KR20230084992A - 세포 투과형 성장인자를 포함하는 세포 배양 또는 증식을 위한 조성물 - Google Patents

세포 투과형 성장인자를 포함하는 세포 배양 또는 증식을 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 투과형 성장인자를 유효성분으로 포함하는 세포 배양, 증식을 위한 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin) 및 세포투과형 간세포성장인자(IntoCell-HGF) 융합 단백질 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포 배양, 증식 촉진, 이동 촉진 또는 상처 치유 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 융합 단백질 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin) 및 세포투과형-HGF(IntoCell-HGF)를 포함하는 조성물은 모발을 구성하는 세포의 증식을 촉진하면서 세포 이동능(migration)을 증대시키고 상처 치유를 촉진하는 효과를 가짐으로써 탈모 치료제의 핵심소재로 활용될 수 있다.

Description

세포 투과형 성장인자를 포함하는 세포 배양 또는 증식을 위한 조성물 {Composition for cell culture or proliferation comprising cell permeable growth factor}
본 발명은 세포 투과형 성장인자를 유효성분으로 포함하는 세포 배양 또는 증식을 위한 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin) 및 세포투과형 간세포성장인자(IntoCell-HGF) 융합 단백질 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포 배양, 증식 촉진, 이동 촉진 또는 상처 치유 촉진용 조성물에 관한 것이다.
모발은 피부 및 두피를 보호하는 일차적인 역할 뿐 아니라, 사회적 및 성적 의사소통에 있어서 고유의 역할을 하므로 매우 중요하다.
모발은 케라틴 단백질로 구성되어 있으며, 진피에 있는 모낭으로부터 발생하여 성장한다. 두피 모낭은 모유두세포, 각질형성세포주주, 내측 및 외측 모근초 세포, 및 멜라노사이트로 구성되어 있고, 이 중 모낭 모유두세포는 특수 섬유모세포의 하나로, 모낭 발생의 기초가 된다. 또한, 모낭 모유두세포는 모발 성장과 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있다.
탈모증이란 정상적으로 모발이 있어야 할 곳에 모발이 없는 상태를 말한다. 모발은 생명에 직접 관계되는 중요한 생리적 기능은 없지만 미용적인 관점에서 역할이 매우 크며 이외에도 자외선 차단, 머리 보호 등의 기능이 있다.
탈모인구의 증가로 탈모시장이 급성장하면서 탈모를 예방 및 치료하기 위한 제품들이 개발되고 있으며, 탈모치료의 근본적인 해결책은 탈모의 원인을 해결하는 것이다.
탈모증의 원인 중에서 남성호르몬 과잉 분비와 직접적인 관계가 있는 가장 흔한 유형은 남성형 탈모증(male pattern baldness)이라고 부르는 안드로겐성 탈모증(androgenic alopecia)이다. 남성형 탈모의 대표적인 원인으로 5-알파 환원효소(5-α-reductase)에 의해 생성되는 dihydrotestosterone(DHT)이 있다. 남성호르몬 중의 하나인 테스토스테론(testosterone)이 5-α-reductase에 의해 DHT로 전환되고, 이렇게 활성화된 DHT가 안드로겐 수용체(adrogen receptor)와 결합하여 모낭세포의 단백질 합성을 지연시키고, 세포괴사인자인 BMP, DKK-1, TGF-β를 생성시켜 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제해 탈모를 유발한다.
많은 연구들에서 DHT 합성을 억제시키는 노력이 진행되었으며, 그 대표적인 약물이 미국의 머크제약에서 시판하고 있는 프로페시아(Propecia)라는 치료제이다. 이 치료제의 주성분인 피나스테라이드(Finasteride)는 남성호르몬인 테스토스테론이 DHT로 전환되는 것을 억제하는 기작을 보여 준다. 프로페시아는 1997년 탈모증의 치료제로 미국의 FDA로부터 사용 승인을 받아 현재 시판 중이다. 그러나 복용 후 수개월이 지나서 효과가 나타나며, 미미하나마 성욕감퇴, 발기부전 등의 부작용이 있다는 단점을 갖는다. 또한, 남성만이 사용 가능하고 여성과 어린이에 있어서 안정성이 확립되어 있지 않으며, 임산부나 임신의 가능성이 있는 여성의 사용이 금지된다는 단점도 갖는다. 이외에도 탈모증의 치료나 예방에 있어서 가장 널리 사용되는 제제로서 미국의 파마시아사가 개발한 모발의 재성장을 촉진하는 약제로 FDA의 승인을 받은 탈모증 치료제인 미녹시딜(minoxidil)이 있다. 미녹시딜은 바르는 약으로 치료대상이 젊고, 기름기가 많고, 가마부위가 빠지는 경우에는 어느 정도 효과가 있으나 그 이외의 경우는 미미한 효과만 보일 뿐만 아니라, 접촉성 피부염이나 입안이 마르는 증상, 혈압강하, 현기증의 부작용이 보고되었다.
프로페시아 및 미녹시딜을 포함하는 종래 치료제의 여러 가지 부작용으로 인해 대체 발모제 연구가 활발히 진행되고 있으나 현재까지 실제 임상에서 두피에 작용하는 효과가 탁월한 대체제가 부재한 실정이다. 따라서 효과가 우수하며 부작용이 적은 여러 가지 다른 천연물질 및 펩타이드와 같은 바이오 소재의 발모제를 탐색하는 연구가 절실한 실정이다.
한편, 재조합 단백질 기술은 유전공학기술을 이용하여 고등생물에서 유래한 단백질을 미생물 및 동물세포에서 대량 발현시키는 기술이다. 단백질의 기능적 특성에 따라 미생물 및 동물세포에서 생산하는 공정기술이 응용되고 있으며, 이렇게 생산된 단백질은 제약, 화장품, 식품, 분석 및 진단 산업분야에 널리 사용되고 있다. 재조합 단백질 기반의 화장품 신소재의 경우, 주로 트러블성 피부질환을 대상으로 연구개발이 활발하다. 이러한 재조합 단백질 기술기반으로 생산된 성장인자를 탈모치료제에 적용하면 위의 탈모치료제의 부작용을 최소화 할 수 있을 것으로 기대된다.
하지만, 이러한 재조합 단백질들은 일반적으로 친수성이며, 거대한 분자들은 세포막이라는 장벽에 의해 세포 안으로 들어가는 것이 매우 어렵다. 세포막은 펩타이드나 단백질, 핵산과 같은 거대 분자가 세포 내로 들어가지 못하게 막으며 세포막 수용체에 의한 엔도사이토시스(Endocytosis)라는 생리적 기작을 통해 세포 내로 들어가더라도 세포의 리소좀(Lysosomal compartment)과 융합되어 결국 분해되므로 이들 거대분자 바이오 활성소재를 세포 외에서 전달하는 데 많은 제약이 따른다.
노긴(Noggin)은 모낭 자극 성장 인자로서 모모세포의 분화를 촉진하여 초기 모낭 생성을 개시하고 헤어전구세포의 증식 유도를 통해 모낭 형성과 성장을 촉진시키는 주요 생체 분자이다. Noggin은 모발 형성 초기 단계에서 성장기(anagen) 개시를 저해하는 BMP-2, BMP-4, BMP-7의 antagonist로 작용한다. BMP 단백질이 이들의 수용체에 결합하는 것을 방해하여 모발 주기의 휴지기 (telogen)에서 성장기(anagen)로의 전환을 유도하는 역할을 한다. 또한 TGF-β ligand에 결합하여 모발 퇴행 인자로 알려진 TGF-β의 신호 전달을 억제하고, 모낭 세포의 분화와 증식을 결정하는 Lef-1, β-catenin, neurotrophin receptor, alkaline phosphatase의 발현을 조절한다.
인간 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)는 혈관 신생, 세포 분열 및 형태 형성 등 다양한 기능을 가지는 단백질이다. 특히 HGF는 피부 진피 층의 모유두 세포에서부터 분비되는 인자로써 모유두 세포와 상피 케라틴모세포 사이의 상호작용을 조절하고, 모발 강화 인자의 발현을 촉진시키는 모낭 줄기세포 증식 인자로 알려졌다. HGF는 모발 생산 유도자인 β-catenin을 상피 모낭 줄기세포의 핵으로 유입시키는 작용을 하고, β-catenin 발현을 증가시켜 모낭의 성장을 촉진시킨다. 뿐만 아니라 모낭 형태 생성을 가속화하여 성장기(anagen)에서 퇴행기(telogen)로의 진행을 지연시키고, 휴지기의 모포를 성장기로 유도하여 모발 성장 주기 조절에 주요 역할을 하는 단백질이다.
