KR20220105426A - 세포투과형 혈소판 유래 성장인자의 융합 단백질 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 개선용 조성물 - Google Patents
세포투과형 혈소판 유래 성장인자의 융합 단백질 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질 및 상기 세포투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 또는 탈모 방지 또는 탈모 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질은 발모 촉진 및 탈모 예방 또는 개선 효과를 가지고 있어, 이와 관련한 화장료 조성물, 약학적 조성물, 의약외품 조성물, 식품 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 탈모증 예방 또는 개선 효능이 있는 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 또는 탈모 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
모발은 피부 및 두피를 보호하는 일차적인 역할 뿐 아니라, 사회적 및 성적 의사소통에 있어서 고유의 역할을 하므로 매우 중요하다.
모발은 케라틴 단백질로 구성되어 있으며, 진피에 있는 모낭으로부터 발생하여 성장한다. 두피 모낭은 모유두세포, 각질형성세포, 내측 및 외측 모근초 세포, 및 멜라노사이트로 구성되어 있고, 이 중 모낭 모유두세포는 특수 섬유모세포의 하나로, 모낭 발생의 기초가 된다. 또한, 모낭 모유두세포는 모발 성장과 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있다.
탈모증이란 정상적으로 모발이 있어야 할 곳에 모발이 없는 상태를 말한다. 모발은 생명에 직접 관계되는 중요한 생리적 기능은 없지만 미용적인 관점에서 역할이 매우 크며 이외에도 자외선 차단, 머리 보호 등의 기능이 있다.
탈모인구의 증가로 탈모시장이 급성장하면서 탈모를 예방 및 치료하기 위한 제품들이 개발되고 있으며, 탈모치료의 근본적인 해결책은 탈모의 원인을 해결하는 것이다.
탈모증의 원인 중에서 남성호르몬 과잉 분비와 직접적인 관계가 있는 가장 흔한 유형은 남성형 탈모증(male pattern baldness)이라고 부르는 안드로겐성 탈모증(androgenic alopecia)이다. 남성형 탈모의 대표적인 원인으로 5-알파 환원효소(5-α reductase)에 의해 생성되는 dihydrotestosterone(DHT)이 있다. 남성호르몬 중의 하나인 테스토스테론(testosterone)이 5α-reductase에 의해 DHT으로 전환되고, 이렇게 활성화된 DHT이 안드로겐 수용체(adrogen receptor)와 결합하여 모낭세포의 단백질 합성을 지연시키고, 세포괴사인자인 BMP, DKK-1, TGF-β를 생성시켜 Wnt/b-catenin 신호전달을 억제해 탈모를 유발한다.
많은 연구들에서 DHT 합성을 억제시키는 노력이 진행되었으며, 그 대표적인 약물이 미국의 머크제약에서 시판하고 있는 프로페시아(Propecia)라는 치료제이다. 이 치료제의 주성분인 피나스테라이드(Finasteride)는 남성호르몬인 테스토스테론이 DHT으로 전환되는 것을 억제하는 기작을 보여 준다. 프로페시아는 1997년 탈모증의 치료제로 미국의 FDA로부터 사용 승인을 받아 현재 시판 중이다. 그러나 복용 후 수개월이 지나서 효과가 나타나며, 미미하나마 성욕감퇴, 발기부전 등의 부작용이 있다는 단점을 갖는다. 또한, 남성만이 사용 가능하고 여성과 어린이에 있어서 안정성이 확립되어 있지 않으며, 임산부나 임신의 가능성이 있는 여성의 사용이 금지된다는 단점도 갖는다. 이외에도 탈모증의 치료나 예방에 있어서 가장 널리 사용되는 제제로서 미국의 파마시아사가 개발한 모발의 재성장을 촉진하는 약제로 FDA의 승인을 받은 탈모증 치료제인 미녹시딜(minoxidil)이 있다. 미녹시딜은 바르는 약으로 치료대상이 젊고, 기름기가 많고, 가마부위가 빠지는 경우에는 어느 정도 효과가 있으나 그 이외의 경우는 미미한 효과만 보일 뿐만 아니라, 접촉성 피부염이나 입안이 마르는 증상, 혈압강하, 현기증의 부작용이 보고되었다.
프로페시아 및 미녹시딜을 포함하는 종래 치료제의 여러 가지 부작용으로 인해 대체 발모제 연구가 활발히 진행되고 있으나 현재까지 실제 임상에서 두피에 작용하는 효과가 탁월한 대체제가 부재한 실정이다. 따라서 효과가 우수하며 부작용이 적은 여러 가지 다른 천연물질 및 펩타이드와 같은 바이오 소재의 발모제를 탐색하는 연구가 절실한 실정이다.
