. SEKV ID NR: 459 er cDNA-sekvensen i 23045.

SEKV ID NR: 460 er cDNA-sekvensen i 23032.

SEKV ID NR: 461 er cDNA-sekvensen for klon 23054.

SEKV ID NR: 462-467 er cDNA-sekvenser for kjente gener. SEKV ID NR: 468-471 er cDNA-sekvenser for P710P.

SEKV ID NR: 472 er en cDNA-sekvens for P1001C.

SEKV ID NR: 473 er den bestemte cDNA-sekvens for en første spleisevariant av P775P (referert til som 27505).

SEKV ID NR: 474 er den bestemte cDNA-sekvens for en andre spleisevariant av P775P (referert til som 19947).

SEKV ID NR: 475 er den bestemte cDNA-sekvens for en tredje spleisevariant av P775P (referert til som 19941).

SEKV ID NR: 476 er den bestemte cDNA-sekvens for en fjerde spleisevariant av P775P (referert til som 19937).

SEKV ID NR: 477 er en første antatt aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 474.

SEKV ID NR: 478 er en andre antatt aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 474.

SEKV ID NR: 479 er den antatte aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 475.

SEKV ID NR: 480 er en første antatt aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 473.

SEKV ID NR: 481 er en andre antatt aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 473.

SEKV ID NR: 482 er en tredje antatt aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 473.

SEKV ID NR: 483 er en fjerde antatt aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 473.

SEKV ID NR: 484 er de første 30 aminosyrer av M. tuberculosis antigen Ra12.

SEKV ID NR: 485 er PCR-primeren AW025.

SEKV ID NR: 486 er PCR-primeren AW003.

SEKV ID NR: 487 er PCR-primeren AW027.

SEKV ID NR: 488 er PCR-primeren AW026.

SEKV ID NR: 489-501 er peptider anvendt i epitop-kartleggings-undersøkelser.

SEKV ID NR: 502 er den bestemte cDNA-sekvens av den komplementaritetsbestemmende region for det anti-P503S monoklonale antistoffet 20 D4.

SEKV ID NR: 503 er den bestemte cDNA-sekvens av den komplementaritetsbestemmende region for det anti-P503S monoklonale antistoffet JA1.

SEKV ID NR: 504 & 505 er peptider anvendt i epitop-katrleggings-undersøkelser.

SEKV ID NR: 506 er den bestemte cDNA-sekvens av den komplementaritetsbestemmende region for det anti-P703P monoklonale antistoffet 8H2.

SEKV ID NR: 507 er den bestemte cDNA-sekvens av den komplementaritetsbestemmende region for det anti-P703P monoklonale antistoffet 7H8.

SEKV ID NR: 508 er den bestemte cDNA-sekvens av den komplementaritetsbestemmende region for det anti-P703P monoklonale antistoffet 2D4.

SEKV ID NR: 509-522 er peptider anvendt i epitop-kartleggings-undersøkelser.

SEKV ID NR: 523 er en moden form av P703P anvendt for å fremkalle antistoffer mot P703P.

SEKV ID NR: 524 er den antatte full-lengde cDNA-sekvens av P703P.

SEKV ID NR: 525 er den antatte aminosyresekvens kodet for av SEKV ID NR: 524.

SEKV ID NR: 526 er full-lengde cDNA-sekvensen for P790P. SEKV ID NR: 527 er den antatte aminosyresekvens for P790P. SEKV ID NR: 528 & 529 er PCR-primere.

SEKV ID NR: 530 er cDNA-sekvensen av en spleisevariant av SEKV ID NR: 366.

SEKV ID NR: 531 er cDNA-sekvensen av den åpne leseramme til SEKV ID NR: 530.

SEKV ID NR: 532 er den antatte aminosyre kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 531.

SEKV ID NR: 533 er DNA-sekvensen av en antatt ORF for P775P.

SEKV ID NR: 534 er den antatte aminosyresekvens kodet for av SEKV ID NR: 533.

SEKV ID NR: 535 er en første full-lengde cDNA-sekvens for P510S. SEKV ID NR: 536 er en andre full-lengde cDNA-sekvens for P510S.

SEKV ID NR: 537 er den antatte aminosyresekvens kodet for av SEKV ID NR: 535.

SEKV ID NR: 538 er den antatte aminosyresekvens kodet for av SEKV ID NR: 536.

SEKV ID NR: 539 er peptidet P501S-370.

SEKV ID NR: 540 er peptidet P501S-376.

SEKV ID NR: 541-551 erepitoperav P501S.

SEKV ID NR: 552 er en forlenget cDNA-sekvens for P712P.

SEKV ID NR: 553-568 er aminosyresekvensene kodet for av forutsagte åpne leserammer i SEKV ID NR: 552.

SEKV ID NR: 569 er en forlenget cDNA-sekvens for P776P.

SEKV ID NR: 570 er den bestemte cDNA-sekvens for en spleisevariant av P776P referert til som contig 6.

SEKV ID NR: 571 er den bestemte cDNA-sekvens for en spleisevariant av P776P referert til som contig 7.

SEKV ID NR: 572 er den bestemte cDNA-sekvens for en spleisevariant av P776P referert til som contig 14.

SEKV ID NR: 573 er aminosyresekvensen kodet for av en første forutsagt ORF av SEKV ID NR: 570.

SEKV ID NR: 574 er aminosyresekvensen kodet for av en andre forutsagt ORF av SEKV ID NR: 570.

SEKV ID NR: 575 er aminosyresekvensen kodet for av en forutsagt ORF av SEKV ID NR: 571.

SEKV ID NR: 576-586 er aminosyresekvenser kodet for av forutsagte ORF av SEKV ID NR: 569.

SEKV ID NR: 587 er en DNA konsensus-sekvens av sekvensene i P767P og P777P.

SEKV ID NR: 588-590 er aminosyresekvenser kodet for av forutsagte ORF av SEKV ID NR: 587.

SEKV ID NR: 591 er en forlenget cDNA-sekvens for P1020C.

SEKV ID NR: 592 er den antatte aminosyresekvens kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: P1020C.

SEKV ID NR: 593 er en spleisevariant av P775P referert til som 50748. SEKV ID NR: 594 er en spleisevariant av P775P referert til som 50717. SEKV ID NR: 595 er en spleisevariant av P775P referert til som 45985. SEKV ID NR: 596 er en spleisevariant av P775P referert til som 38769. SEKV ID NR: 597 er en spleisevariant av P775P referert til som 37922. SEKV ID NR: 598 er en spleisevariant av P510S referert til som 49274. SEKV ID NR: 599 er en spleisevariant av P510S referert til som 39487.

SEKV ID NR: 600 er en spleisevariant av P504S referert til som 5167.16.

SEKV ID NR: 601 er en spleisevariant av P504S referert til som 5167,1.

SEKV ID NR: 602 er en spleisevariant av P504S referert til som 5163.46.

SEKV ID NR: 603 er en spleisevariant av P504S referert til som 5163.42.

SEKV ID NR: 604 er en spleisevariant av P504S referert til som 5163.34.

SEKV ID NR: 605 er en spleisevariant av P504S referert til som 5163.17.

SEKV ID NR: 606 er en spleisevariant av P501S referert til som 10640. SEKV ID NR: 607-615 er sekvensene av PCR primere.

SEKV ID NR: 616 er den bestemte cDNA-sekvens av en fusjon av P703P og PSA.

SEKV ID NR: 617 er aminosyresekvensen av fusjonen av P703P og

PSA.

SEKV ID NR: 618 er cDNA-sekvensen av genet DD3.

SEKV ID NR: 619 er en forlenget cDNA-sekvens for P714P.

SEKV ID NR: 620-622 er cDNA-sekvensener for spleisevarianter av P704P.

SEKV ID NR: 623 er cDNA-sekvensen av en spleisevariant av P553S referert til som P553S-14.

SEKV ID NR: 624 er cDNA-sekvensen av en spleisevariant av P553S referert til som P553S-12.

SEKV ID NR: 625 er cDNA-sekvensen av en spleisevariant av P553S referert til som P553S-10.

SEKV ID NR: 626 er cDNA-sekvensen av en spleisevariant av P553S referert til som P553S-6.

SEKV ID NR: 627 er aminosyresekvensen kodet for av SEKV ID NR: 626.

SEKV ID NR: 628 er en første aminosyresekvens kodet for av SEKV ID NR: 623.

SEKV ID NR: 629 er en andre aminosyresekvens kodet for av SEKV ID NR: 623.

SEKV ID NR: 630 er en første full-lengde cDNA-sekvens for prostata-spesifikt transglutaminase-gen (også referert til her som P558S).

SEKV ID NR: 631 er en andre full-lengde cDNA-sekvens for prostata-spesifikt transglutaminase-gen.

SEKV ID NR: 632 er aminosyresekvensen kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 630.

SEKV ID NR: 633 er aminosyresekvensen kodet for av sekvensen i SEKV ID NR: 631.

SEKV ID NR: 634 er full-lengde cDNA-sekvensen for P788P.

SEKV ID NR: 635 er aminosyresekvensen kodet for av SEKV ID NR: 634.

SEKV ID NR: 636 er den bestemte cDNA-sekvens for en polymorf variant av P788P.

SEKV ID NR: 637 er aminosyresekvensen kodet for av SEKV ID NR: 636.

SEKV ID NR: 638 er aminosyresekvensen av peptid 4 fra P703P.

SEKV ID NR: 639 er cDNA-sekvensen som koder for peptid 4 fra P703P.

SEKV ID NR: 640-655 er cDNA-sekvenser som koder for epitoper av P703P.

SEKV ID NR: 656-671 er aminosyresekvensene av epitoper av P703P. SEKV ID NR: 672 og 673 er PCR-primere.

SEKV ID NR: 674 er cDNA-sekvensen som koder for en N-terminal del av P788P uttrykt i E. coli.

SEKV ID NR: 675 er aminosyresekvensen av den N-terminale del av P788P uttrykt i E. coli.

SEKV ID NR: 676 er aminosyresekvensen av M. tuberculosis antigenet Ra12.

SEKV ID NR: 677 og 678 er PCR-primere.

SEKV ID NR: 679 er cDNA-sekvensen for Ra12-P510S-C-konstruksjonen.

SEKV ID NR: 680 er cDNA-sekvensen for P510S-C-konstruksjonen. SEKV ID NR: 681 er cDNA-sekvensen for P510S-E3-konstruksjonen.

SEKV ID NR: 682 er aminosyresekvensen for Ra12-P510S-C-konstruksjonen.

SEKV ID NR: 683 er aminosyresekvensen for P510S-C-konstruksjonen.

SEKV ID NR: 684 er aminosyresekvensen for P510S-E3-konstruksjonen.

SEKV ID NR: 685-690 er PCR-primere.

SEKV ID NR: 691 er cDNA-sekvensen av konstruksjonen Ra12-P775P-ORF3.

SEKV ID NR: 692 er aminosyresekvensen av konstruksjonen Ra12-P775P-ORF3.

SEKV ID NR: 693 og 694 er PCR-primere.

SEKV ID NR: 695 er den bestemte aminosyresekvens for et P703P His-merke fusjonsprotein.

SEKV ID NR: 696 er den bestemte cDNA-sekvens for et P703P His-merke fusjonsprotein.

SEKV ID NR: 697 og 698 er PCR-primere.

SEKV ID NR: 699 er den bestemte aminosyresekvens foret P705P His-merke fusjonsprotein.

SEKV ID NR: 700 er den bestemte cDNA-sekvens for et P705P His-merke fusjonsprotein.

SEKV ID NR: 701 og 702 er PCR-primere.

SEKV ID NR: 703 er den bestemte aminosyresekvens for et P711P His-merke fusjonsprotein.

SEKV ID NR: 704 er den bestemte cDNA-sekvens for et P711P His-merke fusjonsprotein.

SEKV ID NR: 705 er aminosyresekvensen av M. tuberculosis antigen Ra12.

SEKV ID NR: 706 og 707 er PCR-primere.

SEKV ID NR: 708 er den bestemte cDNA-sekvens for konstruksjonen Ra12-P501S-E2.

SEKV ID NR: 709 er den bestemte aminosyresekvens for konstruksjonen Ra12-P501S-E2.

SEKV ID NR: 710 er aminosyresekvensen for en epitop av P501S. SEKV ID NR: 711 er DNA-sekvensen som koder for SEKV ID NR: 710. SEKV ID NR: 712 er aminosyresekvensen for en epitop av P501S. SEKV ID NR: 713 er DNA-sekvensen som koder for SEKV ID NR: 712.

SEKV ID NR: 714 er et peptid anvendt i epitop-kartleggings-undersøkelser.

SEKV ID NR: 715 er aminosyresekvensen for en epitop av P501S. SEKV ID NR: 716 er DNA-sekvensen som koder for SEKV ID NR: 715.

SEKV ID NR: 717-719 er aminosyresekvensene for CD4-epitoper av P501S.

SEKV ID NR: 720-722 er DNA-sekvensene som koder for sekvensene i SEKV ID NR: 717-719.

SEKV ID NR: 723-734 er aminosyresekvensene for antatte CTL-epitoper av P703P.

SEKV ID NR: 735 er full-lengde cDNA-sekvensen for P789P.

SEKV ID NR: 736 er aminosyresekvensen kodet for av SEKV ID NR: 735.

SEKV ID NR: 737 er den bestemte full-lengde cDNA-sekvens for spleisevarianten av P776P referert til som contig 6.

SEKV ID NR: 738-739 er bestemte full-lengde cDNA-sekvenserfor spleisevarianten av P776P referert til som contig 7.

SEKV ID NR: 740-744 er aminosyresekvenser kodet for av SEKV ID NR: 737.

SEKV ID NR: 745-750 er aminosyresekvenser kodet for av spleisevarianten av P776P referert til som contig 7.

SEKV ID NR: 751 er full-lengde cDNA-sekvensen for human transmembran protease-serin 2.

SEKV ID NR: 752 er aminosyresekvensen kodet for av SEKV ID NR: 751.

SEKV ID NR: 753 er cDNA-sekvensen som koder for de første 209 aminosyrer av human transmembran protease-serin 2.

SEKV ID NR: 754 er de første 209 aminosyrer av human transmembran protease-serin 2.

SEKV ID NR: 755 er aminosyresekvensen av peptid 296-322 av P501S. SEKV ID NR: 756-759 er PCR-primere.

SEKV ID NR: 760 er den bestemte cDNA-sekvens av Vb-kjeden av en T-celle-reseptor for den P501S-spesifikke T-celle-klon 4E5.

SEKV ID NR: 761 er den bestemte cDNA-sekvens av Va-kjeden av en T-celle-reseptor for den P501S-spesifikke T-celle klon 4E5.

SEKV ID NR: 762 er aminosyresekvensen kodet for av SEKV ID NR 760.

SEKV ID NR: 763 er aminosyresekvensen kodet for av SEKV ID NR 761.

SEKV ID NR: 764 er full-lengde åpen leseramme for P768P omfattende stoppkodon.

SEKV ID NR: 765 er full-lengde åpen leseramme for P768P uten stoppkodon.

SEKV ID NR: 766 er aminosyresekvensen kodet for av SEKV ID NR: 765.

SEKV ID NR: 767-772 er aminosyresekvensene for forutsagte domener av P768P.

SEKV ID NR: 773 er full-lengde cDNA-sekvensen av P835P.

SEKV ID NR: 774 er cDNA-sekvensen av det tidligere identifiserte klon FLJ13581.

SEKV ID NR: 775 er cDNA-sekvensen av den åpne leseramme for P835P med stoppkodon.

SEKV ID NR: 776 er cDNA-sekvensen av den åpne leseramme for P835P uten stoppkodon.

SEKV ID NR: 777 er full-lengde aminosyresekvensen for P835P.

SEKV ID NR: 778-785 er aminosyresekvensene av ekstracellulære og intracellulære domener av P835P.

SEKV ID NR: 786 er full-lengde cDNA-sekvensen for P1000C.

SEKV ID NR: 787 er cDNA-sekvensen av den åpne leseramme for P1000C, omfattende stoppkodon.

SEKV ID NR: 788 er cDNA-sekvensen av den åpne leseramme for P1000C, uten stoppkodon.

SEKV ID NR: 789 er full-lengde aminosyresekvensen for P1000C. SEKV ID NR: 790 er aminosyrer 1-100 i SEKV ID NR: 789.

SEKV ID NR: 791 er aminosyrer 100-492 i SEKV ID NR: 789.

SEKV ID NR: 792 er aminosyresekvensen av et a prepro-P501S rekombinant protein.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse angår generelt preparater og anvendelse av dem i terapi og diagnose av kreft, spesielt prostatakreft. Som beskrevet videre nedenfor, omfatter illustrative preparater ifølge foreliggende oppfinnelse, men er ikke begrenset til, polypeptider, spesielt immunogene polypeptider, polynukleotider som koder for slike polypeptider, antistoffer og andre bindemidler, antigenpresenterende celler (APC) og immunsystem-celler { f. eks. T-celler).

Utførelsen av foreliggende oppfinnelse vil anvende, hvis ikke annet spesifikt er angitt, konvensjonelle metoder innen virologi, immunologi, mikrobiologi, molekylærbiologi og rekombinante DNA-teknikker kjent for fagfolk på området, som mange er beskrevet nedenfor for illustrasjonsformål. Slike teknikker er forklart fullstendig i litteraturen. Se, f. eks. Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ed., 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, ed., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

Alle publikasjoner, patenter og patentsøknader angitt her, ovenfor eller nedenfor, inntas herved ved referanse i deres helhet.

Som anvendt i denne beskrivelsen og de følgende krav, omfatter entallsformene "en", "det" og "den" flertallsformer hvis ikke innholdet klart tilsier noe annet.

Polypeptidpreparater

Som anvendt her blir betegnelsen "polypeptid"" anvendt i dens konvensjonelle betydning, dvs. som en sekvens av aminosyrer. Polypeptidene er ikke begrenset til en spesifikk lengde av produktet; således er peptider, oligopeptider og proteiner omfattet innenfor definisjonen av polypeptid og slike betegnelser kan anvendes om hverandre her hvis ikke spesifikt angitt på annen måte. Denne betegnelsen refererer ikke til eller utelukker post-ekspresjon-modifikasjoner av polypeptidet, for eksempel glykosyleringer, acetyleringer, fosforyleringer og lignende, så vel som andre modifikasjoner kjent på området, både naturlig forekommende og ikke-naturlig forekommende. Et polypeptid kan være et helt protein eller en subsekvens derav. Spesielle polypeptider av interesse i sammenheng med foreliggende oppfinnelse er aminosyre-subsekvenser omfattende epitoper, dvs. antigene determinanter hovedsakelig ansvarlig for de immunogene egenskapene til et polypeptid og som kan utløse en immunrespons.

Spesielt illustrative polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter de kodet for av en polynukleotidsekvens angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328,330,332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569- 572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788 eller en sekvens som hybridiserer under moderat stringente betingelser, eller, alternativt, under meget stringente betingelser, til en polynukleotidsekvens angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 1-111,115-171,173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788. I spesifikke utførelsesformer omfatter polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse aminosyresekvenser som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 og 789-791.

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er noen ganger referert til her som prostata-spesifikke proteiner eller prostata-spesifikke polypeptider, som en indikasjon på at deres identifikasjon er basert i det minste delvis på deres økede nivåer av ekspresjon i prostatavev-prøver. Således refererer "prostata-spesifikt polypeptid" eller "prostata-spesifikt protein," generelt til en polypeptidsekvens ifølge foreliggende oppfinnelse eller en polynukleotidsekvens som koder for et slikt polypeptid, som er uttrykt i en vesentlig andel av prostatavev-prøver, for eksempel fortrinnsvis over ca. 20%, mer foretrukket over ca. 30% og mest foretrukket over ca. 50% eller mer av testede prostatavev-prøver, i et nivå som er minst to ganger og fortrinnsvis minst fem ganger, større enn nivået av ekspresjon i annet normalt vev, som bestemt ved anvendelse av et representativt forsøk angitt her. En prostata-spesifikk polypeptidsekvens ifølge foreliggende oppfinnelse, basert på dens økede nivå av ekspresjon i tumorceller, har spesiell nytte både som en diagnostisk markør så vel som et terapeutisk mål, som ytterligere beskrevet nedenfor.

I visse foretrukne utførelsesformer er polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse immunogene, dvs. de reagerer detekterbart i en immunoassay (så som ELISA eller T-celle-stimuleringsforsøk) med antisera og/eller T-celler fra en pasient med prostatakreft. Screening for immunogen aktivitet kan utføres ved anvendelse av teknikker velkjent for fagfolk. For eksempel kan slike screeninger utføres ved anvendelse av metoder så som de beskrevet i Harlow og Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. I ett illustrativt eksempel kan et polypeptid immobiliseres på en fast bærer og bringes i kontakt med pasient-sera for å tillate binding av antistoffer i sera til det immobiliserte polypeptid. Ubundet sera kan deretter fjernes og bundete antistoffer detekteres ved anvendelse av for eksempel 125l-merket Protein A.

Som det vil forstås av fagfolk er immunogene deler av polypeptidene beskrevet her også omfattet av foreliggende oppfinnelse. En "immunogen del" som anvendt her, er et fragment av et immunogent polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse som selv er immunologisk reaktiv ( dvs. spesifikt binder) med B-celler og/eller T-celle-overflate-antigen-reseptorer som gjenkjenner polypeptidet. Immunogene deler kan generelt identifiseres ved anvendelse av velkjente teknikker, så som de oppsummert i Paul, Fundamental Immunology, 3. ed., 243-247 (Raven Press, 1993) og referanser angitt der. Slike teknikker omfatter screening av polypeptider for evnen til å reagere med antigen-spesifikke antistoffer, antisera og/eller T-cellelinjer eller kloner. Som anvendt her er antisera og antistoffer "antigen-spesifikke" hvis de spesifikt binder til et antigen ( dvs. de reagerer med proteinet i ELISA eller annen immunoassay og reagerer ikke detekterbart med ubeslektede proteiner). Slike antisera og antistoffer kan fremstilles som beskrevet her og ved anvendelse av velkjente teknikker.

I én foretrukket utførelsesform er en immunogen del av et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse en del som reagerer med antisera og/eller T-celler i et nivå som ikke er vesentlig mindre enn reaktiviteten til full-lengde-polypeptidet ( f. eks. i ELISA og/eller T-celle reaktivitetsforsøk). Fortrinnsvis er nivået av immunogen aktivitet til den immunogene delen minst ca. 50%, fortrinnsvis minst ca. 70% og mest foretrukket over ca. 90% av immunogenisiteten til full-lengde-polypeptidet. I noen tilfeller vil foretrukne immunogene deler identifiseres som har et nivå av immunogen aktivitet større enn den til det tilsvarende full-lengde-polypeptidet, f. eks. som har mer enn ca. 100% eller 150% eller mer immunogen aktivitet.

I visse andre utførelsesformer kan illustrative immunogene deler omfatte peptider hvor en N-terminal ledersekvens og/eller transmembran-domene er deletert. Andre illustrative immunogene deler vil inneholde en liten N- og/eller C-terminal-delesjon ( f. eks. 1-30 aminosyrer, fortrinnsvis 5-15 aminosyrer), i forhold til det modne protein.

I en annen utførelsesform kan et polypeptidpreparat ifølge foreliggende oppfinnelse også omfatte ett eller flere polypeptider som er immunologisk reaktive med T-celler og/eller antistoffer dannet mot et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt et polypeptid som har en aminosyresekvens beskrevet her eller et immunogent fragment eller variant derav.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes polypeptider som omfatter ett eller flere polypeptider som kan indusere T-celler og/eller antistoffer som er immunologisk reaktive med ett eller flere polypeptider beskrevet her eller ett eller flere polypeptider kodet for av påfølgende nukleinsyresekvenser inneholdt i polynukleotidsekvensene beskrevet her eller immunogene fragmenter eller varianter derav eller én eller flere nukleinsyresekvenser som hybridiserertil én eller flere av disse sekvenser under betingelser med moderat til høy stringens.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i et annet aspekt, polypeptid-fragmenter omfattende minst ca. 5, 10, 15, 20, 25, 50 eller 100 påfølgende aminosyrer eller mer, omfattende alle mellomlengder, av et polypeptidpreparat angitt her, så som de angitt i SEKV ID NR: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 og 789-791 eller de kodet for av en polynukleotidsekvens angitt i en sekvens i SEKV ID NR: 1-111,115-171,173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og

384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788.

I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse varianter av polypeptid preparatene beskrevet her. Polypeptidvarianter generelt omfattet av foreliggende oppfinnelse vil typisk oppvise minst ca. 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% eller mer identitet (bestemt som beskrevet nedenfor), langs dens lengde, til en polypeptidsekvens angitt her.

I én foretrukket utførelsesform er polypeptidfragmentene og variantene tilveiebragt ved foreliggende oppfinnelse, immunologisk reaktive med et antistoff og/eller T-celle som reagerer med etfull-lengde-polypeptid spesifikt angitt her.

I en annen foretrukket utførelsesform oppviser polypeptidfragmentene og variantene tilveiebragt ved foreliggende oppfinnelse, et nivå av immunogen aktivitet på minst ca. 50%, fortrinnsvis minst ca. 70% og mest foretrukket minst ca. 90% eller mer av det vist av en full-lengde polypeptidsekvens spesifikt angitt her.

En polypeptid "variant," som betegnelsen blir anvendt her, er et polypeptid som typisk skiller seg fra et polypeptid spesifikt beskrevet her ved én eller flere substitusjoner, delesjoner, addisjoner og/eller insersjoner. Slike varianter kan være naturlig forekommende eller kan være syntetisk dannet, for eksempel ved modifikasjon av én eller flere av polypeptidsekvensene ovenfor ifølge foreliggende oppfinnelse, og evaluering av deres immunogene aktivitet som beskrevet her kan utføres ved anvendelse av hvilken som helst av flere teknikker velkjent på området.

For eksempel omfatter visse illustrative varianter av polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse de hvor én eller flere deler, så som en N-terminal ledersekvens eller et transmembran-domene, er fjernet. Andre illustrative varianter omfatter varianter hvor en liten del ( f. eks. 1-30 aminosyrer, fortrinnsvis 5-15 aminosyrer) er fjernet fra N- og/eller C-terminalen i det modne protein.

I mange tilfeller vil en variant inneholde konservative substitusjoner. En "konservativ substitusjon" er én hvor en aminosyre er erstattet med en annen aminosyre som har lignende egenskaper, slik at fagfolk på området peptidkjemi ville forvente at den sekundære struktur og hydropatiske natur av polypeptidet ville være hovedsakelig uendret. Som beskrevet ovenfor kan modifikasjoner gjøres i strukturen til polynukleotidene og polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse mens det fortsatt oppnås et funksjonelt molekyl som koder for et variant- eller derivat-polypeptid med ønskelige karakteristika, f. eks. med immunogene karakteristika. Når det er ønsket å endre aminosyresekvensen av et polypeptid for å skape en ekvivalent eller til og med en forbedret, immunogen variant eller del av et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, vil fagfolk på området typisk forandre én eller flere av kodonene i den kodende DNA-sekvens i henhold til Tabell 1.

For eksempel kan visse aminosyrer erstattes med andre aminosyrer i en proteinstruktur uten merkbart tap av interaktiv bindingskapasitet med strukturer så som for eksempel antigen-bindende regioner av antistoffer eller bindingsseter på substratmolekyler. Siden det er den interaktive kapasitet og natur av et protein som definerer det proteinets biologiske funksjonelle aktivitet, kan visse aminosyresekvens-substitusjoner utføres i en proteinsekvens og, selvfølgelig, dens underliggende DNA-kodende sekvens, idet det allikevel oppnås et protein med like egenskaper. Det er således antatt at forskjellige endringer kan gjøres i peptidsekvensene av de beskrevne preparater eller tilsvarende DNA-sekvenser som koder for nevnte peptider uten merkbart tap av deres biologiske nytte eller aktivitet.

Ved utførelse av slike endringer kan den hydropatiske indeks av aminosyrer betraktes. Betydningen av den hydropatiske aminosyre-indeks ved overføring av interaktiv biologisk funksjon til et protein er generelt forstått på området (Kyte og Doolittle, 1982, inntatt her ved referanse). Det er akseptert at den relativt hydropatiske karakter av aminosyren bidrar til den sekundære struktur av det resulterende protein, som så definerer interaksjonen av proteinet med andre molekyler, for eksempel enzymer, substrater, reseptorer, DNA, antistoffer, antigener og lignende. Hver aminosyre er tildelt en hydropatisk indeks på basis av dens hydrofobisitet og ladningskarakteristika (Kyte og Doolittle, 1982). Disse verdier er: isoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glycin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lysin (-3,9); og arginin (-4,5).

Det er kjent på området at visse aminosyrer kan erstattes med andre aminosyrer som har en lignende hydropatisk indeks eller score og fortsatt resultere i et protein med lignende biologisk aktivitet, dvs. et biologisk funksjonelt ekvivalent protein oppnås fortsatt. Når slike endringer gjøres, er substitusjon av aminosyrer hvis hydropatiske indekser er innenfor ±2 foretrukket, de innenfor ±1 er spesielt foretrukket og de innenfor ±0,5 er enda mer spesielt foretrukket. Det er også forstått på området at substitusjon av like aminosyrer kan gjøres effektivt på basis av hydrofilitet. U. S. patent 4,554,101 (spesifikt inntatt her ved referanse i sin helhet), angir at den største lokale gjennomsnittlige hydrofilitet av et protein, som styrt av hydrofiliteten til dens tilstøtende aminosyrer, korrelerer med en biologisk egenskap til proteinet.

Som angitt detaljert i U. S. patent 4,554,101, er de følgende

hydrofilitetsverdier tildelt aminosyrerester: arginin (+3,0); lysin (+3,0); aspartat (+3,0 ± 1); glutamat (+3,0 + 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glycin (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5 ± 1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cystein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); isoleucin (-1,8); tyrosin (-2,3); fenylalanin (-2,5); tryptofan (-3,4). Det vil forstås at en aminosyre kan være erstattet med en annen som har en lignende hydrofilitetsverdi, idet det fortsatt oppnås et biologisk ekvivalent og spesielt, et immunologisk ekvivalent protein. Ved slike endringer er substitusjon av aminosyrer hvis hydrofilitetsverdier er innenfor ±2 foretrukket, de innenfor ±1 er spesielt foretrukket og de innenfor +0,5 er enda mer spesielt foretrukket.

Som beskrevet ovenfor er aminosyre-substitusjoner generelt derfor basert på den relative similaritet av aminosyre-sidekjedesubstituenter, for eksempel deres hydrofobisitet, hydrofilitet, ladning, størrelse og lignende. Eksempler på substitusjoner som tar hensyn til foregående karakteristika er velkjent for fagfolk på området og omfatter: arginin og lysin; glutamat og aspartat; serin og treonin; glutamin og asparagin; og valin, leucin og isoleucin.

I tillegg kan hvilket som helst polynukleotid modifiseres ytterligere for å øke stabilitet in vivo. Mulige modifikasjoner omfatter, men er ikke begrenset til, addisjon avflankesekvenser ved 5'- og/eller 3-endene; anvendelse av fosforotioat eller 2' O-metyl istedenfor fosfodiesterase-bindinger i ryggraden; og/eller inklusjon av ikke-tradisjonelle baser så som inosin, queosin og wybutosin, så vel som acetyl- metyl-, tio- og andre modifiserte former av adenin, cytidin, guanin, thymin og uridin.

Aminosyre-substitusjoner kan videre utføres på basis av similaritet i polaritet, ladning, oppløselighet, hydrofobisitet, hydrofilitet og/eller den amfipatiske natur til restene. For eksempel omfatter negativt ladede aminosyrer asparaginsyre og glutaminsyre; positivt ladede aminosyrer omfatter lysin og arginin; og aminosyrer med uladede polare hodegrupper som har lignende hydrofilitetsverdier omfatter leucin, isoleucin og valin; glycin og alanin; asparagin og glutamin; og serin, treonin, fenylalanin og tyrosin. Andre grupper av aminosyrer som kan representere konservative endringer omfatter: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; og (5) phe, tyr, trp, his. En variant kan også eller alternativt, inneholde ikke-konservative endringer. I en foretrukket utførelsesform skiller variant-polypeptider seg fra en nativ sekvens ved substitusjon, delesjon eller addisjon av fem aminosyrer eller færre. Varianter kan også (eller alternativt) modifiseres ved for eksempel delesjon eller addisjon av aminosyrer som har minimal innvirkning på immunogenisiteten, den sekundære struktur og den hydropatiske natur av polypeptidet.

Som angitt ovenfor kan polypeptider omfatte en signal- (eller leder-) sekvens ved den N-terminale ende av proteinet, som ko-translasjonelt eller post-translasjonelt dirigerer overføring av proteinet. Polypeptidet kan også konjugeres til en linker eller annen sekvens for å lette syntese, rensning eller identifikasjon av polypeptidet ( f. eks. poly-His) eller for å forbedre binding av polypeptidet til en fast bærer. For eksempel kan et polypeptid konjugeres til en immunoglobulin Fc-region.

Ved sammenligning av polypeptidsekvenser er to sekvenser angitt å være "identiske" hvis sekvensen av aminosyrer i de to sekvenser er like når oppstilt for maksimum overensstemmelse, som beskrevet nedenfor. Sammenligninger mellom to sekvenser blir typisk utført ved å sammenligne sekvensene over et sammenligningsvindu for å identifisere og sammenligne lokale regioner av sekvenssimilaritet. Et "sammenligningsvindu" som anvendt her, angir et segment på minst ca. 20 påfølgende posisjoner, vanligvis 30 til ca. 75, 40 til ca. 50, hvor en sekvens kan sammenlignes med en referansesekvens med samme antall påfølgende posisjoner etter at de to sekvenser er optimalt oppstilt.

Optimal oppstilling av sekvenser for sammenligning kan utføres ved anvendelse av Megalign-programmet i Lasergene-serien av bioinformatikk programvare (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), ved anvendelse av default parametere. Dette program omfatter mange oppstillingsskjemaer beskrevet i de følgende referanser: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. I Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, s. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes s. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. og Sharp, P.M.

(1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. og Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 77:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. og Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. og Lipman, D.J. (1983) Proe. Nati. Acad., Sei. USA 80:726-730.

Alternativt kan optimal oppstilling av sekvenser for sammenligning utføres ved den lokale identitetsalgoritme til Smith og Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, ved identitets-oppstillingsalgoritmen til Needleman og Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, ved søking etter similaritet-metodene til Pearson og Lipman (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85: 2444, ved datastyrte implementeringer av disse algoritmer (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA og TFASTA i the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl) eller ved inspeksjon.

Et foretrukket eksempel på algoritmer som er egnet for å bestemme prosent sekvensidentitet og sekvenssimilaritet er BLAST og BLAST 2,0 algoritmer, som er beskrevet i henholdsvis Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 og Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST og BLAST 2,0 kan for eksempel anvendes med parametrene beskrevet her, for å bestemme prosent sekvensidentitet for polynukleotidene og polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Programvare for utføring av BLAST-analyser er ålment tilgjengelig gjennom National Center for Biotechnology Information. For aminosyresekvenser kan scorings-matriks anvendes for å beregne den kumulative score. Utvidelse av ord-treffene i hver retning blir stanset når: den kumulative oppstillings-score faller av med mengden X fra dens maksimum oppnådde verdi; den kumulative score går til null eller under, på grunn av akkumuleringen av én eller flere negativt scorende rest-oppstillinger; eller slutten av en av sekvensene blir nådd. BLAST algoritme parametere W, T og X bestemmer sensitiviteten og hastigheten av oppstillingen.

I én foretrukket metode blir "prosentdel sekvensidentitet" bestemt ved å sammenligne to optimalt oppstilte sekvenser over et sammenligningsvindu med minst 20 posisjoner, hvor delen av polypeptidsekvensen i sammenligningsvinduet kan omfatte addisjoner eller delesjoner [ dvs. gap) på 20 prosent eller mindre, vanligvis 5 til 15 prosent eller 10 til 12 prosent, sammenlignet med referansesekvensene (som ikke omfatter addisjoner eller delesjoner) for optimal oppstilling av de to sekvenser. Prosentdelen blir beregnet ved å bestemme antallet posisjoner ved hvilke den identiske aminosyrerest forekommer i begge sekvenser, hvilket gir antallet matchede posisjoner, divisjon av antallet matchede posisjoner med det totale antall posisjoner i referansesekvensen ( dvs. vindustørrelsen) og multiplisering av resultatene med 100, hvilket gir prosent sekvensidentitet.

I andre illustrative utførelsesformer kan et polypeptid være et fusjonspolypeptid som omfatter multiple polypeptider som beskrevet her eller som omfatter minst ett polypeptid som beskrevet her og en ubeslektet sekvens, så som et kjent tumorprotein. En fusjonspartner kan for eksempel assistere i å tilveiebringe T-hjelper epitoper (en immunologisk fusjonspartner), fortrinnsvis T-hjelper epitoper gjenkjent av mennesker eller kan assistere i å uttrykke proteinet (en ekspresjons-enhancer) med høyere utbytter enn det native rekombinante protein. Visse foretrukne fusjonspartnere er både immunologiske og ekspresjonsforsterkende fusjonspartnere. Andre fusjonspartnere kan velges for å øke oppløseligheten av polypeptidet eller sette polypeptidet i stand til å målrettes til ønskede intracellulære kammere. Enda ytterligere fusjonspartnere omfatter affinitetsmerker, som letter rensning av polypeptidet.

Fusjonspolypeptider kan generelt fremstilles ved anvendelse av

standard teknikker, omfattende kjemisk konjugering. Fortrinnsvis blir et fusjonspolypeptid uttrykt som et rekombinant polypeptid, som tillater fremstilling av økede nivåer, i forhold til et ikke-kondensert polypeptid, i et ekspresjonssystem. Kort, DNA-sekvenser som koder for

polypeptidkomponentene kan settes sammen separat og ligeres inn i en passende ekspresjonsvektor. 3'-enden av DNA-sekvensen som koder for én polypeptid-komponent blir ligert, med eller uten en peptid-linker, til 5'-enden av en DNA-sekvens som koder for den andre polypeptidkomponent slik at leserammene av sekvensene er i fase. Dette tillater translasjon til et enkelt fusjonspolypeptid som beholder den biologiske aktiviteten til begge komponent-polypeptider.

En peptid-linker-sekvens kan anvendes for å separere de første og

andre polypeptid-komponenter med en avstand tilstrekkelig til å sikre at hvert polypeptid folder til dets sekundære og tertiære strukturer. En slik peptid-linker-sekvens blir innført i fusjonspolypeptidet ved anvendelse av standard teknikker velkjent på området. Egnede peptid-linker-sekvenser kan velges basert på de følgende faktorer: (1) deres evne til å innta en fleksibel forlenget konformasjon; (2) deres manglende evne til å innta en sekundær struktur som kunne interagere med funksjonelle epitoper på de første og andre polypeptider; og (3) mangelen på hydrofobe eller ladete rester som kunne reagere med de polypeptid funksjonelle epitoper. Foretrukne peptid-linker-sekvenser inneholder Gly-, Asn- og Ser-rester. Andre nær nøytrale aminosyrer, så som Thr og Ala kan også anvendes i bindingssekvensene. Aminosyresekvenser som hensiktsmessig kan anvendes som linkere omfatter de beskrevet i Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:8258-8262, 1986; U.S. patent nr. 4,935,233 og U.S. patent nr. 4,751,180. Linker-sekvensene kan generelt være fra 1 til ca. 50 aminosyrer i lengde. Linker-sekvenser er ikke nødvendige når de første og andre polypeptider har ikke-essensielle N-terminale aminosyreregioner som kan anvendes for å separere de funksjonelle domener og forhindre sterisk interferens.

De ligerte DNA-sekvenser blir operabelt bundet til egnede transkripsjonene eller translasjonene regulatoriske elementer. De regulatoriske elementene ansvarlig for ekspresjon av DNA er lokalisert bare 5' til DNA-sekvensen som koder for de første polypeptider. Tilsvarende er stoppkodoner nødvendige for å slutte translasjon- og transkripsjon-termineringssignaler bare til stede 3' til DNA-sekvensen som koder for det andre polypeptid.

Fusjonspolypeptidet kan omfatte et polypeptid som beskrevet her sammen med et ubeslektet immunogent protein, så som et immunogent protein som kan fremkalle en tilbakekallingsrespons. Eksempler på slike proteiner omfatter tetanus-, tuberkulose- og hepatitt-proteiner (se for eksempel Stoute et al. New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997).

I én foretrukket utførelsesform blir den immunologiske fusjonspartner avledet fra en Mycobacterium sp., så som et Mycobacterium tuberculosis-avledet Ra12-fragment. Ra12-sammensetninger og metoder for anvendelse av dem for forbedring av ekspresjonen og/eller immunogenisiteten av heterologe polynukleotid/polypeptidsekvenser er beskrevet i U.S. patentsøknad 60/158,585, idet beskrivelsen i denne er inntatt her ved referanse i sin helhet. Kort angir Ra12 en polynukleotidregion som er en subsekvens av en Mycobacterium tuberculosis MTB32A nukleinsyre. MTB32A er en serinprotease med 32 KD molekylvekt kodet for av et gen i virulente og avirulente stammer av M. tuberculosis. Nukleotidsekvensen og aminosyresekvensen av MTB32A er beskrevet (for eksempel U.S. patentsøknad 60/158,585; se også, Skeiky et al., Infection and Immun. (1999) 67:3998-4007, inntatt her ved referanse). C-terminale fragmenter av den MTB32A-kodende sekvens uttrykkes i høye nivåer og forblir som oppløselige polypeptider gjennom hele rensingsprosessen. Videre kan Ra12 forbedre immunogenisiteten av heterologe immunogene polypeptider med hvilke det blir kondensert. Ett foretrukket Ra12 fusjons-polypeptid omfatter et 14 KD C-terminalt fragment svarende til aminosyrerester 192 til 323 i MTB32A. Andre foretrukne Ra12 polynukleotider omfatter generelt minst ca. 15 påfølgende nukleotider, minst ca. 30 nukleotider, minst ca. 60 nukleotider, minst ca. 100 nukleotider, minst ca. 200 nukleotider eller minst ca. 300 nukleotider som koder for en del av et Ra12 polypeptid. Ra12 polynukleotider kan omfatte en nativ sekvens ( dvs. en endogen sekvens som koder for et Ra 12 polypeptid eller en del derav) eller kan omfatte en variant av en slik sekvens. Ra12 polynukleotid-varianter kan inneholde én eller flere substitusjoner, addisjoner, delesjoner og/eller insersjoner slik at den biologiske aktiviteten til det kodede fusjons-polypeptid ikke blir vesentlig redusert, i forhold til et fusjonspolypeptid omfattende et nativt Ra 12 polypeptid. Varianter oppviser fortrinnsvis minst ca. 70% identitet, mer foretrukket minst ca. 80% identitet og mest foretrukket minst ca. 90% identitet til en polynukleotidsekvens som koder for et nativt Ra12 polypeptid eller en del derav.

I andre foretrukne utførelsesformer blir en immunologisk fusjonspartner avledet fra protein D, et overflateprotein fra den gram-negative bakterien Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Fortrinnsvis omfatter et protein D-derivat omtrent den første tredjedel av proteinet ( f. eks. de første N-terminale 100-110 aminosyrer) og et protein D-derivat kan være lipidert. I visse foretrukne utførelsesformer er de første 109 rester av en Lipoprotein D-fusjonspartner inkludert på N-terminus for å gi et polypeptid med ytterligere eksogene T-celle-epitoper og for å øke ekspresjonsnivået i E. coli (for således å fungere som en ekspresjons-enhancer). Den lipide halen sikrer optimal presentasjon av antigenet for antigenpresenterende celler. Andre fusjonspartnere omfatter det ikke-strukturelle protein fra influenzae virus, NS1 (hemaglutinin). Typisk blir de N-terminale 81 aminosyrer anvendt, selv om forskjellige fragmenter som omfatter T-hjelper-epitoper kan anvendes.

I en annen utførelsesform er den immunologiske fusjonspartner proteinet kjent som LYTA eller en del derav (fortrinnsvis en C-terminal del). LYTA er avledet fra Streptococcus pneumoniae, som syntetiserer en N-acetyl-L-alanin-amidase kjent som amidase LYTA (kodet for av LytA-genet; Gene 43:265-292,1986). LYTA er et autolysin som spesifikt nedbryter visse bindinger i peptidoglykan-ryggrad. Det C-terminale domene av LYTA-proteinet er ansvarlig for affiniteten til cholin eller til noen cholin-analoger så som DEAE. Denne egenskap blir utnyttet for utvikling av E. coli C-LYTA som uttrykker plasmider anvendelige for ekspresjon av fusjonsproteiner. Rensning av hybridproteiner inneholdende C-LYTA-fragmentet ved amino-terminus er beskrevet (se Biotechnology 70:795-798,1992). I en foretrukket utførelsesform kan en repeterende del av LYTA innføres i et fusjonspolypeptid. En repeterende del er funnet i den C-terminale region som starter ved rest 178. En spesielt foretrukket repetisjonsdel omfatter rester 188-305.

Enda en annen illustrativ utførelsesform omfatter fusjonspolypeptider og polynukleotidene som koder for dem, hvor fusjonspartneren omfatter et målrettingssignal som kan dirigere et polypeptid til det endosomale/lysosomale kammer, som beskrevet i U.S. patent nr. 5,633,234. Et immunogent polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse vil, når kondensert med dette målrettingssignalet, assosiere mer effektivt med MHC klasse II molekyler og derved gi forbedret in vivo stimulering av CD4<+>T-celler spesifikke for polypeptidet.

Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse blir fremstilt ved anvendelse av hvilke som helst av en rekke velkjente syntese- og/eller rekombinante teknikker, idet sistnevnte er ytterligere beskrevet nedenfor. Polypeptider, deler og andre varianter generelt mindre enn ca. 150 aminosyrer kan dannes ved syntetiske metoder, ved anvendelse av teknikker velkjent for fagfolk på området. I ett illustrativt eksempel blir slike polypeptider syntetisert ved anvendelse av hvilke som helst av de kommersielt tilgjengelige fastfase-teknikker, så som Merrifield fastfase syntesemetode, hvor aminosyrer blir sekvensielt satt til en voksende aminosyrekjede. Se Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. Utstyr for automatisert syntese av polypeptider er kommersielt tilgjengelig fra leverandører så som Perkin Eimer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA) og kan opereres i henhold til produsentens instruksjoner.

Generelt blir polypeptidpreparater (omfattende fusjonspolypeptider) ifølge foreliggende oppfinnelse isolert. Et "isolert" polypeptid er et som blir fjernet fra dets opprinnelige omgivelse. For eksempel blir et naturlig forekommende protein eller polypeptid isolert hvis det blir separert fra noen eller alle de sameksisterende materialer i det naturlige systemet. Fortrinnsvis blir slike polypeptider også renset, er f. eks. minst ca. 90% rene, mer foretrukket minst ca. 95% rene og mest foretrukket minst ca. 99% rene.

Polynukleotid Preparater

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer, i andre aspekter, polynukleotid-preparater. Betegnelsene "DNA" og "polynukleotid" blir anvendt i det vesentlige om hverandre her for å referere til et DNA-molekyl som er isolert fritt for totalt genomisk DNA fra en spesiell art. "Isolert," som anvendt her, betyr at et polynukleotid er hovedsakelig borte fra andre kodende sekvenser og at DNA-molekylet ikke inneholder store deler av ubeslektet kodende DNA, så som store kromosomale fragmenter eller andre funksjonelle gener eller polypeptid-kodende regioner. Selvfølgelig angir dette DNA-molekylet som opprinnelig isolert og utelukker ikke gener eller kodende regioner senere satt til segmentet av menneskehånd.

Som det vil forstås av fagfolk på området kan polynukleotid-preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte genomiske sekvenser, ekstra-genomiske og plasmid-kodede sekvenser og mindre konstruerte gensegmenter som uttrykker eller kan tilpasses til å uttrykke, proteiner, polypeptider, peptider og lignende. Slike segmenter kan være naturlig isolert eller modifisert syntetisk av mennesker.

Som det også vil være kjent av fagfolk, kan polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse være enkeltrådete (kodende eller antisense) eller dobbeltrådete og kan være DNA- (genomisk, cDNA eller syntetisk) eller RNA-molekyler. RNA-molekyler kan omfatte HnRNA-molekyler, som inneholder introner og svarer til et DNA-molekyl på en én-til-én måte og mRNA-molekyler, som ikke inneholder introner. Ytterligere kodende eller ikke-kodende sekvensener kan, men trenger ikke, være til stede i et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse og et polynukleotid kan, men trenger ikke, være bundet til andre molekyler og/eller bærermaterialer.

Polynukleotider kan omfatte en nativ sekvens ( dvs. en endogen sekvens som koder for et polypeptid/protein ifølge foreliggende oppfinnelse eller en del derav) eller kan omfatte en sekvens som koder for en variant eller derivat, fortrinnsvis en immunogen variant eller derivat, av en slik sekvens.

I henhold til et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes polynukleotidpreparater som omfatter noe av eller hele en polynukleotidsekvens angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 1-111,115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788, komplementer av en polynukleotidsekvens angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788 og degenererte varianter av en polynukleotidsekvens angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788. I visse foretrukne utførelsesformer koder polynukleotidsekvensene angitt her, for immunogene polypeptider, som beskrevet ovenfor.

I andre beslektede utførelsesformer tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polynukleotid-varianter som har vesentlig identitet til sekvensene beskrevet her i SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788, for eksempel de omfattende minst 70% sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% eller høyere, sekvensidentitet sammenlignet med en polynukleotidsekvens ifølge foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av metodene beskrevet her, ( f. eks. BLAST-analyse ved anvendelse av standard parametere, som beskrevet nedenfor). Fagfolk på dette området vil forstå at disse verdier kan reguleres hensiktsmessig for å bestemme tilsvarende identitet av proteiner kodet for av to nukleotidsekvenser ved å ta hensyn til kodondegenerasjon, aminosyresimilaritet, leserammeposisjonering og lignende.

Typisk vil polynukleotidvarianter inneholde én eller flere substitusjoner, addisjoner, delesjoner og/eller insersjoner, fortrinnsvis slik at immunogenisiteten av polypeptidet kodet for av variant-polynukleotidet ikke vesentlig blir redusert i forhold til et polypeptid kodet for av en polynukleotidsekvens spesifikt angitt her). Betegnelsen "varianter" skal forstås også å omfatte homologe gener av xenogen opprinnelse.

I ytterligere utførelsesformer tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polynukleotid-fragmenter omfattende forskjellige lengder av påfølgende strekk av sekvenser identisk med eller komplementære til, én eller flere av sekvensene beskrevet her. For eksempel er polynukleotider tilveiebragt ved foreliggende oppfinnelse som omfatter minst ca. 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100,150, 200, 300, 400, 500 eller 1000 eller mer påfølgende nukleotider av én eller flere av sekvensene beskrevet her så vel som alle mellomlengder der imellom. Det vil lett forstås at "mellomlengder", i denne sammenheng, betyr hvilken som helst lengde mellom de angitte verdier, så som 16,17,18,19, etc; 21,22, 23, ete.; 30, 31,32, ete.; 50, 51,52, 53, ete.; 100, 101, 102, 103, ete.; 150, 151, 152,153, ete.; omfattende alle hele tall fra 200-500; 500-1000 og lignende.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen blir polynukleotid-preparater tilveiebragt som kan hybridisere under moderate til høy stringens-betingelser til en polynukleotidsekvens gitt her eller et fragment derav eller en komplementær sekvens derav. Hybridiseringsteknikker er velkjent på området molekylærbiologi. For illustrasjonsformål omfatter egnede moderat stringente betingelser for testing av hybridiseringen av et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse med andre polynukleotider, forvasking i en løsning av 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hybridisering ved 50°C-60°C, 5 X SSC, natten over; fulgt av vasking to ganger ved 65°C i 20 minutter med hver av 2X, 0,5X og 0,2X SSC inneholdende 0,1% SDS. Fagfolk på området vil forstå at stringensen for hybridisering lett kan manipuleres, så som ved å endre saltinnholdet av hybridiseringsløsningen og/eller temperaturen ved hvilken hybridiseringen blir utført. Ved en annen utførelsesform omfatter for eksempel egnede meget stringente hybridiseringsbetingelser de beskrevet ovenfor, med unntak av at temperaturen på hybridiseringen blir øket, f. eks. til 60-65°C eller 65-70°C.