그러나 이런 성장인자들은 친수성이며 분자량이 커서 세포막을 투과하여 피부에 흡수되는데 한계가 있기 때문에 실질적인 활성효과를 기대하기는 어렵다. 이러한 한계를 극복하기 위해 최근 새로운 대안들이 제시되고 있으며 그 중 세포 투과형 펩타이드(Cell penetrating peptide, CPP)들은 현재까지 낮은 세포막 투과성 및 빠른 생체 내 반감기로 인해 약물로 사용하기 어려웠던 치료용 단백질 및 유전자와 같은 거대 분자들의 의약학적 이용가치를 높일 수 있을 것으로 기대되고 있다. 이렇듯 CPP를 이용하여 세포 내 효율적 수송을 위한 다양한 응용이 시도되었으나, 아직까지 세포 투과형 펩타이드와 성장인자들을 결합시켜 탈모 치료제의 핵심소재로 활용하는 연구는 드물었다.
이러한 배경 하에서, 종래 치료제의 부작용을 방지하고 탈모방지 또는 발모개선에 효과를 부여하는 성장인자와 세포 투과형 펩타이드를 결합시켜 탈모 치료제의 핵심소재로 개발 하고자 노력한 결과, 본 발명의 연구자들은 모발을 구성하는 인간 모유두 세포의 증식을 촉진하면서 세포 이동능(migration)을 증대시키는 조성물을 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2021-0131598호
본 발명의 일 예시적 목적은 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 세포 배양을 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 세포 증식 또는 이동 촉진을 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진을 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 상처 치유를 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 피부 재생을 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 세포 배양을 위한 조성물을 이용하여 세포를 배양하는, 세포 배양 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 세포 투과형 성장인자를 포함하는 세포 배양 또는 증식을 위한 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 세포투과형 성장인자인, "세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin) 융합 단백질", "세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질"을 포함하는 세포 증식 또는 이동 촉진을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "세포투과형-노긴 융합 단백질"은 세포투과형 펩타이드와 노긴(Noggin)의 융합 단백질을 의미하며, "세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질"은 세포투과형 펩타이드와 간세포성장인자의 융합 단백질을 의미한다. 일 예시로, 세포투과형-노긴 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하며, 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF) 융합 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 3:
VSRRRRRRGGRRRRQHYLHIRPAPSDNLPLVDLIEHPDPIFDPKEKDLNETLLRSLLGGHYDPGFMATSPPEDRPGGGGGAAGGAEDLAELDQLLRQRPSGAMPSEIKGLEFSEGLAQGKKQRLSKKLRRKLQMWLWSQTFCPVLYAWNDLGSRFWPRYVKVGSCFSKRSCSVPEGMVCKPSKSVHLTVLRWRCQRRGGQRCGWIPIQYPIISECKCSC
서열번호 5:
VSRRRRRRGGRRRRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQSH
본 발명의 용어 "세포 투과형 펩타이드(Cell Penetrating Peptides: CPP)"는 약 10개 내지 60개 정도의 짧은 펩타이드로 이루어진 세포막 투과성 펩타이드로 세포막을 손상시키지 않으면서 세포 내로 이동하고, 세포막을 통과하지 못하는 DNA나 단백질을 세포 내로 전달할 수 있는 펩타이드를 의미한다. 세포 투과형 펩타이드는 그 종류에 크게 제한됨이 없으나, 바람직하게는, TAT, 페너트라틴(penetratin), Antp(antennapedia protein), 또는 저분자 프로타민(Low molecular weight protamine, LMWP)으로 이루어진 군에서 하나 이상일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 세포 투과형 펩타이드는 저분자 프로타민(Low molecular weight protamine, LMWP)인 것일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과형 펩타이드인 저분자 프로타민(Low molecular weight protamine, LMWP)은 프로타민의 일 부분으로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드일 수 있다.
서열번호 1: VSRRRRRRGGRRRR
본 발명의 용어 "세포투과형"은 세포 투과 펩티드와 생물학적 또는 약제학적 활성을 가지는 물질이 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합으로 연결되어 있는 상태를 의미한다.
본 발명의 용어 "노긴(Noggin)"은 모낭 자극 성장 인자로서 모모세포의 분화를 촉진하여 초기 모낭 생성을 개시하고 헤어전구세포의 증식 유도를 통해 모낭 형성과 성장을 촉진시키는 주요 생체 분자를 의미한다. Noggin은 모발 형성 초기 단계에서 성장기(anagen) 개시를 저해하는 BMP-2, BMP-4, BMP-7의 antagonist로 작용한다. BMP 단백질이 이들의 수용체에 결합하는 것을 방해하여 모발 주기의 휴지기(telogen)에서 성장기(anagen)로의 전환을 유도하는 역할을 한다. 또한 TGF-β ligand에 결합하여 모발 퇴행 인자로 알려진 TGF-β의 신호 전달을 억제하고, 모낭 세포의 분화와 증식을 결정하는 Lef-1, β-catenin, neurotrophin receptor, alkaline phosphatase의 발현을 조절한다.
본 발명의 용어 "간세포성장인자(HGF)"는 혈관 신생, 세포 분열 및 형태 형성 등 다양한 기능을 가지는 단백질을 의미한다. HGF는 피부 진피 층의 모유두 세포에서부터 분비되는 인자로써 모유두 세포와 상피 케라틴모세포 사이의 상호작용을 조절하고, 모발 강화 인자의 발현을 촉진시키는 모낭 줄기세포 증식 인자로 알려졌다. HGF는 모발 생산 유도자인 β-catenin을 상피 모낭 줄기세포의 핵으로 유입시키는 작용을 하고, β-catenin 발현을 증가시켜 모낭의 성장을 촉진시킨다. 뿐만 아니라 모낭 형태 생성을 가속화하여 성장기(anagen)에서 퇴행기(telogen)로의 진행을 지연시키고, 휴지기의 모포를 성장기로 유도하여 모발 성장 주기 조절에 주요 역할을 하는 단백질이다.
본 발명의 용어 "융합 단백질"은 수송도메인 및 한 개 이상의 목적 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목적 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다. 또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다. 본 발명의 "융합 단백질"은 세포 투과형 펩타이드와 생물학적 또는 약제학적 활성을 가지는 물질이 화학적 물리적 공유 또는 비공유 결합으로 연결된 물질을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 생물학적 또는 약제학적 활성을 가지는 물질이란 생체 내의 생리현상을 조절할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 지방, 탄수화물 및 화합물(chemical compound), 또는 형광표지물질 등을 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 단백질로 노긴(Noggin) 또는 간세포성장인자(HGF)를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질의 제조는 유전자 재조합 방법으로 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin) 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF) 융합 단백질을 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 모유두 세포, 각질형성세포, 피부섬유아세포, 멜라닌형성세포 또는 모낭 줄기세포일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로, 본 발명은, 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 세포 증식 또는 이동 촉진을 위한 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로, 본 발명은, 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진을 위한 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로, 본 발명은, 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 상처 치유를 위한 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로, 본 발명은, 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 피부 재생을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "세포투과형-노긴 융합 단백질", "세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질"에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로, 본 발명은, 신규 "세포투과형-노긴 융합 단백질"또는"세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질"을 제공한다. 일 예시로, 세포투과형-노긴 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하며, 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF) 융합 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건(stringent conditions) 하에서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 99%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 본 발명에 있어서, 세포 투과형 펩타이드와 성장인자를 융합한 후, 발현 벡터에 삽입하여 융합 단백질 형태로 얻을 수 있으며, 여기에 사용될 수 있는 발현 벡터로는, 예컨대 대장균(E.coli) 발현 벡터인 pBF-01(+), pET21 벡터 등이 가능하나, 종래 이용되는 발현 벡터라면 크게 제한됨이 없이 이용 가능하다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 단백질 발현용 숙주세포를 제공한다.
상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있다. 원핵세포로는, 예를 들어, E.coli JM109, E.coli BL21, E.coli RR1, E.coli LE392, E.coli X1776, 및 E.coli W3110 등이 있다. 진핵세포로는, 예를 들어, 효모(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 숙주세포로 E.coli BL21이 이용될 수 있다.
