PL187095B1

PL187095B1 - Peptyd, kompozycja farmaceutyczna zawierająca peptyd, zastosowanie peptydu oraz zastosowanie frakcji HPLC ekstraktu nowotworu glukagonoma

Info

Publication number: PL187095B1
Application number: PL97328732A
Authority: PL
Inventors: Lars Thim; Brigitte S. Wulff; Martin E. Judge; Ole D. Madsen; Jens J. Holst
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2004-05-31
Also published as: JP4064460B2; CA2246733A1; PL328732A1; CZ273698A3; NO984005L; HU229234B1; NO984005D0; FR13C0009I2; EP0891378B1; ATE227737T1; ES2364705T3; ES2187756T3; UA70283C2; NO323043B1; ATE395359T1; DE69717092T2; EP1975177A1; DE69738695D1; AU1871597A; CZ297338B6

Abstract

1 Peptyd o sekwencji aminokwasowej X1HX2D G S F S D E M N T X 3L D X 4LAX5X6D F I N W L X 7X8T K I T D X 9 w k tó re j................................................. 11. Peptyd o sekwencji aminokwasowej. X1HX2D G S f S D E M N T X 3LDX4LAX5X6D F I N W I X 7X8T\KITDX9 w której ...................................................... 20. Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca farmaceutycznie dopuszczalna zaróbke lub nosnik oraz substancje czynna, znam ienna tym, ze jako substancje czynna zawiera peptyd o sekwencji aminokwasowej. x 1h x 2d g s f s d e m n t x 3l d x 4l a x 5x 6d f i n w l x 7x 8t k i t d x 9 w której ................................................... 34 Zastosowanie peptydu o sekwencji aminokwasowej x 1h x 2d g s f s d e m n t x 3l d x 4l a x 5x 6d f i n w l x 7x 8t k i t d x 9 w k tó rej.......................... do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki lub leczenia chorób, lub zaburzen zwiazanych z uposledzona regulacja apetytu. 47 Zastosowanie frakcji HPLC ekstraktu nowotworu glukagonoma wytworzonego przez kwasna ekstrakcje etanolem, filtra- cje zelowa i preparatywna HPLC, przy czym wspomniana frakcje przedstawiono jako frakcje G4H9 na fig 2 1 zawiera ona jako glówny skladnik GLP-2 badz zawiera jakikolw iek pojedynczy skladnik wspomnianej frakcji albo kombinacje dwóch lub wiecej skladników wspomnianej frakcji, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest peptyd o sekwencji aminokwasowej:

X¹HX²DGSFSDEMNTX³LDX⁴LAX⁵X⁶DFINWLX⁷X⁸TKITDX⁹ w której χΐ oznacza NH2, DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR,

DFPEEVNIVEELRRR, χ2 oznacza Ala lub Gly,

X³ oznacza Ile lub Val, χ4 oznacza Asn, Ser lub His,

X⁵ oznacza Ala lub Thr,

X⁶ oznacza Arg lub Lys,

X oznacza Ile lub Leu,

X⁸ oznacza Gln lub His, a

X⁹ oznacza OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg lub Lys-Lys, z wyjątkiem sekwencji:

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD,

HADGSFSDEMNTILDNLAŁRDFINW'L1QTKITD,

HADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITD,

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDRK,

HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITDKK,

HADGSFSDEMNTVLDNLATTD)FrNWLLHTKITDRK,

HADGSFSDEMNTVLDSLATRDFINWLLQTKITD,

HADGSFSDEMNTVLDSLATRDFINWLLQTKITDRK,,

HADGSFSDEMN'T'IF.DSFATRDFINWLIQTKITD,

HADGSFSDEMNTILDSLATRDFINWLIQTKITDKK,

HADGSFSDEMNTVLDHLATKDFINWLIQTKITDRK,

HADGSFSDEMNTVLDHLATKDFINWLIQTKITD,

HADGSFSDEMNTIFDNLATRDFINAW'LIQT'KIT'DRK.

Korzystnie χΐ oznacza NH2.

Korzystnie X2 oznacza Ala.

Korzystnie X³ oznacza Ile.

Korzystnie X4 oznacza Asn.

Korzystnie X5 oznacza Ala.

Korzystnie X6 oznacza Arg.

Korzystnie X oznacza Ile.

Korzystnie X8 oznacza Gln.

Korzystnie X⁹ oznacza OH.

Przedmiot wynalazku stanowi także peptyd o sekwencji aminokwasowej:

x'hx²dgsfsdemntx³ldx⁴lax5x⁶dfinwlx7x8tkitdx9 w której Xi oznacza NH2, DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR,

DFPEEVNIVEELRRR, χ2 oznacza Gly, χ3 oznacza Ile lub Val, χ4 oznacza Asn, Ser lub His, χ5 oznacza Ala lub Thr, χ6 oznacza Arg lub Lys,

X oznacza Ile lub Leu, χ8 oznacza Gln lub His, a χ9 oznacza OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg lub Lys-Lys.

Korzystnie χΐ oznacza NH2.

187 095

Korzystnie X3 oznacza Ile.

Korzystnie X4 oznacza Asn.

Korzystnie X5 oznacza Ala.

Korzystnie X⁶ oznacza Arg.

Korzystnie X oznacza Ile.

Korzystnie X⁸ oznacza Gln.

Korzystnie X⁹ oznacza OH.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę lub nośnik oraz substancję czynną, charakteryzującą się tym, że jako substancję czynną zawiera peptyd o sekwencji aminokwasowej:

x¹hx²dgsfsdemntx³ldx⁴lax5x⁶dfinwlx7x8tkitdx⁹ w której Xi oznacza NH2, DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR,

DFPEEVNIVEELRRR,

X oznacza Ala lub Gly,

X3 oznacza Ile lub Val,

X4 oznacza Asn, Ser lub His, c

X oznacza Ala lub Thr,

X oznacza Arg lub Lys,

X oznacza Ile lub Leu,

X oznacza Gln lub His, a

X9 oznacza OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg lub Lys-Lys.

Korzystnie przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca peptyd, który posiada sekwencję:

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD,

HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD lub

HADGSFSDEMNTVLDNLATRDF]NWLLHTKITD.

Korzystnie kompozycja zawiera również inny czynnik hamujący łaknienie lub indukujący sytość, przy czym inny czynnik hamujący łaknienie lub indukujący sytość to glukagonopodobny peptyd-1.

Korzystnie ilość peptydu mieści się w zakresie od 10 gg/kg masy ciała do 5 mg/kg masy ciała.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie peptydu o sekwencji aminokwasowej:

X^lHX²DGSFSDEMNTX³ŁDX⁴ŁAχ5χ6DFINWŁχ7χ8τK]TDχ9 w której Xi oznacza NH2, DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR,

DFPEEVNIVEELRRR,

X oznacza Ala lub Gly,

X3 oznacza Ile lub Val,

X4 oznacza Asn, Ser lub His,

X5 oznacza Ala lub Thr,

X oznacza Arg lub Lys,

X oznacza Ile lub Leu,

X8 oznacza Gln lub His, a

X⁹ oznacza OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg lub Lys-Lys, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki lub leczenia chorób, lub zaburzeń związanych z upośledzoną regulacją apetytu, zwłaszcza do profilaktyki lub leczenia otyłości, lub cukrzycy typu II.

Przedmiot wynalazku stanowi także zastosowanie frakcji HPLC ekstraktu nowotworu glukagonoma wytworzonego przez kwaśną ekstrakcję etanolem, filtrację żelową i preparatywną HPLC, przy czym wspomnianą frakcję przedstawiono jako frakcję G4H9 na fig. 2 i zawiera ona jako główny składnik GLP-2 bądź zawiera jakikolwiek pojedynczy składnik wspomnianej frakcji albo kombinację dwóch lub więcej składników wspomnianej frakcji, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, zwłaszcza do profilaktyki lub leczenia chorób, lub

187 095 zaburzeń związanych z upośledzoną regulacją apetytu, w szczególności do profilaktyki lub leczenia otyłości, lub cukrzycy typu II.