I visse foretrukne utførelsesformer koder polynukleotidene beskrevet ovenfor, f. eks. polynukleotid-varianter, -fragmenter og -hybridiseringsekvenser, for polypeptider som er immunologisk kryss-reaktive med en polypeptidsekvens spesifikt angitt her. I andre foretrukne utførelsesformer koder slike polynukleotider for polypeptider som har et nivå av immunogen aktivitet på minst ca. 50%, fortrinnsvis minst ca. 70% og mer foretrukket minst ca. 90% av det for en polypeptidsekvens spesifikt angitt her.

Polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse eller fragmenter derav, uansett lengden av den kodende sekvensen selv, kan kombineres med andre DNA-sekvenser, så som promotere, polyadenyleringssignaler, ytterligere restriksjonsenzymseter, multiple kloningsseter, andre kodende segmenter og lignende, slik at deres totale lengde kan variere betraktelig. Det er derfor antatt at et nukleinsyrefragment av nesten hvilken som helst lengde kan anvendes, idet den totale lengde fortrinnsvis er begrenset av letthet av fremstilling og anvendelse i den tilsiktede rekombinante DNA-protokoll. For eksempel er illustrative polynukleotidsegmenter med totale lengder på ca. 10,000, ca. 5000, ca. 3000, ca. 2,000, ca. 1,000, ca. 500, ca. 200, ca. 100, ca. 50 basepar i lengde og lignende, (omfattende alle mellomlengder) antatt å være anvendelige ved mange implementeringer av foreliggende oppfinnelse.

Ved sammenligning av polynukleotidsekvenser er to sekvenser angitt å være "identiske" hvis sekvensen av nukleotider i de to sekvenser er like når oppstilt for maksimum overensstemmelse, som beskrevet nedenfor. Sammenligninger mellom to sekvenser blir typisk utført ved å sammenligne sekvensene over et sammenligningsvindu for å identifisere og sammenligne lokale regioner av sekvenssimilaritet. Et "sammenligningsvindu" som anvendt her, angir et segment på minst ca. 20 påfølgende posisjoner, vanligvis 30 til ca. 75, fortrinnsvis 40 til ca. 50, hvor en sekvens kan sammenlignes med en referansesekvens med samme antall av påfølgende posisjoner etter at de to sekvenser er optimalt oppstilt.

Optimal oppstilling av sekvenser for sammenligning kan utføres ved anvendelse av Megalign-programmet i Lasergene-serien av bioinformatikk programvare (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), ved anvendelse av default parametere. Dette programmet omfatter mange oppstillingsskjemaer beskrevet i de følgende referanser: Dayhoff, M.O. (1978) A model for evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. I Dayhoff, M.O.

(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, s. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignments and Phylogenes s. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. og Sharp, P.M.

Alternativt kan optimal oppstilling av sekvenser for sammenligning utføres ved lokal identitet-algoritmen til Smith og Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, ved identitet oppstillingsalgoritmen til Needleman og Wunsch

(1970) J. Mol. Biol. 48:443, ved søking etter similahtet-metodene til Pearson og Lipman (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85: 2444, ved datastyrte implementeringer av disse algoritmer (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA og TFASTA i Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl) eller ved inspeksjon.

Et foretrukket eksempel på algoritmer som er egnet for å bestemme prosent sekvensidentitet og sekvenssimilaritet er BLAST og BLAST 2,0 algoritmer, som er beskrevet i henholdsvis Altschul et al. (1977) A/wc/. Acids Res. 25:3389-3402 og Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST og BLAST 2,0 kan for eksempel anvendes med parametrene beskrevet her, for å bestemme prosent sekvensidentitet for polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Programvare for uføring av BLAST-analyser er offentlig tilgjengelige fra National Center for Biotechnology Information. I ett illustrativt eksempel kan kumulative scoringer beregnes ved anvendelse av, for nukleotidsekvenser, parametrene M (belønnings-score for et par av matchende rester; alltid >0) og N (straffe-score for mismatchende rester; alltid <0). Utvidelse av ord-treffene i hver retning blir stanset når: den kumulative oppstillings-score faller med mengden X fra dens maksimum oppnådde verdi; den kumulative score går til null eller under, på grunn av akkumulering av én eller flere negativt scorende restoppposisjoner; eller slutten av en av sekvensene blir nådd. BLAST-algoritme parametere W, T og X bestemmer sesitiviteten og hastigheten av oppstillingen. BLASTN-programmet (for nukleotidsekvenser) anvender som default en ordlengde (W) på 11 og forventning (E) på 10 og BLOSUM62 scoringsmatriks (se Henikoff og Henikoff

(1989) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:10915) oppstillinger, (B) på 50, forventning (E) på 10, M=5, N=-4 og en sammenligning av begge tråder.

Fortrinnsvis blir "prosentdel av sekvensidentitet" bestemt ved å sammenligne to optimalt oppstilte sekvenser over et sammenligningsvindu med minst 20 posisjoner, hvor delen av polynukleotidsekvensen i sammenligningsvinduet kan omfatte addisjoner eller delesjoner { dvs. gap) på 20 prosent eller mindre, vanligvis 5 til 15 prosent eller 10 til 12 prosent, sammenlignet med referansesekvensene (som ikke omfatter addisjoner eller delesjoner) for optimal oppstilling av de to sekvenser. Prosentdelen blir beregnet ved å bestemme antallet posisjoner i hvilke de identiske nukleinsyre-baser forekommer i begge sekvenser, hvilket gir antallet matchede posisjoner, divisjon av antallet matchede posisjoner med det totale antall posisjoner i referansesekvensen ( dvs. vindustørrelsen) og multiplisering av resultatene med 100, hvilket gir prosentdelen av sekvensidentitet.

Det vil forstås av fagfolk på området at, som et resultat av degenerering av den genetiske koden, er det mange nukleotidsekvenser som koder for et polypeptid som beskrevet her. Noen av disse polynukleotider har minimal homologi med nukleotidsekvensen av et nativt gen. Ikke desto mindre er polynukleotider som varierer på grunn av forskjeller i kodon-anvendelse spesifikt omfattet av foreliggende oppfinnelse. Videre er alleler av genene omfattende polynukleotidsekvensene gitt her, innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Alleler er endogene gener som er endret som et resultat av én eller flere mutasjoner, så som delesjoner, addisjoner og/eller substitusjoner av nukleotider. Det resulterende mRNA og protein kan, men trenger ikke, få en endret struktur eller funksjon. Alleler kan identifiseres ved anvendelse av standard teknikker (så som hybridisering, amplifisering og/eller database-sekvenssammenligning).

Ved en annen utførelsesform av oppfinnelsen blir derfor en mutagenese-metode, så som setespesifikk mutagenese, anvendt for fremstilling av immunogene varianter og/eller derivater av polypeptidene beskrevet her. Ved denne metoden kan spesifikke modifikasjoner i en polypeptidsekvens produseres ved mutagenese av de underliggende polynukleotider som koder for dem. Disse teknikker tilveiebringer en enkel metode for å produsere og teste sekvensvarianter, for eksempel omfattende én eller flere av foregående betraktninger, ved innføring av én eller flere nukleotidsekvens-endringer i polynukleotidet.

Setespesifikk mutagenese tillater fremstilling av mutanter ved anvendelse av spesifikke oligonukleotidsekvenser som koder for DNA-sekvensen av den ønskede mutasjon, så vel som et tilstrekkelig antall av tilstøtende nukleotider, for å gi en primersekvens med tilstrekkelig størrelse og sekvens-kompleksitet til å danne en stabil dupleks på begge sider av delesjon-forbindelsen som traverseres. Mutasjoner kan anvendes i en valgt polynukleotidsekvens for å forbedre, endre, redusere, modifisere eller på annen måte forandre egenskapene til polynukleotidet selv og/eller endre egenskapene, aktivitet, sammensetning, stabilitet eller primær sekvens av det kodede polypeptid.

I visse utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse overveier oppfinnerene mutagenese av de beskrevne polynukleotidsekvenserfor å endre én eller flere egenskaper til det kodede polypeptid, så som immunogenisiteten av en polypeptidvaksine. Teknikkene for setespesifikk mutagenese er velkjente på området og er bredt anvendt for å skape varianter av både polypeptider og polynukleotider. For eksempel blir setespesifikk mutagenese ofte anvendt for å endre en spesifikk del av et DNA-molekyl. I slike utførelsesformer blir en primer omfattende typisk ca. 14 til ca. 25 nukleotider eller så i lengde anvendt, idet ca. 5 til ca. 10 rester på begge sider av forbindelsen av sekvensen blir endret.

Som det vil forstås av fagfolk på området har setespesifikke mutagenese-teknikker ofte anvendt en fag-vektor som eksisterer i både en enkeltrådet og dobbeltrådet form. Typiske vektorer anvendelige ved setedirigert mutagenese omfatter vektorer så som M13 fag. Disse fag er lett kommersielt tilgjengelige og anvendelse av dem er generelt velkjent for fagfolk på området. Dobbeltrådete plasmider blir også rutinemessig anvendt ved setedirigert mutagenese som eliminerer trinnet med overføring av det aktuelle genet fra et plasmid til fag.

Generelt blir setedirigert mutagenese i overensstemmelse med dette utført ved først å oppnå en enkeltrådet vektor eller frasmelting av to tråder av en dobbeltrådet vektor som omfatter i dens sekvens en DNA-sekvens som koder for det ønskede peptid. En oligonukleotid-primer som bærer den ønskede muterte sekvens blir fremstilt, generelt syntetisk. Denne primer blir deretter hybridisert med den enkelttrådete vektor og underkastet DNA-polymeriserende enzymer så som E. coli polymerase I Klenow fragment, for fullstendig å syntetisere den mutasjons-bærende tråd. Således blir en heteroduplex dannet hvor én tråd koder for den opprinnelige ikke-muterte sekvens og den andre tråd bærer den ønskede mutasjon. Denne heteroduplex vektor blir deretter anvendt for å transformere passende celler, så som E. coli-celler og kloner blir valgt som omfatter rekombinante vektorer som bærer det muterte sekvens-arrangement.

Fremstilling av sekvensvarianter av de valgte peptid-kodende DNA-segmenter ved anvendelse av setedirigert mutagenese tilveiebringer en metode for å produsere potensielt anvendelige arter og er ikke ment å være begrensende, ettersom det er andre metoder hvor sekvensvarianter av peptider og DNA-sekvensene som koder for dem kan oppnås. For eksempel kan rekombinante vektorer som koder for den ønskede peptidsekvens behandles med mutagene midler, så som hydroksylamin, for å oppnå sekvensvarianter. Spesifikke detaljer angående disse metoder og protokoller er funnet i læren til Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop og Bajpai, 1991; Kuby, 1994; og Maniatis et al., 1982, hver inntatt her ved referanse, for det formålet.

Som anvendt her angir betegnelsen "oligonukleotid-dirigert mutagenese-prosedyre" templat-avhengige prosesser og vektor-mediert propagering som resulterer i en økning i konsentrasjonen av et spesifikt nukleinsyremolekyl i forhold til dets innledende konsentrasjon eller i en økning av konsentrasjonen av et detekterbart signal, så som amplifisering. Som anvendt her skal betegnelsen "oligonukleotid-dirigert mutagenese-prosedyre" referere til en fremgangsmåte som involverer templat-avhengig utvidelse av et primer-molekyl. Betegnelsen templat-avhengig prosess angir nukleinsyre-syntese av et RNA- eller et DNA-molekyl hvor sekvensen av den nysyntetiserte tråd av nukleinsyren er diktert av de velkjente regler for komplementær baseparing (se for eksempel Watson, 1987). Typisk involverer vektormedierte metoder innføringen av nukleinsyrefragmentet i en DNA- eller RNA-vektor, klonal amplifisering av vektoren og gjenvinning av det amplifiserte nukleinsyrefragment. Eksempler på slike metoder er gitt i U. S. patent nr. 4,237,224, spesifikt inntatt herved referanse i sin helhet.

Ved en annen metode for fremstilling av polypeptid-varianter ifølge foreliggende oppfinnelse, kan rekursiv sekvens-rekombinering, som beskrevet i U.S. patent nr. 5,837,458, anvendes. Ved denne metoden blir gjentagende cykler av rekombinering og screening eller seleksjon utført for å "utvikle" individuelle polynukleotidvarianter ifølge foreliggende oppfinnelse som for eksempel har forbedret immunogen aktivitet.

I andre utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse kan polynukleotidsekvensene gitt her fordelaktig anvendes som prober eller primere for nukleinsyre-hybridisering. Som sådanne er det antatt at nukleinsyre-segmenter som omfatter en sekvensregion med minst ca. 15 påfølgende nukleotider som har samme sekvens som eller er komplementær til, en 15 nukleotid lang sammenhengende sekvens beskrevet her, vil være av spesiell nytte. Lenger påfølgende identiske eller komplementære sekvenser, f. eks. de med ca. 20, 30, 40, 50,100, 200, 500,1000 (omfattende alle mellomlengder) og selv opptil full-lengde sekvenser, vil også være anvendelige i visse utførelsesformer.

Evnen til slike nukleinsyre-probertil spesifikt å hybridisere til en sekvens av interesse vil gjøre dem anvendelige for detektering av tilstedeværelsen av komplementære sekvenser i en gitt prøve. Imidlertid er andre anvendelser også forutsett, så som anvendelse av sekvensinformasjonen for fremstilling av mutant-art primere eller primere for anvendelse for fremstilling av andre genetiske konstruksjoner.

Polynukleotid-molekyler som har sekvensregioner bestående av påfølgende nukleotid-strekk på 10-14, 15-20, 30, 50 eller selv 100-200 nukleotider eller så (omfattende også mellomlengder), identiske eller komplementære til en polynukleotidsekvens beskrevet her, er spesielt ment som hybridiseringsprober for anvendelse ved, f. eks. Southern og Northern blotting. Dette ville tillate at et genprodukt eller fragment derav, blir analysert, både i diverse celletyper og også i forskjellige bakterieceller. Den totale størrelsen av fragmentet, så vel som størrelsen av det (de) komplementære strekk, vil til slutt avhenge av den tilsiktede bruk eller anvendelse av det spesielle nukleinsyre-segment. Mindre fragmenter vil generelt finne anvendelse i hybridiserings-utførelsesformer, hvor lengden av den påfølgende komplementære region kan varieres, så som mellom ca. 15 og ca. 100 nukleotider, mens større påfølgende komplementære strekk kan anvendes, i henhold til lengden av komplementære sekvenser man ønsker å detektere.

Anvendelse av en hybridiseringsprobe på ca. 15-25 nukleotider i lengde tillater dannelsen av et dupleks-molekyl som er både stabilt og selektivt. Molekyler som har påfølgende komplementære sekvenser over strekk større enn 15 baser i lengde er allikevel generelt foretrukket, for å øke stabilitet og selektivitet av hybridet og derved forbedre kvaliteten og graden av spesifikke hybridmolekyler oppnådd. Man vil generelt foretrekke å utforme nukleinsyremolekyler som har gen-komplementære strekk på 15 til 25 påfølgende nukleotider eller enda lenger om ønsket.

Hybridiseringsprober kan velges fra hvilken som helst del av hvilken som helst av sekvensene beskrevet her. Alt som er nødvendig er å gjennomgå sekvensene angitt her eller hvilken som helst kontinuerlig del av sekvensene, fra ca. 15-25 nukleotider i lengde opptil og omfattende full-lengde sekvensen, som man ønsker å anvende som en probe eller primer. Valget av probe- og primer-sekvenser kan styres av forskjellige faktorer. For eksempel kan man ønske å anvende primere fra mot termini av den totale sekvensen.

Små polynukleotid-segmenter eller -fragmenter kan lett fremstilles ved for eksempel direkte syntetisering av fragmentet ved kjemiske midler, som er vanlig praktisert ved anvendelse av en automatisert oligonukleotid-syntetisator. Fragmenter kan også oppnås ved anvendelse av nukleinsyre-reproduksjonsteknologi, så som PCR™-teknologien i U. S. patent 4,683,202 (inntatt her ved referanse), ved innføring av valgte sekvenser i rekombinante vektorer for rekombinant produksjon og ved andre rekombinante DNA-teknikker generelt kjent for fagfolk på området molekylær biologi.

Nukleotidsekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for deres evne til selektivt å danne dupleks-molekyler med komplementære strekk av hele gener eller gen-fragmenter av interesse. Avhengig av den tiltenkte anvendelsen, vil man typisk ønske å anvende varierende hybridiseringsbetingelser for å oppnå varierende grader av selektivitet av probe mot målsekvens. For anvendelser som krever høy selektivitet vil man typisk ønske å anvende relativt stringente betingelser for å danne hybridene, f. eks. vil man velge relativt lav-salt- og/eller høy temperatur-betingelser, så som gitt ved en salt-konsentrasjon på fra ca. 0,02 M til ca. 0,15 M salt ved temperaturer på fra ca. 50°C til ca. 70°C. Slike selektive betingelser tolererer liten, om noen i det hele tatt, mismatch mellom proben og templaten eller måltråden og vil være spesielt egnet for å isolere beslektede sekvenser.

Selvfølgelig, for noen anvendelser, for eksempel når man ønsker å fremstille mutanter ved anvendelse av en mutant primertråd hybridisert til en underliggende templat, vil mindre stringente (redusert stringens) hybridiseringsbetingelser typisk være nødvendig for å tillate dannelse av heterodupleks. Under disse omstendigheter kan man ønske å anvende salt-betingelser så som de på fra ca. 0,15 M til ca. 0,9 M salt, ved temperaturer i området fra ca. 20°C til ca. 55°C. Kryss-hybridiserings-arter kan derved lett identifiseres som positive hybridiseringssignaler med hensyn til kontroll-hybridiseringer. I alle tilfeller er det generelt forstått at betingelsene kan gjøres mer stringente ved tilsetning av økende mengder av formamid, som tjener til å destabilisere den hybride dupleks på samme måte som øket temperatur. Således kan hybridiseringsbetingelser lett manipuleres og vil således generelt være en metode for valg avhengig av de ønskede resultater.

I henhold til en annen utførelsesform av oppfinnelsen blir polynukleotid-preparater omfattende antisense-oligonukleotider tilveiebragt. Antisense-oligonukleotider er demonstrert å være effektive og målrettede inhibitorer av proteinsyntese og gir følgelig en terapeutisk metode ved hvilken en sykdom kan behandles ved å hemme syntesen av proteiner som bidrar til sykdommen. Effektiviteten av antisense-oligonukleotider til å hemme proteinsyntese er veletablert. For eksempel blir syntese av polygalaktauronase og muscarin-type 2 acetylcholin-reseptor hemmet av antisense-oligonukleotider rettet mot deres respektive mRNA-sekvenser (U. S. patent 5,739,119 og U. S. patent 5,759,829). Videre er eksempler på antisense-hemning demonstrert med det nukleære protein cyklin, det multiple medikament resistensgen (MDG1), ICAM-1, E-selectin, STK-1, striatal GABAAreseptor og human EGF (Jaskulski et al., Science. 10. juni 1988;240(4858):1544-6; Vasanthakumar og Ahmed, Cancer Commun. 1989;1(4):225-32; Peris et al., Brain Res Mol Brain Res. 15. juni 1998; 57(2):310-20; U. S. patent 5,801,154; U.S. patent 5,789,573; U. S. patent 5,718,709 og U.S. patent 5,610,288). Antisense-konstruksjoner er også beskrevet som hemmer og kan anvendes for å behandle en rekke unormale cellulære proliferasjoner, f. eks. kreft (U. S. patent 5,747,470; U. S. patent 5,591,317 og U. S. patent 5,783,683).

I visse utførelsesformer tilveiebringer derfor foreliggende oppfinnelse oligonukleotidsekvenser som omfatter alle eller en del av, hvilken som helst sekvens som spesifikt kan binde til polynukleotidsekvensen beskrevet her eller et komplement derav. I én utførelsesform omfatter antisense-oligonukleotider DNA eller derivater derav. I en annen utførelsesform omfatter oligonukleotidene RNA eller derivater derav. I en tredje utførelsesform er oligonukleotidene modifiserte DNA omfattende en fosforotioert modifisert ryggrad. I en fjerde utførelsesform omfatter oligonukleotidsekvensene peptid-nukleinsyrer eller derivater derav. I hvert tilfelle omfatter foretrukne preparater en sekvensregion som er komplementær og mer foretrukket hovedsakelig komplementær og enda mer foretrukket, fullstendig komplementær til én eller flere deler av polynukleotidene beskrevet her. Seleksjon av antisense-preparater spesifikke for en gitt gensekvens er basert på analyse av den valgte målsekvens og bestemmelse av sekundær struktur, Tm, bindingsenergi og relativ stabilitet. Antisense-preparater kan velges basert på deres relative manglende evne til å danne dimerer, hårnåler eller andre sekundær strukturer som ville redusere eller hindre spesifikk binding til mål-mRNA i en vertscelle. Meget foretrukne målregioner av mRNA, er de som er ved eller nær AUG-translasjons-initieringskodonet og de sekvenser som er hovedsakelig komplementære til 5'-regionene av mRNA. Disse sekundære struktur-analyser og mål-sete-seleksjonsbetraktninger kan utføres, foreksempel ved anvendelse av v.4 av OLIGO-primeranalyse-programvare og/eller BLASTN 2.0.5 algoritme-programvare (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1. sept. 1997; 25(17):3389-402).

Anvendelse av en antisense leveringsmetode ved anvendelse av en kort peptidvektor, betegnet MPG (27 rester), er også påtenkt. MPG-peptidet inneholder et hydrofobt domene avledet fra fusjonssekvensen av HIV gp41 og et hydrofilt domene fra den nukleære lokaliseringssekvens av SV40 T-antigen (Morris et al., Nucleic Acids Res. 15. juli 1997; 25(14):2730-6). Det har vært demonstrert at mange molekyler av MPG-peptidet belgger antisense oligonukleotider og kan leveres til dyrkede pattedyrceller på mindre enn 1 time med relativt høy effektivitet (90%). Videre øker interaksjon med MPG sterkt både stabiliteten til oligonukleotidet til nuklease og evnen til å krysse plasmamembranen.

I henhold til en annen utførelsesform av oppfinnelsen blir polynukleotid-preparatene beskrevet her anvendt for utformning og fremstilling av ribozym-molekyler for å hemme ekspresjon av tumorpolypeptidene og -proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse i tumorceller. Ribozymer er RNA-protein-komplekser som spalter nukleinsyrer på en setespesifikk måte. Ribozymer har spesifikke katalytiske domener som har endonuklease aktivitet (Kim og Cech, Proe Nati Acad Sei USA. des. 1987; 84(24):8788-92; Forster og Symons, Cell. 24. april 1987; 49(2):211 -20). For eksempel akselererer et stort antall av ribozymer fosfoester-overføringsreaksjoner med en høy grad av spesifisitet, og spalter ofte bare én av mange fosfoestere i et oligonukleotid-substrat (Cech et al., Cell. des. 1981; 27(3 Pt 2):487-96; Michel og Westhof, J Mol Biol. 5. des. 1990; 216(3):585-610; Reinhold-Hurek og Shub, Nature. 14. mai 1992; 357(6374): 173-6). Denne spesifisitet blir tilskrevet kravet at substratet binder via spesifikke base-parings-interaksjonertil den indre guide-sekvens ("IGS") av ribozymet før kjemisk reaksjon.

Seks basiske variasjoner av naturlig forekommende enzymatisk RNA er nå kjent. Hver kan katalysere hydrolyse av RNA-fosfodiester-bindinger in transit (og kan således spalte andre RNA-molekyler) under fysiologiske betingelser. Generelt virker enzymatiske nukleinsyrer ved først å binde til et mål-RNA. Slik binding skjer gjennom den målbindende del av en enzymatisk nukleinsyre som blir holdt i tett nærhet til en enzymatisk del av molekylet som virker til å spalte mål-RNA'et. Således gjenkjenner den enzymatiske nukleinsyre først og binder deretter et mål-RNA gjennom komplementær baseparing og når bundet til det korrekte sete, virker enzymatisk for å kutte mål-RNA'et. Strategisk spaltning av et slikt mål-RNA vil destruere dets evne til direkte syntese av et kodet protein. Etter at en enzymatisk nukleinsyre har bundet og spaltet dens RNA-mål, blir det frigjort fra det RNA for å søke etter et annet mål og kan gjentatte ganger binde og spalte nye mål.

Den enzymatiske natur av et ribozym er fordelaktig fremfor mange teknologier, så som antisense teknologi (hvor et nukleinsyremolekyl enkelt binder til et nukleinsyre-mål for å blokkere dets translasjon) siden konsentrasjonen av ribozym nødvendig for å påvirke en terapeutisk behandling er lavere enn den til et antisense oligonukleotid. Denne fordel reflekterer evnen til ribozymet til å virke enzymatisk. Således kan et enkelt ribozym-molekyl spalte mange molekyler av mål-RNA. I tillegg er ribozymet en meget spesifikk inhibitor, hvor spesifisiteten av hemning er avhengig ikke bare av baseparings-mekanismen for binding til mål-RNA'et, men også av mekanismen for mål-RNA-spaltning. Enkle mismatcher eller base-substitusjoner, nær spaltningssetet kan fullstendig eliminere katalytisk aktivitet til et ribozym. Lignende mismatcher i antisense molekyler forhindrer ikke deres virkning (Woolf et al., Proe Nati Acad Sei U S A. 15. aug. 1992; 89(16):7305-9). Således er spesifisiteten av virkningen av et ribozym større enn den til et antisense oligonukleotid som binder samme RNA-sete.

Det enzymatiske nukleinsyremolekyl kan dannes i hammerhode, hårnål, hepatitt 5-virus, gruppe I intron eller RNaseP RNA (sammen med en RNA guide-sekvens) eller Neurospora VS RNA-motiv. Eksempler på hammerhode-motiver er beskrevet av Rossi et al. Nucleic Acids Res. 11. sept. 1992; 20(17):4559-65. Eksempler på hårnål-motiver er beskrevet av Hampel et al.

(Eur. pat. søknad publ. nr. EP 0360257), Hampel og Tritz, Biochemistry, 13. juni 1989; 28(12):4929-33; Hampel et al., Nucleic Acids Res. 25. jan 1990; 18(2):299-304 og U. S. patent 5,631,359. Et eksempel på hepatitt 8-virus-motivet er beskrevet av Perrotta og Been, Biochemistry. 1. des.1992; 31 (47):11843-52; et eksempel på RNaseP-motivet er beskrevet av Guerrier-Takada et al., Cell. des. 1983; 35(3 Pt 2):849-57; Neurospora VS RNA-ribozym-motivet er beskrevet av Collins (Saville og Collins, Cell. 18. mai 1990; 61(4):685-96; Saville og Collins, Proe Nati Acad Sei U S A. 1. okt. 1991; 88(19):8826-30; Collins og Olive, Biochemistry. 23. mars 1993; 32(11):2795-9); og et eksempel på gruppe I intron er beskrevet i (U. S. Patent 4,987,071). Alt som er viktig i et enzymatisk nukleinsyremolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse er at det har et spesifikt substrat-bindingssete som er komplementært til én eller flere av målgen-RNA-regionene og at det har nukleotidsekvenser innen eller omgivende substrat-bindingssetet som gir en RNA-spaltende aktivitet til molekylet. Således trenger ribozym-konstruksjonene ikke være begrenset til spesifikke motiver nevnt her.

Ribozymer kan utformes som beskrevet i int. pat. søknad publ. nr. WO 93/23569 og int. pat. søknad publ. nr. WO 94/02595, hver spesifikt inntatt her ved referanse) og syntetiseres for å testes in vitro og in vivo, som beskrevet. Slike ribozymer kan også optimaliseres for levering. Mens spesifikke eksempler er gitt, vil fagfolk på området forstå at ekvivalente RNA-mål fra andre arter kan anvendes når nødvendig.

Ribozym-aktivitet kan optimaliseres ved endring av lengden av ribozym-bindingsarmer eller kjemisk syntetisering av ribozymer med modifikasjoner som forhindrer deres nedbrytning av serum-ribonukleaser (se f. eks. int. pat. søknad, publ. nr. WO 92/07065; int. pat. søknad publ. nr. WO 93/15187; int. pat. søknad publ. nr. WO 91/03162; Eur. pat. søknad publ. nr. 92110298,4; U.S. patent 5,334,711; og int. pat. søknad publ. nr. WO 94/13688, som beskriver forskjellige kjemiske modifikasjoner som kan urføres for sukkergruppene i enzymatiske RNA-molekyler), modifikasjoner som forbedrer deres effektivitet i celler og fjerning av stam II baser for å forkorte RNA-syntese-tider og redusere kjemiske krav.

Sullivan et al. (int. pat. søknad publ. nr. WO 94/02595) beskriver de generelle metoder for levering av enzymatiske RNA-molekyler. Ribozymer kan administreres til celler ved en rekke metoder kjent for de med kjennskap til på området, omfattende, men ikke begrenset til, innkapsling i liposomer, ved iontoforese eller ved innføring i andre konstituenter, så som hydrogeler, cyklodekstriner, bionedbrytbare nanokapsler og bioadhesive mikrokuler. For noen indikasjoner kan ribozymer leveres direkte ex vivo til celler eller vev med eller uten ovennevnte konstituenter. Alternativt kan RNA/konstituent-kombinasjonen leveres lokalt ved direkte inhalering, ved direkte injeksjon eller ved anvendelse av et kateter, infusjonspumpe eller stent. Andre leveringsruter omfatter, men er ikke begrenset til, intravaskulær, intramuskulær, subkutan eller ledd-injeksjon, aerosol-inhalering, oral (tablett- eller pille-form), topisk, systemisk, okulær, intraperitoneal og/eller intratekal levering. Mer detaljerte beskrivelser av ribozym-levering og -administrering er gitt i int. pat. søknad publ. nr. WO 94/02595 og int. pat. søknad publ. nr. WO 93/23569, hver spesifikt inntatt her ved referanse.

En annen metode for akkumulering av høye konsentrasjoner av ribozym(er) i celler er å innføre de ribozym-kodende sekvenser i en DNA-ekspresjonsvektor. Transkripsjon av ribozym-sekvensene er drevet av en promoter for eukariot RNA polymerase I (pol I), RNA polymerase II (pol II) eller RNA polymerase III (pol III). Transkripter fra pol II- eller pol lll-promotere vil bli uttrykt i høye nivåer i alle celler; nivåene av en gitt pol ll-promoter i en gitt celletype vil avhenge av typen av gen-regulatorsekvenser (enhancere, silencere, etc.) til stede i nærheten. Prokaryote RNA polymerase-promotere kan også anvendes, forutsatt at det prokaryote RNA-polymerase-enzym er uttrykt i de aktuelle celler. Ribozymer uttrykt fra slike promotere er vist å virke på pattedyrceller. Slike transkripsjonsenheter kan innføres i en rekke vektorer for innføring i pattedyrceller, omfattende men ikke begrenset til, plasmide DNA-vektorer, virale DNA-vektorer (så som adenovirus eller adeno-assosierte vektorer) eller virale RNA-vektorer (så som retrovirale, semliki forest virus-, sindbis virus-vektorer).

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen er peptid-nukleinsyre- (PNA) preparater tilveiebragt. PNA er en DNA-imitator hvor nukleobasene er bundet til en pseudopeptid-ryggrad (Good og Nielsen, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997 7(4) 431-37). PNA kan anvendes ved en rekke metoder som tradisjonelt har anvendt RNA eller DNA. Ofte yter PNA-sekvenser bedre i teknikker enn de tilsvarende RNA- eller DNA-sekvenser og har anvendelser som ikke er reelle for RNA eller DNA. En oversikt over PNA, omfattende metoder for fremstilling, karakterisering og metoder for anvendelse, er gitt av Corey ( Trends Biotechnol, juni1997; 15(6):224-9). Som sådanne kan i visse utførelsesformer, PNA-sekvenser som er komplementære til én eller flere deler av ACE mRNA-sekvensen fremstilles, og slike PNA-preparater kan anvendes for å regulere, endre, nedsette eller redusere translasjonen av ACE-spesifikk mRNA og derved endre nivået av ACE-aktivitet i en vertscelle til hvilke slike PNA-preparater blir administrert.

PNA har 2-aminoetyl-glycin-bindinger som erstatter den normale

fosfodiester-ryggrad av DNA (Nielsen et al., Science, 6. des, 1991; 254(5037): 1497-500; Hanvey et al., Science. 27. nov. 1992; 258(5087):1481-5; Hyrup og Nielsen, Bioorg Med Chem. 4. jan.1996 (1): 5-23). Denne kjemi har tre viktige konsekvenser: for det første, i motsetning til DNA eller fosforotioat-oligonukleotider, er PNA nøytrale molekyler; for det andre er PNA achirale, hvilket unngår behovet for å utvikle stereoselektiv syntese; og for det tredje anvender PNA-syntese standard Boe- eller Fmoc-protokollerforfastfase peptidsyntese, selv om andre metoder, omfattende en modifisert Merrifield-metode, har vært anvendt.

PNA-monomerer eller ferdiglagede oligomerer er kommersielt tilgjengelige fra PerSeptive Biosystems (Framingham, MA). PNA-synteser ved enten Boe- eller Fmoc-protokoller er enkle ved anvendelse av manuelle eller automatiserte protokoller (Norton et al., Bioorg Med Chem., april 1995; 3(4): 437-45). Den manuelle protokollen er velegnet for fremstilling av kjemisk modifiserte PNA eller samtidig syntese av familier av nær beslektede PNA.

Som med peptidsyntese vil suksessen av en spesiell PNA-syntese avhenge av egenskapene til den valgte sekvens. For eksempel mens i teorien PNA kan omfatte hvilken som helst kombinasjon av nukleotid-baser, kan tilstedeværelsen av tilstøtende puriner føre til delesjoner av én eller flere rester i produktet. Idet denne vanskelighet forutsees, er det foreslått at, ved produksjon av PNA med tilstøtende puriner, bør kobling av rester som er sannsynlige å bli tilsatt ineffektivt repeteres. Dette bør bli fulgt av rensing av PNA ved revers-fase høytrykks-væskekromatografi, som gir utbytter og renhet av produkt lignende de observert under syntese av peptider.

Modifikasjoner av PNA for en gitt anvendelse kan oppnås ved kobling av aminosyrer under fastfase-syntese eller ved tilknytning av forbindelser som inneholder en karboksylsyregruppe til det eksponerte N-terminale amin. Alternativt kan PNA modifiseres etter syntese ved kobling til et innført lysin eller cystein. Lettheten som PNA kan modifiseres med, letter optimalisering for bedre oppløselighet eller for spesifikke funksjonelle krav. Når syntetisert kan identiteten til PNA og deres derivater bekreftes ved massespektrometri. Mange undersøkelser har utført og anvendt modifikasjoner av PNA (for eksempel Norton et al., Bioorg Med Chem. april 1995; 3(4):437-45; Petersen et al., J Pept Sei. mai-juni 1995; 1(3): 175-83; Orum et al., Biotechniques. sept. 1995; 19(3):472-80; Footeref a/., Biochemistry. 20. aug.1996; 35(33): 10673-9; Griffith et al., Nucleic Acids Res. 11. aug. 1995; 23(15):3003-8; Pardridge et al., Proe Nati Acad Sei U S A. 6. juni 1995; 92(12):5592-6; Boffa et al., Proe Nati Acad Sei USA. 14. mars1995; 92(6):1901-5; Gambacorti-Passerini et al., Blood. 15. aug. 1996; 88(4): 1411-7; Armitage et al., Proe Nati Acad Sei USA. 11. nov. 1997; 94(23):12320-5; Seeger et al., Biotechniques. sept. 1997; 23(3):512-7). U.S. patent nr. 5,700,922 beskriver PNA-DNA-PNA kimære molekyler og anvendelse av dem i diagnostikk, modulering av protein i organismer og behandling av lidelser mottagelige for terapeutiske midler.

Metoder for karakterisering av antisense bindingsegenskapene til PNA er beskrevet i Rose (Anal Chem. 15. des. 1993; 65(24):3545-9) og Jensen et al. (Biochemistry. 22. april 1997;36(16):5072-7). Rose anvender kapillar- gelelektroforese for å bestemme binding av PNA til deres komplementære oligonukleotid, måling av den relative bindingskinetikk og støkiometri. Lignende typer av målinger ble utført av Jensen et al. ved anvendelse av BIAcore™ teknologi.

Andre anvendelser av PNA som er beskrevet og vil være kjente for fagfolk omfatter anvendelse ved DNA-tråd-invasjon, antisense-hemning, mutasjonen analyse, enhancere av transkripsjon, nukleinsyre-rensning, isolering av transkripsjonelt aktive gener, blokkering av transkripsjonsfaktor-binding, genom-spaltning, biosensorer, in situ hybridisering og lignende.

Polvnukleotid- identifikasion, karakterisering og ekspresjon

Polynukleotid-preparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan identifiseres, fremstilles og/eller manipuleres ved anvendelse av hvilken som helst av en rekke veletablerte teknikker ( se generelt, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 og andre lignende referanser). For eksempel kan et polynukleotid identifiseres, som beskrevet mer detaljert nedenfor, ved screening av en mikromatrise av cDNA for tumor-assosiert ekspresjon ( dvs. ekspresjon som er minst to ganger større i en tumor enn i normalt vev, som bestemt ved anvendelse av et representativt forsøk angitt her). Slike screeninger kan for eksempel utføres ved anvendelse av mikromatrise-teknologien til Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA) i henhold til produsentens instruksjoner (og i det vesentlige som beskrevet av Schena et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:10614-10619, 1996 og Heller et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:2150-2155,1997). Alternativt kan polynukleotider amplifiseres fra cDNA fremstilt fra celler som uttrykker proteinene beskrevet her, så som tumorceller.

Mange templat-avhengige prosesser er tilgjengelige for å amplifisere målsekvenser av interesse til stede i en prøve. Én av de best kjente amplifiseringsmetoder er polymerasekjedereaksjon (PCR™) som er beskrevet i detalj i U.S. patent nr. 4,683,195, 4,683,202 og 4,800,159 som hver er inntatt herved referanse i sin helhet. Kort sagt, i PCR™ blir to primer-sekvenser fremstilt som er komplementære til regioner på motsatte komplementære tråder av målsekvensen. Et overskudd av deoksynukleosid-trifosfater blir satt til en reaksjonsblanding sammen med en DNA-polymerase ( f. eks. Taq polymerase). Hvis målsekvensen er til stede i en prøve vil primerene binde til målet og polymerase vil forårsake at primerene blir forlenget langs målsekvensen ved addisjon på nukleotider. Ved å heve og senke temperaturen på reaksjonsblandingen vil de utvidede primere dissosiere fra målet for å danne reaksjonsprodukter, overskudd av primere vil binde til målet og til reaksjonsproduktet og prosessen blir gjentatt. Fortrinnsvis kan revers transkripsjon og PCR™ amplifiseringsprosedyre utføres for å kvantifisere mengden av mRNA amplifisert. Polymerasekjedereaksjons-metoder er velkjente på området.

Hvilken som helst av flere andre templat-avhengige prosesser, som mange er variasjoner av PCR ™ amplifiseringsteknikken, er godt kjent og tilgjengelig på området. Illustrativt omfatter noen slike metoder ligase-kjedereaksjon (referert til som LCR), beskrevet for eksempel i Eur. pat. søknad publ. nr. 320,308 og U.S. patent nr. 4,883,750; Qbeta Replicase, beskrevet i PCT Int. pat. søknad publ. nr. PCT/US87/00880; Strand Displacement Amplification (SDA) og Repair Chain Reaction (RCR). Enda andre amplifiseringsmetoder er beskrevet i britisk pat. søknad nr. 2 202 328 og i PCT Int. pat. søknad publ. nr. PCT/US89/01025. Andre nukleinsyre-amplifiserings-prosedyrer omfatter transkripsjons-baserte amplifisering systemer (TAS) (PCT Int. pat. søknad publ. nr. WO 88/10315), omfattende nukleinsyresekvens-basert amplifisering (NASBA) og 3SR. Eur. pat. søknad publ. nr. 329,822 beskriver en nukleinsyre-amplifiseringsprosess som involverer cyklisk syntetisering av enkeltrådet RNA ("ssRNA"), ssDNA og dobbeltrådet DNA (dsDNA). PCT int. pat. søknad publ. nr. WO 89/06700 beskriver et nukleinsyresekvens-amplifiseringsskjema basert på hybridisering av en promoter/primer-sekvens til et enkeltrådet DNA- ("ssDNA") mål fulgt av transkripsjon av mange RNA-kopier av sekvensen. Andre amplifiseringsmetoder så som "RACE" (Frohman, 1990) og "én-sidet PCR"

(Ohara, 1989) er også velkjent for fagfolk på området.

En amplifisert del av et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å isolere et full-lengde gen fra et egnet bibliotek ( f. eks. et tumor cDNA-bibliotek) ved anvendelse av velkjente teknikker. Ved slike teknikker blir et bibliotek (cDNA eller genomisk) screenet ved anvendelse av én eller flere polynukleotid-prober eller primere egnet for amplifisering. Fortrinnsvis blir et bibliotek størrelse-selektert til å omfatte større molekyler. Tilfeldig primede biblioteker kan også være foretrukket for å identifisere 5'- og oppstrømsregioner av gener. Genomiske biblioteker er foretrukket for å oppnå introner og utstrekkende 5'-sekvenser.

For hybridiseringsteknikker kan en partiell sekvens merkes { f. eks. ved nick-translasjon eller ende-merking med<32>P) ved anvendelse av velkjente teknikker. Et bakterielt eller bakteriofag bibliotek blir deretter generelt screenet ved hybridiseringsfiltere inneholdende denaturerte bakterielle kolonier (eller duk inneholdende fag-plaque) med den merkede proben ( se Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Hybridiserende kolonier eller plaque blir selektert og ekspandert og DNA'et blir isolert for videre analyse. cDNA-kloner kan analyseres for å bestemme mengden av ytterligere sekvens ved for eksempel PCR ved anvendelse av en primer fra den partielle sekvens og en primer fra vektoren. Restriksjonskart og partielle sekvenser kan dannes for å identifisere én eller flere overlappende kloner. Den fullstendige sekvensen kan deretter bestemmes ved anvendelse av standard teknikker, som kan involvere generering av en serie av delesjonskloner. De resulterende overlappende sekvenser kan deretter settes sammen til en enkel sammenhengende sekvens. Et full-lengde cDNA molekyl kan dannes ved ligering av egnede fragmenter, ved anvendelse av velkjente teknikker.

Alternativt kan amplifiseringsteknikker, så som de beskrevet ovenfor, være anvendelige for å oppnå en full-lengde kodende sekvens fra en partiell cDNA-sekvens. Én slik amplifiseringsteknikk er invers PCR ( se Triglia et al., Nucl. Acids Res. 76:8186, 1988), som anvender restriksjonsenzymer for å danne et fragment i den kjente region av genet. Fragmentet blir deretter sirkularisert ved intramolekylær ligering og anvendt som templat for PCR med divergente primere avledet fra den kjente region. Ved en alternativ metode kan sekvenser tilstøtende en partiell sekvens gjenvinnes ved amplifisering med en primer til en linker-sekvens og en primer spesifikk for en kjent region. De amplifiserte sekvensene blir typisk underkastet en andre runde med amplifisering med samme linker-primer og en andre primer spesifikk for den kjente region. En variasjon av denne prosedyren, som anvender to primere som initierer utvidelse i motsatte retninger fra den kjente sekvens, er beskrevet i WO 96/38591. En annen slik teknikk er kjent som "rask amplifisering av cDNA-ender" eller RACE. Denne teknikk involverer anvendelse av en indre primer og en ytre primer, som hybridiserer til en polyA-region eller vektor-sekvens, for å identifisere sekvenser som er 5" og 3' for en kjent sekvens. Ytterligere teknikker omfatter "capture "-PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 7:111-19, 1991) og "walking"-PCR (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 79:3055-60, 1991). Andre metoder som anvender amplifisering kan også anvendes for å oppnå en full-lengde cDNA-sekvens.

I visse tilfeller er det mulig å oppnå en full-lengde cDNA-sekvens ved analyse av sekvenser gitt i en uttrykt sekvens-merke (EST) database, så som den tilgjengelig fra GenBank. Søk etter overlappende EST kan generelt utføres ved anvendelse av velkjente programmer ( f. eks. NCBI BLAST-søk) og slike EST kan anvendes for å danne en påfølgende full-lengde sekvens. Full-lengde DNA-sekvenser kan også oppnås ved analyse av genomiske fragmenter.

I andre utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse kan polynukleotidsekvenser eller fragmenter derav som koder for polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse eller fusjonsproteiner eller funksjonelle ekvivalenter derav, anvendes i rekombinante DNA-molekylerfor å dirigere ekspresjon av et polypeptid i passende vertsceller. På grunn av den iboende degenerasjon av den genetiske kode, kan andre DNA-sekvenser som koder for hovedsakelig samme eller en funksjonelt ekvivalent aminosyresekvens produseres og disse sekvenser kan anvendes for å klone og uttrykke et gitt polypeptid.

Som det vil forstås av fagfolk på området kan det være fordelaktig i noen tilfeller å produsere polypeptid-kodende nukleotidsekvenser som har ikke-naturlig-forekommende kodoner. For eksempel kan kodoner foretrukket av en spesiell prokaryot eller eukariot vert velges for å øke graden av protein-ekspresjon eller for å produsere et rekombinant RNA-transkript som har ønskelige egenskaper, så som en halveringstid som er lenger enn den til et transkript dannet fra den naturlig forekommende sekvens.

Videre kan polynukleotidsekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse konstrueres ved anvendelse av metoder generelt kjent på området for å endre polypeptid-kodende sekvenser av en rekke grunner, omfattende, men ikke begrenset til, endringer som modifiserer kloning, prosessering og/eller ekspresjon av genproduktet. For eksempel kan DNA "shuffling" ved tilfeldig fragmentering og PCR-gjensammensetning av gen-fragmenter og syntetiske oligonukleotider anvendes for å konstruere nukleotidsekvensene. I tillegg kan seterettet mutagenese anvendes for å innsette nye restriksjonsseter, endre glykosyleringsmønstere, forandre kodon-preferanse, produsere spleisevarianter eller innføre mutasjoner osv.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen kan naturlige, modifiserte eller rekombinante nukleinsyresekvenser ligeres til en heterolog sekvens for å kode for et fusjonsprotein. For eksempel for screening av peptidbiblioteker for inhibitorer av polypeptid-aktivitet, kan det være nyttig å kode for et kimært protein som kan gjenkjennes av et kommersielt tilgjengelig antistoff. Et fusjonsprotein kan også konstrueres til å inneholde et spaltningssete lokalisert mellom den polypeptid-kodende sekvens og den heterologe proteinsekvens, slik at polypeptidet kan spaltes og renses bort fra den heterologe gruppen.

Sekvenser som koder for et ønsket polypeptid kan syntetiseres, helt eller delvis, ved anvendelse av kjemiske metoder velkjent på området (se Caruthers, M. H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232). Alternativt kan proteinet selv produseres ved anvendelse av kjemiske metoder for å syntetisere aminosyresekvensen til et polypeptid eller en del derav. For eksempel kan peptidsyntese utføres ved anvendelse av forskjellige fastfase-teknikker (Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202-204) og automatisert syntese kan for eksempel utføres ved anvendelse av ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Eimer, Palo Alto, CA).

Et nysyntetisert peptid kan i det vesentlige renses ved preparativ høyytelse væskekromatografi ( f. eks. Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.) eller andre sammenlignbare teknikker tilgjengelig på området. Sammensetningen av de syntetiske peptider kan bekreftes ved aminosyreanalyse eller sekvensering ( f. eks. Edman nedbrytningsprosedyre). I tillegg kan aminosyresekvensen til et polypeptid eller hvilken som helst del derav, endres i løpet av direkte syntese og/eller kombineres ved anvendelse av kjemiske metoder, med sekvenser fra andre proteiner eller hvilken som helst del derav, for å produsere et variant-polypeptid.

For å uttrykke et ønsket polypeptid kan nukleotidsekvensene som koder for polypeptidet eller funksjonelle ekvivalenter, innsettes i en passende ekspresjonsvektor, dvs. en vektor som inneholder de nødvendige elementene for transkripsjon og translasjon av den innsatte kodende sekvensen. Metoder som er velkjent for fagfolk på området kan anvendes for å konstruere ekspresjonsvektorer inneholdende sekvenser som koder for et polypeptid av interesse og passende transkripsjonene og translasjonene kontroll-elementer. Disse metoder omfatter in vitro rekombinante DNA-teknikker, synteseteknikker og in vivo genetisk rekombinering. Slike teknikker er beskrevet i for eksempel Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. og Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.

En rekke ekspresjonsvektor/vertssystemer kan anvendes for å inneholde og uttrykke polynukleotidsekvenser. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, mikroorganismer så som bakterier omdannet med rekombinant bakteriofag, plasmid eller kosmid DNA-ekspresjonsvektorer; gjær transformert med gjær-ekspresjonsvektorer; insektcelle-systemer infisert med virus-ekspresjonsvektorer ( f. eks. baculovirus); plantecelle-systemer transformert med virus-ekspresjonsvektorer ( f. eks. blomkål mosaikkvirus, CaMV; tobakk mosaikkvirus, TMV) eller med bakterielle ekspresjonsvektorer ( f. eks. Ti eller pBR322 plasmider); eller dyrecelle-systemer.

"Kontrollelementer" eller "regulatorsekvenser" til stede i en ekspresjonsvektor er de ikke-translaterte regioner av vektor-enhancere, promotere, 5'- og 3'-utranslaterte regioner som interagerer med cellulære proteiner i verten for å utføre transkripsjon og translasjon. Slike elementer kan variere i styrke og spesifisitet. Avhengig av vektorsystemet og verten som anvendes, kan hvilket som helst antall av egnede transkripsjons- og

translasjons-elementer, omfattende konstitutive og induserbare promotere, anvendes. For eksempel ved kloning i bakterielle systemer, kan induserbare promotere så som hybrid lacZ promoter av PBLUESCRIPT phagemid (Stratagene, La Jolla, Calif.) eller PSPORT1 plasmid (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) og lignende anvendes. I pattedyrcelle-systemer er promotere fra pattedyrgener eller fra pattedyr-virus generelt foretrukket. Hvis det er nødvendig for å danne en cellelinje som inneholder multiple kopier av sekvensen som koder for et polypeptid, kan vektorer basert på SV40 eller EBV fordelaktig anvendes med en passende selekterbar markør.