상기 재조합 벡터의 숙주세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 진핵세포인 경우, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질전환된 숙주세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당해 기술 분야에 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 상기 숙주세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 대규모 세포 배양일 수 있으며, 세포 배양 방법은 통상적으로 사용 되는 세포 배양법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 배양 방법은 이로 한정되는 것은 아니지만, 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법(repeated batch culture), 유가 배양법(fed-batch culture), 반복 유가 배양법(repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법(perfusion culture)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수하는 단계는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 분리 및 정제방법을 통해 수행할 수 있다. 통상적으로 세포 조각(cell debris), 배양 불순물 등을 제거하기 위하여 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올, 이소프로필 알콜 등을 이용한 단백질 분획 침전) 등을 수행할 수 있고, 투석, 및 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 등을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 아미노산류, 비타민류, 및 무기염류 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아미노산류는 L-글루탐산(L-Glutamine), 리신(Lysine)·HCl, 이소류신(Isoleucine), 류신(Leucine), 티로신(Tyrosine)·2Na·2H2O, 발린(Valine), 트레오닌(Threonine), 아르기닌(Arginine)·HCl, 시스틴(Cystine)·2HCl, 페닐알라닌(Phenylalanine), 히스티딘(Histidine)·HCl·H2O, 세린(Serine), L-시스틴(Cystine), 글리신(Glycine), 메티오닌(Methionine), 트립토판(Tryptophan), 프롤린(Proline), L-아스파라긴(Asparagine)·H2O, L-글루탐산(Glutamic acid), L-아스파틱산(Aspartic acid), L-알라닌(Alanine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 비타민류는 미오-이노시톨(myo-Inositol), 엽산(Folic Acid), 티아민(Thiamine)·HCl, D-판토텐산(Pantothenic Acid)·
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Ca, 피리독신(Pyridoxine)·HCl, 피리독살(Pyridoxal)·HCl, 니아신아미드(Niacinamide), D-Ca-판토텐산염(Pantothenate), 비타민(Vitamin) B12, 리보플라빈(Riboflavin), 아스코르브산(Ascorbic acid), 비오틴(Biotin) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무기염류는 NaCl, NaHCO3, KCl, CaCl2, MgSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, MgCl2, CuSO4으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 Na-피로베이트(Pyrovate), 시토신(Cytosine), 구아노신(Guanosine), 티민(Thymine), 타우린(Taurine), D-글루코스(Glucose), 조효소(Coenzyme) A, NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide), 다이소듐 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(Disodium Flavine Adenine Dinucleotide), 리포산(Lipoic Acid), 리놀레산(Linoleic Acid) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
이러한 아미노산류, 비타민류, 무기염류 등을 더 포함함으로써, 우수한 세포 증식 촉진, 이동 촉진, 상처 치유 촉진, 나아가 피부 재생, 발모, 육모 촉진, 탈모 예방 등의 효과를 가질 수 있으며, 세포 배양 조성물로써도 우수한 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 상기 예시된 21종류의 아미노산류, 11종류의 비타민류, 9종류의 무기염류, 11종류의 기타성분류를 더 포함할 수 있으며, 상기 세포투과형 융합단백질인 IntoCell-Noggin 및 IntoCell-HGF와 시너지 효과를 가짐으로써 세포 증식 촉진, 이동 촉진 또는 상처 치유 촉진의 효과를 더욱 증진시킨다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 상기 예시된 아미노산류들 중 14종류의 아미노산류, 7종류의 비타민류, 6종류의 무기염류를 더 포함할 수 있으며, 2세포투과형 융합단백질인 IntoCell-Noggin 및 IntoCell-HGF와 시너지 효과를 가짐으로써 세포 증식 촉진, 이동 촉진 또는 상처 치유 촉진의 효과를 더욱 증진시킨다.
본 발명의 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물 또는 의약외품 조성물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성 물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 조성물이 제조되는 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위 (얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물 또는 조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따른 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 '대한민국약전'을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비자연적 담체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 약학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 인간인 경우가 바람직할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 일 구체예로 내복용 제제를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 세포를 배양하는 세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 모유두 세포, 각질형성세포, 피부섬유아세포, 멜라닌형성세포 또는 모낭 줄기세포일 수 있으며, 세포 배양 방법은 하기의 실시예에 제시된 방법을 참고하되, 종래 공지된 세포 배양 방법을 참고하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin) 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF) 융합 단백질를 포함하는 조성물은 모발을 구성하는 세포의 증식을 촉진하면서 세포 이동능(migration)을 증대시키고 상처 치유를 촉진하는 효과를 가짐으로써 탈모 치료제의 핵심소재로 활용될 수 있다.
도 1은 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)의 affinity chromatography를 이용한 정제 결과이다.
도 2는 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)의 SDS-PAGE 분석법에 의한 순도(%)를 확인한 결과이다.
도 3은 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF)의 affinity chromatography를 이용한 정제 결과이다.
도 4는 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF)의 SDS-PAGE 분석법에 의한 순도(%)를 확인한 결과이다.
도 5는 인간 모유두 세포에 대한 세포투과형 성장인자들과 조성물의 세포 증식 촉진 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 인간 각질형성세포주 HaCaT 세포에 대한 세포투과형 성장인자들과 세포 증식 촉진 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 각질형성세포주 HaCaT 세포에 대한 세포투과형 성장인자들과 조성물의 세포 이동 및 상처 치유 촉진 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 각질형성세포주 HaCaT 세포에 대한 세포투과형 성장인자들과 조성물의 세포 이동 및 상처 치유 촉진 효과를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포투과형-노긴 융합단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질의 제조
1.1 세포투과형-노긴 및 세포투과형-간세포성장인자 cDNA 및 발현벡터 제조
세포투과형 펩타이드(IntoCell Moiety)를 모발형성에 도움을 주는 2종의 인체 유래 성장인자들인 노긴(Noggin)과 간세포성장인자(HGF)와 융합하여, 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF)를 제조하였다. 표 1에 나타낸 아미노산 서열번호 3번 세포투과형-노긴 (IntoCell-Noggin)과 서열번호 5번 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF)를 재조합단백질로 생산하기 위하여, 해당 아미노산 서열들을 암호화하는 cDNA들을 발현벡터에 클로닝하여 재조합단백질로 생산하였다. 이를 위해 제한효소 NdeI와 XhoI의 제한부위(restriction sites)를 양 말단에 갖게 목적 유전자들의 합성을 수행한 후, 동일한 제한효소로 처리하였다. 대장균(E.coli) 발현 벡터인 pBF-01(+)를 동일한 제한효소들인 NdeⅠ와 XhoI으로 이중 절단(double digestion) 처리하여 클로닝 부위를 개방하고, 선형으로 정제하였다. 이렇게 얻어진 목적 단백질의 cDNA (insert cDNA)들과 발현벡터를 라이게이션(ligation)하여 클로닝 (cloning)하였다. 이렇게, 발현벡터에 분자생물학적 방법으로 클로닝함으로써, 표 1에 나타낸 아미노산 서열번호 3과 5의 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF)의 cDNA를 갖는 발현벡터를 확보하였다. 이를 외래 재조합단백질의 발현에 사용하는 BL21 계열의 대장균에 형질전환하여 발현 클론을 제조하였다.
