JP4344242B2 - Ｉｇｆ結合タンパク質由来のペプチドまたは低分子 - Google Patents

Description

本発明は、疾患の処置ならびにハイスループットスクリーニングならびにその他の発見および研究適用におけるペプチドまたは低分子の組成物および使用方法に関し、特にインスリン様増殖因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）のＣＤ７４相同性ドメイン中に存在する配列由来の金属結合ペプチドの使用に関する。

規定された標的細胞の増殖因子は、集団における広範囲にわたる生物学的応答（例えば、ＤＮＡ合成、細胞分裂、特定の遺伝子の発現など）を刺激するポリペプチドである。種々の増殖因子が同定され、これらの増殖因子としては以下が挙げられる：トランスフォーミング増殖因子βファミリー（ＴＧＦ−β）、上皮細胞増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）ならびに、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを含むインスリン様増殖因子ファミリー（ＩＧＦ）。多くの増殖因子が癌の病因に関係する。

ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ（「ＩＧＦ」)は、アミノ酸配列および構造において関連し、それぞれのポリペプチドが約７．５キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する。ＩＧＦ−Ｉは成長ホルモンの主作用を媒介し、従って出生後の一次成長メディエーターである。ＩＧＦ−Ｉはまた、種々の他の増殖因子の作用に関係する。これは、このような増殖因子による細胞の処置がＩＧＦ−Ｉの産生の増加をもたらすからである。対照的に、ＩＧＦ−ＩＩは胎児の成長において重要な役割を有すると考えられる。相対的に、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方がインスリン様活性（従ってこれらの名前がある）を有し、そして分裂促進性である(細胞分裂を刺激する)。

ＩＧＦ−Ｉが、多数の異なる種の癌由来の細胞の増殖を刺激することが見出された（Ｂｕｔｌｅｒら、１９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１４）：３０２１−３０２７；Ｆａｖｏｎｉ ＲＥら、１９９８、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７７（１２）：２１３８−２１４７）。ＩＧＦ−Ｉは、さらに腫瘍細胞を含む多数の異なる細胞型に対して抗アポトーシス作用を発揮することが見出された（Ｇｉｕｌｉａｎｏ Ｍら、１９９８ Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３９（８）:１３００−１３１１；Ｚａｗａｄａ ＷＭら、１９９８、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．７８６（１−２）：９６−１０３；Ｋｅｌｌｅｙ ＫＷら、１９９８、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４０：５１８−５２４；Ｔｏｍｓ ＳＡら、１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８８（５）：８８４−８８９；Ｘｕ Ｆら、１９９７、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９７（２）：４２９−４４０）。前向きな研究はＩＧＦ−Ｉを前立腺、胸部および結腸の癌に対する危険因子として示されており、一方で、ＩＧＦに対する主要な循環性結合タンパク質であるＩＧＦＢＰ−３は、保護効果を有するように見える（１０〜１２、２８、２９）。種々の他の観察は、さらに、ＩＧＦＢＰ−３と他のＩＧＦ−結合タンパク質（特にＩＧＦＢＰ−２）との相対的なバランスは、インビトロおよびインビボの両方での腫瘍細胞の増殖の制御において何らかの形で役立つという考えを支持する（７〜９）。最近の証拠はまた、ＩＧＦＢＰ−３がＩＧＦ非依存性の様式での腫瘍細胞の増殖（１３〜１７）およびアポトーシス（１４）において中心的な役割を果たし得ることを示唆する。

米国において毎年癌と診断される１３００万人の患者の約半数は、全身性疾患を有する（または、罹患の危険がある）。化学療法が、これらの患者に対する最も一般的な治療アプローチである（３４）。ほとんどの化学療法剤は主として分裂細胞に対して有効であり、そしてしばしば、骨髄抑制が用量を制限する毒性である。化学薬品はいくつかの範疇に分類され、異なる作用機構を有するが、有効量では多くが、患者の生活の質に深刻な影響を与える副作用を有する。ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、シスプラチン、タモキシフェン、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシルは、種々の癌処置に使用される、一般的な薬剤で、これらは時々併用される。骨髄抑制に加え、胃腸管作用、粘膜炎、脱毛症および（ドキソルビシンの場合は）心毒性もまた、これらの薬剤とともに認められる（３４）。明らかに、これらの化学薬品に対して選択的に感受性のある腫瘍細胞を作製する方法を見い出すことが目的である。

ほとんど全てのＩＧＦは、非常に小さな遊離型ＩＧＦ−Ｉが検出可能なように、ＩＧＦ−Ｉ、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３)および、酸不安定性サブユニット（ＡＬＳ）と称されるより大きいタンパク質サブユニットの非共有結合的に結合した複合体として循環する。三元複合体は、それぞれ等モル量の３つの成分から構成される。いくつかの報告がＩＧＦＢＰ−３はＩＧＦの非存在下でラットＡＬＳと結合し得ることを示唆しているにも拘らず（Ｌｅｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：４９８２−４９８９，１９９５）、ＡＬＳは、ＩＧＦ結合活性が検出されず、ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３複合体とのみ結合するように見える（Ｂａｘｔｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４(２０)：１１８４３−１１８４８；１９８９）。ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３／ＡＬＳの三元複合体は、約１５０ｋＤａの分子量を有し、二元ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３複合体またはＩＧＦ単体と比較される場合、実質的に増加した循環中半減期を有する（Ａｄａｍｓら、Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．６（２−４）：３４７−３５６；１９９５年１０月に提出され、１９９６年に出版された）。この三元複合体は、「ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩが遊離型ＩＧＦの濃度の急激な変化を防止するためのレザバーおよび緩衝液として」働くと考えられる（ＭＯＤＥＲＮ ＣＯＮＣＥＰＴＳ ＯＦ ＩＮＳＵＬＩＮ−ＬＩＫＥ ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲＳにおける、Ｂｌｕｍら、（１９９１）「Ｐｌａｓｍａ ＩＧＦＢＰ−３ Ｌｅｖｅｌｓ ａｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ」、ｐｐ．３８１−３９３、Ｅ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。本質的に余剰の（非結合性の）循環中ＩＧＦＢＰ−３が存在しない一方で、実質的に余剰の遊離型ＡＬＳは実際に存在する（Ｂａｘｔｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．６７：２６５−２７２、１９８８）。

ｐ５３（よく特徴づけられた腫瘍抑制因子）のいくつかの作用を媒介することを示唆する間接的な証拠が存在するにも拘らず（Ｆｅｒｒｙら、（１９９９）Ｈｏｒｍ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ ３１（２−３）：１９２−２０２）、ＩＧＦＢＰ−３がその細胞作用をどのように媒介するかはよく分らない。ＩＧＦＢＰ−３は、急速に増殖する細胞の核に移動される（Ｓｃｈｅｄｌｉｃｈら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２９）：１８３４７−５２；Ｊａｑｕｅｓら、（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８（４）：１７６７−７０）。ＩＧＦＢＰ−３の機能的相互作用を規定するための有用な工程は、ＩＧＦＢＰ−３の細胞内標的および細胞外標的の驚くほど大きなアレイに特異的に結合する能力に関係するタンパク質ドメインを同定することである。既知の標的は以下を含む：ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インスリン（いくつかの条件下で）、酸不安定性サブユニット（ＡＬＳ）、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コラーゲンＩａ型、プレカリクレイン、ＲＸＲ−α、ウイルスの腫瘍性タンパク質、ヘパリン、特異的プロテアーゼ、細胞レセプター、ツーハイブリッドスクリーニングで同定された多くの細胞内標的、および核局在化輸送機構の構成成分（Ｍｏｈｓｅｎｉ−ＺａｄｅｈおよびＢｉｎｏｕｘ（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８（１２）：５６４５−８；Ｃｏｌｌｅｔｔ−Ｓｏｌｂｅｒｇら、（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．８３（８）：２８４３−８；Ｒａｊａｈら、（１９９５）Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．６（２−４）：２７３−８４；ＦｏｗｌｋｅｓおよびＳｅｒｒａ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１：１４６７６−１４６７９；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４２）：３０２１５−２１；Ｄｕｒｈａｍら、（１９９９）Ｈｏｒｍ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ ３１（２−３）：２１６−２５；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９８）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５（２Ｐｔ １）：Ｅ３２１−３１）。

ＩＧＦＢＰ−３は、おおよそＩＧＦＢＰ−３遺伝子のエキソン１、２および３＋４にそれぞれ相当する３つの主要ドメインを有する。ＣＤ７４（インバリアント鎖）に見出されるモチーフおよび多数の他のタンパク質に相同的な配列を含むＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメイン（ドメイン３）は、ＩＧＦＢＰ−３の、血清、細胞外マトリックスおよび細胞表面成分と相互作用する能力に関係しているように見える。この領域中の配列に対して作製されたペプチドは、ＲＸＲ−α、トランスフェリン、ＡＬＳ，プラスミノーゲン、フィブリノーゲンおよびプレカリクレインを含む、多くのその既知のリガンドへのＩＧＦＢＰ−３の結合を干渉することが以前に示されている（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３３６０７−１３、２０００；Ｗｅｉｎｚｉｍｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６：１８０６−１３、２００１；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｅ３２１−３１、１９９８；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０２１５−２１、１９９９；Ｆｉｒｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６３１−８、１９９８）。しかし、現在までに、ＩＧＦＢＰ−３由来ペプチドは、これらのいかなるリガンドに対しても選択的で、高親和性な結合に十分であることが示されていない。

本分子のこの領域はまた、核転座に関係するが、ＩＧＦＢＰ−３が標的細胞内へインターナリゼーションする機構はよく理解されない（Ｓｃｈｌｅｄｌｉｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８３４７−５２、１９９８；Ｊａｑｕｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８：１７６７−７０，１９９７）。最近記載された、ＩＧＦＢＰ−３のドメイン３の２２８−２３２残基が、対応するＩＧＦＢＰ−１（密接に関係するタンパク質）由来の残基に置換された変異体は、ＡＬＳ、ＲＸＲ−αおよびプラスミノーゲンに対して弱められた結合を示す（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５（２ Ｐｔ １）：Ｅ３２１−３１；Ｆｉｒｔｈら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６３１−２６３８）。妊娠および重症疾病のような特定の生理条件下でのＩＧＦＢＰ−３の特異的なタンパク分解は、結合の変更およびそのＩＧＦリガンドの遊離を生じ得る。ＩＧＦＢＰ−３とＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（両方の増殖因子がＩＧＦＢＰ−３と同様の親和性で結合する）との二元複合体は、ＩＧＦＢＰ−３がグリコサミノグリカン、特異的プロテアーゼおよび細胞表面タンパク質と特異的に相互作用し得る細胞内環境に、内皮結合部を横切って溢出し得る。研究報告は、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク分解を阻害し得るＩＧＦＢＰ−３中のＣ末端ドメインの存在を言及する（Ｆｏｗｌｋｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７４８１−８、１９９５；Ｆｏｗｌｋｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８：２２８０−５、１９９７）。しかし、この推定プロテアーゼインヒビタードメインの正確な位置は、まだ記載されていない。ＩＧＦＢＰ−４タンパク分解は、妊娠、血管形成後の平滑筋細胞増殖、骨形成および卵胞優位（ｏｖａｒｉａｎ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）を含む多くの生物学的プロセスの中で重要な事象である（Ｂｙｕｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６：８４７−５４、２００１；Ｂａｙｅｓ＿Ｇｅｎｉｓら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２１：３３５−４１、２００１；Ｍｉｙａｋｏｓｈｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４２：２６４１−８、２００１；Ｃｏｎｏｖｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４２：２１５５、２００１；Ｒｉｖｅｒａら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６５：１０２−１１、２００１）。

ＩＧＦＢＰ−３が最も豊富なＩＧＦ結合タンパク質（「ＩＧＦＢＰ」）である一方で、少なくとも５つの他の異なるＩＧＦＢＰが種々の組織および体液中で同定されていることは注目されるべきである。これらのタンパク質は、ＩＧＦを結合するにも拘らず、別個の遺伝子から由来し、異なるアミノ酸配列を有する。ＩＧＦＢＰ−３と異なり、他の循環ＩＧＦＢＰはＩＧＦで飽和されない。ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ−５は、ＩＧＦおよびＡＬＳと１５０ｋＤａの三元複合体を形成し得る最適の既知のＩＧＦＢＰである。血清から単離された当該タンパク質のＮ末端フラグメントがＩＧＦ結合活性を保持するので、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ結合ドメインは、当該タンパク質のＮ末端部分にあると考えられている。しかし、他のＩＧＦＢＰのいくつかは、治療としてＩＧＦ−Ｉと組み合せた使用がまた示唆されている。