I bakterielle systemer kan hvilken som helst av flere ekspresjonsvektorer velges avhengig av anvendelsen ment for det uttrykte polypeptidet. Når for eksempel store mengder er nødvendig, for eksempel for induksjon av antistoffer, kan vektorer som dirigerer høynivå-ekspresjon av fusjonsproteiner som lett kan renses, anvendes. Slike vektorer omfatter, men er ikke begrenset til, de multifunksjonelle E. coli klonings- og ekspresjons-vektorer så som BLUESCRIPT (Stratagene), hvor sekvensen som koder for polypeptidet av interesse kan ligeres inn i vektoren i ramme med sekvenser for den amino-terminale Met og de påfølgende 7 rester av .beta.-galaktosidase slik at et hybridprotein blir produsert; pIN vektorer (Van Heeke, G. og S. M. Schuster

(1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509); og lignende. pGEX-vektorer (Promega, Madison, Wis.) kan også anvendes for å uttrykke fremmede polypeptider som fusjonsproteiner med glutation S-transferase (GST). Generelt er slike fusjonsproteiner oppløselige og kan lett renses fra lysede celler ved adsorpsjon til glutation-agarose-kuler fulgt av eluering i nærvær av fritt glutation. Proteiner laget i slike systemer kan utformes til å omfatte heparin-, trombin- eller faktor XA protease-spaltningsseter slik at det klonede polypeptidet av interesse kan frigjøres fra GST-gruppen etter ønske.

I gjæren Saccharomyces cerevisiae, kan flere vektorer inneholdende konstitutive eller induserbare promotere så som alfa-faktor, alkoholoksydase og PGH anvendes. For oversikter, se Ausubel et al. (supra) og Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544.

I tilfeller hvor plante-ekspresjonsvektorer blir anvendt, kan ekspresjonen av sekvenser som koder for polypeptider være drevet ved hvilken som helst av en rekke promotere. For eksempel kan virale promotere så som 35S og 19S promotere av CaMV anvendes alene eller i kombinasjon med omega-ledersekvensen fra TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311. Alternativt kan plantepromotere så som den lille subenhet av RUBISCO eller varmesjokk-promotere, anvendes (Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; og Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 77:85-105). Disse konstruksjoner kan innføres i planteceller ved direkte DNA-transformasjon eller patogen-mediert transfeksjon. Slike teknikker er beskrevet i flere generelt tilgjengelige oversikter (se for eksempel Hobbs, S. eller Murry, L. E. i McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; s. 191-196).

Et insektsystem kan også anvendes for å uttrykke et polypeptid av interesse. I ett slikt system blir for eksempel Autographa californica nukleær polyhedrose virus (AcNPV) anvendt som en vektor for å uttrykke fremmede gener i Spodoptera frugiperda-celler eller i Trichoplusia-larver. Sekvensene som koder for polypeptidet kan klones inn i en ikke-essensiell region av viruset, så som polyhedrin-gen og plasseres under kontroll av polyhedrin-promoteren. Vellykket insersjon av den polypeptid-kodende sekvens vil gjøre polyhedrin-genet inaktivt og produsere rekombinant virus som mangler kappe-protein. Det rekombinante virus kan deretter anvendes for å infisere for eksempel S. frugiperda-celler eller Trichoplusia-larver hvor polypeptidet av interesse kan uttrykkes (Engelhard, E. K. et al. (1994) Proe. Nati. Acad. Sei. 91 :3224-3227).

I pattedyr-vertsceller er flere viral-baserte ekspresjonssystemer generelt tilgjengelig. For eksempel i tilfeller hvor et adenovirus blir anvendt som en ekspresjonsvektor, kan sekvenser som koder for et polypeptid av interesse ligeres inn i et adenovirus transkripsjon/translasjon-kompleks bestående av den sene promoter og tredelte ledérsekvens. Insersjon i en ikke-essensiell E1- eller E3-region av det virale genom kan anvendes for å oppnå et levedyktig virus som kan uttrykke polypeptidet i infiserte vertsceller (Logan, J. og Shenk, T.

(1984) Proe. Nati. Acad. Sei. 87:3655-3659). I tillegg kan transkripsjons-enhancere, så som Rous sarkom virus (RSV) enhancer, anvendes for å øke ekspresjon i pattedyr-vertsceller.

Spesifikke initieringssignaler kan også anvendes for å oppnå mer effektiv translasjon av sekvenser som koder for et polypeptid av interesse. Slike signaler omfatter ATG-initieringskodon og tilstøtende sekvenser. I tilfeller hvor sekvenser som koder for polypeptidet, dets initieringskodon og oppstrøms sekvenser blir innsatt i den passende ekspresjonsvektor, trenger ingen ytterligere transkripsjonene eller translasjonene kontrollsignaler være nødvendige. Imidlertid bør, i tilfeller hvor bare den kodende sekvensen eller en del derav, blir innsatt, eksogene translasjonene kontrollsignaler omfattende ATG-initieringskodon være tilveiebragt. Videre må initieringskodonet være i den korrekte leseramme for å sikre translasjon av hele insersjon. Eksogene translasjonene elementer og initieringskodoner kan være av forskjellige opprinnelser, både naturlige og syntetiske. Effektiviteten av ekspresjon kan forbedres ved inklusjon av enhancere som er passende for det spesielle celle-system som blir anvendt, så som de beskrevet i litteraturen (Scharf, D. et al.

(1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).

I tillegg kan en vertscellestamme velges for dens evne til å modulere ekspresjonen av de innsatte sekvensene eller til å prosessere det uttrykte protein på ønsket måte. Slike modifikasjoner av polypeptidet omfatter, men er ikke begrenset til, acetylering, karboksylering, glykosylering, fosforylering, lipidering og acylering. Post-translasjonell prosessering som spalter en "prepro" form av proteinet kan også anvendes for å lette korrekt insersjon, folding og/eller funksjon. Forskjellige vertsceller så som CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 og WI38, som har spesifikt cellulært maskineri og karakteristiske mekanismer for slike post-translasjonelle aktiviteter, kan velges for å sikre korrekt modifikasjon og prosessering av det fremmede proteinet.

For langvarig, høyutbytte produksjon av rekombinante proteiner, er stabil ekspresjon generelt foretrukket. For eksempel kan cellelinjer som stabilt uttrykker et polynukleotid av interesse omdannes ved anvendelse av ekspresjonsvektorer som kan inneholde virale replikasjonsorigoer og/eller endogene ekspresjonselementer og et selekterbart markørgen på samme eller på en separat vektor. Etter innføring av vektoren kan cellene få vokse i 1-2 dager i et anriket medium før de blir overført til selektivt medium. Formålet med den selekterbare markør er å gi resistens for seleksjon, og dens tilstedeværelse tillater vekst og gjenvinning av celler som vellykket uttrykker de innførte sekvenser. Resistente kloner av stabilt transformerte celler kan prolifereres ved anvendelse av vevkultur-teknikker passende for celletypen.

Hvilket som helst antall seleksjonssystemer kan anvendes for å gjenvinne transformerte cellelinjer. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, herpes simplex virus thymidin-kinase- (Wigler, M. et al. (1977) Cell 77:223-32) og adenin-fosforibosyltransferase- (Lowy, I. et al. (1990) Cell 22:817-23) gener som kan anvendes for henholdsvis tk.sup.- eller aprt.sup.- celler. Også antimetabolitt, antibiotisk eller herbicid resistens kan anvendes som basis for seleksjon; for eksempel dhfr som overbringer resistens til methotrexat (Wigler, M. et al. (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. 77:3567-70); npt, som overbringer resistens til aminoglykosidene, neomycin og G-418 (Colbere-Garapin, F. et al

(1981) J. Mol. Biol. 750:1-14); og als eller pat, som gir resistens til henholdsvis klorsulfuron og fosfinotricin-acetyltransferase (Murry, supra). Ytterligere selekterbare gener er beskrevet, for eksempel trpB som tillater celler å anvende indol istedenfor tryptofan, eller hisD som tillater celler å anvende histinol istedenfor histidin (Hartman, S. C. og R. C. Mulligan (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. 85:8047-51). Anvendelse av synlige markører har vunnet popularitet, idet slike markører som anthocyaniner, beta-glucuronidase og dens substrat GUS og luciferase og dens substrat luciferin, blir utstrakt anvendt ikke bare for å identifisere transformanter, men også for å kvantifisere mengden av transient eller stabil proteinekspresjon som kan tilskrives et spesifikt vektorsystem (Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).

Selv om tilstedeværelse/fravær av markørgenekspresjon indikerer at genet av interesse også er til stede, kan dets tilstedeværelse og ekspresjon trenge å bli bekreftet. For eksempel hvis sekvensen som koder for et polypeptid blir innsatt i en markør-gensekvens, kan rekombinante celler inneholdende sekvenser identifiseres ved fravær av markørgen-funksjon. Alternativt kan et markørgen være plassert tandem med en polypeptid-kodende sekvens under kontroll av en enkel promoter. Ekspresjon av markørgenet som respons på induksjon eller seleksjon indikerer vanligvis ekspresjon også av tandem-genet.

Alternativt kan vertsceller som inneholder og uttrykker en ønsket polynukleotidsekvens, identifiseres ved en rekke prosedyrer kjent for fagfolk på området. Disse prosedyrer omfatter, men er ikke begrenset til, DNA-DNA- eller DNA-RNA-hybridiseringer og protein-bioanalyse eller immunoassay-teknikker som omfatter, for eksempel membran-, løsning- eller chip-baserte teknologier for deteksjonen og/eller kvantifisering av nukleinsyre eller protein.

En rekke protokoller for detektering og måling av ekspresjonen av polynukleotid-kodede produkter, ved anvendelse av enten polyklonale eller monoklonale antistoffer spesifikke for produktet, er kjent på området. Eksempler omfatter enzym-bundede immunosorbent-forsøk (ELISA), radioimmunoassay (RIA) og fluorescens-aktivert celle-sortering (FACS). Et to-sete, monoklonal-basert immunoassay som anvender monoklonale antistoffer reaktive for to ikke-interfererende epitoper på et gitt polypeptid kan være foretrukket for noen anvendelser, men et kompetitivt bindingsforsøk kan også anvendes. Disse og andre forsøk er beskrevet, blant annet i Hampton, R. et al.

(1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.)

og Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 758:1211-1216).

En rekke merkings- og konjugeringsteknikker er kjent av fagfolk på området og kan anvendes i forskjellige nukleinsyre- og aminosyre-forsøk. Metoder for å produsere merkede hybridiserings- eller PCR-prober for detektering av sekvenser beslektet med polynukleotider omfatter oligomerking, nick- translasjon, ende-merking eller PCR-amplifisering ved anvendelse av et merket nukleotid. Alternativt kan sekvensene eller hvilke som helst deler derav klones inn i en vektor for produksjon av en mRNA-probe. Slike vektorer er kjent på området, er kommersielt tilgjengelige og kan anvendes for å syntetisere RNA-prober in vitro ved addisjon av en passende RNA-polymerase så som T7, T3 eller SP6 og merkede nukleotider. Disse prosedyrer kan utføres ved anvendelse av en rekke kommersielt tilgjengelige sett. Egnede rapportørmolekyler eller merker som kan anvendes, omfatter radionuklider, enzymer, fluorescerende, kjemiluminescente eller kromogene midler så vel som substrater, kofaktorer, inhibitorer, magnetiske partikler og lignende.

Vertsceller transformert med en polynukleotidsekvens av interesse kan dyrkes under betingelser egnet for uttrykk og gjenvinning av proteinet fra cellekultur. Proteinet produsert av en rekombinant celle kan utskilles eller inneholdes intracellulært avhengig av sekvensen og/eller vektoren som anvendes. Som det vil forstås av fagfolk på området kan ekspresjonsvektorer inneholdende polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse, utformes for å inneholde signalsekvenser som styrer sekresjon av det kodede polypeptid gjennom en prokaryot eller eukariot cellemembran. Andre rekombinante konstruksjoner kan anvendes for å forbinde sekvenser som koder for et polypeptid av interesse, med en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid-domene som vil lette rensning av oppløselige proteiner. Slike rensningslettende domener omfatter, men er ikke begrenset til, metall-chelaterende peptider så som histidin-tryptofan-moduler som tillater rensning på immobiliserte metaller, protein A-domener som tillater rensning på immobilisert immunoglobulin og domenet anvendt i FLAGS utvidelse/affinitet-rensningssystem (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Inklusjonen av spaltbare linker-sekvenser så som de spesifikke for Faktor XA eller enterokinase (Invitrogen. San Diego, Calif.) mellom rensingsdomenet og det kodede polypeptid kan anvendes for å lette rensning. Én slik ekspresjonsvektor tilveiebringer ekspresjon av et fusjonsprotein inneholdende et polypeptid av interesse og en nukleinsyre som koder for 6 histidinrester som går foran et tioredoxin- eller et enterokinase-spaltningssete. Histidinrestene letter rensning på IMIAC (immobilisert metallion-affinitetskromatografi) som beskrevet i Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281) mens enterokinase-spaltningssetet tilveiebringer en metode for rensning av det ønskede polypeptid fra fusjonsproteinet. En omtale av vektorer som inneholder fusjonsproteiner er gitt i Kroll, D. J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 72:441-453).

I tillegg til rekombinante produksjonsmetoder kan polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse og fragmenter derav, produseres ved direkte peptidsyntese ved anvendelse av fastfase-teknikker (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). Proteinsyntese kan utføres ved anvendelse av manuelle teknikker eller ved automatisering. Automatisert syntese kan oppnås for eksempel ved anvendelse av Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Eimer). Alternativt kan forskjellige fragmenter kjemisk syntetiseres separat og kombineres ved anvendelse av kjemiske metoder for å produsere full-lengde-molekylet.

Antistoff- preparater, fragmenter derav og andre bindemidler

I henhold til et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre bindemidler, så som antistoffer og antigen-bindende fragmenter derav, som viser immunologisk binding til et tumor-polypeptid beskrevet her eller til en del, variant eller derivat derav. Et antistoff eller antigen-bindende fragment derav, er angitt å "spesifikt binde," "immunogisk binde," og/eller er "immunologisk reaktivt" med et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse hvis det reagerer i et detekterbart nivå (i for eksempel et ELISA-forsøk) med polypeptidet og ikke reagerer detekterbart med ubeslektede polypeptider under lignende betingelser.

Immunologisk binding, som anvendt i denne sammenheng, angir generelt de ikke-kovalente interaksjoner av typen som forekommer mellom et immunoglobulin-molekyl og et antigen for hvilket immunoglobulinet er spesifikt. Styrken eller affiniteten av immunologiske bindingsinteraksjoner kan uttrykkes som dissosiasjonskonstanten (Kd) av interaksjonen, hvor en mindre Kdrepresenterer en større affinitet. Immunologiske bindingsegenskaper for valgte polypeptider kan kvantifiseres ved anvendelse av metoder velkjent på området. Én slik metode medfører måling av graden av antigen-bindingssete/antigenkompleks-dannelse og dissosiering, hvor gradene avhenger av konsentrasjonene av komplekspartnerene, affiniteten av interaksjon og geometriske parametere som likt innvirker på graden i begge retninger. Således kan både "på grad konstant" (Kon) og "av grad konstant"

(Koff) bestemmes ved beregning av konsentrasjonene og de aktuelle grader av assosiering og dissosiering. Forholdet av K0ff/Kon tillater kansellering av alle parametere ikke relatert til affinitet og er således lik dissosiasjonskonstanten Kd. Se generelt Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473.

Et "antigen-bindingssete," eller "bindingsdel" av et antistoff angir den del av immunoglobulin-molekylet som deltar i antigenbinding. Antigen-bindingssetet blir dannet av aminosyrerester i de N-terminale variable ("V") regioner av de tunge ("H") og lette ("L") kjeder. Tre meget divergente strekk innen V-regionene av de tunge og lette kjeder er referert til som "hypervariable regioner" som er innskutt mellom mer konserverte flankerende strekk kjent som "rammeverk-regioner," eller "FR". Således angir betegnelsen "FR" aminosyresekvenser som er naturlig funnet mellom og tilstøtende til hypervariable regioner i immunoglobuliner. I et antistoff-molekyl er de tre hypervariable regioner av en lettkjede og de tre hypervariable regioner av en tungkjede anbragt i forhold til hverandre i tredimensjonalt rom for å danne en antigen-bindende overflate. Antigen-bindingsoverflaten er komplementær til den tredimensjonelle overflate av et bundet antigen og de tre hypervariable regioner av hver av tung- og lett-kjedene er referert til som "komplementaritetsbestemmende regioner," eller "CDR."

Bindemidler kan videre være i stand til å differensiere mellom pasienter med og uten kreft, så som prostatakreft, ved anvendelse av de representative forsøk angitt her. For eksempel vil antistoffer eller andre bindemidler som binder til et tumorprotein, fortrinnsvis generere et signal som indikerer tilstedeværelse av kreft hos minst ca. 20% av pasienter med sykdommen, mer foretrukket minst ca. 30% av pasientene. Alternativt eller i tillegg vil antistoffet generere et negativt signal som indikerer fravær av sykdommen i minst ca. 90% av individer uten kreften. For å bestemme hvorvidt et bindemiddel tilfredsstiller dette krav, kan biologiske prøver ( f. eks. blod, sera, sputum, urin og/eller tumor-biopsier) fra pasienter med og uten kreft (som bestemt ved anvendelse av standard kliniske tester) undersøkes som beskrevet her for tilstedeværelse av polypeptider som binder til bindemidlet. Fortrinnsvis vil et statistisk signifikant antall prøver med og uten sykdommen bli undersøkt. Hvert bindemiddel må tilfredsstiller kriteriene ovenfor; imidlertid vil fagfolk på området forstå at bindemidler kan anvendes i kombinasjon for å forbedre sensitivitet.

Hvilket som helst middel som tilfredsstiller kravet ovenfor kan være et bindemiddel. For eksempel kan et bindemiddel være et ribosom, med eller uten en peptid-komponent, et RNA-molekyl eller et polypeptid. I en foretrukket utførelsesform er bindemidlet et antistoff eller et antigen-bindende fragment derav. Antistoffer kan fremstilles ved hvilken som helst av en rekke teknikker kjent for fagfolk på området. Se f. eks. Harlow og Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Generelt kan antistoffer produseres ved cellekultur-teknikker, omfattende dannelse av monoklonale antistoffer som beskrevet her eller via transfeksjon av antistoff-gener til egnede bakterielle eller pattedyrcelle-verter, for å tillate produksjon av rekombinante antistoffer. Ved én teknikk blir et immunogen omfattende polypeptidet initielt injisert i hvilket som helst av en rekke pattedyr ( f. eks. mus, rotter, kaniner, sauer eller geiter). I dette trinnet kan polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse tjene som immunogenet uten modifikasjon. Alternativt, spesielt for relativt korte polypeptider, kan en overlegen immunrespons fremkalles hvis polypeptidet er bundet til et bærer-protein, så som bovint serumalbumin eller keyhole limpet hemocyanin. Immunogenet blir injisert i dyreverten, fortrinnsvis i henhold til et forutbestemt skjema som omfatter én eller flere booster immuniseringer og dyrene blir tappet for blod periodisk. Polyklonale antistoffer spesifikke for polypeptidet kan deretter renses fra slike antisera ved for eksempel affinitetskromatografi ved anvendelse av polypeptidet koblet til en egnet fast bærer.

Monoklonale antistoffer spesifikke for et antigen-polypeptid av interesse kan for eksempel fremstilles ved anvendelse av teknikken til Kohler og Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519,1976 og forbedringer derav. Kort sagt involverer disse metoder fremstilling av udødelige cellelinjer som kan produsere antistoffer som har den ønskede spesifisitet ( dvs. reaktivitet med polypeptidet av interesse). Slike cellelinjer kan produseres fra for eksempel miltceller oppnådd fra et dyr immunisert som beskrevet ovenfor. Miltcellene blir deretter udødeliggjort ved for eksempel fusjon med en myelomcelle-fusjonspartner, fortrinnsvis én som er syngen med det immuniserte dyret. En rekke fusjons-teknikker kan anvendes. For eksempel kan miltcellene og myelomcellene kombineres med en ikke-ionisk detergent i noen få minutter og deretter plates ut med lav densitet på et selektivt medium som støtter veksten av hybridceller, men ikke myelomceller. En foretrukket seleksjonsteknikk anvender HAT-(hypoxantin, aminopterin, thymidin) seleksjon. Etter en tilstrekkelig tid, vanligvis ca. 1 til 2 uker, blir kolonier av hybrider observert. Enkle kolonier blir valgt og deres kultur-supernatanter testet for bindingsaktivitet mot polypeptidet. Hybridomer som har høy reaktivitet og spesifisitet er foretrukket.

Monoklonale antistoffer kan isoleres fra supernatantene av voksende hybridomkolonier. I tillegg kan forskjellige teknikker anvendes for å forbedre utbyttet, så som injeksjon av hybridomcellelinjen i peritoneal-hulen til en egnet virveldyrvert, så som en mus. Monoklonale antistoffer kan deretter høstes fra ascites-væsken eller blodet. Forurensninger kan fjernes fra antistoffene ved konvensjonelle metoder, så som kromatografi, gelfiltrering, utfelling og ekstraksjon. Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved rensingsprosessen i for eksempel et affinitetskromatografi-trinn.

Flere terapeutisk anvendelige molekyler er kjent på området, som omfatter antigen-bindingsseter som kan ha immunologiske bindingsegenskaper til et antistoff-molekyl. Det proteolytiske enzym papain spalter preferensielt IgG-molekyler, hvilket gir mange fragmenter, to av hvilke ("F(ab)" fragmenter) hver omfatter en kovalent heterodimer som omfatter et intakt antigen-bindingssete. Enzymet pepsin kan spalte IgG-molekyler for å gi mange fragmenter, omfattende "F(ab')2"-fragmentet som omfatter begge antigen-bindingsseter. Et "Fv"-fragment kan produseres av preferensiell proteolytisk spaltning av et IgM- og i sjeldne tilfeller et IgG- eller IgA-immunoglobulin-molekyl. Fv-fragmenter blir imidlertid mer vanlig utledet ved anvendelse av rekombinante teknikker kjent på området. Fv-fragmentet omfatter en ikke-kovalent VH::VLheterodimer omfattende et antigen-bindingssete som beholder meget av antigen-gjenkjennelses- og -bindings-kapasitetene til det native antistoff-molekylet. Inbar et al. (1972) Proe. Nat. Acad. Sei. USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706-2710; og Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096.

Et enkelkjede Fv- ("sFv") polypeptid er en kovalent bundet VH::VLheterodimer som blir uttrykt fra en genfusjon omfattende VH- og VL-kodende gener bundet av en peptid-kodende linker. Huston et al. (1988) Proe. Nat. Acad. Sei. USA 85(16):5879-5883. Flere metoder er beskrevet for å skille kjemiske strukturer for omdannelse av de naturlig aggregerte - men kjemisk separerte - lett- og tung-polypeptidkjeder fra en antistoff V-region til et sFv-molekyl som vil folde til en tre-dimensjonal struktur hovedsakelig lignende strukturen av et antigen-bindingssete. Se, f. eks. U.S. pat. nr. 5,091,513 og 5,132,405, til Huston et al.; og U.S. pat. nr. 4,946,778, til Ladner et al.

Hvert av de ovenfor beskrevne molekyler omfatter et tungkjede- og et lettkjede-CDR-sett, henholdsvis innskutt mellom et tungkjede- og et lettkjede-FR-sett som gir støtte til CDRS og definerer den romlige posisjon av CDR'ene i forhold til hverandre. Som anvendt her angir betegnelsen "CDR-sett" de tre hypervariable regioner av en tung- eller lettkjede V-region. Ved å starte fra N-terminus av en tung- eller lettkjede er disse regioner betegnet henholdsvis "CDR1," "CDR2," og "CDR3". Et antigen-bindingssete omfatter derfor seks CDR'er, omfattende CDR-settet fra hver av en tung- og en lettkjede V-region. Et polypeptid omfattende en enkel CDR, ( f. eks. en CDR1, CDR2 eller CDR3) er referert til her som en "molekylær gjenkjennelsesenhet." Krystal log råfisk analyse av flere antigen-antistoff-komplekser har demonstrert at aminosyre-restene i CDR danner omfattende kontakt med bundet antigen, hvor den mest omfattende antigenkontakt er med tungkjede CDR3. Således er de molekylære gjenkjennelsesenheter primært ansvarlige for spesifisiteten av et antigen-bindingssete.

Som anvendt her angir betegnelsen "FR-sett" de fire flankerende aminosyresekvenser som rammer inn CDR'ene i et CDR-sett av en tung- eller lettkjede V-region. Noen FR-rester kan kontakte bundet antigen; imidlertid er FR primært ansvarlig for folding av V-regionen i et antigen-bindingssete, spesielt FR-restene direkte tilstøtende CDR'ene. Innen FR er visse aminorester og visse strukturelle trekk meget sterkt konservert. I denne henseende inneholder alle V-region-sekvenser en indre disulfid-sløyfe på rundt 90 aminosyrerester. Når V-regionene folder til et bindingssete, blir CDR'ene vist som fremspringende sløyfemotiver som danner en antigen-bindende overflate. Det er generelt kjent at det er konserverte strukturelle regioner av FR'er som innvirker på den foldede form av CDR-sløyfer til visse "kanoniske" strukturer - uansett den nøyaktige CDR-aminosyresekvens. Videre er visse FR-rester kjent for å delta i ikke-kovalente interdomene-kontakter som stabiliserer interaksjonen av antistoff tunge og lette kjeder.

Flere "humaniserte" antistoff-molekyler omfattende et antigen-bindingssete avledet fra et ikke-humant immunoglobulin, er beskrevet, omfattende kimære antistoffer som har gnager V-regioner og deres assosierte CDR kondensert til humane konstante domener (Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86:4220-4224; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138:4534-4538; og Brown et al. (1987) Cancer Res. 47:3577-3583), gnager-CDRs podet inn i en human støttende FR før fusjon med et passende humant antistoff konstant domene (Riechmann et al.

(1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536; og Jones et al. (1986) Nature 321:522-525) og gnager-CDR støttet av rekombinant belagte gnager-FR (europeisk patentpublikasjon nr. 519,596, publisert 23. des. 1992). Disse "humaniserte" molekyler er utformet for å minimalisere uønsket immunologisk respons mot gnager-antihumane antistoff-molekyler som begrenser varigheten og effektiviteten av terapeutiske anvendelser av de grupper i humane mottagere.

Som anvendt her refererer betegnelsene "podet FR" og "rekombinant podet FR" til selektiv erstatning av FR-rester fra, f. eks. en gnager tung- eller lettkjede V-region, med humane FR-rester for å gi et xenogent molekyl omfattende et antigen-bindingssete som beholder hovedsakelig all den native FR-polypeptid-foldende struktur. Belegnings-teknikker er basert på forståelsen at ligandbindingskarakteristika for et antigen-bindingssete blir bestemt primært av strukturen og det relative arrangement av tung- og lettkjede CDR-sett innen den antigen-bindende overflaten. Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem.

59:439-473. Således kan antigen-bindingsspesifisitet konserveres hos et humanisert antistoff bare når CDR-strukturene, deres interaksjon med hverandre og deres interaksjon med resten av V-region- domenene blir nøye opprettholdt. Ved anvendelse av podningsteknikker, blir ytre ( f. eks. løsningsmiddel-aksessible) FR-rester som lett blir møtt av immunsystemet, selektivt erstattet med humane rester for å tilveiebringe et hybridmolekyl som omfatter enten en svakt immunogen eller hovedsakelig ikke-immunogen belagt overflate.

Fremgangsmåten ved podning anvender de tilgjengelige sekvensdata for humane antistoff variable domener samlet av Kabat et al., i Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987), oppdateringer av Kabat-databasen og andre tilgjengelige U.S. og utenlandske databaser (både nukleinsyre og protein). Løsningsmiddel-tilgjengeligheter for V-region- aminosyrer kan utledes fra den kjente tredimensjonale struktur av humane og murine antistoff-fragmenter. Det er to generelle trinn i belegning av et murint antigen-bindingssete. Initielt blir FR i de variable domener av et antistoff-molekyl av interesse, sammenlignet med tilsvarende FR-sekvenser i humane variable domener oppnådd fra de ovenfor angitte kilder. De mest homologe humane V-regioner blir deretter sammenlignet rest etter rest med tilsvarende murine aminosyrer. Restene i de murine FR som skiller seg fra det humane motstykke blir erstattet med restene til stede i den humane gruppen ved anvendelse av rekombinante teknikker velkjent på området. Rest-svitsjing blir bare utført med grupper som er minst delvis eksponert (løsningsmiddel-tilgjengelige) og forsiktighet blir utvist ved erstatning av aminosyrerester som kan ha en signifikant effekt på den tertiære struktur av V-region-domener, så som prolin, glycin og ladede aminosyrer.

På denne måten blir de resulterende "podede" murine antigen-bindingsseter således utformet for å beholde de murine CDR-rester, restene hovedsakelig tilstøtende CDR'ene, restene identifisert som gjemt eller for det meste gjemt (løsningsmiddel-utilgjengelige), restene antatt å delta i ikke-kovalente ( f. eks. elektrostatiske og hydrofobe) kontakter mellom tung- og lettkjede domener og restene fra konserverte strukturelle regioner av FR'ene som er antatt å innvirke på "kanoniske" tertiære strukturer av CDR-sløyfene. Disse design-kriterier blir deretter anvendt for å fremstille rekombinante nukleotidsekvenser som kombinerer CDR fra både tung- og lettkjede av et murint antigen-bindingssete til human-opptredende FR som kan anvendes for å transfektere pattedyrceller for ekspresjonen av rekombinante humane antistoffer som viser antigen-spesifisiteten til det murine antistoffmolekyl.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen kan monoklonale antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kobles til ett eller flere terapeutiske midler. Egnede midler i denne henseende omfatter radionuklider, differensierings-indusere, medikamenter, toksiner og derivater derav. Foretrukne radionuklider omfatter 90Y,123l,125l,1<3>1l,18<6>Re,<188>Re,<2>1<1>At og<212>Bi. Foretrukne medikamenter omfatter metotrexat og pyrimidin- og purin-analoger. Foretrukne differensierings-indusere omfatter porbolestere og smørsyre. Foretrukne toksiner omfatter ricin, abrin, difteri-toksin, kolera-toksin, gelonin, Pseudomonas exotoksin, Shigella-toksin og kermesbær antiviralt protein.

Et terapeutisk middel kan kobles ( f. eks. kovalent bundet) til et egnet monoklonalt antistoff enten direkte eller indirekte ( f. eks. via en linker-gruppe). En direkte reaksjon mellom et middel og et antistoff er mulig når hver har en substituent som kan reagere med den andre. For eksempel kan en nukleofil gruppe, så som en amino- eller sulfhydrylgruppe, på én være i stand til å reagere med en karbonyl-inneholdende gruppe, så som et anhydrid eller et syrehalogenid eller med en alkylgruppe inneholdende a god utgående gruppe ( f. eks. et halogenid) på den andre.

Alternativt kan det være ønskelig å koble et terapeutisk middel og et antistoff via en linker-gruppe. En linker-gruppe kan fungere som en spacer for å distansere et antistoff fra et agens for å unngå interferens med bindings-kapasiteter. En linker-gruppe kan også tjene til å øke den kjemiske reaktivitet til en substituent på et agens eller et antistoff og således øke koblings-effektiviteten. En økning i kjemisk reaktivitet kan også lette anvendelse av agens eller funksjonelle grupper på agenser, som på annen måte ikke ville være mulig.

Det vil være åpenbart for fagfolk på området at en rekke bifunksjonelle eller polyfunksjonelle reagenser, både homo- og hetero-funksjonelle (så som de beskrevet i katalogen til Pierce Chemical Co., Rockford, IL), kan anvendes som linkergruppe. Kobling kan utføres, for eksempel gjennom aminogrupper, karboksylgrupper, sulfhydrylgrupper eller oksyderte karbohydrat-rester. Det er en rekke referanser som beskriver slik metodikk, f. eks. U.S. patent nr. 4,671,958, til Rodwell et al.

Når et terapeutisk middel er kraftigere når fritt for antistoff-delen av immunokonjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan det være ønskelig å anvende en linker-gruppe som er spaltbar under eller etter internalisering i en celle. Flere forskjellige spaltbare linker-grupper er beskrevet. Mekanismene for intracellulær frigjøring av et agens fra disse linker-grupper omfatter spaltning ved reduksjon av en disulfidbinding ( f. eks. U.S. patent nr. 4,489,710, til Spitler), ved bestråling av en fotolabil binding ( f. eks. U.S. patent nr. 4,625,014, til Senter et al.), ved hydrolyse av derivatiserte aminosyre-sidekjeder ( f. eks. U.S. patent nr. 4,638,045, til Kohn et al.), ved serum komplement-mediert hydrolyse ( f. eks. U.S. patent nr. 4,671,958, til Rodwell et al.) og syrekatalysert hydrolyse ( f. eks. U.S. patent nr. 4,569,789, til Blattler et al.).

Det kan være ønskelig å koble mer enn ett middel til et antistoff. I én utførelsesform blir multiple molekyler av et agens koblet til ett antistoff-molekyl. I en annen utførelsesform kan mer enn én type agens være koblet til ett antistoff. Uansett den spesielle utførelsesform kan immunokonjugater med mer enn ett agens fremstilles på en rekke måter. For eksempel kan mer enn ett agens kobles direkte til et antistoff-molekyl, eller linkere som gir multiple seter for binding kan anvendes. Alternativt kan en bærer anvendes.

En bærer kan bære agensene på en rekke måter, omfattende kovalent binding enten direkte eller via en linker-gruppe. Egnede bærere omfatter proteiner så som albuminer ( f. eks. U.S. patent nr. 4,507,234, til Kato et al.), peptider og polysakkarider så som aminodekstran ( f. eks. U.S. patent nr. 4,699,784, til Shih et al.). En bærer kan også bære et agens ved ikke-kovalent binding eller ved innkapsling, så som i en liposom-vesikkel ( f. eks. U.S. patent nr. 4,429,008 og 4,873,088). Bærere spesifikke for radionuklid-midler omfatter radiohalogenerte små molekyler og chelaterende forbindelser. For eksempel beskriver U.S. patent nr. 4,735,792 representative radiohalogenerte små molekyler og deres syntese. Et radionuklid-chelat kan dannes fra chelaterende forbindelser som omfatter de som inneholder nitrogen- og svovelatomer som donor-atomer for binding av metall- eller metalloksyd-radionuklid. For eksempel beskriver U.S. patent nr. 4,673,562, til Davison et al. representative chelaterende forbindelser og deres syntese.

T- celle- preparater

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i et annet aspekt, T-celler spesifikke for et tumor-polypeptid beskrevet her eller for en variant eller derivat derav. Slike celler kan generelt fremstilles in vitro eller ex vivo, ved anvendelse av standard prosedyrer. For eksempel kan T-celler isoleres fra benmarg, perifert blod eller en fraksjon av benmarg eller perifert blod fra en pasient, ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig cellesepareringsystem, så som Isolex™ System, tilgjengelig fra Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; se også U.S. patent nr. 5,240,856; U.S. patent nr. 5,215,926; WO 89/06280; WO 91/16116 og WO 92/07243). Alternativt kan T-celler avledes fra beslektede eller ubeslektede humane, ikke-humane pattedyr, cellelinjer eller kulturer.

T-celler kan stimuleres med et polypeptid, polynukleotid som koder for et polypeptid og/eller en antigenpresenterende celle (APC) som uttrykker et slikt polypeptid. Slik stimulering blir utført under betingelser og i en tid tilstrekkelig til å tillate dannelse av T-celler som er spesifikke for polypeptidet av interesse. Fortrinnsvis er et tumor-polypeptid eller -polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse, til stede i en leveringskonstituent, så som en mikrokule, for å lette dannelsen av spesifikke T-celler.

T-celler er betraktet å være spesifikke for et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse hvis T-cellene spesifikt prolifererer, utskiller cytokiner eller dreper målceller belagt med polypeptidet eller uttrykker et gen som koder for polypeptidet. T-celle-spesifisitet kan evalueres ved anvendelse av hvilken som helst av en rekke standard teknikker. For eksempel indikerer, i et krom-frigjøringsforsøk eller proliferasjonsforsøk, en stimuleringsindeks på mer enn to ganger økning i lyse og/eller proliferasjon, sammenlignet med negative kontroller, T-celle-spesifisitet. Slike forsøk kan utføres, for eksempel som beskrevet i Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070,1994. Alternativt kan deteksjon av proliferasjonen av T-celler oppnås ved en rekke kjente teknikker. For eksempel kan T-celle-proliferasjon detekteres ved å måle en øket grad av DNA-syntese ( f. eks. ved puls-merking av kulturer av T-celler med tritiert thymidin og måling av mengden av tritiert thymidin innført i DNA). Kontakt med et tumor-polypeptid (100 ng/ml -100ug/ml, fortrinnsvis 200 ng/ml - 25 (ig/ml) i 3 - 7 dager vil typisk resultere i minst en to ganger økning i proliferasjon av T-cellene. Kontakt som beskrevet ovenfor i 2-3 timer skulle resultere i aktivering av T-cellene, som målt ved anvendelse av standard cytokinforsøk hvor en to ganger økning i nivået av cytokinfrigjøring ( f. eks. TNF eller IFN-y) er indikativ for T-celleaktivering ( se Coligan et al., Current Protocols in Immunologi, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)). T-celler som blir aktivert som respons på en tumor-polypeptid-, -polynukleotid eller -polypeptid-uttrykkende APC kan være CD4<+>og/eller CD8<+>. Tumor-polypeptid-spesifikke T-celler kan ekspanderes ved anvendelse av standard teknikker. I foretrukne utførelsesformer blir T-cellene tatt fra en pasient, en beslektet donor eller en ubeslektet donor og blir administrert til pasienten etter stimulering og ekspansjon.

For terapeutiske formål kan CD4<+>eller CD8<+>T-celler som prolifererer som respons på et tumor-polypeptid, -polynukleotid eller -APC utvides i antall enten in vitro eller in vivo. Proliferasjon av slike T-celler in vitro kan gjennomføres på en rekke måter. For eksempel kan T-cellene re-eksponeres for et tumor-polypeptid eller et kort peptid svarende til en immunogen del av et slikt polypeptid, med eller uten tilsetning av T-celle-vekstfaktorer, så som interleukin-2 og/eller stimulatorceller som syntetiserer et tumor-polypeptid. Alternativt kan én eller flere T-celler som prolifererer i nærvær av tumor-polypeptidet utvides i antall ved kloning. Metoder for kloning av celler er velkjent på området og omfatter begrensende fortynning.

Farmasøytiske preparater

I ytterligere utførelsesformer angår foreliggende oppfinnelse et preparat av én eller flere av polynukleotid-, polypeptid-, T-celle- og/eller antistoff-preparatene beskrevet her i farmasøytisk akseptable bærere for administrering til en celle eller et dyr, enten alene eller i kombinasjon med én eller flere andre terapimodaliteter.

Det vil forstås at om ønsket kan et preparat som beskrevet her administreres i kombinasjon med andre midler så vel, så som, f. eks. andre proteiner eller polypeptider eller forskjellige farmasøytisk aktive midler. Faktisk er det praktisk talt ingen grense for andre komponenter som også kan inkluderes, gitt at de ytterligere midler ikke forårsaker en betydelig ugunstig effekt ved kontakt med målcellene eller vertsvevene. Preparatene kan således leveres sammen med forskjellige andre midler som nødvendig i det spesielle tilfellet. Slike preparater kan renses fra vertsceller eller andre biologisk kilder eller kan alternativt syntetiseres kjemisk som beskrevet her. Likeledes kan slike preparater videre omfatte substituerte eller derivatiserte RNA- eller DNA-prepa rater.

I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes derfor farmasøytiske preparater omfattende ett eller flere av polynukleotid-, polypeptid-, antistoff- og/eller T-celle-preparatene beskrevet her i kombinasjon med en fysiologisk akseptabel bærer. I visse foretrukne utførelsesformer omfatter de farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse immunogene polynukleotid- og/eller polypeptid-preparater ifølge foreliggende oppfinnelse for anvendelse i profylaktiske og terapeutiske vaksine-anvendelser. Vaksine-fremstilling er generelt beskrevet i for eksempel M.F. Powell og M.J. Newman, ed., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press (NY, 1995). Generelt vil slike preparater omfatte ett eller flere polynukleotid- og/eller polypeptid-preparater ifølge foreliggende oppfinnelse i kombinasjon med én eller flere immunostimulanter.

Det vil være klart at hvilket som helst av de farmasøytiske preparater beskrevet her kan inneholde farmasøytisk akseptable salter av polynukleotidene og polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike salter kan fremstilles, for eksempel fra farmasøytisk akseptable ikke-toksiske baser, omfattende organiske baser ( f. eks. salter av primære, sekundære og tertiære aminer og basiske aminosyrer) og uorganiske baser ( f. eks. natrium-, kalium-, litium-, ammonium-, kalsium- og magnesium-salter).

I en annen utførelsesform omfatter illustrative immunogene preparater, f. eks. vaksinepreparater ifølge foreliggende oppfinnelse, DNA som koder for ett eller flere av polypeptidene som beskrevet ovenfor, slik at polypeptidet blir dannet in situ. Som angitt ovenfor kan polynukleotidet administreres i hvilket som helst av en rekke leveringssystemer kjent for fagfolk på området. En rekke genleveringsteknikker er faktisk velkjent på området, så som de beskrevet av Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 75:143-198, 1998 og referanser angitt der. Hensiktsmessige polynukleotid-ekspresjonssystemer vil selvfølgelig inneholde de nødvendige regulatoriske DNA-regulatorerekvenser for ekspresjon hos en pasient (så som en egnet promoter og termineringssignal). Alternativt kan bakterielle leveringssystemer involvere administrering av en bakterie (så som Bacillus- Calmette- Guerrin) som uttrykker en immunogen del av polypeptidet på dens celleoverflate eller utskiller en slik epitop.

I visse utførelsesformer blir derfor polynukleotider som koder for immunogene polypeptider beskrevet her, innført i egnede pattedyr-vertsceller for ekspresjon ved anvendelse av hvilken som helst av flere kjente viral-baserte systemer. I én illustrative utførelsesform gir retrovirus en hensiktsmessig og effektiv plattform for genleveringssystemer. En valgt nukleotidsekvens som koder for et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan innsettes i en vektor og pakkes i retrovirale partikler ved anvendelse av teknikker kjent på området. Det rekombinante virus kan deretter isoleres og leveres til et individ. Flere illustrative retrovirale systemerer beskrevet { f. eks. U.S. pat. nr. 5,219,740; Miller og Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al.

(1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:8033-8037; og Boris-Lawrie og Temin

(1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

I tillegg er flere illustrative adenovirus-baserte systemer også beskrevet.

I motsetning til retrovirus som integreres inn i vertsgenomet, forblir adenovirus ekstrakromosomalt og minimaliserer således risikoene forbundet med insersjonell mutagenese (Haj-Ahmad og Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mitterederet al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616-629; og Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476).

Forskjellige adeno-assosierte virus- (AAV) vektorsystemer er også utviklet for polynukleotid-levering. AAV-vektorer kan lett konstrueres ved anvendelse av teknikker velkjent på området. Se, f. eks. U.S. pat. nr. 5,173,414 og 5,139,941; internasjonale publikasjoner nr. WO 92/01070 og WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling og Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; og Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.

Ytterligere virale vektorer anvendelige for levering av polynukleotidene som koder for polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse ved genoverføring omfatter de avledet fra pox-familien av virus, så som vaccinia-virus og fugle-poxvirus. Eksempelvis kan vaccinia-virus-rekombinanter som uttrykker de nye molekyler, konstrueres som følger. DNA som koder for et polypeptid blir først innsatt i en passende vektor slik at det blir nabostilt til en vaccinia-promoter og flankerer vaccinia DNA-sekvenser, så som sekvensen som koder for thymidinkinase (TK). Denne vektor blir deretter anvendt for å transfektere celler som samtidig er infisert med vaccinia. Homolog rekombinering tjener til å innsette vaccinia-promoteren pluss genet som koder for polypeptidet av interesse i det virale genom. Den resulterende TK.sup.(-) rekombinant kan velges ved dyrking av cellene i nærvær av 5-bromdeoksyuridin og velge ut viralt plaque som er resistent for dette.

Et vaccinia-basert infeksjon/transfeksjon-system kan hensiktsmessig anvendes for å gi for induserbar, transient ekspresjon eller koekspresjon av ett eller flere polypeptider beskrevet her i vertsceller av en organisme. I dette spesielle systemet blir celler først infisert in vitro med en vaccinia-virus-rekombinant som koder for bakteriofagen T7 RNA-polymerase. Denne polymerase viser utmerket spesifisitet ved at den bare transkriberer templater som bærer T7-promotere. Etter infeksjon blir celler transfektert med polynukleotidet eller polynukleotidene av interesse, drevet av en T7-promoter. Polymerase uttrykt i cytoplasma fra vaccinia-virus-rekombinanten transkriberer det transfekterte DNA til RNA som deretter blir translatert til polypeptid av det vert-translasjonelle maskineri. Metoden tilveiebringer høynivå, transient, cytoplasmatisk produksjon av store mengder av RNA og dens translasjonsprodukter. Se f. eks. Elroy-Stein og Moss, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1990) 87:6743-6747; Fuerst et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1986) 83:8122-8126.

Alternativt kan avipoxvirus, så som fjærfe-pox- og kanari-pox-virus, også anvendes for å levere de kodende sekvensene av interesse. Rekombinante avipox virus, som uttrykker immunogenerfra pattedyr-patogener, er kjent å gi beskyttende immunitet når administrert til ikke-fuglearter. Anvendelse av en Avipox-vektor er spesielt ønskelig for humane og andre pattedyrarter siden medlemmer av Avipox-slekten bare kan replikere produktivt i mottagelige fuglearter og derfor er ikke-infektive i pattedyrceller. Metoder for å produsere rekombinante Avipoxvirus er kjent på området og anvender genetisk rekombinering, som beskrevet ovenfor med hensyn til fremstilling av vaccinia-virus. Se f. eks. WO 91/12882; WO 89/03429; og WO 92/03545.

Hvilken som helst av flere alfavirus-vektorer kan også anvendes for levering av polynukleotidpreparater ifølge foreliggende oppfinnelse, så som vektorene beskrevet i U.S. patent nr. 5,843,723; 6,015,686; 6,008,035 og 6,015,694. Visse vektorer basert på Venezuelan Equine Encephalitis (VEE) kan også anvendes, idet illustrative eksempler på disse kan finnes i U.S. patent nr. 5,505,947 og 5,643,576.

Videre kan molekylære konjugat-vektorer, så som de adenovirus kimære vektorer beskrevet i Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869 og Wagner et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1992) 89:6099-6103, også anvendes for genlevering ved oppfinnelsen.

Ytterligere illustrativ informasjon om disse og andre kjente viral-baserte leveringssystemer kan finnes, for eksempel i Fisher-Hoch et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sei. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; U.S. patent nr. 4,603,112, 4,769,330 og 5,017,487; WO 89/01973; U.S. patent nr. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627,1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 97:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; og Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993.

I visse utførelsesformer kan et polynukleotid integreres i genomet av en målcelle. Denne integrering kan skje i en spesifikk lokasjon og orientering via homolog rekombinering (generstatning) eller det kan integreres i en tilfeldig, ikke-spesifikk lokasjon (genøkning). I enda ytterligere utførelsesformer kan polynukleotidet holdes stabilt i cellen som et separat, episomalt segment av DNA. Slike polynukleotidsegmenter eller "episomer" koder for sekvenser tilstrekkelige til å tillate opprettholdelse og replikasjon uavhengig av eller synkronisert med vertscellecyklusen. Metoden ved hvilken ekspresjonskonstruksjonen blir levert til en celle og hvor i cellen polynukleotidet forblir, er avhengig av typen ekspresjonskonstruksjon som anvendes.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen blir et polynukleotid administrert/levert som "nakent" DNA, for eksempel som beskrevet i Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 og oversikt av Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Opptaket av nakent DNA kan økes ved å belegge DNA-et på bionedbrytbare kuler, som blir effektivt transportert inn i cellene.

I enda en annen utførelsesform kan et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse leveres via en partikkel-bombardement-metode, hvorav mange er beskrevet. I ett illustrativt eksempel kan gass-drevet partikkel-akselerasjon oppnås med anordninger så som de fremstilt av Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) og Powderject Vaccines Inc. (Madison, Wl), noen eksempler på disse er beskrevet i U.S. patent nr. 5,846,796; 6,010,478; 5,865,796; 5,584,807; og EP patent nr. 0500 799. Denne metoden gir en nål-fri leveringsmetode hvor et tørt pulverpreparat med mikroskopiske partikler, så som polynukleotid eller polypeptid-partikler, blir akselerert til høy hastighet i en heliumgass-stråle dannet med en håndholdt anordning, som driver partiklene inn i et aktuelt målvev.

I en beslektet utførelsesform omfatter andre anordninger og metoder som kan være anvendelige for gass-drevet nål-fri injeksjon av preparater ifølge foreliggende oppfinnelse, de gitt av Bioject, Inc. (Portland, OR), idet noen eksempler på disse er beskrevet i U.S. patent nr. 4,790,824; 5,064,413; 5,312,335; 5,383,851; 5,399,163; 5,520,639 og 5,993,412.

I henhold til en annen utførelsesform vil de farmasøytiske preparater beskrevet her omfatte én eller flere immunostimulanter i tillegg til de immunogene polynukleotid-, polypeptid-, antistoff-, T-celle- og/eller APC-preparater ifølge foreliggende oppfinnelse. En immunostimulant angir i det vesentlige hvilken som helst substans som forbedrer eller forsterker en immunrespons (antistoff- og/eller celle-mediert) til et eksogent antigen. Én foretrukket type av immunostimulant omfatter et adjuvans. Mange adjuvantia inneholder en substans utformet for å beskytte antigenet fra rask katabolisme, så som aluminiumhydroksyd eller mineralolje og en stimulator av immunresponser, så som lipid A-, Bortadella pertussis- eller Mycobacterium tuberculosis- av\ edede proteiner. Visse adjuvantia er kommersielt tilgjengelige, som for eksempel Freund's Incomplete Adjuvant og Complete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, Ml); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); aluminiumsalter så som aluminiumhydroksydgel (alun) eller aluminiumfosfat; salter av kalsium, jern eller sink; en uoppløselig suspensjon av acylert tyrosin; acylerte sukkere; kationiske eller anioniske derivatiserte polysakkarider; polyfosfazener; bionedbrytbare mikrokuler; monofosforyl-lipid A og quil A. Cytokiner, så som GM-CSF, interleukin-2, -7, -12 og andre lignende vekstfaktorer, kan også anvendes som adjvanser.

I visse utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er adjuvans-preparatet fortrinnsvis et som fremkaller en immunrespons overveiende av Th1- typen. Høye nivåer av Th1-type-cytokiner ( f. eks. IFN-y, TNFa, IL-2 og IL-12) tenderer til å favorisere induksjon av celle-medierte immunresponser til et administrert antigen. I motsetning tenderer høye nivåer av Th2-type-cytokiner ( f. eks. IL-4, IL-5, IL-6 og IL-10) til å favorisere induksjon av humorale immunresponser. Etter anvendelse av en vaksine som angitt her, vil en pasient støtte en immunrespons som omfatter Th1- og Th2-type responser. I en foretrukket utførelsesform, hvor en respons er overveiende Th1-type, vil nivået av Th1-type-cytokiner øke i større grad enn nivået av Th2-type cytokiner. Nivåene av disse cytokiner kan lett bedømmes ved anvendelse av standard forsøk. For en oversikt over cytokinfamiliene, se Mosmann og Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.

Visse foretrukne adjuvantia for å frembringe en overveiende Th1-type-respons omfatter for eksempel en kombinasjon av monofosforyl lipid A, fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyl lipid A, sammen med et aluminiumsalt. MPL<®>-adjuvantia er tilgjengelige fra Corixa Corporation (Seattle, WA; se for eksempel US-patent nr. 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 og 4,912,094). CpG-inneholdende oligonukleotider (hvor CpG-dinukleotidet er umetylert) fremkaller også en overveiende Th1-respons. Slike oligonukleotider er velkjente og er beskrevet i for eksempel WO 96/02555, WO 99/33488 og U.S. patent nr. 6,008,200 og 5,856,462. Immunostimulerende DNA-sekvenser er også beskrevet, for eksempel av Sato et al., Science 273:352,1996. Et annet foretrukket adjuvans omfatter et saponin, så som Quil A eller derivater derav, omfattende QS21 og QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escin; Digitonin; eller Gypsophila eller Chenopodium quinoa saponiner. Andre foretrukne preparater omfatter mer enn ett saponin i adjuvans-kombinasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel kombinasjoner av minst to av de følgende grupper omfattende QS21, QS7, Quil A, p-escin eller digitonin.

