JP2000503856A

JP2000503856A - Ｂｐｉ融合タンパク質及びｂｐｉ由来ペプチドの微生物での組換え製造のための方法

Info

Publication number: JP2000503856A
Application number: JP9533802A
Authority: JP
Inventors: ベター，マーク，ディー．
Original assignee: ゾーマコーポレイション
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 2000-04-04
Also published as: EP0904370A1; AU732475B2; WO1997035009A1; US6274344B1; AU2429797A; US5851802A; CA2249180A1; CA2249180C

Abstract

(57)【要約】本発明は、殺菌／浸透性増強タンパク質（BPI）のドメインＩ（アミノ酸第17〜45位）、ドメインII（アミノ酸第65〜99位）及びドメインIII（アミノ酸第142〜169位）に由来する、またはそれらに基づく融合タンパク質及びぺプチドの、微生物での組換え製造のための方法及び物質に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 BPI融合タンパク質及びBPI由来ペプチドの微生物での組換え製造のための方法発明の背景本発明は一般に、殺菌／浸透性増強タンパク質（BPI）のドメインＩ（アミノ酸第17〜45位）、ドメインII（アミノ酸第65〜99位）及びドメインIII（アミノ酸第142〜169位）に由来する、またはそれらに基づく融合タンパク質及びペプチドの、微生物での組換え製造のための方法に関する。 BPIは、微生物による侵入に対する防御に必須の血液細胞である、哺乳動物の多形核白血球（PMNまたは好中球）の顆粒から単離されたタンパク質である。ヒトBPIタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー［Elsbachら、J.Bjol.Chem. 、254巻、11000頁(1979)］または大腸菌アフィニティークロマトグラフィー［We issら、Blood、 69巻、652頁(1987)］のいずれかと、酸抽出とを併用して、PMN から単離されている。このようにして得られたBPIを本明細書中、天然型BPIと称するが、これは、広範なグラム陰性細菌に対する強力な殺菌活性を有することが示されている。ヒトBPIの分子量はおよそ55,000ダルトン（55 kD）である。ヒト BPIタンパク質全体のアミノ酸配列、及び当該タンパク質をコードするDNAの核酸配列は、Glayら、J.Bjol.Chem.、264巻、9505頁(1989)の図１に報告されており、かかる文献を引用することにより、それら配列を本明細書に含むものとする。 GrayらのDNA及びアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号：264及び265に示される。 BPIは、強い陽イオン性を有するタンパク質である。BPIのＮ末端半分は、高い実効電荷の原因となり、一方、分子のＣ末端半分は、-3の実効電荷を有する。［Elsbach及びWeiss(1981)、前出］。約25 kDの分子量を有するB PIのタンパク質分解によるＮ末端断片は、疎水性領域と親水性領域とを交互に含み、両親媒性の特徴を有する。ヒトBPIのこのＮ末端断片は、天然に由来する55 kDのヒトBPIホロタンパク質の抗細菌効果を保有している。［Ooiら、J.Bjol.Che m.、262巻、14891〜14894頁(1987)］。Ｎ末端部分と対照的に、単離されたヒトB PIタンパク質のＣ末端領域は、グラム陰性生物に対してほんのわずかに検出可能な抗細菌活性を呈するに過ぎない。［0oiら、J.Exp.Med.、174巻、649頁(1991) ］。「rBPI₂₃」と称される、およそ23 kDのＮ末端BPI断片が、組換え法により製造されており、これもグラム陰性生物に対して抗細菌活性を保持するものである（Gazzano-Santoroら、Infect.Immun.、60巻、4754〜4761頁(1992)）。その出版物では、発現ベクターが、組換え発現産物（rBPI₂₃）をコードするDNAの供給源として使用されていた。ベクターは、Grayら、前出の配列番号：264及び265に示されるごとく、31残基のシグナル配列及び成熟ヒトBPIのＮ-末端の最初の199アミノ酸をコードするように構築された（第151位のバリンがＧＴＣでなくＧＴＧで特定され、第185位の残基がリジン（ＡＡＧで特定される）でなくグルタミン酸（ＧＡＧで特定される）であるという例外を含む）。Grayら、前出における、配列番号：264及び265で示される配列を有する組換えホロタンパク質（rBPIとも称される）も製造されている（rBPI₂₃について注解した例外を含む）。共有であり係属中の、米国特許第5,420,019号（引用することによりそれらの開示が本明細書に含まれるものである）には、rBPI₂₁またはrBPI₂₁Δcysと命名されているＮ末端断片類似体が記載されている。この類似体は、配列番号：264及び265に示されるBPIホロタンパク質の最初の193アミノ酸を含んでいるが、残基第132位のシステインがアラニンに置換されており、そしてrBPI₂₃について注解した例外を含んでいる。 BPIの殺菌効果は、例えばElsbach及びWeiss、Inflammation:Basic Princip1es and Clinjcal Correlates、 Gallinら編、30章、Raven Press，Ltd.(1992)におけるごとく、グラム陰性の種に特異性が高いとの報告がなされている。BPIは、酵母を包含する他の微生物や、さらに高等な真核細胞に対して、通常非毒性であると考えられている。Elsbach及びWeiss、(1992)、前出は、10^-8から10^-8Ｍ程度の低濃度で、BPIが広範囲のグラム陰性細菌に対して抗細菌活性を呈するものの、それより100から1,000倍高い濃度のBPIが、同時に調べたグラム陽性細菌種、酵母、及びさらに高等な真核細胞のすべてに対して、非毒性であったことを報告している。グラム陽性生物である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus、４つの株）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・ファエカリス（Streptococcus faecalis）、バシラス、サブチリス（Bacjii us subtilis）、ミクロコッカス・リソデイクチカス（Micrococcus lysodeiktic us）、及びリステリア・モノサイトゲンス（Listerja monocytogenes）に対して、pH7.0または5.5のいずれかで調べた場合、10^-6Ｍまたは160μg/mlの濃度で、B PIは毒性効果を有しないことも報告された。報告によれば、pH 7.0または5.5において、BPIは10^-6Ｍにて、真菌であるカンジダ・アルビカンス（Candida albic ans）及びカンジダ・パラシロシス（Candida parasilosis）に対する毒性効果を有さず、ヒト、ウサギ及びヒツジ赤血球細胞ならびに種々のヒト腫瘍細胞系に対して非毒性であった。やはりElsbach及びWeissの、Advancesin Inflammation Re search） G．Weissmann編、２巻、 95〜 113頁、Raven Press(1981)を参照されたい。このように報告された標的細胞の特異性は、リポ多糖（LPS）に対するBPIの強い誘引力の結果であると考えられていた。LPSは、グラム陰性生物の外膜（あるいはエンベロープ）に独特のものである。 BPIのグラム陰性細菌殺傷における正確な機構はいまだ完全には解明されていないが、まず、陽イオン性BPIタンパク質とLPS上の陰性に荷電した部位との間の静電気的相互作用及び疎水性相互作用を通して、細菌の表面にBPIが結合しなければならないと考えられている。LPSは、それが刺激する強い炎症応答（すなわち、回復不能の内毒性ショックを最終的には惹起こしうる宿主炎症細胞によるメディエータの放出）のゆえに、「内毒素」と称されている。BPIはリピドＡに結合するのであるが、これはLPSの最も毒性が強く最も生物学的活性を有する成分であると報告されている。感受性のグラム陰性細菌において、BPIの結合はLPS構造を崩壊させ、リン脂質及びペプチドグリカンを分解する細菌酵素の活性化を惹起こし、細胞外膜の透過性を変化せしめ、最終的には細胞死へと導く事象を開始させると考えられる。［ Elsbach及びWeiss(1992)、前出］。BPIは２段階にて作用すると考えられる。第一は、即時的生育停止、外膜の透過性亢進（permeabilization）ならびにリン脂質及びペプチドグリカンを加水分解する細菌酵素の選択的な活性化によって特徴付けられる亜致死的段階である。この段階での細菌は、血清アルブミンを追加した培地中で生育させることにより救助できる［Mannionら、J.Clin.Invest.、85巻、853〜860頁(1990)］。第二段階は、血清アルブミンで回復しえない生長阻害により規定されるものであるが、細菌をさらに長い間BPIに曝した後に起こるものであり、細胞質内膜への明白な損傷を含む、広範囲の生理学的及び構造的変化により特徴付けられる。 BPIが細菌のLPSにまず結合して、正常時においてＭｇ⁺⁺及びＣａ⁺⁺の結合を通して外膜を安定化させる、LPSのKDO領域中の陰イオン性の基への結合におそらくは起因した、組織的な変化が惹起こされる。グラム陰性細菌の外膜へのBPIの付着によりアクチノマシンＤなどの疎水性物質への外膜の迅速な透過性亢進がなされる。BPIの結合及びそれに続くグラム陰性細菌殺傷は、少なくとも部分的にLPS 多糖の鎖長に依存するものであり、長い0-鎖を持っている「スムーズ」生物は、短いO-鎖を持っている「ラフ」生物よりもBPIの殺菌効果に対して耐性である［W eissら、J.Clin.Invest.、65巻、619〜628頁(1980)］。このBPIの作用の第一段階であるグラム陰性外側エンベロープの透過性亢進は、BPIの解離に際しては可逆性であり、これは、二価陽イオンの存在及び新規LPSの合成を必要とするプロセスである［Weissら、J.Immunol.、132巻、3109〜3115頁(1984)］。しかしながら、グラム陰性細菌の生育力喪失は、エンベロープの完全性を修復するプロセスによっては回復せず、従って殺菌作用は標的生物に誘導される付加的な障害により媒介されるのであり、それは細胞質膜に位置するかもしれないことが示唆される［Mannionら、J.Clin.Invest.、86巻、631〜641頁(1990)］。この可能性を特に精査して、モルベースで、BPIは少なくともポリミキシンＢと同等に細胞質膜小胞機能を阻害することが示されている［In'tVeldら、Infection and Immunity 、56巻、1203〜1208頁(1988)］ものの、正確な機構ならびに、このような小胞と無傷の生物の研究との関連は、いまだ解明されていない。直接的な殺菌活性に加えて、BPIは生細菌または死滅細菌、及び細菌から遊離されたLPSの内毒素特性を中和することもできる。BPIのグラム陰性の殺菌特性及び細菌のLPSに結合して中和する能力のゆえに、菌血症、内毒素血症、及び敗血症を包含する、グラム陰性の細菌によって惹起こされる疾患に罹患している哺乳動物の処置のためにBPIを利用することができる。BPIのこれらの二重の特性から、BPIがかかる療法のための投与に特に有用且つ有利であることが知られる。 