CA2126092A1 - Polypeptides antithrombotiques, antagonistes de la liaison du vwf aux plaquettes et/ou au sous-endothelium - Google Patents

Abstract

2126092 9315200 PCTABS00163 La présente invention concerne des polypeptides recombinants composés d'un partie adhésive dérivée de la structure du vWF capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF aux plaquettes et/ou au sous-endothélium, et d'une partie permettant sa stabilisation et sa présentation in vivo, leur préparation et des compositions pharmaceutiques les contenant.

Description

W 0 93/15200 PC~r/FR93/00087 2l 2~ 3.

POLYPEPTIDES ANTITHROMBOTI~UES, ANTAGONISTES DE LA LIAISON DU VWF AUX
PLAQUETTES ET/OU AU SOUS-ENDOTHELIUM.

La présente invention concerne de nouveaux polypeptides 5 antithrombotiques, leur préparation et des compositions pharmaceutiques les contenant. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides comportant une partie dérivée de la s~ucture du facteur de von Willebrand (vWF) et intrinsèquement capable de æ fixer aux plaquenes sanguines et/ou au sous-endo~elium.
Le vWF est une protéine glycosylée de 2813 acides aminés comprenant une sequence signal de 22 residus, un région `'pro" de 741 résidus et une protéine mature de 2050 acides aminés organisée en plusieurs structures répétées lTitani K. et al., Biochemistry ~ (1986) 3171-3184; Verweij C.L. et al., EMBO J. ~ t1986) 1839-1847]. Cene glycoprotéine complexe est présente i~L vivo, soit stockée dans des 15 vesicules specialisées des cellules endo~éliales ou des plaquettes, soit sous forme circulant~ dans le plasma sanguin après sécretion et maturation protéolytique lors du processus de sécretion. Les formes circulantes du vWF sont p~sentes sous la forrne de multimères de haut poids moléculaire ~usqu'à 20 000 kD8) et dont le protomèreest un dimère d`environ 450 lcDa. Le gène du vWF a été cloné et séquencé par 20 plusieurs equipes et mappé sur le bras court du chromosome 12 lSadler J.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82 (1985) 6394-6398; VenYeij C.L. et al., EMBO J. ~ (1986) 1839-1847; Shelton-lnloes B.B et al., Biochemistry 25 tl986) 3164-3171; BonthronD. et al., Nucleic Acids Res. 17 (1986) 712S-7127; Ginsburg D. et al., Science (1985~ 1401-1406].
Le vWF est impliqué dans la génèse des thrombus artériels par une inte~action complexe et mal comprise entre certains composan~s du sous-endothélium d`une part et les plaquettes sanguines d`autre part (et notamment les récepteurs GPlb plaquettaires). Un point important est que le vWF plasmatique circulant ne lie pas spontanément les recepteurs GPlb des plaquenes, et il est vraisemblable que son interaction avec le sous-endothélium soit nécessaire pour démasquer son tses) sitets) d'interaction avec les plaque~tes, par exemple à la suite d'un changement conformationnel du vWF. L'interaction entre le vWF ainsi activé et Wo 93/15200 pcr/FR93/ooo87 les GPlb plaquettaires conduit à l'activation des plaquettes sanguines qui acquièrent alors la eapacité de s'aggréger et de générer un thrombus fibrino-cellulaire en présence de certaines protéines adhésives (fibrinogène, thrombospondine, vWF
etc.~).
Compte tenu de son rôle précoce dans l'aceivation plaquettaire, le vWF
constitue une cible pharmacologique de choix pour la réalisation d`agents antithrombotiques. Toutefois, de nombreuses difficultés doivent être surmontées pour pouvoir exploiter cette molécule sur le plan pharmacologique: l'incapacité du vWF circulant à lier les plaquettes, la méconnaissance de la con~ibution respective des différentes fonctions adhesives du vWF (sous-endothélium et plaquettes) dansson activité thrombogénique, }a difficulté de produire à des niveaux suffisamment élevés des produits suffisamment purs et homogènes pour pouvoir être utilisés comrne agents thérapeutiques, la taille importante du vWF et sa complexité, la dynamique de sa structure tertiaire, etc... Certains fragments du vWF ont été obtenus 15 par diges~ion protéolytique et étudiés sur le plan pharmacologique. Des fragments recombinants ont également été produ~ts [EP 255 206; Sugimoto M. et al., Biochemistly ~ (1991) 5202-5209; A~uma H. et al., J. Biol. Chem. ~ (1991) 12342-12347~. Il ressort de ces études que les molécules obtenues ne sont pas totalement satisfaisantes, et en particulier, ne se comportent pas comme des 20 antagonistes optimaux de l'interaction vWF-plaquettes en l'absence de certains ligands non physiologiques (tels que la ristocétine ou la botrocétine par exemple), ou encore doivent être modifiés chimiquement (réduction et al};,vlation par exemple~, probablement pour dérnasquer les sites cryptiques de liaison du vWF à la GPlb plaquettaire.
2s La presente invention fotlrnit de nouvelles molécules inerinsèquementcapables d'antagoniser au moins partiellement l'activation plaquettaire. Les molécules de l'invention comportent une partie adhésive derivée de la structure du ~WF et une psrtie permetesnt sa présentation fonctionnelle et assurant la stabilité et la distribution ill ViVQ de la molécule. La demanderesse a en effet montré qu'il est possible de coupler génétiquement le vWF à une structure de nature protéique, et de produire de telles molecules à des niveaux satisfaisants. Les molécules de l'invention permettent de plus de générer et d'utiliser de petites structures dérivées du vWF et donc tres spécifiques d'un effet recherché (par exemple antagonistes de la seule =.~ .

2 ~ 2 ~

interaction vWF-GPlb). La demanderesse a par ailleurs montré qu'un tel couplage favorisait la présentation de cette stmcture à son/ses sites de liaison. Les polypeptides de l'invention perrnettent donc d`exposer, au sein d'une structure stable.
des structures dérivées du vWF capables d'antagoniser au moins partiellement la s liaison du vWF aux plaquettes, et de ce fait d'inhiber l'activation plaquettaire. Les polypeptides de l'invention permettent également d'exposer, au sein d'une structure stable, des structures dérivées du vWF capables d'antagoniser au moins par~iellement la liaison du vWF au sous-endothélium.
Un objet de la présente invention concerne donc des molécules comportant 0 une partie adhésive dérivée de la structure ~u vWF capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF aux plaquettes et/ou au sous-endothélium, et unepartie de nature protéique permettant sa stabilisation et sa présentation in vivo.
Plus particulièrement, dans les molécules de l'invention, la partie adhésive est constituée par tout ou partie de la sé~uence peptidique comprise entre les résidus 1~ 445-733 du vWF ou d'un variant de celle-ci. La séquence peptidique du vWF ayant été publiée, la numérotation des résidus de la partie adhésive des molécules de l'invention se réfère à la numérotation de la séquence du vWF publiée par Titani et al. ~Biochemistry ~ (1986) 3171-3184]. Il est entendu que cette fonction peut être redondante au sein des molécules de la présente invention. Une partie de cette séquence du vWF (résidus Thr470 à Val713) est indiqué~e sur la SEQ ID n 1, danslaquelle elle est couplée en C-terminal de la sérum-albumine humaine.
Au sens de la présente inventionl le t~rne variant dési~ne toute molécule obtenue ~ar modification de la ~équence capable d'anta~oniser au moins partiellement la liaison du vWF aux plaquettes et/ou au sous-endothélium. Par 2~ modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification obtenue, par exemple, au m~y~ a~ des techniques du génie génétique.
De tels variants peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité de la molécule pour son (ses) site(s) de fixation, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui de réduire sa susceptibilité à des proteases, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou encore de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés FEUILLE DE REMPLACEMENT

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pharrnacocinétiques ou biologiques telles que notamment des fonctions adhésives exprimée de façon intrinsèquement non cryptique.
Des polypeptides de l'invention particulièrement avantageux sont ceux dans lesquels la partie adhésive présente:
(a) la séquence peptidique comprise entre les résidus 445-733 du vWF, ou, (b) une partie de la séquence peptidique (a) capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sous-endothélium, our (c) une structure dérivée des structures (a) ou (b) par modifications structurales (mutation, substitution addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus) et capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sous-endothélium, ou>
(d) une sequence peptidique non naturelle, par exemple isolée à partir de banquès peptidiques et capable d`antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sous-endothélium.
Parmi les s~uctures du type (b), on peut citer plus par~iculièrement celles ayant conservé la capacité d'antagoniser l'interaction en~e le vWF et la GPlb plaquettaire, telles que par exemple les peptides G10 ou D5 décrits par Mori et al. [J.
Biol. Chem. ~ (1988) 17901-17904], ou les peptides ayant conservé la capacité delier le collagène [Pareti F.I. et ah, J. Biol. Chem. ~61 (1986) 15310-15315; Roth GJ. et al. Biochemistry 25 (1986) 8357-8361], et/ou l'héparine [Fujimura Y. et al. J.
Biol. Chem. ~ (1987) 1734-1739] et/ou la botrocétine [Sugimoto M. et al., J. Biol.
Chem. 266 (1991) 18172-18178], etlou les sulfatides lChristophe O. et al. Blood 78 ~1991) 2310-2317] et/ou la ristocétine etc.., ou toute combinaison entre ces différentes fonctions adhésives.
Les structures du type (c) comprennent par exemple les molécules dans lesquelles certains sites de N- ou O-glycosylation ont été modifiés ou supprimés, ainsi que les molécules dans lesquelles un, plusieurs, voire tous les résidus cystéine ont été substitués, ou encore des mutants ponctuels et/ou multiples concernant au moins un résidu impliqué dans des pathologies de type IIB associées au vWF commeles résidus Arg543, Arg545, Trp550, Val553 ou Arg578 par exemple. Elles comprennent également des molécules obtenues à partir de (a) ou (b) par délétion de régions n'intervenant pæ ou peu dans l'interaction avec les sites de liaison considérés, et des molécules comportant par rapport à ~a) ou (b) des résidus supplémentaires, tels que par exemple une méthionine N-terminale et/ou une Wo 93/15201) pcr~FRs3/l)oox7 2 ~ O '~ i~