W niniejszym opisie, termin „peptyd” rozumie się jako obejmujący dojrzały peptyd GLP-2 lub jego formę prekursorowa, jak również jego funkcjonalny Fragment, który zasadniczo posiada aktywność peptydu o pełnej długości. Ponadto, zamiarem jest, aby termin „peptyd” obejmował homologi rzeczonego peptydu. Takie homologi zawierają sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 50% identyczności, takie jak te o co najmniej 75%, a szczególnie o co najmniej 90% identyc;zności, z sekwo^Ją aminokwasową GLP-2 ll^i^^-k^ogo. Poziom identyczności można określać konwencjonalnymi metodami, patrz na przykład Altshul i in., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 oraz HenikoF i HenikoF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992.

Homologi niniejszego peptydu mogą posiadać jedno lub więcej podstawień, delecji lub addycji aminokwasowych. Zmiany te mogą mieć nieznaczny charakter, tj. mogą to być konserwatywne podstawienia aminokwasowe, które nie wpływaśą znacząco na ufałdowanie lub aktywność peptydu, niewielkie delecje, zazwyczaj jednego do pięciu aminokwasów, niewielkie wydłużenia końca aminowego lub karboksylowego, takie jak reszta metioninowa na końcu aminowym, krótki peptyd łączący, długości do 15 reszt, lub małe wydłużenie, które ułatwia oczyszczanie, takie jak odcinek polihistydynowy, epitop antygenowy lub domena wiążąca. Patrz informacje ogólne Ford in. , Protein Expression and PuriFication 2: 95-107, 1991. Przykładami podstawień konserwatywnych są te występujące wewnątrz grup aminokwasów zasadowych (takich jak arginina, lizyna, histydyna), aminokwasów kwaśnych (takich jak kwas glutaminowy i kwas asparaginowy), aminokwasów polarnych (takich jak glutamina i asparagina), aminokwasów hydrofobowych (takich jak leucyna, izoleucyna, walina), aminokwasów aromatycznych (takich jak fenyloalanina, tryptofan, tyrozyna) i małych aminokwasów (takich jak glicyna, alanina, seryna, treonina, metionina).

Homologiem może być wariant allelowy, tj. alternatywna forma genu, która powstaje w wyniku mutacji, lub zmieniony peptyd kodowany przez zmutowany gen, ale posiadający zasadniczo taką samą aktywność jak natywny peptyd GLP-2. Tak więc, mutacje mogą być milczące (bez zmiany w kodowanym peptydzie) lub mogą kodować peptydy o zmienionej sekwencji aminokwasowej.

Homologiem niniejszego peptydu może być również homolog gatunkowy, tj. peptyd o podobnej aktywności uzyskany z innego gatunku. Przykładami gatunkowych homologów peptydu GLP-2 są GLP-2 człowieka, wołu, szczura, chomika, świnki morskiej i świni.

W korzystnym rozwiązaniu niniejszego wynalazku, peptydem GLP-2 jest peptyd, w którym X¹ jest NHL·, X² jest Ala, X³ jest Ile;, χ4 jest Asn, χ5 jest Ala, X⁶ jest Arg, χ7 jest Ile, X⁸ jest Gln, a X⁹ jest OH.

W szczególności, peptyd ma następującą sekwencję aminokwasową:

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD (GLP-2 człowieka) lub

HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD (GLP-2 szczura), lub

HADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITD (GLP-2 świni).

Homolog peptydu można wyizolować poprzez przygotowanie biblioteki genomowej lub cDNA komórki danego gatunku i przeszukanie pod kątem sekwencji DNA kodujących cały homolog lub jego część, przy zastosowaniu jako sond oligonukleotydów syntetycznych, zgodnie ze standardowymi technikami, np. jak opisali Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989, lub za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu specyficznych starterów, jak opisali w Sambrook i in., supra.

Niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji zawierającej wariant peptydu GLP-2. Wariantem jest peptyd, w którym jedną lub więcej reszt aminokwasowych podstawiono innymi resztami aminokwasowymi. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, Ala w pozycji 2 dojrzałego peptydu podstawiono Gly. Oczekuje się, że ten wariant będzie wykazywał dłuższy

187 095 okres półtrwania w osoczu niż natywny peptyd, co jest korzystne, ponieważ generalnie niższe będzie dawkowanie wymagane do uzyskania odpowiedniego wpływu obniżenia łaknienia lub wywołania sytości.

Wymienione powyżej peptyd GLP-2 lub jego homolog bądź wariant można wytwarzać technikami rekombinacji DNA zgodnie z dobrze znanymi w tej dziedzinie procedurami.

Bardziej szczegółowo, sekwencję DNA kodującą peptyd GLP-2 można wyizolować lub zsyntetyzować na podstawie opublikowanej sekwencji DNA dla ludzkiego preproglukagonu (patrz J. W. White i in., Nucleic Acids Res. 14, 1986, str. 4719-4730; G. I. Bell i in., Nature 304, 1983, str. 368-371); na przykład można ją otrzymać przez przygotowanie biblioteki genomowej lub cDNA z odpowiedniej tkanki i przeszukiwanie pod kątem sekwencji DNA kodujących cały peptyd GLP-2 lub jego część za pomocą hybrydyzacji, przy wykorzystaniu jako sond syntetycznych oligonukleotydów, zgodnie ze standardowymi technikami (patrz Sambrook i in., supra). Do niniejszych celów, sekwencja DNA kodująca peptyd GLP-2 jest korzystnie pochodzenia ludzkiego.

Konstrukcję DNA kodującą peptyd GLP-2 można również przygotować syntetycznie znanymi metodami standardowymi, np. metodą z wykorzystaniem fosforynoamidów opisaną przez Beaucage i Caruthersa, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, lub metodą opisaną przez Matthesa i in., EMBO Journal 3 (1984), 801-805. Oligonukleotydy syntetyzuje się zgodnie z metodą wykorzystującą fosforynoamidy np. w automatycznym syntezatorze DNA, oczyszcza, hybrydyzuje, liguje i klonuje w odpowiednich wektorach.

Ponadto, konstrukcja DNA może mieć pochodzenie mieszane, syntetyczne i genomowe, syntetyczne i z cDNA lub genomowe i z cDNA, i można ją uzyskać przez ligację odpowiadających różnym częściom całej konstrukcji DNA fragmentów pochodzenia syntetycznego, genomowego i cDNA (jak jest to właściwe), zgodnie ze standardowymi technikami.

Konstrukcję DNA można także przygotować przez reakcję łańcuchową polimerazy stosując specyficzne startery, na przykład jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 683 202 lub Saiki i in., Science 239 (1988), 487-491, bądź Sambrook i in., supra.

W aktualnym korzystnym rozwiązaniu, konstrukcja DNA obejmuje sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 w G. I. Bell i in., Nature 304,1983, str. 368-371, jak również sekwencje kwasów nukleinowych kodujące ludzki GLP-2, które jednakże różnią się od sekwencji DNA przedstawionej na fig. 3 z Bell i in., supra, w wyniku degeneracji kodu genetycznego. Konstrukcja DNA obejmuje ponadto sekwencje kwasów nukleinowych, które hybrydyzujjiz cząsteczką kwasów nukleinowych (pochodzenia genomowego, syntetycznego, cDNA lub RNA) kodującą ludzki GLP-2 w warunkach wysokiej selektywności (tj. wstępne moczenie w 5 x SSC i prehybrydyzacja w ciągu 1 godziny w temperaturze około 40°C w roztworze 20% formamidu, 5 x roztworze Denhardta, 50 mM fosforanie sodowym, pH 6,8 i z 50 [tg zdenaturowanego sonikowanego DNA z grasicy cielęcej, następnie hybrydyzacja w ciągu 18 godzin w temperaturze około 40°C w tym samym roztworze uzupełnionym 100 μΜ ATP, następnie płukanie w 0,4 x SSC w temperaturze około 45°C). Mogłyby to być na przykład sekwencje DNA kodujące GLP-2 innych gatunków, np. GLP-2 szczura, bydła, chomika, świnki morskiej, czy świni.