BPI由来ペプチドを含めてBPIタンパク質産物は、係属中で同じ譲渡人にかかる、1994年９月22日に出願された米国特許出願第08/311,611号及びW095/08344号（ PCT/US94/11225）に記載される如き従来の抗体と併用した補助的療法に有用である。特に、かかるBPIタンパク質産物と抗生物質もしくは抗生物質の組合せとの併用投与または併用処置によって、様々な態様によって抗生物質の治療上の有効性を改善することができる。かかる様々な態様としては、低投与量の抗生物質に対するグラム陰性細菌の感受性を高めること、抗生物質に対するグラム陰性細菌の耐性を有効に反転させること、BPIタンパク質産物もしくは抗生物質のいずれかのみによる個々の効果もしくは相加的な効果を上回る相乗的もしくは強化的効果を提供すること、または抗生物質によって殺傷される細菌による内毒素を中和することなどが挙げられる。BPIタンパク質産物と抗生物質との併用投与は、いずれかの薬剤が単体で投与された場合に奏されるよりも、予期しがたいほど優れた治療効果がin vivoで奏される。特に、関連するグラム陰性細菌がBPIタンパク質産物単独及び／または抗生物質単独での場合の殺菌効果に対して耐性であると考えられる場合にさえ、本発明の改善された処置方法によりBPIタンパク質産物を併用投与することが有効なのである。従って、BPIタンパク質産物は、例えば、腹部もしくは泌尿生殖器の手術を受ける患者や、外傷を負った患者などの、グラム陰性細菌感染の危険性が高い患者の予防を含め、グラム陰性細菌感染の予防または処置のために有用である。近年、BPI由来ペプチドを含むBPIタンパク質産物は、1995年１月13日に出願された係属中の米国特許出願第08/372,783号及びWO95/19180（PCT/US95/00656）に記載されるように、いくつかのグラム陽性生物に対して、直接的及び間接的な殺菌及び生育阻害効果を有することが示されている。加えて、BPIタンパク質産物は、予測せざることに、多くの場合にグラム陽性細菌の抗生物質耐性を反転させる能力を含めて、グラム陽性細菌の抗生物質に対する感受性を高める能力を有していることが示された。同時に投与した場合にBPIタンパク質産物及び抗生物質によって、相加的及び相乗的殺菌／生育阻害効果が奏される。従って、かかるBP Iタンパク質産物は、グラム陽性細菌感染と、それに伴う病態またはそれに起因する病態（例えば、敗血症または菌血症など）を処置するために有用である。近年、BPI由来ペプチドを含むBPIタンパク質産物は、1995年１月13日に出願された係属中且つ同じ譲渡人になる米国特許出願第08/372,105号及びWO95/19179（ PCT/US95/00498）に記載されるように、殺真菌／静真菌効果も有することが示されている。かかるBPIタンパク質産物は、単独または既知の抗真菌剤と組み合わせて投与するとよい。付加的療法に供された場合、BPIタンパク質産物の投与によって、有効な療法のために必要とされる抗真菌剤の量を減じることができ、しかして潜在的な毒性応答及び／または処置の高額化を制限することができる。BP Iタンパク質産物の投与によって、このような薬剤の効果も増強されえ、かかる薬剤の効果の促進すること、あるいはかかる薬剤に対する真菌の耐性を反転させることもできる。 BPIは、他の重要な生物学的活性を有している。例えば、BPI由来ペプチドを含むBPIタンパク質産物は、1994年９月20日に発行された、係属中且つ同じ譲渡人になる米国特許出願第5,348,942号（引用することにより本明細書に組み入れることとする）で、ヘパリン結合及びヘパリン中和活性を有することが示されている。現行のヘパリンの臨床的利用の重要性の故に、かかるヘパリン結合及び中和活性は意義のあるものである。ヘパリンは一般に、心肺バイパス、心臓カテーテル及び血液透析などの外科的手法に際して、かかる手法の間の血液凝固を妨げるために、400 U/kgを上限とする用量にて投与される。ヘパリンが外科的処置に際しての抗凝血効果のために投与される場合、正常な凝血機能が回復されうるように、ヘパリンの効果が速やかに中和されることが、外科的処置後の治療の重要な点である。現在のところ、ヘパリンを中和するためにプロタミンが使用されている。プロタミンは、単純な、アルギニンに富む、強い塩基性の低分子タンパク質のクラスに属する。単独投与を行った場合、プロタミン（通常、プロタミン硫酸塩の形状で投与）は、抗凝血効果を有する。ヘパリン存在下に投与した場合には、安定な複合体が形成され、双方の薬物の抗凝血活性は喪失する。しかしながら、プロタミンの有する、重篤な低血圧及び類アナフィラキシー性効果によって、その臨床的用途は限定されてきた。かくして、プロタミンの有用性を限定している有害な副作用なしに、臨床現場でヘパリンの中和におけるプロタミンに代替できるものとして、BPIはそのヘパリン結合及び中和活性の故に潜在的用途を有しているのである。BPIのさらなる抗菌及び抗内毒素効果は、プロタミンに比較して外科的処置後のヘパリン中和において有用且つ有利なものであるはずである。さらに、BPIタンパク質産物は、そのヘパリン結合及び中和活性に部分的に起因して、脈管形成を阻害するのに有用である。成人では、血管外傷の結果として（創傷治癒）、免疫刺激の結果として（自己免疫疾患）、炎症性メディエータの結果として（プロスタグランジン）または腫瘍細胞より、脈管形成性増殖因子が放出される。これらの因子は、ヘパリン依存性の受容体結合機構を介して、内皮細胞の増殖を誘導する（脈管形成に必須である）。脈管形成は、様々な腫瘍の成長、増殖、及び転移；糖尿病性網膜症、水晶体後繊維増殖症、血管新生緑内障、乾癬、血管線維腫、慢性関節リウマチを含む免疫性及び非免疫性炎症、アテローム斑内での毛細血管増殖、血管腫、子宮内膜症及びカポジ肉腫を包含する、他の数多くの病理学的状態にも関係するものである。しかして、これらやその他の事例において脈管形成を阻害することが望ましいと考えられ、BPIのヘパリン結合及び中和活性は、その目的のために有用なものである。 BPIタンパク質産物の他の用途に、通常脈管形成を伴うような、慢性的炎症に関わる病理学的状態おけるものがある。慢性的炎症に関連するヒトの疾患の一例は関節炎であり、これには末梢関節の炎症が関わっている。慢性関節リウマチでは、炎症は免疫によって駆動されるが、他方反応性関節炎は、化膿性細菌または他の感染性物質で滑液膜組織が感染することに関わっている。多くの型の関節炎が、関節での炎症性浸潤が顕著に起こる段階から、血管新生パンヌスが関節に侵入して軟骨を破壊し始める後期の段階へと進行する。関節における血管新生が疾患または付帯徴候の原因となる要素であるのか否かは明らかでないが、脈管形成が慢性関節リウマチにおける滑膜炎の維持に必須であることの証拠は存在している。BPIは、関節炎及び他の炎症性疾患のための有効な治療を成し逐げることが示されている。 23 kDのＮ末端組換えBPI配列の中の、３つの別々の機能性ドメインが、Little ら、J.Biol.Chem．269巻、1865頁(1994)によって見出された［係属中で同じ譲渡人になるWO94/20128（PCT/US94/02401）;WO9 4/20352（PCT/US94/02465)；及びWO95/19372（PCT/US94/10427）も参照されたい］。BPIのこれらの機能性ドメインは、タンパク質の生物学的総活性に寄与するB PIのアミノ酸配列の領域を表しており、タンパク分解による切断断片（重複する 15マーのペプチド及び他の合成ペプチド）の活性によって本質的に規定されていた。ドメインＩは、約17位のアミノ酸から約45位のアミノ酸を含む、BPIのアミノ酸配列として規定される。このドメインに由来するペプチドは、LPSによって誘導されるLAL活性の阻害と、ヘパリン結合アッセイの双方において中程度の活性を有し、有意な殺菌活性は呈さなかった。ドメインIIは、約65位のアミノ酸から約99位のアミノ酸を含む、BPIのアミノ酸配列として規定される。このドメインに由来する、またはこのドメインに基づくペプチドは、高いLPS及びヘパリン結合能を呈し、そして殺菌性であった。ドメインIIは、約142位のアミノ酸から約169位のアミノ酸を含む、BPIのアミノ酸配列として規定される。このドメインに由来する、またはこのドメインに基づくペプチドは、高いLPS及びヘパリン結合活性を呈し、そして殺菌性であった。BPI機能性ドメインペプチドの生物学的活性には、LPS結合、LPS中和、ヘパリン結合、ヘパリン中和または抗微生物活性が含まれうる。本出願で興味深いのは、組換え融合タンパク質及びペプチドに関する以下の参照文献の開示である。 Shen、 Proc.Nat'l.Acad.Sci．(USA)、281巻、4627頁(1984)には、プロ−インスリン及びβ−ガラクトシダーゼをコードする融合タンパク質の不溶性包含体としての細菌における発現が記載されており、この包含体は、臭化シアンで切断される前にギ酸で溶解された。 Kampら、Gene、39巻239頁(1985)は、神経ペプチド、サブスタンスＰの複数ユニット及びβ−ガラクトシダーゼをコードする融合タンパク質の大腸菌における不溶性包含体としての発現を記載しており、この包含体は、臭化シアンで切断される前にギ酸で溶解された。 Lennickら、Gene、61巻103頁(1987)は、α−ヒト心房性ナトリウム利尿性ペプチドの複数（８）ユニットをコードする融合タンパク質の大腸菌における不溶性包含体としての発現を記載しており、この包含体は、エンドプロテイナーゼで切断される前に尿素で溶解された。 Dykesら、Eur.J.Bjochem.、174巻411頁(1988)は、α−ヒト心房性ナトリウム利尿性ペプチド及びクロラムフェニコールアセチルタオランスフェラーをコードする融合タンパク質の大腸菌における可溶性細胞内発現を記載しており、この融合タンパク質は、ペプチドを遊離させるために、タンパク分解による切断、または2-(2-ニトロフェニルスルフェニル)-E-メチル-3'-ブロモインドレニンで化学的切断を行った。 Rayら、Bio/Technology、 11巻64頁(1993)は、サケのカルシトニン及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼをコードする融合タンパク質の大腸菌における可溶性細胞内発現を記載しており、この融合タンパク質は、臭化シアンで切断された。 Schellenbergerら、Int.J.Peptide Protein Res.、41巻326頁(1993)は、サブスタンスＰペプチド（11アミノ酸）及びβ−ガラクトシダーゼをコードする融合タンパク質の不溶性包含体としての発現を記載しており、この包含体は、融合タンパク質を切断するために、キモトリプシンで処理された。 Hancockら、WO94/04688（PCT/CA93/00342）及びPiersら（Hancock）、Gene、1 34巻７頁(1993)は、（ａ）ヒト好中球ペプチド１（HNP-1）と命名されたデフェンシンペプチドまたはハイブリッドのセクロピン／メリチン（CEME）ペプチド及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（G ST）をコードする融合タンパク質の大腸菌における不溶性包含体としての発現を記載しており、この包含体は、(i)尿素での可溶化の前に、HNP-1-GST融合タンパク質については因子Ｘａプロテアーゼ処理の前に、３％オクチル-ポリオキシエチレンで抽出され、または(ii)CEME-GST融合タンパク質については臭化シアンで切断される前にギ酸で溶解された。