séquence signal de sécrétion et/ou un adaptateur polypeptidique permettant la jonction à la structure stabilisatrice.
A titre d'exemple on peut citer des polypeptides de l'invention comportant la structure stabilisatrice couplée:
- à un peptide de type P1 dont la version minimale correspond au peptide G10 compris entre les résidus Cys474 et Pro488 du vWF, ou, - à un peptide de type P2 dont la version minimale correspond au peptide D5 compris entre les résidus Leu694 et Pro708 du vWF ou, - à un peptide de type X ou XD qui correspondent respectivement au fragment du vWF compris entre les résidus Pro488 et Leu694, et ses vanants obtenus par délédon, ou, - à un peptide de type X* défini comme tout variant moléculaire des peptides de type X et XD, ou, à toute combinaison de ces peptides, et entre autres:
- les peptides de type Pl-P2;
- les peptides de type Pl-X, P1-XD, P1-X*;
- les peptides de type X-P2, XD-P2, X*-P2;
- les peptides dè t~pe P1-X-P2;
- les peptides de type PI-XD-P2;
- les peptides de type P1-X*-P2;
- tout peptide adhésif tel que défini plus avant et représenté plus d'une fois au sein de la molécule de l'invention.
La partie adhésive des molécules; de l'invention peut être couplée, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un peptide de jonction à la structure stabilisatrice protéique. De plus, elle peut constituer l'extrémité N-terminale comme l'extrémité C-terminale de la molécule. Préférentiellement, dans les molécules de l'invention, la partie adhésive constitue la partie C-tenninale de la chimère.

Préférentiellement, la structure stabilisatrice des polypeptides de l'invention est un polypeptide possédant une demie-vie plasmatique élev~e~ A titre d'exemple, il peut s'agir d'une protéine telle qu'une albumine, une apolipoprotéine, une immunoglobuline ou encore une transferine, etc... Il peut également s'ag* de peptides dérivés de telles protéines par modifications structurales, ou de peptides WO 93/15200 pcr/FR93~ooo87 ~ ~ ~ & 0 9 rJ 6 synthétisés artificiellement ou semi-artificiellement, et possédant une demie-vie plasmatique élevée. Par ailleurs, la structure stabilisatrice utilisée est plus préférentiellement un polypeptide faiblement ou non-immunogénique pour l'organisme dans lequel le polypeptide de l'invention est utilisé.
s Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la structure stabilisatrice est une albumine ou un variant de l'albumine et par exemple la sérum-albumine humaine (SAH). Il est entendu que les variants de l'albumine désignent toute protéine à haute demie-vie plasmatique obtenue par modification (mutation, délétion et/ou addition) par les techniques du génie génétique d'un gène codant pour un isomorphe donné de la sérum-albumine humaine, ainsi que toute macromolécule à haute demie-vie plasmatique obtenue par modification in vitro dela protéine codée par de tels gènes. L'albumine étant très polymorphe, de nombreux variants naturels ont été identifiés et répertoriés [Weitkamp L.R. et al., Ann. Hum.
Genet. 37 (1973) 219]. A titre d'exemple, les c~imères entre la (les) dite(s) fonction(s) adhésive(s) et la SAH mature possèdent des propriété~s pharmacocinétiques et des activités antithrombotiques particulièrement utiles enthérapeutique.
Un autre objet de linvention concerne un procédé de préparation des molécules chimè~es décrites ci^avant. Plus precisément, ce procédé consiste à faire e~rimer par un hôte cellulaire eucaryote ou procaryote une séquence nucléotidique codant pour le polypeptide désiré, puis à récolter le polypeptide produit.
Parmi les hôtes eucaryotes ut;lisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les cellules animales, les levtises, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre SaccharomYces~
Klu~vver~mvces, PiÇh~, Sch~anniomvces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, Cl27, etc... Parrni les champignons susceptibles d'être utilisés dans la presente invention, on peut citer plus particulièrement ~oeill~ ssp. ou Tricho~errn~ ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries telles que Escherichi~ c~li, ou appartenant aux genres 30 Corvnebacterium, ~acillus, ou S~eptomvces.

Les séquences nucléotidiques utilisables dans le cadre de la pr~sente invention peuvent être preparées de differentes manières~ Généralement, elles sont WO 93/15200 PCI`/FR93/00087 2.1 2 rS V ~q 2 obtenues en assemblant en phase de lecture les séquences codant pour chacune desparties fonctionnelles du polypeptide. Celles-ci peuvent être isolées par les techniques de l'homme de l'art, et par exemple directement à partir des ARN
messsagers (ARNm) cellulaires, ou par reclonage à partir d'une banque d'ADN
S complémentaire (ADNc) effectuée à partir de cellules productrices, ou encore il peut s'agir de séquences nucléotidiques totalement synthétiques. Il est entendu de plus que les séquences nucléotidiques peuvent également être ultérieurement modifiées, par exemple par les techniques du génie génétique, pour obtenir des dérivés ou des variants desdites séquences.
lo Plus préférentiellement, dans le procédé de l'invention, la séquence nucléotidique fait partie d'une cassette d'expreæion comprenant une région d'initiation de la transcription (région promoteur) permettant, dans les cellules hôtes, I'expression de la séquence nucléotidique placée sous son contrôle et codant pour les polypeptides de l'invention. Cette région peut provenir de régions promoteurs de15 gènes fortement exprimés dans la cellule hôte utilisée, I'expression étant constitutive ou régulable. S'agissant de levures, il peut s'agir du promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK), de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GPD), de la lactase (L~4). des énolases (ENQ), des alcools deshydrogénases (AI)H), etc... S'agissant de bactéries, il peut s'agir du promoteur des gènes droit ou 20 gauche du bactériophage lambda (PL, PR), ou encore des promoteurs des gènes des opérons tryptophane (Ptlp) ou lactose (Plac). En outre, cette région de contrôle peut etre modifiee, par exemple par mutagénèse in vitro, par introduction d'éléments additionnels de contrôle ou de séquences synthétiques, ou par des délétions ou des substitu~ions des éléments orginels de contrôle. La cassette d'expression peut 2s également comprendre une région de terminaison de la transcription fonctionnelle dans l'hôte envisagé, positionnée immédiatement en aval de la sequence nucléotidique codant pour un polypeptide de l'invention.

Dans un mode préféré, les polypeptides de l'invention résultent de l'expression dans un hôte euca~rote ou proca~ote d`une séquence nucléotidique et de 30 la sécrétion du produit d'expression de ladite sequence dans le milieu de culture. 11 est en effet particulièrement avantageux de pouvoir obtenir par voie recombinante des molécules directement dans le milieu de culture. Dans ce cas, la séquence nucléotidique codant pour un polypeptide de l'invention est précédée d'une sé~uence "leader" (ou sequence signal) dirigeant le polypeptide naissant dans les voies de wo 93/15200 Pcr/FRs3/ooox7 2~ 8 secrétion de l'hôte utilisé. Cette séquence "leader" peut être la séquence signal naturelle du vWF ou de la structure stabilisatrice dans le cas où celle-ci est une protéine naturellement sécrétée, mais il peut également s`agir de toute autre séquence '`leader" fonctionnelle, ou d`une séquence `'leader'` artificielle. Le choix de l'une ou 5 l`autre de ces séquences est notamment guidé par l'hôte utilisé. Des exemples de séquences signal fonctionnelles incluent celles des gènes des phéromones sexuelles ou des toxines "killer'` de levures.
En plus de la cassette d`expression, un ou plusieurs marqueurs permettant de sélectionner l'hôte recombiné peuvent être additionnés, tels que par exemple le lo gène URA3 de la levure S. cerevisiae, ou des gènes conférant la resistance à des antibiotiques comme la généticine (G418) ou à tout autre composé toxique comme ce~tains ions métalliques.
L`ensemble constitué par la cassette d`expression et par le marqueur de sélection peut être introduit, soit directement dans les cellules hôtes considérées, soit 15 inséré préalablement dans un vecteur autoréplicatif fonctionnel. Dans le premier cas, des sequences homologues à des régions présentes dans le génôme des cellules hôtes sont préférentiellement additionnées à cet ensemble; lesdites séquences étant alors positionnées de chaque côté de la cassette d`expression et du gène de sélection de fa,con à augmenter la fréquence d`intégration de l`ensemble dans le génôme de l`hote 20 en ciblant l`integration des séquences par recombinaison homologue. Dans le cas où
la cassette d'expression est insérée dans un système réplicatif, un système de réplication préféré pour les levures du genre KluvverQmvces est dérivé du plasmide pKD1 initialement isolé de K. dross phila~um; un système préféré de réplication pour les levures du genre SaccharQmvce~ est dérivé du plasmide 2~ de S. cerevisiae. De 25 plus, ce plasmide d'expression peut contenir tout ou partie desdits systèmes de replication, ou peut combiner des éléments dérivés du plasmide pKDl aussi bien que du plasmide 2~
En outre, les plasmides d'expression peuvent être des vecteurs navettes entre un hôte bactérien tel que Esch~richia coli et la cellule hôte choisie~ Dans ce 30 cas, une origine de réplication et un marqueur de sélection fonctionnant dans l'hôte bactérien sont requises. Il est également possible de positionner des sites de restriction entourant les séquences bactériennes et uniques sur le vecteur dlexpression: ceci permet de supprimer ces séquences par coupure et religature in vitro du vecteur tronqué avant transformation des cellules hôtes, ce qui peut resulter wo 93/15200 2 ~ 2 & ~ ~ I'.t pcr/FRs3/ooo~7 en une augmentation du nombre de copies et en une stabilité accrue des plasmidesd'expression dans lesdits hôtes. Par exemple, de tels sites de restriction peuvent correspondre aux séquences telles que 5'-GGCCNNNNNGGCC-3` (~fiI) ou 5'-GCGGCCGC-3' (~ I) dans la mesure où ces sites sont extrêmement rares et 5 généralement absents d'un vecteur d'expression.
Après construction de tels vecteurs ou cassette d'expression, ceux-ci sont introduits dans les cellules hôtes retenues selon les techniques classiques décrites dans la littérature. A cet égard, toute methode permettant d'introduire un ADN
étranger dans une cellule peut être utilisée. Il peut s'agir notamment de ~0 transformation, électroporation, conjugaison, ou toute autre technique connue de l'homme de l'art. A titre d'exemple pour les hôtes de type levure, les différentes souches de Kluyveromvces utilisées ont été transformées en traitant les cellulesentières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol, selon la technique décrite par lto et al. lJ. Bacteriol. ~ (1983) 163]. La technique de 15 transforrnation décrite par Durrens et al. ~Curr. Genet. 18 (1990) 7] utilisant l'éthylène glycol et le diméthylsulfoxyde a également été utilisée. Il est aussipossible de transformer les levures par electroporation, selon la méthode décrite par Karube et al. [FEBS Letters 18~ ~1985) 901. Un protocole alternatif est également décrit en détail dans les exemples qui suivent.
Après sélection des cellules transformées, les cellules exprimant lesdits polypeptides sont inoculées et la récupération desdits polypeptides peut être faite, soit au cours de la croissance cellulaire pour les procédés "en continu", soit en fin de croissance pour les cultures "en lots" ("batch"~. Les polypeptides qui font l'objet de la présente invention sont ensuite purifiés à partir du surnageant de culture en vue de leur caractérisation moléculaire, pharmacocinétique et anti$hromb~tique.