한편, 재조합 단백질 기술은 유전공학기술을 이용하여 고등생물에서 유래한 단백질을 미생물 및 동물세포에서 대량 발현시키는 기술이다. 단백질의 기능적 특성에 따라 미생물 및 동물세포에서 생산하는 공정기술이 응용되고 있으며, 이렇게 생산된 단백질은 제약, 화장품, 식품, 분석 및 진단 산업분야에 널리 사용되고 있다. 재조합 단백질 기반의 화장품 신소재의 경우, 주로 트러블성 피부질환을 대상으로 연구개발이 활발하다. 이러한 재조합 단백질 기술기반으로 생산된 성장인자를 탈모치료제에 적용하면 위의 탈모치료제의 부작용을 최소화 할 수 있을 것으로 기대된다.
하지만, 이러한 재조합 단백질들은 일반적으로 친수성이고 거대한 분자들은 세포막이라는 장벽에 의해 세포 안으로 들어가는 것이 매우 어렵다. 세포막은 펩타이드나 단백질, 핵산과 같은 거대 분자가 세포 내로 들어가지 못하게 막으며 세포막 수용체의 의한 엔도사이토시스(Endocytosis)라는 생리적 기작을 통해 세포 내로 들어가더라도 세포의 리소좀(Lysosomal compartment)과 융합되어 결국 분해되므로 이들 거대분자 바이오 활성소재를 세포 외에서 전달하는 데 많은 제약이 따른다.
한편, 혈소판유래 성장인자는 모발에서 모낭줄기세포의 활성을 조절하고 모발주기에서 성장기(anagen)를 유도해 모발형성 촉진과 모발 성장 촉진의 효과 있다고 알려져 있으나, 친수성이며 분자량이 커서 세포막을 투과하여 피부에 흡수되는데 한계가 있기 때문에 실질적인 활성효과를 기대하기는 어렵다.
이러한 한계를 극복하기 위해 최근 새로운 대안들이 제시되고 있으며 그 중 세포 투과형 펩타이드(Cell penetrating peptide, CPP)들은 현재까지 낮은 세포막 투과성 및 빠른 생체 내 반감기로 인해 약물로 사용하기 어려웠던 치료용 단백질 및 유전자와 같은 거대 분자들의 의약학적 이용가치를 높일 수 있을 것으로 기대되고 있다. 이렇듯 CPP를 이용하여 세포 내 효율적 수송을 위한 다양한 응용이 시도되었으나, 아직까지 세포 투과형 펩타이드와 성장인자들을 결합시켜 탈모 치료제의 핵심소재로 활용하는 연구는 드물었다.
이에, 종래 치료제의 부작용을 방지하고 탈모방지 또는 발모개선에 효과를 부여하는 성장인자와 세포 투과형 펩타이드를 결합시켜 탈모 치료제의 핵심소재로 개발 하고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 연구자들은 세포의 독성이 없으면서 탈모를 유발하는 5-α reductase와 Adrogen receptor의 생체내 발현을 억제하는 세포투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질을 개발하였다.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 또는 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 또는 탈모 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분을 포함하는 탈모증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 또는 탈모 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 신규한 발모 촉진 또는 탈모 예방에 효과가 있는 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF)는 2개의 펩타이드사슬로 이루어지는 저분자량의 염기성 단백질로서, 평활근세포, 섬유아세포 및 혈관벽과 같은 간엽유래 세포의 증식을 촉진한다. 혈소판유래 성장인자 A서브유닛(PDGFA)은 혈소판 유래 성장인자(PDGF) 계열에 속하는 단백질 중의 하나로서, 혈액 내 혈소판에 함유되어 있으며, 약 18kDa의 크기를 갖는 단백질이다.
혈소판 유래 성장인자는 피부에서 항노화, 피부재생 효과가 있으며, 모발에서 모낭줄기세포의 활성을 조절하고 모발주기에서 성장기(anagen)를 유도해 모발형성 촉진과 모발 성장 촉진의 효과 있다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, "세포 투과형"이란, 세포를 투과하여 세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미하며, "세포 투과형 펩타이드(Cell penetrating peptide, CPP)"는 분자의 크기나 성질에 관계 없이 세포를 통과할 수 있고, 세포 전체에 고르게 전달될 수 있으며, 세포 투과성이 우수한 펩타이드를 말한다.
상기 세포 투과형 펩타이드는 종래 낮은 세포막 투과성 및 빠른 생체 내 반감기로 인해 약물로 사용하기 어려웠던 치료용 단백질 및 유전자와 같은 거대 분자들의 의약학적 이용가치를 높일 수 있어 살아있는 세포의 질이나 핵 안으로 바이오 활성소재를 보다 안전하고 효과적으로 전달할 수 있는 수단으로서 연구되고 있다.