Alternativt kan saponin-preparater kombineres med vaksine-konstituenter sammensatt av chitosan eller andre polykationiske polymerer, polylaktid og polylaktid-co-glykolid partikler, poly-N-acetyl glucosamin-basert polymermatriks, partikler sammensatt av polysakkarider eller kjemisk modifiserte polysakkarider, liposomer og lipid-baserte partikler, partikler sammensatt av glycerolmonoestere, etc. Saponinene kan også formuleres i nærvær av cholesterol for å danne partikkelformede strukturer så som liposomer eller ISCOM. Videre kan saponinene formuleres sammen med en polyoksyetyleneter eller -ester, i enten en ikke-partikkelformet løsning eller suspensjon eller i en partikkelformet struktur så som et paucilamellert liposom eller ISCOM. Saponinene kan også formuleres med adjuvantia så som Carbopol<R>for å øke viskositet eller kan formuleres i en tørr pulverform med en pulver-adjuvans så som laktose.

I én foretrukket utførelsesform omfatter adjuvans-systemet kombinasjonen av et monofosforyl-lipid A og et saponin-derivat, så som kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL<®>adjuvans, som beskrevet i WO 94/00153 eller et mindre reaktogent preparat hvor QS21 blir behandlet med cholesterol, som beskrevet i WO 96/33739. Andre foretrukne preparater omfatter en olje-i-vann emulsjon og tocopherol. Et annet spesielt foretrukket adjuvans-preparat som anvender QS21, 3D-MPL® adjuvans og tocopherol i en olje-i-vann emulsjon er beskrevet i WO 95/17210.

Et annet forbedret adjuvans-system involverer kombinasjonen av et CpG-inneholdende oligonukleotid og et saponinderivat, spesielt er kombinasjonen av CpG og QS21 beskrevet i WO 00/09159. Fortrinnsvis omfatter preparatet i tillegg en olje-i-vann emulsjon og tocopherol.

Ytterligere illustrative adjuvantia for anvendelse i de farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter Montanid ISA 720 (Seppic, Frankrike), SAF (Chiron, California, USA), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), SBAS-serien av adjuvantia { f. eks. SBAS-2 eller SBAS-4, tilgjengelig fra SmithKline Beecham, Rixensart, Belgia), Detox (Enhanzyn<®>; Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) og andre aminoalkyl-glukosaminid-4-fosfater (AGP), så som de beskrevet i løpende U.S. patentsøknad nr. 08/853,826 og 09/074,720, idet beskrivelsene i disse er inntatt her ved referanse i deres helhet og polyoksyetylen-eter-adjuvantia så som de beskrevet i WO 99/52549A1.

Andre foretrukne adjuvantia omfatter adjuvans-molekyler med den generelle formel

(I): HO(CH2CH20)n-A-R,

hvor, n er 1 -50, A er en binding eller -C(O)-, R er C1.50alkyl eller fenyl C1.50alkyl.

En utførelsesform av oppfinnelsen består av et vaksinepreparat omfattende en polyoksyetyleneter med den generelle formel (I), hvor n er mellom 1 og 50, fortrinnsvis 4-24, mest foretrukket 9; R-komponenten er C1.50, fortrinnsvis C4-C20alkyl og mest foretrukket C12alkyl og A er en binding. Konsentrasjonen av polyoksyetylen-etere bør være i området 0,1-20%, fortrinnsvis fra 0,1-10% og mest foretrukket i området 0,1-1%. Foretrukne polyoksyetylen-etere er valgt fra den følgende gruppe: polyoksyetylen-9-lauryleter, polyoksyetylen-9-steoryleter, polyoksyetylen-8-steoryleter, polyoksyetylen-4-lauryleter, polyoksyetylen-35-lauryleter og polyoksyetylen-23-lauryleter. Polyoksyetylen-etere så som polyoksyetylen-lauryleter er beskrevet i the Merck Index (12. ed.: post 7717). Disse adjuvansmolekyler er beskrevet i WO 99/52549. Polyoksyetylen-eteren i henhold til den generelle formel (I) ovenfor kan, om ønsket, kombineres med et annet adjuvans. For eksempel er en foretrukket adjuvanskombinasjon fortrinnsvis med CpG som beskrevet i løpende UK patentsøknad GB 9820956,2.

I henhold til en annen utførelsesform av oppfinnelsen blir et immunogent preparat beskrevet her, levert til en vert via antigenpresenterende celler (APC), så som dendrittiske celler, makrofager, B-celler, monocytter og andre celler som kan konstrueres for å være effektive APCer. Slike celler kan, men trenger ikke, modifiseres genetisk for å øke kapasiteten for presentering av antigenet, for å forbedre aktivering og/eller opprettholdelse av T-celle-responsen, for å ha anti-tumor-effekter per se og/eller for å være immunologisk kompatible med mottageren ( dvs. matchet HLA-haplotype). APC kan generelt isoleres fra hvilken som helst av en rekke biologiske fluider og organer, omfattende tumor-og peritumoralt vev og kan være autologe, allogene, syngene eller xenogene celler.

Visse foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse anvender dendrittiske celler eller progenitorer derav som antigenpresenterende celler. Dendrittiske celler er meget kraftige APCer (Banchereau og Steinman, Nature 392:245-251,1998) og er vist å være effektive som et fysiologisk adjuvans for å frembringe profylaktisk eller terapeutisk antitumor-immunitet ( se Timmerman og Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999). Generelt kan dendrittiske celler identifiseres basert på deres typiske form (stjerneformet in situ, med markerte cytoplasmatiske prosesser (dendritter) synlig in vitro), deres evne til å ta opp, prosessere og presentere antigener med høy effektivitet og deres evne til å aktivere naive T-celle-responser. Dendrittiske celler kan selvfølgelig konstrueres for å uttrykke spesifikke celleoverflate-reseptorer eller -ligander som ikke er vanlig funnet på dendrittiske celler in vivo eller ex vivo og slike modifiserte dendrittiske celler er omfattet av foreliggende oppfinnelse. Som et alternativ til dendrittiske celler, kan utskilte veskikler antigen-lastede dendrittiske celler (betegnet exosomer) anvendes i en vaksine ( se Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998).

Dendrittiske celler og progenitorer kan oppnås fra perifert blod, benmarg, tumor-infiltrerende celler, peritumoralt vev-infiltrerende celler, lymfeknuter, milt, hud, navlestrengblod eller hvilket som helst annet egnet vev eller fluid. For eksempel kan dendrittiske celler differensieres ex vivo ved tilsetning av en kombinasjon av cytokiner så som GM-CSF, IL-4, IL-13 og/eller TNFa til kulturer av monocytter høstet fra perifert blod. Alternativt kan CD34 positive celler høstet fra perifert blod, navlestrengblod eller benmarg differensieres i dendrittiske celler ved tilsetning til dyrkningsmediet av kombinasjoner av GM-CSF, IL-3, TNFa, CD40 ligand, LPS, flt3 ligand og/eller andre forbindelse(r) som fremkaller differensiering, modning og proliferasjon av dendrittiske celler.

Dendrittiske celler blir hensiktsmessig kategorisert som "umodne" og "modne" celler, som gir en enkel måte å skille mellom to godt karakteriserte fenotyper. Imidlertid skal denne nomenklatur ikke anvendes for å utelukke alle mulige mellomstadier av differensiering. Umodne dendrittiske celler erkarakterisertsom APC med en høy kapasitet for antigenopptak og prosessering, som korrelerer med den høye ekspresjon av Fcy-reseptor og mannose-reseptor. Den modne fenotype er typiskkarakterisert veden lavere ekspresjon av disse markører, men en høy ekspresjon av celleoverflate-molekyler ansvarlig for T-celleaktivering så som klasse I og klasse II MHC, adhesjonsmolekyler ( f. eks. CD54 og CD11) og kostimulerende molekyler ( f. eks. CD40, CD80, CD86 og 4-1BB).

APC kan generelt transfekteres med et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse (eller del eller annen variant derav) slik at det kodede polypeptid eller en immunogen del derav, blir uttrykt på celleoverflaten. Slik transfeksjon kan skje ex vivo og et farmasøytisk preparat omfattende slike transfekterte celler kan deretter anvendes for terapeutiske formål, som beskrevet her. Alternativt kan en genleverings-konstituent som målsøker en dendrittisk eller annen antigenpresenterende celle, administreres til en pasient, hvilket resulterer i transfeksjon som skjer in vivo. In vivo og ex vivo transfeksjon av dendrittiske celler kan for eksempel generelt utføres ved anvendelse av hvilke som helst metoder kjent på området, så som de beskrevet i WO 97/24447 eller genpistol-metoden beskrevet av Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75:456-460, 1997. Antigen-lasting av dendrittiske celler kan oppnås ved inkubering av dendrittiske celler eller progenitorceller med tumor-polypeptidet, DNA (nakent eller i en plasmidvektor) eller RNA; eller med antigen-uttrykkende rekombinant bakterie eller virus ( f. eks. vaccinia-, fjærfepox-, adenovirus- eller lentivirus-vektorer). Før lasting kan polypeptidet være kovalent konjugert til en immunologisk partner som tilveiebringer T-celle-hjelp ( f. eks. et bærermolekyl). Alternativt kan en dendrittisk celle pulses med en ikke-konjugert immunologisk partner, separat eller i nærvær av polypeptidet.

Mens hvilken som helst egnet bærer kjent for fagfolk på området kan anvendes i de farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse, vil typen bærer typisk variere avhengig av administreringsmetoden. Preparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres for hvilken som helst passende administreringsmetode, omfattende foreksempel topisk, oral, nasal, mukosal, intravenøs, intrakranial, intraperitoneal, subkutan og intramuskulær administrering.

Bærere for anvendelse i slike farmasøytiske preparater er biokompatible og kan også være bionedbrytbare. I visse utførelsesformer gir preparatet fortrinnsvis et relativt konstant nivå av aktiv komponent-frigjøring. I andre utførelsesformer kan imidlertid raskere frigjøringshastighet umiddelbart etter administrering, være ønsket. Sammensetningen av slike preparater er godt innenfor kunnskapen til vanlige fagfolk på området ved anvendelse av kjente teknikker. Illustrative bærere anvendelige i denne henseende omfatter mikropartikler av poly(laktid-co-glykolid), polyakrylat, lateks, stivelse, cellulose, dekstran og lignende. Andre illustrative bærere med forsinket-frigjøring omfatter supramolekylære biovektorer, som omfatter en ikke-flytende hydrofil kjerne { f. eks. et kryssbundet polysakkarid eller oligosakkarid) og, eventuelt, et ytre lag omfattende en amfifil forbindelse, så som et fosfolipid ( se f. eks. U.S. patent nr. 5,151,254 og PCT-søknader WO 94/20078, WO/94/23701 og WO 96/06638). Mengden av aktiv forbindelse inneholdt i et preparat med forsinket frigjøring avhenger av implantasjonsstedet, hastigheten og forventet varighet av frigjøringen og av typen av tilstanden som skal behandles eller forhindres.

I en annen illustrativ utførelsesform blir bionedbrytbare mikrokuler ( f. eks. polylaktat-polyglykolat) anvendt som bærere for preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse. Egnede bionedbrytbare mikrokuler er beskrevet, for eksempel i U.S. patent nr. 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344, 5,407,609 og 5,942,252. Modifiserte hepatitt B kjerneprotein bærersystemer. så som beskrevet i WO/99 40934 og referanser angitt der, vil også være anvendelige for mange applikasjoner. Et annet illustrativt bærer/leveringssystem anvender en bærer omfattende partikkelformede-proteinkomplekser, så som de beskrevet i U.S. patent nr. 5,928,647, som kan fremkalle klasse l-begrensede cytotoksiske T-lymfocytt-responser hos en vert.

De farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse vil ofte videre omfatte én eller flere buffere ( f. eks. nøytral-bufret saltvann eller fosfatbufret saltvann), karbohydrater ( f. eks. glukose, mannose, sukrose eller dekstraner), mannitol, proteiner, polypeptider eller aminosyrer så som glycin, antioksydasjonsmidler, bakteriostatiske midler, chelaterende midler så som EDTA eller glutation, adjuvantia ( f. eks. aluminiumhydroksyd), oppløselige stoffer som gjør preparatet isotonisk, hypotonisk eller svakt hypertonisk med blodet til en mottager, suspenderingsmidler, fortykningsmidler og/eller konserveringsmidler. Alternativt kan preparater ifølge foreliggende oppfinnelse formuleres som et lyofilisat.

De farmasøytiske preparater beskrevet her kan presenteres i enhetsdose- eller multidose-beholdere, så som forseglede ampuller eller medisinglass. Slike beholdere blir typisk forseglet på en slik måte at de bevarer steriliteten og stabiliteten til preparatet inntil anvendelse. Generelt kan preparater lagres som suspensjoner, løsninger eller emulsjoner i oljeaktige eller vandige konstituenter. Alternativt kan et farmasøytisk preparat lagres i en frysetørket tilstand som bare krever tilsetning av en steril flytende bærer umiddelbart før anvendelse.

Utvikling av egnede doserings- og behandlingsregimer for anvendelse av de spesielle preparater beskrevet her i en rekke behandlingsregimer, omfattende f. eks. oral, parenteral, intravenøs, intranasal og intramuskulær administrering og formulering, er velkjent på området, hvorav noen er kort beskrevet nedenfor for generelle illustrasjonsformål.

I visse applikasjoner kan de farmasøytiske preparater beskrevet her leveres via oral administrering til et dyr. Som sådanne kan disse preparater formuleres med et inert fortynningsmiddel eller med en assimilerbar spiselig bærer eller de kan innelukkes i en hard- eller myk-skall gelatinkapsel eller de kan komprimeres til tabletter eller de kan innføres direkte med maten i dietten.

De aktive forbindelser kan også innføres med adjuvantia og anvendes i form av spiselige tabletter, buckale tabletter, trocher, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, kjeks og lignende (se for eksempel Matiowitz et al., Nature, 27. mars 1997; 386(6623):410-4; Hwang er al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998;15(3):243-84; U. S. patent 5,641,515; U. S. patent 5,580,579 og U.S. patent 5,792,451). Tabletter, trocher, piller, kapsler og lignende kan også inneholde hvilke som helst av en rekke ytterligere komponenter, for eksempel et bindemiddel, så som gummi tragant, akasie, maisstivelse eller gelatin; adjuvantia, så som dikalsiumfosfat; et desintegreringsmiddel, så som maisstivelse, potetstivelse, alginsyre og lignende; et smøremiddel, så som magnesiumstearat; og et søtningsmiddel, så som sukrose, laktose eller sakkarin kan tilsettes eller et smaksgivende middel, så som peppermynte-, vintergrønnolje- eller kirsebærsmak. Når doseenhetsformen er en kapsel, kan den inneholde, i tillegg til materialer av typen ovenfor, en flytende bærer. Forskjellige andre materialer kan være til stede som belegg eller for på annen måte å modifisere den fysiske form av doseenheten. For eksempel kan tabletter, piller eller kapsler belegges med skjellakk, sukker eller begge. Selvfølgelig må hvilket som helst materiale anvendt for fremstilling av hvilken som helst doseenhetsform være farmasøytisk rent og hovedsakelig ikke-toksisk i de anvendte mengdene. I tillegg kan de aktive forbindelser innføres i preparater og formuleringer med forlenget frigjøring.

Typisk vil disse preparater inneholde minst ca. 0,1% av den aktive forbindelse eller mer, selv om prosentdelen av den (de) aktive bestanddel(er) selvfølgelig kan varieres og kan hensiktsmessig være mellom ca. 1 eller 2% og ca. 60% eller 70% eller mer av vekten eller volumet av det totale preparatet. Naturligvis kan mengden av aktiv(e) forbindelse(r) i hvert terapeutisk anvendelige preparat fremstilles på en slik måte at en egnet dose vil oppnås i hvilken som helst gitt enhetsdose av forbindelsen. Faktorer så som oppløselighet, biotilgjengelighet, biologisk halveringstid, administreringsvei, produktholdbarhet, så vel som andre farmakologiske hensyn vil forstås av fagfolk på området fremstilling av slike farmasøytiske preparater og som sådanne, kan en rekke doser og behandlingsregimer være ønskelige.

For oral administrering kan preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse alternativt innføres med én eller flere adjuvantia i form av en munnvask, tannpasta, buckal tablett, oral spray eller sublingualt oralt-administrert preparat. Alternativt kan den aktive bestanddel innføres i en oral løsning så som én inneholdende natriumborat, glycerin og kaliumbikarbonat eller dispergert i en tannpasta eller tilsatt i en terapeutisk-effektiv mengde til et preparat som kan omfatte vann, bindemidler, abrasiver, smaksgivende midler, skummingsmidler og fuktighetsbevarende midler. Alternativt kan preparatene tilpasses i en tablett- eller løsnings-form som kan plasseres under tungen eller på annen måte oppløses i munnen.

Under visse omstendigheter vil det være ønskelig å levere de farmasøytiske preparater beskrevet her parenteralt, intravenøst, intramuskulært eller også intraperitonealt. Slike metoder er velkjente for fagfolk, hvorav noen er ytterligere beskrevet, for eksempel i U. S. patent 5,543,158; U.S. patent 5,641,515 og U. S. patent 5,399,363. I visse utførelsesformer kan løsninger av de aktive forbindelser som fri base eller farmakologisk akseptable salter fremstilles i vann, hensiktsmessig blandet med et overflateaktivt middel, så som hydroksypropylcellulose. Dispersjoner kan også fremstilles i glycerol, flytende polyetylenglykoler og blandinger derav og i oljer. Under vanlige lagringsbetingelser og anvendelse vil disse preparater generelt inneholde et konserveringsmiddel for å forhindre vekst av mikroorganismer.

Illustrative farmasøytiske former egnet for injiserbar anvendelse omfatter sterile vandige løsninger eller dispersjoner og sterile pulvere for ekstemporan fremstilling av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner (se for eksempel U.S. patent 5,466,468). I alle tilfeller må formen være steril og må være flytende i den grad at lett sprøytbarhet eksisterer. Den må være stabil under betingelsene for fremstilling og lagring og må konserveres mot den forurensende virkning av mikroorganismer, så som bakterier og sopper. Bæreren kan være et løsningsmiddel- eller dispersjons-medium inneholdende, for eksempel vann, etanol, polyol ( f. eks. glycerol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol og lignende), egnede blandinger derav og/eller vegetabilske oljer. Riktig fluiditet kan holdes, for eksempel ved anvendelse av et belegg, så som lecitin, ved opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelse i tilfellet av dispersjon og/eller ved anvendelse av overflateaktive midler. Forhindring av virkningen av mikroorganismer kan avhjelpes med forskjellige antibakterielle og antifungale midler, for eksempel parabener, klorbutanol, fenol, sorbinsyre, thimerosal og lignende. I mange tilfeller vil det være foretrukket å inkludere isotoniske midler, for eksempel sukkere eller natriumklorid. Forlenget absorpsjon av de injiserbare preparater kan frembringes ved anvendelse i preparatene av midler som forsinker absorpsjon, for eksempel aluminium-monostearat og gelatin.

I én utførelsesform for parenteral administrering i en vandig løsning, må løsningen være hensiktsmessig bufret hvis nødvendig og det flytende fortynningsmiddel først gjøres isotonisk med tilstrekkelig saltvann eller glukose. Disse spesielle vandige løsninger er spesielt egnet for intravenøs, intramuskulær, subkutan og intraperitoneal administrering. I denne forbindelsen vil et sterilt vandig medium som kan anvendes, være kjent for fagfolk på området i lys av foreliggende beskrivelse. For eksempel kan én dose oppløses i 1 ml isotonisk NaCI-løsning og enten settes til 1000 ml hypodermoklyse-væske eller injiseres på det foreslåtte infusjonssted (se for eksempel "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. Ed., sider 1035-1038 og 1570-1580). Noe variasjon av dose vil nødvendigvis forekomme avhengig av tilstanden til individet som behandles. Videre, for human administrering, vil preparatene selvfølgelig fortrinnsvis oppfylle sterilitet, pyrogenisitet og de generelle sikkerhets- og renhetsstandarder som nødvendig i henhold til FDA Office of Biologics standarder.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen kan preparatene beskrevet her formuleres i nøytral eller salt-form. Illustrative farmasøytisk akseptable salter omfatter syreaddisjonssaltene (dannet med de frie aminogrupper i proteinet) som blir dannet med uorganiske syrer så som for eksempel saltsyre eller fosforsyrer eller slike organiske syrer som eddiksyre, oksalsyre, vinsyre, mandelsyre og lignende. Salter dannet med de frie karboksylgrupper kan også være avledet fra uorganiske baser så som for eksempel natrium, kalium, ammonium, kalsium eller jern(lll) hydroksyder og slike organiske baser som isopropylamin, trimetylamin, histidin, prokain og lignende. Etter fremstilling vil løsninger administreres på en måte kompatibel med dosen av preparat og i en slik mengde som er terapeutisk effektiv.

Bærerene kan videre omfatte hvilket som helst og alle løsningsmidler, dispersjonsmedier, konstituenter, belegg, fortynningsmidler, antibakterielle og antifungale midler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler, buffere, bærer-løsninger, suspensjoner, kolloider og lignende. Anvendelse av slike medier og midler for farmasøytisk aktive substanser er velkjent på området. Bortsett fra hvis hvilket som helst konvensjonelt medium eller middel er inkompatibelt med den aktive bestanddel, er dets anvendelse i de terapeutiske preparater omfattet. Supplerende aktive bestanddeler kan også innføres i preparatene. Uttrykket "farmasøytisk akseptable" angir molekylære enheter og preparater som ikke produserer en allergisk eller lignende uheldig reaksjon når administrert til et menneske.

I visse utførelsesformer kan de farmasøytiske preparater leveres ved intranasale spray-preparater, inhalering og/eller andre aerosol-leverings-konstituenter. Metoder for levering av gener, nukleinsyrer og peptid preparater direkte til lungene via nasale aerosol spray-preparater er beskrevet i f. eks. U.S. patent 5,756,353 og U. S. patent 5,804,212. Likeledes er levering av medikamenter ved anvendelse av intranasale mikropartikkel-harpikser (Takenaga et al., J Controlled Release 2. mars 1998; 52(1-2):81-7) og lysofosfatidyl-glycerol forbindelser (U. S. patent 5,725,871) også velkjent på det farmasøytiske området. Likeledes er illustrativ transmukosal medikament-levering i form av en polytetrafluoretylen-bærermatriks beskrevet i U. S. patent 5,780,045.

I visse utførelsesformer blir liposomer, nanokapsler, mikropartikler, lipid-partikler, vesikler og lignende, anvendt for innføring av preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse i egnede vertsceller/organismer. Spesielt kan preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse formuleres for levering enten innkapslet i en lipid-partikkel, et liposom, en vesikkel, en nanosfære eller en nanopartikkel eller lignende. Alternativt kan preparater ifølge foreliggende oppfinnelse være bundet, enten kovalent eller ikke-kovalent, til overflaten av slike bærer-konstituenter.

Dannelse og anvendelse av liposom og liposom-lignende preparater som potensielle medikament-bærere er generelt kjent for fagfolk på området (se for eksempel Lasic, Trends Biotechnol, juli 1998; 16(7):307-21; Takakura, Nippon Rinsho, mars 1998; 56(3):691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. aug. 1997; 35(8):801-9; Margalit, Crit RevTher Drug Carrier Syst. 1995;12(2-3):233-61; U.S. patent 5,567,434; U.S. patent 5,552,157; U.S. patent 5,565,213; U.S. patent 5,738,868 og U.S. patent 5,795,587, hver spesifikt inntatt herved referanse i sin helhet).

Liposomer har vært anvendt med hell med flere celletyper som normalt er vanskelige å transfektere ved andre prosedyrer, omfattende T-cellesuspensjoner, primære hepatocytt-kulturer og PC 12-celler (Renneisen et al., J Biol Chem. 25. sep. 1990; 265(27):16337-42; Muller et al., DNA Cell Biol. april 1990; 9(3):221-9). I tillegg er liposomer fri for DNA-lengde-restriksjonene som er typiske for viral-baserte leveringssystemer. Liposomer har vært effektivt anvendt for å innføre gener, forskjellige medikamenter, radioterapeutiske midler, enzymer, virus, transkripsjonsfaktorer, allosteriske effektorer og lignende, i en rekke dyrkede cellelinjer og dyr. Videre synes anvendelse av liposomer ikke å være forbundet med autoimmunresponser eller uakseptabel toksisitet etter systemisk levering.

I visse utførelsesformer blir liposomer dannet fra fosfolipider som er dispergert i et vandig medium og spontant danner multilamellære konsentriske bilag-vesikler (også betegnet multilamellære vesikler (MLV).

Alternativt tilveiebringer oppfinnelsen i andre utførelsesformer, farmasøytisk akseptable nanokapsel-preparater av preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse. Nanokapsler kan generelt innkapsle forbindelser på en stabil og reproduserbar måte (se for eksempel Quintanar-Guerrero et al., Drug Devlnd Pharm. des. 1998; 24(12): 1113-28). For å unngå bivirkninger på grunn av intracellulær polymer overbelastning, kan slike ultrafine partikler (med størrelse rundt 0,1 |im) utformes ved anvendelse av polymerer som kan nedbrytes in vivo. Slike partikler kan fremstilles som beskrevet, for eksempel av Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988; 5(1): 1 -20; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. mars 1998; 45(2):149-55; Zambaux et al. J Controlled Release. 2. jan. 1998; 50(1-3):31-40; og U. S. patent 5,145,684.

Kreft- terapeutiske metoder

I ytterligere aspekter ved foreliggende oppfinnelse kan de farmasøytiske preparater beskrevet her, anvendes for behandling av kreft, spesielt for immunoterapi av prostatakreft. Ved slike metoder blir de farmasøytiske preparater beskrevet her administrert til en pasient, typisk et varmblodig dyr, fortrinnsvis et menneske. En pasient kan, men trenger ikke være rammet av kreft. Følgelig kan de farmasøytiske preparatene ovenfor anvendes for å forhindre utvikling av kreft eller for å behandle en pasient rammet av kreft. Farmasøytiske preparater og vaksiner kan administreres enten før eller etter kirurgisk fjerning av primære tumorer og/eller behandling så som administrering av radioterapi eller konvensjonelle kjemoterapeutiske medikamenter. Som beskrevet ovenfor kan administrering av de farmasøytiske preparater skje ved hvilken som helst egnet metode, omfattende administrering ved intravenøse, intraperitoneale, intramuskulære, subkutane, intranasale, intradermale, anale, vaginale, topiske og orale ruter.

I visse utførelsesformer kan immunoterapi være aktiv immunoterapi, hvor behandling er basert på in vivo stimulering av det endogene verts-immunsystem til å reagere mot tumorer ved administrering av immunrespons-modifiserende midler (så som polypeptider og polynukleotider som angitt her).

I andre utførelsesformer kan immunoterapi være passiv immunoterapi, hvor behandling involverer levering av midler med etablert tumor-immun-reaktivitet (så som effektorceller eller antistoffer) som kan direkte eller indirekte mediere antitumor-effekter og ikke nødvendigvis avhenger av et intakt verts-immunsystem. Eksempler på effektorceller omfatter T-celler som beskrevet ovenfor, T-lymfocytter (så som CD8<+>cytotoksiske T-lymfocytter og CD4<+>T-hjelper tumor-infiltrerende lymfocytter), dreperceller (så som naturlige dreperceller og lymfokin-aktiverte dreperceller), B-celler og antigenpresenterende celler (så som dendrittiske celler og makrofager) som uttrykker et polypeptid angitt her. T-celle-reseptorer og antistoffreseptorer spesifikke for polypeptidene angitt her kan klones, uttrykkes og overføres til andre vektorer eller effektorceller for adoptiv immunoterapi. Polypeptidene gitt her kan også anvendes for å danne antistoffer eller anti-idiotypiske antistoffer (som beskrevet ovenfor og i U.S. patent nr. 4,918,164) for passiv immunoterapi.

Effektorceller kan generelt oppnås i tilstrekkelige mengder for adoptiv immunoterapi ved vekst in vitro, som beskrevet her. Dyrkningsbetingelserfor utvidelse av enkle antigen-spesifikke effektorceller til mange milliarder i antall med bibehold av antigen-gjenkjennelse in vivo er velkjent på området. Slike in vitro kulturbetingelser anvender typisk periodevis stimulering med antigen, ofte i nærvær av cytokiner (så som IL-2) og ikke-delende mater-celler. Som angitt ovenfor kan immunoreaktive polypeptider som angitt her, anvendes for raskt å ekspandere antigen-spesifikke T-cellekulturer for å generere et tilstrekkelig antall av celler for immunoterapi. Spesielt kan antigenpresenterende celler, så som dendrittiske, makrofag, monocytt, fibroblast og/eller B-celler, pulses med immunoreaktive polypeptider eller transfekteres med ett eller flere polynukleotider ved anvendelse av standard teknikker velkjent på området. For eksempel kan antigenpresenterende celler transfekteres med et polynukleotid som har en promoter som passer for å øke ekspresjon i et rekombinant virus eller annet ekspresjonssystem. Dyrkede effektorceller for anvendelse ved terapi må være i stand til å vokse og fordeles bredt og til å overleve lang tid in vivo. Undersøkelser har vist at dyrkede effektorceller kan induseres til å vokse in vivo og til å overleve lang tid i vesentlige antall ved gjentatt stimulering med antigen supplert med IL-2 (se for eksempel Cheever et al., Immunological Reviews 757:177, 1997).

Alternativt kan en vektor som uttrykker et polypeptid angitt her, innføres i antigenpresenterende celler tatt fra en pasient og propageres ved kloning ex vivo for å transplanteres tilbake til samme pasient. Transfekterte celler kan gjeninnføres hos pasienten ved anvendelse av hvilken som helst metode kjent på området, fortrinnsvis i steril form ved intravenøs, intrakavital, intraperitoneal eller intratumor administrering.

Metoder og administreringshyppighet for de terapeutiske preparater beskrevet her, så vel som dose, vil variere fra individ til individ og kan lett etableres ved anvendelse av standard teknikker. Generelt kan de farmasøytiske preparater og vaksiner administreres ved injeksjon { f. eks. intrakutan, intramuskulær, intravenøs eller subkutan), intranasalt ( f. eks. ved aspirering) eller oralt. Fortrinnsvis kan mellom 1 og 10 doser administreres over en 52 ukers periode. Fortrinnsvis kan 6 doser administreres, med intervaller på 1 måned og booster vaksinasjoner kan gis periodisk deretter. Alternativt kan protokoller tilpasses for individuelle pasienter. En egnet dose er en mengde av en forbindelse som, når administrert som beskrevet ovenfor, kan fremme en anti-tumor-immunrespons og er minst 10-50% over det basale ( dvs. ubehandlede) nivå. Slik respons kan overvåkes ved å måle anti-tumor-antistoffer hos en pasient eller ved vaksine-avhengig dannelse av cytolytiske effektorceller som kan drepe pasientens tumorceller in vitro. Slike vaksiner må også være i stand til å forårsake en immunrespons som fører til et forbedret klinisk resultat ( f. eks. hyppigere remisjoner, fullstendig eller partiell eller lenger sykdomsfri overlevelse) hos vaksinerte pasienter sammenlignet med ikke- vaksinerte pasienter. Generelt, for farmasøytiske preparater og vaksiner omfattende ett eller flere polypeptider, er mengden av hvert polypeptid til stede i en dose i området fra ca. 25 \ ±g til 5 mg pr. kg av pasient. Egnede dosestørrelser vil variere med størrelsen av pasienten, men vil typisk være i området fra ca. 0,1 ml til ca. 5 ml.

Generelt gir en passende dose og behandlingsregime den (de) aktive forbindelse(r) i en mengde tilstrekkelig til å gi terapeutisk og/eller profylaktisk nytte. En slik respons kan overvåkes ved etablering av et forbedret klinisk resultat ( f. eks. hyppigere remisjoner, fullstendig eller partiell eller lenger sykdomsfri overlevelse) hos behandlede pasienter sammenlignet med ikke-behandlede pasienter. Økninger i preeksisterende immunresponser for et tumorprotein korrelerer generelt med et forbedret klinisk resultat. Slike immunresponser kan generelt evalueres ved anvendelse av standard proliferasjons-, cytotoksisitets- eller cytokin-forsøk, som kan utføres ved anvendelse av prøver tatt fra en pasient før og etter behandling.

Kreftdeteksion og diagnostiske preparater, metoder og sett

Generelt kan kreft detekteres hos en pasient basert på tilstedeværelsen av ett eller flere prostatatumorproteiner og/eller polynukleotider som koder for slike proteiner i en biologisk prøve (for eksempel blod, sera, sputum, urin og/eller tumorbiopsier) tatt fra pasienten. Med andre ord kan slike proteiner anvendes som markører for å indikere nærvær eller fravær av kreft så som prostatakreft. I tillegg kan slike proteiner være anvendelige for deteksjon av annen kreft. Bindemidlene gitt her tillater generelt deteksjon av nivået av antigen som binder til midlet i den biologiske prøven. Polynukleotid-primere og -prober kan anvendes for å detektere nivået av mRNA som koder for et tumorprotein, som også er indikativt for nærvær eller fravær av kreft. Generelt skal en prostatatumor-sekvens være til stede i et nivå som er minst tre ganger høyere i tumorvev enn i normalt vev.

Det finnes en rekke forsøksformater kjent for fagfolk på området for anvendelse av et bindemiddel for å detektere polypeptid-markører i en prøve. Se f. eks. Harlowog Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Generelt kan nærvær eller fravær av kreft hos en pasient bestemmes ved (a) å bringe en biologisk prøve tatt fra en pasient i kontakt med et bindemiddel; (b) å detektere i prøven et nivå av polypeptid som binder til bindemidlet; og (c) sammenligne nivået av polypeptid med en forutbestemt avkuttingsverdi.

I en foretrukket utførelsesform involverer forsøket anvendelse av bindemiddel immobilisert på en fast bærer for å binde til og fjerne polypeptidet fra resten av prøven. Det bundede polypeptidet kan deretter detekteres ved anvendelse av et deteksjonsreagens som inneholder en rapportørgruppe og spesifikt binder til bindemiddel/polypeptid-komplekset. Slike deteksjonsreagenser kan for eksempel omfatte et bindemiddel som spesifikt binder til polypeptidet eller et antistoff eller annet middel som spesifikt binder til bindemidlet, så som et anti-immunoglobulin, protein G, protein A eller et lectin. Alternativt kan et kompetitivt forsøk anvendes, hvor et polypeptid blir merket med en rapportørgruppe og får binde til det immobiliserte bindemidlet etter inkubering av bindemidlet med prøven. Graden i hvilken komponenter av prøven hemmer bindingen av det merkede polypeptid til bindemidlet er indikativt for reaktiviteten til prøven med det immobiliserte bindemidlet. Egnede polypeptider for anvendelse i slike forsøk omfatter full-lengde prostatatumorproteiner og polypeptid-deler derav til hvilke bindemidlet binder, som beskrevet ovenfor.

Den faste bæreren kan være hvilket som helst materiale kjent for fagfolk på området til hvilket tumorproteinet kan bindes. For eksempel kan den faste bæreren være en testbrønn i en mikrotiterplate eller en nitrocellulose eller annen egnet membran. Alternativt kan bæreren være en kule eller skive, så som glass, fiberglass, latex eller et plastmateriale så som polystyren eller polyvinylklorid. Bæreren kan også være en magnetisk partikkel eller en fiberoptisk sensor, så som de beskrevet i for eksempel U.S. patent nr. 5,359,681. Bindemidlet kan immobiliseres på den faste bæreren ved anvendelse av en rekke teknikker kjent for fagfolk på området, som er godt beskrevet i patent- og vitenskaps-litteratur. I sammenheng med foreliggende oppfinnelse angir betegnelsen "immobilisering" både ikke-kovalent assosiering, så som adsorpsjon og kovalent binding (som kan være en direkte binding mellom midlet og funksjonelle grupper på bæreren eller kan være en binding med et kryssbindende middel). Immobilisering ved adsorpsjon til en brønn i en mikrotiter-plate eller til en membran er foretrukket. I slike tilfeller kan adsorpsjon oppnås ved å bringe bindemidlet, i en egnet buffer, i kontakt med den faste bæreren i en egnet tidsperiode. Kontakttiden varierer med temperatur, men er typisk mellom ca. 1 time og ca. 1 dag. Generelt er å bringe en brønn i en plastisk mikrotiter-plate (så som polystyren eller polyvinylklorid) i kontakt med en mengde av bindemiddel i området fra ca. 10 ng til ca. 10 |ig og fortrinnsvis ca. 100 ng til ca. 1 ug, tilstrekkelig til å immobilisere en tilstrekkelig mengde av bindemiddel.

Kovalent binding av bindemiddel til en fast bærer kan generelt oppnås ved først å omsette bæreren med et bifunksjonelt reagens som vil reagere med både bæreren og en funksjonell gruppe, så som en hydroksyl- eller aminogruppe, på bindemidlet. For eksempel kan bindemidlet kovalent bindes til bærere som har et passende polymerbelegg ved anvendelse av benzokinon eller ved kondensering av en aldehyd-gruppe på bæreren med et amin og et aktivt hydrogen på bindingspartneren (se f. eks. Pierce Immunotechnologi Catalog and Handbook, 1991, ved A12-A13).

I visse utførelsesformer er forsøket et to-antistoff sandwich-forsøk. Dette forsøket kan utføres ved først å bringe et antistoff som er immobilisert på en fast bærer, vanligvis brønnen i en mikrotiterplate, i kontakt med prøven, slik at polypeptider i prøven får binde til det immobiliserte antistoffet. Ubundet prøve blir deretter fjernet fra de immobiliserte polypeptid-antistoff-komplekser og et deteksjonsreagens (fortrinnsvis et andre antistoff i stand til å binde til et forskjellig sete på polypeptidet) inneholdende en rapportørgruppe blir tilsatt. Mengden av deteksjonsreagens som forblir bundet til den faste bæreren blir deretter bestemt ved anvendelse av en metode som passer for den spesifikke rapportørgruppe.

Mer spesifikt, når antistoffet er immobilisert på bæreren som beskrevet ovenfor blir de resterende protein-bindingsseter på bæreren typisk blokkert. Hvilket som helst egnet blokkerende middel kjent for fagfolk på området, så som bovint serumalbumin eller Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Det immobiliserte antistoffet blir deretter inkubert med prøven og polypeptid får binde til antistoffet. Prøven kan fortynnes med et egnet fortynningsmiddel, så som fosfat-bufret saltvann (PBS) før inkubering. Generelt er en passende kontakttid { dvs. inkuberingstid) et tidsrom som er tilstrekkelig til å detektere tilstedeværelsen av polypeptid i en prøve tatt fra et individ med prostatakreft. Fortrinnsvis er kontakttiden tilstrekkelig til å oppnå et nivå av binding som er minst ca. 95% av det oppnådd ved likevekt mellom bundet og ubundet polypeptid. Fagfolk på området vil forstå at tiden som er nødvendig for å oppnå likevekt lett kan bestemmes ved bestemmelse av nivået av binding som skjer over et tidsrom. Ved romtemperatur er en inkuberingstid på ca. 30 minutter generelt tilstrekkelig.

Ubundet prøve kan deretter fjernes ved vasking av den faste bæreren med en passende buffer, så som PBS inneholdende 0,1% Tween 20™. Det andre antistoff, som inneholder en rapportørgruppe, kan deretter settes til den faste bæreren. Foretrukne rapportørgrupper omfatter gruppene angitt ovenfor.

Deteksjonsreagenset blir deretter inkubert med det immobiliserte antistoff-polypeptid-komplekset i et tidsrom tilstrekkelig til å detektere det bundede polypeptidet. Et passende tidsrom kan generelt bestemmes ved bestemmelse av nivået av binding som skjer over et tidsrom. Ubundet deteksjonsreagens blir deretter fjernet og bundet deteksjonsreagens blir detektert ved anvendelse av rapportørgruppen. Metoden anvendt for detektering av rapportørgruppen avhenger av typen av rapportørgruppen. For radioaktive grupper er scintillasjonstelling eller autoradiografiske metoder generelt hensiktsmessige. Spektroskopiske metoder kan anvendes for å detektere fargemidler, luminiscerende grupper og fluorescerende grupper. Biotin kan detekteres ved anvendelse av avidin, koblet til en annen rapportørgruppe (vanligvis en radioaktiv eller fluorescerende gruppe eller et enzym). Enzym-rapportørgrupper kan generelt detekteres ved tilsetning av substrat (generelt i en spesifikk tidsperiode), fulgt av spektroskopisk eller annen analyse av reaksjonsproduktene.

For å bestemme nærvær eller fravær av kreft, så som prostatakreft, blir signalet detektert fra rapportørgruppen som forblir bundet til den faste bæreren, generelt sammenlignet med et signal som svarer til en forutbestemt avkuttingsverdi. I én foretrukket utførelsesform er avkuttingsverdien for deteksjon av kreft det gjennomsnittlige middelsignal oppnådd når det immobiliserte antistoffet blir inkubert med prøver fra pasienter uten kreft. Generelt er en prøve som genererer et signal som er tre standardavvik over den forutbestemte avkuttingsverdi, betraktet positiv for kreft. I en alternativ foretrukket utførelsesform blir avkuttingsverdien bestemt ved anvendelse av en Receiver Operator Curve, i henhold til metoden ifølge Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, s. 106-7. Kort sagt, i denne utførelsesform kan avkuttingsverdien bestemmes fra et plot av par med sanne positive verdier ( dvs. sensitivitet) og falske positive verdier (100% spesifisitet) som svarer til hver mulige avkuttingsverdi for det diagnostiske testresultatet. Avkuttingsverdien for plottet som er den nærmest det øvre venstre hjørne ( dvs. verdien som omfatter det største arealet) er den mest nøyaktige avkuttingsverdi og en prøve som genererer et signal som er høyere enn avkuttingsverdien bestemt ved denne metoden kan betraktes positiv. Alternativt kan avkuttingsverdien skiftes til venstre langs plottet, for å minimalisere den falske positive verdi eller til høyre, for å minimalisere den falske negative verdi. Generelt er en prøve som genererer et signal som er høyere enn avkuttingsverdien bestemt ved denne metoden, betraktet positiv for kreft.

I en beslektet utførelsesform blir forsøket utført i et gjennomstrømnings-eller strimmeltest-format, hvor bindemidlet blir immobilisert på en membran, så som nitrocellulose. I gjennomstrømningstesten binder polypeptider i prøven til det immobiliserte bindemidlet ettersom prøven passerer gjennom membranen. Et andre, merket bindemiddel binder deretter til bindemiddel-polypeptid-komplekset ettersom en løsning inneholdende det andre bindemiddel strømmer gjennom membranen. Deteksjonen av bundet andre bindemiddel kan deretter utføres som beskrevet ovenfor. I strimmeltest-formatet blir én ende av membranen til hvilken bindemiddel er bundet, nedsenket i en løsning inneholdende prøven. Prøven migrerer langs membranen gjennom et område inneholdende det andre bindemiddel og til området av immobilisert bindemiddel. Konsentrasjon av det andre bindemiddel i området med immobilisert antistoff indikerer tilstedeværelse av kreft. Typisk danner konsentrasjonen av det andre bindemiddel på det stedet et mønster, så som en linje, som kan leses visuelt. Fravær av et slikt mønster indikerer et negativt resultat. Generelt blir mengden av bindemiddel immobilisert på membranen valgt for å danne et visuelt skjelnbart mønster når den biologiske prøven inneholder et nivå av polypeptid som ville være tilstrekkelig til å danne et positivt signal i to-antistoff sandwich-forsøket, i formatet beskrevet ovenfor. Foretrukne bindemidler for anvendelse i slike forsøk er antistoffer og antigen-bindende fragmenter derav. Fortrinnsvis er mengden av antistoff immobilisert på membranen, i området fra ca. 25 ng til ca. 1 ^g og mer foretrukket fra ca. 50 ng til ca. 500 ng. Slike tester kan typisk utføres med en meget liten mengde biologisk prøve.

Selvfølgelig eksisterer en rekke andre forsøksprotokoller som er egnet for anvendelse med tumorproteinene eller bindemidlene ifølge foreliggende oppfinnelse. Beskrivelsene ovenfor skal bare være eksempler. For eksempel vil det være klart for fagfolk på området at protokollene ovenfor lett kan modifiseres til å anvende tumor-polypeptiderfor å detektere antistoffer som binder til slike polypeptider i en biologisk prøve. Deteksjonen av slike tumorprotein-spesifikke antistoffer kan korrelere med tilstedeværelse av kreft.

Kreft kan også eller alternativt, detekteres basert på tilstedeværelsen av T-celler som spesifikt reagerer med et tumorprotein i en biologisk prøve. Ved visse metoder blir en biologisk prøve omfattende CD4<+>og/eller CD8<+>T-celler isolert fra en pasient, inkubert med et tumorpolypeptid, et polynukleotid som koder for et slikt polypeptid og/eller APC som uttrykker minst én immunogen del av et slikt polypeptid, og nærvær eller fravær av spesifikk aktivering av T-cellene blir detektert. Egnede biologiske prøver omfatter, men er ikke begrenset til, isolerte T-celler. For eksempel kan T-celler isoleres fra en pasient ved rutine-teknikker (så som ved Ficoll/Hypaque-densitet gradient-sentrifugering av perifert blod-lymfocytter). T-celler kan inkuberes in vitro i 2-9 dager (typisk 4 dager) ved 37°C med polypeptid ( f. eks. 5 - 25ng/ml). Det kan være ønskelig å inkubere en annen aliquot av en T-celle-prøve i fravær av tumor-polypeptid for å tjene som kontroll. For CD4<+>T-celler blir aktivering fortrinnsvis detektert ved å bedømme proliferasjon av T-cellene. For CD8<+>T-celler blir aktivering fortrinnsvis detektert ved å bedømme cytolytisk aktivitet. Et nivå av proliferasjon som er minst to ganger større og/eller et nivå av cytolytisk aktivitet som er minst 20% større enn hos sykdomsfrie pasienter indikerer tilstedeværelse av kreft hos pasienten.

Som angitt ovenfor kan kreft også eller alternativt detekteres basert på nivået av mRNA som koder for et tumorprotein i en biologisk prøve. For eksempel kan minst to oligonukleotid-primere anvendes i et polymerasekjedereaksjon- (PCR) basert forsøk for å amplifisere en del av tumor-cDNA avledet fra en biologisk prøve, hvor minst én av oligonukleotid-primerene er spesifikke for ( dvs. hybridiserertil) et polynukleotid som koder for tumorproteinet. Det amplifiserte cDNA blir deretter separert og detektert ved anvendelse av teknikker velkjent på området, så som gelelektroforese. Tilsvarende kan oligonukleotid-prober som spesifikt hybridiserertil et polynukleotid som koder for et tumorprotein, anvendes i et hybridiseringsforsøk for å detektere tilstedeværelse av polynukleotid som koder for tumorproteinet i en biologisk prøve.

For å tillate hybridisering under forsøksbetingelser, må oligonukleotid-primere og -prober omfatte en oligonukleotidsekvens som har minst ca. 60%, fortrinnsvis minst ca. 75% og mer foretrukket minst ca. 90%, identitet til en del av et polynukleotid som koder for et tumorprotein ifølge foreliggende oppfinnelse som er minst 10 nukleotider og fortrinnsvis minst 20 nukleotider, i lengde. Fortrinnsvis hybridiserer oligonukleotid-primere og/eller -prober til et polynukleotid som koder for et polypeptid beskrevet her under moderat stringente betingelser, som definert ovenfor. Oligonukleotid-primere og/eller -prober som hensiktsmessig kan anvendes i de diagnostiske metodene beskrevet her, er fortrinnsvis minst 10-40 nukleotider lange. I en foretrukket utførelsesform omfatter oligonukleotid-primerene minst 10 påfølgende nukleotider, mer foretrukket minst 15 påfølgende nukleotider, av et DNA-molekyl som har en sekvens som beskrevet her. Teknikker for både PCR-baserte forsøk og hybridiseringsforsøk er velkjent på området (se for eksempel Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 57:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).

Ett foretrukket forsøk anvender RT-PCR, hvor PCR blir anvendt sammen med revers transkripsjon. Typisk blir RNA ekstrahert fra en biologisk prøve, så som biopsivev og blir revers transkribert for å produsere cDNA-molekyler. PCR-amplifisering ved anvendelse av minst én spesifikk primer genererer et cDNA-molekyl, som kan separeres og visualiseres ved anvendelse av, for eksempel gelelektroforese. Amplifisering kan utføres på biologiske prøver tatt fra en testpasient og fra et individ som ikke er rammet av kreft. Amplifiseringsreaksjonen kan utføres på mange fortynninger av cDNA som spenner over størrelsesordener. En to-ganger eller større økning i ekspresjon i mange fortynninger av test-pasient-prøven sammenlignet med samme fortynninger av en ikke-cancerøs prøve blir typisk betraktet positiv.

Ved en annen utførelsesform kan preparatene beskrevet her, anvendes som markører for progresjonen av kreft. I denne utførelsesform kan forsøk som beskrevet ovenfor for diagnose av kreft utføres over tid og forandringen i nivået av reaktive polypeptid(er) eller polynukleotid(er) evalueres. For eksempel kan forsøkene utføres hver 24-72 timer i en periode på 6 måneder til 1 år og deretter utføres etter behov. Generelt utvikles kreft hos de pasienter hvor nivået av polypeptid eller polynukleotid detektert, øker over tid. I motsetning utvikles ikke kreften når nivået av reaktivt polypeptid eller polynukleotid enten forblir konstant eller reduseres over tid.

Visse in vivo diagnostiske forsøk kan utføres direkte på en tumor. Ett slikt forsøk involverer å bringe tumorceller i kontakt med et bindemiddel. Det bundete bindemiddel kan deretter detekteres direkte eller indirekte via en rapportørgruppe. Slike bindemidler kan også anvendes ved histologiske anvendelser. Alternativt kan polynukleotid-prober anvendes ved slike applikasjoner.

Som angitt ovenfor, for å forbedre sensitivitet, kan multiple tumorprotein-markører undersøkes i en gitt prøve. Det vil være klart at bindemidler spesifikke for forskjellige proteiner gitt her, kan kombineres i et enkelt forsøk. Videre kan multiple primere eller prober anvendes samtidig. Seleksjon av tumorprotein-markører kan være basert på rutinemessige forsøk for å bestemme kombinasjoner som resulterer i optimal sensitivitet. I tillegg eller alternativt kan forsøk på tumorproteiner gitt her, kombineres med forsøk på andre kjente tumor-antigener.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre sett for anvendelse ved hvilken som helst av de ovenfor diagnostiske metoder. Slike sett omfatter typisk to eller flere komponenter nødvendige for utførelse av et diagnostisk forsøk. Komponenter kan være forbindelser, reagenser, beholdere og/eller utstyr. For eksempel kan én beholder innen et sett inneholde et monoklonalt antistoff eller fragment derav som spesifikt binder til et tumorprotein. Slike antistoffer eller fragmenter kan være bundet til et bærermateriale, som beskrevet ovenfor. Én eller flere ytterligere beholdere kan omfatte elementer, så som reagenser eller buffere, som skal anvendes i forsøket. Slike sett kan også eller alternativt, inneholde et deteksjonsreagens som beskrevet ovenfor som inneholder en rapportørgruppe egnet for direkte eller indirekte deteksjon av antistoff-binding.