Un système d`expression préféré des polypeptides de l'invention consiste en l'utilisation des levures du genre ~l~yver~ rLv~es comme cellule hote, transformées par certains vecteurs dérivés du réplicon ex~achromosomique pKD1 initialement isolé chez K. marxi~ rar. ~rosnphitar~am- Ces levures, et en p&rticulier ~i~ et K. fraPilis sont généralement capables de répliquer lesdits vecteurs de façon stable et possèdent en outre l'avantage d'être incluses dans la liste des organismes G.R.A.S.
("enerally Becognized ~s ~afe"). Des levures privilégiées sont preférentiellement 2 ~ 2 ~

des souches industrielles du genre Kluvveromvces capables de répliquer de façon stable lesdits plasmides dérivés du plasrnide pKD1 et dans lesq~lels a été inséré un marqueur de sélection ainsi qu'une cassette d'expression permettant la sécrétion à des niveaux élevés des polypeptides de l'invention.
s La présente invention concerne également les sequences nucléotidiquescoda~t pour les polypeptides chimères décrits ci-avant, ainsi que les cellules recombinantes, eucaryotes ou procaryotes, comprenant de telles séquences.
La présente invention concerne aussi l'application à titre de médicament des polypeptides selon la présente i~vention. Plus particulièrement, l'inve~tion a pour objet toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides tel que décrit ci-avant. Plus particulièrement, ces compositions peuvent être utilisée$
pour la prévention ou le traitement des thromboses.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LI~TE DES FlGURES
Les représentations des plasmides indiquées dans les Figures suivantes ne sont pas traçées à l'échelle et seuls les sites de restriction importants pour la compréhension des clonages réalisés ont été indiqués.
SEQ ID n 1: Séquence nucléotidique d'lm fragment de restriction ~III
20 codant pour une protéine chimère du type SAH-vWF. La numérotation des acides aminés colTespond à la proteine chimère SAH-vWF470->713 mature (829 résidus);
le fragment Thr470-Val713 du vWF de cette chimère particulière est numéroté des résidus Thr586 à Val829.
Figure 2: Schématisation des chimères du type SAH-vWF (A~, du type 2s vWF-SAH (B) ou vWF-SAH-vWF (C). Abréviations utilisées: M/~, residu méthionine initiateur de la traduction, éventuellement suivi d'une séquence signal de sécrétion; SAH, sérum-albumine humaine mature ou un de ses variants; vWF, fragment(s) du vWF possédant une propriété de fixation aux plaquettes etlou au sou(s-endot~hélium, ou un (des) variants obtenus par les techniques du génie 30 gênétique~ La flèche noire indique l'extrémitê N-terminale de la protéine mature.

FEUILLE DE REMPL~C~REN~

Wo 93/1~200 pcr/FRs3/ooo87 2i 2fil~

fragment(s) du vWF possédant une propriété de fixation aux plaquettes et/ou au sous-endothélium, ou un (des) variants obtenus par les techniques du génie génétique. La flèche noire indique` l'extrémité N^terminale de la protéine mature.
Figure 3: A, carte de restriction du plasmide pYG105 et stratégie de S construction des plasmides d'expression des protéines chimères de la présente inven~ion. A~réviations utilisées: P, promoteur transcrip~ionnel; T, terminateurtranscriptionnel; IR, séquences répétées imersées du plasmide pKD1; LPSAH, région "prépro" de la SAH; Apr et Kmr désignent respectivement les gènes de résistance à l'ampicilline (E. col;) et au G418 (levures).
B, caractéristiques et filiation génétiques des principaux plasmides dlexpression des hybrides entre SAH et vWF exemplifiés dans la présente inve~tion. Les plasmides de la première colonne sont des plasmides de ~lype pUC
comportant un fragment de restriction HindIII correspondant à des fusions traductionnelles entre la totalité de la SAH et un fragment ou un variant moléculaire du vWF. Les plasmides d'expression correspondent au clonage dans l'orientation productive de ces fragments ~ III dans le site HindIII du plasmide pYG105 (LAC4~.
F~gure 4: Caractérisation du matériel sécrété après 4 jours de c~ture (erlenmeyers) de la souche CBS 2g3.91 transformée par les plasmides pYG1248 (plasmide d'expression d`une chimère du type SAH-P1-X-P2) et pKan707 (plasmide contrôle). Dans cette expérience les résultats des panneaux A, B, et C ont été migrés sur le même gel (SDS-PAGE 8,~o) puis traités séparemment.
A, coloration au bleu de coomassie; standard de poids moléculaire (piste 2);
surnageant équivalent à 50 ~1 de la culture transfo~mée par les plasmides pKan707 en milieu YPL (piste 1), ou pYG1248 en milieu YPD (piste 3) ou YPL (piste 4).
B, caractérisation immunologique du matériel sécréte après utilisation d'anticorps de solaris dirigés contre le vWF humain: même légende qu'en A à
l'exception que des standards biotinilés de poids moléculaire ont été utilises.
C, caractérisation immunologique du matériel secrété après utilisation d'anticorps de lapin dirigés contre l'albumine humaine: surnageant équivalent à 50 ~1 de la culture transformée par les plasmides pKan707 en milieu YPL (piste 1), ou pYG1248 en milieu YPD ~piste 2) ou YPL (piste 3).

WO 93/15200 PC~/F~93/OOOX7 Figure 5: Cinétique de sécrétion d'une chimère du type SAH-P2 par la souche CBS 293.91 transformée par le plasmide pYG1206.
A, coloration au bleu de coomassie; standard de poids moléculaire (piste l);
surnageant équivalent à 2,5 ~1 d'une culture "Fed Batch" en milieu YPD après 24h.
(piste 2), 40h. (piste 3) ou 46h. (piste 4) de croissance.
B, caractérisation immunologique du matériel sécrété après utilisation d'anticorps de souris dirigés contre le vWF humain: même légende qu'en A à
l'exception que des standards biotinilés de poids moléculaire ont été utilisés.
Fggure 6: Caractérisation du matériel sécrété par K. lacti~ transformé
par les plasmides pKan707 (plasmide contrôle, piste 2), pYG1206 (plasmide d'expression d'une chimère du t~rpe SAH-P2, piste 3), pYG1214 ~plasmide d'expression d`une chimère du type SAH-P1, piste 4) et pYG1223 (plasmide d'expression d'une chimère du type SAH-Pl-XD-P2, piste 5); standard de poids moleculaire (piste 1). Les dépôts correspondent à 50 ~1 de surnageant d'une culture stationnaire après croissance en milieu YPD, migration dans un gel à 8.5 ~o d'acrylamide et coloration au bleu de coomassie.
Figure 7: Caractérisation du matériel sécrété après 4 jours de culn~e (erlenmeyers) de la souche CBS 293.91 tr~nsformée par les plasmides pYG1311 (SAH-vWF508->704) et pYG1313 (SAH-vWF470->704, C471G, C474G), après migration sur gel SDS-PAGE à 8,5 %.
A, coloration au bleu de coomassie; sul~lageant équivalent à 100 111 de la culture transforrnée par les plasmides pYG1311 (pi~te 1) ou pYG1313 (piste 2) enmilieu YPL; standard de poids moléculaice ~piste 3).
B, caractérisation immunologique du matériel sécrété après utilisation 2s d`anticorps de souris dingés contre le vWF humain: meme legende qu'en A.
C, caractérisation immunologique du matériel sécrété apr~s utilisation d'anticorps de lapin diri~és contre la SAH: même legende qu'en A.
Figure 8: Caractérisation du matériel secreté après 4 jours de culture (erlenmeyers~ de la souche CBS 293.91 t~ansformée par les plasmides pYG1361 (SAH-vWF470^>704, C471G, C474G, R543W~ et pYG1365 (SAH-vWF470-~704, C471G, C474G, P574L), après migration sur gel SDS-PAGE à 8,5 ~ ans cette wo 93/l5200 pcr/FRs3/ooo87 ~ l 5 expérience les résultats des panneaux A, B, et C ont éte migrés sur le même gel puis traités séparemment.
A, coloration au bleu de coomassie; surnageant équivalent à 100 ~1 de la culture transformée par les plasmides pYG1361 (piste 1) ou pYG1365 (piste 2) en 5 milieu YPL; standard de poids moléculaire (piste 3).
B, caractérisation immunologique du matériel sécrété après utilisation d'anticorps de souris dirigés contre le vWF humain: même légende ~qu'en A.
C, caractérisation immunologique du matériel sécrété après utilisation d'anticorps de lapin dirigés contre la SAH: même légende qu'en A.
~O Fggure 9 : Dosage de l'activité antagoniste in vitro de l'agglutination des plaquettes humaines fixées au paraformaldéhyde: CI50 des hybrides SA H-vWF694 708, [SAH-vWF470-713 C471G, C474G] et [SAH-vWF470-704 C471G, C474G~
relativement à l'étalon RG12986. La détermination de l'inhibition dose-dépendante de l'agglutination plaquettaire est réalisée sous agitation à 37C, en utilisant un 15 agrégamètre PAP~, en présence de vWF humain, de botrocétine (8,2 mglml) et duproduit à tester à différentes dilutions. La concentration du produit permettantd'inhiber de moitié l'agglutination controle (absence de produit) est alors déterminée (CI50~.
~EMPLES

Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparati~es d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlon~re de eésium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purificalion de fragments d'ADN par électroélution, les ex~raction 25 de protéines au p~énol ou au phénol-chloroforrne, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transfo~nation dans Escherichia coli etc... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature lManiatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al.
30 (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]~

Wo 93/l5200 pcr/FR93/ooox7 6 ~ ~3 '-~t 14 Les enzymes de restriction ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham et sont utilisées selon les recommandations des fournisseurs.
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont 5 d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 ~Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
lo Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectue par le fragment de Klenow de l'A~N Polymérase I d'~. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destmction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La des~uction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 1 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzyrnatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR oeolymérase-catalyzed ~hain ~eaction, Saiki R.K. et al., Science ~ (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Eslzym. ~ tl987) 335-350] est effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. ;
La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467~ en utilisant le kit distribué par Amersham.
La numérotation des acides aminés du vWF est celle de Titani et al.
~Biochemis~y ~ ~1986) 3171-3184].
Les ~ansformations de K. I~ctis avec l'ADN des plasmides d'expression des protéines de la présente invention sont effectuées par toute technique connue del'homme de l'art, et dont un exemple est donné dans le texte.
Sauf indication contraire, les souches bactériennes utilisé!es sont E:. coli MC1060 (~IPOZYA, X74, g~lU, ~lK, ~Ar), ou ~QIi TG1 (~" ~2A,B, ~2E, 3hi, h~lD5 / E;~D36, ~QA+B+, ~lq, ~Z, M15).

WO 93/15200 PCI`/FR93/OOOX /
~ 2fiO~` ~

Les souches de levures utilisées appartiennent aux levures bourgeonnantes et plus particulièrement aux levures du genre Kluweromyces. Les souche K. lactis MW98-8C (~, uraA. ~, ~, K+, pKD1~) et K. Iactis CBS 293.91 ont été
particulièrement utilisées; un échantillon de la souche MW98-8C a été déposé le 16 5 Septembre 1988 au Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) à Baarn ~Pays Bas) où il a été enregistré sous le numéro CBS 579.88.
Une souche bactérienne (~Qli) transformée avec le plasmide pET-8c52K a été déposée le 17 Avril 1990 auprès de l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC 68306.
Les souches de levures transformées par les plasmides d'expression codant pour les protéines de la présente invention sont cultivées en erlenmeyers ou en fermenteurs pilotes de 21 (SETRIC, France) à 28C en milieu riche (YPD: 1 ~Yo yeast extract, 2 ~o Bactopeptone, 2 ~o glucose; ou YPL: 1 ~o yeast extract, 2 5~o Bactopeptone, 2 5'o lactose) sous agitation constante.
EXEMPLE 1: CONSIRUCTION DU PLASMIDE pET-8c52K ET DE
SES VA~IANTS MOLECULAIRES
Le fragment du cDNA du vWF codant pour les résidus 445 à 733 du vWF
humain possède plusieurs déterminants cruciaux de l'interaction entre le vWF et les plaquettes d'une part, et certains éléments de la membrane basale et du tissu sous-endothelial d'autre part. L'amplification de ces déterminants génétiques peut être réalisée, par exemple à partir d`une lignée cellulaire humaine exprimant le vWF, et par exemple d'une lignée de cellules endothéliales de veines de cordon ombilicalhumain [Verweij C.L. et al., Nucleic Acids Res. L~ (1985) 4699-4717~, ou encore à
partir d'ARN de plaquettes humaines, par exemple seion le protocole décrit par Ware et al. lProc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991) 2946-2950]. Les ARN cellulaires sont puAfiés en utilisant la technique d'extraction au ~hiocyanate de guanidium initialement décrite par Cathala ~ al. [DNA 4 (1983) 329-335] et utilisés comme matrice à la synthèse d'ADN complémentaires (ADNc) incluant la partie du vWF à
amplifier. Dans un premier temps, la synth~se du brin non codant se fait en utilisant le kit dist~ibué par Amersham et un oligodéoxynucléotide complémentaire de la séquence nucleotidique de l'ARNm codant pour des résidus contigus localisés en C-terminal de la partie à amplifier. La solution résultante est ensuite soumise à 30 cycles d'amplification enzymatique par la technique PCR, en utilisant comme 2l268q ~

vecteurs du type M13 en vue de leur vé~ification par sequençage en utilisant soit les amorces universelles situées de part et d'autre du multisite de clonage, soit des oligodéoxynucléotides spécifiques de la région amplifiée du gène du vWF dont la sequence de plusieurs isomorphes est connue [Sadler J.E. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 82 (1985~ 6391 6398; Verweij C.L. et al., EMBO J. ~ (1986) 1839-1847;
Shelton-Inloes B.B. et al., Biochemistry 25 (1986) 3164-3171; Bonthron D. et al., Nucleic Acids Res. 17 (1986) 7125-7127]. Le plasmide pET-8c52K est particulièrement utile car il comporte un fragmellt du cDNA du vWF codant pour les - résidus 445 à 733 du vWF humain et inclus notamment les peptides G10 et D5 antagonistes de l'interaction entre YWF et GPlb [Mori ~I. et al., J. Biol. Chem. ~
(1988) 17901-17904]. Le fragment du vWF present d~s le plasmi.de p5E est identique au fragment du vWF du plasmide pET-8c52K à l'exception que les résiduscystéine aux positions 459, 462,464,471 et 474 ont été mutés en résidus glycine par mutagénèse dirigée. Le plasmide p7E est identique au plasrnide p5E à l`exceptionque les résidus cystéine aux positions 509 et 695 ont également été mutés en residus glycine par mutagenèse dirigee.
EXEMPLE 2: CONSIRUCTION D'UN FRAGMENT DE RESIRlCTION
~II-~III INCLUANT UN SITE DE LIAISON DU vWF AUX
PLAQUETrES SANGUINES
E.2.1. PeptidedutypePl-X-P2.
E.2.1.1. Résidus Thr470-Val713 du vWF.
L'amplification PCR du plasmide pET-8c52K avec les oligodéoxynucleotides 5`-CCCG(~&~TC~Cl~A(~GCl~AACCTGTGAA&CCTGC-3' (Sql969, les sites ~I et MstII sont soulignés) et 5'-CCCG~GAI~CCAAGC-~A&ACl'rGTGCCATGTCG-3' (Sq2029, les sites ~3ar~I et HindIII sont soulignés), génère un fragment incluant les résidus Thr470 à Val713 du vWF (cf.
SEQ ID n 1, résidus Thr586 à Val829). L~s fragments amplifiés sont d`abord coupés par ~m~I, clonés dans le site BamHI d'un vecteur de type pUC et la séquence dtun clone est vérifiée par séquençage. La séquence peptidique ainsi amplifiée comporte un fragment de restriction ~tII-~lin~III incluant les résidusThr470 à Val713 du vWF et dont la séquence pe~tidique est identique à la séquence correspondante décrite par Titani et aL [Biochemistty ~ (1986) 3171-3184]~ Le FEUILLE DE REMPL~:EMEN~
.

2~260~?;, plasmide pYG1220 compo~e ce fragment de restriction ~ HindIII précédé du fragment ~III-~II du plasmide pYG404 (cf. Exemple 4 et Figure 3B).
E.2.1.2. Résidus Thr470-Pro704 du ~WF.
Le résidue 705 du vWF naturel est O-glycosylé et se situe à l'intérieur du peptide D5 défini par les résidus Leu694 à Pro708 du vWF [Mori H. et al., J. Biol.
Chem. ~ (1988) 17901-17904]. De plus il est connu qu'un traitement du vWF
naturel par une neuraminidase, dont la fonction est de libérer les acides sialiques terminaux des glycosylations des cellules de mammifères, permet d'exposer les sites de liaisons du vWF à la GPIb plaquettaire en l'absence de cofacteurs de lo l'agglutination plaquettaire tel que la botrochine par`exemple. Il est donc possible que la suppression de tout ou partie des sites de O-glycosylation du vWF
recombinant, et notasnmerlt sécrété par une le~e dont i] est admis que la O-glycosylation est dépourvue d'acides sialiques, génère un produit in~rinsèquement capable de reconnaitre la GPIb plaquettaire en l'abscence de tels cofacteurs. Unfragment ~-~m incluant les résidus Thr470 à Pro704 du vWF est donc généré de façon similaire à l'exemple précédent: les fragments resultant de l'amplification PCR du plasmide pSE avec les oligodéoxynucléotides 5'-CCCG~
G~TCCCl~GGCl~AACC&GTGAAGCCGGC-3' (Sq2149, les sites ~m~II et ~II sont soulignés) et 5'-CCATGG~TCC~GCl~AAGGAGGAGGGGCl~CA-G&GGCAAGGTC-3' (Sq2622, les sites E~m~I et ~III sont soulignés) sont d'abord clonés dans un vecteur de type pUC sous la forme d'un fragment de restriction ~I, et la sequence d'un clone est vérifiée par sequençage. La séquence du fragrrlent MstII-Hir~III ainsi généré corresponds à la sequence correspondante SEQ ID n 1 à l'exception que le codon T~ spécifiant l'arrêt 2s traductionnel est localisé immédia~ement en aval du résidu Pro704 du vWF et que les résidus 471 et 474 sont des résidus glycine et non des résidus cystéine. Le plasmide pYG1310 comporte ce fragment de restriclion ~II-~III précédé du fragment HindIII-~II du plasmide pYG404 (cf. Exemple 4 et Figure 3B).
E.2.1.3. Résidus Leu494-Pro704 du vWF.
La s~quence peptidique présente dans le plasmide pYG1310 possède enco~e les résidus threonine ou séLine aux positions 485, 492, 493 et S00 qui sont naturellement O-glycosylés dans la moléeule native du vWF humain, localisés à
proximité immediate du peptide G10 défini par Mo~i et al. [J. Bio. ::hem~
(1988) 17901-17904~. L'amplification par la technique PCR du plasmide pET8C-FEU~LLE DE REMPLACEMEN.`