| 구분 | 아미노산 서열 | |
| 서열번호 1 | 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자(I-PDGFA) 융합 단백질 | N-VSRRRRRRGGRRRRSIEEAVPAVCKTRTVIYEIPRSQVDPTSANFLI WPPCVEVKRCTGCCNTSSVKCQPSRVHHRSVKVAKVEYVRKKPKLKEVQVR LEEHLECACATTSLNPDYREEDTGRPRESGKKRKRKRLKPT- C |
| 서열번호 2 |
세포 투과형 펩타이드(IntoCell) |
N-VSRRRRRRGGRRRR-C |
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과형 펩타이드는 Hph-1, Vectocell, Lactoferrin, Sim-2, LPIN3, 2IL-1a, dNP2 Tat 펩타이드, Pep-1 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "융합 단백질"이란 상기 세포 투과형 펩타이드 및 상기 혈소판 유래 성장인자가 결합되도록 인위적으로 합성된 단백질로서, 보다 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 융합 단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백 질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 구성하는 단백질은 당해 분야에 공지된 화학적 단백질 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지 된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 상기 세포 투과형 펩타이드 및 상기 혈소판 유래 성장인자 사이에 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 융합 단백질은 상기 세포 투과형 펩타이드가 상기 혈소판 유래 성장인자의 N-말단에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커(Linker)를 통해 융합 연결될 수도 있다.
상기 링커는 구체적으로 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파 르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 보다 구체적으로 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등의 아미노산을 여러 개 사용하여 연결시 킬 수 있으며, 보다 더 구체적으로 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등 의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "탈모(증)"은 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 말하며, 일반적으로 두피의 성모가 빠지는 것을 의미한다. 상기 탈모증은 원형 탈모증, 유전성 안드로젠 탈모증, 휴지기 탈모증, 외상성 탈모증, 생장기 탈모증, 비강성 탈모증, 지루 탈모증 및 선천성 탈모증으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 용어 "탈모(증) 예방 또는 개선"은 탈모가 진행되는 것을 방지하고 털이 나는 것을 말하며, 유전적인 원인, 호르몬 불균형, 사회생활의 정신적 스트레스, 대기오염 노출, 가공 식품의 섭취 등의 다양한 습관과 환경적 영향으로 인하여 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 개선하는 것을 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 실험예에서는 세포 투과형 혈소한 유래 성장인자 융합 단백질을 인간 각질형성 세포, 섬유아세포 및 인간 모유두세포에 처리하여 세포독성에 의한 피부자극이 유발되지 않음을 확인하였고, 인간 모유두세포에서 탈모를 유발하는 5α-reductase 및 안드로겐 수용체(Adrogen receptor)의 발현 억제 효과를 확인하였다.
이러한 시험예를 바탕으로 본 발명의 융합 단백질은 탈모 예방 또는 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 다른 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 또는 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "융합 단백질" 및 "탈모 예방 또는 개선"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나, 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명의 용어 "유효성분으로 포함하는"의 의미는, 화장료 조성물로써 상기와 같은 탈모증 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 포함하는 것을 말한다.
상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성 물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 본 발명의 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발 명의 화장료 조성물이 제조되는 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위 (얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물 또는 조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이의 제형으로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 조성물은 모발 또는 두피에 직접 도포 또는 산포하는 등의 방법에 의해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물이 적용되는 모발이란, 머리의 모근 및 모낭, 머리카락 및 속눈썹과 겉눈썹, 수염, 겨드랑이, 음모, 신체 전반에 모근 및 모낭이 있는 모든 부위를 포함한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따른 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 '대한민국약전'을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비자연적 담체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 약학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 인간인 경우가 바람직할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 또는 탈모 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 의약외품 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 개인위생용품, 피부외용제, 소독청결제, 샤워폼, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 마스크 또는 연고제를 포함한다. 상기 피부외용제에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 비누, 물티슈, 휴지, 샴푸, 치약, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 또는 탈모 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은, 건강기능 식품 조성물을 포함할 수 있으며, 상기 건강기능 식품 조성물은, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
상기 조성물은 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화 방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질은 합성이 용이하고, 독성에 대한 염려가 없으며, 발모 촉진, 탈모 예방 또는 개선 효과를 가지는 바, 상기 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질을 포함하는 조성물은 탈모 예방, 개선 또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있어 산업적 활용가치가 높다.