Alternativt kan et sett være utformet for å detektere nivået av mRNA som koder for et tumorprotein i en biologisk prøve. Slike sett omfatter generelt minst én oligonukleotid-probe eller -primer, som beskrevet ovenfor, som hybridiserer til et polynukleotid som koder for et tumorprotein. Et slikt oligonukleotid kan anvendes, for eksempel ved PCR- eller hybridiserings-forsøk. Ytterligere komponenter som kan være til stede i et slikt sett omfatter et andre oligonukleotid og/eller et diagnostisk reagens eller en beholder for å lette deteksjonen av et polynukleotid som koder for et tumorprotein.

De følgende eksempler er gitt som illustrasjon og ikke som begrensning.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

Isolering og karakteriserin<g>av prostata-spesifikkeol<yp>etider

Dette eksemplet beskriver isolering av visse prostata-spesifikke polypeptider fra et prostatatumor-cDNA-bibliotek.

Et humant prostatatumor cDNA-ekspresjonsbibliotek ble konstruert fra prostatatumor poly A<+>RNA ved anvendelse av et Superscript Plasmid System for cDNA-syntese- og plasmid-klonings-sett (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD 20897) ved å følge produsentens protokoll. Spesifikt ble prostata-tumorvev homogenisert med polytron (Kinematica, Sveits) og total RNA ekstrahert ved anvendelse av Trizol-reagens (BRL Life Technologies) som anbefalt av produsenten. Poly A<+>RNA ble deretter renset ved anvendelse av et Qiagen oligotex spinn-kolonne mRNA-rensnings-sett (Qiagen, Santa Clarita, CA 91355) i henhold til produsentens protokoll. Første tråd cDNA ble syntetisert ved anvendelse av Notl/Oligo-dT18-primeren. Dobbeltrådet cDNA ble syntetisert, ligert med EcoRI/BAXI-adaptere (Invitrogen, San Diego, CA) og fordøyet med Noti. Etter størrelsesfraksjonering med Chroma Spin-1000 kolonner (Clontech, Palo Alto, CA), ble cDNA ligert inn i EcoRI/Notl-setet av pCDNA3.1 (Invitrogen) og transformert til ElectroMax E. coli DH10B-celler (BRL Life Teknologies) ved elektroporering.

Ved anvendelse av samme prosedyre ble et normalt humant bukspyttkjertel-cDNA-ekspresjonsbibliotek fremstilt fra en samling av seks vevprøver (Clontech). cDNA-biblioteker blekarakterisert vedå bestemme antallet av uavhengige kolonier, prosentdelen av kloner som hadde insersjon, den gjennomsnittlige insersjonsstørrelse og ved sekvensanalyse. Prostatatumor-bibliotek inneholdt 1,64 x 10<7>uavhengige kolonier, hvor 70% av klonene har en insersjon og den gjennomsnittlige insersjonastørrelse er 1745 basepar. Det normale bukspyttkjertel cDNA-bibliotek inneholdt 3,3 x 10<6>uavhengige kolonier, idet 69% av klonene har insersjoner og gjennomsnittlig insersjons-størrelse er 1120 basepar. For begge biblioteker viste sekvensanalyse at hoveddelen av kloner hadde en full-lengde cDNA-sekvens og ble syntetisert fra mRNA, med minimal rRNA- og mitokondrien DNA-forurensning.

cDNA-bibliotek-subtraksjon ble utført ved anvendelse av de ovenfor prostatatumor- og normal bukspyttkjertel-cDNA-biblioteker, som beskrevet av Hara er al. ( Blood, 84:189-199, 1994) med noen modifikasjoner. Spesifikt ble prostata tumor-spesifikt subtrahert cDNA-bibliotek dannet som følger. Normalt bukspyttkjertel cDNA-bibliotek (70 ug) ble fordøyet med EcoRI, Noti og Sful, fulgt av en ifyllings-reaksjon med DNA polymerase Klenow-fragment. Etter fenol-kloroform-ekstraksjon og etanol-utfelling, ble DNA'et oppløst i 100 ul H20, varme-denaturert og blandet med 100 ul (100 (ag) av Photoprobe-biotin (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Som anbefalt av produsenten ble den resulterende blanding bestrålet med en 270 W høyfjellssol på is i 20 minutter. Ytterligere Photoprobe-biotin (50 ul) ble tilsatt og biotinyleringsreaksjonen ble

gjentatt. Etter ekstraksjon med butanol fem ganger ble DNA etanol-utfelt og oppløst i 23 ul H20 for å danne driver-DNA.

For å danne tracer-DNA ble 10 ug prostatatumor cDNA-bibliotek fordøyet med BamHI og Xhol, fenolkloroform-ekstrahert og ført gjennom Chroma spinn-400 kolonner (Clontech). Etter etanol-utfelling ble tracer-DNA oppløst i 5 ul H20. Tracer-DNA ble blandet med 15 ul driver-DNA og 20 ul av 2 x hybridiserings-buffer (1,5 M NaCI/10 mM EDTA/50 mM HEPES pH 7,5/0,2% natrium-dodecylsulfat), overdekket med mineralolje og fullstendig varme-denaturert. Prøven ble umiddelbart overført til et 68°C vannbad og inkubert i 20 timer (lang hybridisering [LH]). Reaksjonsblandingen ble deretter underkastet en streptavidin-behandling fulgt av fenol/kloroform-ekstraksjon. Denne prosessen ble gjentatt tre ganger til. Subtrahert DNA ble utfelt, oppløst i 12 ul H20, blandet med 8 ul driver-DNA og 20 ul av 2 x hybridiseringsbuffer og underkastet hybridisering ved 68°C i 2 timer (kort hybridisering [SH]). Etter fjerning av biotinylert dobbeltrådet DNA, ble subtrahert cDNA ligert inn i BamHI/Xhol-setet av kloramfenicol-resistent pBCSK<+>(Stratagene, La Jolla, CA 92037) og transformert i ElectroMax E. coli DH 10B-celler ved elektroporering for å danne et prostatatumor-spesifikt subtrahert cDNA-bibliotek (referert til som "prostata-subtraksjon 1").

For å analysere det subtraherte cDNA-bibliotek ble plasmid DNA fremstilt fra 100 uavhengige kloner, tilfeldig valgt fra det subtraherte prostatatumor-spesifikke bibliotek og gruppert basert på insersjonsstørrelse. Representative cDNA-kloner ble ytterligerekarakterisert vedDNA-sekvensering med en Perkin Eimer/Applied Biosystems Division Automated Sequencer Model 373A (Foster City, CA). Seks cDNA kloner, nedenfor referert til som F1-13, F1-12, F1-16, H1-1, H1-9 og H1-4, ble vist å være rikelige i det subtraherte prostata-spesifikke cDNA-bibliotek. De bestemte 3' og 5' cDNA-sekvenser for F1-12 er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 2 og 3, med bestemte 3' cDNA-sekvenserfor F1-13, F1-16, H1-1, H1-9 og H1-4 er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 1 og 4-7.

cDNA-sekvensene for de isolerte kloner ble sammenlignet med kjente sekvenser i genbanken ved anvendelse av EMBL- og GenBank-databaser (publikasjon 96). Fire av prostatatumor-cDNA kloner, F1-13, F1-16, H1-1 og

H1-4, ble bestemt å kode for de følgende tidligere identifiserte proteiner: prostata-spesifikt antigen (PSA), human glandulær kallikrein, human tumor-ekspresjon-forbedret gen og mitokondrie-cytochrome C oksydase-subenhet II. H1-9 ble funnet å være identisk med en tidligere identifisert human autonomt replikerende sekvens. Ingen betydelige homologier til cDNA-sekvensen for F1-12 ble funnet.

Påfølgende undersøkelser førte til isolering av en full-lengde cDNA-sekvens for F1-12 (også referert til som P504S). Denne sekvensen er gitt i SEKV ID NR: 107, med den tilsvarende antatte aminosyresekvens gitt i SEKV ID NR: 108. cDNA spleisevarianter av P504S er gitt i SEKV ID NR: 600-605.

For å klone mindre rikelige prostatatumor-spesifikke gener, ble cDNA-bibliotek-subtraksjon utført ved å subtrahere prostatatumor-cDNA-bibliotek beskrevet ovenfor med normal bukspyttkjertel-cDNA-bibliotek og med de tre rikeligste gener i det tidligere subtraherte prostatatumor-spesifikke cDNA-bibliotek: human glandulær kallikrein, prostataspesifikt antigen (PSA) og mitokondrie cytochrome C oksydase subenhet II. Spesifikt ble 1 ug hver av human glandulær kallikrein, PSA og mitokondrie cytochrome C oksydase subenhet II cDNA i pCDNA3,1 satt til driver- DNA og subtraksjon ble utført som beskrevet ovenfor for å gi et andre subtrahert cDNA-bibliotek nedenfor referert til som "subtrahert prostatatumor-spesifikt cDNA-bibliotek med spisspotensiale ("spike")".

22 cDNA kloner ble isolert fra det subtraherte prostatatumor-spesifikke cDNA-bibliotek med spisspotensiale. De bestemte 3' og 5' cDNA-sekvenser for klonene referert til som J1-17, L1-12, N1-1862, J1-13, J1-19, J1-25, J1-24, K1-58, K1-63, L1-4 og L1-14 er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 8-9, 10-11, 12-13, 14-15, 16-17, 18-19, 20-21, 22-23, 24-25, 26-27 og 28-29. De bestemte 3'

cDNA-sekvenser for klonene referert til som J1-12, J1-16, J1-21, K1-48, K1-55, L1-2, L1-6, N1-1858, N1-1860, N1-1861, N1-1864 er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 30-40. Sammenligning av disse sekvenser med de i genbanken beskrevet ovenfor, avslørte ingen betydelige homologier med tre av de fem rikeligste

DNA-arter, (J1-17, L1-12 og N1-1862; henholdsvis SEKV ID NR: 8-9, 10-11 og 12-13). Av de to resterende rikeligste arter ble én (J1-12; SEKV ID NR: 30) funnet å være identisk med det tidligere identifiserte humane pulmonale surfaktant-assosierte protein og det andre (K1-48; SEKV ID NR: 33) ble funnet å ha noe homologi med R. norvegicus mRNA i 2-arylpropionyl-CoA epimerase. Av de 17 mindre rikelige cDNA-kloner isolert fra det subtraherte prostatatumor-spesifikke cDNA-bibliotek med spisspotensiale, ble fire (J1-16, K1-55, L1-6 og N1-1864; henholdsvis SEKV ID NR:31, 34, 36 og 40) funnet å være identiske med tidligere identifiserte sekvenser, to (J1-21 og N1-1860; henholdsvis SEKV ID NR: 32 og 38) ble funnet å vise noe homologi med ikke-humane sekvenser og to (L1-2 og N1-1861; henholdsvis SEKV ID NR: 35 og 39) ble funnet å vise noe homologi med kjente humane sekvenser. Ingen signifikante homologier ble funnet med polypeptidene J1-13, J1-19, J1-24, J1-25, K1-58, K1-63, L1-4, L1-14 (henholdsvis SEKV ID NR: 14-15, 16-17, 20-21, 18-19, 22-23, 24-25, 26-27, 28-29).

Påfølgende undersøkelser førte til isolering av full-lengde cDNA-sekvensérfor J1-17, L1-12 og N1-1862 (henholdsvis SEKV ID NR: 109-111). De tilsvarende antatte aminosyresekvenser er gitt i SEKV ID NR: 112-114. L1-12 er også referert til som P501S. En cDNA spleisevariant av P501S er gitt i SEKV ID NR: 606.

I et ytterligere forsøk ble fire ytterligere kloner identifisert ved å subtrahere et prostatatumor cDNA-bibliotek med normal prostata cDNA fremstilt fra en samling av tre normale prostata poly A+ RNA (referert til som "prostata-subtraksjon 2"). De bestemte cDNA-sekvenser for disse kloner, nedenfor referert til som U1-3064, U1-3065, V1-3692 og 1A-3905, er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 69-72. Sammenligning av de bestemte sekvenser med de i genbanken avslørte ingen betydelige homologier med U1-3065.

En andre subtraksjon med spisspotensiale (referert til som "prostata-subtraksjon spisspotensiale 2") ble utført ved å subtrahere et prostatatumor-spesifikt cDNA-bibliotek med spisspotensiale med normal bukspyttkjertel cDNA-bibliotek og ytterligere "spiked" med PSA, J1-17, pulmonalt surfaktant-assosiert protein, mitokondrien DNA, cytochrome c oksydase subenhet II, N1-1862, autonom replikerende sekvens, L1-12 og tumor-ekspresjonsforsterket gen. Fire ytterligere kloner, nedenfor referert til som V1-3686, R1-2330, 1B-3976 og V1-3679 ble isolert. De bestemte cDNA-sekvenser for disse kloner er gitt i henholdsvis SEKV ID NR:73-76. Sammenligning av disse sekvenser med de i genbanken avslørte ingen betydelige homologier med V1-3686 og R1-2330.

Videre analyse av de tre prostata-subtraksjoner beskrevet ovenfor (prostata subtraksjon 2, subtrahert prostatatumor-spesifikt cDNA-bibliotek med spisspotensiale og prostata-subtraksjon spisspotensiale 2) resulterte i identifikasjon av 16 ytterligere kloner, referert til som 1G-4736, 1G-4738,1G-4741, 1G-4744, 1G-4734, 1H-4774, 1H-4781, 1H-4785, 1H-4787, 1H-4796, 11- . 4810, 11-4811, 1J-4876, 1K-4884og 1K-4896. De bestemte cDNA-sekvenser for disse kloner er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 77-92. Sammenligning av disse sekvenser med de i genbanken som beskrevet ovenfor, avslørte ingen betydelige homologier med 1G-4741, 1G-4734, 11-4807, 1J-4876 og 1K-4896 (henholdsvis SEKV ID NR: 79, 81, 87, 90 og 92). Videre analyse av de isolerte kloner førte til bestemmelse av utvidede cDNA-sekvenser i 1G-4736, 1G-4738, 1G-4741, 1G-4744, 1H-4774, 1H-4781, 1H-4785, 1H-4787, 1H-4796, 11-4807, 1J-4876, 1K-4884 og 1K-4896, gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 179-188 og 191-193, og bestemmelse av ytterligere partielle cDNA-sekvenser i 11-4810 og 11-4811, gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 189 og 190.

Ytterligere undersøkelser med prostata-subtraksjon spisspotensiale 2 resulterte i isolering av ytterligere tre kloner. Deres sekvenser ble bestemt som beskrevet ovenfor og sammenlignet med nyeste GenBank. Alle tre kloner ble funnet å ha homologi med kjente gener, som er cystein-rikt protein, KIAA0242 og KIAA0280 (henholdsvis SEKV ID NR: 317, 319 og 320). Videre analyse av disse kloner med Synteni mikromatrise (Synteni, Palo Alto, CA) demonstrerte at alle tre kloner ble overuttrykt i de fleste prostatatumorer og prostata-BPH, så vel som i hoveddelen av normalt prostatavev testet, men hadde lav ekspresjon i alt annet normalt vev.

En ytterligere subtraksjon ble utført ved å subtrahere et normalt prostata cDNA-bibliotek med normal bukspyttkjertel cDNA (referert til som "prostata-subtraksjon 3"). Dette førte til identifikasjon av seks ytterligere kloner referert til som 1G-4761, 1G-4762, 1H-4766, 1H-4770, 1H-4771 og 1H-4772 (SEKV ID NR: 93-98). Sammenligning av disse sekvenser med de i genbanken avslørte ingen betydelige homologier med 1G-4761 og 1H-4771 (henholdsvis SEKV ID NR: 93 og 97). Videre analyse av de isolerte kloner førte til bestemmelse av utvidede cDNA-sekvenser for 1G-4761,1G-4762, 1H-4766 og 1H-4772 gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 194-196 og 199, og til bestemmelse av ytterligere partielle cDNA-sekvenser i 1H-4770 og 1H-4771, gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 197 og 198.

Subtraksjon av et prostatatumor cDNA-bibliotek, fremstilt fra en samling av polyA+ RNA fra tre prostatakreft-pasienter, med et normalt bukspyttkjertel cDNA-bibliotek (prostata-subtraksjon 4) førte til identifikasjon av åtte kloner, referert til som 1D-4297, 1D-4309, 1D,1-4278, 1D-4288,1D-4283, 1D-4304, 1D-4296 og 1D-4280 (SEKV ID NR: 99-107). Disse sekvenser ble sammenlignet med de i genbanken som beskrevet ovenfor. Ingen betydelige homologier ble funnet med 1D-4283 og 1D-4304 (henholdsvis SEKV ID NR: 103 og 104). Videre analyse av de isolerte kloner førte til bestemmelse av utvidede cDNA-sekvenser i 1D-4309, 1D,1-4278,1D-4288, 1D-4283, 1D-4304, 1D-4296 og 1D-4280, gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 200-206.

cDNA-kloner isolert i prostata-subtraksjon 1 og prostata-subtraksjon 2, beskrevet ovenfor, ble koloni-PCR-amplifisert og deres mRNA-ekspresjonsnivåer i prostatatumor, normal prostata og i forskjellige andre normale vev ble bestemt ved anvendelse av mikromatrise-teknologi (Synteni, Palo Alto, CA). Kort sagt ble PCR-amplifiseringsprodukter prikket på slides i et matriseformat, idet hvert produkt okkuperte en unik lokasjon i matrisen. mRNA ble ekstrahert fra vevprøven som skulle testes, revers transkribert og fluorescerende-merkede cDNA-prober ble dannet. Mikromatrisene ble probet med de merkede cDNA-prober, slides scannet og fluorescens-intensitet ble målt. Denne intensitet korrelerer med hybridiserings-intensiteten. To kloner (referert til som P509S og P510S) ble funnet å være overuttrykt i prostatatumor og normal prostata og uttrykt i lave nivåer i alt annet normalt vev testet (lever, bukspyttkjertel, hud, benmarg, hjerne, bryst, binyre, blære, testikkel, spyttkjertel, tykktarm, nyre, eggstokk, lunge, ryggmarg, skjelettmuskel og kolon). De bestemte cDNA-sekvenser for P509S og P510S er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 223 og 224. Sammenligning av disse sekvenser med de i genbanken som beskrevet ovenfor, avslørte noe homologi med tidligere identifiserte ESTer.

Videre undersøkelser førte til isolering av full-lengde cDNA-sekvensen for P509S. Denne sekvensen er gitt i SEKV ID NR: 332, idet den tilsvarende antatte aminosyresekvens er gitt i SEKV ID NR: 339. To variante full-lengde cDNA-sekvenser for P510S er gitt i SEKV ID NR: 535 og 536, idet de tilsvarende antatte aminosyresekvenser er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 537 og 538. Ytterligere spleisevarianter av P510S er gitt i SEKV ID NR: 598 og 599.

EKSEMPEL 2

Bestemmelse av vev-sesifisitet av prostata-spesifikkeol<yp>etider

Ved anvendelse av genspesifikke primere ble mRNA-ekspresjonsnivåer forde representative prostata-spesifikke polypeptider F1-16, H1-1, J1-17 (også referert til som P502S), L1-12 (også referert til som P501S), F1-12 (også referert til som P504S) og N1-1862 (også referert til som P503S) undersøkt i en rekke normale og tumorvev ved anvendelse av RT-PCR.

Total RNA ble ekstrahert fra en rekke normale og tumorvev ved anvendelse av Trizol-reagens som beskrevet ovenfor. Første tråd-syntese ble utført ved anvendelse av 1-2 ug total RNA med SuperScript II revers transkriptase (BRL Life Technologies) ved 42°C i én time. cDNA ble deretter amplifisert ved PCR med genspesifikke primere. For å sikre den semi-kvantitative natur av RT-PCR, ble p-actin anvendt som en indre kontroll for hvert av de undersøkte vevene. Først ble serie-fortynninger av den første tråd cDNA fremstilt og RT-PCR-forsøk ble utført ved anvendelse av p-actin-spesifikke primere. En fortynning ble deretter valgt som koblet inn lineært område amplifisering av p-actin-templaten og som var sensitiv nok til å reflektere forskjellene i de innledende kopitall. Ved anvendelse av disse betingelser ble p-actin-nivåer bestemt for hver revers transkripsjons-reaksjon fra hvert vev. DNA-forurensning ble minimalisert ved DNase-behandling og ved sikring av et negativt PCR-resultat ved anvendelse av første tråd cDNA som ble fremstilt uten anvendelse av revers transkriptase.

mRNA-ekspresjonsnivåer ble undersøkt i fire forskjellige typer av tumorvev (prostatatumor fra 2 pasienter, brysttumor fra 3 pasienter, kolontumor, lungetumor) og 16 forskjellige normale vev, omfattende prostata, kolon, nyre, lever, lunge, eggstokk, bukspyttkjertel, skjelettmuskel, hud, mage,

testikkel, benmarg og hjerne. F1-16 ble funnet å være uttrykt i høye nivåer i prostatatumorvev, kolontumor og normal prostata og i lavere nivåer i normal lever, hud og testikler, idet ekspresjon var udetekterbar i de andre undersøkte vev. H1-1 ble funnet å være uttrykt i høye nivåer i prostatatumor, lungetumor, brysttumor, normal prostata, normal kolon og normal hjerne, i meget lavere nivåer i normal lunge, bukspyttkjertel, skjelettmuskel, hud, tynntarm, benmarg og ble ikke detektert i de andre testede vev. J1-17 (P502S) og L1-12 (P501S) synes å være spesifikt overuttrykt i prostata, idet begge gener blir uttrykt i høye nivåer i prostatatumor og normal prostata, men i lave til udetekterbare nivåer i alle de andre undersøkte vev. N1-1862 (P503S) ble funnet å være overuttrykt i 60% av prostatatumorer og detekterbart i normal kolon og nyre. RT-PCR-resultater indikerer således at F1-16, H1-1, J1-17 (P502S), N1-1862 (P503S) og L1-12 (P501S) er enten prostata-spesifikke eller blir uttrykt i betydelig forhøyede nivåer i prostata.

Ytterligere RT-PCR-undersøkelser viste at F1-12 (P504S) er overuttrykt i 60% av prostatatu morer, detekterbar i normal nyre, men ikke detekterbar i alle andre testede vev. Tilsvarende ble R1-2330 vist å være overuttrykt i 40% av prostatatu morer, detekterbar i normal nyre og lever, men ikke detekterbar i alle andre testede vev. U1-3064 ble funnet å være overuttrykt i 60% av prostata-tumorer og også uttrykt i bryst- og kolon-tumorer, men var ikke detekterbar i normalt vev.

RT-PCR-karakterisering av R1-2330, U1-3064 og 1D-4279 viste at disse tre antigener er overuttrykt i prostata og/eller prostatatumorer.

Northern analyse med fire prostatatumorer, to normale prostataprøver, to BPH-prostataer og normal kolon, nyre, lever, lunge, bukspyttkjertel, skjelettmuskel, hjerne, mage, testikkel, tynntarm og benmarg, viste at L1-12 (P501S) er overuttrykt i prostatatumorer og normal prostata, mens den er udetekterbar i andre normale vev testet. J1-17 (P502S) ble detektert i to prostatatumorer og ikke i de andre vevene testet. N1-1862 (P503S) ble funnet å være overuttrykt i tre prostata-tumorer og å være uttrykt i normal prostata, kolon og nyre, men ikke i andre vev testet. F1-12 (P504S) ble funnet å være sterkt uttrykt i to prostatatumorer og å være udetekterbar i alle andre vev testet.

Mikromatrise-teknologien beskrevet ovenfor ble anvendt for å bestemme ekspresjonsnivåene av representative antigener beskrevet her i prostatatumor, brysttumor og de følgende normale vev: prostata, lever, bukspyttkjertel, hud, benmarg, hjerne, bryst, binyre, blære, testikkel, spyttkjertel, tykktarm, nyre, eggstokk, lunge, ryggmarg, skjelettmuskel og kolon. L1-12 (P501S) ble funnet å være overuttrykt i normal prostata og prostatatumor, med noe ekspresjon detektert i normal skjelettmuskel. Både J1-12 og F1-12 (P504S) ble funnet å være overuttrykt i prostatatumor, idet ekspresjon var lavere eller udetekterbar i alle andre vev testet. N1-1862 (P503S) ble funnet å være uttrykt i høye nivåer i prostatatumor og normal prostata og i lave nivåer i normal tykktarm og normal kolon, idet ekspresjon var udetekterbar i alle andre vev testet. R1-2330 ble funnet å være overuttrykt i prostatatumor og normal prostata og å være uttrykt i lavere nivåer i alle andre vev testet. 1D-4279 ble funnet å være overuttrykt i prostatatumor og normal prostata, uttrykt i lavere nivåer i normal ryggmarg og å være udetekterbar i alle andre vev testet.

Ytterligere mikromatrise-analyse for spesifikt å finne i hvilken grad P501S (SEKV ID NR: 110) ble uttrykt i brysttumor avslørte moderat overekspresjon ikke bare i brysttumor, men også i metastasisk brysttumor (2/31), med neglisjerbar til lav ekspresjon i normalt vev. Disse data indikerer at P501S kan være overuttrykt i forskjellige brysttumorer så vel som i prostatatumorer.

Ekspresjonsnivåene av 32 EST (uttrykte sekvens-merker) beskrevet av Vasmatzis et al. ( Proe. Nati. Acad. Sei. USA 95:300-304, 1998) i en rekke tumor og normale vev ble undersøkt ved mikromatrise-teknologi som beskrevet ovenfor. To av disse kloner (referert til som P1000C og P1001C) ble funnet å være overuttrykt i prostatatumor og normal prostata og uttrykt i lave til udetekterbare nivåer i alle andre vev testet (normal aorta, thymus, hvilende og aktivert PBMC, epitelceller, ryggmarg, binyre, føtalt vev, hud, spyttkjertel, tykktarm, benmarg, lever, lunge, dendrittiske celler, mage, lymfeknuter, hjerne, hjerte, tynntarm, skjelettmuskel, kolon og nyre. De bestemte cDNA-sekvenser forP1000C og P1001C er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 384 og 472. Sekvensen til P1001C ble funnet å vise noe homologi med det tidligere isolerte humane mRNA for JM27 protein. Påfølgende sammenligning av sekvensen i SEKV ID NR: 384 med sekvenser i offentlige databaser, førte til identifikasjon av en full-lengde cDNA-sekvens av P1000C (SEKV ID NR: 786), som koder for en 492 aminosyresekvens. Analyse av aminosyresekvensen ved anvendelse av PSORT ll-programmet førte til identifikasjon av et antatt transmembran-domene fra aminosyrer 84-100. cDNA-sekvensen av den åpne leseramme til P1000C, omfattende stoppkodonet, er gitt i SEKV ID NR: 787, idet den åpne leseramme uten stoppkodonet er gitt i SEKV ID NR: 788. Full-lengde aminosyresekvens av P1000C er gitt i SEKV ID NR: 789. SEKV ID NR: 790 og 791 representerer henholdsvis aminosyrer 1-100 og 100-492 av P1000C.

Ekspresjonen av polypeptidet kodet for av full-lengde cDNA-sekvensen for F1-12 (også referert til som P504S; SEKV ID NR: 108) ble undersøkt ved immunohistokjemisk analyse. Kanin-anti-P504S polyklonale antistoffer ble dannet mot full-lengde P504S-protein ved standard teknikker. Påfølgende isolering og karakterisering av de polyklonale antistoffene ble også utført ved teknikker velkjent på området. Immunohistokjemisk analyse viste at P504S-polypeptidet ble uttrykt i 100% av prostatakarsinom-prøver testet (n=5).

Kanin-anti-P504S polyklonalt antistoff syntes ikke å merke godartede prostataceller med samme cytoplasmatiske granulære merking, men heller med lett nukleær merking. Analyse av normalt vev viste at det kodede polypeptid ble funnet å være uttrykt i noe, men ikke alle normale humane vev. Positiv cytoplasmatisk merking med kanin-anti-P504S polyklonalt antistoff ble funnet i normal human nyre, lever, hjerne, kolon og lunge-assosierte makrofager, mens hjerte og benmarg var negative.

Disse data indikerer at P504S-polypeptid er til stede i prostatakreft-vev og at det er kvalitative og kvantitative forskjeller i merkingen mellom godartet prostatisk hyperplasi-vev og prostatakreft-vev, hvilket indikerer at dette polypeptid kan detekteres selektivt i prostatatumorer og derfor være anvendelig ved diagnose av prostatakreft.

EKSEMPEL 3

Isolering og karakteriserin<g>av prostata-spesifikkeol<yp>etider ved PCR-BASERT SUBTRAKSJON

Et cDNA subtraksjonsbibliotek, inneholdende cDNA fra normal prostata subtrahert med ti andre normale vev cDNA'er (hjerne, hjerte, nyre, lever, lunge, eggstokk, placenta, skjelettmuskel, milt og thymus) og deretter underkastet en første runde med PCR-amplifisering, ble anskaffet fra Clontech. Dette bibliotek ble underkastet en andre runde av PCR-amplifisering, i henhold til produsentens protokoll. De resulterende cDNA-fragmenter ble subklonet inn i vektoren pT7 Blue T-vektor (Novagen, Madison, Wl) og transformert til XL-1 Blue MRF' E. coli (Stratagene). DNA ble isolert fra uavhengig kloner og sekvensert ved anvendelse av en Perkin Eimer/Applied Biosystems Division Automated Sequenser Modell 373A: 59 positive kloner ble sekvensert. Sammenligning av DNA-sekvensene fra disse kloner med de i genbanken, som beskrevet ovenfor, avslørte ingen betydelige homologier med 25 av disse kloner, nedenfor referert til som P5, P8, P9, P18, P20, P30, P34, P36, P38, P39, P42, P49, P50, P53, P55, P60, P64, P65, P73, P75, P76, P79 og P84. De bestemte cDNA-sekvenser for disse kloner er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 41-45, 47-52 og 54-65. P29, P47, P68, P80 og P82 (henholdsvis SEKV ID NR: 46, 53 og 66-68) ble funnet å vise noen grad av homologi med tidligere identifiserte DNA-sekvenser. Så vidt oppfinnerene vet er ingen av disse sekvenser tidligere vist å være til stede i prostata.

Ytterligere undersøkelser ved anvendelse av sekvensen i SEKV ID NR: 67 som en probe i standard full-lengde kloningsmetoder, resulterte i isolering av tre cDNA-sekvenser som synes å være spleisevarianter av P80 (også kjent som P704P). Disse sekvenser er gitt i SEKV ID NR: 620-622.

Ytterligere undersøkelser ved anvendelse av den PCR-baserte metodikk beskrevet ovenfor, resulterte i isolering av mer enn 180 ytterligere kloner, av hvilke 23 kloner ble funnet å vise ingen betydelig homologi med kjente sekvenser. De bestemte cDNA-sekvenser for disse kloner er gitt i SEKV ID NR: 115-123, 127, 131, 137, 145, 147-151, 153, 156-158 og 160. 23 kloner

(SEKV ID NR: 124-126, 128-130, 132-136, 138-144, 146, 152, 154, 155 og 159) ble funnet å vise noe homologi med tidligere identifiserte EST. Ytterligere ti kloner (SEKV ID NR: 161-170) ble funnet å ha noen grad av homologi med kjente gener. Større cDNA-kloner inneholdende P20-sekvensen representerer spleisevarianter av et gen referert til som P703P. Den bestemte DNA-sekvens for variantene referert til som DE1, DE13 og DE14 er gitt i henholdsvis SEKV

ID NR: 171,175 og 177, idet de tilsvarende antatte aminosyresekvenser er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 172, 176 og 178. Den bestemte cDNA-sekvens for en forlenget spleiset form av P703 er gitt i SEKV ID NR: 225. DNA-sekvensene for spleisevariantene referert til som DE2 og DE6 er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 173 og 174.

mRNA-ekspresjonsnivåer for representative kloner i tumorvev (prostata (n=5), bryst (n=2), kolon og lunge) normalt vev (prostata (n=5), kolon, nyre, lever, lunge (n=2), eggstokk (n=2), skjelettmuskel, hud, mage, tynntarm og hjerne) og aktivert og ikke-aktivert PBMC ble bestemt ved RT-PCR som beskrevet ovenfor. Ekspresjon ble undersøkt i én prøve av hver vevtype hvis ikke annet er angitt.

P9 ble funnet å være sterkt uttrykt i normal prostata og prostatatumor sammenlignet med alle normale vev testet, bortsett fra normal kolon som viste sammenlignbar ekspresjon. P20, en del av P703P-genet, ble funnet å være sterkt uttrykt i normal prostata og prostatatumor, sammenlignet med alle tolv normale vev testet. En beskjeden økning i ekspresjon av P20 i brysttumor (n=2), kolontumor og lungetumor ble sett sammenlignet med alle normale vev, bortsett fra lunge (1 av 2). Øket ekspresjon av P18 ble funnet i normal prostata, prostatatumor og brysttumor sammenlignet med andre normale vev, bortsett fra lunge og mage. En beskjeden økning i ekspresjon av P5 ble observert i normal prostata sammenlignet med de fleste andre normale vev. Imidlertid ble noe forhøyet ekspresjon sett i normal lunge og PBMC. Forhøyet ekspresjon av P5 ble også observert i prostatatumorer (2 av 5), brysttumor og én lungetumor-prøve. For P30 ble lignende ekspresjonsnivåer sett i normal prostata og prostatatumor, sammenlignet med seks av tolv andre normale vev testet. Øket ekspresjon ble sett i brysttumorer, én lungetumor-prøve og én kolontumor-prøve og også i normal PBMC. P29 ble funnet å være overuttrykt i prostatatumor (5 av 5) og normal prostata (5 av 5) sammenlignet med hovedmengden av normalt vev. Imidlertid ble vesentlig ekspresjon av P29 observert i normal kolon og normal lunge (2 av 2). P80 ble funnet å være overuttrykt i prostatatumor (5 av 5) og normal prostata (5 av 5) sammenlignet med alle andre normale vev testet, med øket ekspresjon også sett i kolontumor.

Ytterligere undersøkelser resulterte i isolering av tolv ytterligere kloner, nedenfor referert til som 10-d8, 10-h10, 11-c8, 7-g6, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3, 8-h11, 9-f12 og 9-f3. De bestemte DNA-sekvenser i 10-d8, 10-h10, 11 -c8, 8-d4, 8-d9, 8-h11, 9-f12 og 9-f3 er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 207, 208, 209, 216, 217, 220, 221 og 222. De bestemte forover og reverse DNA-sekvenser i 7-g6, 8-b5, 8-b6 og 8-g3 er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 210 og 211; 212 og 213; 214 og 215; og 218 og 219. Sammenligning avdisse sekvenser med de i genbanken avslørte ingen betydelige homologier med sekvensen av 9-f3. Klonene 10-d8, 11 -c8 og 8-h11 ble funnet å vise noe homologi med tidligere isolerte EST, mens 10-h10, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3 og 9-f12 ble funnet å vise noe homologi med tidligere identifiserte gener. Videre karakterisering av 7-G6 og 8-G3 viste identitet med henholdsvis de kjente gener PAP og PSA.

mRNA-ekspresjonsnivåer for disse kloner ble bestemt ved anvendelse

av mikro-matrise-teknologien beskrevet ovenfor. Klonene 7-G6, 8-G3, 8-B5, 8-B6, 8-D4, 8-D9, 9-F3, 9-F12, 9-H3, 10-A2, 10-A4, 11-C9 og 11-F2 ble funnet å være overuttrykt i prostatatumor og normal prostata, idet ekspresjon i andre vev testet var lav eller udetekterbar. Øket ekspresjon av 8-F11 ble sett i prostatatumor og normal prostata, blære, skjelettmuskel og kolon. Øket ekspresjon av 10-H10 ble sett i prostatatumor og normal prostata, blære, lunge, kolon, hjerne og tykktarm. Øket ekspresjon av 9-B1 ble sett i prostatatumor, brysttumor og normal prostata, spyttkjertel, tykktarm og hud, med øket ekspresjon av 11-C8 sett i prostatatumor og normal prostata og tykktarm.

Et ytterligere cDNA-fragment avledet fra den PCR-baserte normale prostata-subtraksjon, beskrevet ovenfor, ble funnet å være prostata-spesifikt både ved mikro-matrise-teknologi og RT-PCR. Den bestemte cDNA-sekvens av dette klon (referert til som 9-A11) er gitt i SEKV ID NR: 226. Sammenligning av denne sekvensen med de i offentlige databaser avslørte 99% identitet med det kjente gen H0XB13.

Ytterligere undersøkelser førte til isolering av klonene 8-C6 og 8-H7. De bestemte cDNA-sekvenser for disse kloner er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 227 og 228. Disse sekvenser ble funnet å vise noe homologi med tidligere isolerte EST'er.

PCR og hybridiserings-baserte metoder ble anvendt for å oppnå lenger cDNA-sekvenser for klon P20 (også referert til som P703P), hvilket ga tre ytterligere cDNA-fragmenter som progressivt utvidet 5'-enden av genet. Disse fragmenter, referert til som P703PDE5, P703P6.26 og P703PX-23 (SEKV ID NR: 326, 328 og 330, med de antatte tilsvarende aminosyresekvenser gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 327, 329 og 331) inneholder ytterligere 5'-sekvens. P703PDE5 ble gjenvunnet ved screening av et cDNA-bibliotek (#141-26) med en del av P703P som probe. P703P6.26 ble gjenvunnet fra en blanding av tre prostatatumor cDNA'er og P703PX_23 ble gjenvunnet fra cDNA-bibliotek (#438-48). Sammen omfatter de ytterligere sekvenser hele den antatte modne serinprotease sammen med en del av den antatte signalsekvens. Full-lengde cDNA-sekvensen for P703P er gitt i SEKV ID NR: 524, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEKV ID NR: 525.

Ved anvendelse av data-algoritmer ble de følgende regioner av P703P forutsagt å representere potensielle HLA A2-bindende CTL-epitoper: aminosyrer 164-172 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 723); aminosyrer 160-168 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 724); aminosyrer 239-247 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 725); aminosyrer 118-126 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 726); aminosyrer 112-120 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 727); aminosyrer 155-164 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 728); aminosyrer 117-126 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 729); aminosyrer 164-173 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 730); aminosyrer 154-163 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 731); aminosyrer 163-172 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 732); aminosyrer 58-66 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 733); og aminosyrer 59-67 av SEKV ID NR: 525 (SEKV ID NR: 734).

P703P ble funnet å vise noe homologi med tidligere identifiserte proteaser, så som trombin. Trombinreseptoren er vist å være preferensielt uttrykt i meget metastasiske brystkarsinom-celler og brystkarsinom-biopsiprøver. Innføring av trombinreseptor antisense cDNA er vist å hemme invasjon av metastasiske brystkarsinom-celler i kultur. Antistoffer mot trombinreseptor hemmer trombinreseptor-aktivering og trombin-fremkalt blodplate-aktivering. Videre hemmer peptider som ligner reseptorens bundede liganddomene, blodplateaggregering av trombin. P703P kan spille en rolle i prostatakreft gjennom en protease-aktivert reseptor på kreftcellen eller på stromal-celler. Den potensielle trypsin-lignende proteaseaktivitet til P703P kan enten aktivere en protease-aktivert reseptor på kreftcelle-membranen for å fremme tumorgenese eller aktivere en protease-aktivert reseptor på tilstøtende celler (så som stromal-celler) til å utskille vekstfaktorer og/eller proteaser (så som matriks-metalloproteinaser) som kan fremme tumor-angiogenese, -invasjon og -metastase. P703P kan således fremme tumorprogresjon og/eller metastase gjennom aktivering av protease-aktivert reseptor. Polypeptider og antistoffer som blokkerer P703P-reseptor-interaksjon kan derfor hensiktsmessig anvendes ved behandling av prostatakreft.

For å bestemme hvorvidt P703P-ekspresjon øker med øket

alvorlighetsgrad av Gleason-grad, en indikator for tumor-stadium, ble kvantitativ PCR-analyse utført på prostatatumor-prøver med et område av Gleason-score fra 5 til > 8. Det gjennomsnittlige nivå av P703P-ekspresjon øket med økende Gleason-score, hvilket indikerer at P703P-ekspresjon kan korrelere med øket sykdomsalvorlighet.

Ytterligere undersøkelser ved anvendelse av et PCR-basert subtraksjonsbibliotek av en prostatatumor-samling subtrahert mot en samling av normalt vev (referert til som JP: PCR-subtraksjon), resulterte i isolering av 13 ytterligere kloner, som syv ikke hadde noen betydelig homologi med kjente GenBank-sekvenser. De bestemte cDNA-sekvenser for disse syv kloner (P711P, P712P, nye 23, P774P, P775P, P710Pog P768P) er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 307-311, 313 og 315. De resterende seks kloner (SEKV ID NR: 316 og 321-325) ble vist å ha noe homologi med kjente gener. Ved mikromatrise-analyse viste alle 13 kloner tre eller flere ganger overekspresjon i prostatavev, omfattende prostatatumorer, BPH og normal prostata sammenlignet med normalt ikke-prostatavev. Kloner P711P, P712P, ny 23 og P768P viste overekspresjon i de fleste prostatatumorer og BPH-vev testet (n=29) og i hoveddelen av normalt prostatavev (n=4), men bakgrunns- til lave ekspresjonsnivåer i alt normalt vev. Kloner P774P, P775P og P710P viste relativt lavere ekspresjon, og ekspresjon i færre prostatatumorer og BPH-prøver, med negativ til lav ekspresjon i normal prostata.

Ytterligere undersøkelser førte til isolering av en utvidet cDNA-sekvens for P712P (SEKV ID NR: 552). Aminosyresekvensene kodet for av 16 forutsagte åpne leserammer til stede i sekvensen i SEKV ID NR: 552 er gitt i SEKV ID NR: 553-568.

Full-lengde cDNA for P711P ble oppnådd ved anvendelse av den partielle sekvens av SEKV ID NR: 307 for screening av et prostata-cDNA-bibliotek. Spesifikt ble et direksjonelt klonet prostata-cDNA-bibliotek fremstilt ved anvendelse av standard teknikker. Én million kolonier av dette bibliotek ble platet ut på LB/Amp-plater. Nylonmembranfiltere ble anvendt for å løfte disse kolonier og cDNA som ble tatt opp av disse filtere ble denaturert og kryssbundet til filtrene ved UV-lys. P711P cDNA-fragmentet av SEKV ID NR: 307 ble radioaktivt merket og anvendt for å hybridisere med disse filtere. Positive kloner ble valgt og cDNA ble fremstilt og sekvensert ved anvendelse av en automatisk Perkin Eimer/Applied Biosystems sekvenserer. Den bestemte full-lengde sekvens av P711P er gitt i SEKV ID NR: 382, med den tilsvarende antatte aminosyresekvens gitt i SEKV ID NR: 383.

Ved anvendelse av PCR og hybridiserings-baserte metoder ble ytterligere cDNA-sekvens-informasjon utledet for to kloner beskrevet ovenfor, 11-C9 og 9-F3, heretter referert til som henholdsvis P707P og P714P, (SEKV ID NR: 333 og 334). Etter sammenligning med nyeste GenBank ble P707P funnet å være en spleisevariant av det kjente gen HoxB13. I motsetning ble ingen betydelige homologier med P714P funnet. Ytterligere undersøkelser ved anvendelse av sekvensen i SEKV ID NR: 334 som en probe ved standard full-lengde kloningsmetoder, resulterte i en forlenget cDNA-sekvens for P714P. Denne sekvensen er gitt i SEKV ID NR: 619. Denne sekvensen ble funnet å vise noe homologi med genet som koder for humant ribosomalt L23A protein.

Kloner 8-B3, P89, P98, P130 og P201 (som beskrevet i U.S. patentsøknad nr. 09/020,956, innlevert 9. februar 1998) ble funnet å være inneholdt i én sammenhengende sekvens, referert til som P705P (SEKV ID NR: 335, med den antatte aminosyresekvens gitt i SEKV ID NR: 336), som ble bestemt å være en spleisevariant av det kjente gen NKX 3.1.

Ytterligere undersøkelser av P775P resulterte i isolering av fire ytterligere sekvenser (SEKV ID NR: 473-476) som alle er spleisevarianter av P775P-genet. Sekvensen i SEKV ID NR: 474 ble funnet å inneholde to åpne leserammer (ORF). De antatte aminosyresekvenser kodet for av disse ORF er gitt i SEKV ID NR: 477 og 478. cDNA-sekvensen av SEKV ID NR: 475 ble funnet å inneholde en ORF som koder for aminosyresekvensen i SEKV ID NR: 479. cDNA-sekvensen av SEKV ID NR: 473 ble funnet å inneholde fire ORF. De antatte aminosyresekvenser kodet for av disse ORF er gitt i SEKV ID NR: 480-483. Ytterligere spleisevarianter av P775P er gitt i SEKV ID NR: 593-597.

Påfølgende undersøkelser førte til identifikasjon av en genomisk region på kromosom 22q11.2, kjent som Kattøye-syndrom-region, som inneholder de fem prostatagener P704P, P712P, P774P, P775P og B305D. Den relative lokasjon av hver av disse fem gener i genomisk region er vist i Fig. 10. Denne region kan derfor være relatert til ondartede tumorer, og andre potensielle tumorgener kan være inneholdt i denne regionen. Disse undersøkelser førte også til identifikasjon av en potensiell åpen leseramme (ORF) for P775P (gitt i SEKV ID NR: 533) som koder for aminosyresekvensen i SEKV ID NR: 534.

Sammenligning av klonen med SEKV ID NR: 325 (referert til som P558S) med sekvenser i GenBank- og GeneSeq DNA-databaser viste at P558S er identisk med prostata-spesifikt transglutaminase-gen, som er kjent å ha to former. Full-lengde-sekvensene for de to former er gitt i SEKV ID NR: 630 og 631, med de tilsvarende aminosyresekvenser gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 632 og 633. cDNA-sekvensen av SEKV ID NR: 631 har en 15 par base-insersjon, hvilket resulterer i en 5 aminosyre-insersjon i den tilsvarende aminosyresekvens (SEKV ID NR: 633). Denne insersjon er ikke til stede i sekvensen i SEKV ID NR: 630.

Ytterligere undersøkelser av P768P (SEKV ID NR: 315) førte til identifikasjon av den antatte full-lengde åpne leseramme (ORF). cDNA-sekvensen av ORF med stoppkodon er gitt i SEKV ID NR: 764. cDNA-sekvensen av ORF uten stoppkodon er gitt i SEKV ID NR: 765, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEKV ID NR: 766. Denne sekvensen ble funnet å vise 86% identitet med et rotte kalsium-transportør-protein, hvilket indikerer at P768P kan representere et humant kalsium-transportør-protein. Lokasjonene av transmembran-domener i P768P ble forutsagt ved anvendelse av PSORT ll-dataalgoritme. Seks transmembran-domener ble forutsagt i aminosyreposisjoner 118-134, 172-188, 211-227, 230-246, 282-298 og 348-364. Aminosyresekvensene i SEKV ID NR: 767-772 representerer henholdsvis aminosyrer 1-134,135-188, 189-227, 228-246, 247-298 og 299-511 av P768P.

EKSEMPEL 4

Syntese avol<yp>etider

Polypeptider kan syntetiseres på en Perkin Eimer/Applied Biosystems 430A peptid-syntetisator ved anvendelse av FMOC-kjemi med HPTU- (0-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametyluronium-heksafluorfosfat) aktivering. En Gly-Cys-Gly-sekvens kan være bundet til amino-terminus av peptidet for å gi en metode for konjugering, binding til en immobilisert overflate eller merking av peptidet. Spaltning av peptidene fra den faste bæreren kan utføres ved anvendelse av den følgende spaltningsblanding: trifluoreddiksyre:etanditiol:tioanisol:vann:fenol (40:1:2:2:3). Etter spaltning i 2 timer kan peptidene utfelles i kald metyl-t-butyl-eter. Peptid-pellet kan deretter oppløses i vann inneholdende 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) og lyofiliseres før rensning ved C18 revers fase HPLC. En gradient av 0%-60% acetonitril (inneholdende 0,1% TFA) i vann (inneholdende 0,1% TFA) kan anvendes for å eluere peptidene. Etter lyofilisering av de rene fraksjoner kan peptidene karakteriseres ved anvendelse av elektrospray eller andre typer av massespektrometri og ved aminosyreanalyse.

EKSEMPEL 5

Ytterligere isolering ogkarakterisering av prostata-spesifikkeol<yp>etider ved PCR-basert subtraksjon

Et cDNA-bibliotek dannet fra prostata-primærtumor-mRNA som beskrevet ovenfor ble subtrahert med cDNA fra normal prostata. Subtraksjonen ble utført ved anvendelse av en PCR-basert protokoll (Clontech), som ble modifisert for å danne større fragmenter. Ved denne protokollen ble tester og driver dobbeltrådet cDNA separat fordøyet med fem restriksjonsenzymer som gjenkjenner seks-nukleotid-restriksjonsseter (Mlul, Mscl, Pvull, Sali og Stul). Denne fordøyelsen resulterte i en gjennomsnittlig cDNA størrelse på 600 bp, istedenfor den gjennomsnittlige størrelse på 300 bp som er et resultat av fordøyelse med Rsal i henhold til Clontech-protokollen. Denne modifikasjon påvirket ikke subtraksjons-effektiviteten. To tester-populasjoner ble deretter dannet med forskjellige adaptere og driver-bibliotek forble uten adaptere.

Tester- og driver-biblioteker ble deretter hybridisert ved anvendelse av overskudd av driver-cDNA. I det første hybridiseringstrinn ble driver separat hybridisert med hver av de to tester-cDNA-populasjoner. Dette resulterte i populasjoner av (a) uhybridiserte tester-cDNA, (b) tester-cDNA hybridisert til andre tester-cDNA, (c) tester-cDNA hybridisert til driver-cDNA og (d) uhybridiserte driver-cDNA. De to separate hybridiseringsreaksjoner ble deretter kombinert og rehybridisert i nærvær av ytterligere denaturert driver-cDNA. Etter denne andre hybridisering ble i tillegg til populasjoner (a) til (d), en femte populasjon (e) dannet, hvor tester-cDNA med én adapter hybridiserte til tester-cDNA med den andre adapter. Følgelig resulterte det andre hybridiseringstrinn i anrikning av differensielt uttrykte sekvenser som kunne anvendes som templater for PCR-amplifisering med adapter-spesifikke primere.

Endene ble deretter fylt i og PCR-amplifisering ble utført ved anvendelse av adapter-spesifikke primere. Bare populasjon (e), som inneholdt tester-cDNA som ikke hybridiserertil driver-cDNA, ble amplifisert eksponensielt. Et andre PCR-amplifiseringstrinn ble deretter utført, for å redusere bakgrunn og ytterligere anrike differensielt uttrykte sekvenser.

Denne PCR-baserte subtraksjonsteknikk normaliserer differensielt uttrykt cDNA slik at sjeldne transkripter som er overuttrykt i prostata-tumorvev kan gjenvinnes. Slike transkripter ville være vanskelige å gjenvinne ved tradisjonelle subtraksjonsmetoder.

I tillegg til gener kjent å være overuttrykt i prostatatumor ble 77 ytterligere kloner identifisert. Sekvenser av disse partielle cDNA er gitt i SEKV ID NR: 29 til 305. Mesteparten av disse kloner hadde ingen betydelig homologi med database-sekvenser. Unntak var JPTPN23 (SEKV ID NR: 231; similaritet med gris valosin-inneholdende protein), JPTPN30 (SEKV ID NR: 234; similaritet med rotte-mRNA for proteasom-subenhet), JPTPN45 (SEKV ID NR: 243; similaritet med rotte norvegicus cytosolisk NADP-avhengig isocitrat-dehydrogenase), JPTPN46 (SEKV ID NR: 244; similaritet med human subklon H8 4 d4 DNA-sekvens), JP1D6 (SEKV ID NR: 265; similaritet med 6. gallus dynein lettkjede-A), JP8D6 (SEKV ID NR: 288; similaritet med human BAC-klon RG016J04), JP8F5 (SEKV ID NR: 289; similaritet med human subklon H8 3 b5 DNA-sekvens) og JP8E9 (SEKV ID NR: 299; similaritet med human Alu-sekvens).

