BR102016025154A2 - método para produzir um l-aminoácido - Google Patents

Abstract

um método para produzir um l-aminoácido da família do glutamato tal como ácido l-glutâmico é fornecido. um l-aminoácido da família do glutamato é produzido cultivando-se uma bactéria corineforme tendo uma capacidade para produzir um l-aminoácido da família do glutamato, que foi modificado de modo que a atividade de um carreador de absorção do ácido a-cetoglutárico (a-kg) fosse aumentada, em um meio, e coletar o l-aminoácido da família do glutamato do meio.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO” Campo Técnico [001] A presente invenção refere-se a um método para produzir um L-aminoácido da família de glutamato tal como ácido L-glutâmico usando uma bactéria corineforme. L-Aminoácidos são industrialmente úteis como matérias primas de temperos, e assim por diante. Técnica Fundamental [002] L-Aminoácidos são industrialmente produzidos, por exemplo, pela fermentação usando micro-organismos tais como bactérias corineformes tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido (Documento não patente 1). Como tais micro-organismos, por exemplo, cepas isoladas da natureza e cepas mutantes das mesmas têm sido usadas. Também, uma capacidade para produzir L-aminoácido de micro-organismos pode ser melhorada usando-se técnicas de DNA recombinantes. Por exemplo, como meios para melhorar a capacidade produtora de ácido L-glutâmico de bactérias corineformes, técnicas de realçar a atividade de fosfocetolase (Documento de Patente 1) e usando um gene yggB mutante (Documento de Patente 2) são conhecidas.

[003] O gene kgtP de Escherichia coli é um gene que codifica um carreador de absorção do ácido α-cetoglutárico (α-KG) (documento não patente 2). α-KG é conhecido como um intermediário do ácido L-glutâmico na biossíntese do ácido L-glutâmico. Entretanto, não é conhecida a relação entre um carreador de absorção de α-KG e a produção de L-aminoácidos da família do glutamato.

Referências da técnica anterior Documentos de Patente [004] Documento de Patente 1: WO2006/016705 [005] Documento de Patente 2: WO2006/070944 Documentos que não de patente [006] Documento não patente 1: Akashi, K. et al., Amino Acid Fermentation. Japan Scientific Societies Press, p,195 a 215, 1986.

[007] Documento não patente 2: Seol W, Shatkin AJ. Escherichia coli kgtP encodes an alpha-ketoglutarate transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. Maio 1991 1; 88(9): 3802-6.

Sumário da Invenção Objetivo a ser Alcançado pela Invenção [008] Um objetivo da presente invenção é desenvolver uma nova técnica para melhorar uma capacidade para produzir um L-aminoácido da família do glutamato de uma bactéria corineforme, e fornecer deste modo um método para produzir eficientemente o L-aminoácido da família do glutamato. Meios para Alcançar o Objetivo [009] De modo a alcançar o objetivo anteriormente mencionado, os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas. Como um resultado, eles descobriram que uma capacidade para produzir um L-aminoácido da família do glutamato de uma bactéria corineforme pode ser melhorada modificando-se a bactéria corineforme de modo que a atividade de um ácido α-cetoglutárico (α-KG) seja aumentada, e realizaram a presente invenção.

[0010] A presente invenção pode ser assim corporificada, por exemplo, como segue.

[1] Um método para produzir um L-aminoácido, o método compreendendo: cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido em um meio; e coletar o L-aminoácido do meio, em que a bactéria foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção do ácido α-cetoglutárico (α-KG) fosse aumentada quando comparada com uma cepa não modificada, e em que o L-aminoácido é um L-aminoácido da família do glutamato.

[2] O método mencionado acima, em que o carreador de absorção de α-KG é uma proteína codificada pelo gene kgtP.

[3] O método mencionado acima, em que o carreador de absorção de α-KG é uma proteína definida em (a), (b), ou (c) mencionados abaixo: (a) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8, mas que inclui substituição, deleção, inserção, e/ou adição de 1 a 10 resíduos de aminoácido, e tendo atividade de absorção de α-KG; (c) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido mostrando uma identidade de 90% ou mais alta com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8, e tendo atividade de absorção de α-KG.

[4] O método mencionado acima, em que a atividade do carreador de absorção de α-KG é aumentada aumentando-se a expressão de um gene que codifica o carreador de absorção de α-KG.

[5] O método mencionado acima, em que a expressão do gene é aumentada aumentando-se o número de cópia do gene e/ou modificando-se uma sequência de controle de expressão do gene.

[6] O método mencionado acima, em que a bactéria foi modificada ainda de modo que a atividade de fosfocetolase seja aumentada quando comparada com uma cepa não modificada.

[7] O método mencionado acima, em que a fosfocetolase consiste de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase.

[8] O método mencionado acima, em que a atividade da fosfocetolase é aumentada aumentando-se a expressão de um gene que codifica a fosfocetolase.

[9] O método mencionado acima, em que a bactéria foi modificada ainda de modo que a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e/ou succinato desidrogenase seja reduzida quando comparada com uma cepa não modificada.

[10] O método mencionado acima, em que a bactéria é uma bactéria Corynebacterium.

[11] O método mencionado acima, em que a bactéria é Corynebacterium glutamicum.

[12] O método mencionado acima, em que o L-aminoácido da família do glutamato consiste de um ou mais L-aminoácidos selecionados de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-citrulina, e L-ornitina.

[13] O método mencionado acima, em que o L-aminoácido da família do glutamato é o ácido L-glutâmico.

[14] O método mencionado acima, em que o ácido L-glutâmico é o L-glutamato de monoamônio ou L-glutamato monossódico.