도 1은 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질을 SDS-PAGE 분석에 의해 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질의 인간 각질 세포에 대한 독성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질의 인간 섬유아세포에 대한 독성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질의 인간 모유두 세포에 대한 독성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질의 SRD5A1 (5α-reductase type 1)에 대한 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질의 andgrogen receptor에 대한 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질의 인간 각질 세포에 대한 독성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질의 인간 섬유아세포에 대한 독성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질의 인간 모유두 세포에 대한 독성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질의 SRD5A1 (5α-reductase type 1)에 대한 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 세포 투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질의 andgrogen receptor에 대한 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명에 따른 융합 단백질 제조
1-1. cDNA 및 발현벡터 제조
세포 투과형 펩타이드(Intocell)를 혈소판유래성장인자와 융합하여 표 1에 나타낸 서열번호 1의 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자 융합 단백질(I-PDGFA)로 제조하였다. 표 1에 나타낸 서열번호 2의 IntoCell을 암호화하는 유전자인 서열번호 4의 서열을 혈소판 유래 성장 인자(PDGFA) cDNA의 N-말단부에 융합하고 발현벡터로의 클로닝을 위하여 제한효소 NdeI와 XhoI의 제한부위(restriction sites)를 양 말단에 갖는, 표 2에 나타낸 서열번호 3의 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자 융합 단백질(I-PDGFA)의 cDNA를 확보하였다. 이렇게 수득된 삽입 cDNA(insert cDNA)를 발현 벡터에 삽입하였다. 대장균(E.coli) 발현 벡터인 pBF-01(+)를 NdeI와 XhoI으로 이중 절단(double digestion) 처리하여 클로닝 부위를 개방하고, NdeI와 XhoI이 이중 절단한 후 삽입 cDNA(insert cDNA)를 정제하여 발현벡터와 목적 단백질의 삽입 cDNA(insert cDNA)를 라이게이션(ligation)하여 융합하였다. 이렇게 제조된 발현 벡터 pBF-01(+)- Intocell-PDGFA 유전자 수준에서 융합한 후, 외래 재조합단백질의 발현에 사용하는 BL21계열의 대장균에 형질전환하여 발현 클론을 제조하였다.
| 서열번호 | 구분 | 염기서열 |
| 서열번호 3 | 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자 융합 단백질(I-PDGFA)의 cDNA 서열 | GTGAGCCGTAGACGTAGACGTAGAGGTGGTCGTAGACGTAGAAGCATCGAGGAAGCTGTCCCCGCTGTCTGCAAGACCAGGACGGTCATTTACGAGATTCCTCGGAGTCAGGTCGACCCCACGTCCGCCAACTTCCTGATCTGGCCCCCGTGCGTGGAGGTGAAACGCTGCACCGGCTGCTGCAACACGAGCAGTGTCAAGTGCCAGCCCTCCCGCGTCCACCACCGCAGCGTCAAGGTGGCCAAGGTGGAATACGTCAGGAAGAAGCCAAAATTAAAAGAAGTCCAGGTGAGGTTAGAGGAGCATTTGGAGTGCGCCTGCGCGACCACAAGCCTGAATCCGGATTATCGGGAAGAGGACACGGGAAGGCCTAGGGAGTCAGGTAAAAAACGGAAAAGAAAAAGGTTAAAACCCACC |
| 서열번호 4 | 세포 투과형 펩타이드(Intocell)의 유전자서열 | GTGAGCCGTAGACGTAGACGTAGAGGTGGTCGTAGACGTAGA |
1-2. 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자(I-PDGFA) 융합 단백질 발현 및 정제
실시예 1-1에서 제조한 발현 벡터 pBF-01(+)- Intocell-PDGFA를 재조합 단백질 발현용 E.coli 균주로 형질 전환시킴으로써 발현 균주를 구축하였다. 이렇게 확보된 발현 균주를 발현용 글리세롤 스톡(glycerol stock)을 이용하여 다음과 같이 발현 및 정제하였다. 발현용 글리세롤 스톡을 L-broth(LB) 배양액에 1/200 비율로 접종하여 37℃, 150rpm 조건에서 광학 밀도(O.D)가 약 0.8에 도달할 때까지 배양하였다. 배양의 광학 밀도가 0.8에 도달하면 본 배양은 발현용 글리세롤 스톡을 L-broth(LB) 배양액에 1/100 비율로 접종하여 37℃, 100 rpm 조건에서 광학 밀도가 0.6 내지 0.8 가 될 때까지 배양하였다. 발현을 위해 이소프로-β-D-티오갈락토피라노사이드(isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside, IPTG)를 배양액 내 최종 농도가 0.5 mM으로 처리하여 목적단백질을 유도(induction)한 후, 25℃, 100rpm 조건에서 하루 동안 배양하였다. 다음날 원심 분리(6,000rpm, 4℃, 10분)하여 배양 균체를 획득하고, 획득한 균체 펠렛 1 g 당 용균버퍼(Lysis buffer, sodium phosphate buffer, pH7.8, 10mM NaCl, 5mM imidazole) 20ml씩 첨가하여 현탁하였다. 완전히 현탁되면 초음파 처리(sonication)을 통해 균체를 파쇄하였다(10분간 sonication 10초/holding 10초 반복, Amplitude 50%, 4℃). 파쇄된 균체액은 원심 분리(12,000 rpm, 4℃, 10분)하여 비파쇄 균체 및 불용성 분획을 제거하고 상등액만 취한 후, 0.45 ㎛ 실린지(syringe)로 여과하였다. 