서열번호 명칭 서열
1 세포투과형 펩타이드(IntoCell Moiety)의 아미노산 서열 VSRRRRRRGGRRRR
2 세포투과형 펩타이드(IntoCell Moiety)의 뉴클레오타이드 서열 GTGAGCCGTAGACGTAGACGTAGAGGTGGTCGTAGACGTAGA
3 세포투과형-노긴 (IntoCell-Noggin)의 아미노산 서열 VSRRRRRRGGRRRRQHYLHIRPAPSDNLPLVDLIEHPDPIFDPKEKDLNETLLRSLLGGHYDPGFMATSPPEDRPGGGGGAAGGAEDLAELDQLLRQRPSGAMPSEIKGLEFSEGLAQGKKQRLSKKLRRKLQMWLWSQTFCPVLYAWNDLGSRFWPRYVKVGSCFSKRSCSVPEGMVCKPSKSVHLTVLRWRCQRRGGQRCGWIPIQYPIISECKCSC
4 세포투과형-노긴 (IntoCell-Noggin)의 뉴클레오타이드 서열 GTGAGCCGTAGACGTAGACGTAGAGGTGGTCGTAGACGTAGACAGCACTATCTCCACATCCGCCCGGCACCCAGCGACAACCTGCCCCTGGTGGACCTCATCGAACACCCAGACCCTATCTTTGACCCCAAGGAAAAGGATCTGAACGAGAGCTGCTGCGCTCGCTGCTCGGGGGCCACTACGACCCAGGCTTCATGGCCACCTCGCCCCCCGAGGACCGGCCCGGCGGGGGCGGGGGTGCAGCTGGGGGCGCGGAGGACCTGGCGGAGCTGGACCAGCTGCTGCGGCAGCGGCCGTCGGGGGCCATGCCGAGCGAGATCAAAGGGCTAGAGTTCTCCGAGGGCTTGGCCCAGGGCAAGAAGCAGCGCCTAAGCAAGAAGCTGCGGAGGAAGTTACAGATGTGGCTGTGGTCGCAGACATTCTGCCCCGTCTGTACGCGTGGAACGACCTGGGCAGCCGCTTTTGGCCGCGCTACGTGAAGGGGGCAGCTGCTTCAGTAAGCGCTCGTGCTCCGTGCCCGAGGGCATGGTGTGCAAGCCGTCCAAGTCCGTGCACCTCACGGTGCTGCGTGGCGCTGTCAGCGGCGCGGGGGCCAGCGCTGCGGCTGGATTCCCATCCAGTACCCCATCATTTCCGAGTGCAAGTGCTCGTGC
5 세포투과형-간세포성장인자 (IntoCell-HGF)의 아미노산 서열 VSRRRRRRGGRRRRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQSH
6 세포투과형-간세포성장인자 (IntoCell-HGF)의 뉴클레오타이드 서열 GTGAGCCGTAGACGTAGACGTAGAGGTGGTCGTAGACGTAGACAAAGGAAAAGAAGAAATACAATTCATGAATTCAAAAAATCAGCAAAGACTACCCTAATCAAAATAGATCCAGCACTGAAGATAAAAACCAAAAAAGTGAATACTGCAGACCAATGTGCTAATAGATGTACTAGGAATAAAGGACTTCCATTCACTTGCAAGGCTTTTGTTTTTGATAAAGCAAGAAAACAATGCCTCTGGTTCCCCTTCAATAGCATGTCAAGTGGAGTGAAAAAAGAATTTGGCCATGAATTTGACCTCTATGAAAACAAAGACTACATTAGAAACTGCATCATTGGTAAAGGACGCAGCTACAAGGGAACAGTATCTATCACTAAGAGTGGCATCAAATGTCAGCCCTGGAGTTCCATGATACCACACGAACACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACCTACAGGAAAACTACTGTCGAAATCCTCGAGGGGAAGAAGGGGGACCCTGGTGTTTCACAAGCAATCCAGAGGTACGCTACGAAGTCTGTGACATTCCTCAGTGTTCAGAAGTTGAATGCATGACCTGCAATGGGGAGAGTTATCGAGGTCTCATGGATCATACAGAATCAGGCAAGATTTGTCAGCGCTGGGATCATCAGACACCACACCGGCACAAATTCTTGCCTGAAAGATATCCCGACAAGGGCTTTGATGATAATTATTGCCGCAATCCCGATGGCCAGCCGAGGCCATGGTGCTATACTCTTGACCCTCACACCCGCTGGGAGTACTGTGCAATTAAAACATGCGCTGACAATACTATGAATGACACTGATGTTCCTTTGGAAACAACTGAATGCATCCAAGGTCAAGGAGAAGGCTACAGGGGCACTGTCAATACCATTTGGAATGGAATTCCATGTCAGCGTTGGGATTCTCAGTATCCTCACGAGCATGACATGACTCCTGAAAATTTCAAGTGCAAGGACCTACGAGAAAATTACTGCCGAAATCCAGATGGGTCTGAATCACCCTGGTGTTTTACCACTGATCCAAACATCCGAGTTGGCTACTGCTCCCAAATTCCAAACTGTGATATGTCACATGGACAAGATTGTTATCGTGGGAATGGCAAAAATTATATGGGCAACTTATCCCAAACAAGATCTGGACTAACATGTTCAATGTGGGACAAGAACATGGAAGACTTACATCGTCATATCTTCTGGGAACCAGATGCAAGTAAGCTGAATGAGAATTACTGCCGAAATCCAGATGATGATGCTCATGGACCCTGGTGCTACACGGGAAATCCACTCATTCCTTGGGATTATTGCCCTATTTCTCGTTGTGAAGGTGATACCACACCTACAATAGTCAATTTAGACCATCCCGTAATATCTTGTGCCAAAACGAAACAATTGCGA
1.2: 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포 성장인자(IntoCell-HGF) 융합 단백질 발현 및 정제
실시예 1에서 제조한 발현 벡터 pBF-01(+)-IntoCell-Noggin과 pBF-01(+)-IntoCell-HGF를 재조합 단백질 발현용 E.coli 균주들로 형질 전환시킴으로써 발현 균주들을 구축하였다. 이렇게 확보된 발현 균주들을 이용하여 다음과 같이 발현 및 정제하였다.
발현용 글리세롤 스톡을 L-broth (LB) 배양액에 1/200 비율로 접종하여 37℃, 150rpm 조건에서 광학 밀도 (O.D)가 약 0.8에 도달할 때까지 배양하였다. 배양의 광학 밀도가 0.8에 도달하면, 본 배양은 발현용 글리세롤 스톡을 L-broth (LB) 배양액에 1/100 비율로 접종하여 37℃, 100 rpm 조건에서 광학 밀도가 0.6 내지 0.8이 될 때까지 배양하였다. 발현을 위해 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 (Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)를 배양액 내 최종 농도가 0.5mM으로 처리하여 목적단백질들을 유도(induction)한 후, 25℃, 100rpm 조건에서 하루 동안 배양하였다. 다음날 원심 분리(6,000rpm, 4℃, 10분)하여 배양 균체를 획득하고, 획득한 균체 펠렛 1g 당 용균버퍼(Lysis buffer, sodium phosphate buffer, pH 7.8, 10mM NaCl, 5mM imidazole) 20ml씩 첨가하여 현탁하였다. 완전히 현탁되면 초음파 처리(sonication)를 통해 균체를 파쇄하였다(10분간 sonication 10초/holding 10초 반복, Amplitude 50%, 4℃). 파쇄된 균체액은 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 10분)하여 비파쇄 균체 및 불용성 분획을 제거하고 상등액만 취한 후, 0.45㎛ 실린지(syringe)로 여과하였다. 여과한 목적 단백질들을 함유하는 원심 분리 상등액을 동일한 용균 버퍼(Lysis buffer, sodium phosphate buffer, pH 7.8, 10mM NaCl, 5mM imidazole)로 미리 평형화 시킨 affinity column에 30분간 회전시켜 레진 결합을 유도한 후, 결합되지 않은 오염 단백질들은 용출로 제거하였다. 세척 버퍼 1(washing buffer 1, sodium phosphate buffer, pH 7.5, 10mM NaCl, 60 mM imidazole)로 30분씩 1회, 다시 용출 버퍼 1 (Elution buffer 1, sodium phosphate buffer, pH 7.5, 10mM NaCl, 100mM imidazole)로 30분간 1회 컬럼을 씻어주고 용출 버퍼 2 (Elution buffer 2, sodium phosphate buffer, pH 7.5, 10mM NaCl, 200mM imidazole)로 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자(I-PDGFA)를 컬럼으로부터 용출시킨 뒤 초미세 여과(ultra filtration)(Amicon, cutting membrane 3000Da)로 용적 대비 20배 농축하였다. 농축된 용액을 겔 여과 (gel filtration)(Sephadez G-100, Buffer GF(20mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, NaCl 500mM))을 이용하여 목적단백질인 세포투과형-노긴과 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 분획만을 회수하였다. 회수된 분획은 Affinity chromatograpy에서 분리된 목적단백질 세포투과형-노긴 (IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자 (IntoCell-HGF)을 cutting kDa이 10kDa인 초미세여과를 통해 오염 단백질을 추가 정제한 후, 200배 분량의 NaCl이 포함되지 않은 버퍼로 dialysis를 수행하였다. 15% SDS-PAGE 정제도는 200 mM imidazole을 함유하는 용출버퍼(elution buffer)의 용출(elution) 분획에서 가장 효과적이였으며, 약 90-95%의 정제도를 확보하였다.
정제 결과, 표 1에서 나타낸 바와 같이, 상기 방법으로 수득된 각각 219개와 249개 아미노산으로 구성된 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF) 융합 단백질은 SDS-PAGE 분석결과 약 24kDa과 29kDa의 크기로 확인되어 목적단백질이 발현 및 정제되었음을 확인하였다. 또한, 반복적인 정제를 통해 수립한 표준생산공정을 통하여 일정한 순도의 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자 (IntoCell-HGF) 융합 단백질들이 높은 순도로 발현 정제됨을 확인하였다. 표준생산공정은 정제 전 샘플처리 프로토콜과 affinity chromatography를 기본으로 한 정제 프로토콜, 및 컬럼으로 용출(elution)된 샘플분획의 dialysis와 초미세여과 등의 후처리 공정으로 구성되었다.