[15] O método mencionado acima, em que a bactéria foi modificada ainda de modo a abrigar um gene yggB mutante.

[16] O método mencionado acima, em que o gene yggB mutante é um gene yggB tendo uma mutação que melhora a capacidade de produzir ácido L-glutâmico da bactéria corineforme.

[17] O método mencionado acima, em que o gene yggB mutante é um gene yggB tendo um mutação definida em (1), (2), ou (3) mencionados abaixo: (1) uma mutação na região que codifica os resíduos de aminoácido nas posições 419 a 533 de uma proteína YggB do tipo selvagem, (2) uma mutação na região que codifica uma região de transmembrana de uma proteína YggB do tipo selvagem, e (3) uma combinação dos mesmos.

[18] O método mencionado acima, em que a proteína YggB do tipo selvagem é uma proteína definida em (a), (b), ou (c) mencionados abaixo: (a) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12, mas que inclui substituição, deleção, inserção, e/ou adição de 1 a 10 resíduos de aminoácido, e tendo uma propriedade que uma expressão aumentada da mesma na bactéria corineforme fornece uma capacidade produtora de ácido L-glutâmico melhorada da bactéria corineforme; (c) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido mostrando uma identidade de 90% ou mais alta com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12, e tendo uma propriedade que uma expressão aumentada da mesma na bactéria corineforme fornece uma capacidade produtora de ácido L-glutâmico melhorada da bactéria corineforme.

[0011] De acordo com a presente invenção, uma capacidade para produzir um L-aminoácido da família do glutamato de uma bactéria corineforme pode ser melhorada, e o L-aminoácido da família do glutamato pode ser eficientemente produzido.

Modos para Realizar a Invenção [0012] A seguir, a presente invenção será explicada em detalhes.

[0013] O método da presente invenção é um método para produzir um L-aminoácido, o método compreendendo cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido em um meio, e coletar o L-aminoácido do meio, em que a bactéria foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção do ácido α-cetoglutárico (α-KG) seja aumentada, e em que o L-aminoácido é um L-aminoácido da família do glutamato. A bactéria corineforme usada para o método também é aludida como “bactéria da presente invenção”. <1> Bactéria da presente invenção [0014] A bactéria da presente invenção é uma bactéria corineforme tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido, que foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de α-KG seja aumentada. <1-1> Bactéria corineforme tendo capacidade para produzir L- aminoácido [0015] Na presente invenção, o termo “bactéria tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido” se refere a uma bactéria tendo uma capacidade para produzir e acumular um L-aminoácido objeto em um meio ou células da bactéria em um tal grau que o L-aminoácido pode ser coletado, quando a bactéria é cultivada no meio. A bactéria tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido pode ser uma bactéria que é capaz de acumular um L-aminoácido objeto em um meio em uma quantidade maior do que aquela obtenível com uma cepa não modificada. O termo “cepa não modificada” se refere a uma cepa de controle que não foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de α-KG fosse aumentada. Isto é, os exemplos da cepa não modificada incluem cepas do tipo selvagem e cepas precursoras, tais como as cepas ATCC 13869 e ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum. A bactéria tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido pode ser uma bactéria que é capaz de acumular um L-aminoácido objeto em um meio em uma quantidade de preferivelmente 0,5 g/L ou mais, mais preferivelmente 1,0 g/L ou mais.

[0016] O L-aminoácido a ser produzido na presente invenção é um L-aminoácido da família do glutamato. O termo “L-aminoácido da família do glutamato” coletivamente se refere ao ácido L-glutâmico e L-aminoácidos que são biossintetizados via ácido L-glutâmico como um intermediário. Os exemplos dos L-aminoácidos que são biossintetizados via ácido L-glutâmico como um intermediário incluem L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L- citrulina, e L-ornitina. A bactéria da presente invenção pode ter uma capacidade para produzir apenas um dos tipos de L-aminoácido, ou pode ter uma capacidade para produzir dois ou mais tipos de L-aminoácidos.

[0017] Na presente invenção, o termo “aminoácido” se refere a um L-aminoácido, a menos que de outro modo estabelecido. Na presente invenção, o termo “L-aminoácido” se refere a um L-aminoácido em uma forma livre, um sal do mesmo, ou uma mistura do mesmo, a menos que de outro modo estabelecido. Os exemplos de sal serão descritos mais tarde.

[0018] Os exemplos da bactéria corineforme incluem bactérias pertencentes ao gênero Corinebacterium, Brevibacterium, Micobacterium, ou os semelhantes.

[0019] Os exemplos específicos da bactérias corineformes incluem as seguintes espécies.

Corinebacterium acetoacidophilum Corinebacterium acetoglutamicum Corinebacterium alkanolyticum Corinebacterium callunae Corinebacterium crenatum Corinebacterium glutamicum Corinebacterium lilium Corinebacterium melassecola Corinebacterium thermoaminogenes (Corinebacterium efficiens) Corinebacterium herculis Brevibacterium divaricatum (Corinebacterium glutamicum) Brevibacterium flavum (Corinebacterium glutamicum) Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corinebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Corinebacterium ammoniagenes (Corinebacterium stationis) Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Micobacterium ammoniaphilum [0020] Os exemplos específicos das bactérias corineformes incluem as seguintes cepas.

Corinebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corinebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corinebacterium alkanolyticum ATCC 21511 Corinebacterium callunae ATCC 15991 Corinebacterium crenatum AS 1. 542 Corinebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734 Corinebacterium lilium ATCC 15990 Corinebacterium melassecola ATCC 17965 Corinebacterium efficiens (Corinebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539) Corinebacterium herculis ATCC 13868 Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020 Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Corinebacterium ammoniagenes (Corinebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872 Brevibacterium album ATCC 15111 Brevibacterium cerinum ATCC 15112 Micobacterium ammoniaphilum ATCC 15354 [0021] As bactérias Corinebacterium incluem bactérias que foram previamente classificadas dentro do gênero Brevibacterium, mas estão presentemente unidas dentro do gênero Corinebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)). Além disso, Corinebacterium stationis inclui uma bactéria tal que foi anteriormente classificada como Corinebacterium ammoniagenes, mas é presentemente reclassificada como Corinebacterium stationis com base na análise da sequência de nucleotídeo de 16S rRNA etc. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879 (2010)).

[0022] Estas cepas são disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (Endereço: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, os números de registro são designados para as respectivas cepas, e as cepas podem ser encomendadas usando-se estes números de registro (reportar-se ao http://www.atcc.org/). Os números de registro das cepas são listados no catálogo da American Type Culture Collection. Estas cepas também podem ser obtidas, por exemplo, dos depósitos nos quais as cepas foram depositadas.

[0023] A bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria inerentemente tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido, ou pode ser uma bactéria modificada de modo que a mesma tenha uma capacidade para produzir L-aminoácido. A bactéria tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido pode ser obtida comunicando-se uma capacidade para produzir L- aminoácido a uma tal bactéria como mencionado acima, ou realçando-se uma capacidade para produzir L-aminoácido de uma tal bactéria como mencionado acima.

[0024] Para comunicar ou realçar uma capacidade para produzir L-aminoácido, métodos convencionalmente utilizados na criação de cepas produtoras de aminoácido de bactérias corineformes, bactérias Escherichia, e assim por diante (ver “Amino Acid Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1a Edição, publicado 30 de maio de 1986, pp. 77-100) podem ser usadas. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, adquirir uma cepa mutante auxotrófica, adquirindo uma cepa resistente análoga ao L-aminoácido, adquirindo uma cepa mutante de regulagem metabólica, e construindo uma cepa recombinante na qual a atividade de uma enzima biossintética de L-aminoácido é realçada. Na criação de bactérias produtoras de L-aminoácido, uma das propriedades descritas acima tais como auxotrofia, resistência de análogo, e mutação de regulagem metabólica podem ser comunicadas sozinhas, ou dois ou três ou mais de tais propriedades podem ser comunicadas em combinação. A atividade de uma das enzimas biossintéticas de L-aminoácido pode ser realçada sozinha, ou as atividades de duas ou três ou mais de tais enzimas podem ser realçadas em combinação. Além disso, a(s) propriedade(s) de comunicação tal(is) como auxotrofia, resistência de análogo, e mutação de regulagem metabólica pode(m) ser combinada(s) com o realce da(s) atividade(s) de enzima(s) biossintética(s).

[0025] Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente a análogo, ou cepa mutante de regulagem metabólica tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido pode ser obtida submetendo-se uma cepa precursora ou cepa do tipo selvagem a um tratamento de mutagênese usual, e depois selecionando uma cepa que exiba auxotrofia, resistência de análogo, ou uma mutação de regulagem metabólica, e tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido a partir das cepas mutantes obtidas. Os exemplos do tratamento de mutagênese usual incluem irradiação de raio X ou ultravioleta e um tratamento com um agente de mutação tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS), e metanossulfonato de metila (MMS).

[0026] Uma capacidade para produzir L-aminoácido também pode ser comunicada ou realçada realçando-se a atividade de uma enzima envolvida na biossíntese de um L-aminoácido objeto. A atividade de uma enzima pode ser realçada, por exemplo, modificando-se uma bactéria de modo que a expressão de um gene que codifica a enzima seja realçada. Métodos para realçar a expressão de gene são descritos na WO00/18935, EP 1010755 A, e assim por diante. Os procedimentos detalhados para realçar a atividade enzimática serão descritos mais tarde.

[0027] Além disso, uma capacidade para produzir L-aminoácido também pode ser comunicada ou realçada reduzindo-se a atividade de uma enzima que catalisa uma reação ramificando-se do caminho biossintético de um L-aminoácido objeto para gerar um composto outro que não o L-aminoácido objeto. O termo “enzima que catalisa uma reação ramificando-se do caminho biossintético de um L-aminoácido objeto para gerar um composto outro que não o L-aminoácido objeto” aqui aludido também inclui enzimas envolvidas na decomposição do aminoácido objeto. O método para reduzir a atividade de uma enzima será descrito mais tarde.

[0028] A seguir, bactérias produtoras de L-aminoácido e métodos para comunicar ou realçar uma capacidade para produzir L-aminoácido serão especificamente exemplificados. Todas as propriedades das bactérias produtoras de L-aminoácido e modificações para comunicar ou realçar uma capacidade para produzir L-aminoácido podem ser usadas independentemente ou em qualquer combinação apropriada. <bactérias produtoras de ácido L-glutâmico>

[0029] Os exemplos de métodos para comunicar ou realçar a capacidade produtora de ácido L-glutâmico incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionados de enzimas da biossíntese do ácido L-glutâmico. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitadas a, glutamato desidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintase (gltBD), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), metilcitrato sintase (prpC), piruvato carboxilase (pyc), piruvato desidrogenase (aceEF, IpdA), piruvato cinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgml), fosfoglicerato cinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bisfosfato aldolase (fbp), glicose fosfato isomerase (pgi), 6-fosfogliconato desidratase (edd), 2-ceto-3-desóxi-6- fosfogliconato aldolase (eda), e transidrogenase. Mostrados nos parênteses depois dos nomes das enzimas estão os exemplos dos nomes dos genes que codificam as enzimas (o mesmo deve se aplicar às mesmas ocasiões a seguir). / É preferível realçar a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionados de, por exemplo, glutamato desidrogenase, citrato sintase, fosfoenol piruvato carboxilase, e metilcitrato sintase, entre estas enzimas.