여과한 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자(I-PDGFA)를 함유하는 원심 분리 상등액을 동일한 용균 버퍼(Lysis buffer, sodium phosphate buffer, pH 7.8, 10 mM NaCl, 5 mM imidazole)로 미리 평형화 시킨 affinity column에 30분간 회전시켜 레진 결합을 유도한 후, 결합되지 않은 오염 단백질들은 용출로 제거하였다. 세척 버퍼1(washing buffer 1, sodium phosphate buffer, pH7.5, 10 mM NaCl, 60 mM imidazole)로 30분씩 1회, 다시 용출 버퍼 1(Elution buffer 1, sodium phosphate buffer, pH7.5, 10 mM NaCl, 100 mM imidazole)로 30분간 1회 컬럼을 씻어주고 용출 버퍼 2(Elution buffer 2, sodium phosphate buffer, pH7.5, 10 mM NaCl, 200 mM imidazole)로 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자(I-PDGFA)를 컬럼으로부터 용출시킨 뒤 초미세 여과(ultra filtration)(Amicon, cutting membrane 3000Da)로 용적 대비 20배 농축하였다. 농축된 용액을 겔 여과(gel filtration)(Sephadez G-100, Buffer GF(20mM sodium phosphate buffer, pH7.5, NaCl 500mM))을 이용하여 목적단백질인 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자(I-PDGFA) 융합 단백질 분획만을 회수하였다. 회수된 분획은 Affinity chromatograpy에서 분리된 목적단백질 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자(I-PDGFA)을 cutting kDa이 10kDa인 초미세여과 를 통해 오염 단백질을 추가 정제한 후, 200배 분량의 NaCl이 포함되지 않은 버퍼로 dialysis를 수행하였다. 15% SDS-PAGE 정제도는 200 mM imidazole을 함유하는 용출버퍼(elution buffer)의 용출(elution) 분획에서 가장 효과적으로 리되었으며, 약 90-95% 의 정제도를 확보하였다. 정제 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이, 상기 방법으로 수득된 145개 아미노산으로 구성된 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자(I-PDGFA) 융합 단백질은 SDS-PAGE 분석결과 약 16.9D ka의 크기로 확인되어 목적단백질이 발현 및 정제되었음을 확인하였다.
또한, 반복적인 정제를 통해 수립한 표준생산공정을 통하여 일정한 순도의 세포 투과형 혈소판 유래 성장 인자(I-PDGFA) 융합 단백질이 높은 순도로 발현 정제됨을 확인하였다.
표준생산공정은 정제 전 샘플처리 프로토콜과 affinity chromatography를 기본으로 한 정제 프로토콜, 및 컬럼 으로 용출(elution)된 샘플분획의 dialysis와 초미세여과 등의 후처리 공정으로 구성되었다.
실험예 1: 인간 각질형성세포 독성 확인
1-1. 인간 각질형성 세포 배양
인간 각질형성 세포인 HaCaT 세포주는 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양되었다. 배양 용기의 85 ~ 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, trypsin 처리로 세포를 탈착시켜 계수 후, 5 × 103 cells/Cm2으로 계대 배양하였다. 세포의 배양에는 10% Fetal Bovine Serum (FBS, GIBCO, Cat. No., 26140-079, USA)과 100 U/ml penicillin 그리고 100 ug/ml streptomycin이 첨가된 Delbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat. No. 11995-065, USA)을 사용하였다. 계대 배양을 위하여 75 T-flask (NUNC, Cat. No. 156499, Danmark)가 사용되었으며, 세포 독성 시험을 위해서는 96 well plate (NUNC, Cat. No., 142475, Danmark)가 사용되었다.
1-2. 독성 확인
혈소판 유래 성장 인자(PDGFA) 및 실시예 1에서 제조된 I-PDGFA의 피부 독성 여부를 확인하기 위하여, 인간 각질형성 세포에 대한 세포 독성 유무를 시험하였다.
구체적으로, 배양한 인간 각질형성 세포를 96 well plate에 5 × 103 cells/well 씩 동일하게 heamacytometer를 이용하여 계수한 후 분주하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 배양하여 배양용기 표면적의 60 ~ 70%만큼 배양되면, PDGFA와 I-PDGFA가 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 20 ul 첨가하고 3시간 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 ul의 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 처리하여 교반한 후, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 정도는 시료대신 순수한 물을 처리한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.
세포증식율(%) =(시험군의 흡광도/대조군의 흡광도)X100
MTT 시험을 수행하여 초기 배양 5 × 103 cells/well 세포들이 배양용기 표면적의 60 ~ 70% 만큼 배양된 시점에서 본 연구에 사용된 PDGFA와 I-PDGFA를 농도별로 첨가하여 대조군과 비교한 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이, PDGFA와 I-PDGFA를 1ppm까지 처리한 경우 80% 이상의 증식 정도를 보여 독성이 없는 것으로 확인되었다.
실험예 2: 섬유아세포 독성 확인
2-1. 섬유아세포 배양
섬유아세포는 히알루론산, 콜라겐, 엘라스틴 등의 피부 교원질을 생산하는 세포로써 주름개선 및 탄력을 위해서는 섬유아세포의 증식 및 분화가 이루어져야 한다.