1.3: IntoCell-Noggin 유전자 합성, 발현 벡터, 클론 개발 및 정제 생산
205개의 아미노산으로 구성된 Noggin에 14개의 아미노산으로 구성된 IntoCell moiety를 N-말단에 연결하여 219개 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 cDNA를 합성하였다. 이를 발현 벡터 발현 벡터 pBF-01(+)에 클로닝하고, 구축된 발현벡터를 재조합 단백질 발현용 competent cell에 형질전환하고, kanamycin이 100ug/ml 농도로 첨가된 LB agar plate에 도말한 다음 37℃에서 배양하였다. 18시간 배양 후 발생한 콜로니들을 확인하였다. 배양 후 발생한 콜로니들을 동일 농도의 kanamycin을 함유한 LB배지 10ml에 접종하여 660nm에서 흡광도가 0.8에 도달하였을 때 최종 농도 0.5mM에 해당하는 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 37℃에서 3시간, 25℃에서 overnight 배양하였다. IPTG에 의한 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin) 발현이 25℃ overnight 배양에서 가장 높음을 확인하였고, 발현된 균주 stock을 만들었다.
발현 균주 stock을 100ug/ml 농도의 kanamycin을 함유하는 2X LB 액체 배지 50ml에 접종한 후 37℃에서 하룻밤 배양하였다(전배양). 다음날 아침 동일한 농도의 kanamycin을 함유하는 2X LB배지 4.5L에 배양된 배양액 50ml을 접종하여, 37℃에서 200rpm으로 흔들면서 배양하였다. 660nm에서 흡광도가 0.8에 도달하였을 때 최종 농도 0.5mM에 해당하는 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 25℃에서 overnight 추가로 배양하였으며, 배양물을 원심분리기를 통해 pellet을 수확하였다. 정제 테스트는 다음과 같이 두가지 방법으로 진행되었다. 2% sarcosine buffer에 pellet을 현탁하여 초음파 분쇄하는 방법으로 실험하였다. 2% sarcosine buffer에 pellet을 현탁 후 초음파 분쇄를 통해 세포벽을 파쇄하였고, 원심 분리를 통해 세포 잔해를 없앤 상등액을 Ni-column에 반응시켜 imidazole 5 ~ 500mM Buffer와 0.1N NaOH에서 IntoCell-Noggin이 용출되는지 확인하였다. 2% sarcosine buffer에서 정제했을 때 imidazole 300mM에서 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)이 정제됨을 확인하였다. 평균적으로 4.5L scale 배양 배지로 1회 정제 시, 대략 생산량 45mg의 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)이 생산되었다. 성공적으로 정제된 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)을 SDS-PAGE로 분석하고, 결과 이미지를 ImageJ 프로그램으로 밴드 덴시티를 분석하는 방법으로 IntoCell-Noggin은 순도 96.5%로 정제됨을 확인하였다 (도 1, 도 2).
1.4: IntoCell-HGF 유전자 합성, 발현 벡터, 클론 개발 및 정제 생산
235개의 아미노산으로 구성된 간세포성장인자에 14개의 아미노산으로 구성된 IntoCell moiety를 N-말단에 연결하여 249개 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 cDNA를 합성하였다. 이를 발현 벡터 발현 벡터 pBF-01(+)에 클로닝하고, 구축된 발현벡터를 재조합 단백질 발현용 competent cell에 형질전환하고, kanamycin이 100ug/ml 농도로 첨가된 LB agar plate에 도말한 다음 37℃에서 배양하였다. 18시간 배양 후 발생한 콜로니들을 확인한다. 배양 후 발생한 콜로니들을 동일 농도의 kanamycin이 함유한 LB배지 10ml에 접종하여 660 nm에서 흡광도가 0.8에 도달하였을 때 최종 농도 0.5mM에 해당하는 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 37℃에서 3시간, 25℃에서 overnight 배양하였다. IPTG에 의한 세포투과형-간세포성장인자 (IntoCell-HGF) 발현이 25℃ overnight 배양에서 가장 높음을 확인하였고, 발현된 균주 stock을 만들었다.
발현 균주 stock을 100ug/ml 농도의 kanamycin을 함유하는 2X LB 액체 배지 50ml에 접종한 후 37℃에서 하룻밤 배양하였다(전배양). 다음날 아침 동일한 농도의 kanamycin을 함유하는 2X LB배지 4.5L에 배양된 배양액 50ml을 접종하여, 37℃에서 200rpm으로 흔들면서 배양하였다. 660nm에서 흡광도가 0.8에 도달하였을 때 최종 농도 0.5mM에 해당하는 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 25℃에서 overnight 추가로 배양하였으며, 배양물을 원심분리기를 통해 pellet을 수확하였다. 1% SDS buffer에 pellet을 현탁후 초음파 분쇄하여 세포벽을 파쇄하였다. 원심 분리를 통해 세포 잔해를 없앤 상등액을 Ni-column에 반응시켜 imidazole 5 ~ 500mM Buffer와 0.1N NaOH에서 IntoCell-HGF가 용출되는지 확인하였다. 1% SDS buffer에서 정제했을 때 imidazole 300mM ~ 500mM buffer와 0.1N NaOH에서 세포투과형-간세포성장인자 (IntoCell-HGF)가 정제됨을 확인하였다. 성공적으로 정제된 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF)를 SDS-PAGE로 분석하고, 결과 이미지를 ImageJ 프로그램으로 밴드 덴시티를 분석하는 방법을 이용하여, IntoCell-Noggin은 순도 96.5%로 정제됨을 확인하였다(도 3, 도 4).
실시예 2: 아미노산류, 비타민류, 무기염류 등을 포함한 조성물의 제조
인간 모발 세포들의 배양에는 다양한 유기 및 무기화합물들의 복합체가 사용된다. 이러한 성분들 중 특히 모발 세포의 성장에 필수적인 성분들로 개발된 2종류의 세포투과형 성장인자들의 효과와 시너지 효과를 갖는 조성물을 개발하였다.
본 발명에서는, 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF)를 포함하는 조성물에, 세포배양에 사용되는 다양한 성분들을 아미노산류(Amino acids: AA Group), 비타민류 (Vitamins: VT Group), 무기염류(Inorganic Salts: IS Group), 기타성분류 (Others: Other Group)로 구분하여 인간 모발 세포인 모유두 세포와 각질형성세포주주인 HaCaT 세포들의 생육에 미치는 증식 촉진 효과를 확인하여, 조성물 2종, BF-Cell Booster Mixture와 BF-Cell Growth Mixture를 구성하고 개발하였다.
BF-Cell Booster Mixture는 AA Group에 21종류의 아미노산류, VT Group에 11종류의 비타민류, IS Group에 9종류의 무기염류, Other Group에 11종류의 기타성분류 그리고 실시예 1 및 실시예 2에서 개발된 2종류의 세포투과형 성장인자들, 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자 (IntoCell-HGF)를 포함하였다(표 2).
　Group 내 순서 성분명 함량 (mg/L) INCI 명 Group
1 L-Glutamine 265 Glutamine Amino Acids
(AA Group)
2 Lysine·HCl 118.6 Lysine HCl
3 Isoleucine 105 Isoleucine
4 Leucine 105 Leucine
5 Tyrosine·2Na·2H2O 103 Tyrosine
6 Valine 94 Valine
7 Threonine 92 Threonine
8 Arginine·HCl 84 Arginine HCl
9 Cystine·2HCl 62.6 Cysteine HCl
10 Phenylalanine 50.7 Phenylalanine
11 Histidine·HCl·H2O 42 Histidine HCl
12 Serine 34.1 Serine
13 L-Cystine 31.2 cystine
14 Glycine 30 Glycine
15 Methionine 23.6 Methionine
16 Tryptophan 16 Tryptophan
17 Proline 8.6 Proline
18 L-Asparagine H2O 7.5 Asparagine
19 L-Glutamic acid 7.3 Glutamic Acid
20 L-Aspartic acid 6.5 Aspartic acid
21 L-Alanine 4.5 Alanine
22 myo-Inositol 9.9 Inositol Vitamins
(VT Group)
23 Folic Acid 4 Folic Acid
24 Thiamine·HCl 4 Thiamine HCl
25 D-Pantothenic Acid· ½Ca 3.06 Pantothenic Acid
26 Pyridoxine·HCl 3.02 Pyridoxine HCl
27 Niacinamide 3.01 Niacinamide
28 D-Ca-Pantothenate 2.24 Calcium Pantothenate
29 Vitamin B12 0.68 Cyanocobalamin
30 Riboflavin 0.4 Riboflavin
31 Ascorbic acid 0.01 Ascorbic acid
32 Biotin 0.00183 Biotin
33 NaCl 6700 Sodium Chloride Inorganic Salts
(IS Group)
34 NaHCO3 1200 Sodium Bicarbonate
35 KCl 355.9 Potassium Chloride
36 CaCl2 209 Calcium Chloride
37 MgSO4 150 Magnesium Sulfate
38 NaH2PO4 105.8 Sodium Phosphate
39 Na2HPO4 71 Disodium Phosphate
40 MgCl2 30.5 Magnesium Chloride
41 CuSO4 0.00063 Coppersulfate
42 Na-Pyrovate 110 Sodium Pyruvate Others
(Other Group)
43 Cytosine 10 Cytosine
44 Guanosine 10 Guanosine
45 Thymine 10 Thymine
46 Taurine 10 Taurine
47 D-Glucose 3.8 Glucose
48 Coenzyme A 2.5 Coenzyme A
49 Nicotinamide Adenine Dinucleotide 1 Nicotinamide Adenine Dinucleotide
50 Disodium Flavine Adenine Dinucleotide 1 Disodium Flavine Adenine Dinucleotide
51 Lipoic acid 0.0525 Thioctic Acid
52 LinoleicAcid 0.042 Linoleic Acid
53 IntoCell-HGF 10 r-(s-Rainbow Trout Oligopeptide-1 sh-Polypeptide-62 세포투과형 성장인자
54 IntoCell-Noggin 10 sr-Rainbow Trout Oligopeptide-1 sh-Polypeptide-13
55 water up to 100% Aqua
BF-Cell Growth Mixture는 AA Group에 14종류의 아미노산류, VT Group에 7종류의 비타민류, IS Group에 6종류의 무기염류 그리고 실시예 1 및 실시예 2에서 개발된 2종류의 세포투과형 성장인자들, 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF)를 포함하였다(표 3).