血清における主要なＩＧＦキャリアータンパクとしての役割に加え、ＩＧＦＢＰ−３は最近、多くの異なる活性を有することが示されている。ＩＧＦＢＰ−３は、外因的に添加されたＩＧＦ−Ｉの活性を阻害し得る場合、細胞表面上のまだ同定されていない分子に結合し得る（Ｋａｒａｓら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２（２６）：１６５１４−１６５２０）。細胞表面へのＩＧＦＢＰ−３の結合がヘパリンによって阻害され得るにも拘らず、同定されていない細胞表面結合分子は、ヘパリン様細胞表面グルコサミノグリカンとは考えられない。これは、ヘパリングリコサミノグリカンの酵素学的な除去がＩＧＦＢＰ−３細胞表面結合に影響がないからである（Ｙａｎｇら、１９９６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７（１０）：４３６３−４３７１）。細胞表面結合分子が、Ｌｅａｌら（１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３）：２０５７２−２０５７６）によって同定されたＩＧＦＢＰ−３レセプターと同じであるか、または異なるかは明らかでない。このＩＧＦＢＰ−３レセプターは、Ｖ型トランスフォーミング増殖因子−β(ＴＧＦ−β)レセプターと同一である。

インビトロアッセイにおいて単独で使用される場合、ＩＧＦＢＰ−３はまた、アポトーシスを促進することが報告されている。興味深いことに、ＩＧＦＢＰ−３は、機能的な１型ＩＧＦレセプターを有する細胞および機能的な１型ＩＧＦレセプターを有さない細胞においてアポトーシスを促進することが示されている（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３７（３）：６９０−６９３；Ｒａｊａｈら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１８）：１２１８１−１２１８８）。しかし、アポトーシスが全長ＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−３のタンパク分解フラグメントによって誘導されるかどうかに関しては、矛盾する報告がある（Ｒａｊａｈら、同書；Ｚａｄｅｈら、１９９７、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８（７）：３０６９−３０７２）。より最近、多数の研究室で集められた多数の未発表のデータが、上記の出版物で作成された特許請求の範囲のいくつかを支持しない。現在までに検定されたインビボモデルにおいて、注入されたＩＧＦＢＰ−３タンパク質単体は、腫瘍増殖の制限において、入り混じった結果を示している。

米国特許第５，６８１，８１８号は、癌の処置におけるソマトメジン依存性腫瘍の増殖を制御するためのＩＧＦＢＰ−３の投与に関する。米国特許第５，８４０，６７３はまた、腫瘍増殖を制御するための方法としてＩＧＦＢＰ−３レベルの間接的な細胞内調節を記載する。米国特許第６，０１５，７８６号は、ＩＧＦ依存性腫瘍の処置のための、ＩＧＦ変異体と複合体化されたＩＧＦＢＰ−３の使用を開示する。しかし、これらの特許のいずれも、投与されたＩＧＦＢＰ−３タンパク質の腫瘍増殖に対する直接的なインビボ効果を開示する。これらの特許はすべて、インタクトなＩＧＦＢＰ−３（そのＩＧＦ結合ドメインを含む）の使用を予見する。多数の出版（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０（１）：２２−７，２０００；Ｐｅｒｋｓら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７５（４）：６５２−６４，１９９９；Ｍａｉｌｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０（９）：４０４０−５，１９９９；Ｇｉｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２（４１）：２５６０２−７，１９９７）はさらに、培養細胞に対するＩＧＦ結合タンパク質、放射線およびセラミドの併用効果を示す。１つの報告（Ｐｏｒｔｅｒａら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ＆ ＩＧＦ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０００、補遺Ａ、Ｓ４９−Ｓ５０、２０００）において、ＣＰＴ−１１と併用されたＩＧＦＢＰ−３は、インビボおよびインビトロ両方の結腸癌において相加的な効果を示した。上記の研究はすべて、ＩＧＦ（抗アポトーシス性である）を細胞に運ぶことが可能である一方、自身が保有するＩＧＦ依存性のプロアポトーシス作用も発揮し得る多機能分子である、インタクトなＩＧＦＢＰ−３を使用して行われた。明らかに、これらの２つの活性を分子レベルで分離することが目的であるが、インタクトなＩＧＦＢＰ−３の活性の所望のサブセットを示す分子は、記載されていない。

ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３は、天然供給源から精製され得るか、または組換え手段により作製され得る。例えば、ヒト血清からのＩＧＦ−Ｉの精製は、当該分野で周知である（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔら、（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：２３６５−２３６９）。組換えプロセスによるＩＧＦ−Ｉの産生は、１９８４年１２月に発行されたＥＰ ０ １２８ ７３３に示される。ＩＧＦＢＰ−３は、Ｂａｘｔｅｒら（１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３９：１２５６−１２６１）に示されるようなプロセスを使用して、天然供給源から精製され得る。あるいは、ＩＧＦＢＰ−３は、Ｓｏｍｍｅｒら、ｐｐ．７１５−７２８、ＭＯＤＥＲＮ ＣＯＮＣＥＰＴＳ ＯＦ ＩＮＳＵＬＩＮ−ＬＩＫＥ ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲＳ（Ｅ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）で議論されるように、組換え的に合成され得る。組換えＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−Ｉと１：１の分子比で結合する。

ラットおよび豚の創傷に対するＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３複合体の局所投与は、ＩＧＦ−Ｉ単独投与（Ｉｄ．）よりも顕著により効果的である。下垂体切除されたラット、卵巣摘出されたラットおよび正常なラットに対するＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３複合体の皮下投与、ならびにカニクイザルに対する静脈内投与は、単独で投与された（Ｉｄ．）ＩＧＦ−Ｉの「低血糖作用を実質的に阻害する」。

ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３複合体の使用は、多種多様の障害（例えば、米国特許第５，１８７,１５１号、同５，５２７，７７６号、同５，４０７，９１３号、同５，６４３，８６７号、同５，６８１，８１８号および同５，７２３，４４１号、ならびに国際特許出願番号ＷＯ ９５／０３８１７、ＷＯ ９５／１３８２３、およびＷＯ ９６／０２５６５を参照のこと）の処置について示唆されている。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３複合体はまた、糖尿病および股関節骨折手術からの復帰を含む、複数の適応症に対する処置として、Ｉｎｓｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．によって開発中である。

当業者にとって、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３の複合体は通常、異なる化合物であるとみなされ、そして、ＩＧＦＢＰ−３単独と比して異なる生物学的効果を有するとみなされる。

癌の処置に対して利用可能な膨大数の細胞傷害性薬物が存在する一方で、これらの薬物は一般的に、脱毛症、白血球減少症、粘膜炎を含む、種々の深刻な副作用と関連する。従って、当該分野において、従来の細胞傷害性化学療法に付随する深刻な副作用を誘導しない癌治療に対する必要性がある。この目的を達成するための１つの方法は、細胞傷害薬物に選択的に感受性な標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を作製し、それによって深刻な副作用を付随しないより低用量での、このような薬物の効果的な使用を可能にすることである。ＩＧＦ結合タンパク質由来のプロアポトーシスペプチドは、化学療法および他の薬剤に対する腫瘍細胞のアポトーシス応答を促進することが可能であり得る（２００１年９月１８日に提出された、Ｄ．Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓによる「インビボにおける標的細胞の選択的な感作のためのＩＧＦ結合タンパク質の使用方法」と題された米国同時係属出願を参照のこと）。

ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ由来のペプチドおよび本発明の関連分子についての他の適用は、調節因子または炎症の診断レポーター、および以下における侵襲性プロセスを含むことを予見され得る：癌転移、腫瘍間質活性化、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫疾患、多発性硬化症、糖尿病、強直性脊椎炎、潰瘍性結腸炎、クローン病および他の炎症性腸疾患、関節炎、喘息およびアレルギー、骨吸収性疾患、増殖性疾患、創傷治癒、網膜症を含む眼科系疾患、繊維性疾患、生殖性生物学、アテローム性動脈硬化症および他の心臓血管適応症；ゲノム学関連適用、およびプロテオミクス関連適用において有用な、薬物発見およびその他の研究プログラムにおけるハイスループットスクリーニング手段を含む研究手段、早期発現および新規遺伝子配列のスクリーニングのための現存の技術を強化することが可能な試薬およびベクター、遺伝子治療、診断およびナノテクノロジー適用；ならびに幹細胞関連の適用において有用な研究手段。

多数の天然プロセスおよび病理学的なプロセスが「炎症侵襲性の」または「炎症遊走性の」状態を含む。例としては以下が挙げられる：侵襲性腫瘍、胚盤胞移植／栄養膜細胞層移植、アテローム性プラ−ク沈着、骨交替、関節炎状態における関節腫脹、多発性硬化症、ＳＬＥなどのような再発軽減性（ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ）自己免疫状態、増殖性網膜疾患および喘息における気道上皮の活性化。これらの生物学的プロセスの通常の特徴は、疾患状態に関連する局所的なクロストークに関与する、細胞型の活性化状態である。例えば、侵襲性の上皮腫瘍としては一般的に、（自身の腫瘍細胞に加えて）活性型間質細胞、微小血管上皮細胞および炎症性免疫細胞が挙げられる。これらの細胞型のいずれかの標的化の介入は、全ての疾患パターンに劇的に影響することが予想され得る。本発明者は、予期せずしてＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ由来のペプチドが、このような活性化されていない同じ細胞型と比べて、活性化されている細胞において優先的に、細胞死／細胞アポトーシスをトリガーするということを見出している。確実な観察は、活性化された細胞および遊走細胞によって（Ｂｏｌｅｓら、２０００、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｌ７０３−Ｌ７１２；Ｌａｕｋａｉｔｉｓら、２００１、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５３：１４２７−１４４０）、および上皮腫瘍由来の骨髄微小転移巣において優先的に示されることが公知であり（Ｐｕｔｚら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２４１−２４８）、α−５インテグリンおよびβ−１インテグリンに対する共アポトーシス効果に依存する。

これらの効果を、ＩＧＦ−Ｉ依存性増殖作用の排除に関連する作用と区別することが重要である。文献が、乾癬のようなＩＧＦ−Ｉ依存性の炎症性プロセスに十分に言及する。例えば、米国特許第５，９２９，０４０号は、ＩＧＦ−Ｉレセプターを標的化し、それによって皮膚炎症を縮小するインヒビターの使用を教示する。ＩＧＦＢＰは、結合することによってこのレセプターを介するシグナル伝達を減少させ得、従ってＩＧＦ−Ｉを隔離し得る。しかし、本発明のＩＧＦＢＰ由来のペプチドは、ＩＧＦ−Ｉに結合せず、ＩＧＦ−Ｉレセプターを経由してこれらの効果を発揮するとは考えられない。

本発明ならびに、免疫不全および貧血を罹患する患者を治療するためのインタクトなＩＧＦＢＰ-３／ＩＧＦ−Ｉ複合体の使用を示す米国特許第５，５２７，７７６号の間にもまた区別がなされるべきである。本発明は、免疫不全ではなく、免疫刺激によって特徴付けられる状態を処置するためにＩＧＦＢＰ−３由来の非ＩＧＦ−Ｉ結合フラグメントを単独で使用する。

結果として、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ由来のペプチドおよび本発明に関連する分子は、脈管形成性の、破骨細胞形成性の（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ）生物学的プロセス、アテローム生成的な生物学的プロセス、侵襲的な生物学的プロセス、転移性の生物学的プロセス、生殖性の生物学的プロセス、関節炎性の生物学的プロセス、喘息性の生物学的プロセス、繊維性の生物学的プロセス、網膜症性の生物学的プロセス、感染性の生物学的プロセス、炎症性の生物学的プロセス、神経変性の生物学的プロセス、ストレス関連の生物学的プロセス、細胞再構築の生物学的プロセス、または不死化関連の生物学的プロセス、調節因子または診断レセプターとして予見され得る。