さらにHancockら、WO94/04688（PCT/CA93/00 342）及びPiersら（Hancock）、Gene） 134巻７頁(1993)は、さらに（ｂ）CEME ペプチド及びプロテインＡをコードする融合タンパク質の、黄色ブドウ球菌の細胞外上清における発現；（ｃ）精製されたある融合タンパク質での、所定の融合タンパク質のタンパク溶解性分解；ならびに（ｄ）他の融合タンパク質のタンパク溶解性分解と、融合タンパク質を回収及び精製できないことを記載している。 Laiら、米国特許第5、206、154号及びLaiら、Antimicrob.Agents & Chemo.、3 7巻1614頁(1993)は、セロピンペプチド、及びL-ルブロキナーゼ遺伝子の5'-端によりコードされるタンパク質をコードする融合タンパク質の不溶性包含体としての発現を記載しており、この包含体は、臭化シアンで切断される前にギ酸で溶解された。 Gammら、Blo/Technology、12巻1017頁(1994)は、ヒトの副甲状腺ホルモンペプチド及びバクテリオファージT4でコードされるgp55タンパク質をコードする融合タンパク質の大腸菌における不溶性包含体としての発現を記載しており、この包含体（６％重量／容量）は、Asp-Pro切断部位を加水分解するために酸で処理された。 Kuliopulosら、J.Am.Chem.Soc.、116巻4599頁(1994)は、酵母α−交配型ペプチドの複数ユニット及び細菌ケトステロイドイソメラーゼタンパク質をコードする融合タンパク質の大腸菌における不溶性包含体としての発現を記載しており、この包含体は、臭化シアンで切断される前にグアニジンで溶解された。前記の参照文献は、細菌からの小ペプチドの生産が様々な理由により問題をはらんでいることを示唆している。ペプチドが、より大きな融合タンパク質の一部として作製される場合でも、あるペプチドのタンパク質分解には特に問題がある。キャリアタンパク質／ペプチドを含むこのような融合タンパク質は、細菌宿主細胞によって発現されないことがあり、あるいは発現されるのに細菌のプロテアーゼによって切断されることもある。特に、前記参照文献であるHancockら、WO9 4/04688（PCT/CA93/00342）によって、陽イオン性の抗微生物性ペプチドを細菌において発現する上での困難性が記載されている。彼らの見解によれば、これは、かかるポリ陽イオン性ペプチドが細菌のプロテアーゼによる分解を受けやすいためである。当該技術分野において、新しい組換え産物が希求されており、特に、抗微生物剤（抗細菌及び抗真菌剤を含む）として、内毒素結合及び中和剤として、ならびにヘパリン結合及び中和剤（投与されたヘパリンの抗凝血効果を中和するための薬剤、慢性の炎症性疾患状態を処置するための薬剤、ならびに正常または病的な脈管形成を阻害するための薬剤）として有用な、BPI由来ペプチドの組換え製造のための方法が希求され続けている。発明の要約本発明は、殺菌／浸透性増強タンパク質（BPI）に由来する、またはそれに基づく融合タンパク質及びペプチドの、微生物での組換え製造のための方法及び物質を提供する。好ましいBPIペプチドは、BPIのドメインＩ（アミノ酸第17〜45位）、ドメインII（アミノ酸第65〜99位）及びドメインIII（アミノ酸第142〜169位）に由来するもので、各ペプチドは、BPI機能性ドメインのアミノ酸配列またはその部分列、及びBPIの少なくとも１つの生物学的活性を有する配列または亜配列の変異体であるアミノ酸配列を有している。本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つのBPIペプチド配列、キャリアタンパク質配列、及びBPIペプチドとキャリアタンパク質配列との間に位置する少なくとも１つのアミノ酸切断部位配列を含む。本発明はさらに、１以上のBPIペプチドをコードする、かかる融合タンパク質の微生物での製造のための方法を提供する。本発明の組換えBPI由来ペプチドは、融合タンパク質内の切断部位での切断によって遊離される。かかるペプチドは、本発明によって効率よく経済的に製造される。融合タンパク質及びBPI由来ペプチドの、微生物での組換え製造のための本発明の方法は、以下の意外な発見すなわち、かかる融合タンパク質が、細胞内に大量に発現されるかまたは微生物宿主細胞から分泌されること、微生物宿主細胞によって抗微生物性のBPIペプチドが効率よく生産されること、そしてペプチドは融合タンパク質から効率よく切断及び遊離されることに基づくものである。本発明の抗微生物性BPIペプチドは、大腸菌で効率よく作製されることは、特に意外である。BPIの１以上の生物学的活性を有する、かかるBPI由来ペプチドは、本発明によって単離及び精製されることができる。このようにして、本発明は機能性の組換えBPIペプチドを提供する。融合タンパク質から遊離される、生物学的に活性な本発明の組換えBPIペプチドは、以下の活性の１以上を有している：LPS結合、LPS中和、ヘパリン結合、ヘパリン中和または抗微生物活性（抗細菌、抗真菌活性を含む）。組換えBPI由来ペプチドは、それ自体で抗微生物剤（抗細菌、及び抗真菌剤を含む）として、内毒素結合及び中和剤として、ならびにヘパリン結合及び中和剤（投与されたヘパリンの抗凝血効果を中和するための薬剤、慢性の炎症性疾患状態を処置するための薬剤、ならびに正常または病的な脈管形成を阻害するための薬剤）として有用である。本発明は細菌宿主への導入に好適な組換えDNAベクター構築体を提供するが、かかる構築体は、（ａ）少なくとも１つの陽イオン性BPIペプチドをコードしてるDNA配列；（ｂ）キャリアタンパク質をコードしているDNA配列；及び（ｃ）配列（ａ）と（ｂ）との間に位置する、アミノ酸切断部位をコードしているDNA配列を有する、融合タンパク質に対するコード配列を含む。本発明によれば、好ましいベクター構築体は、融合タンパク質に対するコード配列が、5'-（ｂ）-（ｃ）-（ａ）-3'にて、すなわち、5'から3'方向に、キャリアをコードする配列、その後に切断部位をコードする配列、そして次にペプチドをコードする配列、となるように提供される。本発明はさらに、殺細菌性、殺真菌性、内毒素結合性、内毒素中和性、ヘパリン結合性またはヘパリン中和性である、コードされたBPIペプチドを提供する。本発明の一つの特徴によれば、配列番号：１〜239のアミノ酸配列を含む、コードされたBPIペプチドが提供される。本発明はまた、例えば、ゲロニンまたはヒト骨形成タンパク質のＤサブユニットなどの陽イオン性キャリアタンパク質であるキャリアタンパク質を提供する。構築体はまた、融合タンパク質のアミノ末端で細菌性分泌リーダー配列をさらにコードするものを提供する。ベクター構築体内に、Asp-Pro、Met、Trp及びGluをコードするコドンを包含して、コードされるアミノ酸切断部位が提供される。大腸菌宿主細胞を包含する、本発明のベクター構築体で形質転換された細菌宿主細胞も提供される。本発明は、BPIペプチド−、キャリアタンパク質−、及びアミノ酸切断部位− をコードする配列を有する融合タンパク質をコードするベクター構築体で形質転換された細菌宿主細胞を培養し、適宜に発現された融合タンパク質を単離し、発現された融合タンパク質を切断してBPIペプチドを遊離させ、そしてBPIペプチドを単離することによって、融合タンパク質及びBPIペプチドを細菌で製造するための方法を提供する。本発明の方法で製造されたBPIペプチド産物が提供される。加えて、融合タンパク質の、細菌での製造のための方法が提供され、この方法は以下の工程すなわち、融合タンパク質をコードするベクター構築体で形質転換された細菌宿主細胞を培養し、及び発現された融合タンパク質を単離する工程を含む。かかる方法で製造された融合タンパク質産物も提供される。図面の簡単な説明図１には、様々な温度でのAsp-Proペプチドリンカーの酸不安定性（liability ）を経時的に示す。図２には、融合タンパク質の加水分解についてのアレニウス・プロットを示す。図３には、様々な酸で処理された包含体懸濁液の酸切断速度を示す。図４には、60 mM及び90 mMの塩酸で処理した懸濁液で成し逐げられる最高のペプチド遊離を示す。図５には４つのペプチド反復ユニットを用いたpING3360からの産物の最高収率を示す。詳細な説明本発明は、融合タンパク質及び当該融合タンパク質によってコードされ且つそれから遊離されるBPIペプチドの組換え製造法及び組成物を提供する。予期に反して、抗微生物活性を備えたBPI由来ペプチドを含むこのような融合タンパク質は、取り立ててタンパク質分解を受けることなく大量に発現されることができ、場合によっては微生物宿主細胞から実際に分泌される。本発明の組換え法によって、表４に掲載された配列（配列番号：１〜239）を包含する様々なBPI由来ペプチドが製造されうる。少なくとも１つのBPI活性（例えば、LPS結合、LPS中和、ヘパリン結合、ヘパリン中和または抗微生物活性（抗細菌、抗真菌活性を含む））を有する前記BPI由来ペプチドは、抗微生物剤（抗細菌、及び抗真菌剤を含む）として、内毒素結合及び中和剤として、ならびにヘパリン結合及び中和剤（投与されたヘパリンの抗凝血効果を中和するための薬剤、慢性の炎症性疾患状態を処置するための薬剤、ならびに正常または病的な脈管形成を阻害するための薬剤）として有用である。本発明によって提供される利点は、かかるBPIぺプチドを細菌宿主細胞から効率よく且つ経済的に製造する能力である。さらなる利点は、規模拡大が容易な方法によって、均質なペプチドを大量に得ることができることにもある。本明細書中に使用される「BPI由来ペプチド」または「BPIペプチド」は、殺菌／浸透性増強タンパク質（BPI）に由来する、またはそれに基づくペプチドであって、BPIのドメインＩ（アミノ酸第17〜45位）、ドメインII（アミノ酸第65〜9 9位）及びドメインIII（アミノ酸第142〜169位）に由来するペプチドを包含するものを称し、各ペプチドは、BPI機能性ドメインのアミノ酸配列またはその部分列、及びBPIの少なくとも１つの生物学的活性を有する配列または亜配列の変異体であるアミノ酸配列を有している。本明細書で使用される「BPIの生物学的活性」は、LPS結合、LPS中和、ヘパリン結合、ヘパリン中和または抗微生物活性（抗細菌、抗真菌活性を含む）を称する。本明細書で使用される「陽イオン性BPIペプチド」は、本明細書にて表４に掲載されているペプチドにより例証されるごとき、p1＞7.0を有するBPIペプチドを称する。本明細書で使用される「形質転換された宿主細胞」は、組換え遺伝子材料を含む細菌細胞または、組換え産物の発現に必要な遺伝子材料を含む細菌細胞を称する。この遺伝子材料は、形質転換、形質導入、エレクトロポレーション及び感染を包含する、当該技術分野において知られた如何なる方法によって導入されてもよい。本明細書で使用される「ベクター構築体」は、１もしくはそれ以上の組換え産物をコードしうる組換え遺伝子材料を含み、細菌において自己複製を行うことができるプラスミドDNAを称する。本明細書で使用される「キャリアタンパク質」は、細菌において発現されることができ、結合されたペプチドまたはタンパク質との融合パートナーとして使用されうるタンパク質を称する。好ましいキャリアタンパク質は、高収率で発現でき、融合パートナーとして用いられた場合に結合されたペプチドまたはタンパク質に高レベルでの発現を付与できるものである。本明細書で使用される「陽イオン性キャリアタンパク質」は、7.0を上回る、好ましくは8.0を上回るpIを有する（アミノ酸配列に基づいて計算した場合、または溶液にて計算した場合）キャリアタンパク質を称する。かかる好ましいタンパク質には、ゲロニン（pI9.58）及びヒト骨形成タンパク質のＤサブユニット（pI 8.18）が含まれる。本明細書で用いられる「アミノ酸切断部位」は、ペプチド鎖が化学物質または酵素によって当該部位で切断されるよう、化学的または酵素的反応に対する認識部位として働く１以上のアミノ酸を称する。