　Group 내 순서 성분명 함량 (mg/L) INCI 명 Group
1 Lysine·HCl 146 Lysine HCl Amino Acids
(AA Group)
2 Isoleucine 105 Isoleucine
3 Leucine 105 Leucine
4 Tyrosine·2Na·2H2O 103.79 Tyrosine
6 Valine 94 Valine
5 Threonine 95 Threonine
7 Arginine·HCl 84 Arginine HCl
8 Phenylalanine 66 Phenylalanine
9 Histidine·HCl·H2O 42 Histidine HCl
10 Serine 42 Serine
11 Cystine·2HCl 62.6 Cysteine HCl
12 Glycine 30 Glycine
13 Methionine 30 Methionine
14 Tryptophan 16 Tryptophan
15 myo-Inositol 7.2 Inositol Vitamins
(VT Group)
16 Folic Acid 4 Folic Acid
17 Thiamine·HCl 4 Thiamine HCl
18 D-Pantothenic Acid· ½Ca 4 Pantothenic Acid
19 Pyridoxal·HCl 4 Pyridoxine HCl
20 Niacinamide 4 Niacinamide
21 Riboflavin 0.4 Riboflavin
22 NaCl 6400 Sodium Chloride Inorganic Salts
(IS Group)
23 NaHCO3 1200 Sodium Bicarbonate
24 KCl 400 Potassium Chloride
25 CaCl2 200 Calcium Chloride
26 MgSO4 97.67 Magnesium Sulfate
27 NaH2PO4 109 Sodium Phosphate
28 IntoCell-HGF 10 r-(s-Rainbow Trout Oligopeptide-1 sh-Polypeptide-62 세포투과형 성장인자
29 IntoCell-Noggin 10 sr-Rainbow Trout Oligopeptide-1 sh-Polypeptide-13
30 water up to 100% Aqua
실험예 1: 인간 모유두세포 및 각질형성세포주 HaCaT 세포 증식 촉진능 확인
1.1: 인간 모유두세포 및 각질형성세포주 HaCaT 세포 배양
인간 모유두세포와 각질형성세포주 HaCaT 세포들은 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양되었다. 배양 용기의 85 내지 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, 트립신을 처리하여 세포를 탈착시켜 계수 후, 5×103 cells/cm2으로 계대 배양하였다. 세포의 배양에는 10% 소태아혈청(Fetal BovineSerum (FBS), GIBCO, Cat. No. 26140-079, USA)과 100 units/ml 페니실린 그리고 100ug/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat. No. 11995-065, USA)을 사용하였다. 계대 배양을 위하여 75 T-flask (NUNC, Cat. No. 156499, Denmark), 세포 증식 촉진 시험을 위해 96 well plate (NUNC, Cat. No. 142475, Denmark)를 사용하였다. 세포의 특성상 모든 실험은 패시지(passage) 5에서 7사이의 세포를 사용하였다.
1.2: 인간 모유두세포 및 각질형성세포주 HaCaT 세포 증식 촉진능 확인
(1) 실시예 2에서 제조한 조성물 BF-Cell Booster Mixture와 BF-Cell Growth Mixture의 Groups별 성분들(AA Groups, VT Groups, IS Groups, Other Groups, 세포투과형 성장인자 2종)을 무처리 대조군과 비교하여 각각의 조성물 Groups의 세포 증식 촉진능을 확인하였다.
구체적으로, 배양된 인간 모유두세포와 각질형성세포주주 HaCaT 세포를 hemacytometer를 사용하여 96 well plate에 5×103 cells/well씩 동일하게 계수한 후 분주하였다. 인간 모유두세포와 및 각질형성세포주주 HaCaT 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 배양하여 배양용기 표면적의 60 내지 70%만큼 배양되면, 본 개발에서 사용된 성분 Groups가 단독 혹은 복합으로 함유된 3% glucose 용액으로 교체하여 24시간 동안 배양하였다. 대조군은 성분 Groups가 포함되지 않은 3% glucose 용액만을 사용하였다. 이어서 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5mg/ml)을 20ul 첨가하고, 3시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200ul씩 처리하여 교반하고, 540nm에서 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)를 실시하여 흡광도를 측정하였다. 세포증식률은 하기 수학식으로 계산하였고, 세포 증식 촉진효과 정도는 대조군은 성분 Groups가 포함되지 않은 3% glucose 용액을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.
세포생존률 (%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100
(2) 앞서 설명한 바와 같이, 인간 모발을 구성하는 주요 세포인 모유두 세포에 대해 개발된 세포투과형 성장인자 2종과 다양한 세포배양성분들의 Group들을 단독 혹은 혼합 처리한 결과, 매우 우수한 세포증식 촉진 효과를 갖는 것으로 확인되었다. BF-Cell Booster Mixture는 AA Group에 21종류의 아미노산류, VT Group에 11종류의 비타민류, IS Group에 9종류의 무기염류, Other Group에 11종류의 기타성분류 그리고 본 기술에서 개발된 2종류의 세포투과형 성장인자들, 세포투과형-노긴 (IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자 (IntoCell-HGF)를 포함하였다.
각 Group간 증식 촉진 효과를 MTT 시험법으로 확인한 결과, 3% glucose를 처리한 대조군에 비해 AA group을 처리한 세포(도 5, 실험군 1)에서는 대조군 대비 171.4 ± 5%, VT Group을 처리한 세포(도 5, 실험군 2)에서는 대조군 대비 122.6 ± 13%, IS Group을 처리한 세포(도 5, 실험군 3)에서는 대조군 대비 175.5 ± 15%, Other Group을 처리한 세포(도 5, 실험군 4)에서는 대조군 대비 136.7 ± 9%, 세포투과형 성장인자 2종만을 1 ug/ml (1 ppm) 처리한 세포(도 5, 실험군 5)에서는 대조군 대비 124.2 ± 10%, All Groups (AA Group + VT Group + IS Group + Other Group)을 처리한 세포(도 5, 실험군 6)에서는 대조군 대비 221.6 ± 19%, BF-Cell Booster Mixture (All Groups + 세포투과형 성장인자 2종)을 처리한 세포(도 5, 실험군 7)에서는 대조군 대비 295.9 ± 7% 증식 촉진 효과를 확인할 수 있었다(표 4, 도 5).
대조군 대비 약 300%의 증식 촉진 효과를 보인 BF-Cell Booster Mixutre는 탁월한 세포 증식능을 확인할 수 있었다. 단지, 해당 조성물은 매우 다양한 성분으로 구성되어 있어 상업적 활용의 경우, 제조에 높은 어려움과 높은 생산 단가의 한계가 있다. 이를 극복하기 위해 좀더 단순한 성분으로 구성된 BF-Cell Growth Mixture를 개발하고자 하였다. BF-Cell Growth Mixture는 AA Group에 14종류의 아미노산류, VT Group에 7종류의 비타민류, IS Group에 6종류의 무기염류 그리고 본 기술에서 개발된 2종류의 세포투과형 성장인자들, 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF)를 포함하였다.