Do ekspresji GLP-2, konstrukcję DNA kodującą peptyd GLP-2 wstawia się do odpowiedniego wektora rekombinacyjnego. Może to być jakikolwiek wektor, który można dogodnie poddawać procedurom rekombinacji DNA, i wybór wektora często będzie zależał od komórki gospodarza, do której ma on zostać wprowadzony. Tak więc, wektorem może być wektor ulegający autonomicznej replikacji, tj. wektor, który występuje jako jednostka pozachromosomalna, której replikacja jest niezależna od replikacji chromosomu, np. plazmid. Alternatywnie, wektorem może być wektor, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza ulega integracji z genomem komórki gospodarza i replikacji wraz z chromosomem(ami), z którym uległ integracji.

Korzystnie, wektorem jest wektor ekspresyjny, w którym sekwencja DNA kodująca peptyd GLP-2 jest połączona w sposób umożliwiający działanie z dodatkowymi odcinkami wymaganymi do transkrypcji DNA. Na ogół, wektor ekspresyjny pochodzi z DNA plazmidowego lub wirusowego, lub może zawierać elementy obu z nich. Termin „połączony w sposób umożliwiający działanie” wskazuje, że odcinki są tak ułożone, że wszystkie działają zgodnie

187 095 z przewidzianym zastosowaniem, tj. transkrypcja ulega inicjacji w promotorze i rozciąga się na sekwencję DNA kodującą peptyd.

Promotorem może być jakakolwiek sekwencja DNA wykazująca aktywność transkrypcyjną w wybranej komórce gospodarza i może on pochodzić z genów kodujących zarówno białka homologiczne, jak i heterologiczne dla komórki gospodarza.

Przykładami promotorów odpowiednich do kierowania transkrypcją DNA kodującego peptyd GLP-2 w komórkach ssaków są promotor SV40 (Subramani i in., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), promotor MT-1 (genu metalotioneiny) (Palminter i in., Science 222 (1983), 809-814) lub główny promotor fazy późnej adenowirusa 2.

Przykładem promotora odpowiedniego do stosowania w komórkach owadów jest promotor poliedryny (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 745 051; Vasuvedan i in., fEbS Lett. 311, (1992) 7-11), promotor PIO (J. M. Vlak i in., J. Gen. Virology 69, 1988, str. 765-776), promotor białka wirusowego poliedrozy Autographa callfotmica (europejski opis patentowy numer 397 485), promotor natychmiastowego wczesnego genu 1 bakulowirusa (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 155 037; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 162 222) lub promotor wczesnego genu opóźnionego 39K bakulowirusa (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 155 037; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 162 222).

Przykłady promotorów odpowiednich do stosowania w drożdżowych komórkach gospodarza obejmują promotory drożdżowych genów glikolitycznych (Hitzeman i in., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber i Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) oraz promotory genów dehydrogenazy alkoholowej (Young i in., w: Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (red. Hollaender i in.), Plenum Press, Nowy Jork, 1982) lub TPI1 (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 599 311) bądź ADH2-4c (Russell i in., Nature 304 (1983), 652-654).

Przykładami promotorów odpowiednich do stosowania w komórkach gospodarza grzybów nitkowatych są promotor ADH3 (McKnight i in., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) lub promotor tpiA. Przykładami innych użytecznych promotorów są te pochodzące z genów kodujących amylazę TAKA A. oryzae, proteinazę asparaginianowa Rhizomucor miehei, obojętną α-amylazę A. niger, α-amylazę kwasoopomą A. niger, glukoamylazę (gluA) A. niger lub A. awamori, lipazę Rhizomucor miehei, proteazę alkaliczną A. oryzae, izomerazę triozofosforanowąA. oryzae lub acetamidazę A. nidulans. Korzystne sąpromotory amylazy TAKA i gluA.

Przykłady promotorów odpowiednich do stosowania w komórkach gospodarzy bakteryjnych obejmują promotor genu amylazy maltogennej Bacillus stearothermophilus, genu alfa-amylazy Bacillus licheniformis, genu amylazy BAN Bacillus amyloliquefaciens, genu proteazy alkalicznej Bacillus subtilis lub genu ksylozydazy Bacillus pumilus bądź promotory Pr lub Pl faga Lambda lub promotory lac, trp bądź tac E. coli.

Sekwencja DNA kodująca peptyd GLP-2 może również, jeśli jest to konieczne, być połączona w sposób umożliwiający działanie z odpowiednią sekwencją terminującą, taką jak sekwencja terminująca ludzkiego hormonu wzrostu (Palmiter i in., op. cit.) lub (dla gospodarzy grzybowych) sekwencjami terminującymi TPI1 (Alber i Kawasaki, op. cit.) lub ADH3 (McKnight i in., op. cit.). Ponadto, wektor może zawierać takie elementy, jak sygnały poliadenylacji (np. z SV40 lub regionu Elb adenowirusa 5), sekwencje wzmacniające transkrypcję (np. sekwencja wzmacniająca SV40) i sekwencje wzmacniające translację (np. te kodujące RNA VA adenowirusa).

Wektor rekombinacyjny może ponadto zawierać sekwencję DNA umożliwiającą replikację wektora w danej komórce gospodarza. Przykładem takiej sekwencji (gdy komórką gospodarza jest komórka ssaka) jest miejsce początku replikacji SV40.

Jeśli komórką gospodarza jest komórka drożdżowa, odpowiednimi sekwencjami umożliwiającymi replikację wektora są geny replikacji REP 1-3 i miejsce początku replikacji drożdżowego plazmidu 2μ.

Wektor może również zawierać marker selekcyjny, tj. gen, którego produkt komplementuje defekt w komórce gospodarza, taki jak gen kodujący reduktazę dihydrofolianową (DHFR) lub gen TPI Schizosaccharomycespombe (opisany w P.R. Russell, Gene 40, 1985, str. 125-130),

187 095 lub taki, który nadaje oporność na antybiotyk, np. ampicylinę, kanamycynę, tetracyklinę, chloramfenikol, neomycynę, higromycynę lub metotreksat. Markery selekcyjne dla grzybów nitkowatych obejmują amdS, pyrG, argB, niaD, sC.

W celu skierowania peptydu GLP-2 na szlak wydzielania komórki gospodarza, w wektorze rekombinacyjnym można zapewnić sekwencję sygnałową wydzielania (znaną także jako sekwencja liderowa, preprosekwencja lub prosekwencja). Sekwencja sygnałowa wydzielania jest połączona z sekwencją DNA kodującą peptyd we właściwej ramce odczytu. Zazwyczaj sekwencje sygnałowe wydzielania są położone na końcu 5' sekwencji DNA kodującej peptyd. Sekwencją sygnałową wydzielania może być sekwencja normalnie występująca z peptydem lub może ona pochodzić z genu kodującego inne wydzielane białko.

Dla wydzielania z komórek drożdżowych, sekwencja sygnałowa wydzielania może kodować dowolny peptyd sygnałowy zapewniający wydajne kierowanie peptydu ulegającego ekspresji na szlak wydzielniczy komórki. Peptydem sygnałowym może być naturalnie występujący peptyd sygnałowy, lub jego funkcjonalna część, lub może to być peptyd syntetyczny. Stwierdzono, że odpowiednimi peptydami sygnałowymi są peptyd sygnałowy czynnika a (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 870 008), peptyd sygnałowy mysiej amylazy ze śliny (patrz O. Hagenbuchle i in., Nature 289, 1981, str. 643-646), zmodyfikowany peptyd sygnałowy karboksypeptydazy (patrz L.A. Vails i in., Cell 48, 1987, str. 887-897), drożdżowy peptyd sygnałowy BARI (patrz zgłoszenie patentowe WO 87/02670) lub peptyd sygnałowy drożdżowej proteazy asparaginianowej 3 (YAP3) (patrz M. Egel-Mitani i in., Yeast 6, 1990, str. 127-137).