好ましいアミノ酸切断部位は、アスパラギン酸−プロリン（Asp-Pro）、メチオニン（Met）、トリプトファン（Trp ）またはグルタミン酸（Glu）である。特に好ましいのは、酸加水分解によってA spとProとの間が切断されるAsp-Pro切断部位である。本明細書において用いられる「BPIタンパク質産物」には、天然に及び組換えにより製造されるBPIタンパク質；天然、合成、及び組換えの、BPIタンパク質の生物学的に活性を有するポリペプチド断片；ハイブリッド融合タンパク質及びダイマーを含む、BPIタンパク質の生物学的に活性を有するポリペプチド変異体またはその断片；システインで置換された類似体を含む、BPIタンパク質の生物学的に活性を有するポリペプチド類似体またはその断片または変異体；ならびにBP I由来ペプチドが包含される。本発明に従って投与されるBPIタンパク質産物は、当該技術分野において知られているいかなる手段によって生産及び／または単離してもよい。引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである、米国特許第5,198,541号に、rBPI₅₀と称される組換えBPIホロタンパク質及びBPIの組換え断片を含むBPIタンパク質をコードする組換え遺伝子、及びその発現のための方法が開示されている。共有であり係属中の米国特許出願第07/885,501号及びその一部継続出願である1993年５月19日出願の米国特許出願第08/072,063号及びそれに対応する1993年５月19日出願のPCT出願第93/04752号（すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）は、培養にて、遺伝的に形質転換した哺乳動物宿主細胞で発現し、そして当該細胞から分泌される組換えBPI タンパク質産物の新規精製方法を開示しており、また、安定で均質な製薬調剤に配合するのに好適な、大量の組換えBPI産物をどのように製造するかを開示している。 BPIの生物学的に活性を有する断片（BPI断片）には、その断片分子が、ホロタンパク質のアミノ末端アミノ酸、内部アミノ酸、及び／またはカルボキシ末端アミノ酸を欠くことを除いては、天然のヒトBPIホロタンパク質と同じまたは類似のアミノ酸配列を有する、生物学的に活性を有する分子が包含される。このような断片の例に、Ooiら、J.Exp.Med.、174巻、649頁(1991)に記載されるおよそ25 kDの天然ヒトBPIのＮ-末端断片及びGazzano-Santoroら、Infect.Immun.60巻、47 54〜4761頁(1992)に記載され、rBPI₂₃と称されている天然ヒトBPIの第１位よりおよそ第193から199位までのＮ-末端アミノ酸をコードするDNAの組換え発現産物が包含されるが、これらに限定されるものではない。かかる出版物において、Gr ayら、前出の図１に示されると同様の、31残基のシグナル配列及び成熟ヒトBPI のＮ-末端の最初の199アミノ酸を有する組換え発現産物（rBPI₂₃）をコードする DNA（第151位のバリンがＧＴＣでなくＧＴＧで特定され、第185位の残基がリジン（ＡＡＧで特定される）でなくグルタミン酸（ＧＡＧで特定される）であるという例外を含む）のソースとして、発現ベクターが用いられた。Grayら、前出の図１に示される配列（配列番号：145及び146）を有する組換えホロタンパク質（ rBPI）も製造されている（rBPI₂₃について注解した例外、及び第417位の残基がバリン（ＧＴＴで特定される）でなくアラニン（ＧＣＴで特定される）であるという点は異なる）。他の例には、共有であり係属中の、1994年３月11日出願の米国特許出願第08/212,132号及び対応するPCT出願第95/03125号（引用することによりそれらの開示が本明細書に含まれるものである）に記載されるごとき、BPI断片のダイマー型が包含される。好ましいダイマー産物には、モノマーが、BPIホロタンパク質のおよそ第１〜175から、およそ第１〜199までのＮ- 末端残基を有するアミノ末端BPI断片である、ダイマーのBPIタンパク質産物が包含される。特に好ましいダイマー産物は、rBPI₄₂ダイマーと名付けられた、Ｎ- 末端残基第１から193までを有するBPI断片のダイマー型である。 BPIの生物学的に活性を有する変異体（BPI変異体）には、BPIホロタンパク質もしくはその生物学的に活性を有する断片及び他のポリペプチドの少なくとも一部を含む組換えハイブリッド融合タンパク質、またはBPI変異体のダイマー型が包含されるが、これらに限定されない。このようなハイブリッド融合タンパク質及びダイマー型の例は、共有であり係属中の米国特許出願第07/885,501号（Theo fanらによる）及びその一部継続出願である1993年５月19日出願の来国特許出願第08/064,693号及びそれに対応する1993年５月19日出願のPCT出願第US93/04754 号（すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）に記載されており、アミノ末端端部でBPIタンパク質またはその生物学的活性を有する断片、及びカルボキシ末端端部で少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖の定常ドメインまたはその対立変異体を含む、ハイブリッド融合タンパク質を包含する。このようなハイブリッド融合タンパク質の他の例は、BPI(1-199)-LBP(198-456 )ハイブリッドと命名された、LBPのアミノ酸第198位から第456位をコードするDN Aに連結されたBPIのアミノ酸第１位から第199位をコードするDNAの組換え発現産物であり、これは、1993年６月17日出願の米国特許出願第08/079,510号の一部継続出願として1994年６月17日に出願された、共有であり係属中の米国特許出願第08/261,660号に対応する、1994年６月17日出願のPCT出願第US94/06931号（すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）に記載されている。 BPIの生物学的に活性を有する類似体（BPI類似体）には、１以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸に置換されているBPIタンパク質産物が包含されるが、これらに限定されない。例えば、共有であり係属中の1993年２月２日出願の米国特許出願第08/013,801号及び対応する1994年２月２日出願のPCT出願第US94/01235号（すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）に、システイン残基が異なるアミノ酸で置換されたBPI及びBPI断片のポリペプチド類似体が開示されている。この出願に記載された好ましいBPIタンパク質産物は、BPI ホロタンパク質のＮ-末端アミノ酸の第１アミノ酸よりおよそ第193から199までのアミノ酸をコードするDNAの発現産物（第132番目のシステイン残基がアラニンで置換されており、rBPI₂₁ΔcysまたはrBPI₂₁と名付けられている）である。他の例としては、例えば、共有であり係属中の1994年３月11日出願の米国特許出願第08/212,132号及びそれに対応するPCT出願第95/03125号（引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）の、BPI類似体のダイマー型が包含される。さらにBPIタンパク質産物には、1996年３月21日出願の「抗真菌ペプチド」の名称を有する、共有であり係属中の米国特許出願第08/621,259号（代理人事件番号27129/33198）；1995年７月20日出願のPCT/US95/09262号及び米国特許出願第0 8/504,841号；1994年９月15日出願のWO95/19372号（PCT出願第US94/010427号）及び米国特許出願第08/306,473号；1994年３月11日出願のWO94/20532号（PCT出願第US94/02465号）及び米国特許出願第08/209,762号：1993年７月15日出願のWO 94/20128号（PCT出願第US94 /02401号）及び米国特許出願第08/093,202号（これらはすべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）に記載されるものなどの、BPIに由来するまたはそれらに基づくペプチド（BPI由来ペプチド）も含まれる。以下の例示的な実施例を考慮して、本発明の他の特徴及び利点が理解されるであろう。実施例１には、融合タンパク質発現ベクター構築体の構築を示す。実施例２には、組換え融合タンパク質の発現を示す。実施例３には、細胞内組換え産物を発現している細胞からの包含体の単離を示す。実施例４には、細菌宿主細胞培養培地からの、分泌された融合タンパク質の単離及び組換えペプチドの精製を示す。実施例５には、組換えペプチドの抗微生物活性分析のための、放射拡散アッセイを示す。そして実施例６には、組換えペプチドのさらなる生物学的活性のアッセイを示す。実施例１融合タンパク質発現ベクター構築体の構築１．細菌発現ベクター構築体：pING3793 ペプチド融合タンパク質をコードする、細菌発現ベクターを構築した。このベクターは、SLTリンカーをコードする配列（配列番号：250及び251の、アミノ酸第277位から296位を参照されたい）に連結されたゲロニンをコードする遺伝子に対する配列（配列番号：250及び251の、アミノ酸第23位から273位を参照されたい）、ならびにBPIの第85〜99位及び第148〜162位（配列番号：265）に対応するアミノ酸を含む、BPIに由来するペプチドをコードする配列を含んでいる。コード付されたAsp-Proジペプチドと共に、ゲロニンとペプチドをコードしているDNA の接合部で、このベクターに固有のBamHI部位を組み入れた。以下に記載する実験用に、制限酵素及び修飾酵素はNew England Biolabs、Beverley、マサチューセッツ州及びGIBCO/BRL、 Gathersberg、メリーランド州より購入した。発現ベクターのp ING3793は、pING3748と命名され、米国特許第5,416,202号（引用することによってその全体を本明細書に含まれるものとする）に記載された、ゲロニンを含む以前に報告されたベクターから構築した。SLTに連結されたゲロニン遺伝子を含むプラスミドpING3748を、ScaI及びXhoIで切断した。ベクター断片を、BPI由来ペプチドをコードする、アニーリングされ伸長されたオリゴヌクレオチドに連結した。BPI由来ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドは、及びであった。各オリゴ16μgを、10 mMトリス、pH 8、100 mM NaCl、 0.1mMEDTAにてアニーリングした。アニーリングされたオリゴは、AmpliTaq（商標名、Perkin Elmer、No rwalk、コネチカット州）を用いて、製造業者の指示に従い72℃にて１０分間、G ene Amp（商標名、Perkin Elmer、Norwalk、コネチカット州）において標準のPC R試薬を含む50μLの反応液中で伸長させた。伸長されたDNA断片は、Chroma-spin 30カラム（Clontech、Palo Alto、カリホルニア州）にて精製し、そしてFspI及びXhoIで消化した。精製されたDNA断片をpING3748ベクター断片に連結した。連結されたDNAを、大腸菌MC1061を形質転換するために使用した。DNAのインサートを含むクローンの候補を、制限酵素分析によって同定した。pING3793によってコードされる融合タンパク質の配列は、配列番号：250及び251に示す。