섬유아세포 CCD986-SK 세포주는 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양되었다. 배양 용기의 85 ~ 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, trypsin 처리로 세포를 탈착시켜 계수 후, 5 × 103 cells/Cm2으로 계대 배양하였다. 세포의 배양에는 10% Fetal Bovine Serum (FBS, GIBCO, Cat. No., 26140-079, USA)과 100 U/ml penicillin 그리고 100 ug/ml streptomycin이 첨가된 Delbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat. No. 11995-065, USA)을 사용하였다. 계대 배양을 위하여 75 T-flask (NUNC, Cat. No. 156499, Danmark)가 사용되었다.
2-1. 증식능 확인
혈소판 유래 성장 인자(PDGFA) 및 실시예 1에서 제조된 I-PDGFA의 장시간 사용 시 피부자극 없이 개선 효과가 나타나는지 확인하기 위하여, 섬유아세포에 대한 세포 증식도를 확인하였다.
구체적으로, CCD986-SK 세포를 96 well plate에 5 × 103 cells/well 동일하게 heamacytometer를 이용하여 계수한 후 분주하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 배양하여 배양용기 표면적의 60~70%만큼 배양되면, 본 특허에서 개발한 PDGFA와 I-PDGFA 교체하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 20 ul 첨가하고 3시간 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 ul의 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 처리하여 교반한 후, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 정도는 시료 대신 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.
세포증식율(%) =(시험군의 흡광도/대조군의 흡광도)X100
도 3에 나타낸 바와 같이, MTT 시험법을 시험한 결과, PDGFA와 I-PDGFA를 0.1ppm까지 처리한 경우 100% 이상으로 모두 세포독성은 없고 증식이 나타났으며, 1ppm을 처리한 겨우 80% 이상의 활성능을 보였다.
따라서 PDGFA와 I-PDGFA를 장기간 사용하여도 세포독성에 의한 피부자극이 유발되지 않음을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 인간 모유두세포 독성 확인
3-1. 인간 모유두세포 배양
인간 모유두세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양되었다. 배양 용기의 85 내지 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, 트립신을 처리하여 세포를 탈착시켜 계수 후, 5 × 103cells/cm2으로 계대 배양하였다. 세포의 배양에는 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum (FBS), GIBCO, Cat. No., 26140-079, USA)과 100 U/ml 페니실린 그리고 100 ug/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Delbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat. No. 11995-065, USA)을 사용하였다. 계대 배양을 위하여 75 T-flask (NUNC, Cat. No. 156499, Danmark), 세포 독성 시험을 위해 96 well plate(NUNC, Cat. No., 142475, Danmark)를 사용하였다. 세포의 특성 상 모든 실험은 패시지(passage) 5에서 7사이의 세포를 사용하였다.
3-2. 독성 확인
혈소판 유래 성장 인자(PDGFA) 및 실시예 1에서 제조된 I-PDGFA의 장시간 사용 시 피부자극 없이 개선 효과가 나타나는지 확인하기 위하여, 인간 모유두세포에 대한 독성 여부를 확인하였다.
구체적으로, 배양된 인간 모유두세포를 hemacytometer를 사용하여 96 well plate에 5 X 103cells/well씩 동일하게 계수한 후 분주하였다. 인간 모유두세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 배양하여 배양용기 표면적의 60 내지 70%만큼 배양되면, 본 연구에서 사용된 PDGFA와 I-PDGFA가 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 동안 배양하였다. 이어서 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5 mg/ml)을 20 ul 첨가하고, 3시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200ul씩 처리하여 교반하고, 540 nm에서 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)를 실시하여 흡광도를 측정하였다. 세포증식률은 하기 식으로 계산하였고, 세포 독성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.
세포생존률(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100
장기간 사용 시 유발될 수 있는 두피자극에 대한 간접적 평가로 인간 모유두 세포주(HFDPC)를 이용한 MTT 시험을 수행하였다. Well 당 초기 배양 5 X 103cells/well 세포들이 배양용기 표면적의 60 ~ 70% 만큼 배양된 시점에서 PDGFA와 I-PDGFA를 농도별로 첨가하여 대조군과 비교한 결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이 PDGFA와 I-PDGFA를 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1ppm까지 처리한 경우 모두 97% 이상의 증식 정도를 보였다.