Aby uzyskać wydajne wydzielanie w drożdżach, można również wstawić sekwencję kodującą peptyd liderowy za sekwencją sygnałową, a przed sekwencją DNA kodującą peptyd GLP-2. Funkcją peptydu liderowego jest umożliwienie kierowania ulegającego ekspresji peptydu z retikulum endoplazmatycznego do aparatu Golgi'ego, a następnie do pęcherzyka wydzielniczego dla wydzielania do podłoża hodowlanego (tj. przeniesienie peptydu poprzez ścianę komórkową, lub przynajmniej przez błonę cytoplazmatyczną, do przestrzeni periplazmatycznej komórki drożdżowej). Peptydem liderowym może być lider drożdżowego czynnika a (którego stosowanie opisano np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 546 082; europejskim opisie patentowym numer 16 201, europejskim opisie patentowym numer 123 294; europejskim opisie patentowym numer 123 544 i europejskim opisie patentowym numer 163 529). Alternatywnie, peptydem liderowym może być syntetyczny peptyd liderowy, to znaczy peptyd liderowy nie występujący w przyrodzie. Syntetyczne peptydy liderowe można na przykład konstruować jak opisano w zgłoszeniu patentowym WO 89/02463 lub WO 92/11378.

Peptyd sygnałowy do stosowania w grzybach nitkowatych może dogodnie pochodzić z genu kodującego amylazę lub glukoamylazę Aspergillus sp., genu kodującego lipazę lub proteazę Rhizomucor miehei i lipazę Humicola languinosa. Korzystnie, peptyd sygnałowy pochodzi z genu kodującego amylazę TAKA A. oryzae, obojętną a-amylazę A. niger, amylazę kwasoopomą A. niger lub glukoamylazę A. niger.

Peptyd sygnałowy do stosowania w komórkach owadów może dogodnie pochodzić z genu owada (patrz opis zgłoszenia patentowego WO 90/05783), taki jak peptyd sygnałowy prekursora hormonu adipokinetycznego motyla Manduca sexta (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 023 328).

Procedury wykorzystywane do ligacji sekwencji kodujących peptyd GLP-2, promotor i ewentualnie sekwencję terminującą i/lub sekwencję sygnałową wydzielania oraz do wstawiania ich do odpowiednich wektorów zawierających informację niezbędną do replikacji, są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie (patrz na przykład Sambrook i in., op. cit.).

Kodująca peptyd GLP-2 sekwencja DNA wprowadzana do komórki gospodarza może być dla danego gospodarza zarówno homologiczna, jak i heterologiczna. Jeśli jest ona homologiczna dla komórki gospodarza, tj. wytwarzana przez komórkę gospodarza w przyrodzie, zazwyczaj jest połączona w sposób umożliwiający działanie z inną sekwencją promotorową i, w razie potrzeby, z inną sekwencją sygnałową wydzielania i/lub sekwencją terminującą. Zamierza się, aby termin „homologiczna” obejmował sekwencję cDNA kodującą polipeptyd

187 095 naturalnie występujący w danym organizmie gospodarza. Zamierza się, aby termin „heterologiczna” obejmował sekwencję DNA, która nie ulega ekspresji w komórce gospodarza w przyrodzie. Tak więc, sekwencja DNA może pochodzić z innego organizmu lub może to być sekwencja syntetyczna.

Komórką gospodarza, do której wprowadza się konstrukcję DNA lub wektor rekombinacyjny według wynalazku, może być jakakolwiek komórka zdolna do wytwarzania niniejszego peptydu; obejmuje ona komórki bakterii, drożdży, grzybów i wyższych eukariontów.

Przykładami komórek gospodarza bakteryjnego, które podczas hodowli są zdolne do wytwarzania peptydu GLP-2, są bakterie Gram-dodatnie, takie jak szczepy Bacillus, jak B. subtilis, B. llcheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium lub B. thuringiensis, oraz szczepy Streptomyces, takie jak S. lividans lub S. murinus, bądź bakterie Gram-ujemne, takie jak Escherichia coli. Transformację bakterii można uzyskać dzięki transformacji protoplastów lub wykorzystując komórki kompetentne przy użyciu powszechnie znanych metod (patrz Sambrook i in., supra).

Podczas ekspresji peptydu w bakteriach takich jak E. coli, peptyd może być zatrzymywany w cytoplazmie, zazwyczaj w postaci nierozpuszczalnych ziarnistości (znanych jako ciałka wtrętowe), lub może być kierowany przez bakteryjną sekwencję wydzielania do przestrzeni peripłazmatycznej. W pierwszym przypadku komórki lizuje się, a ziarnistości odzyskuje i denaturuje, po czym peptyd poddaje się ponownemu ufałdowywaniu przez rozcieńczenie czynnika denaturującego. W drugim przypadku, peptyd można odzyskiwać z przestrzeni peripłazmatycznej poprzez rozbicie komórek, np. przez sonikację lub szok osmotyczny dla uwolnienia zawartości przestrzeni peripłazmatycznej i odzyskania peptydu.

Przykładami odpowiednich linii komórek ssaków są linie komórkowe COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL39) lub CHO (ATCC CCL 61). Metody transfekcji komórek ssaków i ekspresji wprowadzonych do komórek sekwencji DNA opisano np. w Kaufman i Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern i Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-34l; Loyter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 422-426; Wigier i in., Celi 14 (1978), 725; Corsaro i Pearson, Somatic Celi Genetics 7 (1981), 603, Graham i van der Eb, Virology 52 (1973), 456 oraz Neumann i in., EMBOJ. 1 (1982), 841-845.

Przykłady odpowiednich komórek drożdżowych obejmują komórki Saccharomyces spp. lub Schizosaccharomyces spp., w szczególności szczepy Saccharomyces cerevisiae lub Saccharomyces kluyveri. Metody transformacji komórek drożdżowych heterologicznym DNA i wytwarzania heterologicznych polipeptydów opisano np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 599 311, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 931 373, opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 870 008 i 5 037 743 oraz opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 845 075, z których wszystkie włączono w ten sposób do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe. Stransformowane komórki selekcjonuje się dzięki fenotypowi determinowanemu przez marker selekcyjny, zazwyczaj oporności na antybiotyk lub zdolności do wzrostu w nieobecności określonego składnika odżywczego, np. leucyny. Korzystnym wektorem do stosowania w drożdżach jest wektor POT1 ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 931 373. Sekwencję DNA kodującą peptyd GLP-2 może poprzedzać sekwencja sygnałowa i ewentualnie sekwencja liderowa, np. jak opisano powyżej. Dalszymi przykładami odpowiednich komórek drożdżowych są szczepy Kluyveromyces, takie jak K lactis, Hansenula, np. H. polymorpha lub Pichia, np. P. pastoris (patrz Gleeson i in., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, str. 3459-3465; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 882 279).

Przykładami innych komórek grzybów są komórki grzybów nitkowatych, np. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. lub Trichoderma spp., w szczególności szczepy A. oryzae, A. nidulans lub A. niger. Stosowanie Aspergillus spp. do ekspresji białek opisano np. w europejskim opisie patentowym numer 272 277 i europejskim opisie patentowym numer 230 023. Transformację F. oxysporum można, na przykład, przeprowadzić jak opisali Malardier i in., 1989, Gene 78: 147-156.

187 095

Jeśli jako komórkę gospodarza stosuje się grzyb nitkowaty, dla otrzymania zrekombinowanej komórki gospodarza można ją dogodnie transformować konstrukcją DNA kodującą peptyd GLP-2 poprzez integrację konstrukcji DNA z chromosomem gospodarza. Zasadniczo uważa się, że integracja jest zaletą, gdyż bardziej prawdopodobne jest stabilne utrzymywanie sekwencji DNA w komórce. Integrację konstrukcji DNA z chromosomem gospodarza można przeprowadzić zgodnie z konwencjonalnymi metodami, np. poprzez rekombinację homologiczną lub heterologiczną.

Transformację komórek owadów i wytwarzanie w nich heterologicznych polipeptydów można prowadzić jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 745 051; opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 879 236; opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 155 037 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 162 222; europejskim opisie patentowym numer 397 485, z których wszystkie włączono w ten sposób do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe. Odpowiednimi liniami komórek owadów stosowanymi jako gospodarz mogą być linie komórkowe Lepidoptera, takie jak komórki Spodoptera frugiperda lub komórki Trichoplusia ni (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 077 214). Odpowiednimi warunkami hodowli mogą być na przykład te opisane w światowym opisie patentowym numer 89/01029 lub światowym opisie patentowym numer 89/01028 bądź w którymkolwiek z wymienionych powyżej odnośników literaturowych.