２．細菌発現ベクター構築体：ING3795 BPIのアミノ酸第85〜99位及び第148〜162位（配列番号：265）を含むBPI由来ペプチドに連結された、ゲロニン遺伝子（配列番号：250及び251の、アミノ酸第 23位から273位を参照されたい）、を含むが、前記のSLT領域を欠く発現ベクター構築体をpING3793から調製した。この調製を成し遂げるために、３つのプラスミドからのDNAセグメントをまとめてクローニングした。米国特許第5,416,202号（引用することによって本明細書に含まれるものとする）に記載された、組換えゲロニンをコードするプラスミドpING3825（実施例２を参照されたい）を、NcoI及びHindIIIで消化した。このゲロニン遺伝子の5'-端を含むベクター断片を精製した。米国特許第5,416,202号（引用することによって本明細書に含まれるものとする）に記載されたプラスミドpING3755（実施例１０を参照されたい）をEagIで消化し5'の突出部を埋めるためにT4ポリメラーゼで処理し、そしてNcoIで消化した。およそ650 bpのDNA断片を精製した。プラスミド3793をFspI及びHindIIIで消化し、そしておよそ175 bpのDNA断片を精製した。３つの単離されたDNA断片を連結してpING3795を作製した。連結されたDNAを使用して、大腸菌MC 1061を形質転換した。制限酵素分析によって、正しいDNAインサートを含む候補となるクローンを同定し、そして候補となったクローンであるpING3793のDNA配列をSequenase （商標名、US Biochemical、Clevel and、オハイオ州）を用いて配列決定することにより確かめた。制限酵素分析によって、正しいDNAインサートを含む候補となったクローンを同定した。pING379 5によってコードされる融合タンパク質の配列は、配列番号：252及び253に示すとおりである。３．細菌発現ベクター構築体：pING3353 BPIのアミノ酸第85〜99位及び第148〜162位（配列番号：265）を含むBPI由来ペプチドをコードするDNAセグメントを、ヒト骨形成タンパク質のサブユニットＤ（「Bone D」）をコードする遺伝子の3'-端へとタンパク質ベクター（配列番号：248及び249のアミノ酸第23〜161位を参照されたい）にクローニングして、ペプチド融合タンパク質をコードするベクター構築体を調製した。このベクター構築体pING3353は、以下に記載するとおりに調製したもので、このベクターはBo ne Dタンパク質、Asp-Proジペプチド、BPI由来ペプチドセグメントをコードしており、独特のBamHI制限酵素部位を含んでいる（配列番号：254及び255を参照されたい）。プラスミドpING3913のレジデントとしてpel Bリーダー配列に連結された前記B one D遺伝子（配列番号：248及び249のアミノ酸第１〜161位を参照のこと）は、コード領域の3'-端にBfaI制限酵素部位を含んでいる。プラスミドpING3913は、米国特許第5,284,756号（引用することによってその全体を本明細書に含まれるものとする）に記載されている、ヒト骨形成タンパク質のサブユニットＤをコードする遺伝子をコードしている（実施例９、図６及び配列番号：２を参照されたい）。pING3913をBfaIで消化してから大豆ヌクレアーゼで5'-突出部を処理することによって平滑末端を作製し、これは、第139位のアミノ酸（ヒスチジン）であるBone D遺伝子の最後のアミノ酸を含み、当該アミノ酸までをコードするものである。pING3913をBfaIで切断し、大豆ヌクレアーゼで処理して、次いでEcoRIで切断した。次に、Bone Dをコードするおよそ550 bpのDNA断片を精製した。プラスミドpING3793（前記第１節を参照のこと）をFspI及びHindIIIで切断し、そしてBamHI部位を含むDNAセグメントとAsp-Proジペプチド及びBPI由来ペプチドをコードするDNAセグメント（およそ175 bp）を精製した。これらの２つのD NA断片を、pING3353を作製するためにEcoRI及びHindIIIで消化しておいた、Ara B発現系を含む大腸菌発現ベクターへとクローニングした（例えば、pING3737／A TCC 69009；pING3746／ATCC 69008；pING3747／ATCC69101；pING3754／ATCC 691 02；pING3758／ATCC 69103；pING3759／ATCC 69104；pING3336／ATCC 69331；pI NG4644／ATCC69332；pING4629／ATCC 69333）；米国特許第5,416,202号を参照されたい。連結されたDNAを使用して、大腸菌MC1061を形質転換した。制限酵素分析によって、正しいDNAインサートを含む候補となるクローンを同定した。Bone D遺伝子の接合部及びpING3353のペプチドセグメントのDNA配列を、Sequenase（商標名、US Biochemical、Cleveland、オハイオ州）を用いたDNA配列決定によって確かめた。４．中間型ベクター構築体：pING3354 ４つのBPI由来ペプチドをコードするDNAを、Bone D遺伝子との融合体としてプラスミドベクターにクローニングした。これらのペプチドをコードすることができる縮重オリゴヌクレオチドを合成した。これらオリゴヌクレオチドは、２つの部位で縮重しており、BPIの第153位の残基に対応する位置で、アミノ酸F、A、S 及びVを有する、４種のペプチドをコードする可能性があった。２つのオリゴ：及びを合成し、10％アクリルアミドゲルにて精製した。それぞれおよそ１μgを、10 mMトリス、pH 8、100 mM NaCl、0.1mM EDTA中でアニーリングした。プラスミドp ING3353（前記３節を参照されたい）をEcoRI及びBamHIで切断し、そしてBone D 遺伝子を含むおよそ550 bpの断片を精製した。米国特許第5,410,202号（引用することにより本明細書に組み入れることとする）に記載される、pBR322の誘導体であってE．carotovora pel B遺伝子のリーダー配列を含むプラスミドpIC100をE coRI及びXhoIで切断し、そのベクター断片を精製した。アニーリングされたオリゴを、消化されたpING3353及びpIC100に連結して、クローニングされたペプチド融合体を含む４種のプラスミドを作製した。連結されたDNAを使用して、大腸菌M C1061を形質転換した。制限酵素分析によって、DNAインサートを含むクローンの候補を同定した。ペプチド中、BPIの第153残基に対応する位置にアラニンを有するペプチド融合タンパク質をコードするプラスミドを、pING3354と命名した。ペプチド中、BPIの第153残基に対応する位置にセリンを有するペプチド融合タンパク質をコードするプラスミドを、pING3355と命名した。ペプチド中、BPIの第153 残基に対応する位置にバリンを有するペプチド融合タンパク質をコードするプラスミドを、pING3356と命名した。ペプチド中、BPIの第153残基に対応する位置にフェニルアラニンを有するペプチド融合タンパク質をコードするプラスミドを、pING3357と命名した。プラスミドpING3354は、アラニンがコードされた位置での独特なApaI部位により、制限酵素分析によって識別された。４種のペプチドをコードするプラスミドすべてのDNA配列は、Sequenase (商標名、US Bio chemical、Cleveland、オハイオ州）を用いたDNA配列決定によって確かめた。プラスミドpING3354によってコードされる融合タンパク質の配列は、配列番号：25 6及び257に示す。pING3355、pING3356及びpING3357によってコードされる融合タンパク質の配列は、BPIの第153残基に対応する残基がそれぞれ、セリン、バリン及びフェニルアラニンであることを除いて、配列番号：257に示される融合タンパク質と同じである。５．細菌発現ベクター構築体：pING3797 中間型ベクターpING3354から、以前にXMP.36と命名されたBPI由来抗真菌ペプチドの配列をコードするDNAを、ゲロニン遺伝子の3'-端にクローニングした。その結果得られたプラスミドのpING3797は、ゲロニンとペプチドの遺伝子セグメントの間にAsp-Proジペプチドをコードしており、以下のとおりに調製された。組換えゲロニンをコードするプラスミドpING3825を、NcoI及びXhoIで消化し、そしてゲロニン遺伝子の5'-端を含むベクター断片を精製した。プラスミドpING3 795を、NcoI及びBamHIで消化し、そしてゲロニン遺伝子の3'-端を含むおよそ650 bpの断片を精製した。プラスミドpING3354は、BamHI及びXhoIで切断した。３つのDNA断片を一緒に連結して、ゲロニンペプチド融合タンパク質をコードするpING3797を作製した。連結されたDNAを使用して、大腸菌MC106 1を形質転換した。制限酵素分析によって、正しいDNAインサートを含む候補となるクローンを同定した。プラスミドpING3797によってコードされる融合タンパク質の配列は、配列番号：258及び259に示す。６．細菌発現ベクター構築体：pING3796 中間型ベクターpING3354からのBPI由来抗真菌ペプチドをコードするDNAに融合されたBone D遺伝子を、細菌発現ベクターにクローニングした。プラスミドpING 3354は、EcoRI及びXhoIで切断して、Bone D全体及びペプチド配列をコードするおよそ610 bpのDNA断片を精製した。このDNA断片を、EcoRI及びXholで切断しておいたpING3217のベクター断片へとクローニングした。このベクター断片は、pI NG3737／ATCC 69009（あるいは、pING3746／ATCC 69008；pING3747／ATCC 69101 ；pING3754／ATCC 69102；pING3758／ATCC 69103；pING3759／ATCC 69104；pING 3336／ATCC 69331：pING4644／ATCC 69332;及びpING4629/ATCC 69333）より得られるベクター断片と同じである。連結されたDNAを使用して、大腸菌MC1061を形質転換した。制限酵素分析によって、正しいDNAインサートを含む候補となるクローンを同定した。この結果得られたプラスミドはpING3796であった。プラスミドpING3796によってコードされる融合タンパク質の配列は、配列番号：260及び2 61に示す。７． Bone D融合体及びBPI由来ペプチドの反復ユニットをコードする、細菌発現ベクター構築体：pING3359、pING3360、pING3361、及びpING3362 プラスミドpING3796は、Bone Dの3'-端に連結された単一のペプチドセグメントと、その間のAsp-Proジペプチドとをコードするものである（配列番号：260及び261を参照されたい）。Asp-Proをコードするセグメントによって分かたれた、このペプチドセグメントの反復ユニットを含む、同様の発現ベクターをいくつか構築した。反復ユニットを構築するために、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そしてBone D及びペプチドをコードするDNA配列を増幅するために使用した。その結果得られたPCR産物をApaIで切断しペプチドをコードする48 bpのユニットを精製した。このDNA断片を、２、３、４及び５のペプチドをコードするセグメントを含む反復ユニットが主たる産物となるような条件下で自己連結させた。これらの連結産物をアガロースゲルで精製し、pING3354の、BPIの第153位の残基に対応するアミノ酸をコードする位置に存在する独特のApaI部位へと連結した。