따라서 PDGFA와 I-PDGFA를 장기간 사용하여도 세포독성에 의한 두피자극이 유발되지 않음을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 인간 모유두세포 탈모촉진인자 발현 억제 확인
탈모치료의 근본적인 해결책은 탈모의 원인을 해결하는 것이다. 탈모증의 원인 중에서 남성호르몬 과잉 분비와 직접적인 관계가 있는 가장 흔한 유형은 남성형 탈모증(male pattern baldness)이라고 부르는 안드로겐성 탈모증(androgenic alopecia)이다. 남성형 탈모의 대표적인 원인으로 5-알파 환원효소(5-α reductase)에 의해 생성되는 dihydrotestosterone(DHT)이 있다. 남성호르몬 중의 하나인 테스토스테론(testosterone)이 5α-reductase에 의해 DHT으로 전환되고, 이렇게 활성화된 DHT이 안드로겐 수용체(adrogen receptor)와 결합하여 모낭세포의 단백질 합성을 지연시키고, 세포괴사인자인 BMP, DKK-1, TGF-β를 생성시켜 Wnt/b-catenin 신호전달을 억제해 탈모를 유발한다. 이러한 기작 중 5α-reductase와 안드로겐 수용체(Adrogen receptor)의 발현 억제를 통한 탈모효과를 RT-PCR로 확인해 보았다.
4-1. 인간 모유두세포 RNA 추출 및 cDNA 합성
실험예 3에서 배양된 인간 모유두세포를 hemacytometer를 사용하여 6 well plate에 1 X 105cells/well씩 동일하게 계수한 후 분주하였다. 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 배양하여 배양용기 표면적의 60 내지 70%만큼 배양되면, 본 실험에 사용된 0, 0.1, 1 ppm 농도의 PDGFA와 I-PDGFA가 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 동안 배양하였다.
세포배양이 끝난 세포를 QIAzol Lysis Reagent (QIAGEN, 79306, USA) 를 이용하여 용해 후, 0.2 mL chloroform (Duksan, 67-66-3, Korea)을 첨가하여 상온에 방치하였다. 12,000 rpm, 4℃ 조건으로 20 min간 원심 분리하여 단백질이 포함된 하등액과 mRNA가 포함된 상등액을 분리하였고 상등액은 0.5 mL isopropanol (Merck, 109634, Germany)을 첨가하여 10 min간 상온에 방치한 다음 12,000 rpm, 4℃ 조건으로 원심 분리하여 RNA를 침전시키고 75% ethanol을 이용하여 세척 후 ethanol을 제거하고 상온에서 건조시켰다. 건조된 mRNA는 Diethylpyrocarbonate (DEPC, Biopure) water로 녹여 실험에 사용하였으며, 추출된 RNA는 Nanodrop (Nanodrop, USA)을 이용하여 260 nm/280 nm의 ratio 1.8 이상의 순도의 RNA만을 실험에 사용하였다. cDNA 합성은 Takara PrimeScript™ RT Master Mix (RR036A)를 사용하였다. PCR tube에 1 μg RNA, 5×PrimeScript RT Master Mix 4㎕, RNase Free dH2O를 total 20 μl로 제조 후 37℃에서 15 min, 85℃ 5sec 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
4-2. 5α-reductase 및 Androgen receptor 발현 감소 확인
탈모유발에 관여하는 인자 SRD5A1은 5a-reductase type 1으로 피부의 표피세포에서 발현하여 testosterone을 DHT로 전환하여 탈모를 유발시킨다. 5a-reductase를 감소시키면 탈모의 근본 원인을 제거할 수 있다. 또 다른 탈모유발에 관여하는 인자인 Androgen receptor(AR)은 DHT와 결합하여 탈모를 유발시키므로, AR 감소를 통해 DHT 결합을 막아 탈모를 감소시킬수 있다.
따라서, 상기 4-1에서 합성한 cDNA를 사용해 RT-PCR을 통하여 SRD5A1 및 Adngrogen receptor의 유전자 발현 감소를 확인하였다.
구체적으로, 표 3에서 나타낸 프라이머와 cDNA를 94°C에서 5분간 반응시킨 후 94°C에서 30초간 denaturation시키고, 적정온도(55 ~ 65°C)에서 30초간 annealing시킨 다음, 72°C에서 1분간 extension시키는 cycle을 30회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72°C에서 10분간 PCR machine(BIO-GENER)에서 수행하였다. 각 PCR products는 1.5% agarose gel에 loading하여 100 V 조건에서 30분간 전기영동을 통하여 분석하였다. 분석 후 ImageJ 프로그램을 통해 그래프로 수치화시켰다. 대조군으로는 housekeeping gene GAPDH를 사용하였다.
| 유전자 | 길이 (bp) |
Forword Sequences (5’→ 3') | 서열번호 | Reverse Sequences (5’→ 3') | 서열번호 |
| AR | 1004 | GGT AAG GGA AGT AGG TGG AA | 5 | CCT TCT AGC CCT TTG GTG TA | 6 |
| SRD5A1 | 370 | ACT GCA TCC TCC TGG CCA TGT TC | 7 | GGC ATA GCC ACA CCA CTC CAT GA | 8 |
| GAPDH (대조군) |
226 | GAA GGT GAA GGT CGG AGT | 9 | GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC | 10 |
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 인간 모유두세포에서 PDFGA는 농도에 관계 없이 SRD5A1의 발현 감소에 효과가 없었으나, I-PDGFA는 사용 농도가 증가함에 따라 SRD5A1의 농도를 유의하게 감소시킴으로 탈모에 효과가 있음을 확인하였다.