特に、本明細書中に開示されるＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドまたはより小さい誘導体分子は、プロテアーゼインヒビター、金属キレート剤、抗増殖性分子、抗転移性分子、または抗血管形成分子として使用され得る。これらはまた、血漿キャリア剤、細胞外マトリックス成分への結合の促進剤、標的化剤、細胞内への大化合物もしくは小化合物の輸送剤（細胞インターナリゼーション剤）、アフィニティー精製タグ、スクリーニングタグ、転写剤もしくはＤＮＡ結合剤、細胞標識化剤、調節モジュレーターとして、または上記の性質のいずれかの組み合せを示す薬剤として有用であり得る。特に、このような誘導体分子は、ＩＧＦＢＰ−３のカルボキシ末端のＣＤ７４相同性ドメイン配列由来であり得、そしてこれらの活性の多くは、これまでＩＧＦＢＰ−３分子のこの領域に局在化しなかった。この領域の配列を作るペプチドは、これまでに、ＲＸＲ−α、トランスフェリン、ＡＬＳ、プラスミノーゲン、フィブロネクチンおよびプレカリクレインを含む、多数のその公知のリガンドとＩＧＦＢＰ−３との結合を妨害することが示されている（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｎｅｍ．２７５：３３６０７−１３、２０００；Ｗｅｉｎｚｉｍｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６：１８０６−１３、２００１；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｅ３２１−３１、１９９８；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０２１５−２１、１９９９；Ｆｉｒｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６３１−８、１９９８）。しかし、現在まで、ＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドは、これらのリガンドのいずれかに対する選択的な高アフィニティー結合に十分であることが示されていない。

本明細書中で開示されるＩＧＦＢＰ−３由来の金属結合ドメインペプチドは、ＩＧＦ−Ｉに結合できないこと、独特な抗原性および、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦＢＰ−３推定デスレセプター（Ｐ４．３３）相互作用ドメイン（いわゆる「中央領域」；アミノ酸８８−１４８）の欠如を含む、多数の重要な方法において、以前に開示されたＩＧＦＢＰ−３由来分子と異なる。Ｐ４−３３推定デスレセプターは、国際特許出願番号ＷＯ ０１／８７２３８（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＣ０３１２１７；ｇｉ：２１４１１４７７）に記載される。例えば、国際特許出願番号ＷＯ ０２／３４９１６は、ＩＧＦ−Ｉへの結合が障害性であるＩＧＦＢＰ−３の点変異体の使用を教示する。しかし、記載される分子は、ＩＧＦＢＰ−３の中央領域を含み、Ｐ４．３３推定レセプターと相互作用することによって生物学的効果を発揮することが予想される。国際特許出願番号ＷＯ ０１／８７２３８は、疾患の処置に対するＰ４．３３モジュレーターの使用を教示する。本発明の金属結合ペプチドは、Ｐ４．３３推定相互作用ドメイン（ＩＧＦＢＰ−３の中央領域）を含まない。米国特許第６，４１７，３３０号は、加水分解に耐性であるように改変されたＩＧＦＢＰ−３改変体の使用を教示する。ネイティブＩＧＦＢＰ−３中の核局在化シグナル（ＮＬＳ）が変更される改変ＩＧＦＢＰ−３もまた開示される。さらに、種々のＮ末端伸長を含む、アミノ末端伸長ＩＧＦＢＰ−３が開示される。全てのこれらの分子は、本発明の金属結合ドメインペプチドと２つの重要な点において異なる：これらの分子はＩＧＦ−Ｉに結合し、そしてこれらの分子は、Ｐ４．３３推定デスレセプターと相互作用すると考えられているＩＧＦＢＰ−３の中央領域を含む。いくつかの最近の刊行物は、培養中の細胞を処理するためのＩＧＦＢＰ−３ペプチドの使用を記載する。胸部癌細胞に有効であることが見出された唯一のペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３の中央領域由来である（ＭｃＣａｉｇら、２００２、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８６：１９６３−１９６９；Ｐｅｒｋｓら、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２９４：９８８−９９４、２００２）。この領域は、本発明の金属結合ドメインペプチドの配列中には存在しない。

この背景の節中におけるいかなる特許、特許出願、または刊行物に対するいかなる参照も、このような特許、特許出願、または刊行物が、本発明に対する先行技術を構成することを承認しないことを注意すべきである。

（発明の開示）
本発明者は、驚いたことに、ヒトＩＧＦＢＰ−３配列の一部を含むＩＧＦＢＰ−３またはペプチドが、多数の有用な物理的性質および生物学的性質を示し得ることを見出している。特に、本発明者は、ＩＧＦＢＰ−３のＣＤ−７４様ドメインが、多数の以前に記述されていない性質（例えば、亜鉛およびニッケルなどの金属に選択的に結合する能力）を示すことを実証している。本発明者はまた、インタクトなＩＧＦＢＰ−３のいくつかの以前に示された活性を、本分子のこの領域に位置付けている。ペプチドについての配列境界の正確な位置は、特にプロアポトーシスペプチドの場合において、それらの生物学的活性に決定的である。発明者はまた、ＩＧＦＢＰ−３のこの領域由来の２２アミノ酸配列を表現するペプチドが、共有結合されたより大きなタンパク質（緑色蛍光タンパク質）のインターナリゼーションを、生ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞へと方向付けるのに十分であるという、驚くべきかつ誘発性の観察を行っている。ＩＧＦＢＰ−３により使用される、標的細胞に入るための機構は、よく分かっていないが、細胞表面レセプターの存在が提唱されている。

本発明は、ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメイン由来の、ほんの１２〜２２アミノ酸を含む短ペプチドが、全分子の共アポトーシス性質、細胞貫通性性質、および金属結合性質を模倣し得ることを明らかにする。これらのペプチド（「ＭＢＤペプチド」）は、以下に列挙する理由に対して、全長ＩＧＦＢＰ−３の使用の魅力的な代替法を提供する。

効能：ＩＧＦＢＰ−３のアミノ末端ドメインは、循環中でＩＧＦと結合し、かつＩＧＦを輸送し、多くの細胞型についてのＩＧＦの筋肉増強効果および抗アポトーシス効果を増強する一方、カルボキシ末端ドメインは、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ非依存性の効果を媒介すると考えられる。従って、この分子の治療剤としての効力は、その機能の二重性により本質的に緩衝され得る。ＭＢＤペプチドは、共アポトーシスアッセイにおいて、全長ＩＧＦＢＰ−３よりも、最大で３倍より活性であり、そしてＩＧＦＢＰ−３と異なり、ＭＢＤ活性は、細胞外マトリックスおよび血漿タンパク質によって激しく抑制されない。

処方：ＩＧＦＢＰ−３の中央ドメインは、タンパク質分解に対し精巧に感受性である。ＩＧＦＢＰ−３の有限の溶解性、その低い安定性および明白な凝集傾向に起因して、インタクトなＩＧＦＢＰ−３に対する適切な処方および都合の良い送達経路の開発は魅力的である。例えば、７０ｋｇの成人ＩＧＦＢＰ−３に対する１ｍｇ／ｋｇ／日の投与量のＩＧＦＢＰ−３（７ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝食塩水中の最大溶解度）は、１０ｍｌ（皮下ボーラス注射に適さない）である一方、７０ｋｇの成人に対して０．５ｍｇ／ｋｇ／日で与えられるＭＢＤペプチド（ＰＢＳ中３５ｍｇ／ｍｌ）は、たった１ｍｌ（皮下ボーラス注射に適する）である。

安定性：ＭＢＤペプチドは、熱（９５℃、１０分間）に安定であり、そしてサイズが小さく、このことがＭＢＤペプチドを全長ＩＧＦＢＰ−３よりも、経皮または吸入剤に基づく送達経路としてより受け入れられやすくする。

費用：ＩＧＦＢＰ−３分子が生物学的に活性であるために、ＩＧＦＢＰ−３分子の全１８システイン残基は分子内ジスルフィド結合を形成しなければならない。このことは、細菌性システムまたは酵母のシステムでの臨床グレードのＩＧＦＢＰ−３の十分な量の産生を、非常に魅力的にする。哺乳動物のシステムは、この分子の産業的生産には高価すぎる。ヒトＩＧＦＢＰ−３ ｃＤＮＡが１９８８年にクローン化されて以来、たった一つのグループがグラム量の臨床グレードの組換えＩＧＦＢＰ−３をうまく生産した。単４ｍｇ／ｋｇ皮下投与量のＩＧＦＢＰ−３の計画された販売価格は、１２年間にわたって開発、洗練されたＩＧＦＢＰ−３のための生産技術に基づいて、そして産業標準の原価（Ｃｏｓｔ ｏｆ Ｇｏｏｄｓ）（ＣＯＧ）に対する価格比を使用して、数千ドルの範囲であることが多い。払い戻しおよび他の考慮に基づいて、この価格は禁止され得る。一方、ＭＢＤペプチドは、当業者に周知の合成化学的方法または高度に効率的な生物学的生産システムのいずれかを使用して、ＩＧＦＢＰ−３よりも安くかつ簡単に生産されることが予想される。

いくつかの実験室からのデータを組み合わせた配列アラインメントは、構造的に自律性である一方、分子の腫瘍細胞に対するプロアポトーシス効果を特定するのに十分であることが多いＩＧＦＢＰ−３の領域への洞察を提供し得る。他の研究は、この同じドメインの他の配列が核局在化、ＲＸＲ−α結合、ならびに血清およびＥＣＭ成分との結合に関与することを示している（２１，２３〜２５，３５，４０）。我々は、この分子のこれらの領域を、動物界（哺乳動物、カエル、魚、ハエ、線虫）にまたがる、タンパク質の本質的に異なる群に見られるＣＤ７４相同性モチーフと配列比較した。本発明の目的のために、ＩＧＦＢＰ−３のＣＤ７４相同性ドメインは、成熟ＩＧＦＢＰ−３タンパク質のカルボキシ末端のおよそ６０アミノ酸残基、またはこれらの任意のサブセットを含むと規定される。

図２は、ＣＤ７４モチーフを含む、選択されたヒトタンパク質のアラインメントを示す。保存された残基は、太字で示される。ＩＧＦＢＰ−３中のイタリック体の残基は、核局在化およびコラーゲン結合に要求されるが、ＩＧＦ−Ｉ結合には要求されない。アスタリスクはＩＧＦＢＰ−３のＨＢＤ変異体における残基置換を示し、プラスミノーゲン、プレカリクレイン、ＡＬＳおよびＲＸＲ−αへの結合が損なわれる。＃で示されるこのペプチド領域は、緑色蛍光タンパク質と結合された場合に、細胞インターナリゼーションを促進するのに十分である。予備データは、この領域の一部を表現するペプチドが、培養中の細胞においてアポトーシスを促進するのに十分であり得ることをさらに示唆する。

疾患の症状を緩和するための方法もまた、本明細書中で開示される。一つの実施形態において、有効量のＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子が、癌を有する被験体に対して化学療法剤と全身同時投与され、これによって癌の症状を緩和する。外因的に添加されたＩＧＦＢＰ−３は、通常使用される化学療法剤に対して癌を敏感にし、腫瘍の大きさおよび転移の両方に影響する。これらの効果は、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、５−フルオロウラシル、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）およびＣＰＴ−１１を含む種々の薬剤とともに見られ、そしてＩＧＦＢＰ−３のプロアポトーシスのＩＧＦ−Ｉ非依存性効果に反映すると考えられる。

別の実施形態において、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子は、疾患を有する被験体に対し、他の生物学的調節剤（例えばレチノイドレセプターもしくは甲状腺レセプターのリガンド、または標的細胞分子と結合可能な抗体）と全身同時投与される。

なお別の実施形態において、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子は、他の実施形態に記載されたように投与されるが、この投与は、ウイルスベクターもしくは他のビヒクルによって送達される遺伝子配列を使用してか、または誘導剤もしくはアンタゴニストを使用して、間接的に生じる。

特定の局面において、本発明は、疾患を有する被験体に対し、有効量のＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチドまたは低分子とともに同時投与剤を投与することにより、疾患の症状を緩和するための方法を提供する。