Wo 93/15200 pcrlFRs3/oooR7 . 6 0 ~1 'J

proximité immediate du peptide G10 défini par Mori et al. [J. Biol. Chem. 263 (1988) 17901-179043. L'amplification par la technique PCR du plasrnide pET8C-52K par les olig~éoxynucléotides 5'-CCCGGGTACCTTAGG-CTTACTGTATGTGGAGGACATC-3'(Sq3037, les sites ~I et ~II sont 5 soulignés) et 5'-CCATGGATC~AGCTTAAGGAGGAGGGGCTTCAGGGG~-AAGGTC-3'(Sq2622, les sites ~amHI et ~III sont soulignés) génère un fragment incluant les résidus Leu494 à Pro704 du vWF. Les fragments amplifiés sont d'abord coupés par les enzymes ~_I et BamHI pour être clonés dans un vecteur de type pUC coupé par les mêmes enzymes. Un clone particulier est isolé
]O qui corresponds à la séquence attendue vérifiée par séquençage. Ce fragment KpnI-~mHI comporte donc un fragment ~II-~ III incluant les résidus Leu494 à
Pro704 du vWF humain. Le plasmide pYG1373 comporte ce fragment de restriction MstII-HindIII précédé du fragment ~lindIII-M~II du plasmide pYG404 (cf.
Exemple 4 et Figure 3B).
E 2.1.4. Résidus Tyr508-Pro704 du vWF.
La séquence peptidique présente après amplification PCR dans le plasmide pYG1373 poss~de encore le résidu thréonine à la position 500 qui est naturellement O-glycosylé dans la molécule na~ive du vWF humain. L'amplification par la technique PCR du plasmide pET8C-52K par les oligodéoxynucléotides 5'-CCCGG-GTAC~TTA~GCTTATACTGCAGCA&GCTACTGGACCTG-3' (Sq2621, les sites ~BI et ~II sont soulignés) et 5'-CCATG~ATC-CAAGCTTAAGGAGGAGGGGCTTCAGGGGCAAGGTC-3' (Sq2622, les sites BamHI et ~IindIII sont soulignés) génère un fragment incluant les résidus Tyr508 à
Pro704 du vWF Les fragments amplifiés sont d'abord coupes par les en;~ymes ~.nI
2s et BamHI pour être clones dans un vecteur de type pUC coupe par les memes enzymes. Vn clone particulier est isolé qui corresponds à la séquence attendue vérifiée par séquençage. Ce fragment ~nI-~amHI comporte donc un fragment MstII-HindIII incluant les résidus Tyr5Q8 à Pro704 du vWF humain. Le plasmide pYG1309 comporte ce fragment de restriction ~II-~lindIII précédé du fragment HindIII-~l~II du plasmide pY&404 (cf. Exemple 4 et Figure 3B).
E.2.1.5. Résidus Pro502-Pro704 du vWF.
La séquence peptidique correspondant aux rêsidus Pro502 à Pro704 du vWF
hun~ain est générée à partir du plasmide précédent par insertion des oligodéoxynucléotides 5'-lTA&GGTTACCACClTrGCATGACTTCTACTGCA-3' wo ~3/15200 pcr/FRs3/ooox7 2 1 2 6 0 9 ~:~

(Sq27~1) et 5'-GTAGAAGTCATGCAAAGGTGGTAACCC-3' (Sq2752) qui en s'appariant peuvent être clonés entre les sites ~II et ~I du plasmide obtenu après amplification PCR selon l'exemple E.2.1.4., ce qui permet de générer un fragment de restriction ~II-HindIII incluan~ les résidus Pro502 à Pro704 du vWF humain. Le 5 plasmide pYG1350 comporte ce fragment de restriction ~II-HindIII précédé du fragment ~indIII-MstII du plasmide pYG404 (cf. Exemple 4 et Figure 3B).
E.2.2. Résidus Thr470-Asp498 du vWF: peptide du type Pl.
Dans un mode de realisation par~ticulier~ le site de liaison du vWF est un peptide incluant les résidus l~r470 à Asp498 du vWF mature. Cette séquence inclus lo le peptide G10 (Cys474-Pro488) décrit par Mori et al. lJ. Biol. Chem. ,~ (1988) 17901-17904~ et capable d'antagoniser l'interaction du vWF humain à la GPlb des plaquettes humaines. La séquence incluant le peptide G10 est d'abord générée sous la forme d'un fragment de restriction ~II-HindIII, par exemple au moyen de la technique d'amplification PCR, ou encore directement à l'aide 15 d'oligodéoxynucléotides syn~étiques. Par exemple, les produits de l`amplification PCR du plasrnide pET-8c52K avec les oligodéoxynucleotides Sql969 et 5'-CCCG_ GGATC~CAAGCl~AGTCCTCCACATACAG-3' ~Sql970, les sites ~m~I et HindIII sont soulignés) sont d'abord coupés par l'enzyme ~m~I puis clonés dans le site Ba~I d'un vecteur de type pUC. Un clone particulier est isolé qui corresponds 20 à la séquence attendue vérifiée par séquençage. Ce fragment ~amHI comporte donc un fragment ~II-HindIII incluant les résidus Thr470 à Asp498 du vWF humain.
Le plasmide pYG1210 comporte ce fragment de restriction ~ ndIII precédé
du fragment HindIII-~II du plasmide p~G404 (cf. Exemple 4 et Figure 3B~.
E.2.3. Residus Leu694-Pro708 du vWF: peptide du type P2.
2~ Dans un second mode de réalisation~ le site de liaison du vWF à la GPlb est directement conçu à l'aide d'oligodéoxynucleotides synthétiques, et par exemple les oligodéoxynucleotides 5'-TTAGGCCTCTGTGACCl'rGCCCCTG-AAGCCCCTCCTCCTACTCTGCCCCCCTAAGC~A-3' et 5'-GATC-TAAGCTTA&GGGGGCAGAGTAGGAGGAGGGGCTTCAGGGGCAAG&TC-ACAGAGGCC-3`. Ces oligodeoxynucléotides fonnent en s'appariant un fragment de restriction ~II-~lII incluant le fragment MstII-~jn~III correspondant au peptideD5 défini par les résidus Leu694 à Pro708 du vWF [Mori H~ et al., ~. Biol. Chem.263 (1988) 17901^17904]~ Le plasmide pYG1204 comporte ce fragment de 2o2l26or.~

restriction ~lI-Hindlll précédé du fragm~nt }-lindIII-~ll du plasmide p~'Ci4( (cf. Exemple 4 et Figure 3B).

E.2.~. Peptide du ~pe Pl -XD-P2.
Des variants utiles du plasmide pET-8c52K sont delé~és par mulacénèse dirigée entre les peptides G10 et D5, par exemple des sites de fL~;ation au collagène, et/ou à l'héparine, et/ou à la botrocétine, et/ou aux sulfatides etlou à la ristocéline.
Un exemple est le plasmide pMMB9 délété par mutagénèse dirigée entre les résidusCys~09 et Ile662. L'amplification PCR de ce plasmide avec les oli~odéox~nucléolides Sql969 et Sq2029 génère un fragment de restriction ~II-HindIII incluant les residus rnr470 à Tyr508 et Arg663 à Val713 et en particulier les peptides G10 et D~ du vWF et délété en particulier de son site de fixation au collagène localisé entre les résidus Glu542 et Met622 [Roth GJ. et al. Biochemistry 2~ (19~6) 83~/-8361]. Le plasmide pYG1217 comporte ce fragment de restriction MStII-~LIII précédé du fragment ~III-~II du plasmide pYG404 (cf.
ExempIe 4 et Fi_ure 3B). Dans d'autres modes de réalisation~ l`utilisation des techniques combinées de mutacénèse dirigé~e et d'amplification PCR permet de générer à volonté des variants du fragment de restriction ~II-HindIII de la SEQ ID
n 1-mais délétés d'un ou plusieurs sites de fixation aux sulfatides ettou à la botrocétine et/ou à l'hépanne et/ou au ~ollagène~
E.~.5. Peptide du h~ pe Pl-X~-P2.
E.2.5.1. Altération conformationnelle par substitution des résidus cystéine.
Les produils de l'amplification PCR des plasmides p~E et p7E a-~ec les olioodéoxynucléotides Sq2149 (~'-CCCG~GATC~ lTAGGCl-rAACCGGTG-AAGCCGGC-3', les sites ~I et ~II sont soulignés) et Sq2029 sont d'abord clones dans un ~lecleur de ~rpe pUC sous la forme d'un fragment de restriction 2~ BamHI, et la séquence d'un clone est vérifiée par séquença~e. La séquence du fragment ~II-HindIII ainsi _énéré corresponds à la séquence correspondante SEQ
ID n 1 à l`exception que les résidus 471 et 474 du ~WF sont des résidus gl~cine et non des résidus cystéine. Le plasmide pYG1271 comporte ce fra8ment de restriction ~ in~III précedé du fraoment ~ HI-~stII du plasmide pYG401 ~cf.
Exemple 4 et Figure 3B). Le plasmide pYG1269 est généré de façon similaire à
l'exception que le plasmide p7E est utilisé comme matrice lors de l'amplification PCR par les oli odéoxynucléotides Sq2149 et Sq2029.
E.2.5.2. Altération conformationnelle par introduction de mutations du type IIB