Ytterligere undersøkelser som anvendte det PCR-baserte subtraksjonsbibliotek bestående av en prostatatumor-samling subtrahert mot en normal prostata-samling (referert til som PT-PN PCR-subtraksjon), ga tre ytterligere kloner. Sammenligning av cDNA-sekvensene av disse kloner med den siste offentliggjørelsen fra GenBank avslørte ingen betydelige homologier med de to kloner referert til som P715P og P767P (SEKV ID NR: 312 og 314). Den gjenværende klon ble funnet å ha noe homologi med det kjente gen KIAA0056 (SEKV ID NR: 318). Ved anvendelse av mikromatrise-analyse for å måle mRNA-ekspresjonsnivåer i forskjellige vev, ble alle tre kloner funnet å være overuttrykt i prostatatumorer og BPH-vev. Spesifikt ble klon P715P overuttrykt i de fleste prostatatumorer og BPH-vev med en faktor på tre eller større, idet forhøyet ekspresjon ble sett i hoveddelen av normale prostata-prøver og i føtalt vev, men negativ til lav ekspresjon i alle andre normale vev. Klon P767P ble overuttrykt i mange prostatatumorer og BPH-vev, med moderate ekspresjonsnivåer i halvparten av de normale prostata prøve r og bakgrunn til lav ekspresjon i alle andre normale vev testet.

Videre analyse, med mikromatrise som beskrevet ovenfor, av PT-PN PCR-subtraksjonsbiblioteket og av et DNA-subtraksjonsbibliotek inneholdende cDNA fra prostatatumor subtrahert med en samling av normalt vev cDNA, førte til isolering av 27 ytterligere kloner (SEKV ID NR: 340-365 og 381) som ble funnet å være overuttrykt i prostatatumor. Klonene av SEKV ID NR: 341, 342, 345, 347, 348, 349, 351, 355-359, 361, 362 og 364 ble også funnet å være uttrykt i normal prostata. Ekspresjon av alle 26 kloner i en rekke normale vev ble funnet å være lav eller udetekterbar, med unntak av P544S (SEKV ID NR: 356) som ble funnet å være uttrykt i tynntarm. Av de 26 kloner ble 11 (SEKV ID NR: 340-349 og 362) funnet å vise noe homologi med tidligere identifiserte sekvenser. Ingen betydelige homologier ble funnet med klonene av SEKV ID NR: 350, 351, 353-361 og 363-365.

Sammenligning av sekvensen i SEKV ID NR: 362 med sekvenser i GenBank og GeneSeq DNA-databaser viste at denne klon (referert til som P788P) er identisk med GeneSeq aksesjonsnr. X27262, som koder for et protein funnet i GeneSeq proteinet aksesjonsnr. Y00931. Full-lengde cDNA-sekvensen av P788P er gitt i SEKV ID NR: 634, med den tilsvarende forutsagte aminosyre gitt i SEKV ID NR: 635. Deretter ble en full-lengde cDNA-sekvens for P788P som inneholder polymorfismer ikke funnet i sekvensen i SEKV ID NR: 634, klonet multiple ganger ved PCR-amplifisering fra cDNA fremstilt fra mange RNA-templater fra tre individer. Denne bestemte cDNA-sekvens av denne polymorfe variant av P788P er gitt i SEKV ID NR: 636, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEKV ID NR: 637. Sekvensen i SEKV ID NR: 637 skiller seg fra den i SEKV ID NR: 635 ved seks aminosyrerester. P788P-proteinet har 7 potensielle transmembran-domener ved den C-terminal del og er forutsagt å være et plasmamembran-protein med en ekstracellulær N-terminal region.

Ytterligere undersøkelser av klonen av SEKV ID NR: 352 (referert til som P790P) førte til isolering av full-lengde cDNA-sekvensen av SEKV ID NR: 526. Den tilsvarende forutsagte aminosyre er gitt i SEKV ID NR: 527. Data fra to kvantitative PCR-forsøk viste at P790P er overuttrykt i 11/15 testede prostatatumorprøver og er uttrykt i lave nivåer i ryggmarg, idet ingen ekspresjon ble sett i alle andre normale prøver testet. Data fra ytterligere PCR-forsøk og mikromatrise-forsøk viste overekspresjon i normal prostata og prostatatumor med liten eller ingen ekspresjon i andre vev testet. P790P ble deretter funnet å vise betydelig homologi med en tidligere identifisert G-protein-koblet prostatavev-reseptor.

Ytterligere undersøkelser av klonen av SEKV ID NR: 354 (referert til som P776P) førte til isolering av en forlenget cDNA-sekvens, gitt i SEKV ID NR: 569. De bestemte cDNA-sekvenser av tre ytterligere spleisevarianter av P776P er gitt i SEKV ID NR: 570-572. Aminosyresekvensene kodet for av to antatte åpne leserammer (ORF) inneholdt i SEKV ID NR: 570, én antatt ORF inneholdt i SEKV ID NR: 571 og 11 antatte ORF inneholdt i SEKV ID NR: 569, er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 573-586. Ytterligere undersøkelser førte til isolering av full-lengde-sekvensen for klonen av SEKV ID NR: 570 (gitt i SEKV ID NR: 737). Full-lengde kloningsanstrengelser for klonen av SEKV ID NR: 571 førte til isolering av to sekvenser (gitt i SEKV ID NR: 738 og 739), som representerte en enkel klon, som er identisk med unntak av en polymorf insersjon/delesjon i posisjon 1293. Spesifikt har klonen med SEKV ID NR: 739 (referert til som klon F1) en C i posisjon 1293. Klonen med SEKV ID NR: 738 (referert til som klon F2) har en enkel basepar delesjon i posisjon 1293. De antatte aminosyresekvenser kodet for av 5 åpne leserammer lokalisert i SEKV ID NR: 737 er gitt i SEKV ID NR: 740-744, med de antatte aminosyresekvenser kodet for av klonen av SEKV ID NR: 738 og 739 gitt i SEKV ID NR: 745-750.

Sammenligning av cDNA-sekvensene for klonene P767P (SEKV ID NR: 314) og P777P (SEKV ID NR: 350) med sekvenser i GenBank human EST-database viste at de to klonene felles matchet mange EST-sekvenser, hvilket indikerer at P767P og P777P kan representere samme gen. En DNA konsensus-sekvens avledet fra en DNA-sekvensoppstilling av P767P, P777P og multiple EST-kloner er gitt i SEKV ID NR: 587. Aminosyresekvensene kodet for av tre antatte ORF lokalisert i SEKV ID NR: 587 er gitt i SEKV ID NR: 588-590.

Klonen av SEKV ID NR: 342 (referert til som P789P) ble funnet å vise homologi med et tidligere identifisert gen. Full-lengde cDNA-sekvens for P789P og den tilsvarende aminosyresekvens er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 735 og 736.

EKSEMPEL 6

Petidrimin<g>af mus ogroa<g>erin<g>av CTL-linjer

6.1. Dette eksemplet illustrerer fremstilling av en CTL-cellelinje spesifikk for celler som uttrykker P502S-genet.

Mus som uttrykker transgenet for human HLA A2Kb (gitt av Dr L. Sherman, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) ble immunisert med P2S#12-peptid (VLGWVAEL; SEKV ID NR: 306), som er avledet fra P502S-genet (også referert til her som J1-17, SEKV ID NR: 8), som beskrevet av Theobald et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92:11993-11997, 1995 med de følgende modifikasjoner. Mus ble immunisert med 100 ug av P2S#12 og 120ug av et l-Ab -bindende peptid avledet fra hepatitt B Virus protein emulgert i ufullstendig Freunds adjuvans. Tre uker senere ble disse musene avlivet og ved anvendelse av et nylonnett ble enkle cellesuspensjoner fremstilt. Celler ble deretter resuspendert med 6 x 10<6>celler/ml i komplett medium (RPMI-1640; Gibco BRL, Gaithersburg, MD) inneholdende 10% FCS, 2mM Glutamin (Gibco BRL), natriumpyruvat (Gibco BRL), ikke-essensielle aminosyrer (Gibco BRL), 2 x 10'<5>M 2-merkaptoetanol, 50 U/ml penicillin og streptomycin og dyrket i nærvær av bestrålet (3000 rad) P2S#12-pulset (5 mg/ml P2S#12 og 10 mg/ml p2-mikroglobulin) LPS-blaster (A2 transgene miltceller dyrket i nærvær av 7 ug/ml dekstransulfat og 25ug/ml LPS i 3 dager). Seks dager senere ble cellene (5 x 105/ml) restimulert med 2,5 x 10<6>/ml peptid pulset bestrålede (20.000 rad) EL4A2KB-celler (Sherman et al, Science 258:815-818, 1992) og 3 x 10<6>/ml A2 transgene milt-mateceller. Celler ble dyrket i nærvær av 20U/ml IL-2. Celler ble fortsatt restimulert på en ukentlig basis som beskrevet, for preparering for kloning av linjen.

P2S#12-linje ble klonet ved begrensende fortynningsanalyse med peptid pulsede EL4 A2Kb tumorceller (1 x 10<4>celler/ brønn) som stimulatorer og A2 transgene miltceller som matere ( 5 x 10<5>celler/brønn) dyrket i nærvær av 30U/ml IL-2. På dag 14 ble cellene restimulert som før. På dag 21 ble kloner som vokste, isolert og holdt i kultur. Mange av disse kloner demonstrerte betydelig høyere reaktivitet (lyse) mot humane fibroblaster (HLA A2Kb- uttrykkende) transdusert med P502S enn mot kontroll-fibroblaster. Et eksempel er presentert i Figur 1.

Disse data indikerer at P2S #12 representerer en naturlig prosessert epitop av P502S-proteinet som er uttrykt i sammenheng med det humane HLA A2Kb molekyl.

6.2. Dette eksemplet illustrerer fremstilling av murine CTL-linjer og CTL-kloner spesifikke for celler som uttrykker P501S-genet.

Denne serien av forsøk ble utført tilsvarende til det beskrevet ovenfor. Mus ble immunisert med P1S#10-peptidet (SEKV ID NR: 337), som er avledet fra P501S-genet(også referert til her som L1-12, SEKV ID NR: 110). P1S#10-peptidet ble utledet ved analyse av den antatte polypeptidsekvens for P501S for potensielle HLA-A2 bindingssekvenser som definert ved publiserte HLA-A2-bindende motiver (Parker, KC, et al, J. Immunol., 152:163, 1994). P1S#10-peptid ble syntetisert som beskrevet i Eksempel 4 og empirisk testet for HLA-A2-binding ved anvendelse av et T-celle-basert kompetitivt forsøk. Forutsagte A2-bindende peptider ble testet for deres evne til konkurrere med HLA-A2-spesifikk peptid-presentasjon for en HLA-A2 begrenset CTL-klon (D150M58), som er spesifikk for det HLA-A2-bindende influensamatriks-peptid fluM58. D150M58 CTL utskiller TNF som respons på selv-presentasjon av peptid fluM58. I dette kompetitive forsøk, ble testpeptider med 100-200 ug/ml satt til kulturer av D150M58 CTL for å binde HLA-A2 på CTL. Etter 30 minutter ble CTL dyrket med testpeptider eller kontrollpeptider, testet for deres antigen-doserespons på fluM58-peptidet i en standard TNF-bioanalyse. Som vist i Figur 3, konkurrerer peptid P1S#10 med HLA-A2-begrenset presentasjon av fluM58, som demonstrerer at peptid P1S#10 binder HLA-A2.

Mus som uttrykker transgenet for human HLA A2Kb ble immunisert som beskrevet av Theobald et al. ( Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92:11993-11997, 1995) med de følgende modifikasjoner. Mus ble immunisert med 62,5ug av P1S #10 og 120ug av et l-Ab<->bindende peptid avledet fra Hepatitt B Virus protein emulgert i ufullstendig Freunds adjuvans. Tre uker senere ble disse musene avlivet og enkle cellesuspensjoner fremstilt ved anvendelse av et nylonnett. Cellene ble deretter resuspendert med 6 x 10<6>celler/ml i fullstendig medium (som beskrevet ovenfor) og dyrket i nærvær av bestrålede (3000 rad) P1S#10-pulsede (2ug/ml P1S#10 og 10 mg/ml p2-mikroglobulin) LPS-blaster (A2 transgene miltceller dyrket i nærvær av 7 ug/ml dekstransulfat og 25ug/ml LPS i 3 dager). Seks dager senere ble cellene (5 x 10<5>/ml) restimulert med 2,5 x 10<6>/ml peptid-pulsede bestrålede (20.000 rad) EL4A2KB-celler, som beskrevet ovenfor og 3 x 10<6>/ml A2 transgene milt-materceller. Cellene ble dyrket i nærvær av 20 U/ml IL-2. Cellene ble restimulert på en ukentlig basis for preparering for kloning. Etter tre runder av in vitro stimuleringer ble én linje dannet som gjenkjente P1S#10-pulsede Jurkat A2Kb-mål og P501S-transduserte Jurkat-mål som vist i Figur 4.

En P1S#10-spesifikk CTL-linje ble klonet ved begrensende fortynningsanalyse med peptid-pulsede EL4 A2Kb-tumorceller (1 x 10<4>celler/brønn) som stimulatorer og A2 transgene miltceller som matere (5 x 10<5>celler/brønn) dyrket i nærvær av 30U/ml IL-2. På dag 14 ble cellene restimulert som før. På dag 21 ble levedyktige kloner isolert og holdt i kultur. Som vist i Figur 5 demonstrerte fem av disse kloner spesifikk cytolytisk reaktivitet mot P501S-transduserte Jurkat A2Kb-mål. Disse data indikerer at P1S#10 representerer en naturlig prosessert epitop av P501S-proteinet som blir uttrykt i sammenheng med det humane HLA-A2.1-molekyl.

EKSEMPEL 7

Primin<g>av CTL in vivo ved anvendelse av naken DNA-immuniserin<g>

MED ET PROSTATA-ANTIGEN

Prostata-spesifikt antigen L1-12, som beskrevet ovenfor, er også referert til som P501S. HLA A2Kb Tg mus (gitt av Dr L. Sherman, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) ble immunisert med 100 ug P501S i vektoren VR1012 enten intramuskulært eller intradermalt. Musene ble immunisert tre ganger, med et to ukers intervall mellom immuniseringene. To uker etter siste immunisering ble immune miltceller dyrket med Jurkat A2Kb-P501S-transduserte stimulatorceller. CTL-linjer ble stimulert ukentlig. Etter to uker med in vitro stimulering ble CTL-aktivitet bedømt mot P501S-transduserte mål. To av 8 mus utviklet sterke anti-P501S CTL-responser. Disse resultater demonstrerer at P501S inneholder minst én naturlig prosessert HLA-A2-begrenset CTL-epitop.

EKSEMPEL 8

Evne til humane T-celler til å<g>jenkjenne prostata-spesifikkeol<yp>etider

Dette eksemplet illustrerer evnen til T-celler spesifikke for et prostatatumor-polypeptid til å gjenkjenne human tumor.

Humane CD8<+>T-celler ble primet in vitro til P2S-12-peptidet (SEKV ID NR: 306) avledet fra P502S (også referert til som J1-17) ved anvendelse av dendrittiske celler i henhold til protokollen til Van Tsai et al. { Critical Reviews in Immunology 78:65-75,1998). De resulterende CD8<+>T-celle-mikrokulturer ble testet for deres evne til å gjenkjenne P2S-12-peptidet presentert av autologe fibroblaster eller fibroblaster som var transdusert til å uttrykke P502S-genet i et y-interferon ELISPOT-forsøk (se Lalvani et al., J. Exp. Med. 786:859-865, 1997). Kort sagt ble titreringstall for T-celler undersøkt in duplo på 10<4>fibroblaster i nærvær av 3 (ag/ml human p2-mikroglobulin og 1 ug/ml P2S-12-peptid eller kontroll E75-peptid. I tillegg ble T-celler samtidig undersøkt på autologe fibroblaster transdusert med P502S-genet eller som en kontroll, fibroblaster transdusert med HER-2/neu. Før forsøket ble fibroblastene behandlet med 10 ng/ml y-interferon i 48 timer for å oppregulere klasse I MHC-ekspresjon. Én av mikrokulturene (#5) demonstrerte sterk gjenkjennelse av både peptid-pulsede fibroblaster så vel som transduserte fibroblaster i et y-interferon ELISPOT-forsøk. Figur 2A demonstrerer at det var en sterk økning i antallet av y-interferon-flekker med økende tall av T-celler på fibroblaster pulset med P2S-12-peptidet (fylte stolper) men ikke med kontroll E75 peptid (åpne stolper). Dette viser evnen til disse T-celler til spesifikt å gjenkjenne P2S-12-peptidet. Som vist i Figur 2B demonstrerte denne mikrokultur også en økning i antallet av y-interferon-flekker med økende tall av T-celler på fibroblaster transdusert til å uttrykke P502S-genet, men ikke HER-2/neu-genet. Disse resultater gir ytterligere bekreftende bevis for at P2S-12-peptidet er en naturlig prosessert epitop av P502S-proteinet. Videre demonstrerer dette også at det eksisterer i det humane T-celle-repertoar, høyaffinitet T-celler som kan gjenkjenne denne epitop. Disse T-celler vil også være i stand til å gjenkjenne humane tumorer som uttrykker P502S-genet.

EKSEMPEL 9

Fremkalling av prostata-antigen-spesifikke CTL-responser

i humant blod

Dette eksemplet illustrerer evnen til et prostata-spesifikt antigen til å fremkalle en CTL-respons i blod fra normale mennesker.

Autologe dendrittiske celler (DC) ble differensiert fra monocytt-kulturer avledet fra PBMC fra normale donorer ved vekst i fem dager i RPMI-medium inneholdende 10% humant serum, 50 ng/ml GMCSF og 30 ng/ml IL-4. Etter kultur ble DC infisert natten over med rekombinante P501S-uttrykkende vaccinia-virus med en M.O.I. på 5 og modnet i 8 timer ved tilsetning av 2 mikrogram/ml CD40-ligand. Virus ble inaktivert ved UV-bestråling, CD8<+->celler ble isolert ved positiv seleksjon ved anvendelse av magnetiske kuler og primingskulturer ble initiert i 24-brønn plater. Etter fem stimuleringscykler ved anvendelse av autologe fibroblaster retroviralt transdusert til å uttrykke P501S og CD80, ble CD8+ linjer identifisert som spesifikt produserte interferon-gamma når stimulert med autologe P501S-transduserte fibroblaster. Den P501S-spesifikke aktivitet til cellelinje 3A-1 kunne holdes etter ytterligere stimulerings-cykler på autolog B-LCL transdusert med P501S. Linje 3A-1 ble vist spesifikt å gjenkjenne autolog B-LCL transdusert til å uttrykke P501S, men ikke EGFP-transdusert autolog B-LCL, som målt ved cytotoksisitetsforsøk (<51>Cr frigjøring) og interferon-gamma-produksjon (Interferon-gamma Elispot; se ovenfor og Lalvani et al., J. Exp. Med. 186:859-865,1997). Resultatene av disse forsøk er presentert i Figurer 6A og 6B.

EKSEMPEL 10

Identifikasjon av en naturlig prosessert CTL-epitop inneholdt i prostata-spesifikt anti<g>en P703P

9-mer-peptidet p5 (SEKV ID NR: 338) ble avledet fra P703P-antigenet (også referert til som P20). p5-peptidet er immunogent i humane HLA-A2-donorer og er en naturlig prosessert epitop. Antigen-spesifikke humane CD8+ T-celler kan primes etter gjentatte in vitro stimuleringer med monocytter pulset med p5-peptid. Disse CTL gjenkjenner spesifikt p5-pulsede og P703P-transduserte målceller i både ELISPOT- (som beskrevet ovenfor) og krom-frigjørings-forsøk. I tillegg fører immunisering av HLA-A2Kb transgene mus med p5 til dannelse av CTL-linjer som gjenkjenner en rekke HLA-A2Kb- eller HLA-A2-transduserte målceller som uttrykker P703P.

Innledende undersøkelser som demonstrerer at p5 er en naturlig prosessert epitop ble utført ved anvendelse av HLA-A2Kb transgene mus. HLA-A2Kb transgene mus ble immunisert subkutant i fotputen med 100 ug p5-peptid sammen med 140 ug av hepatitt B virus kjernepeptid (et Th-peptid) i Freunds ufullstendige adjuvans. Tre uker etter immunisering ble miltceller fra immuniserte mus stimulert in vitro med peptid-pulsede LPS-blaster. CTL-aktivitet ble bedømt ved kromfrigjørings-forsøk fem dager etter primær in vitro stimulering. Retroviralt transduserte celler som uttrykker kontroll-antigenet P703P og HLA-A2Kb ble anvendt som mål. CTL-linjer som spesifikt gjenkjenner både p5-pulsede mål så vel som P703P-uttrykkende mål ble identifisert.

Humane in vitro primingsforsøk demonstrerte at p5-peptidet er immunogent for mennesker. Dendrittiske celler (DC) ble differensiert fra monocytt-kulturer avledet fra PBMC fra normale humane donorer ved dyrking i fem dager i RPMI-medium inneholdende 10% humant serum, 50 ng/ml humane GM-CSF og 30 ng/ml humane IL-4. Etter kulturen ble DC pulset med 1 ug/ml p5-peptid og dyrket med CD8+ T-celle-anriket PBMC. CTL-linjer ble restimulert på en ukentlig basis med p5-pulsede monocytter. Fem til seks uker etter initiering av CTL-kulturene ble CTL-gjenkjennelse av p5-pulsede målceller demonstrert. CTL ble i tillegg vist å gjenkjenne humane celler transdusert til å uttrykke P703P, som demonstrerer at p5 er en naturlig prosessert epitop.

Undersøkelser som identifiserer en ytterligere peptid-epitop (referert til som peptid 4) avledet fra prostatatumor-spesifikt antigen P703P som kan gjenkjennes av CD4 T-celler på overflaten av celler i sammenheng med HLA klasse ll-molekyler ble utført som følger. Aminosyresekvensen for peptid 4 er gitt i SEKV ID NR: 638, med den tilsvarende cDNA-sekvens gitt i SEKV ID NR: 639. 20 15-mer peptider overlappende med 10 aminosyrer og avledet fra det karboksy-terminale fragment av P703P ble dannet ved anvendelse av standard prosedyrer. Dendrittiske celler (DC) ble avledet fra PBMC fra en normal hunndonor ved anvendelse av GM-CSF og IL-4 ved standard protokoller. CD4 T-celler ble dannet fra samme donor som DC ved anvendelse av MACS-kuler og negativ seleksjon. DC ble pulset natten over med samlinger av 15-mer-peptider, med hvert peptid i en endelig konsentrasjon på 0,25 mikrogram/ml. Pulset DC ble vasket og platet ut med 1 x 10<4>celler/brønn av 96-brønn V-bunnede plater og rensede CD4 T-celler ble tilsatt med 1 x 10<5>/brønn. Kulturer ble supplert med 60 ng/ml IL-6 og 10 ng/ml IL-12 og inkubert ved 37 °C. Kulturer ble restimulert som ovenfor på en ukentlig basis ved anvendelse av DC dannet og pulset som ovenfor, som antigenpresenterende celler, supplert med 5 ng/ml IL-7 og 10 u/ml IL-2. Etter 4 in vitro stimuleringscykler ble 96 linjer (hver linje tilsvarende én brønn) testet for spesifikk proliferasjon og cytokinproduksjon som respons på stimuleringssamlingene, med en irrelevant samling av peptider avledet fra mammaglobin anvendt som kontroll. Én linje (referert til som 1-F9) ble identifisert fra samling #1 som demonstrerte spesifikk proliferasjon (målt ved 3H proliferasjonsforsøk) og cytokinproduksjon (målt ved interferon-gamma ELISA-forsøk) som respons på samling #1 av P703P-peptider. Denne linjen ble ytterligere testet for spesifikk gjenkjennelse av peptid-samlingen, spesifikk gjenkjennelse av individuelle peptider i samlingen og i HLA-mismatch-analyser for å identifisere det relevante restriksjons-allel. Linje 1-F9 ble funnet spesifikt å proliferere og produsere interferon-gamma som respons på peptid samling #1 og også peptid 4 (SEKV ID NR: 638). Peptid 4 svarer til aminosyrer 126-140 i SEKV ID NR: 327. Peptid-titreringsforsøk ble utført for å bedømme sensitiviteten av linje 1-F9 for det spesifikke peptid. Linjen ble funnet spesifikt å reagere på peptid 4 i konsentrasjoner så lave som 0,25 ng/ml, hvilket indikerer at T-cellene er meget sensitive og derfor sannsynlige å ha høy affinitet for epitopen.

For å bestemme HLA-restriksjonen av P703P-responsen, ble et panel av antigenpresenterende celler (APC) dannet som delvis var matchet med donoren anvendt for å danne T-cellene. APC ble pulset med peptidet og anvendt i proliferasjon- og cytokin-forsøk sammen med linje 1-F9. APC matchet med donoren ved HLA-DRB0701- og HLA-DQB02-alleler var i stand til å presentere peptidet for T-cellene, hvilket indikerte at den P703P-spesifikke respons er begrenset til ett av disse alleler.

Antistoff-blokkeringsforsøk ble anvendt for å bestemme om restriksjonsallelet var HLA-DR0701 eller HLA-DQ02. Anti-HLA-DR-blokkerende antistoff L243 eller en irrelevant isotype matchet lgG2a ble satt til T-celler og APC-kulturer pulset med peptidet RMPTVLQCVNVSWS (SEKV ID NR: 638) med 250 ng/ml. Standard interferon-gamma- og proliferasjons-forsøk ble utført. Mens kontroll-antistoffet ikke hadde noen virkning på evnen til T-cellene til å gjenkjenne peptid-pulset APC, blokkerte i begge forsøk anti-HLA-DR antistoff fullstendig evnen til T-cellene til spesifikt å gjenkjenne peptid-pulset APC.

For å bestemme om peptid-epitopen RMPTVLQCVNVSWS (SEKV ID NR: 638) ble naturlig prosessert, ble evnen til linje 1-F9 til å gjenkjenne APC pulset med rekombinant P703P-protein undersøkt. For disse forsøk ble flere rekombinante P703P-kilder anvendt; E. co//-avledet P703P, Pichia-avledet P703P og baculovirus-avledet P703P. Irrelevante protein-kontroller anvendt var E. coli -avledet L3E, et lunge-spesifikt antigen) og baculovirus-avledet mammaglobin. I interferon-gamma ELISA forsøk, var linje 1-F9 i stand til effektivt å gjenkjenne både E. coli- former av P703P så vel som Pichia-avledet rekombinant P703P, mens baculovirus-avledet P703P ble gjenkjent mindre effektivt. Påfølgende Western blot analyse viste at E coli- og Pichia P703P protein-preparater var intakte mens baculovirus P703P-preparatet ble omtrent 75% nedbrutt. Således er peptid RMPTVLQCVNVSWS (SEKV ID NR: 638) fra P703P en naturlig prosessert peptid-epitop avledet fra P703P og presentert til T-celler i sammenheng med HLA-DRB-0701.

I ytterligere undersøkelser ble 24 15-mer peptider overlappende med 10 aminosyrer og avledet fra det N-terminale fragment av P703P (svarende til aminosyrer 27-154 i SEKV ID NR: 525), dannet ved standard prosedyrer og deres evne til å gjenkjennes av CD4-celler ble bestemt i det vesentlige som beskrevet ovenfor. DC ble pulset natten over med samlinger av peptidene med hvert peptid i en endelig konsentrasjon på 10 mikrogram/ml. Et stort antall av individuelle CD4 T-cellelinjer (65/480) demonstrerte betydelig proliferasjon og cytokin-frigjøring (IFN-gamma) som respons på P703P-peptid-samlingene, men ikke på en kontroll-peptid-samling. CD4 T-cellelinjer som demonstrerte spesifikk aktivitet ble restimulert på den passende samling av P703P-peptider og igjen undersøkt på de individuelle peptider av hver samling så vel som en peptid-dosetitrering av samlingen av peptider i et IFN-gamma frigjøringsforsøk og i et proliferasjonsforsøk.

16 immunogene peptider ble gjenkjent av T-cellene fra hele settet av peptid-antigener testet. Aminosyresekvensene av disse peptider er gitt i SEKV ID NR: 656-671, med de tilsvarende cDNA-sekvenser gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 640-655. I noen tilfeller kunne peptid-reaktiviteten til T-cellelinjen kartlegges til et enkelt peptid, imidlertid kunne noen kartlegges til mer enn ett peptid i hver samling. De CD4 T-cellelinjer som viste et representativt mønster av gjenkjennelse fra hver peptid-samling med en rimelig affinitet for peptid ble valgt for videre analyse (1-1 A, -6A; II-4C, -5E; III-6E, IV-4B, -3F, -9B, -10F, V-5B, -4D og -10F). Disse CD4 T-celler linjer ble restimulert på det passende individuelle peptid og igjen undersøkt på autolog DC pulset med en forkortet form av rekombinant P703P-protein fremstilt i E. coli (aminosyrer 96 - 254 i SEKV ID NR: 525), full-lengde P703P fremstilt i baculovirus-ekspresjonssystemet og en fusjon mellom influensa-virus NS1 og P703P fremstilt i E. coli. Av T-cellelinjene testet gjenkjente linje 1-1A spesifikt den forkortede form av P703P (E. coli), men ingen annen rekombinant form av P703P. Denne linjee gjenkjente også peptidet anvendt for å fremkalle T-cellene. Linje 2-4C gjenkjente den forkortede form av P703P (E. coli) og full-lengde-formen av P703P fremstilt i baculovirus, så vel som peptid. De resterende T-cellelinjer testet var enten bare peptid-spesifikke (II-5E, II-6F, IV-4B, IV-3F, IV-9B, IV-10F, V-5B og V-4D) eller var ikke-responsive for noe antigen testet (V-10F). Disse resultater demonstrerer at peptidsekvensen RPLLANDLMLIKLDE (SEKV ID NR: 671; svarende til aminosyre 110-124 i SEKV ID NR: 525) gjenkjent av T-cellelinjen 1-1A og peptidsekvensene SVSESDTIRSISIAS (SEKV ID NR: 668; svarende til aminosyrene 125-139 i SEKV ID NR: 525) og ISIASQCPTAGNSCL (SEKV ID NR: 667; svarende til aminosyrenel 35-149 i SEKV ID NR: 525) gjenkjent av T-cellelinjen II-4C, kan være naturlig prosesserte epitoper av P703P-proteinet.

EKSEMPEL 11

Eksresjon av et br<y>sttumor-avledet anti<g>en i prostata

Isolering av antigenet B305D fra brysttumor ved differensielt display er beskrevet i US patentsøknad nr. 08/700,014, innlevert 20. august 1996. Mange forskjellige spleiseformer av dette antigen ble isolert. De bestemte cDNA-sekvenser for disse spleiseformer er gitt i SEKV ID NR: 366-375, med den antatte aminosyresekvenser svarende til sekvensene i SEKV ID NR: 292, 298 og 301-303 gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 299-306. I ytterligere undersøkelser ble en spleisevariant av cDNA-sekvensen av SEKV ID NR: 366 isolert, som ble funnet å inneholde en ytterligere guanin-rest i posisjon 884 (SEKV ID NR: 530), hvilket førte til et rammeskift i den åpne leserammen. Den bestemte DNA-sekvens av denne ORF er gitt i SEKV ID NR: 531. Dette rammeskift genererer en proteinsekvens (gitt i SEKV ID NR: 532) på 293 aminosyrer som inneholder det C-terminale domene felles med de andre isoformer av B305D, men som avviker i den N-terminale region.

Ekspresjonsnivåene av B305D i en rekke tumorvev og normalt vev ble undersøkt ved sanntid PCR og ved Northern analyse. Resultatene viste at B305D er sterkt uttrykt i brysttumor, prostatatumor, normal prostata og normal testikkel, idet ekspresjonen er lav eller udetekterbar i alle andre vev undersøkt (kolontumor, lungetumor, eggstokktumor og normal benmarg, kolon, nyre,

lever, lunge, eggstokk, hud, tynntarm, mage). Ved anvendelse av sanntid PCR på et panel av prostatatumorer, ble ekspresjon av B305D i prostatatumorer vist

å øke med økende Gleason-grad, hvilket demonstrerer at ekspresjon av B305D øker ettersom prostatakreft utvikles.

EKSEMPEL 12

Dannelse av human CTL in vitro ved anvendelse av hel-genrimin<g>og stimulerin<g>steknikker med prostata-spesifikt anti<g>en P501S

Ved anvendelse av in vitro hel-gen priming med P501S-vaccinia infisert DC (se for eksempel Yee et al, The Journal of Immunology, 157(9):4079-86, 1996), ble humane CTL-linjer avledet som spesifikt gjenkjenner autologe fibroblaster transdusert med P501S (også kjent som L1-12), som bestemt ved interferon-y ELISPOT-analyse som beskrevet ovenfor. Ved anvendelse av et panel av HLA-mismatchede B-LCL-linjer transdusert med P501S, ble disse CTL-linjer vist sannsynlig å bli begrenset til HLAB klasse l-allel. Spesifikt ble dendrittiske celler (DC) differensiert fra monocytt-kulturer avledet fra PBMC fra normale humane donorer, ved dyrking i fem dager i RPMI-medium inneholdende 10% humant serum, 50 ng/ml human GM-CSF og 30 ng/ml human IL-4. Etter kulturen ble DC infisert natten over med rekombinant P501S vaccinia-virus med en multiplisitet av infeksjon (M.O.I) på fem og modnet natten over ved tilsetning av 3 ng/ml CD40 ligand. Virus ble inaktivert ved UV-bestråling. CD8+ T-celler ble isolert ved anvendelse av et magnetisk kule-system og primingskulturer ble initiert ved anvendelse av standard kultur-teknikker. Kulturer ble restimulert hver 7-10 dager ved anvendelse av autologe primære fibroblaster retroviralt transdusert med P501S og CD80. Etter fire stimuleringscykler ble CD8+ T-cellelinjer identifisert som spesifikt produserte interferon-y når stimulert med P501S og CD80-transduserte autologe fibroblaster. Et panel av HLA-mismatchede B-LCL-linjer transdusert med P501S ble dannet for å definere restriksjons-allelet av responsen. Ved å måle interferon-y i et ELISPOT-forsøk ble den P501S-spesifikke respons vist sannsynlig å være begrenset av HLA B-alleler. Disse resultater demonstrerer at en CD8+ CTL-respons på P501S kan fremkalles.

For å identifisere epitopen(e) gjenkjent ble cDNA som koder for P501S fragmentert ved forskjellige restriksjonsfordøyelser og sub-klonet inn i den retrovirale ekspresjonsvektor pBIB-KS. Retrovirale supernatanter ble dannet ved transfeksjon av hjelper pakkingslinje Phoenix-Ampho. Supernatanter ble deretter anvendt for å trandusere Jurkat/A2KB-celler for CTL-screening. CTL ble screenet i IFN-gamma ELISPOT-forsøk mot disse A2Kb-mål transdusert med "biblioteket" av P501S-fragmenter. Innledende positive fragmenter P501S/H3 og P501S/F2 ble sekvensert og funnet å kode for aminosyrer henholdsvis 106-553 og aminosyrer 136-547, av SEKV ID NR: 113. En avkutting av H3 ble utført for å kode for aminosyrerester 106-351 av SEKV ID NR: 113, som ikke var i stand til å stimulere CTL, og således lokalisere epitopen til aminosyrerester 351-547. Ytterligere fragmenter som koder for aminosyrer 1-472 (Fragment A) og aminosyrer 1-351 (Fragment B) ble også konstruert. Fragment A, men ikke Fragment B, stimulerte CTL og lokaliserte således epitopen til aminosyrerester 351-472. Overlappende 20-mer og 18-mer peptider som representerte denne region ble testet ved å pulse Jurkat/A2KB-celler mot CTL i et IFN-gamma-forsøk. Bare peptider P501S-369(20) og P501S-369(18) stimulerte CTL. 9-mer og 10-mer peptider som representerer denne region ble syntetisert og tilsvarende testet. Peptid P501S-370 (SEKV ID NR: 539) var den minimale 9-mer som ga en sterk respons. Peptid P501S-376 (SEKV ID NR: 540) ga også en svak respons, hvilket indikerer at den kunne representere en kryss-reaktiv epitop.

I påfølgende undersøkelser ble evnen til primære humane B-celler transdusert med P501S for å prime MHC klasse l-begrenset, P501S-spesifikke, autologe CD8 T-celler undersøkt. Primære B-celler ble avledet fra PBMC fra en homozygot HLA-A2-donor ved kultur i CD40-ligand og IL-4, transdusert med høy frekvens med rekombinant P501S i vektoren pBIB og selektert med blastocidin-S. For in vitro priming ble rensede CD8+ T-celler dyrket med autologe CD40 ligand + IL-4 avledede, P501S-transduserte B-celler i et 96-brønn mikrokultur-format. Disse CTL-mikrokulturer ble restimulert med P501S-transduserte B-celler og deretter undersøkt for spesifisitet. Etter denne innledende screening ble mikrokulturer med betydelig signal over bakgrunn, klonet på autologe EBV-transformerte B-celler (BLCL) også transdusert med P501S. Ved anvendelse av IFN-gamma ELISPOT for deteksjon ble mange av disse CD8 T-celle-kloner funnet å være spesifikke for P501S, som demonstrert ved reaktivitet til BLCL/P501S men ikke BLCL transdusert med kontroll-antigen. Det ble videre demonstrert at anti-P501S CD8 T-celle-spesifisitet er HLA-A2-begrenset. For det første viste antistoff-blokkeringsforsøk med anti-HLA-A,B,C monoklonalt antistoff (W6.32), anti-HLA-B,C monoklonalt antistoff (B1.23.2) og et kontroll monoklonalt antistoff, at bare anti-HLA-A,B,C antistoff blokkerte gjenkjennelse av P501S-uttrykkende autologe BLCL. For det andre gjenkjente anti-P501S CTL også HLA-A2 matchet, heterolog BLCL transdusert med P501S, men ikke den tilsvarende EGFP-transduserte kontroll-BLCL.

En naturlig prosessert, CD8, klasse l-begrenset peptid-epitop av P501S ble identifisert som følger. Dendrittiske celler (DC) ble isolert ved Percol-gradient fulgt av differensiell adherens og dyrket i 5 dager i nærvær av RPMI-medium inneholdende 1% humant serum, 50ng/ml GM-CSF og 30ng/ml IL-4. Etter kulturen ble DC infisert i 24 timer med P501S-uttrykkende adenovirus med en MOI på 10 og modnet i ytterligere 24 timer med tilsetning av 2 ug/ml CD40 ligand. CD8-celler ble anriket ved subtraksjon av CD4+, CD14+ og CD16+ populasjoner fra PBMC med magnetiske kuler. Primingskulturer inneholdende 10,000 P501S-uttrykkende DC og 100,000 CD8+ T-celler pr. brønn ble satt opp i 96-brønn V-bunn plater med RPMI inneholdende 10% humant serum, 5ng/ml IL-12 og 10ng/ml IL-6. Kulturer ble stimulert hver 7. dag ved anvendelse av autologe fibroblaster retroviralt transdusert til å uttrykke P501S og CD80 og ble behandlet med IFN-gamma i 48-72 timer for å oppregulere MHC Klasse l-ekspresjon. 10 u/ml IL-2 ble tilsatt på tidspunktet for stimulering og på dager 2 og 5 etter stimulering. Etter 4 stimulerings-cykler, ble én P501S-spesifikk CD8+ T-cellelinje (referert til som 2A2) identifisert som produserte IFN-gamma som respons på IFN-gamma-behandlede P501S/CD80- uttrykkende autologe fibroblaster, men ikke som respons på IFN-gamma-behandlede P703P/CD80-uttrykkende autologe fibroblaster i et y-IFN Elispot forsøk. Linje 2A2 ble klonet i 96-brønn plater med 0,5 celle/brønn eller 2 celler/brønn i nærvær av 75,000 PBMC/brønn, 10,000 B-LCL/brønn, 30ng/ml OKT3 og 50u/ml IL-2. Tolv kloner ble isolert som viste sterk P501S-spesifisitet som respons på transduserte fibroblaster.

Fluorescens-aktivert cellesorterings- (FACS) analyse ble utført på P501S-spesifikke kloner ved anvendelse av CD3-, CD4- og CD8-spesifikke antistoffer konjugert til henholdsvis PercP, FITC og PE. I overensstemmelse med anvendelse av CD8-anrikede T-celler i primingskulturene, ble P5401S-spesifikke kloner funnet å være CD3+, CD8+ og CD4-.

For å identifisere den relevante P501S-epitop gjenkjent av P501S-spesifikk CTL, ble samlinger av 18-20 mer eller 30-mer peptider som spente over hoveddelen av aminosyresekvensen av P501S lastet på autolog B-LCL og testet i y-IFN Elispot-forsøk for evnen til å stimulere to P501S-spesifikke CTL-kloner, referert til som 4E5 og 4E7. Én samling, sammensatt av fem 18-20 mer peptider som spente over aminosyrer 411-486 av P501S (SEKV ID NR: 113), ble funnet å gjenkjennes av begge P501S-spesifikke kloner. For å identifisere det spesifikke 18-20 mer peptid gjenkjent av klonene, ble hver av 18-20 mer peptidene som omfattet den positive samling, testet individuelt i y-IFN Elispot-forsøk for evnen til å stimulere de to P501S-spesifikke CTL-kloner, 4E5 og 4E7. Både 4E5 og 4E7 gjenkjente spesifikt ett 20-mer peptid (SEKV ID NR: 710; cDNA-sekvens gitt i SEKV ID NR: 711) som spente over aminosyrer 453-472 av P501S. Siden den minimale epitop gjenkjent av CD8+ T-celler nesten alltid er enten en 9- eller 10-mer peptidsekvens, ble 10-mer peptider som spente over hele sekvens av SEKV ID NR: 710, syntetisert som avvek med 1 aminosyre. Hver av disse 10-mer peptider ble testet for evnen til å stimulere to P501S-spesifikke kloner, (referert til som 1D5 og 1E12). Ett 10-mer peptid (SEKV ID NR: 712; cDNA-sekvens gitt i SEKV ID NR: 713) ble identifisert som spesifikt stimulerte P501S-spesifikke kloner. Denne epitop spenner over aminosyrer 463-472 av P501S. Denne sekvensen definerer en minimal 10-mer epitop fra P501S som naturlig kan prosesseres og til hvilken CTL-responser kan identifiseres i normal PBMC. Således er denne epitop en kandidat for anvendelse som en vaksine-enhet og som et terapeutisk og/eller diagnostisk reagens mot prostatakreft.

For å identifisere klasse l-restriksjonselement for den P501S-avledede sekvens av SEKV ID NR: 712, ble HLA-blokkerings- og mismatch-analyser utført. I y-IFN Elispot-forsøk ble den spesifikke respons av kloner 4A7 og 4E5 til P501S-transduserte autologe fibroblaster blokkert ved preinkubering med 25 ug/ml W6/32 (pan-Klasse I blokkerende antistoff) og B1.23.2 (HLA-B/C blokkerende antistoff). Disse resultater demonstrerer at SEKV ID NR: 712-

spesifikk respons er begrenset til et HLA-B- eller HLA-C-allel.

For HLA-mismatch-analyse ble autolog B-LCL (HLA-A1,A2,B8,B51, Cw1, Cw7) og heterolog B-LCL (HLA-A2,A3,B18,B51,Cw5,Cw14) som har et felles HLAB51-allel, pulset i én time med 20ug/ml peptid med SEKV ID NR: 712, vasket og testet i y-IFN Elispot-forsøk for evnen til å stimulere kloner 4A7 og 4E5. Antistoff-blokkeringsforsøk med B1.23.2 (HLA-B/C blokkerende antistoff) ble også utført. SEKV ID NR: 712-spesifikk respons ble detektert ved anvendelse av både autolog (D326) og heterolog (D107) B-LCL og videre ble responsene blokkert ved preinkubering med 25ug/ml B1.23.2 HLA-B/C-blokkerende antistoff. Sammen demonstrerer disse resultater at P501S-spesifikk respons på peptidet med SEKV ID NR: 712 er begrenset til HLA-B51 klasse l-allel. Molekylær kloning og sekvensanalyse av HLA-B51-allel fra D3326 viste at HLA-B51-undertype av D326 er HLA-B51011.

Basert på den 10-mer P501S-avledede epitop med SEKV ID NR: 712, ble to 9-merer med sekvensene SEKV ID NR: 714 og 715 syntetisert og testet i Elispot-forsøk for evnen til å stimulere to P501S-spesifikke CTL-kloner avledet fra linje 2A2. 10-mer peptidet med SEKV ID NR: 712, så vel som 9-mer peptidet med SEKV ID NR: 715, men ikke 9-mer peptidet med SEKV ID NR: 714, var i stand til å stimulere P501S-spesifikk CTL til å produsere IFN-gamma. Disse resultater demonstrerer at peptidet med SEKV ID NR: 715 er en 9-mer P501S-avledet epitop gjenkjent av P501S-spesifikk CTL. DNA-sekvensen som koder for epitopen med SEKV ID NR: 715 er gitt i SEKV ID NR: 716.

For å identifisere det klasse l-begrensende allel for P501S-avledet peptid med SEKV ID NR: 712 og 715 spesifikk respons, ble hver av HLA B- og C-alleler klonet fra donoren anvendt i in vitro primingsforsøket. Sekvensanalyse viste at de relevante alleler var HLA-B8, HLA-B51, HLA-Cw01 og HLA-Cw07. Hver av disse alleler ble subklonet inn i en ekspresjonsvektor og kotransfektert sammen med P501S-gen til VA-13 celler. Transfekterte VA-13-celler ble deretter testet for evnen til spesifikt å stimulere P501S-spesifikk CTL i ELISPOT-forsøk. VA-13-celler transfektert med P501S og HLA-B51 var i stand til å stimulere P501S-spesifikk CTL til å utskille gamma-IFN. VA-13-celler transfektert med HLA-B51 alene eller P501S + de andre HLA-alleler var ikke i stand til å stimulere P501S-spesifikk CTL. Disse resultater demonstrerer at det begrensende allel for den P501S-spesifikke respons er HLAB51-allelet. Sekvensanalyse viste at undertypen av det relevante restriksjons-allel er HLA-B51011.

For å bestemme hvorvidt P501S-spesifikk CTL kunne gjenkjenne prostatatumorceller som uttrykker P501S, ble de P501S-positive linjer LnCAP og CRL2422 (som begge uttrykker "moderate" mengder av P501S mRNA og protein) og PC-3 (som uttrykker lave mengder av P501S mRNA og protein), pluss den P501S-negative cellelinje DU-145, retroviralt transdusert med HLA-B51011 -allel som var klonet fra donoren, anvendt for å danne P501 S-spesifikk CTL. HLA-B51011- eller EGFP-transduserte og selekterte tumorceller ble behandlet med gamma-interferon og androgen (for å oppregulere henholdsvis stimulerende funksjoner og P501S) og anvendt i gamma-interferon Elispot-forsøk med de P501S-spesifikke CTL-kloner 4E5 og 4E7. Ubehandlede celler ble anvendt som kontroll.

Både 4E5 og 4E7 gjenkjente effektivt og spesifikt LnCAP- og CRL2422-celler som ble transdusert med HLA-B51011-allelet, men ikke samme cellelinjer transdusert med EGFP. I tillegg gjenkjente begge CTL-kloner spesifikt PC-3-celler transdusert med HLA-B51011, men ikke den P501S-negative tumorcellelinje DU-145. Behandling med gamma-interferon eller androgen forbedret ikke evnen til CTL til å gjenkjenne tumorceller. Disse resultater demonstrerer at P501 S-spesifikk CTL, dannet ved in vitro hel-gen-priming, spesifikt og effektivt gjenkjenner prostatatumorcellelinjer som uttrykker P501S.

En naturlig prosessert CD4-epitop av P501S ble identifisert som følger.

CD4-celler spesifikke for P501S ble fremstilt som beskrevet ovenfor. En serie av 16 overlappende peptider ble syntetisert som spente over omtrent 50% av den amino-terminale del av P501S-genet (aminosyrer 1- 325 i SEKV ID NR: 113). For priming ble peptider samlet i samlinger på 4 peptider, pulset med 4 ug/ml på dendrittiske celler (DC) i 24 timer, med TNF-alfa. DC ble deretter vasket og blandet med negativt selekterte CD4+ T-celler i 96 brønn U-bunn-plater. Kulturene ble restimulert ukentlig på friske DC lastet med peptid-samlinger. Etter totalt 4 stimuleringscykler fikk cellene hvile i ytterligere en uke og ble testet for spesifisitet til APC pulset med peptid-samlinger ved anvendelse av y-IFN ELISA- og proliferasjons-forsøk. Fordisse forsøk ble adherente monocytter lastet med enten den relevante peptid-samling med 4ug/ml eller et irrelevant peptid med ug/ml, anvendt som APC. T-cellelinjer som demonstrerte enten spesifikk cytokin-sekresjon eller proliferasjon ble deretter testet for gjenkjennelse av individuelle peptider som var til stede i samlingen. T-cellelinjer kunne identifiseres fra samlinger A og B som gjenkjente individuelle peptider fra disse samlinger.

Fra samling A gjenkjente linjer AD9 og AE10 spesifikt peptid 1 (SEKV ID NR: 719) og linje AF5 gjenkjente peptid 39 (SEKV ID NR: 718). Fra samling B kunne linje BC6 identifiseres som gjenkjente peptid 58 (SEKV ID NR: 717). Hver av disse linjer ble stimulert på det spesifikke peptid og testet for spesifikk gjenkjennelse av peptidet i et titreringsforsøk så vel som cellelysater dannet ved infeksjon av HEK 293-celler med adenovirus som uttrykker enten P501S eller et irrelevant antigen. For disse forsøk ble APC-adherente monocytter pulset med enten 10,1 eller 0,1 ug/ml individuelle P501S-peptider og DC ble pulset natten over med en 1:5 fortynning av adenoviralt infiserte cellelysater. Linjer AD9, AE10 og AF5 beholdt betydelig gjenkjennelse av de relevante P501S-avledede peptider selv ved 0,1 mg/ml. Videre demonstrerte linje AD9 betydelig (8,1 ganger stimuleringsindeks) spesifikk aktivitet for lysater fra adenovirus-P501S-infiserte celler. Disse resultater demonstrerer at høyaffinitet CD4 T-cellelinjer kan dannes mot P501S-avledete epitoper og at minst ett subsett av disse T-celler spesifikke for den P501S-avledete sekvens av SEKV ID NR: 719, er spesifikk for en epitop som blir naturlig prosessert av humane celler. DNA-sekvensene som koder for aminosyresekvensene med SEKV ID NR: 717-719 er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 720-722.

For ytterligere å karakterisere den P501S-spesifikke aktivitet til AD9, ble linjen klonet ved anvendelse av anti-CD3. Tre kloner, referert til som 1A1, 1A9 og 1F5, ble identifisert som var spesifikke for P501S-1-peptidet (SEKV ID NR: 719). For å bestemme HLA-restriksjons-allelet for den P501 S-spesifikke respons, ble hver av disse kloner testet i klasse II antistoff-blokkerings- og HLA-mismatch-forsøk ved anvendelse av proliferasjons- og gamma-interferon-forsøk. I antistoff-blokkerings-forsøk og måling av gamma-interferon-produksjon ved anvendelse av ELISA-forsøk, ble evnen til alle tre kloner til å gjenkjenne peptid-pulset APC, spesifikt blokkert ved koinkubering med enten et pan-klasse ll-blokkerende antistoff eller et HLA-DR-blokkerende antistoff, men ikke med HLA-DQ eller et irrelevant antistoff. Proliferasjonsforsøk utført samtidig med samme celler bekreftet disse resultater. Disse data indikerer at den P501S-spesifikke respons av klonene blir begrenset av et HLA-DR-allel. Ytterligere undersøkelser demonstrerte at restriksjons-allelet for den P501S-spesifikke respons er HLA-DRB1501.