いくつかの実施形態において、同時投与剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、抗腫瘍抗生物質、ニトロソ尿素、金属ＤＮＡ改変化合物および微小管安定化剤からなる群から選択された化学薬剤であるか、栄養制限、抗体、ワクチン、ペプチド、サイトカイン、レセプターリガンドおよび核酸からなる群から選択された生物薬剤であるか、または、熱、圧力、浸透性、酸性および放射性からなる群から選択された物理薬剤である。好ましい同時投与薬剤は、ドキソルビシン、パクリタキセル、メトトレキサート、タモキシフェン、シクロホスファミド、ビンクリスリン、エトポシド、ストレプトゾトシンおよび５−フルオロウラシルからなる群から選択された化学薬剤を含む。

特定の実施形態において、処置される疾患は、胸部癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、食道癌または肺癌である。

いくつかの実施形態において、ＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドまたは低分子は、１日あたり１キログラム全身重量あたり約０．００１〜約４０ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ／日）で投与される。

この発明は、種々の有用な性質（金属結合、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）結合、細胞インターナリゼーションの方向付け、プロテアーゼ活性の抑制、転写の調節、アポトーシスの促進、血管形成の抑制、抗炎症性活性、ならびに細胞画像化および発現タグ化に関する有用性を含む）を有する多数の新規ペプチド（およびペプチドの構造を模倣する低分子）に関連する。

疾患の処置のための新規方法が、本明細書中で開示される。本発明のペプチドの種々の活性は、ある種類の障害（癌、自己免疫疾患、心臓血管適応症、関節炎、喘息、アレルギー、生殖適応症、網膜増殖性疾患、骨疾患、炎症性疾患、炎症性腸疾患および繊維性疾患を含む）を処置するために利用され得る。

特定の実施形態において、有効量のプロアポトーシスペプチドおよび同時投与剤は、癌を罹患している被験体に全身投与され、これによって癌の症状を緩和する。広範な種々の悪性疾患（胸部癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌および肺癌を含む）は、本発明の方法を使用して処置され得る。同時投与剤は、代表的に細胞傷害性化学療法剤（例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、メトトレキサート、タモキシフェン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、エトポシド、ストレプトゾトシンおよび５−フルオロウラシル）である。

（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「ＩＧＦ結合タンパク質」および「ＩＧＦＢＰ」は、６つのヒトインスリン様増殖因子結合タンパク質１〜６のいずれかに基づく天然分子および誘導体分子をいう。「誘導体ペプチドまたは低分子」は、本発明に適切なＩＧＦＢＰの構造的性質を保持するか、あるいは模倣する、ペプチドまたはペプチドも模倣物をいう。本明細書中の誘導体ペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３の全長よりも短い配列を含む。本明細書中で使用される場合、その配列または構造がＩＧＦＢＰに対して同一であるか、または相同的である場合、ペプチドまたは低分子はＩＧＦＢＰ「由来」である。

「ＣＤ７４相同性ドメインペプチドまたは低分子」は、ＩＧＦＢＰ−３のカルボキシ末端の６０アミノ酸配列の一部を含む誘導体ペプチドまたは低分子を意味する。

「金属結合ドメインペプチド」または「ＭＢＤペプチド」は、約１２〜約６０アミノ酸長の、好ましくは約１３〜４０アミノ酸長のＩＧＦＢＰ由来のペプチドまたはポリペプチドを意味し、ＩＧＦＢＰ−３のカルボキシ末端６０アミノ酸中にＣＤ−７４相同性ドメイン配列のセグメントを含み、配列ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣを含み、そして金属結合性質を示すが、別個の抗原性性質を示すことでインタクトなＩＧＦＢＰ−３とは異なり、ＩＧＦ−Ｉ結合性質を欠如し、そして中央領域配列（ＩＧＦＢＰ−３配列のアミノ酸８８〜１４８）を欠如する。例えば、ペプチドＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷは、金属結合ドメインペプチドの例である。これは、金属イオンに結合するが、ＩＧＦ−Ｉには結合せず、そしてこのペプチドに対するポリクローナル抗体はインタクトなＩＧＦＢＰ−３と実質的に交差反応せず、そしてその逆もまた真である。

「伸長金属結合ドメインペプチド」は、天然のＩＧＦＢＰ−３配列とは異なって、さらなる残基と連結された金属結合ドメインペプチドである。例えば、トリペプチドであるアスパラギン−グリシン−アルギニン（ＮＧＲ）のような伸長、または大きいタンパク質の配列が、薬物動態学的な標的化目的のためにか、または脂肪および核酸のような他の分子との結合体（「伸長金属結合ドメインペプチド結合体」）を調製する目的のために、付加され得る。

「改変金属ドメインペプチド」は、天然のアミノ酸配列が改変された金属結合ドメインペプチドまたは伸長金属結合ドメインペプチドであり、このような改変としては、以下が挙げられる：配列の任意の位置における天然のアミノ酸残基の保存的な置換、天然の状況においてＩＧＦＢＰ−３の対応する配列位置で生じることが見出されたリン酸化、アセチル化、グリコシル化もしくは他の化学的状態の変化、配列におけるＬ−アミノ酸のＤ−アミノ酸での置換、またはタンパク質−核酸（ＰＮＡ）のような鎖骨格化学の改変。

「コア金属結合ドメインペプチド」は、コア１２マー配列ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣを含む、１４アミノ酸長未満のペプチドである。例えば、ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣ、ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣおよびＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷは、コア金属結合ドメインペプチドである。

「伸長コア金属結合ドメインペプチド」は、コア１２マー配列ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣを含むが、以下の天然ＩＧＦＢＰ−３の１４マー配列：ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷを含まない、伸長金属結合ドメインペプチドである。

「改変コア金属結合ペプチド」は、コア１２マー配列ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣを含むが、以下の天然ＩＧＦＢＰ−３の１４マー配列：ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷを含まない、改変金属結合ドメインペプチドである。

「レトロ金属結合ドメインペプチド」は、逆転した順序でＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸のいずれかを含む、金属結合ドメインペプチドの誘導体である。

「細胞インターナリゼーションペプチド」は、ＩＧＦＢＰ−３のＣＤ７４相同性ドメインに存在する配列ＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷまたはその一部を含む、ペプチドまたは他のタンパク質性分子、あるいはその変異体または他の誘導体を意味する。

「血漿循環ペプチド」は、ＩＧＦＢＰ−３の循環血漿タンパク質結合特性のいくらかまたは全てを保持する、ＣＤ７４相同性ドメインペプチドを意味する。プラスミノーゲン、トランスフェリン、カリクレイン、酸不安定性サブユニットまたはフィブリノーゲンへの結合は、この範疇の例である。

「ＥＣＭ結合ペプチド」は、ＩＧＦＢＰ−３の細胞外マトリックス成分結合特性のいくらかまたは全てを保持する、ＣＤ７４相同性ドメインペプチドを意味する。ヘパリン、コラーゲンおよび細胞表面成分への結合は、この範疇の例である。

「プロテアーゼインヒビターペプチド」は、ＩＧＦＢＰ−３のプロテアーゼインヒビター特性のいくらかまたは全てを保持するＣＤ７４相同性ドメインペプチドを意味する。特に、これはシステインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼの阻害をいう。「発現ベクタータグ」は、遺伝子発現ベクター中に含まれる任意のＣＤ７４相同性ドメインペプチド配列を意味し、ここでベクタータグ中に保持されるＩＧＦＢＰ−３の性質が、研究、ハイスループットスクリーニング、または当該分野で十分認識される他の適用のためのベクターの使用を促進するのに役立つ。

「プロアポトーシスペプチド」は、ＩＧＦＢＰ−３のプロアポトーシス特性のいくらかまたは全てを保持するが、ＩＧＦ結合特性を保持しない、ＣＤ７４相同性ドメインペプチドを意味する。１つの実施形態において、「コア」プロアポトーシスペプチドは、第一配列ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣを含むが、インタクトなＩＧＦＢＰ−３分子の第一配列にほとんどすぐに隣接して存在する第二配列ＫＫＧＦＹＫＫＫを含まない。当業者に公知であるように、その性質を実質的に改変することなしに、配列を任意のタンパク質またはペプチド配列に対して配列変化を作成することが可能である。従って、匹敵する生物学的活性を示し、かつ上記の配列のいずれかに対し、少なくとも８０％の配列相同性、より好ましくは８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列相同性を示すペプチド配列はまた、上記の定義により包含される。

本明細書中で使用される場合、用語「同時投与剤」は、化学薬剤；生物薬剤（例えば、抗体、ワクチン、栄養物、サイトカイン、核酸または増殖因子、レチノイドレセプターリガンドもしくは甲状腺レセプターリガンドのようなレセプターリガンド）；および物理薬剤（例えば、放射性、酸性度および熱）をいう。同時投与剤は、好ましくは、ＩＧＦＢＰの非存在下で投与される場合に抗腫瘍活性を有する。

「化学薬剤」としては、以下に挙げるような全ての通常の化学療法剤が含まれる：アルキル化剤（例えば、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミド）、代謝拮抗剤（例えば、Ａｒａ−Ｃ、５−フルオロウラシル、メトトレキサート）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン）、ポドフィロトキシン（例えば、ＶＭ−２６、エトポシド）、抗生物質（例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン／ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ニトロソ尿素（例えば、ＢＣＮＵ、ストレプトゾトシン）、および金属ＤＮＡ改変化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン）ならびに微小管安定化剤（例えば、パクリタキセル／ＴＡＸＯＬ（登録商標））。化学薬剤はまた、同属のリガンドのレベルを減少することによってか、標的化レセプターに作用することによってか、または標的化レセプターのシグナル伝達経路に作用することによって、標的化レセプターに直接影響する、化学化合物を含む。例えば、甲状頚動脈は、甲状頚動脈アンタゴニストのようなアンタゴニストを経由して間接的に操作され得る。例として、用語「甲状頚動脈アンタゴニスト」は、被験体における甲状腺ホルモン活性を減少させるように作用する化合物をいう。甲状頚動脈アンタゴニストとしては、以下が挙げられる：６−ｎ−プロピル−２−チオウラシル（プロピルチオウラシルまたはＰＴＵ）、メチマゾール、カルビマゾール、および甲状腺刺激ホルモン、甲状腺ホルモン、または甲状腺レセプターシグナル伝達を減少することが当該分野で公知の他の化合物。

用語「処置レジメン」は、治療の過程をいう。処置レジメンは、単一の化学薬剤のような単一の薬剤を使用し得るが、より代表的には、２つ以上の異なる薬剤（例えば、複数の異なる細胞傷害性化学療法剤を用いる併用療法）を含み得、そして２つ以上の異なる型の薬剤（例えば、電離放射線のような物理薬剤と組み合わせた、パクリタキセルのような化学薬剤の投与）を含み得る。処置レジメンはまた、栄養レジメン、ストレスレジメンまたは運動レジメンをいい得る。

本明細書中で使用される場合、用語「緩和する」は、癌の症状の改善、減殺（ｌｅｓｓｅｎｉｎｇ）または減少をいう。「緩和する」はまた、症状の進行の緩徐化、または停止を含む。

本明細書中で使用される場合、用語「被験体」は、鳥類および哺乳動物個体を含み、より具体的には、スポーツ動物（ｓｐｏｒｔ ａｎｉｍａｌ）（例えば、犬、猫など）、農業用動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジなど）および霊長類（例えばヒト）を含む、脊椎動物個体をいう。

本明細書中で参照される場合、配列「同一性」および配列「相同性」は、ＢＬＳＡＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０）、特に、デフォルトパラメーター（例えば、Ｍａｔｒｉｘ ０ ＢＬＯＳＵＭ６２、それぞれギャップオープンペナルティ１１および伸長ペナルティ１、ギャップＸ＿ドロップオフ５０ならびにワードサイズ３）を使用する、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって実行されているＢＬＡＳＴＰ ２を使用して決定され得る。「連続した」アミノ酸といわれない限りは、配列は、必要に応じて、アラインメントを向上する適切な数のギャップまたは挿入を含み得る。

本明細書中で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同族は、その包含的意味で使用される；すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｄｉｎｇ）」およびその対応する同族と同等である。