~EU~LE~ DE REMPLACEM~

WO 93/15200 21 2 ~ PCl`~FR93/00087 de façon similaire à l'exception que le plasmide p7E est utilisé comme matrice lors de l'amplification PCR par les oligodeoxynucléotides Sq2149 et Sq2029.
E.2.5.2. Altération conformationnelle par introduction de mutations du type IIB
D'autres mutations particulièrement utiles concernent au moins un résidu impliqué dans des pathologies de type IIB associées au vWF (aug;mentation de l`affinité intrinsèque du vWF pour la GPlb), comme les résidus Arg543, Arg545, Trp550, Val551, Val553, ProS74 ou Arg578 par exemple. Les techniques de recombinaison génétique m vitro permettent également d'introduire à volonté un ou o des résidus supplémentaires dans la séquence du vW~ et par exemple une méthionine surnuméraire entre les positions Asp539 et ~lu542. Dans une exemplification particulière, les mutations Arg543->Trp543 (R543W) et Pro574 >Leu574 (P574L) sont introduites par mutagènèse dirigée à l`aide des oligodéoxynucléotides 5'-GTGCTGAAGGCCTTTGTGGTCGACATGATGGA-15 G I~CTGCGGATATCCCAGAAGTGGGTAGCGGTGGCCGTGGTGGA-GTACC-3' (Sq2851; le codon specifiant le residu Arg543 est souligné) et 5'-GGGCTCAAGGACCGGAAGCGCl~`AAGCGAGCTGCGGCGCAl~GCC-AGCCAG-3' (Sq2855; le codon spécifiant le résidu LeuS74 est souligné), respectivement. Après vérification de la séquence nucléotidique, on génère ainsi des 20 fragments de restriction ~II-HindIII incluant les mutants de type IIB du vWF
humain R543W et P574L. I es plasmides pYG1359 (R543W) et pYG1360 (P574L) comportent ces fragments de restriction ~IX~ III précédés du fragment ~III-~II du plasmide pYG404 (cf. Exemple 4 et Fig~re 3B). La mutagènèse à
l'aide de l'oligodéoxynucléotide Sq2851 introduit également les sites ~I, ~QBv et 25 ~1 aux positions Val538, Ile546 et Val551, respec~ivement. Ces sites de restriction ne sont pas présents dans la séquence cor~espondante naturelle du vWF
humain et sont donc particulièrement utiles pour introduire facilement toute mutation désirable entre les résidus Val538 et Val551. A titre d`exemple, les oligodéoxynucléotides 5'-ATCCCAGAAGT~GTA-3' (Sq3017, le codon spécifiant 30 le mutant de type IIB Cys550 est souligné) et 5'-CGCGTACGCACTTCTGGGAT-3`
ISq3018) forment en s'appariant un fragment de restriction ~QBV~ aI qui peut être cloné dans le plasmide pYG1359 coupé par les enzymes E~Q~V et ~1, ce qui génère le plasmide pYG1374 comportant les mutations R543W et W550C ~Figure 3B). De la même façon, les oligodéoxynucléoddes 5`-WO 93/15200 PCI`/FR93/000~7 TCGACATGATGGAGÇ~GCTGCGGAT-3' (Sq3019, le codon spécifiant le résidu Arg543 provenant de la séquence naturelle est souligné) et 5'-ATCCGCAGCCGCTCCATCATG-3' (Sq3020) forment en s`appariant un fragment de restriction ~I-EcoRV qui peut être cloné dans le plasmide pYG1374 coupé par s les enzyrnes ~I et ~QBv~ ce qui génère le plasmide pY&1386 qui ne comporte que la mutation W550C lFigure 3B).
EXEMPLE 3: CONSTRUCTION D'UN FRAGMENT DE RESI`RICTION
~II/~INDIII INCLUANT UN SITE DE LIAISON DU vWF AU SOU~
ENDOTHELIUM

Dans un mode de réalisation particulier, les sites de liaison du vWF aux composants du tissu sous-endothélial et du collagène en particulier, sont générés par amplication PCR du plasmide pET-8c52K. Par exemple l'utilisation des oligodéoxynucléotides Sq2258 (5'-GGAT~GCTG-TGCAGCAGGCTACTGGACCTGGTC-3', le site ~II est souligné) et Sq2259 (5'-GAAl7rCAAGCl~AACAGAGGTAGCTAACGATCTCGTCCC-3', le site ~III
est souligné) permet de générer le plasmide pYG1254 dont le fragment de restriction ~II-,~indIII inclus les résidus Cys509 à Cys695 du vWF naturel (peptide de type X). La ligature de ce fragment de restriction avec le fragment de restriction ~III-~II du plasmide pYG404 (cf. Exemple 4) génère le fragment de restriction HindIII du plasmide pYG1276 (Figure 3B).
Des variants moléculaires des types XD (cf. E.2.4.) ou X* (cf. E.2.5.
peuvent également être générés selon la même stratégie et qui comportent toute combinaison souhaitable entre les sites de,fL~cation du vW~ aux sulfatides et/ou à la botrocétine et/ou à l'héparine et/ou au collagène et/ou tout résidu responsable d'une ~5 modification de l'affinité du vWF pour la GPlb (pathologies de type II associee au vWF). Dans Im autre mode de realisation, le domaine capable de se fixer au collagène peut également provenir du fragment du vWF compris entre les residus 911 et 1114 et décrit par Pareti et al. [J. Biol. Chem. (1987) ~ 13835-13841].
EXEMPLE 4: COUPLAGE EN C-TERMINAL DE LA SAH

Le plasmide pYG404 est decrit dans la demande de brevet EP 361 99L Ce plasmide comporte un fragment de restriction ~ III codant pour le gène de la prépro-SAH précédé des 21 nucléotides naturellement présents immédiatement en WO 93/lS200 pcr/FRs3/ooo~7 2~ r~

amont de l`ATG initiateur de traduction du gène pGK de S. cerevisiae. Ce fragment comporte un fragment de restriction ~ correspondant à la totalité du gène codant pour la SAH à l'exception des trois acides arninés les plus C-terminaux (résidus leucine-glycine-leucine). La ligat~lre de ce fragment avec l'un quelconque 5 des fragments k~II-~in51III décrits dans les exemples 2 ou 3 perrnet de générer des fragments de restriction ~ III incluant des gènes composites codant pour des protéines chimères dans lesquelles un fragment du vWF doué de propriétés particulières est positionné en phase traductionnelle de lecture en C-terminal de la molécule de SAH. De tels gènes composites sont exemplifiés dans le Tableau de la10 Figure 3B.
EXEMPLE 5: COUPLAGE EN N-TERMINAL DE LA SAH
Dans un mode réalisation particulier, les techniques combinées de mutagénèse dirigée et d'amplification PCR permettent de constn~ire des gènes hybrides codant pour une protéine chimère résultant du couplage traductionnel entre 15 un pe~tide signal (et par exemple la r~gion prépro de la SAH), une séquence incluant un fragment du vWF doué de propriétés d'adhésivité et la forme mature de la SAH
~; ou un de ses variants moléculaires. Ces gènes hybrides sont préférentiellement bordés en 5' de l'ATG initiateur de traduction et en 3' du codon de fin de traduction par des sites de restriction ~in51III ce qui permet de génére: des plasmides 20 d'expression de ces proteines chimères, par exemple selon la strategie détaillée dans l'exemple suivant.
EXEMPLE 6: PLASMIDES D'EXPRESSION
Les protéines chimères des exemples précédents peuvent être exprimées dans les le~ures à partir de promoteurs foncdonnels, régulables ou cQnstitutifs, tels que, 2s par exemple, ceux présents dans les plasrnides pYG105 (promoteur LAC4 de Kluweromvces ~IO. pYG106 (promoteur ~ de Sacchar~mvces çerevisiae), pYG536 (promoteur ~IQ5 de ~jsj~, ou des promoteur hybrides tels que ceux décrits dsns la demande de brevet EP 361 991~ Les plasmides pYG105 et pYG106 sont ici particulièrement utiles car ils permettent l'expression des gènes 30 codés par les fragrnents de restriction ~lin~lII des exemples E~4. et E.5. à partir de promoteurs foncdonnels chez JC lactis, régulables ~pYG105) ou consdtutdfs (pYGl06). Le plasmide pYGl05 axres~nds au plasmide plCan707 deit dans la WO 93/15200 PCI`/FR93/00087 ~6~i3~ 24 demande de brevet EP 361 991 dans lequel le site de restriction ~n~III unique etlocalisé dans le gène de résistance à la généticine (G418) a été détruit par mutagénèse dirigée tout en conservant une protéine inchangée (oligodeoxynucleotide S'-GAAATGCATAAGCTCTTGCCATTCTCACCG-3'). Le fragment ~
S codant pour le gène ~3 du plasmide muté a été ensuite remplacé par un fragment de resOriction ~I-~l comportant une cassette d'expression constituée du promoteur h~4 de }C. lactis (sous la forme d'un fragment ~I-~j~III) et du terminateur du gene ~, de S. cerevisiae (sous la forme d'un fragment ~III-~I). Le plasmide pYG105 est mitotiquement très stable chez les levures 10 }~llaYveromvces et une carte de restriction en est donnée à la Figure 3. Les plasmides pYG105 et pYG106 ne diffèrent entre eux que par la nature du promoteur de transcription encodé par le fragment ~I-~j~III. A titre d'exemple, le clonage, "dans l'orientation productive" (définie comme l'orientation qui place la région"prépro" de l'albumine de façon proximale par rapport au promoteur de 15 transcription), des fragments de restriction ~lindIII des plasmides pYG1220, pYG1310, pYG1373, pYG1309, pYG1350, pYG1210, pYG1204, pYG1217, pYG1269,pYG1271,pYG1359,pYG1360,pYG1374,pYG1386 et pYG1276, dans le site ~III du plasmide pYG105 génère respectivement les plasmides d'expression pYG1~8, pYG1313, pYG1375, pYG1311, pYG1355, pYG1214, : 20 pYG1206, pYG1223, pYG1279, pYG1283, pYG1361, pYG1365, pYG1377, pYG1389 et pYG1277.
EXEMPLE7: TRANSFORMATION DESLEVURES