또한 도 6에서 나타낸 바와 같이, 인간 모유두세포에서 PDFGA는 농도에 관계 없이 AR의 발현 감소에 효과가 없었으나, I-PDGFA는 농도가 증가함에 따라 AR의 발현을 유의하게 감소시킴으로 탈모에 효과가 있음을 확인하였다.
이러한 결과를 통하여 혈소판 유래 성장인자를 단독으로 사용한 경우에 비해 세포 투과형 펩타이드와 결합시킨 경우 세포투과를 통한 세포 작용에 현저히 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
<110> BIO-FD&C
<120> Composition Comprising I-PDGFA fusion protein for Preventing or
Improving Hair Loss
<130> KPA2021-008
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 139
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I-PDGFA
<400> 1
Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Ser Ile
1 5 10 15
Glu Glu Ala Val Pro Ala Val Cys Lys Thr Arg Thr Val Ile Tyr Glu
20 25 30
Ile Pro Arg Ser Gln Val Asp Pro Thr Ser Ala Asn Phe Leu Ile Trp
35 40 45
Pro Pro Cys Val Glu Val Lys Arg Cys Thr Gly Cys Cys Asn Thr Ser
50 55 60
Ser Val Lys Cys Gln Pro Ser Arg Val His His Arg Ser Val Lys Val
65 70 75 80
Ala Lys Val Glu Tyr Val Arg Lys Lys Pro Lys Leu Lys Glu Val Gln
85 90 95
Val Arg Leu Glu Glu His Leu Glu Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ser Leu
100 105 110
Asn Pro Asp Tyr Arg Glu Glu Asp Thr Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly
115 120 125
Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys Pro Thr
130 135
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IntoCell
<400> 2
Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 417
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I-PDGFA cDNA
<400> 3
gtgagccgta gacgtagacg tagaggtggt cgtagacgta gaagcatcga ggaagctgtc 60
cccgctgtct gcaagaccag gacggtcatt tacgagattc ctcggagtca ggtcgacccc 120
acgtccgcca acttcctgat ctggcccccg tgcgtggagg tgaaacgctg caccggctgc 180
tgcaacacga gcagtgtcaa gtgccagccc tcccgcgtcc accaccgcag cgtcaaggtg 240
gccaaggtgg aatacgtcag gaagaagcca aaattaaaag aagtccaggt gaggttagag 300
gagcatttgg agtgcgcctg cgcgaccaca agcctgaatc cggattatcg ggaagaggac 360
acgggaaggc ctagggagtc aggtaaaaaa cggaaaagaa aaaggttaaa acccacc 417
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IntoCell DNA
<400> 4
gtgagccgta gacgtagacg tagaggtggt cgtagacgta ga 42
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AR Forword primer
<400> 5
ggtaagggaa gtaggtggaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AR Reverse primer
<400> 6
ccttctagcc ctttggtgta 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SRD5A1 Forword primer
<400> 7
actgcatcct cctggccatg ttc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SRD5A1 Reverse primer
<400> 8
ggcatagcca caccactcca tga 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Forword primer
<400> 9
gaaggtgaag gtcggagt 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Reverse primer
<400> 10
gaagatggtg atgggatttc 20
Claims (6)
- 세포 투과형 펩타이드와 혈소판 유래 성장인자가 융합된 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 세포투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질은 세포투과형 펩타이드가 혈소판 유래 성장인자의 N말단에 융합된 것인, 세포투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 따른 세포투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 또는 탈모 방지 또는 탈모 개선용 화장료 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 세포투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 또는 탈모 방지 또는 탈모 개선용 의약외품 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 세포투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 또는 탈모 방지 또는 탈모 개선용 약학적 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 세포투과형 혈소판 유래 성장인자 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 또는 탈모 방지 또는 탈모 개선용 식품 조성물.
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| KR1020210008104A KR20220105426A (ko) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 세포투과형 혈소판 유래 성장인자의 융합 단백질 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 개선용 조성물 |
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| KR1020210008104A KR20220105426A (ko) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 세포투과형 혈소판 유래 성장인자의 융합 단백질 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 개선용 조성물 |
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| KR20220105426A true KR20220105426A (ko) | 2022-07-27 |
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| KR102069184B1 (ko) | 2019-06-28 | 2020-01-22 | (주)미래씨티 | 신경줄기세포 추출물유래 bmp신호전달경로 억제 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 조성물 |
-
2021
- 2021-01-20 KR KR1020210008104A patent/KR20220105426A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102069184B1 (ko) | 2019-06-28 | 2020-01-22 | (주)미래씨티 | 신경줄기세포 추출물유래 bmp신호전달경로 억제 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 조성물 |
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|---|---|---|---|
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