[0030] Os exemplos de bactérias corineformes modificadas de modo que a expressão do gene da glutamato sintetase (gltBD) fosse aumentada incluem aqueles divulgados na WO99/07853.

[0031] Os exemplos de métodos para comunicar ou realçar a capacidade produtora de ácido L-glutâmico também incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de modo que a bactéria tem uma atividade ou atividades reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionados das enzimas que catalisam uma reação de ramificação fora do caminho da biossíntese de L-glutamina para gerar um composto outro que não o ácido L-glutâmico. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, isocitrato liase (aceA), α-cetoglutarato desidrogenase (sucA, odhA), acetolactato sintase (ilvI), formiato acetiltransferase (pfl), lactato desidrogenase (Idh), álcool desidrogenase (adh), / glutamato descarboxilase (gadAB), e succinato desidrogenase (sdhABCD). E preferível reduzir ou deletar, por exemplo, a atividade da α-cetoglutarato desidrogenase, entre estas enzimas.

[0032] As bactérias corineformes em que a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase é reduzida ou eliminada, e métodos para a obtenção destas são divulgados na WO2008/075483. Os exemplos específicos de bactérias corineformes em que a atividade da α-cetoglutarato desidrogenase é reduzida ou eliminada incluem, por exemplo, as seguintes cepas.

[0033] A cepa L30-2 de Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2006-340603) [0034] A cepa Δ8 de Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) (WO95/34672) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12821 (FERM BP-4172, Patente Francesa No. 9401748) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12822 (FERM BP-4173, Patente Francesa No. 9401748) Corinebacterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174, Patente Francesa No. 9401748) Corinebacterium glutamicum L30-2 cepa (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2006-340603) [0035] Os exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e cepas precursoras para derivá-las também incluem cepas em que tanto a atividade da α-cetoglutarato desidrogenase (sucA) quanto a atividade da succinato desidrogenase (sdh) são reduzidas ou eliminadas (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2010-041920). Os exemplos específicos de tais cepas incluem, por exemplo, Corinebacterium glutamicum cepa 8Ε3ΘΔ8ΌΗ, que é a cepa deficiente dupla odhAsdhA de Corinebacterium glutamicum ATCC 14067 (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2010-041920).

[0036] Os exemplos de métodos para comunicar ou realçar a capacidade produtora de L-glutamina também incluem, por exemplo, um método de realçar a expressão do gene yhfK (WO2005/085419) ou gene ybjL (WO2008/133161), que é um gene de secreção do ácido L-glutâmico.

[0037] Além disso, os exemplos de métodos para comunicar ou realçar a capacidade produtora de ácido L-glutâmico às ou nas bactérias corineformes também incluem métodos de comunicar resistência a um análogo do ácido orgânico, inibidor respiratório, ou os semelhantes, e métodos de comunicar sensibilidade a um inibidor da síntese da parede celular. Os exemplos específicos de tais métodos incluem, por exemplo, o método de comunicar resistência ao ácido monofluoroacético (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 50-113209), o método de comunicar resistência à adenina ou resistência à timina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-065198), o método de atenuar a urease (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 52-038088), o método de comunicar resistência ao ácido malônico (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 52-038088), o método de comunicar resistência às benzopironas ou naftoquinonas (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-1889), o método de comunicar resistência a HOQNO (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-140895), o método de comunicar resistência ao ácido α-cetomalônico (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-2689), o método de comunicar resistência à guanidina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-35981), o método de comunicar sensibilidade à penicilina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 4-88994), e assim por diante.

[0038] Os exemplos específicos de tais bactérias resistentes ou sensíveis incluem as seguintes cepas.

Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ3949 (FERM BP-2632, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 50-113209) Corinebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-065198) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11355 (FERM P-5007, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-1889) Corinebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-1889) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11217 (FERM P-4318, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-2869) Corinebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-2869) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11564 (FERM BP-5472, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-140895) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11439 (FERM BP-5136, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-35981) Corinebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 04-88994) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11426 (FERM P-5123, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-048890) Corinebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P-5137, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-048890) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11796 (FERM P-6402, reportar-se à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 58-158192) [0039] Além disso, os exemplos de métodos para comunicar ou realçar a capacidade produtora de ácido L-glutâmico às ou nas bactérias corineformes também incluem um método de realçar a expressão de gene YggB e um método de introduzir um gene YggB mutante tendo uma mutação na região codificadora (WO2006/070944). Isto é, a bactéria da presente invenção pode ter sido modificada de modo que a expressão de gene YggB seja aumentada, ou pode ter sido modificada de modo a abrigar (ter) um gene YggB mutante.

[0040] O gene YggB é um gene que codifica um canal mecanossensível. Os exemplos do gene YggB incluem genes YggB de bactérias corineformes. Os exemplos específicos dos genes YggB de bactérias corineformes incluem, por exemplo, os genes YggB de Corinebacterium glutamicum ATCC13869, Corinebacterium glutamicum ATCC13032, Corinebacterium glutamicum ATCC14967, e Corinebacterium melassecola ATCC17965 (WO2006/070944). O gene YggB de Corinebacterium glutamicum ATCC 13032 corresponde à sequência complementar à sequência de nucleotídeo números 1.336.091 a 1.337.692 na sequência genômica registrada como Acesso no Genbank No. NC_003450 na base de dados NCBI, e também é chamada NCgl1221. A proteína YggB codificada pelo gene YggB de Corinebacterium glutamicum ATCC 13032 é registrada como acesso no GenBank No. NP_600492. Além disso, a sequência de nucleotídeo do gene YggB de Corinebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) e a sequência de aminoácido da proteína YggB codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 11 e 12, respectivamente.