La transformation des levures appa~tenant au genre Kluwe~omyces, et en particulier les souches MW98-8C et CBS`293.91 de }~i~, s'effectue par exemple 2s par la technique de traitement des cellules entières par de l'acétate de lithium [Ito H~
et al., J. BacteAol. 153 (1983) 163-168], adaptee comme suit. La croissance des cellules se fait à 28C dans 50 ml de milieu YPD, avec agitation et jusqu'à une densité optique à 600 nm (D06~0) comprise entre 0,6 et 0,8; les cellules sont récoltées par centAfugation à faible vitesse, lavées dans une solution stérile de TE
(10 mM Tds HCl pH 7,4; 1 mM EDTA), resusp~dues dans 3 4 ml d'acétate lithium (0,1 M dans du TE) pour obtenir une densité cellulaire d'environ 2 x 108 cellules/ml, puis incubées à 30C pendant 1 heure sous agitation modérée. Des aliquotes de 0,1 ml de la suspension résultante de cellules compétentes sont incubés W O 93/15200 2 ~ , PC~r/FR93/00087 à 30C pendsnt 1 heure en présence d'ADN et à une concentration finale de 35 % de polyéthylène glycol (PEG4000, Sigma). Après un choc thermique de 5 minutes à
42C, les cellules sont lavées 2 fois, resuspendues dans 0,2 ml d'eau stérile etincubées 16 heures à 2$C dans 2 ml de milieu YPD pour perrnettre l'expression s phénotypique du gène de résistance au G418 exprimé sous contrôle du promoteur Pkl (cf. EP 361 991); 200 ~1 de la suspension cellulaire sont ensuite étalés surboites YPD sélectives (G418, 200 ~lg/ml). Les boites sont mises à incuber à 28C et les transformants apparaissent après 2 à 3 jours de croissance cellulaire.
EXEMPLE 8: SECRETION DES CHIMERES
lo Après sélection sur milieu riche supplementé en G418 les clones recombinants sont testés pour leur capacité à sécréter les protéines chimères entre SAH et vWF. Quelques clones correspondant à la souche CBS 293.91 transformée, par exemple, avec les plasmides pYG1214 (SAH-P1), pYG1206 (SAH-P2), pYG1223 (SAH-P1-XD-P2) et pYG1248 (SAH-Pl-X-P2) ou pKan707 (vecteur 15 témoin) sont mis à incuber en milieu YPD ou YPL à 28~C. Les surnageants cellulaires sont récupérés psr centrifugation qusnd les cellules atteignent la phase stationnaire de croissance, éventuellement concentrés 10 fois par précipitation pendsnt 30 minutes à -20C dans une concentration finale de 60 ~o d'éthanol, puis testés sprès électrophorèse en gel SDS-PAGE à 8.5 ~, soit directement par 20 soloration du gel par du bleu de coomassie, soit après immunoblot en utilisant comme anticorps primaires des anticorps de sollris dirigés contre le vWF ou un sérum polyclonal de lapin dirigé contre la SAH. l,ors des expériences de détection immunologique, le filtre de nitrocellulose est d'abord incubé en présence des anticorps prima~res specifiques, lavé plusieurs fois, incubé en présence d'anticorps 25 de chèvre anti-souris ~immunoblot anti-vWF) ou anti-lapin (immunoblot anti-SAH), puis incubé en présence d'un complexe avidine-péroxydase en utilisant le "kit ABC"
distribué par Vectastain (Biosys S.A., Compiègne, France). La réaction immunologique est ensuite révélée par addition de diamino-3,3' benzidine tetrachlorydrate (Prolabo) en présence d'eau oxygénée, selon les recommandations30 du fabricant. Les résultats des Figures 4 à 8 démontrent que la levure K. lactis est capable de sécrêter des protéines chimères entre la SAH et un fragrnent du vWF, et que ces chimères sont reconnues par des anticorps spécifiques de la SAH ou du vWF.

2 1 2 6 ~ !

Les chimères présentes dans les surnageants de cult~re correspondant à la souche CBS 293.91 transformëe, par exemple par les plasmides d'expression selon l'exemple 6, sont caractérisées dans un premier ternps à l'aide d'anticorps spécifiques de la partie SAH et de la partie vWF. Les résultats des Figures 4 à 8 démontrent que 5 la le~ure K. Iactis est capable de sécréter des protéines chimères entre la SAH et un fragment du vWF, et que ces chimères sont immunologiquement réactives. Il peut etre également souhaitable de purifier certaines de ces chimères. La culture est alors centrifugée (10000 g, 30 min), le surnageant est passé à travers un filtre de 0,22 mm (Millipore), puis concentré par ultrafiltration (Amicon) en utilisant une membrane 10 dont le seuil de discrimination se situe à 30 kDa. L~ concentrat obte~u est alors dialysé contre une solution de Tris HCl (50 mM pH 8) puis purifié sur colonne. Par exemple, le concentrat correspondant au surnageant de culture de la souche CBS
293.91` transformée par le plasmide pYG1206 est purifiée par chromatographie d'affinité sur Bleu-Trisacryl (IBF). Une purification par chromatographie d'échange 1~ d'ions pe~t également être utilis~e. Par exemple dans le cas de la chimère SAH-vWF470-713, le concentrat obtenu après ultrafiltration est dialysé contre une solution de Tns HCl (50 mM pH 8), puis déposé par fractions de 20 ml sur une - colonne (5 ml~ échangeuse de cations (S Fast Flow, Pharmacia) équilibrée dans le même tampon. La colonne est alors lavée plusieurs fois par la solution de Tris HCl 20 (50 mM pH 8) et la protéine chimère est alors éluée de la colonne par un ~adient (0 à 1 M~ de NaCl. Les fractions contenant la protéine chimère sont alors réunies et dialysées contre une solution de Tris HCl 50 mM (pH 8) puis redéposées sur colonne S Fast Flow. Après élution de la colonne, les fractions contenant la protéine sont réunies, dialysées contre de l'eau et lyophilisées avant caractérisation: par exemple, 2~ le séquençage (Applied Biosystem3 de la protéine ~SAH-vWF470-704 C471G, C474G] sécrétée par la levure CBS 293.91 donne la sequence N-terminale a~tendue de la SAH (Asp-Ala-His...), démontrant une maturation correcte de la chimère immédiatement en C-terminal du doublet ~'e ~é~:dus Arg-Arg de la region "pro" de la SAH (SEQ ID n 1). Le caractère essentiellement monomérique des protéines 30 chimères entre SAH et vWF est également confinné par leur profil d'elution sur colonne TSK 3000 [Toyo Soda Company, équilibrée par une solution de cacodylate (pH 7~ contenant 0,2 M de Na2so4]: par exemple la chimère [SAH-vWF 470-704 C471G, C474G] se comporte dans ces conditions comme une pro~éine de poids moléculaire apparent de 9~ kDa démontrant son caractère monomérique.

FEUILLE DE REMPLACEM~

WO 93/15200 P~/FR93/00087 2l26~ 2 C474G] se comporte dans ces conditions comme une protéine de poids moléculaire apparent de 95 kDa démontrant son caractère monomérique.
EXEMPLE l0: ACTIVITE ANTAGONISTE l)ES HYBRIDES GENETIQUES
ENTRE SAH ET VWF POUR L'AGGLUTINATION Pl.AQUErrAIRE
L'activité antagoniste des produits est déterminée par mesure de l'inhibition dose-dépendante de l'agglutination des plaquettes humaines fixées au paraformaldéhyde selon la méthode décrite par Prior et al. [Bio~rechnology ~1992) 10: 66]. Les mesures se font dans un agrégamètre (PAP-4, Bio Data, HoFsham, PA, USA) qui enregistre les variations au cours du temps de la transmission optique sous agitation à 37C en presence de vWF, de botrocétine (8,2 mg/ml) et du produit à
tester à différentes dilutions (concentrations). Pour chaque mesure, 400 ml (8x107 plaquettes) d`une suspension de plaquettes humaines stabilisées au paraformaldéhyde ~0,5 ~%, puis resuspendues en INaCl (137 mM); MgCI2 (1 mM); NaH2PO4 (0,36 mM); NaHCO3 (10 mM); KCI (2,7 mM); glucose (5,6 mM); SAH (3,5 mg/ml);
tampon HEPES (10 mM, pH 7,35)] sont préincubés à 3'7~C dans la cuve cylindrique (8,75 x 50 mm, Wellcome Distriwell, 159 rue Nationale, Paris) de l'agrégamètre pendant 4 min puis sont additionnés de 30 ml de la solution du produit à tester à
différentes dilutions dans ~u véhicule de formulation apyrogène Imannitol (50 g/l);
acide citrique (192 mg/l); ~lysine monochlorhydratée (182,6 mg/l); NaCI
(88mg~1); pH ajusté à 3,5 par ad,dition de NaOH (lM)], ou de véhicule de formulation uniquement (essai contrôle). ~a suspension résultante est alors incubée pendant 1 min à 37~C et on ajoute 12,5 ml de vWF humain [American Bioproducts, Parsippany, NJ, USA ; 11 % d'activitè ~on Willebrand mesurée selon les recommandations d'utilisation du PAP~ (Platelet Aggregation ProfilerR) à l'aide de plaque~es fixées au formaldéhyde (2x105 plaquettes/ml), de plasma humain contenant de 0 à 100 % de vWF et de ristocétine (10 mg/ml, cf. p. 36 45: YW
Program~M~] que l'on incube à 37C pendant 1 min avant d'ajouter 12,5 ml de la solution de botr~cétine [purifiée à partir de venin lyophilise de B~throps jararaca (Sigma~, selon le protocole décrit pa,r Sugimoto et al., Bi~hemi~ 1991) ~:
18172]. L'enregistrement de la lecture de la transmission en fonction du temps est alors réalisee pendant 2 min sous agitation à l'aide d`un barreau aimanté (Wellcome Distriwell) placé dans la cuve et sous une agitation magnétique de 1100 trlmin assurée par ragrégamètre. La variadon moyenne de la transmission optique (n35 ~, wo 93/15200 PC~/FR93/OOOX7 c?,~'1.,b~'~` 28 pour chaque dilution) au cours du temps est donc une mesure de l'agglutination plaquettaire due à la présence de vWF et de botrocétine, en l'absence ou en présence de concentrations variables du produit à tester. A partir de tels enregistrements, on déterrnine alors le % d'inhibition de l'agglutination plaquettaire due à chaque 5 concentration de produit et on trace la droite donnant le % d'inhibition en fonction de l'inverse de la dilution de produit en échelle log-log. La CI50 (ou concentration de produit provoquant 50 ~o d'inh;bition de l'agglutination) est alors déterminée sur cette droite. Le Tableau de la Figure 9 compare les CI50 de quelques unes des chimères SAH-vWF de la présente invention et démontre que certaines d'entre elles lû sont de meilleurs antagonistes de l'agglutination plaquettaire que le produitRG12986 décrit par Prior et al. lBiolTechnology (1992) .lQ: 66] et inclus dans les essais à titre de valeur étalon. Des tests identiques de l'inhibition de l'agglutination de plaquettes humaines en présence de vWF de plasma de porc (Sigma) permet en plus dè démontrer que certains des hybrides de la présente invention, et notamment 15 certains variants de type IIB, sont de très bons antagonistes de l'agglutination plaquettaire en l'absence de co-facteurs de type botrocétine. L'antagonisme botrocétine-indépendant de ces chimères par~iculières peut également être démontré
selon le protocole initialement décrit par Ware et al. lProc. Natl. Acad. Sci. (1991) 8~: 2946] par déplacement de l`anticorps monoclonal 125I-LJ-IB1 (10 mg/ml), un 20 inhibiteur competitif de la fixation du vWF sur la GPIb plaquettaire lHanda M. et al., (1986) J. Biol. Chem. ~1: 12579~ après 30 min d'incubation à 22C en présence de plaquettes fraiches (108 plaquettes/ml).