制限酵素分析によって、所望のペプチドセグメントの２〜５の反復ユニットを含む候補となるクローンを同定し、それらのDNA配列を、Sequenase （商標名、US Biochemical、Cleveland）オハイオ州）を用いたDNA配列決定によって確かめた。次いで、pING3354からpING3796の構築について前記したと同様の方法で、セグメントを含む反復ユニットを細菌発現ベクターにクローニングした。詳細には、以下の２つのオリゴヌクレオチド：及びを合成し、そしてこれらのプライマーと共にpING3354を増幅した。増幅されたおよそ550 bpの断片をApaIで切断し、そして48 bpのDNA断片をアガロースゲルで精製した。48 bpの断片およそ１μgを30μLの反応液中で５UのT4リガーゼを用いて連結させた。0.5、３及び１５分の３つの時点で10μLのアリコートを取り出し、連結反応を停止するために60 mMのEDTAを２ μL添加した。次いで、３つの試料を混合し、そして２〜５の反復ユニットと予測されるサイズの範囲にある連結産物をアガロースゲルで精製した。プライマー pING3354をApaIで切断し、そのDNAを、ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。48 bpのDNA反復ユニットをpING3354へ連結して、大腸菌MC1061を形質転換するために使用した。その結果得られたクローンを、制限酵素分析によって分析した。２、３、４及び５の反復ユニットを含むクローンが同定され、反復インサート全体のDNA配列をSequenase（商標名）を用いて配列決定した。各クローンは、EcoRI及びXhoIで消化した。これらのDNA断片を、EcoRI及びXhoIで消化しておいたプラスミドベクターpING3217へ連結した。こうして得られた、２．３．４及び５のペプチド配列の反復ユニットを含むプラスミドは、それぞれpING3359 、pING3360、pING3361、及びpING3362と命名された。pING3359によってコードされる融合タンパク質の配列を、配列番号：262及び263に示す。８．ベクター構築体の他の方法での調製前記のごときペプチド融合タンパク質をコードする発現ベクターは、pING3737 ／ATCC 69009（あるいは、pING3746／ATCC69008；pING3747／ATCC 69101；pING3 754／ATCC 69102；pING3758／ATCC 69103；pING3759／ATCC 69104；pING3336／A TCC69331；pING4644／ATCC69332;及びpING4629／ATCC69333）をEcoRI及びXhoIで切断してベクター断片を精製し、次いでpel B理ダーをコードする配列を有する合成DNAセグメントを調製し（例えば、配列番号：246または248のアミノ酸第１〜22位を参照されたい）、次に、例えば、本明細書中で配列番号：250、252、254、258、260または262で示されるような、ゲロニンペプチドまたはBone Dペプチド融合タンパク質をコードする合成DNAセグメントを調製することにより、他の方法でも作製することができる。実施例２組換え融合タンパク質の発現１．実験室規模の製造方法 araBプロモーターの制御下での組換え産物の発現を、以下のとおりに評価した。発現ベクター構築体は、大腸菌E104で形質転換され（ATCC 69009；ATCC 69008 ；ATCC 69101；ATCC 69102；ATCC 69103；ATCC 69104；ATCC 69331；ATCC 69332 ；ATCC69333として寄託されており、それぞれゲロニンをコードするプラスミドを含む）、細菌の培養を、15μg/mLのテトラサイクリンを追加したTYE培地（１リットル当たり、15gトリプトン、10 g酵母抽出物、５gNaCl）にて37℃で、ＯＤ₆₀₀ がおよそ0.4になるまで生育させた。L-アラビノースの20％重量／容量溶液を用い、0.1％の最終濃度となるように添加した。次いで、細菌の培養液を37℃にて誘導後１６時間インキュベートした。分泌されたタンパク質は、無細胞の培養上清中で直接検出された。細胞を遠心によって分離し、培養上清を0.2mのAcrodi scフィルター（Gelman）で濾過して４℃にて保存した。培養上清中の組換え産物をELISAによって検出するか、またはポリアクリルアミドゲルにて分析した。細胞画分に会合したままの組換えタンパク質は、再懸濁した細胞ペレットのSDS-PA GEによって直接評価した。２．大規模の発酵方法産物の発現ベクターを含む細菌培養物を、下記のGMM培養培地100 mLの接種し、そして32℃にておよそ200 クレット（Klett）単位にまで生育させ、次いで35 Lのファーメンターに接種した。ファーメンターの最終容量は、およそ10リットルから20リットルであり、炭素源としてグリセロールを含む最小塩培地（グリセロール最小培地、GMM）を含んでいた。10 Lで行うには、ファーメンター容器に、以下の成分を含有する最終容量7.35 LのGMMを入れてオートクレーブ滅菌した： (NH₄)₂S０₄ 101 g KH₂PO₄ 13.2 g K₂HPO₄ 118.7 g MgSO₄・７H₂O 2.3 g H₃PO₄（濃縮） 24.8 mL 消泡剤 0.8 mL ビオチン 0.01 g 酵母抽出物 38.8 g グリセロール 155 g これに、細菌の接種に先駆けて、濾過滅菌したおよそ200 mLの溶液を添加した： CaCl₂・2H₂O（10％重量/容量） 7.75 mL 微量Ｄ溶液^* 129 mL チアミンHCI（10％重量/容量） 0.8 mL ニコチン酸（１％重量/容量） 15.5 mL ^* 微量Ｄ溶液（濾過済）： FeCl₃・6H₂O 6.480 g ZnSO₄・７H₂O 1.680 g MnCl₂・4H₂O 1.200 g Na₂MoO₄・2H₂O 0.576 g CuSO₄・5H₂O 0.240 g CoCl₂・6H₂O 0.240 g H₃BO₃ 0.720 g H₃PO₄（濃縮） 96.0 mL H₂O（バッチ容量） 2.000 L 接種されたファーメンターを、10 L/分の通風を行い、1000rpmで撹拌しながら、pH 6.0及び32℃に維持した。栄養成分が限られてきたら（ＤＯが概ね100％に上昇することによって判定される）、約40〜100の吸光度（ＯＤ₆₀₀）に達するまでは、さらに培養液に栄養成分を供給した（ＤＯはおよそ20％に保つ）。詳細には、培養液には第１のAI（接種後）補給物を供給した。第１のAI補給物：オートクレーブ滅菌成分：グリセロール 1960 g MgSO₄・7H₂O 29.4 g ビオチン 0.026 g H₂O（バッチ容量） 2.800 L 濾過成分： CaCl₂・2H₂O（10％重量/容量） 98.1 mL チアミンHCl（10％重量/容量） 9.8 mL ニコチン酸（１％重量/容量） 19.7 mL 培養液は、およそ40〜100のＯＤにて、誘導剤のL-アラビノースを含有する第２の補給物を用いたグラジエント誘導によって誘導した。詳細には、第２のAI補給物は以下のとおりであった：第２のAI補給物：オートクレーブ滅菌成分：グリセロール 420 g MgSO₄・7H₂O 6.3 g ビオチン 0.005g アラビノース 50 g dl-H₂O（バッチ容量） 0.6 L 濾過成分： CaC12・2H₂O（10％重量/容量） 21 mL チアミンHCl（10％重量/容量） 2．1 mL ニコチン酸（１％重量/容量） 4.2 mL 培養液は、誘導後２０時間から３６時間で採収した。細胞を、0.2μmのMicrogon Hollow Fiberカートリッジ（10ft．（フィート）² ）を用いて、細胞上清から分離した。細胞内組換え融合タンパク質産物を発現している細胞から包含体を単離するために、得られた細胞ペーストの処理を下記実施例３に従って行った。あるいは、発現及び分泌された産物については、無細胞の発酵ブロスを濃縮し、S10Y10 Amiconカートリッジを備えたDC 10を用いて10 m Mリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.0に透析濾過（diafilter）した。分泌された組換え産物を含有する濃縮された培養培地は、およそ３リットルの容量であった。組換え融合タンパク質の単離と組換えペプチドの精製を行うために、濃縮された培地の処理を下記実施例４に従って行った。実施例３細胞内組換え産物を発現している細胞からの包含体の単離 Asp-Proペプチド結合によって相互連結されているBone D及びBPI由来ペプチドを含む融合タンパク質を発現させるために実験を行った。Bone DとBPI由来ペプチドとの融合タンパク質の発現のために、実施例２に記載のとおりに（例えば、 pING3353）培養された大腸菌からの細胞ペーストを、100 mMトリスHCl、 pH8.0 、5mM EDTA中に再懸濁し（7mL/gペースト）、そして１０分間インキュベートした。リゾチーム（100 mMトリスHCL pH8.0、5mM EDTA中に10 mg/mL）を添加して1 0 mg/g細胞ペーストの最終濃度となるようにし、これを溶菌が起こるまで（すなわち、溶液が非常に粘稠になるまで）氷上でインキュベートした。溶菌は、典型的には約１０分以内に起こった。SonicUソニケーター（B.Braun Biotech Inc.、 Allentown）ペンシルバニア州）をを使用し、最高の設定値にて３または４回、１０秒間のパルスで混合液を超音波処理した。22,000 gで４０分間遠心分離することにより、包含体をペレット化した。Triton X-100、次いで60 mM HCl、そして次に水を用いて一連の洗浄操作を行った。最初に、包含体ペレットは、100 mM トリスHCl、pH 8.0、５mM EDTA、１％Triton X-100に再懸濁し、次に22,000 gで４０分間遠心分離することによって洗浄した。次の洗浄は、さらに60mM HClそして水を用いて行った。各洗浄操作につき４℃にて、包含体の再懸濁は、Polytron （商標名、Brinkmann Instruments、Wastbury、ニューヨーク）を用いて行った。酸洗浄は、包含体ペレットからリゾチームを除去するために行った。組換えペプチドが遊離することはなく（すなわち、HClで包含体ペレットを洗浄した後に上清またはペレットに出現することがなく）、酸洗浄の条件が充分に穏やかであるために、融合タンパク質のAsp-Pro結合の切断が起こらなかったことが示唆された。酸の代わりに水で包含体ペレットを洗浄しても、リゾチームが除去されることはなかった。 10〜20％のトリシンゲル（Novex、San Diego、カリホルニア州）を使用して、 SDS-PAGEによって試料を分析した。還元剤を含むSDS負荷用緩衝液中で５分間煮沸することにより、試料を調製した。Shimadzu自動インジェクター及びVydac C1 8（#218TP54）カラムを備えたBeckmanの装置を使用し、HPLCによっても試料の分析を行った。溶媒Ａは10％アセトニトリル／0.05％TFAで、溶媒Ｂは90％アセトニトリル／0.05％TFAであった。229 nmでペプチドを検出しながら、1mL/分の流速で２０分間にわたって、18〜40％の溶媒Ｂの濃度勾配にてカラムクロマトグラフィーを行った。 Bone D及びペプチドの融合タンパク質は、その接合部にAsp-Pro結合を有し、しかして酸での処理に伴って遊離されうるのである。アスパラギン酸の残基のペプチド結合は、希酸中で他のペプチド結合よりも少なくとも１００倍の速度で切断されえ、そしてアスパラギン酸−プロリンの結合はアスパラギン酸のペプチド結合のうち最も不安定なものである。