각 Group간 증식 촉진 효과를 MTT 시험법으로 확인한 결과, 3% glucose를 처리한 대조군에 비해 AA group을 처리한 세포(도 5, 실험군 1)에서는 대조군 대비 166.3 ± 12%, VT Group을 처리한 세포(도 5, 실험군 2)에서는 대조군 대비 127 ± 14%, IS Group을 처리한 세포(도 5, 실험군 3)에서는 대조군 대비 139.3 ± 2%, Other Group을 처리한 세포(도 5, 실험군 4)에서는 대조군 대비 99.3 ± 2%, 세포투과형 성장인자 2종만을 1 ug/ml (각각 1 ppm) 처리한 세포(도 5, 실험군 5)에서는 대조군 대비 123.6 ± 8%, All Groups (AA Group+VT Group+IS Group+Other Group)을 처리한 세포(도 5, 실험군 6)에서는 대조군 대비 177.6 ± 11%, BF-Cell Growth Mixture (All Groups + 세포투과형 성장인자 2종)을 처리한 세포(도 5, 실험군 7)에서는 대조군 대비 206 ± 11% 증식 촉진 효과를 확인할 수 있었다. Other Groups은 해당 성분이 없으며, 대조군과 동일한 처리를 하였다. 이를 통해 BF-Cell Growth Mixture는 대조군 대비 약 200%의 모유도 세포 증식 촉진 효과가 있는 것으로 확인되었다(표 4, 도 5).
AA Group VT Group IS Group Other Group IntoCell-GFs-2 All Groups All Groups
(+) 2종 IntoCell-GFs
BF-Cell Booster Mixture Groups
(단위(%))		 171.4 ± 5 122.6 ± 13 175.5 ± 15 136.7 ± 9 124.2 ± 10 221.6 ± 19 295.9 ± 7
BF-Cell Growth Mixture Groups(단위(%)) 166.3 ± 12 127 ± 14 139.3 ± 2 99.3 ± 2 123.6 ± 8 177.6 ± 11 206 ± 11
(3) 인간 모발을 구성하는 주요 세포인 인간 각질형성세포주 HaCaT 세포에 대해 개발된 세포투과형 성장인자 2종과 다양한 세포배양성분들의 Group들을 단독 혹은 혼합 처리한 결과, 매우 우수한 세포증식 촉진 효과를 갖는 것으로 확인되었다. BF-Cell Booster Mixture는 AA Group에 21종류의 아미노산류, VT Group에 11종류의 비타민류, IS Group에 9종류의 무기염류, Other Group에 11종류의 기타성분류 그리고 본 기술에서 개발된 2종류의 세포투과형 성장인자들, 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF)를 포함하였다.
각 Group간 증식 촉진 효과를 MTT 시험법으로 확인한 결과, 3% glucose를 처리한 대조군에 비해 AA group을 처리한 세포(도 6, 실험군 1)에서는 대조군 대비 150.6 ± 7%, VT Group을 처리한 세포(도 6, 실험군 2)에서는 대조군 대비 132 ± 5%, IS Group을 처리한 세포(도 6, 실험군 3)에서는 대조군 대비 163.6 ± 13%, Other Group을 처리한 세포(도 6, 실험군 4)에서는 대조군 대비 137 ± 18%, 세포투과형 성장인자 2종만을 1 ug/ml (1 ppm) 처리한 세포(도 6, 실험군 5)에서는 대조군 대비 125.6 ± 17%, All Groups (AA Group + VT Group + IS Group + Other Group)을 처리한 세포(도 6, 실험군 6)에서는 대조군 대비 188 ± 23%, BF-Cell Booster Mixture (All Groups + 세포투과형 성장인자 2종)을 처리한 세포(도 6, 실험군 7)에서는 대조군 대비 264 ± 17% 증식 촉진 효과를 확인할 수 있었다(표 5, 도 6).
HaCaT 세포에 대해 대조군 대비 약 264%의 증식 촉진 효과를 보인 BF-Cell Booster Mixutre는 탁월한 세포 증식능을 확인할 수 있었다.
또한, 좀더 적은 수의 성분으로 구성된 BF-Cell Growth Mixture를 개발하였다. BF-Cell Growth Mixture는 AA Group에 14종류의 아미노산류, VT Group에 7종류의 비타민류, IS Group에 6종류의 무기염류 그리고 본 기술에서 개발된 2종류의 세포투과형 성장인자들, 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin)과 세포투과형-간세포성장인자 (IntoCell-HGF)를 포함하였다.
각 Group간 증식 촉진 효과를 MTT 시험법으로 확인한 결과, 3% glucose를 처리한 대조군에 비해 AA group을 처리한 세포(도 6, 실험군 1)에서는 대조군 대비 123.6 ± 6%, VT Group을 처리한 세포(도 6, 실험군 2)에서는 대조군 대비 124.6 ± 17%, IS Group을 처리한 세포(도 6, 실험군 3)에서는 대조군 대비 149 ± 7%, Other Group을 처리한 세포(도 6, 실험군 4)에서는 대조군 대비 99.6 ± 1%, 세포투과형 성장인자 2종만을 1 ug/ml (1 ppm) 처리한 세포(도 6, 실험군 5)에서는 대조군 대비 119.6 ± 12%, All Groups (AA Group + VT Group + IS Group + Other Group)을 처리한 세포(도 6, 실험군 6)에서는 대조군 대비 169 ± 29%, BF-Cell Growth Mixture (All Groups + 세포투과형 성장인자 2종)을 처리한 세포(도 6, 실험군 7)에서는 대조군 대비 197.6 ± 9% 증식 촉진 효과를 확인할 수 있었다. Other Groups은 해당 성분이 없으며, 대조군과 동일한 처리를 하였다. 이를 통해 BF-Cell Growth Mixture는 대조군 대비 약 200%의 모유도 세포 증식 촉진 효과가 있는 것으로 확인되었다(표 5, 도 6).
AA Group VT Group IS Group Other Group IntoCell-GFs-2 All Groups All Groups
(+) 2종 IntoCell-GFs
BF-Cell Booster Mixture Groups
(단위(%))		 150.6 ± 7 132 ± 5 163.6 ± 13 137 ± 18 125.6 ± 17 188 ± 23 264 ± 17
BF-Cell Growth Mixture Groups(단위(%)) 123.6 ± 6 124.6 ± 17 149 ± 7 99.6 ± 1 119.6 ± 12 169 ± 29 197.6 ± 9
실험예 2: 인간 각질형성세포주 HaCaT 세포에 대한 본 발명의 조성물의 세포 이동 및 상처 치유 촉진 효과
2.1 인간 각질형성세포주 HaCaT 세포에 대한 상처 치유와 이동능 촉진능 확인
실시예 2 에서 얻어진 조성물 BF-Cell Booster Mixture와 BF-Cell Growth Mixture의 Groups별 성분들 (AA Groups, VT Groups, IS Groups, Other Groups, 세포투과형 성장인자 2종)을 무처리 대조군과 비교하여 각각의 조성물 Groups의 세포 이동능(migration)에 대한 촉진 효과와 이를 통한 세포 상처 치유능을 확인하였다.
구체적으로, 배양된 인간 각질형성세포주 HaCaT 세포를 hemacytometer를 사용하여 96 well plate에 5×103 cells/well씩 동일하게 계수한 후 분주하였다. 인간 각질형성세포주 HaCaT 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 배양하여 배양용기 표면적의 90 내지 100%만큼 배양되면, 멸균된 칼날을 이용하여 세포배양 표면에 동일한 일정 간격의 인위적인 상처를 유발하였다. 본 개발에서 사용된 성분 Groups가 단독 혹은 복합으로 함유된 3% glucose 용액으로 교체하여 48시간 동안 배양하여, 그 상처가 회복 되는 정도를 상처 면적의 감소로 측정하였다. 대조군은 성분 Groups가 포함되지 않은 3% glucose 용액만을 사용하였다. 48시간 후, 세포에 유발된 상처 감소 면적은 동일한 배율의 현미경 (ECLIPSE, TS2, Nikon, Tokyo, Japan) 관찰을 통해, 상처 면적의 감소를 상대적으로 평가하였다.