本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別に指示されない限り、複数形の言及を含む。

（ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドおよび低分子組成物）
本発明の方法に従う使用のためのＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子は、任意の種由来であり得るが、種が一致したＩＧＦ結合タンパク質（すなわち、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子を投与するべき被験体と同じ種由来のネイティブ配列に基づいた、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子）が、好ましい（例えば、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子がヒト被験体に投与されることが意図される場合、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子は、ヒトＩＧＦＢＰ由来であることが好ましい）。本発明における使用のためのＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子は、非複合体化ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子であり、すなわち、ＩＧＦの非存在下で投与され（例えば、ＩＧＦ−Ｉ複合体として投与されない）、そして、好ましくはいかなるＩＧＦタンパク質も含まないで投与される。好ましくは、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子は、ＩＧＦＢＰ−３由来である。

ＩＧＦＢＰ−３についての天然に存在するタンパク質配列の１つは、図１に示される。ヒトＩＧＦＢＰ−３は、２つの天然に存在する対立遺伝子改変体として見出される；アラニンが成熟なタンパク質の位置５で見出され得る（図１Ａに示される）か、あるいはグリシンがこの位置に見出され得る。さらに、ＩＧＦＢＰ−３の他の改変体が作製され得る。例えば、［Ｎ１０９Ｄ］−ＩＧＦＢＰ−３は、成熟配列の位置１０９にアミノ酸配列変更を有するが、現在までに試験されている多くのアッセイにおいて、野生型のＩＧＦＢＰ−３と非常に類似して振る舞うＩＧＦＢＰ−３の誘導体である。点変異誘導体はまた、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦＢＰの他の公知のリガンドのいずれかに結合する能力において選択的に衰弱された変異体を含む。例えば、ＩＧＦＢＰ−５の保存的残基または半保存的残基Ｖａｌ_４９、Ｔｙｒ_５０、Ｐｒｏ_６２、Ｌｙｓ_６８、Ｐｒｏ_６９、Ｌｅｕ_７０、Ａｌａ_７２、Ｌｅｕ_７３およびＬｅｕ_７４の１つ以上に対応する位置の点変異が、ＩＧＦ−Ｉ結合を衰弱させ得ることが示されている。これらの残基の多くは、他のＩＧＦ結合タンパク質でもまた、よく保持されている。ＩＧＦＢＰ−３の成熟配列の位置２２８および２３０における変異は、核移行および、コラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質との結合に影響すると考えられる。

ＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−３配列の一部に基づくペプチド誘導体の欠質変異体もまた、誘導体ペプチドおよび低分子の設計のための鋳型として使用され得る。ＩＧＦＢＰ−３分子は、２６４アミノ酸からなり、３つの主要な構造ドメインを有する。システインリッチなアミノ末端ドメイン（おおまかに成熟配列の最初の１００アミノ酸）が、ＩＧＦの高親和性結合に必須であることが公知である。中央ドメイン（約８０アミノ酸）は、システイン残基を有さず、そしてプロテアーゼに対して非常に敏感である。この部分はまた、特異的な細胞レセプターとの結合において重要な役割を果たし得る。カルボキシ末端ドメイン（約８０アミノ酸）はまた、システインリッチであり、そして、細胞外マトリックス分子（例えば、ヘパリンおよびコラーゲン）、血清分子（例えば、ＡＬＳ、プラスミノーゲンおよびフィブリノーゲン）、核レセプター（例えば、ＲＸＲおよびインポーティン（ｉｍｐｏｒｔｉｎ））との結合に必須の配列を含む。欠失変異体または点変異体を得るための核酸操作、タンパク質発現およびタンパク質精製の方法は、当該分野で公知である。

一旦、ＩＧＦＢＰ−３のドメインが、必要に応じて点変異分析または欠失分析によって決定され、そして特定の生物学的活性（例えば、標的細胞の感作）に十分である場合、ＩＧＦＢＰ配列の一部からなる、ペプチドのようなより低分子を設計することが可能である。例えば、配列
（Ｈ２Ｎ）．．．ＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ．．．（ＣＯＯＨ）（配列番号１）；
（Ｈ２Ｎ）．．．ＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ．．．（ＣＯＯＨ）（配列番号２）；
（Ｈ２Ｎ）．．．ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ．．．（ＣＯＯＨ）（配列番号３）；および
（Ｈ２Ｎ）．．．ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣ．．．（ＣＯＯＨ）（配列番号４）
のうちの１つ以上は、ＩＧＦＢＰ−３の生物学的効果のいくつかを模倣するのに十分であり得るが、本発明の特定の実施形態は、配列ＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷおよび配列ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷを含むか、または配列ＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷおよび配列ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷからなるペプチドを排除し得る。

ＩＧＦＢＰ−３の三次元構造は知られていないが、ＩＧＦＢＰ−３分子の関連領域とかなりの相同性を共有する、ＣＤ７４インバリアント鎖の構造は記載されている（Ｇｈｏｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３７８：４５７−４６２、１９９５）。ＩＧＦＢＰ（好ましくはＩＧＦＢＰ−３）配列由来のペプチド模倣物分子は、当該分野で公知の技術を使用して、ＣＤ７４インバリアント鎖の三次元構造を参照して生成され得る。これらの誘導体分子のいずれもが、化学処置に対して標的細胞を感作する能力を含む、所望の生物学的活性についてアッセイされ得る。これらのアッセイの結果に基づき、変更された特性を有する、少ない数のＩＧＦＢＰ−３変異体またはＩＧＦＢＰ−３誘導体が、ヒト疾患の状況において、臨床試験のために選択され得る。

ＩＧＦＢＰ由来のプロテアーゼインヒビターペプチドおよびペプチド模倣物がまた、本発明中で企図される。このようなペプチドおよびペプチド模倣物は、ＩＧＦＢＰ−４を切断するタンパク質分解活性のインヒビターとして有用である。上述のように、特定のプロテアーゼによるＩＧＦＢＰ−４の切断は、血管平滑筋細胞の増殖を含む、多数の異なるプロセスにおいて重要である、ＩＧＦ−Ｉ活性の効果的な増加をもたらす。従って、プロテアーゼインヒビターペプチドは、血管再狭窄（特に血管形成術（ステント留置を伴ってか、または伴わない）および冠動脈バイパス手術の後に続く動脈再狭窄）の抑制に有用である。さらに、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解は、骨形成の促進に重要である。従って、タンパク質分解抑制ペプチドはまた、過剰な骨形成を含む適応症において、骨形成を抑制することについて有用である。タンパク質分解抑制ペプチドはまた、腫瘍侵襲性と関連することが知られている、システインプロテアーゼ（例えば、カテプシンＢ）およびメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）の抑制について有用である。従って、本発明は、ＩＧＦＢＰ由来のタンパク質分解抑制ペプチドを投与することにより、腫瘍侵襲性を減少する方法（例えば、腫瘍の局所性拡散、限局的拡散および転移性拡散を減少する）を提供する。

（ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチド生成）
ＩＧＦ結合タンパク質または誘導体は、通常、ＩＧＦＢＰ配列における全ての可能な改変体の生成を可能にする組換え法によって生成される。組換えＤＮＡの操作に関する技術は、当該分野で周知であるタンパク質の組換え生成に関する技術とも同様である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、1〜３巻（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、（１９８９）；または、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）および定期的な最新情報を参照のこと）。公知の組成の誘導体ペプチドまたは低分子はまた、当該分野で周知の方法を使用して、化学合成によっても生成され得る。

ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子をコードする配列を含む核酸ベクターは、研究、ハイスループットスクリーニングまたは他のゲノム科学関連技術およびプロテオミクス関連技術の実行を促進するためにこれらの分子の改変された性質を利用し得る。特に、いくつかのＣＤ７４様ペプチドの金属結合特性は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂（例えば、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ニッケル−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ））を使用し、このような樹脂の製造業者によって推奨されるプロトコールを使用する、粗抽出物からの発現遺伝子産物の迅速なアフィニティ精製に役立ち得る。同様に、いくつかのＣＤ７４様ペプチドのプロテアーゼインヒビター特性は、精製の間の発現遺伝子産物の安定性に役立ち得る。いくつかのＣＤ７４様ペプチドの細胞インターナリゼーション性質は、特に細胞核への輸送が生物学的性質のスクリーニングを促進し得る場面において、哺乳動物細胞における、特定の遺伝子産物の迅速なスクリーニングに役立ち得る。ベクター内のＩＧＦ結合タンパク質由来配列の選択的タンパク質分解切断部位の使用は、ＩＧＦＢＰまたはそのペプチド誘導体の適切に折り畳まれたドメインの発見に役立ち得る。このような配列を含む遺伝子産物の発現後切断をもたらすためのヒトライノウイルス ３Ｃプロテイナーゼの使用は、特に推奨される（参照）。

好ましくは、ＩＧＦ結合タンパク質または誘導体は、組換え宿主細胞として細菌細胞株を使用して産生される。発現構築物（すなわち、宿主細胞における適切な発現に必須のＤＮＡ配列と実施可能に連結された、所望のＩＧＦ結合タンパク質または誘導体をコードする配列を含むＤＮＡ配列（例えば、構築物の５’末端のプロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメント、ならびに構築物の３’末端のターミネーターエレメント））が、宿主細胞に導入される。ＩＧＦ結合タンパク質または誘導体をコードするＤＮＡ配列は、必要な場合、別のタンパク質（「融合パートナー」）をコードする配列と連結され、融合タンパク質を形成し得る。好ましくは、ＩＧＦ結合タンパク質または誘導体をコードするＤＮＡ配列は、米国特許第５，９１４，２５４号に記載されるような融合パートナーをコードする配列と連結される。発現構築物は、プラスミドあるいはコスミドのような染色体外構築物であり得るか、または、例えば、米国特許第５，８６１，２７３号に記載されるように、宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。

（ＩＧＦＢＰ由来のペプチドを組み込んだ融合ポリペプチド）
本明細書中で開示するように、ペプチドＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷは、無関係のタンパク質の細胞インターナリゼーションを方向付けることが可能である。従って、本発明は、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドおよび低分子と、細胞内に内部移行されることが所望される分子との、融合物ならびに／または結合体を提供する。融合物パートナー分子は、通常（例えば、大きいサイズ、親水性などの理由で）内部移行されないポリペプチド、核酸、または低分子であり得る。当業者に明らかであるように、このような融合／結合体は、医薬品（通常は内部移行されない治療分子のインターナリゼーションを促進するため）、遺伝子治療（遺伝子治療構築物のインターナリゼーションを促進するため）、および研究（インターナリゼーションマーカータンパク質を用いる細胞の「マーキング」を可能にする）を含む、多数の異なる分野において有用である。好ましいＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドは、配列ＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷまたは上記配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％の相同性を有する配列を含むペプチドであり、ここで、このペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３の完全配列を含まない。ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドとポリペプチドとの融合物は、好ましくは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物の作製によって生成されるが、このような融合物はまた、インターナリゼーションペプチドと目的のポリペプチドとの化学連結反応によって作製され得る。ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドと核酸または低分子との結合体は、当該分野で公知の化学架橋技術を使用して作製され得る。好ましくは、結合体は、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して生成され、インターナリゼーションペプチドのマルチマーの生成を回避する。

ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドと転写調節因子（例えば、転写因子）との結合体が、本発明によって提供される。ほとんど全ての転写因子は、通常は細胞外の環境から内部移行されることができず、そのために、そのネイティブの型では薬剤として不適切である、細胞内タンパク質である。しかし、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドと融合または結合体化される場合、転写因子は、内部移行され得、そして細胞の転写に影響し得る。例えば、Ｔ−ｂｅｔ（Ｓｚａｂｏら、２０００、Ｃｅｌｌ １００ （６）:６５５−６９）、すなわち、Ｔリンパ球をＴ_ｈ１系統に方向付けるように見える転写因子は、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドと融合され、免疫調節に有用な分子を作製し得る。

マーカー部分およびＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドを含む融合分子／結合体分子もまた、提供される。このような融合／結合体分子に有用なマーカー部分としては、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、および、酵素活性の効力により検出され得る他のタンパク質（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）のようなタンパク質、ならびに、二次検出システム（例えば、特異的な抗体）によって検出され得る「発現タグ」部分が挙げられる。発現タグ部分は周知であり、そしてｍｙｃおよび他のタンパク質由来のペプチドを含む。急速に分裂する細胞の核へのＩＧＦＢＰ−３の局在化に起因して、配列ＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷまたは上記配列に少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％の相同性を有する配列を含む、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドを含む融合分子／結合体分子は、細胞標識用途、および診断用途に、特に有用であると考えられる。ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドを含む、このような融合／結合体分子の他の企図される用途としては、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドを組み込む薬学的分子の薬物動態学的な研究が挙げられる。