[0041] Na presente invenção, um gene YggB tendo a “mutação específica” descrita mais tarde também é aludida como “gene YggB mutante”, e uma proteína codificada deste modo também é aludida como “proteína YggB mutante”. Além disso, na presente invenção, um gene YggB não tendo a “mutação específica” descrito mais tarde também é aludido como “gene YggB do tipo selvagem”, e uma proteína codificada deste modo também é aludida como “proteína YggB do tipo selvagem”. Além disso, como para a proteína YggB, a mudança da sequência de aminoácido causada pela “mutação específica” no gene YggB também é aludida como “mutação específica”. O termo “tipo selvagem” aqui aludido é usada por conveniência para distinguir o gene YggB ou a proteína YggB do “tipo selvagem” do gene YggB ou proteína YggB “mutante”, e o gene YggB ou a proteína YggB do “tipo selvagem” não são limitados a aqueles obtidos como substância natural, contanto que não tenham a “mutação específica”. Os exemplos da proteína YggB do tipo selvagem incluem as proteínas YggB exemplificadas acima, tais como a proteína YggB tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12. Os exemplos da proteína YggB do tipo selvagem também incluem variantes conservativas (variantes nas quais a função original das mesmas é mantida) das proteínas YggB exemplificadas acima, contanto que as variantes conservativas não tenham a “mutação específica”. A “função original” com respeito à proteína YggB pode ser, por exemplo, uma função como um canal mecanossensível ou uma propriedade que uma expressão aumentada da mesma em uma bactéria corineforme fornece uma capacidade produtora de ácido L-glutâmico melhorada da bactéria corineforme.

[0042] A “mutação específica” não é particularmente limitada, contanto que a mesma mude a sequência de aminoácido da proteína YggB tal como aquelas descritas acima para melhorar deste modo uma capacidade produtora de ácido L-glutâmico de uma bactéria corineforme. Os exemplos da “mutação específica” incluem mutação no lado do terminal C e mutação em uma região de transmembrana. A “mutação específica” também podem ser uma combinação destas.

(1) Mutação no lado do terminal C

[0043] A mutação no lado do terminal C é um mutação introduzida na região do gene YggB do tipo selvagem que codifica os resíduos de aminoácido das posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem. A mutação no lado do terminal C pode ser introduzida em um ou mais sítios na região. O tipo de mudança da sequência de aminoácido induzida pela mutação no lado do terminal C não é particularmente limitado. A mutação no lado do terminal C pode ser uma mutação causando substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), inserção de resíduo de aminoácido, deleção de resíduo de aminoácido, introdução de códon de parada (mutação sem sentido), mutação de deslocamento do quadro de leitura, ou uma combinação destas. A mutação no lado do terminal C é preferivelmente, por exemplo, uma mutação para inserir uma sequência de nucleotídeo tal como uma sequência de inserção (daqui em diante também aludida como “IS”) ou transposon. (1-1) Inserção de sequência de nucleotídeo [0044] Exemplos da mutação no lado do terminal C incluem, por exemplo, uma mutação que insere uma sequência de nucleotídeo no sítio que codifica o resíduo de valina na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem (mutação tipo 2A-1). A mutação tipo 2A-1 pode ser, por exemplo, uma mutação que causa deleção ou substituição para uma parte ou todo dos resíduos de aminoácido das posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem. Os exemplos específicos do gene YggB mutante tendo a mutação tipo 2A-1 incluem, por exemplo, o gene YggB incluindo IS inserido dentro do próximo “G” na posição 1255 na SEQ ID NO: 11, e codificando deste modo uma proteína YggB mutante tendo um tamanho natural de 423 resíduos de amino, que é mais curta do que aquele da proteína YggB do tipo selvagem original (SEQ ID NO: 12). A sequência de nucleotídeo deste gene YggB mutante (V419::IS) e a sequência de aminoácido da proteína YggB mutante codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 13 e 14, respectivamente. Na SEQ ID NO: 13, as posições 1 a 1269 correspondem à CDS para esta proteína YggB mutante (V419::IS). (1-2) Substituição para resíduos de prolina [0045] Os exemplos da mutação no lado do terminal C também incluem, por exemplo, uma mutação que substitui um resíduo de prolina presente nas posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem com um outro resíduo de aminoácido. Os exemplos de um tal resíduo de prolina incluem os resíduos de prolina nas posições 424, 437, 453, 457, 462, 469, 484, 489, 497, 515, 529, e 533 da proteína YggB do tipo selvagem. É especialmente preferível substituir os resíduos de prolina das posições 424 e/ou 437 com outros resíduos de aminoácido. O “outro aminoácido” não é particularmente limitado contanto que o mesmo seja um aminoácido de ocorrência natural outro que não prolina. Os exemplos do “outro aminoácido” incluem Lys, Glu, Thr, Val, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys, Met, Phe, Trp, Tyr, Gly, Ala, e His. Por exemplo, o resíduo de prolina na posição 424 pode ser substituído preferivelmente com um resíduo de aminoácido hidrofóbico (Ala, Gly, Val, Leu, ou Ile), mais preferivelmente um resíduo de aminoácido de cadeia ramificada (Leu, Val, ou Ile). Além disso, por exemplo, o resíduo de prolina na posição 437 pode ser substituído preferivelmente com um resíduo de um aminoácido tendo grupo hidroxila na cadeia lateral (Thr, Ser, ou Tyr), mais preferivelmente com um resíduo Ser. (2) Mutação na região de transmembrana [0046] A proteína YggB é estimada ter cinco regiões de transmembrana. As regiões de transmembrana correspondem aos resíduos de aminoácido das posições 1 a 23 (primeira região de transmembrana), as posições 25 a 47 (segunda região de transmembrana), as posições 62 a 84 (terceira região de transmembrana), as posições 86 a 108 (quarta região de transmembrana), e as posições 110 a 132 (quinta região de transmembrana) da proteína YggB do tipo selvagem. A mutação em uma região de transmembrana é uma mutação nas regiões que codificam estas regiões de transmembrana do gene YggB do tipo selvagem. A mutação na região de transmembrana pode ser introduzida em um ou mais sítios na região. A mutação na região de transmembrana é preferivelmente uma mutação que induz a substituição, deleção, adição, inserção, ou inversão de um ou vários resíduos de aminoácido, mas não incluem nenhuma mutação de deslocamento do quadro de leitura ou mutação sem sentido. O número pretendido pelo termo “um ou vários” é preferivelmente de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10, ainda mais preferivelmente de 1 a 5, de modo particularmente preferível de 1 a 3. Os exemplos da mutação em uma região de transmembrana incluem uma mutação que insere um ou vários resíduos de aminoácido, tais como Cys-Ser-Leu, entre o resíduo de leucina na posição 14 e o resíduo de triptofano na posição 15; uma mutação que substitui o resíduo de alanina na posição 100 com um outro resíduo de aminoácido, tal como um resíduo de um aminoácido tendo grupo hidroxila na cadeia lateral (isto é, Thr, Ser, ou Tyr), preferivelmente o resíduo Thr; uma mutação que substitui o resíduo de alanina na posição 111 com um outro resíduo de aminoácido tal como um resíduo de um aminoácido tendo grupo hidroxila na cadeia lateral (isto é, Thr, Ser, ou Tyr), preferivelmente o resíduo Thr; na proteína YggB do tipo selvagem.