EKSEMPEL 13

Identifikasjon av prostata-spesifikke anti<g>ener ved mikromatrise-analyse

Et humant prostatatumor-cDNA-ekspresjonsbibliotek som beskrevet ovenfor ble screenet ved anvendelse av mikromatrise-analyse for å identifisere kloner som viser minst en tre ganger overekspresjon i prostatatumor og/eller normalt prostatavev, sammenlignet med ikke-prostata normalt vev (ikke omfattende testikkel). 372 kloner ble identifisert og 319 ble med hell sekvensert. Tabell I presenterer en oppsummering av disse kloner, som er vist i SEKV ID NR:385-400. Av disse sekvenser svarer SEKV ID NR: 386, 389, 390 og 392 til nye gener og SEKV ID NRs: 393 og 396 svarer til tidligere identifiserte sekvenser. De andre (SEKV ID NR: 385, 387, 388, 391, 394, 395 og 397-400) svarer til kjente sekvenser, som vist i Tabell I.

CGI-82 viste 4,06 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den ble overuttrykt i 43% av prostatatumorer, 25% normal prostata, ikke detektert i andre normale vev testet. L-iditol-2-dehydrogenase viste 4,94 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den ble overuttrykt i 90% av prostatatumorer, 100% av normal prostata og ikke detektert i andre normale vev testet. Ets-transkripsjonsfaktor PDEF viste 5,55 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den ble overuttrykt i 47% prostatatumorer, 25% normal prostata og ikke detektert i andre normale vev testet. hTGR1 viste 9,11 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den ble overuttrykt i 63% av prostatatumorer og ble ikke detektert i normale vev testet omfattende normal prostata. KIAA0295 viste 5,59 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den ble overuttrykt i 47% av prostatatumorer, og var lav til udetekterbar i normale vev testet omfattende normalt prostatavev. Prostatisk syrefosfatase viste 9,14 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den ble overuttrykt i 67% av prostatatumorer, 50% av normal prostata og ikke detektert i andre normale vev testet. Transglutaminase viste 14,84 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den ble overuttrykt i 30% av prostatatumorer, 50% av normal prostata og ikke detektert i andre normale vev testet. Høydensitet lipoprotein-bindingsprotein (HDLBP) viste 28,06 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den ble overuttrykt i 97% av prostatatumorer, 75% av normal prostata og er udetekterbar i alle andre normale vev testet. CGI-69 viste 3,56 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Det er et lite forekommende gen, detektert i mer enn 90% av prostatatumorer og i 75% av normalt prostatavev. Ekspresjonen av dette genet i normalt vev var meget lav. KIAA0122 viste 4,24 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den ble overuttrykt i 57% av prostatatumorer, den var udetekterbar i alle normale vev testet omfattende normalt prostatavev. 19142,2 bangur viste 23,25 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den ble overuttrykt i 97% av prostatatumorer og 100% av normal prostata. Den var udetekterbar i andre normale vev testet. 5566,1 Wang viste 3,31 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den var overuttrykt i 97% av prostatatumorer, 75% av normal prostata og var også overuttrykt i normal benmarg, bukspyttkjertel og aktivert PBMC. Ny klon 23379 (også referert til som P553S) viste 4,86 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den var detekterbar i 97% av prostatatumorer og 75% av normal prostata og var udetekterbar i alle andre normale vev testet. Ny klon 23399 viste 4,09 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den var overuttrykt i 27% av prostatatumorer og var udetekterbar i alle normale vev testet, omfattende normalt prostatavev. Ny klon 23320 viste 3,15 ganger overekspresjon i prostatavev sammenlignet med andre normale vev testet. Den var detekterbar i alle prostatatumorer og 50% av normalt prostatavev. Den var også uttrykt i normal kolon og luftrør. Andre normale vev uttrykker ikke dette genet i et høyt nivå.

Påfølgende full-lengde kloningsundersøkelser av P553S, ved anvendelse av standard teknikker, viste at denne klon er en ufullstendig spleiset form av P501S. De bestemte cDNA-sekvenser for fire spleisevarianter av P553S er gitt i SEKV ID NR: 623-626. En aminosyresekvens kodet for av SEKV ID NR: 626 er gitt i SEKV ID NR: 627. cDNA-sekvensen av SEKV ID NR: 623 ble funnet å inneholde to åpne leserammer (ORF). Aminosyresekvensene kodet for av disse to ORF er gitt i SEKV ID NR: 628 og 629.

EKSEMPEL 14

Identifikasjon av prostata-spesifikke anti<g>ener ved elektronisk subtraksjon

Dette eksemplet beskriver anvendelse av en elektronisk subtraksjonsteknikk for å identifisere prostata-spesifikke antigener.

Potensielle prostata-spesifikke gener til stede i GenBank human EST-database ble identifisert ved elektronisk subtraksjon (lignende den beskrevet av

Vasmatizis et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 95:300-304,1998). Sekvensene av EST-kloner (43,482) avledet fra forskjellige prostatabiblioteker ble oppnådd fra GenBank offentlige human EST-database. Hver prostata-EST-sekvens ble anvendt som en spørresekvens i et BLASTN- (National Center for Biotechnology Information) søk mot human EST-databasen. Alle matcher betraktet som identiske (lengde av matchende sekvens >100 basepar, densitet av identiske matcher over denne region > 70%) ble gruppert (oppstilt) sammen i et duster. Clustere inneholdende mer enn 200 EST ble kastet ettersom de sannsynligvis representerte repeterende elementer eller høyt uttrykte gener så som de for ribosomale proteiner. Hvis to eller flere clustere hadde felles EST, ble disse clustere ble gruppert sammen i et "superduster," hvilket resulterte i 4.345 prostata-superclustere.

Poster for de 479 humane cDNA-biblioteker representert i GenBank-utgivelsen ble lastet ned for å skape en database av disse cDNA-bibliotek-poster. Disse 479 cDNA-biblioteker ble gruppert i tre grupper: Pluss (normal prostata- og prostatatumor-biblioteker og brystcellelinje-biblioteker, hvor ekspresjon var ønsket), Minus (biblioteker fra andre normale vev fra voksne, hvor ekspresjon ikke var ønskelig) og Andre (biblioteker fra føtalt vev, barnevev, vev funnet bare hos kvinner, ikke-prostatatumorer og cellelinjer forskjellig fra prostatacellelinjer, hvor ekspresjon ble betraktet å være irrelevant). En oppsummering av disse bibliotekgrupper er presentert i Tabell

II.

Hvert superduster ble analysert uttrykt som EST i superclusteret. Vevkilden for hver EST-klon ble notert og anvendt for å klassifisere superdusterne i fire grupper: Type 1- EST-kloner funnet bare i Pluss-gruppe biblioteker; ingen ekspresjon detektert i Minus- eller Andre-gruppe biblioteker; Type 2- EST-kloner avledet bare fra Pluss- og Andre-gruppe biblioteker; ingen ekspresjon detektert i Minus-gruppen; Type 3- EST-kloner avledet fra Pluss-, Minus- og Andre-gruppe biblioteker, men antallet EST avledet fra Pluss-gruppen er høyere enn i Minus- eller Andre-grupper; og Type 4- EST-kloner avledet fra Pluss-, Minus- og Andre-gruppe biblioteker, men antallet avledet fra Pluss-gruppen er høyere enn antallet avledet fra Minus-gruppen. Denne analyse identifiserte 4345 bryst-clustere (se Tabell III). Fra disse dustere, ble 3172 EST-kloner bestilt fra Research Genetics, Inc. og mottatt som frosne glycerol-lagere i 96-brønn plater.

EST-klon-insersjonene ble PCR-amplifisert ved anvendelse av amino-bundete PCR-primere for Synteni mikromatrise-analyse. Når mer enn ett PCR-produkt ble oppnådd for en spesiell klon, ble det PCR-produktet ikke anvendt for ekspresjonsanalyse. Totalt ble 2528 kloner fra den elektroniske subtraksjonsmetoden analysert ved mikromatrise-analyse for å identifisere brystkloner fra elektronisk subtraksjon som hadde høye nivåer av tumor- vs. normalt vev-mRNA. Slike screeninger ble utført ved anvendelse av en Synteni (Palo Alto, CA) mikromatrise, i henhold til produsentens instruksjoner (og i det vesentlige som beskrevet av Schena et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:10614-10619, 1996 og Heller et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:2150-2155, 1997). Ved disse analyser ble klonene arrangert i matrise på brikken, som deretter ble probet med fluorescerende prober dannet fra normal- og tumorprostata-cDNA, så vel som forskjellige andre normale vev. Slides ble scannet og fluorescens-intensitet ble målt.

Kloner med et ekspresjonsforhold større enn 3 ( dvs. nivået i prostatatumor- og normal prostata-mRNA var minst tre ganger nivået i annet normalt vev-mRNA) ble identifisert som prostatatumor-spesifikke sekvenser (Tabell IV). Sekvensene av disse kloner er gitt i SEKV ID NR: 401-453, med visse nye sekvenser vist i SEKV ID NR: 407, 413, 416-419, 422, 426, 427 og 450.

Ytterligere undersøkelser av klonen med SEKV ID NR: 407 (også referert til som P1020C) førte til isolering av en forlenget cDNA-sekvens gitt i SEKV ID NR: 591. Denne utvidede cDNA-sekvens ble funnet å inneholde en åpen leseramme som koder for den antatte aminosyresekvens i SEKV ID NR: 592. P1020C cDNA og aminosyresekvenser ble funnet å vise noe similaritet med det humane endogene retrovirale HERV-K pol-gen og protein.

EKSEMPEL 15

Ytterligere identifikasjon av prostata-spesifikke antigener ved mikromatrise-analyse

Dette eksemplet beskriver isolering av ytterligere prostata-spesifikke polypeptider fra et prostatatumor-cDNA-bibliotek.

Et humant prostatatumor-cDNA-ekspresjonsbibliotek som beskrevet ovenfor ble screenet ved anvendelse av mikromatrise-analyse for å identifisere kloner som viste en minst tre ganger overekspresjon i prostatatumor og/eller normalt prostatavev, sammenlignet med ikke-prostata normalt vev (ikke omfattende testikkel). 142 kloner ble identifisert og sekvensert. Visse av disse kloner er vist i SEKV ID NR: 454-467. Av disse sekvenser representerer SEKV ID NR: 459-460 nye gener. De andre (SEKV ID NR: 454-458 og 461-467) svarer til kjente sekvenser. Sammenligning av den bestemte cDNA-sekvens av SEKV ID NR: 461 med sekvenser i Genbank-databasen ved anvendelse av BLAST-programmet avslørte homologi med det tidligere identifiserte transmembran-protease-serin 2 (TMPRSS2). Full-lengde cDNA-sekvens for denne klon er gitt i SEKV ID NR: 751, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEKV ID NR: 752. cDNA-sekvensen som koder for de første 209 aminosyrer i TMPRSS2 er gitt i SEKV ID NR: 753, idet de første 209 aminosyrer er gitt i SEKV ID NR: 754.

Sekvensen i SEKV ID NR: 462 (referert til som P835P) ble funnet å svare til den tidligere identifiserte klon FLJ13518 (Aksesjon AK023643; SEKV ID NR: 774), som ikke hadde noen assosiert åpen leseramme (ORF). Denne klon ble anvendt for søk i Geneseq DNA-databasen og matchet en klon tidligere identifisert som et G protein-koblet reseptorprotein (DNA Geneseq Aksesjon A09351; aminosyre Geneseq Aksesjon Y92365), som erkarakterisertved tilstedeværelsen av syv transmembran-domener. Sekvensene av fragmenter mellom disse domener er gitt i SEKV ID NR: 778-785, hvor SEKV ID NR: 778, 780, 782 og 784 representerer ekstracellulære domener og SEKV ID NR: 779, 781, 783 og 785 representerer intracellulære domener. SEKV ID NR: 778-785 representerer henholdsvis aminosyrer 1-28, 53-61, 83-103,124-143, 165-201, 226-238, 263-272 og 297-381 av P835P. Full-lengde cDNA-sekvensen for P835P er gitt i SEKV ID NR: 773. cDNA-sekvensen av den åpne leserammen for P835P, omfattende stoppkodon, er gitt i SEKV ID NR: 775, med den åpne leseramme uten stoppkodon gitt i SEKV ID NR: 776 og den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEKV ID NR: 777.

EKSEMPEL 16

Ytterligerekarakterisering av prostata-spesifikt antigen P710P

Dette eksemplet beskriver full-lengde kloning av P710P.

Prostata cDNA-bibliotek beskrevet ovenfor ble screenet med P710P-fragmentet beskrevet ovenfor. Én million kolonier ble platet ut på LB/Ampicillin-plater. Nylonmembran-filtere ble anvendt for å løfte disse koloniene og cDNA fanget opp av disse filtere ble deretter denaturert og kryssbundet til filtrene med UV-lys. P71 OP-fragmentet ble radioaktivt merket og anvendt for å hybridisere med filtrene. Positive cDNA-kloner ble valgt og deres cDNA gjenvunnet og sekvensert med en automatisk Perkin Eimer/Applied Biosystems Division sekvenserer. Fire sekvenser ble oppnådd og er presentert i SEKV ID NR: 468-471. Disse sekvenser synes å representere forskjellige spleisevarianter av P710P-genet. Påfølgende sammenligning av cDNA-sekvensene av P710P med de i Genbank, avslørte homologi med DD3-genet (Genbank aksesjonsnummere AF103907 & AF103908). cDNA-sekvensen av DD3 er gitt i SEKV ID NR: 618.

EKSEMPEL 17

Proteineksresjon av prostata-spesifikke anti<g>ener

Dette eksemplet beskriver ekspresjon og rensning av prostata-spesifikke antigener i E. coli, baculovirus, pattedyr- og gjær-celler.

a) Ekspresjon av P501S i E . coli

Ekspresjon av full-lengde-formen av P501S ble forsøkt ved først å klone

P501S uten ledersekvensen (aminosyrer 36-553 av SEKV ID NR: 113) nedstrøms for de første 30 aminosyrer i M. tuberkulose antigen Ra 12 (SEKV ID NR: 484) i pET17b. Spesifikt ble P501S DNA anvendt for å utføre PCR ved anvendelse av primerene AW025 (SEKV ID NR: 485) og AW003 (SEKV ID NR: 486). AW025 er en sense kloningsprimer som inneholder et Hindlll-sete. AW003 er en antisense kloningsprimer som inneholder et EcoRI-sete. DNA-amplifisering ble utført ved anvendelse av 5 ul 10X Pfu-buffer, 1 ul 20 mM dNTP, 1 ul hver av PCR-primerene med 10 uM konsentrasjon, 40 ul vann, 1 (il Pfu DNA-polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) og 1 ul DNA med 100 ng/ul. Denaturering ved 95°C ble utført i 30 sek., fulgt av 10 cykler med 95°C i 30 sek., 60°C i 1 min. og ved 72°C i 3 min. 20 cykler med 95°C i 30 sek., 65°C i 1 min. og ved 72°C i 3 min. og til slutt med 1 cyklus på 72°C i 10 min. PCR-produkt ble klonet til Ra12m/pET17b ved anvendelse av Hindi11 og EcoRI. Sekvensen av den resulterende fusjonskonstruksjon (referert til som Ra12-P501S-F) ble bekreftet ved DNA-sekvensering.

Fusjonskonstruksjonen ble transformert til BL21(DE3)pLysE, pLysS og CodonPlus E. coli (Stratagene) og dyrket natten over i LB-medium med kanamycin. Den resulterende kultur ble utviklet med IPTG. Protein ble overført til PVDF-membran og blokkert med 5% ikke-fett melk (i PBS-Tween buffer), vasket tre ganger og inkubert med mus anti-His tag antistoff (Clontech) i 1 time. Membranen ble vasket 3 ganger og probet med HRP-Protein A (Zymed) i 30 min. Til slutt ble membranen vasket 3 ganger og utviklet med ECL (Amersham). Ingen ekspresjon ble detektert ved Western blot. Tilsvarende ble ingen ekspresjon detektert ved Western blot når Ra12-P501S-F-fusjonen ble anvendt for ekspresjon i BL21 CodonPlus med CE6 fag (Invitrogen).

Et N-terminalt fragment av P501S (aminosyrer 36-325 av SEKV ID NR: 113) ble klonet nedstrøms for de første 30 aminosyrer av M. tuberculosis antigenet Ra12 i pET17b som følger. P501S DNA ble anvendt for å utføre PCR ved anvendelse av primerene AW025 (SEKV ID NR: 485) og AW027 (SEKV ID NR: 487). AW027 er en antisense kloningsprimer som inneholder et EcoRI-sete og et stoppkodon. DNA-amplifisering ble utført i det vesentlige som beskrevet ovenfor. Det resulterende PCR-produkt ble klonet til Ra 12 i pET17b ved Hindi 11- og EcoRI-setene. Fusjonskonstruksjonen (referert til som Ra12-P501S-N) ble bekreftet ved DNA-sekvensering.

Ra12-P501S-N fusjonskonstruksjonen ble anvendt for ekspresjon i BL21(DE3)pLysE, pLysS og CodonPlus, i det vesentlige som beskrevet ovenfor. Ved anvendelse av Western blot analyse ble proteinbånd observert ved den forventede molekylvekt på 36 kDa. Noen høymolekylvekt bånd ble også observert, som sannsynligvis skyldtes aggregering av det rekombinante protein. Ingen ekspresjon ble detektert ved Western blot når Ra12-P501S-F-fusjonen ble anvendt for ekspresjon i BL21 CodonPlus av CE6 fag.

En fusjonskonstruksjon omfattende en C-terminal del av P501S (aminosyrer 257-553 av SEKV ID NR: 113) lokalisert nedstrøms for de første 30 aminosyrer av M. tuberculosis antigenet Ra12 (SEKV ID NR: 484) ble fremstilt som følger. P501S DNA ble anvendt for å utføre PCR ved anvendelse av primerene AW026 (SEKV ID NR: 488) og AW003 (SEKV ID NR: 486). AW026 er en sense kloningsprimer som inneholder et Hindlll-sete. DNA-amplifisering ble utført i det vesentlige som beskrevet ovenfor. Det resulterende PCR-produkt ble klonet til Ra12 i pET17b ved Hindlll- og EcoRI-setene. Sekvensen for fusjonskonstruksjonen (referert til som Ra12-P501S-C) ble bekreftet.

Ra12-P501S-C-fusjonskonstruksjonen ble anvendt for ekspresjon i BL21(DE3)pLysE, pLysS og CodonPlus, som beskrevet ovenfor. En liten mengde av protein ble detektert ved Western blot, idet noen molekylvekt-aggregater også ble observert. Ekspresjon ble også detektert ved Western blot når Ra12-P501S-C-fusjonen ble anvendt for ekspresjon i BL21 CodonPlus fremkalt av CE6 fag.

En fusjonskonstruksjon omfattende et fragment av P501S (aminosyrer 36-298 i SEKV ID NR: 113) lokalisert nedstrøms for M. tuberculosis antigen Ra12 (SEKV ID NR: 705) ble fremstilt som følger. P501S DNA ble anvendt for å utføre PCR ved anvendelse av primerene AW042 (SEKV ID NR: 706) og AW053 (SEKV ID NR: 707). AW042 er en sense kloningsprimer som inneholder et EcoRI-sete. AW053 er en antisense primer med stopp- og Xho I-seter. DNA-amplifisering ble utført i det vesentlige som beskrevet ovenfor. Det resulterende PCR-produkt ble klonet til Ra12 i pET17b ved EcoRI- og Xho l-seter. Den resulterende fusjonskonstruksjon (referert til som Ra12-P501S-E2) ble uttrykt i B834 (DE3) pLys S E. coli vertsceller i TB media i 2 timer ved romtemperatur. Uttrykt protein ble renset ved vasking av inklusjonsstoffene og kjøring på en Ni-NTA-kolonne. Det rensede proteinet forble oppløselig i buffer inneholdende 20 mM Tris-HCI (pH 8), 100 mM NaCI, 10 mM B-Me og 5% glycerol. De bestemte cDNA og aminosyresekvenser for det uttrykte fusjonsprotein er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 708 og 709.

b) Ekspresjon av P501S i Baculovirus

Bac-til-Bac baculovirus-ekspresjonssystem (BRL Life Technologies, Inc.)

ble anvendt for å uttrykke P501S-protein i insektceller. Full-lengde P501S (SEKV ID NR: 113) ble amplifisert ved PCR og klonet inn i Xbal-setet av donor-plasmidet pFastBacl. Det rekombinante bacmid og baculovirus ble fremstilt i henhold til produsentens instruksjoner. De rekombinante baculovirus ble amplifisert i Sf9 celler og høytiter virale lågere ble anvendt for å infisere High Five-celler (Invitrogen) for å fremstille det rekombinante protein. Identiteten til full-lengde-proteinet ble bekreftet ved N-terminal-sekvensering av det rekombinante protein og ved Western blot-analyse (Figur 7). Spesifikt ble 0,6 million High Five-celler i 6-brønn-plater infisert med enten ubeslektet kontroll-virus BV/ECD_PD (spor 2), med rekombinant baculovirus for P501S i forskjellige mengder eller MOI (spor 4-8) eller ikke-infiserte (spor 3). Celle-lysater ble kjørt på SDS-PAGE under reduserende betingelser og analysert ved Western blot med anti-P501S monoklonalt antistoff P501S-10E3-G4D3 (fremstilt som beskrevet nedenfor). Spor 1 er den biotinylerte protein-molekylvekt-markør (BioLabs).

Lokaliseringen av rekombinant P501S i insektcellene ble undersøkt som følger. Insektcellene som overuttrykker P501S ble fraksjonert i fraksjoner av kjerne, mitokondrier, membran og cytosol. Like mengder av protein fra hver fraksjon ble analysert ved Western blot med et monoklonalt antistoff mot P501S. På grunn av skjemaet for fraksjonering, inneholder både kjerne- og mitokondrie-fraksjoner noen plasmamembran-komponenter. Imidlertid er membranfraksjonen basisk fri for mitokondrier og kjerne. P501S ble funnet å være til stede i alle fraksjoner som inneholder membran-komponenten, hvilket indikerer at P501S kan være assosiert med plasmamembran av insektcellene som uttrykker det rekombinante protein.

c) Ekspresjon av P501S i pattedyrceller

Full-lengde P501S (553 aminosyrer; SEKV ID NR: 113) ble klonet inn i

forskjellige pattedyr-ekspresjonsvektorer, omfattende pCEP4 (Invitrogen), pVR1012 (Vical, San Diego, CA) og en modifisert form av den retrovirale vektor pBMN, referert til som pBIB. Transfeksjon av P501S/pCEP4 og P501S/pVR1012 til HEK293-fibroblaster ble utført ved anvendelse av Fugene transfeksjonsreagens (Boehringer Mannheim). Kort sagt ble 2 ul av Fugene-reagens fortynnet i 100 ul av serum-fritt medium og inkubert ved romtemperatur i 5-10 min. Denne blandingen ble satt til 1 ug av P501S plasmid-DNA, blandet kort og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Fugene/DNA-blandingen ble satt til celler og inkubert i 24-48 timer. Ekspresjon av rekombinant P501S i transfekterte HEK293-fibroblaster ble detektert ved hjelp av Western blot ved anvendelse av et monoklonalt antistoff til P501S.

Transfeksjon av p501S/pCEP4 til CHO-K-celler (American Type Culture Collection, Rockville, MD) ble utført ved anvendelse av GenePorter transfeksjonsreagens (Gene Therapy Systems, San Diego, CA). Kort sagt ble 15 ul av GenePorter fortynnet i 500 ul av serum-fritt medium og inkubert ved romtemperatur i 10 min. GenePorter/media-blandingen ble satt til 2 ng av plasmid-DNA som ble fortynnet i 500 ul av serum-fritt medium, blandet kort og inkubert i 30 min ved romtemperatur. CHO-K-celler ble skyllet i PBS for å fjerne serumproteiner og GenePorter/DNA-blandingen ble tilsatt og inkubert i 5 timer. De transfekterte cellene ble deretter matet i et likt volum av 2 x medium og inkubert i 24-48 timer.

FACS-analyse av P501S transient infiserte CHO-K-celler demonstrerte overflateekspresjon av P501S. Ekspresjon ble detektert ved anvendelse av kanin-polyklonale-antisera mot et P501S-peptid, som beskrevet nedenfor. Strømnings-cytometrisk analyse ble utført ved anvendelse av en FaCScan

(Becton Dickinson) og dataene ble analysert ved anvendelse av Cell-Quest programmet.

d) Ekspresjon av P501S i S. cerevisiae

P501S ble uttrykt i gjær, rettet mot membraner ved anvendelse av gjær-et prepro-signalsekvens. Den naturlige signalsekvens og første lumenale domene av P501S ble deletert for å konservere den naturlige posisjonering av det uttrykte P501S-protein.

Spesifikt ble a-prepro-signalsekvensen av S. cerevisiae bundet til aminosyrer 55-553 av SEKV ID NR: 113 med en His-merkehale klonet inn i plasmidet pRIT15068 med CUP1-promoter og transfektert til S. cerevisiae stamme Y1790. Y1790-stammen er Leu+ og His-. Ekspresjon av protein ble fremkalt ved tilsetning av enten 500 uM eller 250 uM CuS04ved 30°C i minimalt medium supplert med histidin. Celler ble høstet 24 timer etter induksjon. Ekstrakter ble fremstilt ved å dyrke celler til en konsentrasjon på OD600 5,0 i 50 mM citratfosfatbuffer (pH 4,0) pluss 130 mM NaCI supplert med proteaseinhibitorer. Celler ble oppbrutt ved anvendelse av glasskuler og sentrifugert i 20 min. ved 15,000 g. Det rekombinante protein ble funnet å være 100% pellet-assosiert.

Ekspresjon av det rekombinante protein (molekylvekt 63 kD) ble demonstrert ved Western blot-analyse, ved anvendelse av det anti-P501S monoklonale antistoff 10E-D4-G3 beskrevet nedenfor. Aminosyresekvensen av det uttrykte protein er gitt i SEKV ID NR: 792.

Fermenteringsprosesser for fremstilling av a prepro-P501S-His-merke rekombinant protein i S. cerevisiae (stamme Y1790 - CUP1 induserbar promoter) ble evaluert som følger. 100 ul av master-kim inneholdende 2,5 x 10<8>celler/ml transformert S. cerevisiae Y1790 ble spredd på FSC004AA fast medium. Sammensetningen av FSC004AA-medium er som følger: glukose 10 g/l; Na2Mo04,2H20 0,0002 g/l; folinsyre 0,000064 g/l; KH2P041 g/l; MnS04.H20 0,0004 g/l; Inositol 0,064 g/l; MgS04,7H20 0,5 g/l; H3B030,0005 g/l; Pyridoxin 0,008 g/l; CaCI2,2H20 0,1 g/l; Kl 0,0001 g/l; Tiamin 0,008 g/l; NaCI 0,1 g/l; CoCI2,6H20 0,00009 g/l; Niacin 0,000032 g/l; FeCI3,6H20 0,0002 g/l; Riboflavin 0,000016 g/l; Panthotenat Ca 0,008 g/l; CuS04,5H20 0,00004 g/l; Biotin 0,000064 g/l; para-aminobenzosyre 0,000016 g/l; ZnS04,7H20 0,0004 g/l; (NH4)2S045 g/l; agar 18 g/l; Histidin 0,1 g/l.

To plater ble inkubert i 26 timer ved 30 °C. Disse faste pre-kulturer ble høstet i 5 ml flytende medium FSC007AA og 0,5 ml (eller 9,3 x 10<7>celler) av denne suspensjonen ble anvendt for å inokulere 2 flytende pre-kulturer.

Sammensetningen av FSC007AA-medium er som følger: Glukose 10 g/l; Na2Mo04.2H20 0,0002 g/l; folinsyre 0,000064 g/l; KH2P041 g/l; MnS04.H20 0,0004 g/l; Inositol 0,064 g/l; MgS04.7H20 0,5 g/l; H3B030,0005 g/l; Pyridoxin 0,008 g/l; CaCI2.2H20 0,1 g/l; Kl 0,0001 g/l; Tiamin 0,008 g/l; NaCI 0,1 g/l; CoCI2.6H20 0,00009 g/l; Niacin 0,000032 g/l; FeCI3.6H20 0,0002 g/l; Riboflavin 0,000016 g/l; Panthotenat Ca 0,008 g/l; CuS04.5H20 0,00004 g/l; Biotin 0,000064 g/l; para-aminobenzosyre 0,000016 g/l; ZnS04.7H20 0,0004 g/l; (NH4)2S045 g/l; Histidin 0,1 g/l.

Disse pre-kulturer ble kjørt i 20 timer i 2 I kolber inneholdende 400 ml medium FSC007AA for å oppnå en OD på 1,8. De andre karakteristika for disse pre-kulturer er som følger: pH 2,8; glukose 2,3 g/l; etanol 3,4 g/l.

Den beste timing for flytende pre-kulturer for stamme Y1790 ble bestemt i preliminære forsøk. Flytende pre-kulturer inneholdende 400 ml medium og podet med forskjellige volumer av Master-kim (0,25, 0,5, 1 eller 2 ml) ble overvåket for å identifisere den beste podestoff-størrelse og timing. Glukose, etanol, pH, OD og celle-tall (bestemt ved strømnings-cytometri) ble fulgt mellom 16 og 23 timers kultur. Glukose-utarming og maksimal biomasse ble oppnådd etter 20 timers inkubering med 0,5 podestoff. Disse betingelsene ble anvendt for overføring av pre-kulturen til fermentering.

Totalt ble 800 ml pre-kultur anvendt for å pode en 20 I fermentor inneholdende 5 I av medium FSC002AA. Tre ml bestrålet antiskummingsmiddel ble tilsatt før poding. Sammensetningen av FSC002AA-medium er som følger: (NH4)2S046,4 g/l; Na2Mo04.2H20 2,05 mg/l; folinsyre 0,54 mg/l; KH2P048,25 g/l; MnS04.H20 4,1 mg/l; inositol 540 mg/; MgS04,7H20 4,69 g/l; H3B035,17 m/l; pyridoxin 68 mg/l; CaCI2.2H20 0,92 g/l; Kl 1,03 mg/l; tiamin 68 mg/l; NaCI 0,06 g/l; CoCI2.6H20 0,92 mg/l; Niacin 0,27 mg/l; HC11 ml/l; FeCI3.6H20 9,92 mg/l; Riboflavin 0,13 mg/l; CuS04.5H20 0,41 mg/l; Glukose 0,14 g/l; Panthotenat Ca 68 mg/l; ZnS04.7H20 4,1 mg/l; Biotin

0,54 mg/l; para-aminobenzosyre 0,13 mg/l; Histidin 0,3 g/l.

Karbonkilden (glukose) ble supplert ved kontinuerlig mating av FFB004AA-medium. Sammensetningen av FFB004AA-mediet er som følger: glukose 350 g/l; Na2Mo04.2H20 5,15 mg/l; folinsyre 1,36 mg/l; KH2P0420,6 g/l; MnS04.H20 10,3 mg/l; inositol 1350 mg/l; MgS04.7H20 11,7 g/l; H3B0312,9 m/l; pyridoxin 170 mg/l; CaCI2.2H20 2,35 g/l; Kl 2,6 mg/l; tiamin 170 g/l; NaCI 0,15 g/l; CoCI2.6H20 2,3 mg/l; niacin 0,67 mg/l; HCI 2,5 ml/l; FeCI3.6H20 24,8 mg/l; riboflavin; 0,33 mg/l; CuS04.5H20 1,03 mg/l; biotin 1,36 mg/l; panthotenat Ca 170 mg/l; ZnS04.7H20 10,3 mg/l; para-aminobenzosyre: 0,33 mg/l; histidin 5,35 g/l.

Den gjenværende glukose-konsentrasjonen ble holdt meget lav (^>0 mg/l) for å minimalisere etanol-produksjon under fermenteringen. Dette ble oppnådd ved å begrense utviklingen av mikroorganismen ved anvendelse av en begrenset glukose-matingshastighet. Standard biomasse-innhold (OD 80-90) ble nådd ved fermentering etter 44 timers vekstfase.

CUP1-promoter ble deretter indusert ved tilsetning av 500 uM CuS04for å produsere P501S-antigen. CuS04tilsetning ble fulgt av etanol-akkumulering (opptil 6 g/l) og glukose-matingshastigheten ble deretter redusert for å konsumere etanolen. Kobberet tilgjengelig for mikroorganismen ble overvåket ved testing av Cu-ionekonsentrasjon i medium-supernatanten ved anvendelse av et spektrofotometrisk kobberforsøk (DETC-metode). Fermenteringen ble deretter supplert med CuS04gjennom hele induksjonsfasen for å opprettholde konsentrasjonen mellom 150 og 250 uM i supernatanten. Biomassen nådde en OD på 100 ved slutten av induksjonen. Celler ble høstet etter 8 timers induksjon.

Cellehomogenat ble fremstilt og analysert ved SDS-PAGE og Western Blot ved anvendelse av standard protokoller. Et hoved-proteinbånd med den forventede molekylvekt på 62KD ble detektert ved Western blot ved anvendelse av anti-P501S monoklonale antistoffer. Western blot analyse viste også at det vesentlige 62KD-bånd ble progressivt produsert fra 30 minutter av induksjon og nådde et maksimum etter 3 timer. Intet mer antigen syntes å bli produsert mellom 3 og 12 timer av induksjon.

Antallet passasjer gjennom en French Press nødvendig for å ekstrahere alt antigenet fra cellene ble evaluert. Én, tre og fem passasjer ble testet og total celle-lysater, supernatanter og pellet av cellelysater ble analysert ved Western blot. Tre passasjer gjennom en French Press var tilstrekkelig til å fullføre ekstraksjon av antigenet. Antigenet var til stede i den uoppløselige fraksjon.

e) Ekspresjon av P703P i Baculovirus

cDNA for full-lengde P703P-DE5 (SEKV ID NR: 326), sammen med

mange flankerende restriksjonsseter, ble oppnådd ved fordøyelse av plasmidet pCDNA703 med restriksjons-endonukleaser Xba I og Hind III. Det resulterende restriksjonsfragment (ca. 800 basepar) ble ligert inn i overførings-plasmidet pFastBacI som ble fordøyet med samme restriksjonsenzymer. Sekvensen av insersjonen ble bekreftet ved DNA-sekvensering. Det rekombinante overføringsplasmid pFBP703 ble anvendt for å fremstille rekombinant bacmid DNA og baculovirus ved anvendelse av Bac-To-Bac Baculovirus ekspresjonssystem (BRL Life Technologies). High Five-celler ble infisert med det rekombinante virus BVP703, som beskrevet ovenfor, for å oppnå rekombinant P703P-protein.

e) Ekspresjon av P788P i E . Coli

En forkortet, N-terminal del, av P788P (rester 1-644 av SEKV ID NR: 777; referert til som P788P-N) kondensert med et C-terminalt 6xHis-merke ble uttrykt i E. coli som følger. P788P cDNA ble amplifisert ved anvendelse av primerene AW080 og AW081 (SEKV ID NR: 672 og 673). AW080 er en sense klonings-primer med et Ndel-sete. AW081 er en antisense klonings-primer med et Xhol-sete. Det PCR-amplifiserte P788P, så vel som vektoren pCRX1, ble fordøyet med Ndel og Xhol. Vektor og insersjon ble ligert og transformert til NovaBlue-celler. Kolonier ble tilfeldig screenet for insersjon og deretter sekvensert. P788P-N klon #6 ble bekreftet å være identisk med den utformede konstruksjon. Ekspresjonskonstruksjonen P788P-N #6/pCRX1 ble transformert til E. coli BL21 CodonPlus-RIL kompetente celler. Etter induksjon vokste mesteparten av cellene godt, og nådde OD600 på mer enn 2,0 etter 3 timer. Coomassie merket SDS-PAGE viste et overuttrykt bånd ved ca. 75 kD. Western blot analyse ved anvendelse av et 6xHis-merke antistoff bekreftet at båndet var P788P-N. Den bestemte cDNA-sekvens for P788P-N er gitt i SEKV ID NR: 674, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEKV ID NR: 675.

f) Ekspresjon av P510S i E . Coli

P510S-proteinet har 9 potensielle transmembran-domener og er

forutsagt å være lokalisert ved plasma-membranen. Det C-terminale protein av dette protein, så vel som det antatte tredje ekstracellulære domene av P510S ble uttrykt i E. coli som følger.

Ekspresjonskonstruksjonen referert til som Ra12-P501S-C ble utformet for å ha et 6 His-merke ved den N-terminale ende, fulgt av M. tuberculosis antigen Ra12 (SEKV ID NR: 676) og deretter den C-terminale del av P510S (aminorester 1176-1261 av SEKV ID NR: 538). Full-lengde P510S ble anvendt for å amplifisere P510S-C-fragmentet ved PCR ved anvendelse av primerene AW056 og AW057 (henholdsvis SEKV ID NR: 677 og 678). AW056 er en sense kloningsprimer med et EcoRI-sete. AW057 er en antisense primer med stopp og Xhol-seter. Det amplifiserte P501S fragment og Ra12/pCRX1 ble fordøyet med EcoRI og Xhol og deretter renset. Insersjonen og vektoren ble ligert sammen og transformert til NovaBlue. Kolonier ble tilfeldig screenet for insersjon og sekvenser. For protein-ekspresjon ble ekspresjonskonstruksjonen transformert til E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIL kompetente celler. En mini-induksjons-screen ble utført for å optimalisere ekspresjonsbetingelsene. Etter induksjonen vokste cellene godt, og nådde en OD 600 nm større enn 2,0 etter 3 timer. Coomassie-merke SDS-PAGE viste et meget overuttrykt bånd ved ca.

30 kD. Selv om dette er høyere enn den forventede molekylvekt, var Western blot-analyse positiv, som viser at dette bånd var His-merke-inneholdende protein. De optimaliserte kulturbetingelser er som følger. Fortynn natten over kultur/dagtid-kultur (LB + kanamycin + kloramfenicol) i 2xYT (med kanamycin og kloramfenicol) i et forhold på 25 ml kultur til 1 liter 2xYT. La vokse ved 37°C inntil OD600 = 0,6. Ta ut en aliquot som TO prøve. Tilsett 1 mM IPTG og la vokse ved 30°C i 3 timer. Ta ut en T3 prøve, spinn ned celler og lagre ved -80°C. De bestemte cDNA- og aminosyresekvenser for Ra12-P510S-C-konstruksjonen er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 679 og 682.

Ekspresjonskonstruksjonen P510S-C ble utformet for å ha et 5' tilsatt start-kodon og et glycin- (GGA) kodon og deretter det P510S C terminale fragment fulgt av i rammen 6x histidin-merke og stoppkodon fra pET28b-vektoren. Kloningsstrategien er lignende den anvendt for Ra12-P510S-C, bortsett fra at de anvendte PCR-primerene var de vist i henholdsvis SEKV ID NR: 685 og 686, og Ncol/Xhol kuttet i pET28b ble anvendt. Primeren med SEKV ID NR: 685 dannet et 5' Ncol-sete og tilsatte et start-kodon. Antisense primer med SEKV ID NR: 686 skaper et Xhol-sete på P510S C terminalt fragment. Kloner ble bekreftet ved sekvensering. For protein-ekspresjon ble ekspresjonskonstruksjonen transformert til E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIL kompetente celler. En OD600 større enn 2,0 ble oppnådd 30 timer etter induksjon. Coomassie-merket SDS-PAGE viste et overuttrykt bånd ved ca. 11 kD. Western blot-analyse bekreftet at båndet var P510S-C, som også N-terminal proteinsekvensering. De optimaliserte kulturbetingelser er som følger: fortynn natten over kultur/dagtid-kultur (LB + kanamycin + kloramfenicol) i 2x YT (+ kanamycin og kloramfenicol) i et forhold på 25 ml kultur til 1 liter 2x YT og la vokse ved 37°C inntil en OD 600 på ca. 0,5 blir oppnådd. Ta ut en aliquot som TO prøve. Tilsett 1 mM IPTG og la vokse ved 30°C i 3 timer. Spinn ned cellene og lagre ved -80 °C inntil rensning. De bestemte cDNA- og aminosyresekvenser for P510S-C-konstruksjonen er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 680 og 683.

Det antatte tredje ekstracellulære domene av P510S (P510S-E3; rester 328-676 i SEKV ID NR: 538) ble uttrykt i E. coli som følger. P510S-fragmentet ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av primerene vist i SEKV ID NR: 687 og 688. Primeren av SEKV ID NR: 687 er en sense primer med et Ndel-sete for anvendelse ved ligering til pPDM. Primeren med SEKV ID NR: 688 er en antisense primer med et tilsatt Xhol-sete for anvendelse ved ligering til pPDM. Det resulterende fragment ble klonet til pPDM ved Ndel- og Xhol-setene. Kloner ble bekreftet ved sekvensering. For proteinekspresjon ble klonen transformert til E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIL kompetente celler. Etter induksjon ble en OD600 større enn 2,0 oppnådd etter 3 timer. Coomassie-merket SDS-PAGE viste et overuttrykt bånd ved ca. 39 kD og N-terminal sekvensering bekreftet at N-terminalen var den av P510S-E3. Optimaliserte kulturbetingelser er som følger: fortynn natten over kultur/dagtid kultur (LB + kanamycin + kloramfenicol) i 2x YT (kanamycin og kloramfenicol) i et forhold på 25 ml kultur til 1 liter 2x YT. La vokse ved 37°C inntil OD 600 er 0,6. Ta ut en aliquot som T0-prøve. Tilsett 1 mM IPTG og la vokse ved 30°C i 3 timer. Ta ut en T3-prøve, spinn ned cellene og lagre ved -80 °C inntil rensning. De bestemte cDNA- og aminosyre-sekvenser for P501S-E3-konstruksjonen er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 681 og 684.

g) Ekspresjon av P775S i E . Coli

Antigenet P775P inneholder multiple åpne leserammer (ORF). Den

tredje ORF, som koder for proteinet i SEKV ID NR: 483, har den beste emotiv scoring. En ekspresjons-fusjonskonstruksjon inneholdende M. tuberculosis antigen Ra12 (SEKV ID NR: 676) og P775P-ORF3 med et N-terminal 6x His-merke ble fremstilt som følger. P775P-ORF3 ble amplifisert ved anvendelse av sense PCR-primere med SEKV ID NR: 689 og anti-sense PCR-primer med SEKV ID NR: 690. Det PCR-amplifiserte fragment av P775P og Ra12/pCRX1 ble fordøyet med restriksjonsenzymene EcoRI og Xhol. Vektor og insersjon ble ligert og deretter transformert til NovaBlue-celler. Kolonier ble tilfeldig screenet for insersjon og deretter sekvensert. En klon som har den ønskede sekvens ble transformert til E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIL kompetente celler. To timer etter induksjon toppet celledensiteten ved OD600 på omtrent 1,8. Coomassie-merket SDS-PAGE viste et overuttrykt bånd ved ca. 31 kD. Western blot ved anvendelse av 6x His-merke antistoff bekreftet at båndet var Ra12-P775P-ORF3. De bestemte cDNA- og aminosyre-sekvenser for fusjonskonstruksjonen er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 691 og 692.

H) Eksresjon av et P703P His-merke fusjonsrotein i E. coli

cDNA for den kodende region av P703P ble fremstilt ved PCR ved anvendelse av primerene med SEKV ID NR: 693 og 694. PCR-produktet ble fordøyet med EcoRI-restriksjonsenzym, gelrenset og klonet inn i en modifisert pET28-vektor med et His-merke i ramme, som var fordøyet med Eco72l- og EcoRI-restriksjonsenzymer. Korrekt konstruksjon ble bekreftet ved DNA-sekvensanalyse og deretter transformert til E. coli BL21 (DE3) pLys S ekspresjons-vertsceller. De bestemte aminosyre- og cDNA-sekvensene for det uttrykte rekombinante P703P er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 695 og 696.

I) Eksresjon av et P705P His-merke fusjonsrotein i E. coli

cDNA for den kodende region av P705P ble fremstilt ved PCR ved anvendelse av primerene med SEKV ID NR: 697 og 698. PCR-produktet ble fordøyet med EcoRI-restriksjonsenzym, gelrenset og klonet inn i en modifisert pET28-vektor med et His-merke i ramme, som var fordøyet med Eco72l- og EcoRI-restriksjonsenzymer. Korrekt konstruksjon ble bekreftet ved DNA-sekvensanalyse og deretter transformert til E. coli BL21 (DE3) pLys S og BL21 (DE3) CodonPlus ekspresjons-vertsceller. De bestemte aminosyre- og cDNA-sekvenser for det uttrykte rekombinante P705P er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 699 og 700.

J) Eksresjon av et P711P His-merke fusjonsrotein i E. coli

cDNA for den kodende region av P711P ble fremstilt ved PCR ved anvendelse av primerene med SEKV ID NR: 701 og 702. PCR-produktet ble fordøyet med EcoRI-restriksjonsenzym, gelrenset og klonet inn i en modifisert pET28-vektor med et His-merke i ramme, som var fordøyet med Eco72l- og EcoRI-restriksjonsenzymer. Korrekt konstruksjon ble bekreftet ved DNA-sekvensanalyse og deretter transformert til E. coli BL21 (DE3) pLys S og BL21 (DE3) CodonPlus ekspresjonsvertsceller. De bestemte aminosyre- og cDNA-sekvenser for det uttrykte rekombinante P711P er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 703 og 704.

EKSEMPEL 18

Fremstilling ogkarakterisering av antistoffer mot prostata-spesifikkeol<yp>etider a) Fremstilling og karakterisering av polyklonale antistoffer mot P703P.

P504S og P509S

Polyklonale antistoffer mot P703P, P504S og P509S ble fremstilt som følger.

Hvert prostatatumor-antigen uttrykt i et E. coli rekombinant ekspresjonssystem ble dyrket natten over i LB-medium med passende antibiotika ved 37°C i en ristende inkubator. Neste morgen ble 10 ml av kulturen natten over satt til 500 ml av 2x YT pluss passende antibiotika i en 21 pisket Erlenmeyer-kolbe. Når den optiske densiteten (ved 560 nm) av kulturen nådde 0,4-0,6 ble cellene utviklet med IPTG (1 mM). Fire timer etter induksjon med IPTG ble cellene høstet ved sentrifugering. Cellene ble deretter vasket med fosfatbufret saltvann og sentrifugert igjen. Supernatanten ble kastet og cellene ble enten frosset for fremtidig anvendelse eller umiddelbart prosessert.

20 ml lyse-buffer ble satt til cellepelleten og virvlet. For å bryte opp E. coli-cellene ble denne blandingen deretter kjørt gjennom French Press ved et trykk på 1120 kg/cm<2>. Cellene ble deretter sentrifugert igjen og supernatanten og pellet ble kontrollert ved SDS-PAGE for fordeling av det rekombinante protein. For proteiner som var lokalisert i celle-pelleten ble pelleten resuspendert i 10 mM Tris pH 8,0, 1% CHAPS og den inkluderende stoff-pellet ble vasket og sentrifugert igjen. Denne prosedyren ble gjentatt to ganger til. Den vaskede inkluderende stoff-pellet ble solubilisert med enten 8 M urinstoff eller 6 M guanidin-HCI inneholdende 10 mM Tris pH 8,0 pluss 10 mM imidazol. Det solubiliserte protein ble satt til 5 ml nikkel-chelat harpiks (Qiagen) og inkubert i 45 min. til 1 time ved romtemperatur med kontinuerlig agitering. Etter inkubering ble harpiksen og proteinblandingen hellet gjennom en engangs-kolonne og gjennomstrømningen ble oppsamlet. Kolonnen ble deretter vasket med 10-20 kolonnevolumer av solubiliseringsbufferen. Antigenet ble deretter eluert fra kolonnen ved anvendelse av 8M urinstoff, 10 mM Tris pH 8,0 og 300 mM imidazol og oppsamlet i 3 ml fraksjoner. En SDS-PAGE gel ble kjørt for å bestemme hvilke fraksjoner som skulle oppsamles for ytterligere rensning.

Som et endelig rensningstrinn ble en sterk anionebytterharpiks så som HiPrepQ (Biorad) ekvilibrert med den passende buffer og de samlede fraksjoner fra ovenfor ble fylt på kolonnen. Hvert antigen ble eluert fra kolonnen med en økende saltgradient. Fraksjoner ble oppsamlet mens kolonnen ble kjørt og en annen SDS-PAGE gel ble kjørt for å bestemme hvilke fraksjoner fra kolonnen som skulle oppsamles. De samlede fraksjoner ble dialysert mot 10 mM Tris pH 8,0. Proteinene ble deretter fylt på glass etter filtrering gjennom et 0,22 mikron filter og antigenene ble frosset inntil de trengtes for immunisering.

400 mikrogram av hvert prostata-antigen ble kombinert med 100 mikrogram av muramyldipeptid (MDP). Hver fjerde uke fikk kaniner en forsterkningsdose med 100 mikrogram blandet med et likt volum av Incomplete Freund's Adjuvans (IFA). Syv dager etter hver forsterkning ble dyrene tappet for blod. Sera ble dannet ved inkubering av blodet ved 4°C i 12-4 timer fulgt av sentrifugering.

Nittiseks-brønn plater ble belagt med antigen ved inkubering med 50 mikroliter (typisk 1 mikrogram) rekombinant protein ved 4°C i 20 timer. 250 mikroliter BSA-blokkeringsbuffer ble satt til brønnene og inkubert ved romtemperatur i 2 timer. Plater ble vasket 6 ganger med PBS/0,01% Tween. Kanin-sera ble fortynnet i PBS. 50 mikroliter fortynnet serum ble satt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur i 30 min. Plater ble vasket som beskrevet ovenfor før 50 mikroliter geit anti-kanin pepperrot peroksydase (HRP) med 1:10000 fortynning ble tilsatt og inkubert ved romtemperatur i 30 min. Platene ble igjen vasket som beskrevet ovenfor og 100 mikroliter TMB mikrobrønn peroksydase-substrat ble satt til hver brønn. Etter 15 min. inkubering i mørke ved romtemperatur ble den kolorimetriske reaksjon stanset med 100 mikroliter 1N H2S04 og lest umiddelbart ved 450 nm. Alle polyklonale antistoffer viste immunoreaktivitet til det aktuelle antigen.

b) Fremstilling og karakterisering av antistoffer mot P501S

Et murint monoklonalt antistoff rettet mot karboksy-terminus av det

prostata-spesifikke antigen P501S ble fremstilt som følger.

Et forkortet fragment av P501S (aminosyrer 355-526 av SEKV ID NR: 113) ble dannet og klonet inn i pET28b-vektoren (Novagen) og uttrykt i E. coli som et tioredoxin-fusjonsprotein med et histidin-merke. trx-P501S-fusjonsproteinet ble renset ved nikkel-kromatografi, fordøyet med trombin for å fjerne trx-fragmentet og ytterligere renset ved en syreutfellingsprosedyre fulgt av revers fase HPLC.