ＥＣＭ結合ペプチドを含む融合分子／結合体分子もまた、提供される。この融合分子／結合体分子は、ＥＣＭ結合ペプチドを通って細胞外マトリックスへと標的化される。ＩＧＦＢＰのＣＤ７４相同性ドメイン由来のペプチドまたはペプチド模倣物は、異なるポリペプチドとか、もしくは低分子との融合物として、結合体化され得るか、または産生され得る。代替の実施形態において、ＥＣＭ結合ペプチドは、リポソーム（もしくは他のカプセル化処方物）の表面に結合体化され得るか、または挿入され得、この組み合せを細胞外マトリックスに標的化する。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望んではいないが、本発明者は、ＩＧＦＢＰ由来のＥＣＭ結合ペプチドは、ＥＣＭ結合ならびにＩＧＦＢＰ切断プロテアーゼが存在する部位にある融合パートナー／結合体パートナーの標的化された放出の両方に有用であると考える。

実施例３で開示されるように、発明者は、ＩＧＦＢＰ−３分子中の金属結合モチーフの存在を発見し、これによってこのモチーフを含むドメインの実用的な回収を可能にした。ＩＧＦＢＰ由来のペプチドＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷおよびペプチドＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷは各々、ニッケルを充填されたアフィニティーカラムに結合する。このような金属結合性質は、複合混合物（例えば、細菌細胞溶解物）からの所望のペプチドの精製に使用され得る。代表的に、各ペプチドをコードするＤＮＡ配列（または金属結合活性および少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列相同性を有するそのホモログ）は、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と融合され、ここで、このペプチドはＩＧＦＢＰ−３の完全配列を含まない。金属結合ペプチドをコードする配列は、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’末端または３’末端に融合され得、そして、目的の配列内に挿入さえされ得る（このことはあまり好ましくないが）。好ましくは、エンドプロテアーゼについての認識部位をコードするＤＮＡは、金属結合ペプチドをコードする配列と目的のポリペプチドをコードする配列との間に挿入され、金属結合ペプチドの除去を可能にする。有用なプロテアーゼ認識部位としては、ヒトライノウイルス ３Ｃプロテアーゼの認識部位、エンテロキナーゼの認識部位、Ｘａ因子の認識部位、およびユビキチンの認識部位（ユビキチナーゼの認識部位）が挙げられる。次いで、融合ポリペプチド（ＩＧＦＢＰ由来の金属結合ペプチドおよび目的のポリペプチド、ならびに必要な場合プロテアーゼ認識部位を含む）をコードするＤＮＡは、コードされた融合ポリペプチドの転写および翻訳に必須のＤＮＡ配列を含む都合よい任意の発現ベクターに挿入される。ＤＮＡ発現構築物は、組換え宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に形質転換され、そして当該分野で公知の標準の方法を使用して回収される。次いで、融合ポリペプチドは、当該分野で周知のように、二価のカチオン（例えば、亜鉛またはニッケル）を充填されたアフィニティーカラムを使用して精製され得る。融合ポリペプチドがプロテアーゼ認識部位を含む場合、同族のプロテアーゼが、精製プロセスの適切な時点において、目的のポリペプチドから金属結合ペプチドを切断するのに使用され得る。

適切に折り畳まれたＩＧＦＢＰ−３のサブドメインを生成するための方法もまた、開示される。ＩＧＦＢＰ−３の場合、このアプローチの現実的な重要性は、多数の実験室において、多数の失敗した試みがすでになされ、適切に折り畳まれた形状のＩＧＦＢＰ−３の短縮型セグメントを発現したことである。現在までに、これらは、総発現産物の主要割合として、このような適切に折り畳まれた分子を生成することに、相対的に失敗したことを明らかにしている。インタクトな分子を生成し、そしてその後それを切断することによって、実質的に高い効率で折り畳まれたドメインを生成することが可能である。

実施例５で開示されるように、ＩＧＦＢＰ−３の適切に折り畳まれたサブドメインは、ＩＧＦＢＰ−３配列の戦略的な位置にある特定のプロテアーゼについての標的部位を操作し、構築物を発現させ、そして発現したタンパク質を同族のプロテアーゼで切断することによって、生成され得る。当業者に明白であるように、この方法は、ＩＧＦＢＰ−３の天然に存在するサブドメインと改変体サブドメインの両方の生成に有用である。この方法を実行するための技術は、当該分野で周知であり、ＩＧＦＢＰ−３配列にプロテアーゼ認識部位を挿入するための組換えＤＮＡ操作の工程を包含する。上述のように、種々の異なるプロテアーゼ認識部位が公知である。そして、任意の都合よいプロテアーゼ認識部位が、この部位がＩＧＦＢＰ−３配列中に未だ存在しない限りは使用され得る。ヒトライノウイルスの３Ｃプロテアーゼの認識部位は、好ましいプロテアーゼ認識部位である。挿入されたプロテアーゼ認識部位とともにＩＧＦＢＰ−３をコードするＤＮＡ配列を含む構築物は、次いで、ＩＧＦＢＰ−３構築物配列の転写および翻訳に必須のシグナルを含む、適切な発現ベクターに挿入される。次いで、ＩＧＦＢＰ−３は、適切な組換え宿主への発現構築物の形質転換によって生成され、発現される。好ましくは、ＩＧＦＢＰ−３は、組換え発現系から精製され、リフォールディングされ（必要な場合）、次いで切断され、適切に折り畳まれたＩＧＦＢＰ−３のサブドメインを与える。

（治療的な投与）
ＩＧＦ結合タンパク質誘導ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導低分子は、細胞損傷もしくはストレスを起こす薬剤または処置レジメンと併用して、細胞傷害性または細胞増殖抑制性の処置が指示される任意の疾患または障害（例えば、癌（好ましくは乳癌、前立腺癌、結腸癌および肺癌）、炎症関連細胞または他の免疫関連細胞の増殖を含む過増殖性障害、ならびに動脈再狭窄（例えば、血管形成術および／または冠動脈バイパス手術後の）を含む）の処置のために使用され得る。特定の実施形態において、同時投与薬剤は、ＩＧＦＢＰ由来のＥＣＭ結合ペプチドと結合体化されて標的化および局在化を提供し得る、化学療法剤（例えば、パクリタキセル、ビンクリスチンなど）である。

本発明はまた、腫瘍の侵襲性減少の方法の方法（例えば、腫瘍の局所的、限局的および転移性の拡散の減少）、特に過度の骨形成に関連する障害における骨形成の減少の方法、ならびに、ＩＧＦＢＰ由来のタンパク質分解抑制ペプチドを投与することにより、血管再狭窄を減少または抑制する方法を提供する。

転写調節因子とＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドとの融合物または結合体を含む、組成物の投与を含む治療的な方法もまた提供される。いくつかの実施形態において、その融合物または結合体は、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドと、Ｔ−ｂｅｔのような転写因子とを含む。Ｔ−ｂｅｔを含む結合体は、Ｔ_ｈ１応答に対する免疫応答を変更するか、または偏らせる、免疫調節に有用であり、この免疫調節は、アレルギー、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ）および他のＴ_ｈ２媒介性障害のような障害の症状を緩和し得る。

ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む分子は、好ましくは経口投与を介してか、または非経口投与を介して投与される。非経口投与には以下が含まれるが、これらに限定されない：静脈内（ＩＶ）経路、腹腔内（ＩＰ）経路、筋肉内（ＩＭ）経路、皮下（ＳＣ）経路、皮内（ＩＤ）経路、経皮経路、吸入経路、および鼻腔内経路。ＩＶ投与、ＩＰ投与、ＩＭ投与およびＩＤ投与は、ボーラス投与によってか、または注入投与によってであり得る。ＳＣ投与については、投与は、ボーラス投与によってか、注入によってか、あるいは移植可能なミニポンプ（例えば、浸透圧性ミニポンプもしくは機械的ミニポンプ）または徐放性の移植片のような移植可能なデバイスによって、であり得る。ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子はまた、ＩＶ投与、ＩＰ投与、ＩＭ投与、ＩＤ投与またはＳＣ投与に適合された徐放性処方物中で送達され得る。吸入されるＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子は、好ましくは、分散した用量で送達される（例えば、タンパク質送達に適合された定用量吸入器によって）。経皮経路を経由する、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む分子の投与は、連続的であるか、または拍動性であり得る。誘導体ペプチドまたは誘導体低分子の投与はまた、経口的に起こり得る。

非経口投与について、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む組成物は、乾燥粉末処方物、半固形処方物または液体処方物中にあり得る。吸入以外の経路による非経口投与について、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む組成物は、好ましくは、液体処方物にて投与される。ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチド処方またはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子処方物を含む組成物は、塩、緩衝液、膨張性薬剤、オスモライト（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）、酸化防止剤、洗剤、界面活性剤、および当該分野で公知の他の薬学的賦形剤のような付加的な成分を含み得る。

ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドおよびＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む組成物は、約０．００１〜約４０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、より好ましくは約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、より好ましくは、約０．０５〜約４ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、なおより好ましくは、約０．１〜約１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、被験体に投与される。

ＩＧＦＢＰ誘導体ペプチドまたはＩＧＦＢＰ誘導体低分子を含む組成物の投与の代替法としては、ＩＧＦＢＰ誘導体ペプチドまたはＩＧＦＢＰ誘導体低分子を含む組成物をコードする核酸構築物が投与され得る。この構築物は、ＩＧＦＢＰ誘導体ペプチドを含む組成物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、そして、通常、細胞におけるＩＧＦＢＰ誘導体ペプチド配列を含む組成物の発現および翻訳を生じるＩＧＦＢＰ誘導体ペプチド配列に作動可能に連結された配列（例えば、プロモーター／エンハンサー、翻訳開始部位、ポリアデニル化シグナルなど）を含むが、細胞染色体中に組み込むように設計された構築物もまた、企図される（例えば、その構築物がＩＧＦＢＰ誘導体ペプチド配列に隣接するレシピエント細胞の染色体に相同な配列のような、宿主の染色体への組み込みを促進する配列を含む場合）。

遺伝子移入の方法は、当該分野で周知であり、インビトロ法（例えば、培養細胞（好ましくは被験体に再導入される自己細胞）の形質転換）、エキソビボ法（例えば、インビボで培養されていない細胞（好ましくは被験体に再導入される自己細胞）の形質転換）およびインビボ法（例えば、被験体への核酸構築物の投与によるインサイチュでの細胞の形質転換）が挙げられる。このような遺伝子移入を達成するための方法は、当該分野で周知であり、リン酸カルシウム形質転換、バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）形質転換、エレクトロポレーション、脂質媒介性形質転換、裸のＤＮＡ移入、およびウイルス媒介性移入（例えば、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター）を含む、標準の形質転換法が挙げられる。

ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む組成物は、以下の同時投与剤のうちの１つ以上と一緒に被験体に投与される：化学療法剤；抗体；物理的ストレス（例えば放射線）；処置レジメン（例えば、栄養上のレジメン）；または標的細胞上に存在するレセプター（例えば、レチノイドレセプターおよび甲状腺レセプター）のリガンド。被験体が、同時に両方の薬剤に対する曝露を経験する限りは、２つの薬剤の投与は、同時であっても、重なっていても、または時間的に別々であってもよい。２つの薬剤が同じ投与経路および同じ投与スケジュールのために処方される場合、投与は、好ましくは同時であるか、またはほぼ同時である（例えば、同時注入または連続注入）。しかし、いくつかの実施形態において、２つの薬剤についての投与経路および投与スケジュールは異なり、このことが同時投与を不都合にする。化合物がいつ、どのようにして投与されるかにかかわらず、被験体が両方の化合物に対して同時かつ全身性の暴露を経験する場合、被験体は両方の薬剤を投与されたとみなされる。

ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子を含む組成物との同時投与剤の投与を必要とする方法において、この同時投与剤の用量は通常、その薬剤について当該分野で公知のように、個々の被験体について力価測定される。同時投与剤は、非経口および経口の投薬形態を含む、当該分野で公知の任意の処方物において作製され得る。経口処方物が好ましいが、非経口処方物もまた受容可能であり、そして入院の場面においてより簡便であり得る。非経口投与のための処方は、通常液体として処方されるが、ゲル形態または固形デポー形態でもあり得る。経口投与のための処方物は、通常錠剤またはカプセルの形態であるが、シロップまたは液体もまた受容可能である。同時投与剤の処方は通常、賦形剤（例えば、塩、緩衝液、バルキング剤、洗浄剤、結合剤、界面活性剤、安定化剤、保存剤、酸化防止剤、潤滑剤、コーティング剤、および当該分野で公知の他の薬学的に受容可能な賦形剤）を含む。

同時投与剤の投薬量および投与形態は、当該分野に公知であるように、同一性、処方、投与経路および同時投与剤に関する他の関連特性に従って、調節されるべきである。

誘導物質およびアンタゴニストは、同様の方法で投与される。例として：アンタゴニストがプロピルチオウラシルである場合、プロピルチオウラシルの用量は、１〜４００ｍｇ／日であり得る。被験体は通常、５０〜４００ｍｇ／日の用量（代表的には３回の等用量に分けられる）で開始され、２回または３回の等用量に分けて５０〜１００ｍｇ／日で維持される。メチマゾールおよびカルビマゾ−ルについては、用量は、０．１〜５０ｍｇ／日であり得る。代表的には、被験体は５〜５０ｍｇ／日で開始され、１〜５ｍｇ／日で維持される。

当業者に理解されるように、本方法ならびに症状を測定するために使用される方法によって緩和される疾患の症状は、特定の疾患および個々の患者によって変化する。

（キット）
本発明は、ＩＧＦＢＰ由来のペプチドまたは低分子を備えるキットを提供する。このキットは、ＩＧＦＢＰ由来のペプチドまたは低分子を含む組成物を含む少なくとも１つのパッケージを備える。必要に応じて、キットはまた、組成物の使用に関する説明書のセットを備える。

キットに含まれる組成物は、ＩＧＦＢＰ由来のペプチドもしくは低分子、またはＩＧＦＢＰ由来のペプチドもしくは低分子を含む融合体／結合体であり得る。特定の実施形態において、キットはまた、細胞傷害性化学療法薬剤（例えば、パクリタキセルまたはドキソルビシン）のような同時投与剤の少なくとも１パッケージを含み得る。ＩＧＦＢＰ由来のペプチドまたは低分子（および任意の、同時投与剤）を含む組成物の容器は、単位用量であるか、バルクパッケージ（例えば、多用量パッケージ）であるか、またはサブユニット用量であり得る。

説明書を含む実施形態において、この説明書は通常、包含される組成物の意図した使用のための（例えば、癌、過剰増殖障害、または動脈再狭窄の処置のための）、投薬量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。本発明のキットに提供される説明書は、代表的に、ラベルまたはパッケージ挿入物（例えば、キットに含まれる紙の書面）に書かれた説明書であるが、機械で読み取り可能な説明書（例えば、磁気記憶ディスクまたは光学記憶ディスクで実行される説明書）もまた受容可能である。

本開示を通して引用された特許、特許出願、および出版物は、それら全体が、本明細書中で参考として援用される。

（実施例１：ＩＧＦＢＰ−３を用いた、栄養的ストレスを与えられたＨＥＫ２９３肝細胞の処置）
ヒト胚性肝臓２９３(ＨＥＫ２９３)細胞を、２％、４％、６％または８％のウシ胎児血清を補充したダルベッコの改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中で増殖させた。細胞が８０〜８５％コンフルエンシー（細胞の力価：１プレートあたりおよそ２．１×１０^６細胞）に到達したとき、５μｇのＩＧＦＢＰ−３または緩衝液コントロールを各プレートに添加した。細胞を、３７℃で一晩培養した。次の日、培地を除去し、細胞をトリプリン−ＥＤＴＡ（０．２５％トリプシン、１ｍＭ ＥＤＴＡ）＋１×リン酸緩衝生理食塩水でリンスした。細胞を遠心分離し、そして上清を除去した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）製のＡｐｏＡｌｅｒｔカスパーゼ３アッセイキットを使用して、アポトーシスを測定した。細胞を５０μｌの冷却した細胞溶解緩衝液に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。得られた細胞溶解物をＢｅｃｋｍａｎ マイクロ遠心分離機中、１４０００ｒｐｍで４℃で３分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、５０μｌの２×反応緩衝液／ＤＴＴ＋５μｌの１ｍＭカスパーゼ３基質を各チューブに添加した。水浴中３７℃で１時間インキュベートした後、サンプルをマイクロプレートリーダーの４０５ｎｍで読んだ。この実験の結果を、図３に示す。

（実施例２：プロアポトーシスペプチド配列の同定）
図３Ａに示すように、そして共有に係る米国特許出願番号０９／９５６，５０８に開示されるように、ＩＧＦＢＰ−３は、アポトーシス促進活性を有する。ＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドを、本質的に実施例１に記載されるように、アポトーシス促進活性について試験した。

試験したペプチドを、表１に記載する（＊で印を付けたペプチドは、ヘキサヒスチジンタグを含む）。

図４Ｂに要約されるこの実験からのデータは、最初に、インタクトなＩＧＦＢＰ−３自体より大きいアポトーシス促進活性（重量ベースに基づく）を示すＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドを生成することが可能であることを示した。ペプチドＨとペプチドＩのアポトーシス促進活性を比較すると、ペプチドＩが重量ベースでインタクトなＩＧＦＢＰ−３（Ｂ、Ｃ）または長いペプチド（Ｇ、Ｈ）よりも３〜４倍高いアポトーシス促進活性を示したことは注目すべきである。すなわち、ペプチドＩと比較して、ペプチドＨの９つのさらなるアミノ酸の存在が、劇的に低いアポトーシス促進活性をもたらした。

（実施例３：ＩＧＦＢＰ−３および誘導体ペプチドの金属結合特性）
図５に示すように、インタクトなＩＧＦＢＰ−３は、固定化されたニッケルおよび亜鉛に結合し、６０ｍＭイミダゾールで樹脂から溶出され得る。このＩＧＦＢＰ−３の以前まで知られていなかった特性は、魅力的であり、そして多数の実用的な意味を有し、その中で、固定化金属アフィニティ（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して産物を捕捉する能力が、治療、ハイスループットな発見、および他の研究領域における多数の潜在的な用途をもたらす。

図５は、Ｎｉ^＋＋（パネルａ）ＩＭＡＣおよびＺｎ^＋＋（パネルｂ）ＩＭＡＣを使用する、ＩＧＦＢＰ−３のＩＭＡＣ精製からのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。ＩＧＦＢＰ−３は、両方のＩＭＡＣ樹脂に効率的に結合する。

本発明者らは、金属に結合するＩＧＦＢＰ−３由来のサブドメインおよびペプチドの能力をさらに試験した。以下の実施例５に示すように、インビボで生成されたＩＧＦＢＰ−３の規定されたフラグメントは、ＩＭＡＣ上に捕捉され得る。２つの短いペプチドがＮｉ−Ｈｉｓ結合カラムを通過した：
ペプチド１：（Ｈ２Ｎ）．．．ＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ．．．（ＣＯＯＨ）;
ペプチド２：（Ｈ２Ｎ）．．．ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ．．．（ＣＯＯＨ）。

両方のペプチドが、カラムに特異的に結合した。ペプチド１は６０ｍＭイミダゾールで溶出されたのに対し、より高濃度のイミダゾール（１Ｍ）がペプチド２の溶出に必要であった。それゆえ、ペプチド２はペプチド１が結合するよりも、より密接に金属に結合するようである。

（実施例４：ＩＧＢＰ−３および同時投与剤を用いるＬＡＰＣ−４前立腺腫瘍細胞の処置）
ＩＧＦＢＰ−３のＴＡＸＯＬ（登録商標）との併用の、ＬＡＰＣ−４移植片モデルを利用する前立腺癌細胞の増殖および死に対する効果を分析するための研究を実施した。１００万個の細胞（１００μｌ中）をＳＣＩＤマウスにＳＱ注入した。４週間後に、蝕知可能な腫瘍が観察された。４群を処置した（１群あたり６マウス）：１）生理食塩水コントロール；２）ＩＧＦＢＰ−３（４ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内）；３）ＴＡＸＯＬ（登録商標）（２ｍｇ／ｋｇ／日で５〜８日目に腹腔内）；４）ＴＡＸＯＬ（登録商標）とＩＧＦＢＰ−３の併用。毎週の触診により、腫瘍をサイズについて分析し、血清を採取した。動物を２１日目に屠殺し、腫瘍重量を評価した。この実験の結果は、併用治療による減少した腫瘍サイズ（４０％）の傾向を示した。この生物学的作用は、ＩＧＦＢＰ−３のアポトーシス促進活性に起因すると考えられる。

（実施例５：３Ｃプロテアーゼ標的部位をタンパク質の一次配列中に操作することによるＩＧＦＢＰ−３の定義されたサブドメインの生成）
規定されたＩＧＦＢＰ−３サブドメインを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系において可溶性融合タンパク質として発現される構築物から生成した。この融合体の一般的な構造は、以下である：
ＩＶＳ−１：ＤｓｂＡ（ｍｕｔ）．．．［３Ｃ］．．．ドメイン１．．．［３Ｃ］．．．ドメイン２／３
ＩＶＳ−２：ＤｓｂＡ（ｍｕｔ）．．．［３Ｃ］．．．ドメイン１／２．．．［３Ｃ］．．．ドメイン３。

ここで、［３Ｃ］は、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼによって認識されるペプチド配列である。規定されたドメインを生成するための一般的なストラテジーを、図５に示す。収量は、野生型に匹敵し、実質的な分画は、ＩＧＦ−Ｉに結合するタンパク質の実証された能力に基づいて、正確に折り畳まれると考えられる。切断の後、ＩＶＳ−１構築物（ドメイン１、２／３）から生成されたＩＧＦＢＰ−３のサブドメインを、疎水性相互作用樹脂（例えば、フェニル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標））上または（あまり所望されないが）カチオン交換樹脂（例えば、ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標））上で捕捉する。他の樹脂（例えば、固定化ヘパリン）もまた使用され得る。３ＣプロテイナーゼとのＩＶＳ−１融合のカラム上での効果的な切断は、１：１０（プロテアーゼ対基質）の割合を使用して４℃または室温で示されている。完全な切断は、２０分未満で見られている。過去に、切断産物のアミノ酸配列は、酵素が異常にきれいな様式（＜５％「でこぼこした」末端）で切断することを示している。さらに、ほとんど均質までの精製が、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーまたは亜鉛アフィニティクロマトグラフィーにより達成され得る。明らかに、金属結合は、ＩＧＦＢＰ−３分子においてＩＧＦ−Ｉ結合のための初期ドメインを構成すると考えられるタンパク質のアミノ末端の約１００アミノ酸を必要としない。

（実施例６：細胞インターナリゼーションペプチドの同定）
３つのペプチド伸長を、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に関する遺伝子とインフレームでそれぞれクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）中に発現させた。各構築物は、６Ｈタグをさらに含む。産物をＨｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で捕捉し、６０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出し、次いで、ＨＩＣ（フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）高性能樹脂、Ａｍｅｒｓｈａｍ）樹脂でさらに精製し、５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水で溶出した。精製されたペプチド−ｇｆｐを、ＨＥＫ２９３（ヒト胚性肝細胞株）上の細胞インターナリゼーションについて試験した。ＨＥＫ２９３細胞を、８０〜８５％コンフルエント（１プレートあたり約２．１×１０^６細胞）になるまでダルベッコの改変イーグル培地中で培養した。各ペプチド（１プレートあたり１１μｇ）を含む新鮮な培地をプレートに添加した。細胞を、およそ３０分間３７℃でインキュベートした。培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、１×リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。蛍光を測定するために、細胞を長波長ＵＶランプ下で維持した。サンプルの写真を図７に示す。サンプル「ｄ」が、強い蛍光を示した唯一のサンプルであった。従って、ペプチドＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷが、大きい無関係のタンパク質の、ＨＥＫ２９３細胞内へのインターナリゼーションを指示するのに必須の全配列情報を含むようである。この同じ配列の部分に属すると考えられる公知の核転座特性と組み合わされ、このペプチドは、細胞取り込みならびに種々の分子（例えば、タンパク質、核酸および小さな化学成分）に関する核トランスポーターとして有用であり得る。従来のおよび遺伝子治療、細胞画像化、研究、ならびにハイスループットスクリーニングへの適用が、予見される。