2.2: 각질형성세포주 HaCaT 세포에 대한 본 발명의 조성물의 세포 이동 및 상처 치유 촉진 효과
인간 모발을 구성하는 주요 세포인 인간 각질형성세포주 HaCaT 세포에 대해, 실시예 2에서 얻어진, 세포투과형 성장인자 2종과 다양한 세포배양성분들의 Group들을 단독 혹은 혼합 처리한 결과, 매우 우수한 세포증식 촉진 효과를 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 2에서 얻어진 BF-Cell Booster Mixture 및 BF-Cell Growth Mixture들의 인간 각질형성세포주주 HaCaT 세포의 이동능에 대한 촉진 효과를 확인한 결과, 3% glucose를 처리한 대조군(도 7, A)에 비해 세포투과형 성장인자 2종만을 1 ug/ml (1 ppm) 처리한 세포(도 7, B)에서는 168 ± 27 %, BF-Cell Booster Mixture를 처리한 세포(도 7, D)에서는 279 ± 33%, BF-Cell Growth Mixture를 처리한 세포(도 7, C)에서는 227 ± 19%의 촉진 효과를 보여, 세포 이동능에 우수한 촉진 효과가 있음을 확인할 수 있었다 (도 7, 도 8).
<110> BIO-FD&C <120> Composition for cell culture or proliferation comprising cell permeable growth factor <130> KPA2021-348 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 1 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 2 gtgagccgta gacgtagacg tagaggtggt cgtagacgta ga 42 <210> 3 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 3 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Gln His 1 5 10 15 Tyr Leu His Ile Arg Pro Ala Pro Ser Asp Asn Leu Pro Leu Val Asp 20 25 30 Leu Ile Glu His Pro Asp Pro Ile Phe Asp Pro Lys Glu Lys Asp Leu 35 40 45 Asn Glu Thr Leu Leu Arg Ser Leu Leu Gly Gly His Tyr Asp Pro Gly 50 55 60 Phe Met Ala Thr Ser Pro Pro Glu Asp Arg Pro Gly Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Ala Ala Gly Gly Ala Glu Asp Leu Ala Glu Leu Asp Gln Leu Leu Arg 85 90 95 Gln Arg Pro Ser Gly Ala Met Pro Ser Glu Ile Lys Gly Leu Glu Phe 100 105 110 Ser Glu Gly Leu Ala Gln Gly Lys Lys Gln Arg Leu Ser Lys Lys Leu 115 120 125 Arg Arg Lys Leu Gln Met Trp Leu Trp Ser Gln Thr Phe Cys Pro Val 130 135 140 Leu Tyr Ala Trp Asn Asp Leu Gly Ser Arg Phe Trp Pro Arg Tyr Val 145 150 155 160 Lys Val Gly Ser Cys Phe Ser Lys Arg Ser Cys Ser Val Pro Glu Gly 165 170 175 Met Val Cys Lys Pro Ser Lys Ser Val His Leu Thr Val Leu Arg Trp 180 185 190 Arg Cys Gln Arg Arg Gly Gly Gln Arg Cys Gly Trp Ile Pro Ile Gln 195 200 205 Tyr Pro Ile Ile Ser Glu Cys Lys Cys Ser Cys 210 215 <210> 4 <211> 653 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 4 gtgagccgta gacgtagacg tagaggtggt cgtagacgta gacagcacta tctccacatc 60 cgcccggcac ccagcgacaa cctgcccctg gtggacctca tcgaacaccc agaccctatc 120 tttgacccca aggaaaagga tctgaacgag agctgctgcg ctcgctgctc gggggccact 180 acgacccagg cttcatggcc acctcgcccc ccgaggaccg gcccggcggg ggcgggggtg 240 cagctggggg cgcggaggac ctggcggagc tggaccagct gctgcggcag cggccgtcgg 300 gggccatgcc gagcgagatc aaagggctag agttctccga gggcttggcc cagggcaaga 360 agcagcgcct aagcaagaag ctgcggagga agttacagat gtggctgtgg tcgcagacat 420 tctgccccgt ctgtacgcgt ggaacgacct gggcagccgc ttttggccgc gctacgtgaa 480 gggggcagct gcttcagtaa gcgctcgtgc tccgtgcccg agggcatggt gtgcaagccg 540 tccaagtccg tgcacctcac ggtgctgcgt ggcgctgtca gcggcgcggg ggccagcgct 600 gcggctggat tcccatccag taccccatca tttccgagtg caagtgctcg tgc 653 <210> 5 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 5 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Val Val 1 5 10 15 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 20 25 30 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 35 40 45 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 50 55 60 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 65 70 75 80 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 85 90 95 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 100 105 110 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 115 120 125 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 130 135 140 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 145 150 155 160 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 165 170 175 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 180 185 190 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 195 200 205 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 210 215 220 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 225 230 235 240 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser His 245 <210> 6 <211> 1431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 6 gtgagccgta gacgtagacg tagaggtggt cgtagacgta gacaaaggaa aagaagaaat 60 acaattcatg aattcaaaaa atcagcaaag actaccctaa tcaaaataga tccagcactg 120 aagataaaaa ccaaaaaagt gaatactgca gaccaatgtg ctaatagatg 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gatgggtctg aatcaccctg gtgttttacc actgatccaa acatccgagt tggctactgc 1080 tcccaaattc caaactgtga tatgtcacat ggacaagatt gttatcgtgg gaatggcaaa 1140 aattatatgg gcaacttatc ccaaacaaga tctggactaa catgttcaat gtgggacaag 1200 aacatggaag acttacatcg tcatatcttc tgggaaccag atgcaagtaa gctgaatgag 1260 aattactgcc gaaatccaga tgatgatgct catggaccct ggtgctacac gggaaatcca 1320 ctcattcctt gggattattg ccctatttct cgttgtgaag gtgataccac acctacaata 1380 gtcaatttag accatcccgt aatatcttgt gccaaaacga aacaattgcg a 1431

Claims (15)

  1. 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 세포 배양을 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 모유두 세포, 각질형성세포, 피부섬유아세포, 멜라닌형성세포 또는 모낭 줄기세포인 것인, 세포 배양을 위한 조성물.
  3. 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 세포 증식 또는 이동 촉진을 위한 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 세포는 모유두 세포, 각질형성세포, 피부섬유아세포, 멜라닌형성세포 또는 모낭 줄기세포인 것인, 세포 증식 또는 이동 촉진을 위한 조성물.
  5. 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진을 위한 조성물.
  6. 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 상처 치유를 위한 조성물.
  7. 세포투과형-노긴 융합 단백질 및 세포투과형-간세포성장인자 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 피부 재생을 위한 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포투과형-노긴(IntoCell-Noggin) 융합 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 것인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포투과형-간세포성장인자(IntoCell-HGF) 융합 단백질은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 것인, 조성물.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산류, 비타민류, 및 무기염류 중 하나 이상을 더 포함하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 아미노산류는 L-글루탐산(L-Glutamine), 리신(Lysine)·HCl, 이소류신(Isoleucine), 류신(Leucine), 티로신(Tyrosine)·2Na·2H2O, 발린(Valine), 트레오닌(Threonine), 아르기닌(Arginine)·HCl, 시스틴(Cystine)·2HCl, 페닐알라닌(Phenylalanine), 히스티딘(Histidine)·HCl·H2O, 세린(Serine), L-시스틴(Cystine), 글리신(Glycine), 메티오닌(Methionine), 트립토판(Tryptophan), 프롤린(Proline), L-아스파라긴(Asparagine)·H2O, L-글루탐산(Glutamic acid), L-아스파틱산(Aspartic acid), 및 L-알라닌(Alanine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 비타민류는 미오-이노시톨(myo-Inositol), 엽산(Folic Acid), 티아민(Thiamine)·HCl, D-판토텐산(Pantothenic Acid)·
    Figure pat00002
    Ca, 피리독신(Pyridoxine)·HCl, 피리독살(Pyridoxal)·HCl, 니아신아미드(Niacinamide), D-Ca-판토텐산염(Pantothenate), 비타민(Vitamin) B12, 리보플라빈(Riboflavin), 아스코르브산(Ascorbic acid), 및 비오틴(Biotin) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 무기염류는 NaCl, NaHCO3, KCl, CaCl2, MgSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, MgCl2, 및 CuSO4으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    Na-피로베이트(Pyrovate), 시토신(Cytosine), 구아노신(Guanosine), 티민(Thymine), 타우린(Taurine), D-글루코스(Glucose), 조효소(Coenzyme) A, NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide), 다이소듐 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(Disodium Flavine Adenine Dinucleotide), 리포산(Lipoic Acid), 및 리놀레산(Linoleic Acid) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 조성물.
  15. 제1항에 따른 세포 배양을 위한 조성물을 이용하여 세포를 배양하는, 세포 배양 방법.
KR1020210173247A 2021-12-06 2021-12-06 세포 투과형 성장인자를 포함하는 세포 배양 또는 증식을 위한 조성물 KR20230084992A (ko)

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