Opisane powyżej stransformowane lub stransfekowane komórki gospodarza hoduje się następnie w odpowiednim podłożu odżywczym, w warunkach umożliwiających ekspresję peptydu GLP-2, po czym powstały peptyd GLP-2 odzyskuje się z hodowli.

Podłożem stosowanym do hodowli komórek może być jakiekolwiek konwencjonalne podłoże odpowiednie do hodowli komórek gospodarza, takie jak minimalne lub złożone podłoża zawierające odpowiednie uzupełnienia. Odpowiednie podłoża są dostępne komercjalnie lub można je przygotowywać zgodnie z opublikowanymi recepturami (np. w katalogach American Type Culture Collection). Peptyd GLP-2 wytworzony przez komórki można następnie odzyskać z podłoża hodowlanego za pomocą konwencjonalnych procedur, obejmujących oddzielanie komórek gospodarza od podłoża hodowlanego poprzez wirowanie lub sączenie, wytrącanie białkowych składników supematantu lub przesączu za pomocą soli, np. siarczanu amonu, oczyszczanie za pomocą różnych procedur chromatograficznych, np. chromatografii jonowymiennej, sączenia molekularnego, chromatografii powinowactwa lub podobnych.

W kompozycji Farmaceutycznej według wynalazku, peptydowi GLP-2 można nadawać dowolną postać znanymi metodami nadawania postaci kompozycji farmaceutycznych, np. jak opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985. Kompozycja może mieć postać odpowiednią do iniekcji ogólnoustrojowych lub wlewu i jako taka, może zostać utworzona przy użyciu odpowiedniego płynnego podłoża, takiego jak sterylna woda lub izotoniczny roztwór soli bądź glukozy. Kompozycje można sterylizować przy użyciu konwencjonalnych technik sterylizacji, które są dobrze znane w tej dziedzinie. Otrzymane wodne roztwory można pakować do użycia lub sączyć w warunkach aseptycznych i liofilizować; liofilizowane preparaty łączy się z jałowym roztworem wodnym przed podaniem. Kompozycja może zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje wspomagające, jak wymagane do przybliżenia jej do warunków fizjologicznych, takie jak czynniki buforujące, czynniki tonizujące i podobne, na przykład octan sodowy, mleczan sodowy, chlorek sodowy, chlorek potasowy, chlorek wapniowy, itd.

Kompozycję farmaceutyczną według niniejszego wynalazku można również przystosować do podawania donosowego, przezskómego, dopłucnego lub doodbytniczego. Farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem wykorzystanym w kompozycji może być, jakikolwiek konwencjonalny nośnik stały. Przykładami stałych nośników są laktoza, siarczan wapniowy, sacharoza, talk, żelatyna, agar, pektyna, guma arabska, stearynian magnezowy i kwas stearynowy. Podobnie, nośnik lub rozcieńczalnik może zawierać jakikolwiek znany w tej dziedzinie materiał spowalniający uwalnianie, taki jak monostearynian glicerolu, distearynian glicerolu, sam lub zmieszany z woskiem.

Szczególnie korzystne może być zapewnienie kompozycji według wynalazku w postaci o spowolnionym uwalnianiu. W tym przypadku, kompozycji można nadawać postać

187 095 mikrokapsułek lub mikrocząstek zawierających peptyd GLP-2 zamknięty w kapsułkach lub zawieszony w odpowiednim, farmaceutycznie dopuszczalnym, polimerze ulegającym biodegradacji, takim jak kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy lub kopolimer kwasu mlekowego i glikolowego.

Preparat do podawania donosowego może zawierać peptyd GLP-2 rozpuszczony lub zawieszony w płynnym nośniku, w szczególności nośniku wodnym do stosowania w postaci areozolu. Nośnik może zawierać takie dodatki, jak czynniki rozpuszczające, np. glikol propylenowy, substancje powierzchniowo czynne, substancje wzmacniające wchłanianie, takie jak lecytyna (fosfatydylocholina) lub cyklodekstryna, lub konserwanty, takie jak parabeny.

Zasadniczo, związki według niniejszego wynalazku porcjuje się w postaci do dawkowania jednostkowego, zawierającej 0,5-500 mg peptydu wraz z przypadającym na dawkę jednostkową farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Uważa się, że korzystne jest stosowanie peptydu GLP-2 w hamowaniu łaknienia i indukcji sytości, np. w profilaktyce lub leczeniu chorób lub zaburzeń związanych z upośledzoną regulacją łaknienia. Przykładami takich chorób lub zaburzeń są otyłość i cukrzyca typu II. Dawkowanie peptydu GLP-2 podawanego pacjentowi będzie zróżnicowane w zależności od rodzaju i ciężkości leczonego stanu, ale zasadniczo będzie pozostawać w zakresie od około 10 ng/kg do około 5 mg/kg wagi ciała.

W kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, peptyd GLP-2 można łączyć z innym czynnikiem hamującym łaknienie lub indukującym sytość. Przykładem takiego czynnika jest GLP-1, dla którego wykazano pewien wpływ na hamowanie łaknienia (patrz M. D. Turton i in., Nature 379, 4 stycznia 1996, str. 69-72).

Uważa się ponadto, że peptyd GLP-2 w odpowiednio znakowanej postaci, np. znakowany izotopem promieniotwórczym, można stosować do identyfikacji receptora GLP-2 w badaniach wiązania przy użyciu tkanki(ek), w której, jak się przewiduje, zachodzi ekspresja receptora GLP-2, np. tkanki podwzgórza. Po zlokalizowaniu przez wiązanie GLP-2, receptor można sklonować przez klonowanie ekspresyjne, tj. przez przygotowanie biblioteki cDNA danej tkanki, sklonowanie cDNA w odpowiednich wektorach i wprowadzenie wektorów do odpowiedniej komórki dla uzyskania ekspresji cDNA, po czym klon, w którym zachodzi ekspresja receptora, identyfikuje się przez wiązanie GLP-2. Następnie linię komórkową, w której zachodzi stabilna ekspresja receptora można wykorzystywać w oznaczeniach przeszukiwania pod kątem agonów GLP-2 (tj. związków, których działanie na receptor indukuje sytość lub hamuje łaknienie) lub antagonów GLP-2 (tj. związków, które działają na receptor przeciwnie niż GLP-2, np. w celu ich wykorzystania do leczenia anoreksji na tle nowotworowym lub anorexia nervosa).

Wynalazek ilustrują dodatkowo poniższe przykłady, których celem nie jest w jakikolwiek sposób ograniczanie zakresu zastrzeganego wynalazku.

Przykład 1

Kwaśna ekstrakcja tkanki nowotworu etanolem

Anorektyczne nowotwory u szczurów utworzono w sposób opisany uprzednio (Madsen, O.D. i in. (1993) Endocrinology 133, 2022-2030). Pięćdziesiąt anorektycznych nowotworów 12C3AN (MSL-G-AN) (w temperaturze -80°C), odpowiadających 50,07 g mokrej tkanki, zhomogenizowano w temperaturze 4°C w 4P 700 ml zakwaszonego etanolu (96% etanol/0,7 M HC1, 3/1, v/v). Homogenizację prowadzono w ciągu 5 minut w uprzednio schłodzonym (4°C) Waring Commercial Blender o pojemności 2 litrów przy maksymalnej prędkości. Po homogenizacji mieszaninę mieszano w ciągu 16 godzin w temperaturze 4°C. Mieszaninę wirowano przy 9000 obrotów na minutę w temperaturze 4°C w ciągu 1 godziny. Objętość supematantu zmniejszono do 20% przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce obrotowej. Podczas tego procesu, w którym główna część etanolu zostaje usunięta, tworzy się nieco osadu. Osad usunięto przez wirowanie w temperaturze 4°C w ciągu jednej godziny przy 20 000 obrotów na minutę. Supernatant, który nadal zawierał nieco materiału lipidopodobnego, przesączono i nałożono, przy szybkości przepływu 2 ml/minutę, na kolumnę LiChroprep RP-18 (Merck) (2,5 x 10 cm) zrównoważoną 0,1% TFA. Kolumnę przemyto 100 ml 0,1% TFA przy szybkości przepływu 4 ml/minutę. Związany materiał eluowano 400 ml 0,1% TFA zawierającego 70% (v/v) acetonitrylu. Acetonitryl usunięto przez odparowanie pod zmniejszonym

187 095 ciśnieniem, a powstałą mieszaninę zliofiłizowano. Po liofilizacji materiał rozpuszczono w 50 ml wody i doprowadzono pH do 5,3 425 (ii 1 N NaOH. Dalsze miareczkowanie mieszaniny do pH 6,0 powodowało powstanie osadu. Po miareczkowaniu powrotnym do pH 5,3 ten osad ponownie się rozpuszczał. Dlatego też pozostawiono pH 5,3 i mieszaninę zliofiłizowano. Całkowita wydajność zliofilizowanego materiału uzyskiwanego z 50 nowotworów wyniosła 359 mg suchego proszku.