（実施例７：ＩＧＦＢＰ−３の金属結合特性）
種々の金属で荷電された固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂へのＩＧＦＢＰ−３の結合を測定した。約１ｍｇのＩＧＦＢＰ−３を、各カラム（ＮＴＡ樹脂、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に充填した。充填、フロースルー（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）、洗浄、および６０ｍＭイミダゾールでの溶出のＯＤ２８０を測定することによって、「結合割合」を算出した。代表的な回収率は、８５〜９５％であった。結果を表２にまとめる。

（実施例８：ＩＧＦＢＰ−３およびパクリタキセルの共アポトーシス活性）
パクリタキセルと組み合わせたＩＧＦＢＰ−３の共アポトーシス活性を、実施例１で記載したＨＥＫ２９３アッセイで測定した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ＋８％ＦＣＳ中で増殖させ、次いで、０．３ｎｇ／ｍｌのパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））中か、５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−３中か、またはこの２つの組み合せにおいてインキュベートした。いくつかの培養物を、２００ｎｇ／ｍｌの抗−β−１−インテグリン抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で３０分間、前処置した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．製のＡｐｏＡｌｅｒｔカスパーゼ−３キットを使用して、カスパーゼ−３をアッセイした。

この実験の結果を図８に示す。図８Ａに示す結果は、ＨＥＫ２９３細胞にパクリタキセルとＩＧＦＢＰ−３の強力な共アポトーシス相乗効果を実証する。図８Ｂに示すように、抗−β−１−インテグリン抗体による前処置は、このアッセイにおけるＩＧＦＢＰ−３の共アポトーシス活性を非常に阻害する。しかし、ＩＧＦＢＰ−３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびシスプラチンを使用して行われた同様の実験において、いかなる共アポトーシス活性も実証できなかった（図８Ｃ）。

（実施例９：ＭＢＤ２ペプチドによって方向付けられるＧＦＰの迅速な細胞取り込み）
ペプチドＫＫＧＨＡＫＤＳＱＲＹＫＶＤＹＥＳＱＳ（無関係なペプチドＧＦＰ３１）、ペプチドＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（長いペプチドＧＦＰ３２）、ペプチドＫＫＧＦＹＫＫＫ（上流ペプチドＧＦＰ３４）、およびペプチドＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（ＭＢＤ２を含む下流ペプチドＧＦＰ３５）をコードするポリヌクレオチドを、ｐＧＦＰｕｖベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）中のＧＦＰコード配列の５’末端へのインフレーム融合としてクローン化した。発現するタンパク質を金属アフィニティークロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを通して精製した。

各タンパク質を、８０％コンフルエントのＨＥＫ２９３細胞に、０．５μｇ／ｍｌで添加した。図９Ａは上から下に、精製タンパク質のクマシー染色したゲル、添加１時間後の処置細胞のＧＦＰ蛍光および同じ細胞由来の抽出物のウェスタンブロット（二連の実験）を示す。（^＊）ウェスタンは、抗ＧＦＰ抗体で探索した。図９Ｂはさらに、これらの細胞へのＧＦＰ３２の取り込みが、細胞を抗フィブロネクチン抗体ではなく、２００ｎｇ／ｍｌの抗インテグリン抗体で前処理することによって選択的に抑制され得ることを示す、ＧＦＰ３２処理細胞の蛍光を示す。

（実施例１０：ＭＢＤペプチドとパクリタキセルの共アポトーシス活性）
ペプチド（５０ｎｇ／ｍｌ）を、ペプチドと併用して０．３ｎｇ／ｍｌパクリタキセルを補填したＤＭＥＭ中で増殖させた、８０％コンフルエントのＨＥＫ２９３細胞に添加した。カスパーゼ−３活性を、添加８時間後の細胞抽出物において測定した。

結果を表３にまとめる。アポトーシス活性を、モルベース（ＭＢＤ２活性を１００単位（３つの実験の平均）として規定した）でＭＢＤ２に対して正規化した、任意のカスパーゼ−３単位で表す；「ｎｄ」は「実施せず」を示し、；「ｐｓ」はホスフォセリンを示す。金属結合を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に結合する充填したペプチドの割合として表す；約１〜１．５ｍｇのペプチドを、カラム上に充填した。細胞取り込みを、実施例９に記載されるように、ＧＦＰとの遺伝的融合を使用して決定した。

（実施例１１：ＭＢＤペプチドの抗原性プロファイリング）
ＭＢＤペプチドの抗原性プロファイルを、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。ＭＢＤペプチドまたはＩＧＦＢＰ−３を、９６ウェルＮｉ−ＮＴＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のウェルに１５分間添加し、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ緩衝液で２回洗浄し、次いで、同じ緩衝液中３％ＢＳＡで４時間ブロックした。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化した二次抗体を使用して、検出を比色定量分析的に（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）（吸光度単位で記録して）行った。

図１０に示すように、ＭＢＤペプチドは、全長ＩＧＦＢＰ−３と抗原性で異なる。パネル（ａ）に示すように、試験したＭＢＤペプチドのいずれもが、ポリクローナル抗ＩＧＦＢＰ−３抗体と反応しなかった。パネル（ｂ）は、ＭＢＤ５ペプチドに対して産生されるポリクローナル抗体を使用して得られた吸光度単位を示し、ここでポリクローナル抗体は、ＭＢＤペプチドに結合するが、ＩＧＦＢＰ−３には結合しない。

（実施例１２：ＭＢＤ共アポトーシス活性は、血漿タンパク質による阻害に対して抵抗性である。）
パクリタキセルと、ＭＢＤペプチドまたはＩＧＦＢＰ−３との共アポトーシス活性を、２つの血漿タンパク質；フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンの存在下または非存在下で試験した。ＭＢＤペプチドまたはＩＧＦＢＰ−３、（５０ｎｇ／ｍｌ）、０．３ｎｇ／ｍｌパクリタキセル、および血漿タンパク質（２００ｎｇ／ｍｌ）を、本質的に実施例８に記載されるように、ＤＭＥＭ中で増殖させた８０％コンフルエントのＨＥＫ２９３細胞に添加した。カスパーゼ−３を、８時間のインキュベーション後に測定した。

アポトーシス活性を、ＭＢＤ２に対して正規化した（ＭＢＤ２活性を１００単位として規定した）、任意のカスパーゼ−３単位で算出した。結果を表４にまとめる（３つの実験の平均）。フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンの、阻害ＩＧＦＢＰ−３共アポトーシス活性は、フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンの両方によって本質的に排除される一方、ＭＢＤ２共アポトーシス活性は、本質的に影響を受けないか（フィブロネクチン）、または、適度に減少するだけか（フィブリノーゲン）のいずれかである。

本発明は、直接的な記載および実施例の両方によって詳述されている。本発明の等価物または本発明の改変は、当業者に明らかであり、そして本発明の範囲内に包含される。

図１は、ＩＧＦＢＰ−３配列を１文字表記のアミノ酸コードで示す。図１Ａは、ネイティブヒトＩＧＦＢＰ−３（Ａｌａ_５対立遺伝子改変体）のアミノ酸配列を示す。図１Ｂは、［Ｎ１０９Ｄ］−ｈＩＧＦＢＰ−３誘導体（Ａｌａ_５対立遺伝子改変体）を示す。 図２は、ＣＤ７４モチーフを含む選択されたヒトタンパク質のアミノ酸配列アラインメントを示す。 図３は、実施例１に記載される実験の結果を示す。 図４は、実施例２に記載される実験の結果を示す。 図５は、Ｎｉ^＋＋ＩＭＡＣおよびＺｎ^＋＋ＩＭＡＣを使用する、ＩＧＦＢＰ−３のＩＭＡＣ精製の結果を示す。パネルａおよびｂは、それぞれＮｉ^＋＋ＩＭＡＣおよびＺｎ^＋＋ＩＭＡＣからのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＦＴはカラムに吸着しなかった物質を示す；Ｗは洗浄（画分）を示す；５０は５０ｍＭイミダゾール洗浄（画分）を示す；６０は６０ｍＭイミダゾール洗浄（画分）を示す；Ｅは１Ｍイミダゾール溶出緩衝液（画分）を示す；Ｓは１Ｍ ＥＤＴＡ緩衝液（画分）を示す。 図６は、融合タンパク質を使用するＩＧＦＢＰ−３ドメインの生成に関するスキームを示す。下パネルは、精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１は、３Ｃタンパク質分解酵素（１０：１希釈）で消化した粗抽出物を示す；レーン２は、フェニルセファロースＨＩＣクロマトグラフィー後を示す；レーン３は、ニッケル金属アフィニティクロマトグラフィー後を示す。 図７は、ペプチド−ｇｆｐ融合体とともにインキュベートした後の細胞の蛍光を示す。ａ＝細胞単独（ｇｆｐの添加なし）；ｂ＝細胞＋ＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＡＨＱＮＳＱＴ−ｇｆｐ；ｃ＝細胞＋ＫＫＧＨＡＫＤＳＱＲＹＫＶＤＹＥＳＱＳ−ｇｆｐ；ｄ＝細胞＋ＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ−ｇｆｐ。 図８は、実施例８に記載される共アポトーシスアッセイの結果をまとめたグラフを示す。 図９は、実施例９に記載される細胞インターナリゼーション実験の結果を示す。 図１０は、実施例１１に記載される抗原性プロファイリング研究の結果を示す。

Claims (21)

1. ＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチドを含む組成物であって、ここで、該ペプチドが、重量基準で、全長の成熟ＩＧＦ結合タンパク質と同等または、より大きい程度の生物学的特性を示し、該生物学的特性が、プロアポトーシス、金属結合、および細胞内在化からなる群から選択され、該ペプチドが、ＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号１）、ＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号２）、ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号３）、ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣ（配列番号８）、ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号９）、およびＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣ（配列番号４）からなる群より選択される配列からなる、組成物。
2. 前記ペプチドが、配列ＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号１）からなる、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ペプチドが、配列ＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号２）からなる、請求項１に記載の組成物。
4. 前記ペプチドが、配列ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号３）からなる、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ペプチドが、配列ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣ（配列番号８）からなる、請求項１に記載の組成物。
6. 前記ペプチドが、配列ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号９）からなる、請求項１に記載の組成物。
7. 前記ペプチドが、配列ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣ（配列番号４）からなる、請求項１に記載の組成物。
8. 前記ペプチドが、治療分子もしくはマーカー分子に融合または結合体化される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記治療分子が、ポリペプチドである、請求項８に記載の組成物。
10. 前記生物学的特性が、プロアポトーシスである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記生物学的特性が、金属結合である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記生物学的特性が、細胞内在化である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
13. 癌の症状を緩和するための組成物であって、該組成物は、有効量のＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチドまたは低分子を含み、該組成物は癌に罹患している個体に投与されることを特徴とし、そして該ペプチドは、ＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号１）、ＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号２）、ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号３）、ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣ（配列番号８）、ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（配列番号９）、およびＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣ（配列番号４）からなる群より選択される配列からなる、組成物。
14. 前記ペプチドが、治療分子に融合または結合体化される、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記治療分子が、ポリペプチドである、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記癌が乳癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌および肺癌からなる群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
17. 同時投与される薬剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
18. 請求項１７に記載の組成物であって、ここで、前記同時投与される薬剤が、ドキソルビシン、パクリタキセル、メトトレキサート、タモキシフェン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、エトポシド、ストレプトゾトシンおよび５−フルオロウラシルからなる群から選択される化学薬剤である、組成物。
19. 前記癌が前立腺癌である、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記同時投与される薬剤が、パクリタキセルである、請求項１９に記載の組成物。
21. 請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物が、０．００１〜４０ｍｇ／ｋｇ全体重／日（ｍｇ／ｋｇ／日）で投与されることを特徴とする、組成物。

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