この反応が融合タンパク質に対して有効であるために包含体が可溶化される必要があるか否かは不明であった。可溶化せずとも包含体に対して酸が有効であり、そして融合タンパク質のAsp-Pro結合が切断されたとしても、フリーのペプチド及び／またはBone Dタンパク質が可溶性になるか否かは不明であった。包含体ペレットの加水分解は、30 mMまたは60 mM HClで行ったが、包含体の酸洗浄よりも長時間にわたりさらに高温で実施した。融合タンパク質のAsp-Pro結合を切断してフリーのペプチドを遊離させるのに充分な温度及びインキュベーション時間の条件は、以下の実験によって決定した。 Asp-Pro結合の完全な切断を成し遂げるために、様々な条件を調べた。60 mM H Clを使用し55℃にて、４８時間までに完全な切断が起こった。このことは、SDS- PAGE分析から明らかであり、４８時間後に融合タンパク質のバンドはほとんど消失し、それはBone D及びペプチドのバンドに変換されていた。試料をSDS-PAGEによって分析し、そして酸加水分解後のペレットから得られたゲルによる結果は、 Bone Dタンパク質が驚くべきことに60mM HCl処理の後にも不溶性のままであることを示していた。この結果は、切断されたペプチドの酸上清からの単離が許容されることであるので有利なものであった。特に、酸加水分解後に行った上清のSD S-PAGE分析より、不溶性融合タンパク質からの切断後にペプチドが上清中に溶解していることが明らかになった。包含体ペレットを前記のようにリゾチームを除去するために酸で洗浄しない場合には、SDS-PAGEによつて包含体ペレット中に14 kDのリゾチームのバンドが観察された。 SDS-PAGE分析により、酸加水分解の際に上清中に時間に依存してペプチドが生成することが明らかになった。融合タンパク質中のAsp-Pro結合の完全な加水分解に必要とされる時間を減ずる試みにおいて、さらに高い温度を用いた。60 mM HClを使用して、85℃にてペプチドを所定時間にわたり遊離させた。SDS-PAGEによって分析したところ４時間後の試料中に融合タンパク質は存在していなかったので、反応は２時間と４時間の間に完了した。上清中へのペプチドの蓄積を所定時間にわたり観察したが、２時間後には、おそらくペプチドの加水分解及び／またはデアミデーションのためにペプチド濃度のわずかな低下が観察された。酸加水分解は、高温で、但しより低いHCl濃度の30mMでも実施した。85℃におけるこれらの条件下で、反応は４時間で完遂した。SDS-PAGE分析によれば、４時間で融合タンパク質は存在していなかった。６時間までに、ペプチド濃度は低下し始め、これはおそらくはペプチドの加水分解及び／またはデアミデーションのためであると考えられた。図１に、様々な温度での、所定時問にわたるAsp-Proペプチドリンカーの酸不安定性を示す。図２には、融合タンパク質の加水分解についてのアレニウス・プロットを示し、これは加水分解速度が温度に比例していることを立証したものである。 85℃にて30 mM HClを用い、様々な重量／容量濃度の包含体を使用して、融合タンパク質の、包含体からの完全な酸切断に要する条件を調べるために、さらなる実験を実施した。大規模での方法のためには、高い重量／容量濃度の包含体を使用できることが望ましかったが、しかしながら、前記の実験において、及び全く異なる組換え融合タンパク質［REF］を用いて以前に公開された実験においては、切断のために使用した最高の重量／容量濃度はそれぞれ10％（すなわち、10 g湿潤重量／100 mL容量）及び6％（すなわち、6g/100 mL）であった。図３に示される結果より、85℃にて４〜６時間で10％重量／容量を用いた場合に最高の切断が成し遂げられるが、包含体の重量／容量濃度を20％、30％及び50 ％に増加すると、反応速度が有意に低下することが立証される。特に、30％及び 50％の濃度では、包含体の加水分解によって、ほとんどまたは全く、ペプチドは遊離されなかった。酸で処理された各々の包含体懸濁液のpHを測定すると、懸濁液のpHが劇的に変化していることが判った（酸で処理された、10％、20％、30％及び50％の包含体懸濁液それぞれに対し、pH 2.6、3.7、4.4及び5.1）。 pHの変化が遊離の減少の原因であるか否かを調べるために、そしてそれが原因ならば完全な加水分解を成し遂げるために30mM、 60 mMまたは90 mM HClを使用し、30％の包含体懸濁液を用いてさらなる実験を実施した。図４に示すように、 60 mM及び90 mM HClで処理した懸濁液で、最高のペプチド遊離が成し遂げられた。30 mM、 60 mM及び90 mMで処理された懸濁液のpHは、それぞれ3.5、2.4及び1. 5であった。これらの実験の結果は、包含体の低pH懸濁液を得て、これを維持することが、最高のペプチド切断及び遊離を成し遂げるために重要であるということであった。酸分解のために現在のところ好ましい条件には、10％重量／容量濃度を上回る、好ましくは30％の懸濁液を使用して、濃塩酸でpH 2.2に滴定することが包含される。ペプチドの遊離のため、効率の良い完全な加水分解を行うには、2.6以下の一定のpHを維持して行うことが重要であること、高い重量／容量濃度（すなわち、10〜50％を上回る）の包含体を日常的に用いて良好に処理されうことが見出された。大腸菌からの組換えペプチドの精製のために、３つのカラム分離工程を利用して充分に低レベルの不純物（例えば、タンパク質、内毒素、及びDNA）のものが得られた。しかしながら、最初の実験では、いくらかのペプチドを含む沈殿物が形成された。この沈殿は、５Mの尿素を添加することによって回避することができた。精製方法を開発するための初期の試みでは、30 gの細胞ペーストを用いた。第１工程にSPセファロースを選択した。第２工程として、疎水性相互作用樹脂のブチルセファロースを選択した。スペルデクス30 （Superdex 30、Pharmacia）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーを最終工程として選択した。表１に示すように、全体としての回収率は10.7％であり、ロスほとんどがSPセファロース工程で生じていた。この精製より単離されたペプチドの質量スペクトル分析より、予測された質量（3735.7）に一致する質量（3735）が示され、完全なアミノ及びカルボキシル末端を有することが示唆された。精製されたペプチドの抗微生物活性を、実施例５に記載のとおりにアッセイし、活性であることが見出された。さらなる実験の結果に基づき、5 M尿素中での限外濾過工程とその後のCMセファデックスカラムを採用して、30 gの細胞ペーストを用いた精製方法について調べた。表２に示すように、この精製スキームに対する回収率は31％であった。ロスのほとんどが濾過工程で生じていた。 Asp-Proペプチド結合によって連結された、BoneDとBPI由来ペプチドの複数反復体とを含む融合タンパク質を発現するために、さらなる実験を行った。これらの実験のためには、35リットルの容器での発酵バッチ５つ分を生育し、各々が異なる融合タンパク質を生産していた。詳細には、５つの発酵バッチは、p1NG3796 （単一ペプチド構築体）、pING3359（２つのペプチド構築体）、pING3361（３つのペプチド構築体）、pING3360（４つのペプチド構築体）及びpING3362（５つのペプチド構築体）のプラスミドを含み、しかして各バッチでペプチド単位数を増加させて、実施例２に記載のとおりの大腸菌E104細胞の35 Lファーメンターにて生育した。実験では、各発酵バッチからの１グラムの細胞ペーストをリゾチーム／EDTAで溶菌し、次いで前記のとおりに超音波処理を行った。包含体は、遠心分離によって単離し、そして 30 mM HCl中に85℃にて3.5時間懸濁した。上清に含まれるペプチドを、HPLCによって定量した。各発酵バッチから二検体のアリコートについて分析した。図５に示す結果より、４つのペプチド反復単位を有するpING3360からの産物が、最も収率がよいことが明らかになった。前記の、発酵バッチにおける機械的概要（description）を、リゾチーム／EDT Aの後に超音波処理を用いる本実施例３に記載の方法に取って代わる方法について精査した。細胞破壊のための機械的な方法は、大規模での適用にきわめて好適であるので、大規模の細胞溶菌ののためにMicrofluidizer（商標名、Microfluid ics International Corporation、Newton、マサチューセッツ州、モデルM-ll0Y ）の使用について精査した。この装置を用いると、高速でミクロチャンネルを通過する空気圧によって産物が駆動せしめられる。処理流路（process stream）は分かれているが、次いで再結合して細胞の衝突を許容する。その結果生じる剪断力及びキャビテーション力が、細胞を破壊する。単流を用いて、95％を越える溶菌が成し遂げられた。処理時間は10％の懸濁固形物の濃度の再懸濁細胞ペースト 10リットルにつき、約３０分間であった。包含体を、11,000 gで１時間遠心分離することにより単離した。アスパラギン酸・プロリン結合の完全な加水分解を、５つの発酵バッチの各々から得た包含体を30 mM HCl中に懸濁し（10％、重量／容量）、そして前記のとおりに85℃にて４〜５時間インキュベートすることによって成し遂げた。あるいは、包含体を水に再懸濁した後、次いで酸を添加することもできた。遊離されたペプチドは水性の環境において可溶性であった。溶液を緩衝化するよう、クエン酸ナトリウムを添加することによって酸加水物を中和し、次いでNaOHを添加してpHを6.0に調整した。この機械的概要方法を使用すると、リゾチーム／EDTA/超音波処理法で認められたような酸加水分解後の中和に伴う沈降物は観察されなかった。その後の精製工程により、酸加水物中の多くの大腸菌タンパク質による不純物が除去された。精製方法における２種のカラムに対する至適な溶出条件を調べるために実験を行った。CMセファロースカラムについては、試料を負荷し、pH 3.0の10 mMクエン酸塩緩衝液中、NaClの濃度を増加させてカラムを段階的な溶出に付した。ほとんどのペプチドは、40 mM NaClで溶出し、少量のペプチドが80 mM NaClで溶出した。従って、CMセファロースに対する溶出用緩衝液は、10 mMクエン酸塩、80 mM NaCl pH 3.0を選択した。ブチルセファロースカラムに対する溶出条件も、同様の実験によって決定した。ペプチドを負荷したブチルセファロースカラムは、pH 7.0の10 mMリン酸ナトリウム緩衝液中、硫酸アンモニウムの濃度を減少させて段階的な溶出に付した。比較的純粋なペプチドが、硫酸アンモニウム濃度を1.1Mに下げると溶出された。0.8M硫酸アンモニウムでは、不純物がペプチドと共に溶出され始めた。これらの実験では、純粋なペプチドを得るために至適な硫酸アンモニウム濃度は、0.8Mと1.1Mの間であった。これらの至適な溶出条件を用いて5グラムの包含体からペプチドを溶出した場合、SDS-PAGE分析により、酸加水分解後のペレットは主としてBone Dを含んでおり、融合タンパク質はほとんど含まれていないことが明らかになったので、加水分解がほぼ完全に成し遂げられたことが判った。酸加水分解物中には、多くのタンパク質不純物が存在していた。CMセファロースで、かなりの精製が行われ、ブチルセファロースの後には、SDS-PAGEによって検出されうるタンパク質不純物のバンドは存在しなかった。 Shimadzu自動インジェクター及びC18 （Vydac）#218TP54）逆相カラムを備えたBeckmanの装置を使用し、HPLCによっても純度の評価を行った。溶媒Ａは10％アセトニトリル／0.1％TFAで、溶媒Ｂは90％アセトニトリル／0.1％TFAであった。