Przykład 2

Pierwszy etap oczyszczania: sączenie molekularne na Sephadex G-75

Zliofilizowany materiał (278 mg) z ekstraktu zakwaszonym etanolem, odpowiadający 38 pojedynczym nowotworom, rozpuszczono w 20 ml 1 M HAc i nałożono na kolumnę Sepahdex G75 (5 x 50 cm). Kolumnę zrównoważono i eluowano 1 M HAc przy szybkości przepływu 55 ml/godzinę i zbierano frakcje odpowiadające 10 ml. Dla każdej frakcji mierzono absorpcję przy 280 nm. Chromatogram sączenia molekularnego przedstawiono na fig. 1. Pojedyncze frakcje połączono w 5 głównych frakcji: G1 (frakcje 30-39), G2 (frakcje 40-45), G3 (frakcje 46-66), G4 (frakcje 67-91) i G5 (frakcje 92-118) i po liofilizacji poddano oznaczeniom biologicznym.

Przykład 3

Drugi etap oczyszczania: preparatywna HPLC frakcji G4

Stwierdzono, że pewna aktywność hamowania łaknienia występuje we frakcji G4 spośród frakcji po sączeniu molekularnym, i tę pulę frakcjonowano dalej przez preparatywną HPLC. Zliofilizowany materiał G4 (odpowiadający 80 nowotworom) rozpuszczono w 15 ml 0,1% TFA i nałożono na kolumnę Vydac 214TP1022 C4 (2,2 x 25 cm) zrównoważoną 0,1% tFa. Kolumnę przemyto 20 ml 0,1% TFA, a następnie 100 ml MeCN/ZEOTFA (10,0:89,9:0,1, v/v/v). Materiał eluowano w temperaturze 25°C przy szybkości przepływu 4 ml/minutę liniowym gradientem utworzonym z MeCN/H^O/TFA (10:79,9:0,1, obj./obj./obj.) i MeCN/HĘO/TFA (65,0:34,9:0,1, v/v/v) w ciągu 110 minut. Monitorowano absorpcję UV przy długościach fali 214 nm i 280 nm. Chromatogram HPLC (monitorowany przy 280 nm) przedstawiono na fig. 2. Frakcje odpowiadające 10 głównym pulom utworzono iak wskazano na fig. 2. Objętość zmniejszono do około 25% przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce obrotowej i frakcje zliofiłizowano i poddano oznaczeniom biologicznym. Aktywność ograniczenia łaknienia stwierdzono we frakcji G4H9 (przykład 6) i peptydy z tej frakcji analizowano poprzez analizę sekwencji aminokwasowej i spektrometrię masową (przykład 4).

Przykład 4

Chemiczna charakterystyka peptydów we frakcji G4H9

Analizę sekwencji aminokwasowej przeprowadzono metodą automatycznej degradacji Edmana, stosując sekwenator gazowy Applied Biosystems Model 477, zasadniczo w sposób opisany przez producenta. Spektrometrię masową prowadzono stosując układ API ΙΠ LC/MS/MS (Sciex, Thornhill, Ont., Kanada). Ten aparat do pomiarów potrójnego kwadrupola posiada zakres masa-do-ładunku (m/z) 2400 i jest wyposażone we wspomagany pneumatycznie sterownik elektrorozpylacza (nazywanego również rozpylaczem jonowym) (Bruins, A. P, Covey, T.R. i Henion, J.D. (1987) Anal Chem. 59, 2642-2646 i Covey, T.R., Bonner, R.F., Shushan, B.l. i Henion, J.D. (1988) Rapid Commun. Mass Spectrom. 2, 249-256). Wprowadzanie próbki prowadzono przy użyciu strzykawkowej pompy infuzyjnej (Sage Instruments, Cambridge, MA) przez połączoną kapilarę (średnica wewnętrznej 1/75 mm) przy szybkości przepływu cieczy ustawionym na 0,5-1 ml/min. Skalę m/z aparatu kalibrowano przy jednostkowej rozdzielczości obdarzonymi pojedynczymi ładunkami amonowymi jonami addycyjnymi glikoli (poli)propylenowych (PPG). Generalnie dokładność oznaczania masy jest lepsza niż 0,02%.

Frakcja G4H9:

Stwierdzono, że dominujący w tej frakcji peptyd ma następującą sekwencję aminokwasową:

HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD

Masa cząsteczkowa określona przez spektrometrię masową wynosiła 3796.

187 095

Ten peptyd jest identyczny z GLP-2 (1-33) szczura. Stwierdzono również mniejsze ilości następujących dwóch peptydów:

DFPEEVAIAEELGRRHADGSFSDEMNTILDNLATRDFINW L I Q T K I T D i

HDEFERHAEGTF T _ S DVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR

Peptydy te są identyczne odpowiednio z GLP-2 szczura, który został wydłużony o peptyd odstępnikowy 2 i GLP-1 (1-36 amid) szczura.

Przykład 5

Testowa metoda pomiaru hamowania łaknienia u myszy.

Myszy pozbawiono ich normalnego pokarmu w ciągu dwu dni i zapewniono nieograniczony dostęp do 20% roztworu sacharozy podczas pierwszego pozbawienia pokarmu. Po dwudniowym okresie pozbawienia pokarmu myszom wstrzyknięto dootrzewnowo 0,5 ml roztworu zawierającego testowaną substancję. Trzydzieści minut po wstrzyknięciu pojedyncze myszy umieszczono w jednej z ośmiu komór testowych o powierzchni 15 cm², z podłogą z siatki ze stali nierdzewnej, zaopatrzonych w rurkę do picia wprowadzoną do komory. Rurkę do picia połączono ze zbiornikiem zawierającym 20% roztwór sacharozy, a wnętrze rurki do picia zawierało elektrodę umożliwiającą wykrywanie picia roztworu przez pomiar przepływu słabego (niewyczuwalnego) prądu elektrycznego przepływającego przez myszy dzięki aparatowi elektronicznemu połączonemu z elektrodą w rurce do picia i podłogą ze stali nierdzewnej. Pobieranie roztworu sacharozy mierzono w ciągu 10 minut przez elektroniczny pomiar całkowitego czasu kontaktu z roztworem sacharozy podczas sesji testowej. Stopień hamowania łaknienia powodowany przez daną testowaną substancję określano poprzez statystyczne porównanie czasu trwania pobierania sacharozy przez myszy kontrolne (traktowane podłożem) z tym mierzonym dla myszy traktowanych substancją testowaną. Stopień hamowania łaknienia w testowanej grupie myszy wyrażono jako procent odpowiedzi grupy kontrolnej.

Przykład 6

Testowanie hamowania łaknienia u myszy przez frakcje zawierające GLP-2

Myszy testowano pod względem hamowania łaknienia (patrz przykład 5) po podaniu substancji testowanej. Substancja testowa składała się z ekstraktów nowotworów anorektycznych wyspiaków wydzielających glukagon przygotowanych zgodnie z przykładem 3 (frakcja G4 z sączenia molekularnego) lub zgodnie z przykładem 4 (frakcja G4H9 z HPLC) rozpuszczonych w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Roztwór testowy zawierający liofilizowany materiał z frakcji G4 po sączeniu molekularnym, odpowiadający 3,3 nowotworom, hamował pobieranie sacharozy o 72%. Spośród 10 subfrakcji po HPLC z frakcji G4 po sączeniu molekularnym (patrz przykład 4 i fig. 2), jedynie frakcja G4H9, zawierająca GLP-2, powodowała statystycznie istotne hamowanie łaknienia, hamując pobieranie sacharozy o 49%, gdy podawano liofilizowany materiał odpowiadający 5,3 nowotworom.