LISTE DE S~QU~NCES

(1) INFORMATION GENERALE:
(l) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
IB) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: NOUVEAUX POLYPEPTIDES ANTITHROMBOTIQUES, LEUR PREPARATION ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LES CONTENANT.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 - (iv) FORME LISIBLE PAR OR~INATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i~ CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 2591 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire . (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 26..2587 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
_ (A) NOM/CI,E: misc. feature (B) EMPLACEMENT: 1842 .1848 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS : nom standard : "Site MstII"
(ix) CAR~CTERISTIQUE ADDIT`IONELLE:
(A) NOM/CLE: misc. feature (B) EMPLACEMENT: 196~.,1974 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS : no~ standard : "Site Pst I"

5~ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
AAGCTTTACA ACAAATATAA AAACA ATG AAG TGG ~TA ACC TTT ATT TCC CTT 52 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu FEU~LLE I~E REMPLACEMENT

_.

Leu Phe Leu Pha Ser S~r Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp GCA CAC AAG AG~ GAG GTT GC~ CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA GAA GAA 148 Ala Hls Lys Ser Glu Val Ala His Arq Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe li ' Ala Lys Thr Cys Val`Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser . 75 80 85 Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu : 110 115 120 Arg Asn Glu Cys Phe Teu Gln His Lys Asp Asp Asn Pr~ Asn Leu Pro 125 130 135 :
CGA TTG GTG AG~ CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT CAT GAC 484 Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Lèu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA AGG TAT 580His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr 4; Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys ~ 190 . 195 200 Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Sar Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg -GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTA GCT CGC CTG AGC CAG AGA m ccc AAA 772 Ala Phe ~ys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Pha Pro Lys GCT GAG m GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC AAA GTC 820 Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Lau Thr Lys Val FEUILLE D REMPLACEM~N~

2~. 2~.3 CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CT. GAA TGT GCT GAT GAC AGG 868 ~is Th~ G1u Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg 350 35; 360 2~ :

His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr GAA ACC ACT CTA GAG AAC~ TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT GAA TGC 1204 Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA CC~ CTT GTG GAA GAG CCT CAG 1252 Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln : 3g5 400 405 AAT TTA ATC AAA CAA AAT TGT GAG CTT TT~ GAG CAG CTT GGA GAG TAC 1300 Asn Leu Il~ Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gl~ Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln 430 43; 440 GTG TCA ACT CCA ACT CTT ~TA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA AAA GTG 1396 Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg As~ Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala 460 465 4?~

5~ Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACC AAA~TGC TGC ACA G.~P T~^ TTG 1540 Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser _au 60 490 4g5 500 505 GTG AAC AGG CGA CCA $GC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA ACA TAC 1588 FEUILLE DE REMPLACME~l~

21 26~g2 V~l Asn Ars Ars Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr ~10 . 515 520 Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu ~ys Cys Cys Lyæ Ala GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT GTT GCT 1828Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala . 590 595 600 Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro 605 610 . 615 GGA GGC CTG GTG GTG CCT CCC ACA GAT GCC CCG GTG AGC CCC ACC ACT 1924 ::
Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr 620 . 625 630 Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys

3~

Ser Arq Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu TCC GAG GCT GAG TTT GAA GTG CTG AAG GCC TTT GTG GTG GAC ATG ATG 2068Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met ~70 675 680 Glu Arg ~eu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arq Lys Arg Pro Ser Glu Leu A_g Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys~Tyr T~r Leu Phe Gln lle TTC AGC AAG ATC GAC CGC CCT GAA GCC TCC CGC ATC GCC CTG CTC CTG 2308Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu FEUILLE DE REl'lPLA~:EME~;T

-' 21260~q..'~

ATG GCC AGC CAG GAG CCC C~A CGG ATG TCC CGG AAC TTT GTC CGC TAC 23 ~ i Met Ala Ser Gln Glu ~ o 51n Arg Met Ser Arg Asn Phq Val Arg Tvr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln 81 0 ` 815 820 825 . CAA AGG GAC GAG ATC GTT AGC TAC CTC TGT GAC CTT GCC CCT GAA GCC 25~8 Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val 2~

FEUILLE DE REMPLACEME~

Claims (22)

REVENDICATIONS

1. Polypeptide recombinant composé d'une partie adhésive dérivée de la structure du vWF capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF
aux plaquettes et/ou au sous-endothélium, et d'une partie constituée d'un polypeptide possédant une demi-vie plasmatique élevée permettant sa stabilisation et sa présentation in vivo.

2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisée en ce que la partie adhésive est constituée par tout ou partie de la séquence peptidique comprise entre les résidus 445 et 733 du vWF ou d'un variant de celle-ci.

3. Polypeptide selon la revendication 2 caractérisé en ce que la partie adhésive présente une structure choisie parmi:
(a) la séquence peptidique comprise entre les résidus 445-733 du vWF, ou, (b) une partie de la séquence peptidique (a) capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sous-endothélium, ou, (c) une structure dérivée des structures (a) ou (b) par modifications structurales (mutation, substitution addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus) et capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sous-endothélium, ou, (d) une séquence peptidique non naturelle, par exemple isolée à parti? de banques peptidiques aléatoires, et capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sous-endothélium.

4. Polypeptide selon la revendication 3 caractérisé en ce que la partie adhésive est constituée par une séquence choisie parmi les peptides de type P1, P2, X, XD et X* ou par toute combinaison de ces peptides entre-eux.

5. Polypeptide selon la revendication 4 caractérisé en ce que la combinaison des peptides est choisie parmi les peptides de type P1-P2, P1-X, P1-XD, P1-X*, X-P2, XD-P2, X*-P2, P1-X-P2, P1-XD-P2 et P1-X*-P2.

6. Polypeptide selon la revendication 4 caractérisé en ce que la partie adhésive est constituée par tout peptide d'un type défini dans les revendications 4 et 5 représenté plus d'un fois.

7. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la partie adhésive est couplée à l'extrémité N-terminale de la structure stabilisatrice.

8. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la partie adhésive est couplée à l'extrémité C-terminale de la structure stabilisatrice.

9. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que la polypeptide possédant une demi-vie plasmatique élevée est une protéine telle qu'une albumine, une apolipoprotéine, une immunoglobuline ou encore une transferine.

10. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que le polypeptide possédant une demi-vie plasmatique élevée est dérivé par modification(s) structurale(s) (mutation, substitution addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus, modification chimique) d'une protéine selon la revendication 10.

11. Polypeptide selon l'une des revendication 1 à 10 caractérisé en ce que la structure stabilisatrice est un polypeptide faiblement ou non-immunogénique pour l'organisme dans lequel il est utilisé.

12. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que la structure stabilisatrice est une albumine ou un variant de l'albumine.

13. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.

14. Séquence nucléotidique selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence "leader" permettant la sécrétion du polypeptide exprimé.

15. Cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 13 ou 14 sous le contrôle d'une région d'initiation de la transcription et éventuellement d'une région de terminaison de la transcription.

16. Plasmide autoréplicatif comportant une cassette d'expression selon la revendication 15.

17. Cellule recombinante eucaryote ou procarycte dans laquelle a été inséré
une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 13 ou 14 ou ou une cassette d'expression selon la revendication 15 ou un plasmide selon la revendication 16.

18. Cellule recombinante selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une levure, d'une cellule animale, d'un champignon ou d'une bactérie.

19. Cellule recombinante selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une levure.

20. Cellule recombinante selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une levure du genre Saccharomyces ou Kluvvemmyces.

21. Procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinante selon l'une des revendications 17 à 20 dans des conditions d'expression, et on récupère le polypeptide produit.

22. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.