Mus ble immunisert med forkortet P501S-protein. Serum-tapping fra mus som potensielt inneholdt anti-P501S polyklonale sera ble testet for P501S-spesifikk reaktivitet ved anvendelse av ELISA-analyse med rensede P501S- og trx-P501S-proteiner. Serum-tapning som syntes å reagere spesifikt med P501S ble deretter screenet for P501S-reaktivitet ved Western analyse. Mus som hadde en P501 S-spesifikk antistoff-komponent ble avlivet og miltceller ble anvendt for å danne anti-P501S antistoff-produserende hybridomer ved anvendelse av standard teknikker. Hybridom-supernatanter ble testet for P501 S-spesifikk reaktivitet initielt ved ELISA og deretter ved FACS-analyse av reaktivitet med P501S-transduserte celler. Basert på disse resultater ble monoklonal hybridom referert til som 10E3 valgt for videre subkloning. Flere subkloner ble dannet, testet for spesifikk reaktivitet for P501S ved anvendelse av ELISA og typet for IgG-isotype. Resultatene av denne analyse er vist nedenfor i Tabell V. Av de 16 testede subkloner ble det monoklonale antistoffet 10E3-G4-D3 valgt for videre undersøkelse.

Spesifisiteten av 10E3-G4-D3 for P501S ble undersøkt ved FACS-analyse. Spesifikt ble celler fiksert (2% formaldehyd, 10 minutter), permeabilisert (0,1% saponin, 10 minutter) og merket med 10E3-G4-D3 med 0,5 -1 ug/ml, fulgt av inkubering med et sekundært, FITC-konjugert geit anti-mus lg antistoff (Pharmingen, San Diego, CA). Celler ble deretter analysert for FITC-fluorescens ved anvendelse av en Excalibur fluorescens-aktivert cellesorterer. For FACS-analyse av transduserte celler ble B-LCL retroviralt transdusert med P501S. For analyse av infiserte celler ble B-LCL infisert med en vaccinia-vektor som uttrykker P501S. For å demonstrere spesifisitet i disse forsøk ble B-LCL transdusert med et forskjellig antigen (P703P) og ikke-infiserte B-LCL-vektorer ble anvendt. 10E3-G4-D3 ble vist å binde med P501S-transdusert B-LCL og også med P501S-infisert B-LCL, men ikke med hverken ikke-infiserte celler eller P703P-transduserte celler.

For å bestemme hvorvidt epitopen gjenkjent av 10E3-G4-D3 ble funnet på overflaten eller i et intracellulært kammer av celler, ble B-LCL transdusert med P501S eller HLA-B8 som et kontroll-antigen og enten fiksert og permeabilisert som beskrevet ovenfor eller direkte merket med 10E3-G4-D3 og analysert som ovenfor. Spesifikk gjenkjennelse av P501S av 10E3-G4-D3 ble funnet å kreve permeabilisering, hvilket indikerer at epitopen gjenkjent av dette antistoffet er intracellulær.

Reaktiviteten til 10E3-G4-D3 med de tre prostata tumorcellelinjer Lncap, PC-3 og DU-145, som er kjent for å uttrykke henholdsvis høye, medium og meget lave nivåer av P501S, ble undersøkt ved permeabilisering av cellene og behandling av dem som beskrevet ovenfor. Høyere reaktivitet for 10E3-G4-D3 ble sett med Lncap enn med PC-3, som på sin side viste høyere reaktivitet enn DU-145. Disse resultater er i overensstemmelse med sanntid PCR og demonstrerer at antistoffet spesifikt gjenkjenner P501S i disse tumorcellelinjer og at epitopen gjenkjent i prostatatumorcellelinjer også er intracellulær.

Spesifisitet av 10E3-G4-D3 for P501S ble også demonstrert ved Western blot analyse. Lysaterfra prostatatumorcellelinjer Lncap, DU-145 og PC-3, fra P501S-transient transfekterte HEK293-cellerog fra ikke-transfekterte HEK293-celler ble dannet. Western blot analyse av disse lysater med 10E3-G4-D3 avslørte et 46 kDa immunoreaktivt bånd i Lncap, PC-3 og P501S-transfekterte HEK-celler, men ikke i DU-145-celler eller ikke-transfekterte HEK293-celler. P501S mRNA-ekspresjon er i overensstemmelse med disse resultater siden semi-kvantitativ PCR-analyse viste at P501S mRNA er uttrykt i Lncap, i et lavere, men detekterbart nivå i PC-3 og ikke i det hele tatt i DU-145-celler. Bakterielt uttrykt og renset rekombinant P501S (referert til som P501SStr2) ble gjenkjent av 10E3-G4-D3 (24 kDa), som var full-lengde P501S som var transient uttrykt i HEK293-celler ved anvendelse av enten ekspresjonsvektoren VR1012 eller pCEP4. Selv om den antatte molekylvekt av P501S er 60,5 kDa, hadde både transfektert og "nativ" P501S en noe lavere mobilitet på grunn av dens hydrofobe natur.

Immunohistokjemisk analyse ble utført på prostatatumor og et panel av normale vev-snitt (prostata, binyre, bryst, livmorhals, kolon, duodenum, galleblære, ileum, nyre, eggstokk, bukspyttkjertel, ørespyttkjertel, skjelettmuskel, milt og testikkel). Vevprøver ble fiksert i formalin-løsning i 24 timer og innleiret i paraffin før de ble kuttet i 10 mikron snitt. Vev-snitt ble permeabilisert og inkubert med 10E3-G4-D3 antistoff i 1 time. HRP-merket anti-mus fulgt av inkubering med DAB-kromogen ble anvendt for å visualisere P501S-immunoreaktivitet. P501S ble funnet å være sterkt uttrykt i både normal prostata og prostata-tumorvev, men ble ikke detektert i noen av de andre vev testet.

For å identifisere epitopen gjenkjent av 10E3-G4-D3 ble en epitop-kartlegging utført. En serie av 13 overlappende 20-21 mer (5 aminosyre overlapping; SEKV ID NR: 489-501) ble syntetisert som spente over fragmentet av P501S anvendt for å danne 10E3-G4-D3. Flatbunnede 96 brønn mikrotiter-plater ble belagt med enten peptidene eller P501S-fragmentet anvendt for å immunisere mus, med 1 mikrogram/ml i 2 timer ved 37°C. Brønner ble deretter aspirert og blokkert med fosfatbufret saltvann inneholdende 1% (vekt/volum) BSA i 2 timer ved romtemperatur og deretter vasket i PBS inneholdende 0,1% Tween 20 (PBST). Renset antistoff 10E3-G4-D3 ble tilsatt med 2 ganger fortynninger (1000 ng -16 ng) i PBST og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Dette ble fulgt av vasking 6 ganger med PBST og deretter inkubering med HRP-konjugert esel anti-mus IgG (H+L)Affinipure F(ab') fragment (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) med 1:20000 i 30 minutter. Platene ble deretter vasket og inkubert i 15 minutter i tetrametyl-benzidin. Reaksjoner ble stanset ved tilsetning av 1N svovelsyre og platene ble lest ved 450 nm ved anvendelse av en ELISA plateleser. Som vist i Fig. 8 ble reaktivitet sett med peptidet med SEKV ID NR: 496 (svarende til aminosyrer 439-459 for P501S) og med P501S-fragmentet, men ikke med de resterende peptider, hvilket demonstrerer at epitopen gjenkjent av 10E3-G4-D3 er lokalisert til aminosyrer 439-459 i SEKV ID NR: 113.

For ytterligere å evaluere vev-spesifisiteten av P501S, ble multi-matrise immunohistokjemisk analyse utført på omtrent 4700 forskjellige humane vev omfattende alle de viktigste normale organer så vel som neoplasier avledet fra disse vev. 65 av disse humane vevprøver var av prostataopprinnelse. Vevsnitt 0,6 mm i diameter ble formalin-fiksert og paraffin-innleiret. Prøver ble forbehandlet med HIER ved anvendelse av 10 mM citratbuffer pH 6,0 og koking i 10 min. Snittene ble merket med 10E3-G4-D3 og P501S-immunoreaktivitet ble visualisert med HRP. Alle de 65 prostatavev-prøver (5 normale, 55 ubehandlede prostatatumorer, 5 hormon-motstandsdyktige prostatatumorer) var positive, og viser distinkt perinukleær merking. Alle andre undersøkte vev var negative for P501S-ekspresjon.

c) Preparering og karakterisering av antistoffer mot P503S

Et fragment av P503S (aminosyrer 113-241 av SEKV ID NR: 114) ble

uttrykt og renset fra bakterier i det vesentlige som beskrevet ovenfor for P501S og anvendt for å immunisere både kaniner og mus. Mus monoklonale antistoffer ble isolert ved anvendelse av standard hybridom-teknologi som beskrevet ovenfor. Kanin monoklonale antistoffer ble isolert ved anvendelse av Selected Lymphocyte Antibody Method (SLAM) teknologi ved Immgenics Pharmaceuticals (Vancouver, BC, Canada). Tabell VI nedenfor lister opp de monoklonale antistoffene som ble utviklet mot P503S.

DNA-sekvensene som koder for de komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) for de kanin monoklonale antistoffer 20D4 og JA1 ble bestemt og er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 502 og 503.

For bedre å definere den epitop-bindende region i hvert av antistoffene, ble en serie av overlappende peptider dannet som spenner over aminosyrer 109-213 i SEKV ID NR: 114. Disse peptider ble anvendt for å epitop-kartlegge anti-P503S monoklonale antistoffer ved ELISA som følger. Det rekombinante fragment av P503S som ble anvendt som immunogenet, ble anvendt som en positiv kontroll. 96 brønn mikrotiterplater ble belagt med enten peptid eller rekombinant antigen med 20 ng/brønn natten over ved 4°C. Plater ble aspirert og blokkert med fosfatbufret saltvann inneholdende 1% (vekt/volum) BSA i 2 timer ved romtemperatur og deretter vasket i PBS inneholdende 0,1% Tween 20 (PBST). Rensede kanin monoklonale antistoffer fortynnet i PBST ble satt til brønnene og inkubert i 30 min. ved romtemperatur. Dette ble fulgt av vasking 6 ganger med PBST og inkubering med Protein-A HRP-konjugat i en 1:2000 fortynning i ytterligere 30 min. Plater ble vasket seks ganger i PBST og inkubert med tetrametylbenzidin- (TMB) substrat i ytterligere 15 min. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 1N svovelsyre og plater ble lest ved 450 nm ved anvendelse av ELISA-plateleser. ELISA med mus monoklonale antistoffer ble utført med supernatanter fra vevkultur kjørt ufortynnet i forsøket.

Alle antistoffene bandt til det rekombinante P503S-fragment, med unntak av den negative kontrollen SP2-supernatant. 20D4, JA1 og 1D12 bandt stramt til peptid #2101 (SEKV ID NR: 504), som svarer til aminosyrer 151-169 i SEKV ID NR: 114. 1C3 bandt til peptid #2102 (SEKV ID NR: 505), som svarer til aminosyrer 165-184 i SEKV ID NR: 114. 9C12 bandt til peptid #2099 (SEKV ID NR: 522), som svarer til aminosyrer 120-139 i SEKV ID NR: 114. De andre antistoffer bandt til regioner som ikke ble undersøkt i disse studier.

Etter epitop-kartlegging ble antistoffene testet ved FACS-analyse på en cellelinje som stabilt uttrykte P503S for å bekrefte at antistoffene binder til celleoverflate-epitoper. Celler transfektert stabilt med et kontrollplasmid ble anvendt som en negativ kontroll. Celler ble merket levende uten fiksativ. 0,5 ug anti-P503S monoklonalt antistoff ble tilsatt og celler ble inkubert på is i 30 min. før de ble vasket to ganger og inkubert med FITC-merket geit anti-kanin eller mus sekundært antistoff i 20 min. Etter å være vasket to ganger ble celler analysert med en Excalibur fluorescens-aktivert cellesorterer. De monoklonale antistoffene 1C3, 1D12, 9C12, 20D4 og JA1, men ikke 8D3, ble funnet å binde til en celleoverflate-epitop av P503S.

For å bestemme hvilke vev som uttrykker P503S ble immunohistokjemisk analyse utført, i det vesentlige som beskrevet ovenfor, på et panel av normale vev (prostata, binyre, bryst, livmorhals, kolon, duodenum, galleblære, ileum, nyre, eggstokk, bukspyttkjertel, ørespyttkjertel, skjelettmuskel, milt og testikkel). HRP-merket anti-mus eller anti-kanin antistoff fulgt av inkubering med TMB ble anvendt for å visualisere P503S-immunoreaktivitet. P503S ble funnet å være sterkt uttrykt i prostatavev, med lavere nivåer av ekspresjon observert i livmorhals, kolon, ileum og nyre og ingen ekspresjon ble observert i adrenal, bryst, duodenum, galleblære, eggstokk, bukspyttkjertel, ørespyttkjertel, skjelettmuskel, milt og testikkel.

Western blot analyse ble anvendt for å karakterisere anti-P503S monoklonal antistoff-spesifisitet. SDS-PAGE ble utført på rekombinant (rek) P503S uttrykt i og renset fra bakterier og på lysater fra HEK293-celler transfektert med full-lengde P503S. Protein ble overført til nitrocellulose og deretter Western blot-analysert med hver av de anti-P503S monoklonale antistoffer (20D4, JA1, 1D12, 6D12 og 9C12) med en antistoff-konsentrasjon på 1 ug/ml. Protein ble detektert ved anvendelse av pepperrot-peroksydase (HRP) konjugert til enten et geit anti-mus monoklonalt antistoff eller til protein A-sepharose. Det monoklonale antistoffet 20D4 detekterte det aktuelle molekylvekt 14 kDa rekombinante P503S (aminosyrer 113-241) og 23,5 kDa arter i HEK293-cellelysater transfektert med full-lengde P503S. Andre anti-P503S monoklonale antistoffer viste lignende spesifisitet ved Western blot.

d) Preparering og karakterisering av antistoffer mot P703P

Kaniner ble immunisert med enten forkortet (P703Ptr1; SEKV ID NR: 172) eller full-lengde moden form (P703Pfl; SEKV ID NR: 523) av rekombinant P703P-protein uttrykt i og renset fra bakterier som beskrevet ovenfor. Affinitetsrenset polyklonalt antistoff ble dannet ved anvendelse av immunogen P703Pfl eller P703Ptr1 bundet til en fast bærer. Kanin monoklonale antistoffer ble isolert ved anvendelse av SLAM-teknologi ved Immgenics Pharmaceuticals. Tabell VII nedenfor lister opp både de polyklonale og monoklonale antistoffer som ble dannet mot P703P.

DNA-sekvensene som koder for de komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) for kanin monoklonale antistoffer 8H2, 7H8 og 2D4 ble bestemt og er gitt i henholdsvis SEKV ID NR: 506-508.

Epitop-kartleggingsundersøkelser ble utført som beskrevet ovenfor. Monoklonale antistoffer 2D4 og 7H8 ble funnet spesifikt å binde peptidene i henholdsvis SEKV ID NR: 509 (tilsvarende aminosyrer 145-159 i SEKV ID NR: 172) og SEKV ID NR: 510 (tilsvarende aminosyrer 11-25 i SEKV ID NR: 172). Det polyklonale antistoff 2594 ble funnet å binde til peptidene i SEKV ID NR: 511-514, idet det polyklonale antistoff 9427 binder til peptidene i SEKV ID NR: 515-517.

Spesifisiteten av anti-P703P-antistoffene ble bestemt ved Western blot analyse som følger. SDS-PAGE ble utført på (1) bakterielt uttrykt rekombinant antigen; (2) lysater av HEK293-celler og Ltk-/- celler enten utransfektert eller transfektert med et plasmid som uttrykker full-lengde P703P; og (3) supernatant isolert fra disse cellekulturer. Protein ble overført til nitrocellulose og deretter Western blot-analysert ved anvendelse av det anti-P703P polyklonale antistoff #2594 med en antistoff-konsentrasjon på 1 ug/ml. Protein ble detektert ved anvendelse av pepperrot-peroksydase (HRP) konjugert til et anti-kanin antistoff. Et 35 kDa immunoreaktivt bånd kunne observeres med rekombinant P703P. Rekombinant P703P kjører ved noe høyere molekylvekt siden det er epitop-merket. I lysater og supernatanter fra celler transfektert med full-lengde P703P, ble 30 kDa bånd svarende til P703P observert. For å sikre spesifisitet ble lysater fra HEK293-celler stabilt transfektert med et kontrollplasmid også testet og var negative for P703P-ekspresjon. Andre anti-P703P antistoffer viste lignende resultater.

Immunohistokjemiske undersøkelser ble utført som beskrevet ovenfor, ved anvendelse av anti-P703P monoklonalt antistoff. P703P ble funnet å være uttrykt i høye nivåer i normal prostata og prostatatumorvev, men var ikke detekterbar i alle andre testede vev (brysttumor, lungetumor og normal nyre).

e) Preparering og karakterisering av antistoffer mot P504S

Full-lengde P504S (SEKV ID NR: 108) ble uttrykt og renset fra bakterier

i det vesentlige som beskrevet ovenfor for P501S og anvendt for å fremkalle

kanin monoklonale antistoffer ved anvendelse av Selected Lymphocyte Antibody Method (SLAM) teknologi ved Immgenics Pharmaceuticals (Vancouver, BC, Canada). Det anti-P504S monoklonale antistoff 13H4 ble vist ved Western blot å binde til både uttrykt rekombinant P504S og til nativ P504S i tumorceller.

Immunohistokjemiske undersøkelser ved anvendelse av 13H4 for å bedømme P504S-ekspresjon i forskjellige prostatavev ble utført som beskrevet ovenfor. Totalt 104 tilfeller, omfattende 65 tilfeller av radikal prostatektomier med prostatakreft (PC), 26 tilfeller av prostata-biopsier og 13 tilfeller av godartet prostatahyperplasi (BPH), ble merket med det anti-P504S monoklonale antistoff 13H4. P504S viste sterkt cytoplasmatisk granulær merking i 64/65 (98,5%) av PC i prostatektomier og 26/26 (100% ) PC i prostatiske biopsier. P504S ble merket sterkt og diffust i karsinomer (4+ i 91,2% av tilfellene av PC; 3+ i 5,5%; 2+ i 2,2% og 1+ i 1,1%) og høy grad prostatisk intraepitelial neoplasi (4+ i alle tilfeller). Ekspresjonen av P504S varierte ikke med Gleason-score. Bare 17/91 (18,7%) av tilfellene av NP/BPH rundt PC og 2/13 (15,4%) av BPH-tilfeller var fokale (1+, ingen 2+ til 4+ i alle tilfeller) og svakt positive for P504S i store kjertler. Ekspresjon av P504S ble ikke funnet i små atrofiske kjertler, postatrofisk hyperplasi, basalcelle-hyperplasi og transisjonen celle-metaplasi i hverken biopsier eller prostatektomier. P504S ble således funnet å være overuttrykt i alle Gleason-score for prostatakreft (98,5 til 100% sensitivitet) og viste bare fokal positivitet i store normale kjertler i 19/104 tilfeller (82,3% spesifisitet). Disse funn indikerer at P504S hensiktsmessig kan anvendes for diagnose av prostatakreft.

EKSEMPEL 19

Karakteriserin<g>av celleoverflate-eksresjon og

kromosom-lokalisering av prostata-spesifikt anti<g>en P501S

Dette eksemplet beskriver undersøkelser som demonstrerer at prostata-spesifikt antigen P501S blir uttrykt på overflaten av celler, sammen med undersøkelser for å bestemme den sannsynlige kromosomale lokasjon av P501S.

Proteinet P501S (SEKV ID NR: 113) er forutsagt å ha 11 transmembran-domener. Basert på oppdagelsen at epitopen gjenkjent av det anti-P501 S monoklonale antistoff 10E3-G4-D3 (beskrevet ovenfor i Eksempel 17) er intracellulær, ble det antatt at følgende transmembran-determinanter ville tillate forutsigelse av ekstracellulære domener av P501S. Fig. 9 er en skjematisk representasjon av P501S-proteinet som viser den antatte lokasjon av transmembrandomenene og den intracellulære epitop beskrevet i Eksempel 17. Understreket sekvens representerer de antatte transmembran-domener, uthevet sekvens representerer de antatte ekstracellulære domener og kursiv sekvens representerer de antatte intracellulære domener. Sekvens som er både uthevet og understreket representerer en sekvens anvendt for å danne polyklonalt kanin-serum. Lokasjonen av transmembrandomenene ble forutsagt ved anvendelse av HHMTOP som beskrevet av Tusnady og Simon (Principles Governing Amino Acid Composition of Integral Membrane Proteins: Applikacations to Topology Prediction, J. Mol. Biol. 283:489-506, 1998).

Basert på Fig. 9 er P501 S-domenet flankert av transmembrandomenene svarende til aminosyrer 274-295 og 323-342 antatt å være ekstracellulært. Peptidet i SEKV ID NR: 518 svarer til aminosyrer 306-320 i P501S og ligger i det antatte ekstracellulære domene. Peptidet i SEKV ID NR: 519, som er identisk med peptidet i SEKV ID NR: 518 med unntak av substitusjonen av histidin med asparginin, ble syntetisert som beskrevet ovenfor. Cys-Gly ble satt til C-terminus av peptidet for å lette konjugering til bærerproteinet. Spaltning av peptidet fra den faste bæreren ble utført ved anvendelse av den følgende spaltningsblanding: trifluoreddiksyre:etandiol:tioanisol:vann:fenol (40:1:2:2:3). Etter spaltning i to timer ble peptidet utfelt i kald eter. Peptid-pellet ble deretter oppløst i 10% volum/volum eddiksyre og lyofilisert før rensning ved C18 revers fase hplc. En gradient av 5-60% acetonitril (inneholdende 0,05% TFA) i vann (inneholdende 0,05% TFA) ble anvendt for å eluere peptidet. Renheten av peptidet ble verifisert ved hplc og massespektrometri og ble funnet å være

>95%. Det rensede peptidet ble anvendt for å danne kanin polyklonale antisera som beskrevet ovenfor.

Overflateekspresjon av P501S ble undersøkt ved FACS-analyse. Celler ble merket med polyklonalt anti-P501S peptid-serum med 10 ug/ml, vasket, inkubert med sekundær FITC-konjugert geit anti-kanin lg antistoff (ICN), vasket og analysert for FITC-fluorescens ved anvendelse av en Excalibur fluorescens aktivert cellesorterer. For FACS-analyse av transduserte celler ble B-LCL retroviralt transdusert med P501S. For å demonstrere spesifisitet i disse forsøk ble B-LCL transdusert med et irrelevant antigen (P703P) eller ikke-transdusert merket parallelt. For FACS-analyse av prostatatumor-cellelinjer, ble Lncap, PC-3 og DU-145 anvendt. Prostatatumor-cellelinjer ble dissosiert fra vevkulturplater ved anvendelse av celledissosieringsmedium og merket som ovenfor. Alle prøver ble behandlet med propidiumjodid (Pl) før FACS-analyse og data ble oppnådd fra Pl-ekskluderende ( dvs. intakte og ikke-permeabiliserte) celler. Kanin polyklonalt serum dannet mot peptidet i SEKV ID NR: 519 ble vist spesifikt å gjenkjenne overflaten av celler transdusert til å uttrykke P501S, hvilket demonstrerer at epitopen gjenkjent av det polyklonale serum er ekstracellulær.

For å bestemme biokjemisk hvorvidt P501S blir uttrykt på celleoverflaten, ble perifere membraner fra Lncap-celler isolert og underkastet Western blot-analyse. Spesifikt ble Lncap-celler lyset ved anvendelse av en dounce homogenisator i 5 ml homogeniseringsbuffer (250 mM sukrose, 10 mM HEPES, 1mM EDTA, pH 8,0, 1 komplett proteaseinhibitor-tablett (Boehringer Mannheim)). Lysatprøver ble spunnet ved 1000 g i 5 min. ved 4°C. Supernatanten ble deretter spunnet ved 8000 g i 10 min. ved 4°C. Supernatant fra 8000 g sentrifugeringen ble gjenvunnet og underkastet 100,000 g spinning i 30 min. ved 4°C for å gjenvinne perifer membran. Prøver ble deretter separert ved SDS-PAGE og Western blot-analysert med det mus monoklonale antistoff 10E3-G4-D3 (beskrevet ovenfor i Eksempel 17) ved anvendelse av betingelsene beskrevet ovenfor. Rekombinant renset P501S, så vel som HEK293-celler transfektert med og overuttrykkende P501S ble inkludert som positive kontroller for P501S-deteksjon. LCL-cellelysat ble inkludert som negativ kontroll. P501S kunne detekteres i Lncap totalt cellelysat, 8000 g (indre membran) fraksjonen og også i 100,000 g (plasma-membran) fraksjonen. Disse resultater indikerer at P501S blir uttrykt ved og lokaliserer til, den perifere membran.

For å vise at kanin polyklonalt antiserum dannet mot peptidet med SEKV ID NR: 519 spesifikt gjenkjenner dette peptid så vel som det tilsvarende native peptid med SEKV ID NR: 518, ble ELISA-analyser utført. For disse analyser ble flatbunnede 96-brønn mikrotiter-plater belagt med enten peptidet med SEKV ID NR: 519, det lenger peptidet med SEKV ID NR: 520 som spenner over hele det forutsagte ekstracellulære domene, peptidet med SEKV ID NR: 521 som representerer epitopen gjenkjent av det P501S-spesifikke antistoff 10E3-G4-D3 eller et P501S-fragment (svarende til aminosyrer 355-526 i SEKV ID NR: 113) som ikke omfatter den immuniserende peptidsekvens, med 1 ug/ml i 2 timer ved 37°C. Brønnene ble aspirert, blokkert med fosfatbufret saltvann inneholdende 1% (vekt/volum) BSA i 2 timer ved romtemperatur og deretter vasket i PBS inneholdende 0,1% Tween 20 (PBST). Renset anti-P501S polyklonalt kanin-serum ble tilsatt med 2 ganger fortynninger (1000 ng - 125 ng) i PBST og inkubert i 30 min. ved romtemperatur. Dette ble fulgt av vasking 6 ganger med PBST og inkubering med HRP-konjugert geit anti-kanin IgG (H+L) Affinipure F(ab') fragment ved 1:20000 i 30 min. Platene ble deretter vasket og inkubert i 15 min. i tetrametyl-benzidin. Reaksjoner ble stanset ved tilsetning av 1N svovelsyre og platene ble lest ved 450 nm ved anvendelse av en ELISA plateleser. Som vist i Fig. 11 gjenkjente spesifikt det anti-P501S polyklonale kaninserum peptidet med SEKV ID NR: 519 anvendt for immuniseringen så vel som det lenger peptid med SEKV ID NR: 520, men gjenkjente ikke de irrelevante P501S-avledede peptider og fragmenter.

I ytterligere undersøkelser ble kaniner immunisert med peptider avledet fra P501S-sekvens og antatt å være enten ekstracellulære eller intracellulære, som vist i Fig. 9. Polyklonale kaninsera ble isolert og polyklonale antistoffer i serumet ble renset, som beskrevet ovenfor. For å bestemme spesifikk reaktivitet med P501S, ble FACS-analyse anvendt, ved anvendelse av enten B-LCL transdusert med P501S eller det irrelevante antigen P703P fra B-LCL infisert med vaccinia-virus-uttrykkende P501S. For overflateekspresjon ble døde og ikke-intakte celler utelukket fra analysen som beskrevet ovenfor. For intracellulær merking ble celler fiksert og permeabilisert som beskrevet ovenfor. Kanin polyklonalt serum dannet mot peptidet med SEKV ID NR: 548, som svarer til aminosyrer 181-198 av P501S, ble funnet å gjenkjenne en overflateepitop av P501S. Kanin polyklonalt serum dannet mot peptidet med SEKV ID NR: 551, som svarer til aminosyrer 543-553 av P501S, ble funnet å gjenkjenne en epitop som var enten potensielt ekstracellulær eller intracellulær, ettersom i forskjellige forsøk intakte eller permeabiliserte celler ble gjenkjent av de polyklonale sera. Basert på lignende deduktiv slutning kan sekvensene i SEKV ID NR: 541-547, 549 og 550, som svarer til henholdsvis aminosyrer 109-122, 539-553, 509-520, 37-54, 342-359, 295-323, 217-274, 143-160 og 75-88 av P501S, betraktes å være potensielle overflate-epitoper av P501S gjenkjent av antistoffer.

I ytterligere undersøkelser ble mus monoklonale antistoffer fremkalt mot aminosyrer 296 til 322 av P501S, som er antatt å være i et ekstracellulært domene. A/J mus ble immunisert med P501S/adenovirus, fulgt av påfølgende forsterkning med et E. coli rekombinant protein, referert til som P501N, som inneholder aminosyrer 296 til 322 av P501S og med peptid 296-322 (SEKV ID NR: 755) koblet med KLH. Musene ble deretter anvendt for milt B-celle-fusjoner for å danne anti-peptid hybridomer. De resulterende 3 kloner, referert til som 4F4 (lgG1 .kappa), 4 G5 (lgG2a,kappa) og 9B9 (lgG1,kappa), ble dyrket for antistoff-produksjon. 4 G5 mAb ble renset ved å føre supernatanten over en Protein A-sepharose kolonne, fulgt av antistoff-eluering ved anvendelse av 0.2M glycin, pH 2,3. Renset antistoff ble nøytralisert ved tilsetning av 1M Tris, pH 8 og buffer byttet til PBS.

For ELISA-analyse ble 96-brønn plater belagt med P501S peptid 296-322 (referert til som P501-lang), et irrelevant P775 peptid, P501S-N, P501TR2, P501S-lang-KLH, P501S peptid 306-319 (referert til som P501-kort)-KLH eller det irrelevante peptid 2073-KLH, alle i en konsentrasjon på 2 ug/ml og fikk inkubere i 60 minutter ved 37°C. Etter betegningen ble platene vasket 5X med PBS + 0,1% Tween og deretter blokkert med PBS, 0,5% BSA, 0,4% Tween20 i 2 timer ved romtemperatur. Etter tilsetning av supernatanter eller renset mAb ble platene inkubert i 60 minutter ved romtemperatur. Platene ble vasket som ovenfor og esel anti-mus IgHRP-bundet sekundært antistoff ble tilsatt og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur, fulgt av en endelig vasking som ovenfor. TMB-peroksydase-substrat ble tilsatt og inkubert 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 1N H2S04og OD ble lest ved 450 nM. Alle tre hybridkloner utskilte mAb som gjenkjente peptid 296-322 og det rekombinante protein P501N.

For FACS-analyse ble HEK293-celler transient transfektert med P501SA/R1012 ekspresjons-konstruksjoner ved anvendelse av Fugene 6 reagens. Etter 2 dagers kultur ble cellene høstet og vasket, og deretter inkubert med renset 4 G5 mAb i 30 minutter på is. Etter mange vaskinger i PBS, ble 0,5% BSA, 0,01% azid, geit anti-mus Ig-FITC satt til cellene og inkubert i 30 minutter på is. Cellene ble vasket og resuspendert i vaskebuffer omfattende 1% propidiumjodid og underkastet FACS-analyse. FACS-analysen bekreftet at aminosyrer 296-322 av P501S er i et ekstracellulært domene og blir celleoverflate-uttrykt.

Den kromosomale lokasjon av P501S ble bestemt ved anvendelse av GeneBridge 4 Radiation Hybrid panel (Research Genetics). PCR-primere med SEKV ID NR: 528 og 529 ble anvendt i PCR med DNA-samlingerfra hybrid-panelet i henhold til produsentens retningslinjer. Etter 38 cykler med amplifisering ble reaksjonsproduktene separert på en 1,2% agarosegel og resultatene ble analysert gjennom Whitehead Institute/M IT Center for Genome Research web-server (http://www-genom.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) for å bestemme den sannsynlige kromosomale lokasjon. Ved anvendelse av denne metoden ble P501S kartlagt til den lange armen av kromosom 1 ved Wl-9641 mellom q32 og q42. Denne region av kromosom 1 er knyttet til prostatakreft-mottagelighet ved arvelig prostatakreft (Smith et al. Science 274:1371-1374, 1996 og Berthon et al. Am. J. Hum. Genet. 62:1416-1424, 1998). Disse resultater indikerer at P501S kan spille en rolle ved ondartet prostatakreft.

EKSEMPEL 20

Regulering av eksresjon av prostata-spesifikt anti<g>en P501S

Steroid (androgen) hormon-modulering er en vanlig behandlings-modalitet ved prostatakreft. Ekspresjon av flere prostatavev-spesifikke antigener har tidligere vært demonstrert å reagere på androgen. Mottageligheten av prostata-spesifikt antigen P501S for androgen-behandling ble undersøkt i et vevkultur-system som følger.

Celler fra prostatatumor-cellelinje LNCaP ble platet ut med 1,5 x 106 celler/T75 kolbe (for RNA isolering) eller 3 x 105 celler/brønn av en 6-brønn plate (for FACS-analyse) og dyrket natten over i RPMI 1640 media inneholdende 10% trekull-strippet føtalt kalveserum (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD). Cellekultur ble fortsatt i ytterligere 72 timer i RPMI 1640 media inneholdende 10% trekull-strippet føtalt kalveserum, med 1 nM av det syntetiske androgen Metyltrienolon (R1881; New England Nuclear) tilsatt på forskjellige tidspunkter. Celler ble deretter høstet for RNA-isolering og FACS-analyse 0,1,2, 4, 8, 16, 24, 28 og 72 timer etter androgen-tilsetning. FACS-analyse ble utført ved anvendelse av anti-P501S antistoff 10E3-G4-D3 og permeabiliserte celler.

For Northern analyse ble 5-10 mikrogram total RNA kjørt på en

formaldehyd-denaturingsgel, overført til Hybond-N nylon-membran (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), kryssbundet og merket med metylenblått. Filteret ble deretter prehybridisert med Church's Buffer (250 mM Na2HP04, 70 mM H3PO4, 1 mM EDTA, 1% SDS, 1% BSA i pH 7,2) ved 65°C i 1 time. P501S DNA ble merket med 32P ved anvendelse av High Prime random-primed DNA-merkings-sett (Boehringer Mannheim). Ikke inkorporert merking ble fjernet ved anvendelse av MicroSpin S300-HR kolonner (Amersham Pharmacia Biotech). RNA-filtrene ble deretter hybridisert med frisk Churcl<Y>s Buffer inneholdende merket cDNA natten over, vasket med 1X SCP (0,1 M NaCI, 0,03 M Na2HP04,7H20, 0,001 M Na2EDTA), 1% sarkosyl (n-lauroylsarcosin) og eksponert for røntgenfilm.

Ved anvendelse av både FACS og Northern analyse ble P501S-message- og protein-nivåer funnet å øke som respons på androgen-behandling.

EKSEMPEL 20

Fremstilling avfusjonsproteiner av prostata-spesifikke antigener

Eksemplet beskriver fremstilling av et fusjonsprotein av prostata-spesifikt antigen P703P og en forkortet form av det kjente prostata antigen PSA. Den forkortede form av PSA har en 21 aminosyre delesjon rundt det aktive serin-setet. Ekspresjonskonstruksjonen for fusjonsproteinet har også et restriksjonssete ved 3'-enden, umiddelbart før terminerings-kodonet, for å hjelpe ved addisjon av cDNA for ytterligere antigener.

Full-lengde cDNA for PSA ble oppnådd ved RT-PCR fra en samling av RNA fra humane prostatatumorvev ved anvendelse av primerene med SEKV ID NR: 607 og 608 og klonet i vektoren pCR-Blunt ll-TOPO. Det resulterende cDNA ble anvendt som templat for å fremstille to forskjellige fragmenter av PSA ved PCR med to sett primere (SEKV ID NR: 609 og 610; og SEKV ID NR: 611 og 612). PCR-produktene som har den forventede størrelse ble anvendt som templater for å fremstille forkortede former av PSA ved PCR med primerene med SEKV ID NR: 611 og 613, som dannet PSA (delta 208-218 i aminosyrer). cDNA for den modne formen av P703P med et 6X histidin-merke ved 5'-enden, ble fremstilt ved PCR med P703P og primerene med SEKV ID NR: 614 og 615. cDNA for fusjonen av P703P med den forkortede form av PSA (referert til som FOPP) ble deretter oppnådd ved PCR ved anvendelse av det modifiserte P703P cDNA og den forkortede form av PSA cDNA som templater og primerene med SEKV ID NR: 614 og 615. FOPP-cDNA ble klonet inn i Ndel-setet og Xhol-setet av ekspresjonsvektoren pCRX1 og bekreftet ved DNA-sekvensering. Den bestemte cDNA-sekvens for fusjonskonstruksjonen FOPP er gitt i SEKV ID NR: 616, med aminosyresekvensen gitt i SEKV ID NR: 617.

Fusjonen FOPP ble uttrykt som et enkel rekombinant protein i E. coli som følger. Ekspresjonsplasmidet pCRX1 FOPP ble transformert til E. coli stamme BL21 -CodonPlus RIL. Transformanten ble vist å uttrykke FOPP-protein etter induksjon med 1 mM IPTG. Kulturen med det tilsvarende ekspresjonsklon ble inokulert i 25 ml LB-medium inneholdende 50 ug/ml kanamycin og 34 ug/ml kloramfenicol, dyrket ved 37°C til OD 600 på ca. 1 og lagret ved 4°C natten over. Kulturen ble fortynnet i 1 liter TB LB inneholdende 50 ug/ml kanamycin og 34 ug/ml kloramfenicol og dyrket ved 37°C til OD600 på 0,4. IPTG ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 1 mM og kulturen ble inkubert ved 30°C i 3 timer. Cellene ble pelletert ved sentrifugering ved 5000 rpm i 8 min. For å rense proteinet ble cellepelleten suspendert i 25 ml 10 mM Tris-CI pH 8,0, 2mM PMSF, fullstendig proteaseinhibitor og 15 ug lysozym. Cellene ble lyset ved 4°C i 30 minutter, ultralydbehandlet mange ganger og lysatet ble sentrifugert i 30 minutter ved 10.000 x g. Fellingen, som inneholdt inklusjonsstoffet, ble vasket to ganger med 10 mM Tris-CI pH 8,0 og 1% CHAPS. Inklusjonsstoffet ble oppløst i 40 ml 10 mM Tris-CI pH 8,0,100 mM natriumfosfat og 8 M urinstoff. Løsningen ble bundet til 8 ml Ni-NTA (Qiagen) i én time ved romtemperatur. Blandingen ble hellet i en 25 ml kolonne og vasket med 50 ml 10 mM Tris-CI pH 6,3, 100 mM natriumfosfat, 0,5% DOC og 8M urinstoff. Det bundede protein ble eluert med 350 mM imidazol, 10 mM Tris-CI pH 8,0, 100 mM natriumfosfat og 8 M urinstoff. Fraksjonene inneholdende FOPP-proteiner ble samlet og dialysert i stor utstrekning mot 10 mM Tris-CI pH 4,6, aliquotfordelt og lagret ved - 70°C.

EKSEMPEL 21

Sanntid PCR-karakteriserin<g>av prostata-spesifikt anti<g>en P501S ierifert blod frarostatakreft-pasienter

Sirkulerende epitelceller ble isolert fra friskt blod fra normale individer og metastasisk prostatakreft-pasienter, mRNA isolert og cDNA fremstilt ved anvendelse av sanntid PCR-prosedyrer. Sanntid PCR ble utført ved Taqman™ prosedyren ved anvendelse av både genspesifikke primere og prober for å bestemme nivåene av genekspresjon.

Epitelceller ble anriket fra blodprøver ved anvendelse av en immunomagnetisk kule separeringsmetode (Dynal A.S., Oslo, Norge). Isolerte celler ble lyset og de magnetiske kuler fjernet. Lysatet ble deretter prosessert for poly A+ mRNA-isolering ved anvendelse av magnetiske kuler belagt med Oligo(dT)25. Etter vasking av kulene i buffer ble kule/poly A+ RNA-prøver suspendert i 10 mM Tris-HCI, pH 8,0 og underkastet revers transkripsjon. Det resulterende cDNA ble underkastet sanntid PCR ved anvendelse av gen spesifikke primere. Beta-actin-innhold ble også bestemt og anvendt for normalisering. Prøver med P501S-kopier større enn gjennomsnittet av de normale prøver + 3 standardavvik ble betraktet positive. Sanntid PCR på blodprøver ble utført ved anvendelse av Taqman™ prosedyren, men med utvidelse til 50 cykler ved anvendelse av forover og reverse primere og prober spesifikke for P501S. Av de åtte prøver testet var 6 positive for P501S og B-actin-signal. De resterende 2 prøver hadde ikke detekterbar B-actin eller P501S. Intet P501 S-signal ble observert i de fire normale blodprøver testet.

EKSEMPEL 22

Eksresjon av prostata-spesifikke anti<g>ener P703P og P501S i

SCID MUS-PASSERTE PROSTATATUMORER

Ved vurdering av effektiviteten av antigener ved behandling av prostatakreft er fortsatt tilstedeværelse av antigenene i tumorer i løpet av androgen ablasjonsterapi viktig. Tilstedeværelsen av prostata-spesifikke antigener P703P og P501S i prostatatumor-prøver dyrket i SCID mus i nærvær av testosteron ble evaluert som følger.

To prostatatumorer som hadde metastasert til ben ble fjernet fra pasienter, implantert i SCID-mus og dyrket i nærvær av testosteron. Tumorer ble evaluert for mRNA-ekspresjon av P703P, P501S og PSA ved anvendelse av kvantitativ sanntid PCR med SYBR-grønn forsøksmetode. Ekspresjon av P703P og P501S i en prostatatumor ble anvendt som en positiv kontroll og fravær i normal tarm og normalt hjerte som negative kontroller. I begge tilfeller var det spesifikke mRNA til stede i sen-passasje tumorer. Siden benmetastasene ble dyrket i nærvær av testosteron, impliserer dette at tilstedeværelse av disse gener ikke ville bli tapt i løpet av androgen-ablasjonsterapien.

EKSEMPEL 23

ANTI-P503S MONOKLONALT antistoff hemmer tumorvekst in vivo

Evnen til det anti-P503S monoklonale antistoff 20D4 til å undertrykke tumordannelse hos mus ble undersøkt som følger.

Ti SCID-mus ble injisert subkutant med HEK293-celler som uttrykte P503S. Fem mus mottok 150 mikrogram av 20D4 intravenøst på dag 0 (tid for tumorcelle-injeksjon), dag 5 og dag 9. Tumorstørrelse ble målt i 50 dager. Av de fem dyrene som ikke fikk 20D4, dannet tre detekterbare tumorer etter ca. 2 uker som fortsatte å vokse gjennom hele undersøkelsen. I motsetning dannet ingen av de fem mus som fikk 20D4, tumorer. Disse resultater demonstrerer at anti-P503S Mab 20D4 oppviser kraftig anti-tumor-aktivitet in vivo.

EKSEMPEL 24

Karakteriserin<g>av en T-celle reseptor-klon fra en

501 s-spesifikk t- celle-klon

T-celler har en begrenset levetid. Imidlertid muliggjør kloning av T-celle-reseptor- (TCR) kjeder og påfølgende overføring i det vesentlige uendelig propagering av T-celle-spesifisiteten. Kloning av tumor-antigen TCR-kjeder tillater overføring av spesifisiteten til T-celler isolert fra pasienter som har felles TCR MHC-restriksjons-allel. Slike T-celler kunne deretter utvides og anvendes i adoptive overføringsoppsett for å innføre tumor-antigen-spesifisitet til pasienter som bærer tumorer som uttrykker antigenet. T-cellereseptor alfa- og beta-kjeder fra en CD8 T-celle-klon spesifikk for prostataspesifikt antigen P501S ble isolert og sekvensert som følger.

Total mRNA fra 2 x 10<6>celler fra CTL-klon 4E5 (beskrevet ovenfor i Eksempel 12) ble isolert ved anvendelse av Trizol-reagens og cDNA ble syntetisert. For å bestemme Va- og Vb-sekvenser i denne klon ble et panel av Va- og Vb-undertype-spesifikke primere syntetisert og anvendt i RT-PCR-reaksjoner med cDNA dannet fra hver av klonene. RT-PCR-reaksjonene demonstrerte at hver av klonene uttrykte en felles Vb-sekvens som svarte til Vb7-subfamilien. Videre, ved anvendelse av cDNA dannet fra klonen, ble den uttrykte Va-sekvens bestemt å være Va6. For å klone de fulle TCR alfa- og beta-kjeder fra klon 4E5, ble primere utformet som spente over de initiator- og terminator-kodende TCR-nukleotider. Primerene var som følger: TCR Valfa-6 5'(sense): GGATCC—GCCGCCACC— ATGTCACTTTCTAGCCTGCT (SEKV ID NR: 756) BamHI sete Kozak TCR alfa sekvens TCR alfa 3' (antisense): GTCGAC—TCAGCTGGACCACAGCCGCAG (SEKV ID NR: 757) Sali sete TCR alfa konstant sekvens TCR Vbeta-7.

5'(sense): GGATCC—GCCGCCACC--ATGGGCTGCAGGCTGCTCT (SEKV ID

NR: 758) BamHI sete Kozak TCR alfa sekvens TCR beta 3' (antisense): GTCGAC—TCAGAAATCCTTTCTCTTGAC (SEKV ID NR: 759) Sali sete TCR beta konstant sekvens. Standard 35 cyklus RT-PCR-reaksjoner ble etablert ved anvendelse av cDNA syntetisert fra CTL-klonen og primerene ovenfor ved anvendelse av den korrekturlesende termostabile polymerase PWO (Roche, Nutley, NJ).

De resulterende spesifikke bånd (ca. 850 bp for alfa og ca. 950 for beta) ble ligert inn i PCR butt vektor (Invitrogen) og transformert til E. coli. E . coli transformert med plasmider inneholdende full-lengde alfa- og beta-kjeder ble identifisert og stor skala-preparater av de tilsvarende plasmider ble dannet. Plasmider inneholdende full-lengde TCR alfa- og beta-kjeder ble underkastet sekvensering. Sekvenseringsreaksjonene demonstrerte kloning av full-lengde TCR alfa- og beta-kjeder med de bestemte cDNA-sekvenser for Vb- og Va-kjedene vist i henholdsvis SEKV ID NR: 760 og 761. De tilsvarende aminosyresekvenser er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 762 og 763. Va-sekvensen ble ved nukleotidsekvensoppstilling vist å være 99% identisk (347/348) med Va6,2 og Vb å være 99% identisk med Vb7 (336/338).

Fra det foregående vil det forstås at selv om spesifikke utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er beskrevet her for illustrasjonsformål, kan forskjellige modifikasjoner utføres uten å avvike fra omfanget av foreliggende oppfinnelse. Følgelig er oppfinnelsen bare begrenset av de følgende krav.

Claims

1. Isolert polynukleotid omfattende en sekvens valgt fra gruppen bestående av: (a) sekvenser gitt i SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788; (b) komplementer av sekvensene gitt i SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788; (c) sekvenser bestående av minst 20 påfølgende rester av en sekvens gitt i SEKV ID NR: 1-111, 115-171,173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788; (d) sekvenser som hybridiserer til en sekvens gitt i SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328,330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788 under moderat stringente betingelser; (e) sekvenser som har minst 75% identitet med en sekvens i SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788; (f) sekvenser som har minst 90% identitet med en sekvens i SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788; og (g) degenererte varianter av en sekvens gitt i SEKV ID NR: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 og 786-788.

2. Isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: (a) sekvenser angitt i SEKV ID NR: 112-114, 172, 176, 178,327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 og 789-791; (b) sekvenser som har minst 70% identitet med en sekvens i SEKV ID NR: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383,477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 og 789-791; (c) sekvenser som har minst 90% identitet med en sekvens i SEKV ID NR: 112-114, 172, 176, 178, 327,329, 331,336,339,376-380,383,477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 og 789-791; (d) sekvenser kodet for av et polynukleotid ifølge krav 1; (e) sekvenser som har minst 70% identitet med en sekvens kodet for av et polynukleotid ifølge krav 1; og (f) sekvenser som har minst 90% identitet med en sekvens kodet for av et polynukleotid ifølge krav 1.

3. Ekspresjonsvektor omfattende et polynukleotid ifølge krav 1 operabelt bundet til en ekspresjonskontroll-sekvens.

4. Vertscelle transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 3.

5. Isolert antistoff eller antigen-bindende fragment derav, som spesifikt binder til et polypeptid ifølge krav 2.

6. Metode for detektering av tilstedeværelse av kreft hos en pasient, omfattende trinnene: (a) å oppnå en biologisk prøve fra pasienten; (b) å bringe den biologiske prøven i kontakt med et bindemiddel som binder til et polypeptid ifølge krav 2; (c) å detektere i prøven en mengde av polypeptid som binder til bindemidlet; og (d) å sammenligne mengden av polypeptid med en forutbestemt avkuttingsverdi og derved bestemme tilstedeværelsen av kreft hos pasienten.

7. Fusjonsprotein omfattende minst ett polypeptid ifølge krav 2.

8. Fusjonsprotein ifølge krav 7, hvor fusjonsproteinet omfatter en sekvens valgt fra gruppen bestående av: (a) sekvenser gitt i SEKV ID NR: 682, 692, 695, 699, 703 og 709; og (b) sekvenser kodet for av SEKV ID NR: 679, 691, 696, 700, 704 og 708.

9. Oligonukleotid som hybridiserertil en sekvens angitt i SEKV ID NR: 1-111,115-171,173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 og 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 eller 786-788 under moderat stringente betingelser.

10. Metode for å stimulere og/eller ekspandere T-celler spesifikke for et tumorprotein, omfattende å bringe T-celler i kontakt med minst én komponent valgt fra gruppen bestående av: (a) polypeptider ifølge krav 2; (b) polynukleotider ifølge krav 1; og (c) antigenpresenterende celler som uttrykker et polypeptid ifølge krav 1, under betingelser og i en tid tilstrekkelig til å tillate stimulering og/eller ekspansjon av T-celler.

11. Isolert T-celle-populasjon, omfattende T-celler fremstilt ved metoder ifølge krav 10.

12. Preparat omfattende en første komponent valgt fra gruppen bestående av fysiologisk akseptable bærere og immunostimulanter og en andre komponent valgt fra gruppen bestående av: (a) polypeptider ifølge krav 2; (b) polynukleotider ifølge krav 1; (c) antistoffer ifølge krav 5; (d) fusjonsproteiner ifølge krav 7; (e) T-celle-populasjoner ifølge krav 11; og (f) antigenpresenterende celler som uttrykker et polypeptid ifølge krav 2.

13. Metode for å stimulere en immunrespons hos en pasient, omfattende administrering til pasienten av et preparat ifølge krav 12.

14. Metode for behandling av kreft hos en pasient, omfattende administrering til pasienten av et preparat ifølge krav 12.

15. Metode for å bestemme tilstedeværelse av kreft hos en pasient, omfattende trinnene: (a) å oppnå en biologisk prøve fra pasienten; (b) å bringe den biologiske prøven i kontakt med et oligonukleotid ifølge krav 9; (c) å detektere i prøven en mengde av et polynukleotid som hybridiserertil oligonukleotidet; og (d) å sammenligne mengden av polynukleotid som hybridiserer til oligonukleotidet med en forutbestemt avkuttingsverdi og derved bestemme tilstedeværelse av kreft hos pasienten.

16. Diagnostisk sett omfattende minst ett oligonukleotid ifølge krav 9.

17. Diagnostisk sett omfattende minst ett antistoff ifølge krav 5 og et deteksjonsreagens, hvor deteksjonensreagenset omfatter en rapportørgruppe.

18. Metode for å hemme utvikling av kreft hos en pasient, omfattende trinnene: (a) inkubering av CD4+ og/eller CD8+ T-celler isolert fra en pasient med minst én komponent valgt fra gruppen bestående av: (i) polypeptider ifølge krav 2; (ii) polynukleotider ifølge krav 1; og (iii) antigenpresenterende celler som uttrykker et polypeptid ifølge krav 2, slik at T-cellen prolifererer; og (b) administrering til pasienten av en effektiv mengde av de prolifererte T-celler, for derved å hemme utviklingen av kreft hos pasienten.