[0047] Na presente invenção, um “resíduo de aminoácido na posição X da proteína YggB do tipo selvagem” significa o resíduo de aminoácido correspondendo a aquele da posição X na SEQ ID NO: 12, a menos que de outro modo estabelecido. A “posição X” em uma sequência de aminoácido é a Xa posição contada a partir do terminal N da sequência de aminoácido, e o resíduo de aminoácido do terminal N é o resíduo de aminoácido da posição 1. Isto é, as posições anteriormente mencionadas de resíduos de aminoácido indicam as posições relativas, e as posições absolutas do mesmo podem mudar devido à deleção, inserção, adição, ou os semelhantes de um resíduo ou resíduos de aminoácido. Por exemplo, o “resíduo de aminoácido na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem” significa o resíduo de aminoácido correspondendo a aquele da posição 419 na SEQ ID NO: 12, e quando um resíduo de aminoácido é deletado em uma posição no lado do terminal N da posição 419, o 418o resíduo de aminoácido a partir do terminal N é “o resíduo de aminoácido na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem”. Além disso, quando um resíduo de aminoácido é inserido em uma posição no lado do terminal N da posição 419, o 420o resíduo de aminoácido a partir do terminal N é “o resíduo de aminoácido na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem”. Especificamente, por exemplo, os resíduos de aminoácido das posições 419 a 529 da proteína YggB de Corinebacterium glutamicum ATCC14967 correspondem aos resíduos de aminoácido das posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem.

[0048] Qual o resíduo de aminoácido é “o resíduo de aminoácido correspondente a aquele da posição X na SEQ ID NO: 12” na sequência de aminoácido de uma proteína YggB arbitrária pode ser determinado pelo alinhamento entre a sequência de aminoácido da proteína YggB arbitrária e a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12. O alinhamento pode ser realizado, por exemplo, usando-se software de análise de gene conhecido. Os exemplos específicos de tal software incluem DNASIS produzido pela Hitachi Solutions, GENETYX produzido pela Genetyx, e assim por diante (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1) 72-96, 1991; Barton GJ et al., Journal of Molecular Biology, 198 (2), 327-37, 1987).

[0049] Um gene YggB mutante pode ser obtido modificando-se um gene YggB do tipo selvagem de modo a ter a “mutação específica” anteriormente mencionada. A modificação de DNA pode ser realizada por um método conhecido. Por exemplo, uma mutação objeto pode ser introduzida em um sítio objeto de DNA pelo método de mutação específica de sítio. Os exemplos específicos do método de mutação específica de sítio incluem, por exemplo, um método de usar PCR (Higuchi, R., 61, em PCR Technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton Press, 1989; Carter P., Met. In Enzymol., 154, 382, 1987), e um método de usar um fago (Kramer, W. e Frits, H.J., Met. in Enzymol., 154, 350, 1987; Kunkel, T.A. et al., Met. in Enzymol., 154, 367, 1987). Além disso, um gene YggB mutante também pode ser obtido pela síntese química.

[0050] Tal modificação de uma bactéria que a bactéria tem um gene YggB mutante pode ser atingido pela introdução do gene YggB mutante na bactéria. Tal modificação de uma bactéria que a bactéria tem um gene YggB mutante também pode ser atingida pela introdução de uma mutação no gene YggB da bactéria através da mutação natural ou um tratamento com um mutágeno. <Bactérias que Produzem L-Glutamina >

[0051] Os exemplos do método para comunicar ou realçar a capacidade produtora de L-glutamina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de modo que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas da biossíntese de L-glutamina são realçadas. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, glutamato desidrogenase (gdhA) e glutamina sintetase (glnA). A atividade da glutamina sintetase também pode ser realçada pelo rompimento do gene da glutamina adenililtransferase (glnE) ou rompimento do gene da proteína de controle PII (glnB) (EP 1229121).