１mL/分の流速で２０分間にわたって、15〜35％の溶媒Ｂの濃度勾配にてC18カラムクロマトグラフィーを行った。229 nmでペプチドを検出した。ペプチドのデアミデーション型が、およそ5％のレベルで酸上清中に存在し、それは精製工程によって除去されなかった。表３に示すように、CMセファロース及びブチルセファロース後の回収率は、それぞれ87.2％及び43.5％であった。この方法によって大腸菌から単離された組換えペプチドの試験を、実施例５に記載するとおりに行い、比較対照の合成ペプチドと同様に放射拡散アッセイで活性であることが見出された。精製プロセスをさらに改善するための試みにおいて、さらなる実験でブチルセファロースに置き換えることができる樹脂を選択した。CMセファロース溶出物を、Source逆相樹脂（Pharmacia）カラムに付し、次いでアセトニトリル濃度を増加させる濃度勾配で溶出した。ペプチドのピークを単離し、減圧遠心分離装置にて蒸発させることによって溶媒を除去した。試料を緩衝液中に再懸濁し、SDS-PA GE及びHPLCによって純度を評価した。純度はブチルセファロースカラムを用いて得られたものに匹敵し、なおかつ収率は向上していた。このカラム工程における収率は98％であって、ブチルセファロースかラムに比べてかなり改善されていた。実施例４細菌宿主細胞培養培地からの、分泌された融合タンパク質の単離及び組換えペプチドの精製ペプチド−ゲロニン融合タンパク質をコードするpING3797を含む大腸菌E 104 細胞を、実施例２に記載のとおりにファーメンターにて生育した。分泌された融合タンパク質を、細胞生育の後に大腸菌発酵ブロスから単離した。発酵ブロスを細菌細胞より分離し、そして無細胞発酵ブロスを濃縮して、実施例２に記載したとおりにS10Y10 Amiconカートリッジを備えたDC 10を用いて10 MMリン酸ナトリウムpH 7.0に透析濾過した。濃縮された培養培地は、およそ３リットルの容量であった。透析濾過されたものを、10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0に平衡化したC Mセフアロース・ファスト・フロー（Pharmacia） Uppsala）スウェーデン）のカラムに負荷した。カラムを10 mMリン酸ナトリウムで平衡化し、400 m M NaCl、 pH 7.0で融合タンパク質を単離した。ゲロニン−ペプチド融合タンパク質は、およそ70％の純度であり、実施例５に示す放射拡散アッセイで活性であることが認められた。最終的なHCl濃度が30 mMとなるように、CMセファロースの溶出液に濃塩酸を添加した。試料を85℃にて３時間インキュベートし、次いで500 mMクエン酸ナトリウムを最終濃度が15 mMとなるように添加することによって中和した。形成された沈降物を遠心分離によって除去し、その試料をさらにC18カラムでHPLCによって精製した。 1 mL/分の流速で２０分間にわたって、15〜35％の、90％アセトニトリル／0.05％TFAの濃度勾配にてペプチドを溶出した。ぺプチドのピークを単離し、Ｎ末端配列分析によってその同一性を確認した。精製されたペプチドの抗微生物活性は、以下の実施例５に記載される放射拡散アッセイによって調べた。実施例５組換えペプチドの抗微生物活性分析のための、放射拡散アッセイ本発明の組換え法によって、表４に列挙される配列（配列番号：１〜239）を含むものを包含する様々なBPI由来ペプチドを製造することができ、放射拡散アッセイにて、抗微生物活性（抗真菌及び抗細菌活性の双方）を調べることができる。最初に、組換えにより製造されたペプチドの抗真菌活性を放射拡散アッセイにて評価するために、実験を行った。これらの実験のため、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）PS6またはカンジダ・アルビカンス（Can dida albicans）SLU-1を、300 mM EDTA及び0.02％ Tween 20を加えた、1％アガロース中の1/100 Xサブロー・デキストロース・ブロス8 mLに、1 mL当たり１ｘ10⁶細胞数を添加した。混合液をプレートに注加し、固化した後に穿孔器によって3.5mM のウェルをつくった。試料を生理食塩水に希釈し、そして５μLの試料を各々のウェルに添加した。室温にて試料を３時間インキュベートし、次いでプレートに、300 mM EDTA及び0.02％Tween 20を加えた、1％アガロース中の２ Xサブロー・デキストロース・ブロス８ mLを重ねた。30℃にて２４時間インキュベートした後、阻害の領域を計算した。実施例３に記載のとおりに調製したペプチドは、このアッセイにおいて活性であることが見出された。実施例４に記載のとおりに調製した融合タンパク質はもまた、このアッセイにおいて活性であること見出された。組換えによって製造したペプチドの抗細菌活性を評価するために、放射拡散アッセイで大腸菌J5または大腸菌E104細胞を用いてさらなる実験を行った。これらの実験のため、大腸菌J5の培養物は、TYEブロス（１リットル当たり15gトリプトン、10g酵母抽出物、5gNaClを含む）中で終夜生育し、次いで、TEAブロス培地中で中間対数増殖期にまで生育した（Simonら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.(USA)、51巻、877〜883頁(1964)）。栄養ブロス（普通ブイヨン）を含有する、溶融した0.8 ％アガロースに、大腸菌J5細胞を2〜3ｘ10⁵細胞数/mLにて添加した。0.15M NaCl で、ペプチドの連続的な希釈液を調製した。希釈されたペプチドの５μlを、または対照として生理食塩水のみを、固化したアガロース中につくった３mmのウェルに添加した（５μ1/ウェル）。乾燥を防止するためにパラフィルムでプレートを密封し、37℃にて２４時間インキュベートした。阻害ゾーンを測定し、3 mmのウエルと阻害ゾーンとにわたる領域から、3 mmのウェルを含む領域を差し引くことによって、阻害の純領域を決定した。組換えにより製造したペプチドを、抗細菌活性についてアッセイし、それと同等物たる合成ペプチドの結果を比較する。以下の表４に示す配列を有する合成ペプチド、XMP. 13、XMP.284、XMP.353、XMP.366、XMP.406及びXMP.407を、抗細菌活性についてアッセイした。ペプチドXMP.284は、最高の抗細菌活性を呈し、次いで、XMP.13 、XMP.391、XMP.366、XMP.353、XMP.406そしてXMP.407が最低の殺細菌活性を呈した。合成ペプチドのXMP.406及びXMP.407は、実施例１、第７節及び実施例３に記載される、コードされた融合タンパク質から調製されたペプチドと同じ配列を有している。pING3353より調製された組換えペプチド（実施例１及び３）は、このアッセイにおいて活性であることが見出された。実施例６組換えペプチドのさらなる生物学的活性についてのアッセイ組換え法によって製造したペプチドの内毒素結合及び中和活性を評価するために、共有であり係属中の米国特許出願第08/372,105号及びW095/19179号（PCT/US 95/00498号）（引用することによりその全体を本明細書に組み入れることとする）に記載のごとき、RAW細胞に基づくアッセイ（例えば、実施例７を参照されたい）を含めたアッセイを使用して、さらなる実験を行う。組換え法によって製造したペプチドのヘパリン素結合及び中和活性を評価するために、米国特許第5,348,942号ならびに共有であり係属中の米国特許出願第08/ 306,473号及びW095/19372号（PCT/US94/10427号）（引用することによりその全体を本明細書に組み入れることとする）に記載のごとき共有のアッセイ法における、TCT凝血を含めたアッセイを使用して、さらなる実験を実施する。如上の開示内容は、本発明のある特定の実施態様を重点的に述べたものであるが、それらに対してあらゆる修正や改変を施した均等物が、添付の請求の範囲に示される本発明の範囲に入ることが理解されるべきである。特に、当業者であれば、本発明の好ましい実施態様についての前記記載を考慮して、多くの修正や変更を想起することが予測される。よって、本発明の範囲に課されるべき限定は、添付の請求の範囲によるもののみとすべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．組換えDNAベクター構築体であって、以下の配列、すなわち、（ａ）少なくとも１つの陽イオン性BPIペプチドをコードしいてるDNA配列；（ｂ）キャリアタンパク質をコードしているDNA配列；及び（ｃ）配列（ａ）と（ｂ）との間に位置する、アミノ酸切断部位をコードしているDNA配列を有する、融合タンパク質に対するコード配列を含む、細菌宿主へ導入するのに好適な組換えDNAベクター構築体。２．融合タンパク質に対するコード配列が、5'-（ｂ）-（ｃ）-（ａ）-3'である請求の範囲第１項記載のベクター構築体。３．コードされるBPIペプチドが、殺細菌性を有する請求の範囲第１項記載のベクター構築体。４．コードされるBPIペプチドが、殺真菌性を有する請求の範囲第１項記載のベクター構築体。５．コードされるBPIペプチドが、内毒素結合性である請求の範囲第１項記載のベクター構築体。６．コードされるBPIペプチドが、ヘパリン結合性である請求の範囲第１項記載のベクター構築体。７．コードされるキャリアタンパク質が、陽イオン性キャリアタンパク質である請求の範囲第１項記載のベクター構築体。８．陽イオン性キャリアタンパク質が、ゲロニン及びヒト骨形成タンパク質のＤサブユニットよりなる群から選択される請求の範囲第１項記載のベクター構築体。９．前記構築体が、融合タンパク質のアミノ末端で細菌性分泌リーダー配列をさらにコードする請求の範囲第１項記載のベクター構築体。１０．コードされるBPIペプチドが、配列番号：１〜239のペプチドである請求の範囲第１項記載のベクター構築体。１１．コードされるアミノ酸切断部位が、Asp-Pro、 Met、Trp及びGluをコードするコドンの群より選択される、請求の範囲第１項記載のベクター構築体。１２．請求の範囲第１項記載のベクター構築体で形質転換された、細菌宿主細胞。１３．請求の範囲第１２項記載の大腸菌宿主細胞。１４．陽イオン性BPIペプチドの、細菌での製造のための方法であって、以下の工程、すなわち、（ａ）融合タンパク質の発現を許容する条件下に、請求の範囲第１２項記載の形質転換された細菌宿主細胞を培養し、（ｂ）発現された融合タンパク質を単離し、（ｃ）陽イオン性BPIペプチドを遊離させるために、発現された融合タンパク質を切断し、及び（ｄ）陽イオン性BPIペプチドを単離する工程を含む方法。１５．陽イオン性BPIペプチドの、細菌での製造のための方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）融合タンパク質の発現を許容する条件下に、請求の範囲第１２項記載の形質転換された細菌宿主細胞を培養し、（ｂ）陽イオン性BPIペプチドを遊離させるために、発現された融合タンパク質を切断し、及び（ｃ）陽イオン性BPIペプチドを単離する工程を含む方法。１６．請求の範囲第１４項記載の方法で製造された、陽イオン性BPIペプチド産物。１７．請求の範囲第１５項記載の方法で製造された、陽イオン性BPIペプチド産物。１８．融合タンパク質の、細菌での製造のための方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）融合タンパク質の発現を許容する条件下に、請求の範囲第１２項記載の形質転換された細菌宿主細胞を培養し、及び（ｂ）発現された融合タンパク質を単離する工程を含む方法。１９．請求の範囲第１８項記載の方法で製造された、融合タンパク質。