Przykład 7

Testowanie hamowania łaknienia u myszy przez syntetyczny GLP-2

Myszy testowano pod względem hamowania łaknienia po podaniu substancji testowanej składającej się z syntetycznego GLP-2 świni rozpuszczonego w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, jak opisano w przykładzie 5. GLP-2 świni posiada następującą sekwencję aminokwasową:

HADGSFSDEMTYLDMATRDFINWWLLHlK^nD).

Dootrzewnowe wstrzyknięcie testowanego roztworu, zawierającego 50 mikrogramów, syntetycznego GLP-2 świni, hamowało pobieranie sacharozy o 38%.

Przykład 8

Testowa metoda pomiaru hamowania łaknienia u myszy

Metoda jest taka jak w przykładzie 5, ale zamiast 20% sacharozy wykorzystuje się mleko dla niemowląt (Complan®). Substancję testowaną rozpuszcza się w podłożu składającym się z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i 1% albuminy. Testowane substancje rozpuszczone w podłożu wstrzykuje się albo dożylnie (IV) w objętości 100 mikrolitrów, albo do komór mózgowych (ICV) w objętości 10 mikrolitrów.

187 095

Przykład 9

Testowanie hamowania łaknienia u myszy przez syntetyczny GLP-2

Myszy testowano pod względem hamowania łaknienia jak opisano w przykładzie 8 po podaniu substancji testowanej składającej się z syntetycznego ludzkiego GLP-2. Ludzki GLP-2 ma następującą sekwencję aminokwasową:

HADGSFSDEMTILDNLAARDFINWLIQTKITD.

Wstrzyknięcie IV roztworu testowanego zawierającego 3 mikrogramy syntetycznego ludzkiego GLP-2 hamowało spożycie mleka o 24%, podczas gdy wstrzyknięcie ICV 3 mikrogramów i 10 mikrogramów syntetycznego ludzkiego GLP-2 hamowało spożycie mleka odpowiednio o 32% i 35%.

uiu 082 τοΞοβη^ρ o Tfpj Aza:d pCouvqaosq¥

187 095

ο ο

ο σ>

co

8ο

CD ο

ιη ο

τ σ

ο

CM urn 08ζ posobnpp ο τρ^? /zjd eCouequosqv ο

cn

Numer frakcji (objętość - lOml)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Peptyd o sekwencji aminokwasowej:

x’hx²dgsfsdemntx³ldx⁴lax⁵x⁶dfinwlx⁷x⁸tkitdx⁹ w której X¹ oznacza NH2, DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR, DFPEEVNIVEELRRR,

X oznacza Ala lub Gly, χ3 oznacza Ile lub Val, χ4 oznacza Asn, Ser lub His,

X oznacza Ala lub Thr,

X oznacza Arg lub Lys,

X oznacza Ile lub Leu,

X oznacza Gln lub His, a

X⁹ oznacza OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg lub Lys-Lys z wyjątkiem sekwencji:

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD,

HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD,

HADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITD,

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDRK,

HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITDKK,

HADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITDRK,

HADGSFSDEMNTVLDSLATRDFINWLLQTKITD,

HADGSFSDEMNTVLDSLATRDFINWLLQTKITDRK,

HADGSFSDEMNTILDSLATRDFINWLIQTKITD,

HADGSFSDEMNTILDSLATRDFINWLIQTKITDKK,

HADGSFSDEMNTVLDHLATKDFINWLIQTKITDRK,

HADGSFSDEMNTVLDHLATKDFINWLIQTKITD,

HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITDRK.
2. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że X’oznacza NH2.
3. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że X2oznacza Ala.
4. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że X3oznacza Ile.
5. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że X4oznacza Asn.
6. Peptyd według zastrz. 1. znamienny tym, że X5oznacza Ala.
7. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że X oznacza Arg.
8. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że X7oznacza Ile.
9. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że X⁸oznacza Gln.
10. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że X9oznacza OH.
11. Peptyd o sekwencji aminokwasowej:

x¹hx²dgsfsdemntx³ldx⁴lax5x⁶dfinwlx7x⁸tkitdx9 w której χ1 oznacza NH2, DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR, DFPEEVNIVEELRRR,

X oznacza Gly, χ3 oznacza Ile lub Val, χ4 oznacza Asn, Ser lub His,

X oznacza Ala lub Thr, z ⁷

X oznacza Arg lub Lys,

187 095

X⁷ oznacza Ile lub Leu,

X oznacza Gln lub His, a

X oznacza OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg lub Lys-Lys.
12. Peptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że X¹ oznacza NH2.
13. Peptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że X³oznacza Ile.
14. Peptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że X⁴oznacza Asn.
15. Peptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że X⁵oznacza Ala.
16. Peptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że X⁶oznacza Arg.
17. Peptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że X7oznacza Ile.
18. Peptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że X⁸oznacza Gln.
19. Peptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że X⁹oznacza OH.
20. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę lub nośnik oraz substancję czynną, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera peptyd o sekwencji aminokwasowej:

x'hx²dgsfsdemntx³ldx⁴lax5x⁶dfinwlx7x⁸tkitdx9 w której χ1 oznacza NH₂, DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR,

DFPEEVNIVEELRRR,

X² oznacza Ala lub Gly,

X³ oznacza Ile lub Val, χ4 oznacza Asn, Ser lub His, χ5 oznacza Ala lub Thr, χ6 oznacza Arg lub Lys, χ7 oznacza Ile lub Leu,

X⁸ oznacza Gln lub His, a χ9 oznacza OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg lub Lys-Lys.
21. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że χ1 oznacza NH 2.
22. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że χ2 oznacza Ala
23. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że X oznacza Gly.
24. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że χ3 oznacza Ile.
25. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że χ4 oznacza Asn.
26. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że χ5 oznacza Ala.
27. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że χ6 oznacza Arg.
28. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że X oznacza Ile.
29. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że χ8 oznacza Gln.
30. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że X oznacza OH.
31. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że peptyd posiada sekwencję:

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD,

HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD lub

HADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITD.
32. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że zawiera również inny czynnik hamującym łaknienie lub indukujący sytość, przy czym inny czynnik hamujący łaknienie lub indukujący sytość to glukagonopodobny peptyd-1.
33. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że ilość peptydu mieści się w zakresie od 10 ng/kg masy ciała do 5 mg/kg masy ciała.
34. Zastosowanie peptydu o sekwencji aminokwasowej:

χ¹ hx²dgsfsdemntx³ ldx⁴ lax5 x6dfinwlx⁷x8 tkitdx9 w której χ1 oznacza NH2, DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR,

DFPEEVNIVEELRRR, χ2 oznacza Ala lub Gly, χ3 oznacza Ile lub Val, χ4 oznacza Asn, Ser lub His, χ5 oznacza Ala lub Thr,

187 095

X⁶ oznacza Arg lub Lys,

X⁷ oznacza Ile lub Leu,

X⁸ oznacza Gln lub His, a

X⁹ oznacza OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg lub Lys-Lys, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki lub leczenia chorób, lub zaburzeń związanych z upośledzoną regulacją apetytu.
35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że X¹ oznacza NH2.
36. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że X² oznacza Ala.
37. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że X2 oznacza Gly.
38. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że X³ oznacza Ile.
39. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że X⁴ oznacza Asn.
40. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że X⁵ oznacza Ala.
41. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że X6 oznacza Arg.
42. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że X oznacza Ile.
43. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że X8 oznacza Gln.
44. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że X9 oznacza OH.
45. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że peptyd posiada sekwencję:

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD,

HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD lub

HADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITD.
46. Zastosowanie według zastrz. 34, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki lub leczenia otyłości, lub cukrzycy typu II.
47. Zastosowanie frakcji HPLC ekstraktu nowotworu glukagonoma wytworzonego przez kwaśną ekstrakcję etanolem, filtrację żelową i preparatywną HPLC, przy czym wspomnianą frakcję przedstawiono jako frakcję G4H9 na fig. 2 i zawiera ona jako główny składnik GLP-2 bądź zawiera jakikolwiek pojedynczy składnik wspomnianej frakcji albo kombinację dwóch lub więcej składników wspomnianej frakcji, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej.
48. Zastosowanie według zastrz. 48, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki lub leczenia chorób, lub zaburzeń związanych z upośledzoną regulacją apetytu.
49. Zastosowanie według zastrz. 48, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki lub leczenia otyłości, lub cukrzycy typu II.