[0052] Os exemplos do método para comunicar ou realçar a capacidade produtora de L-glutamina também incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de modo que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas que catalisam uma reação ramificando-se do caminho da biossíntese de L-glutamina para gerar um composto outro que não L-glutamina sejam reduzidas. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, glutaminase.

[0053] Os exemplos específicos de bactérias produtora de L- glutamina e cepas precursoras para derivá-las incluem, por exemplo, bactérias corineformes em que a atividade ou atividades de glutamato desidrogenase (gdhA) e/ou glutamina sintetase (glnA) (EP 1229121, EP 1424398) são realçadas, e as bactérias corineformes nas quais a atividade de glutaminase (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2004-187684) é reduzida.

[0054] Os exemplos dos métodos para comunicar ou realçar a capacidade produtora de L-glutamina às ou nas bactérias corineformes também incluem o método de comunicar resistência à 6-diazo-5-oxo- norleucina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 3-232497), o método de comunicar resistência de análogo de purina e resistência ao sulfóxido de metionina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 61202694), e o método de comunicar resistência ao ácido α-cetomalônico (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-151495). Os exemplos específicos de bactérias corineformes tendo capacidade produtora de L-glutamina incluem, por exemplo, as seguintes cepas.

Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11573 (FERM P-5492, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-151495) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11576 (FERM BP-10381, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-151495) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12212 (FERM P-8123, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 61-202694) <Bactérias Produtoras de L-Prolina>

[0055] Os exemplos de métodos para comunicar ou realçar a capacidade produtora de L-Prolina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionados de enzimas da biossíntese de L-prolina. Os exemplos de tais enzimas incluem glutamato-5-cinase (proB), γ-glutamilfosfato redutase, e prolina-5-carboxilato redutase (putA). Para realçar a atividade de uma tal enzima, por exemplo, o gene de proB que codifica uma glutamato cinase desensibilizada para a inibição da retroalimentação pela L-prolina (Patente alemã No. 3127361) pode ser preferivelmente usada.

[0056] Os exemplos de métodos para comunicar ou realçar a capacidade produtora de L-glutamina também incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade reduzida de uma enzima envolvida na decomposição de L-prolina. Os exemplos de uma tal enzima incluem prolina desidrogenase e ornitina aminotransferase. <Bactérias produtoras de L-Arginina>

[0057] Os exemplos de métodos para comunicar ou realçar a capacidade produtora de L-arginina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionados de enzimas da biossíntese de L-arginina. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitadas a, N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetil transferase (argJ), N-acetilglutamato cinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), acetilornitina desacetilase (argE), ornitina carbamoil transferase (argF), argininossuccinato sintetase (argG), argininossuccinato liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase (carAB). Como O gene da N-acetilglutamato sintase (argA), por exemplo, um gene que codifica uma N-acetilglutamato sintase mutante dessensibilizada para a inibição da retroalimentação pela L-arginina pela substituição no lugar dos resíduos de aminoácido correspondentes às posições 15 a 19 da enzima tipo selvagem (Patente Européia Aberta ao Público No. 1170361) pode ser preferivelmente usado.

[0058] Os exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e cepas precursoras para derivá-las também incluem tais bactérias corineformes como uma cepa deficiente em ArgR, que é um repressor de arginina (Pedido de Patente Publicado U.S. No. 20020045223), e uma cepa na qual a atividade da glutamina sintetase é aumentada (Pedido de Patente Publicado U.S. No. 20050014236).

[0059] Os exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e cepas precursoras para derivá-las também incluem cepas mutantes de bactérias corineformes, as cepas mutantes tendo resistência a um análogo de aminoácido ou os semelhantes. Os exemplos de tais cepas incluem, por exemplo, cepas tendo resistência à 2-tiazolalanina e exibindo ainda auxotrofia para L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina, ou L-triptofano (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 54-44096); cepas resistentes ao ácido cetomalônico, ácido fluoromalônico, ou ácido monofluoroacético (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 5718989); cepas resistentes ao argininol (Patente Japonesa Publicação No. 6224075); cepas resistentes à X-guanidina (X representa uma cadeia alifática ou um derivado do mesmo, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2186995); e cepas resistentes ao hidroxamato de arginina e 6-azauracila (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-150381). Os exemplos específicos de bactérias corineformes tendo capacidade produtora de L-arginina incluem as seguintes cepas.

Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11169 (FERM BP-6892) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12092 (FERM BP-6906) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11336 (FERM BP-6893) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11345 (FERM BP-6894) Corinebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12430 (FERM BP-2228) <Bactérias Produtoras de L-Citrulina e Bactérias Produtoras de L-Ornitina>

[0060] Os caminhos biossintéticos de L-citrulina e L-ornitina são comuns a aquele da L-arginina. Portanto, uma capacidade para produzir L-citrulina e/ou L-ornitina pode ser comunicada ou realçada aumentando-se a atividade ou atividades da N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetiltransferase (argJ), N-acetilglutamato cinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), e/ou acetilornitina desacetilase (argE) (WO2006/35831).