Wynalazek dotyczy peptydów o określonej sekwencji aminokwasowej, kompozycji farmaceutycznej zawierającej peptyd o określonej sekwencji aminokwasowej i ewentualnie inny czynnik hamujący łaknienie lub indukujący sytość, jak również zastosowania peptydu o określonej sekwencji aminokwasowej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki lub leczenia chorób lub zaburzeń związanych z upośledzoną regulacją apetytu oraz zastosowania frakcji HPLC ekstraktu nowotworu glukagonoma wytworzonego przez kwaśną ekstrakcję etanolem, filtrację żelową i preparatywną HPLC.

Glukagon jest wytwarzany przez komórki A trzustki i wydzielany w odpowiedzi na niskie poziomy glukozy we krwi. Jego głównym miejscem działania jest wątroba, gdzie stymuluje wytwarzanie glukozy. Jest on zatem głównym hormonem o działaniu przeciwstawnym do insuliny w homeostazie glukozy we krwi (Unger, R. H. i L. Orci (1990). Glucagon, w: Diabetes Mellitus, wyd. 4, Nowy Jork, Elsevier, str. 104-120).

Glukagon jest wytwarzany z większego prekursora przez ograniczoną proteolizę. Sklonowanie genu glukagonu wykazało, że prekursor, proglukagon, zawierał nie tylko glukagon, ale również dwa dodatkowe podobne do glukagonu peptydy nazwane GLP-1 i GLP-2. GLP-1 i GLP-2 są kodowane przez oddzielne egzony, co sugeruje odrębne aktywności biologiczne. Później wykazano, że prekursor proglukagon ulega różnicowej obróbce w trzech różnych tkankach, o których wiemy, że wytwarzają proglukagon: komórkach A trzustki, komórkach L jelita i w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS). Tak więc, w wysepkowych komórkach A

187 095 z prekursora wycinany jest selektywnie glukagon, podczas gdy z komórek L jelita i z CNS selektywnie uwalniane są GLP-1 i GLP-2 [przegląd w (Unger, R. H. i L. Orci (1990). Glucagon. w: Diabetes Mellitus, wyd. 4, Nowy Jork, Elsevier, str. 104-120)].

Zidentyfikowano specyficzne receptory GLP-1 (Thorens, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8641-8645), które są wyraźnie różne od receptora glukagonu (L.J. Jelinek i in. (1993) Science 259: 1614-1616) i wykazują inne rozmieszczenie tkankowe (R.V. Campos, i in. (1994) Endocrynology 134: 2156-2164). GLP-1 uwalnia się z komórek L po posiłku i działa jako hormon dokrewny (tj. wzmacnia indukowane glukozą uwalnianie insuliny z komórek B trzustki). A zatem, receptor GLP-1 ulega ekspresji na wysokich poziomach na powierzchni komórek B wysepek (K. Moens, i in. (1996) Diabetes 45: 257-261).

Wykazano indukcję proliferacji nabłonka jelitowego przez GLP-2 (Drucker, D. J. i in. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7911-7916) i ujawniono leczenie chorób gastrologicznych komórkami hodowanymi w podłożu z GLP-2 (Drucker, D. J. i Keneford, J. R., światowy opis patentowy numer 96/32414). Jak dotąd, nie opisano żadnego receptora GLP-2.

Peptydy powstające z proglukagonu a zachowanie odżywiania

Uprzednio donieśliśmy o uzyskaniu i ustabilizowaniu przeszczepialnych anorektycznych wyspiaków wydzielających glukagon (O. D. Madsen i in. (1993) Endocrinology 133: 2022-2030), jak również hipoglikemizujących wyspiaków wydzielających insulinę u szczura (O. D. Madsen i in. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6652-6656). Takie nowotwory można uzyskiwać z wielopotencjalnych komórek MSL o wspólnym pochodzeniu klonalnym (O. D. Madsen i in. (1986) J. Cell Biol. 103: 2025-2034) i odzwierciedlają one proces dojrzewania odpowiednio w kierunku komórek A i B wysepek (O. D. Madsen i in. (1993) Endocrinology 133: 2022-2030).

Anoreksja towarzysząca wyspiakowi wydzielającemu glukagon jest bardzo ciężka: ma gwałtowny początek i po paru dniach prowadzi do całkowitego zatrzymania przyjmowania pokarmów. Ten ciężki przebieg anoreksji jest niespotykany przy innych nowotworach doświadczalnych u gryzoni i sugeruje wytwarzanie przez wyspiaka wydzielającego glukagon bardzo silnego czynnika sytości, który działa na obwodowej drodze podawania. Uprzednio wykazano, że anorektyczne wyspiaki wydzielające glukagon wykazywały niefizjologiczne przetwarzanie, prowadzące do wytwarzania zarówno glukagonu, jak i GLP-1 (O. D. Madsen i in. (1993) Endocrinology 133: 2022-2030). Co więcej, nieanorektyczna odmiana wyspiaka wytwarzającego glukagon była niezdolna do przetwarzania prekursora (O. D. Madsen i in. (1995) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 55, suppl. 220: 27-36). Wzmiankuje się o utracie wagi, jako o składowej zespołu wyspiaka wydzielającego glukagon także u człowieka (J. J. Holst (1985) Glucagonproducing tumors, w: Hormone-producing tumors of gastrointestinal tract. Nowy Jork, Churchill Livingstone, str. 57-84), chociaż wykazuje ona wysoki poziom zmienności pomiędzy różnymi pacjentami (S. J. Bhathena i in. (1981) Glucagonoma and glucagonoma syndrome, w: Glucagon. Physiology, pathophysiology and morphology of the pancreatic A-cells. Nowy Jork, Elsevier. 413-438).

Glukagon

Wykazano, że glukagon jest zaangażowany w regulację wielkości spontanicznego posiłku u szczurów, ale całkowity wpływ jest niewielki i wywierany jest poprzez połączenia z wątrobą przez nerw błędny (N. Geary i in. (1993) Am. J. Physiol. 264: R116-R122). Wpływ ten obserwuje się wyłącznie po infuzji wątroby glukagonem przez żyłę wrotną, podczas gdy dootrzewnowe podawanie dawek farmakologicznych nie wykazuje żadnego wpływu na pobieranie pokarmu przez głodzone szczury (O. D. Madsen i in. (1993) Endocrinology 133: 2022-2030).

GLP-1

Ostatnio doniesiono o podstawowej roli GLP-1 w regulacji odżywiania (M. D. Turton i in. (1996) Nature 379: 69-72). Podawanie do komór mózgu (ICV) GLP-1 hamowało przyjmowanie pokarmu przez głodzone szczury. Również i w tym przypadku, podawanie obwodowe GLP-1 nie miało żadnego wpływu na zachowania pokarmowe (M. D. Turton i in. (1996) Nature 379: 69-72; O. D. Madsen i in. (1993) Endocrinology 133: 2022-2030), co sugeruje, że GLP-1 wytwarzany przez nowotwory może nie mieć znaczącego udziału w obserwowanej anoreksji.

187 095

Stwierdzono, że podawany obwodowo GLP-2 wywiera silny wpływ na zmniejszenie przyjmowania pokarmu.

Proponuje się, że GLP-2, normalnie wydzielany wraz z GLP-1 z jelitowych komórek L, pełni własną, odrębną rolę jako obwodowy czynnik sytości.