[0061] Os métodos para comunicar ou realçar a capacidade produtora de ácido L-glutâmico também pode ser eficaz para comunicar ou realçar uma capacidade para produzir estes L-aminoácidos que são biossintetizados via ácido L-glutâmico como um intermediário, tal como L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-citrulina, e L-ornitina. Consequentemente, uma bactéria tendo uma capacidade para produzir qualquer um destes L-aminoácidos que são biossintetizados via ácido L-glutâmico como um intermediário pode ter uma tal propriedade possuída por uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico como descrita acima, como requerido. Por exemplo, uma bactéria tendo uma capacidade para produzir qualquer um destes L-aminoácidos que são biossintetizados via ácido L-glutâmico como um intermediário pode ter sido modificada de modo que a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e/ou succinato desidrogenase seja reduzida.

[0062] Os exemplos de métodos para comunicar ou realçar a capacidade para produzir L-aminoácido tal como a capacidade de produzir ácido L-glutâmico também incluem um método de modificar uma bactéria de modo que a atividade de fosfocetolase seja aumentada (WO2006/016705). Consequentemente, a bactéria da presente invenção pode ter sido modificada de modo que a atividade de fosfocetolase seja aumentada. Os exemplos de fosfocetolase incluem D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e frutose-6-fosfato fosfocetolase. Cada uma da atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e da atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase pode ser realçada, ou ambas podem ser realçadas.

[0063] O termo “atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase” se refere a uma atividade para converter xilulose-5-fosfato em glicelaldeído-3-fosfato e fosfato de acetila com consumo de ácido fosfórico para liberar uma molécula de H2O. Esta atividade pode ser medida pelo método descrito por Goldberg, M. et al. (Methods Enzymol., 9, 515-520, 1996) ou o método descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183: 2929-2936, 2001). Os exemplos de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase incluem aqueles de bactérias pertencentes aos gêneros Acetobacter, Bifidobacterium, Lactobacillus, Thiobacillus, Streptococcus, Metilococcus, Butyrivibrio, e Fibrobacter, e levedura pertencente aos gêneros Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Pichia, Yarrowia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Trichosporon, e Wingea. Os exemplos específicos de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e genes que os codificam são divulgados na WO2006/016705.

[0064] O termo “atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase” se refere a uma atividade para converter frutose-6-fosfato em eritrose-4-fosfato e fosfato de acetila com consumo de ácido fosfórico para liberar uma molécula de H2O. Esta atividade pode ser medida pelo método descrito por Racker, E. (Methods Enzymol., 5, 276-280, 1962) ou o método descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183: 2929-2936, 2001). Os exemplos de frutose-6-fosfato fosfocetolase incluem aqueles de bactérias pertencentes aos gêneros Acetobacter, Bifidobacterium, Chlorobium, Brucella, Metilococcus, e Gardnerella, e levedura pertencente aos gêneros Rhodotorula, Candida, e Saccharomyces. Os exemplos específicos de frutose-6-fosfato fosfocetolase e genes que os codificam são divulgados na WO2006/016705.

[0065] Tanto a atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase quanto a atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase também podem ser retidas por uma única enzima (isto é, D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase/frutose-6-fosfato fosfocetolase).

[0066] A sequência de nucleotídeo do gene da fosfocetolase (gene xfp) de Bifidobacterium longum JCM1217 e a sequência de aminoácido da fosfocetolase (proteína Xfp) codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 9 e 10, respectivamente.

[0067] Além disso, os exemplos de métodos para comunicar ou realçar uma capacidade para produzir L-aminoácido também incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de modo que a atividade ou atividades de uma ou mais das proteínas envolvidas no glicometabolismo e proteínas envolvidas no metabolismo de energia sejam aumentadas.

[0068] Os exemplos das proteínas envolvidas no glicometabolismo incluem proteínas envolvidas na absorção de sacarídeos e as enzimas do sistema de glicólise. Os exemplos de genes que codificam as proteínas envolvidas no glicometabolismo incluem o gene da glicose-6-fosfato isomerase (pgi, WO01/02542), o gene da piruvato carboxilase (pyc, WO99/18228, EP 1092776 A), gene da fosfoglicomutase (pgm, WO03/04598), gene da frutose bisfosfato aldolase (pfkB, fbp, WO03/04664), gene da transaldolase (talB, WO03/008611), gene da fumarase (fum, WO01/02545), gene da captação de sacarose não PTS (csc, EP 1149911 A), e gene da utilização da sacarose (operon scrAB, Patente U.S. No. 7.179.623).

[0069] Os exemplos de genes que codificam as proteínas envolvidas no metabolismo de energia incluem o gene da transidrogenase (pntAB, Patente U.S. No. 5.830.716) e gene da oxidase do tipo citocromo bo (cyoB, EP 1070376 A).

[0070] Os genes e proteínas usadas para criar bactérias produtoras de L-aminoácido podem ter, por exemplo, as sequências de nucleotídeo e sequências de aminoácido de genes e proteínas conhecidos, tais como aqueles exemplificados acima, respectivamente. Também, os genes e proteínas usados para criar bactérias produtoras de L-aminoácido podem ser variantes conservativas de genes e proteínas conhecidos, tais como aqueles exemplificados acima, respectivamente. Especificamente, por exemplo, os genes usados para criar bactérias produtoras de L-aminoácido podem cada um ser um gene que codifica uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de uma proteína conhecida, mas incluindo substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições, contanto que a função original da mesma seja mantida. Para as variantes conservativas de genes e proteínas, as descrições para variantes conservativas do gene carreador de absorção de α-KG e carreador de absorção de α-KG mencionados mais tarde podem ser aplicadas, mutatis mutandis.

<1-2> Realce de carreador de absorção de atividade α-KG

[0071] A bactéria da presente invenção foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de α-KG (carreador de absorção da atividade de α-KG) seja aumentada. Especificamente, a bactéria da presente invenção foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de α-KG (carreador de absorção da atividade de α-KG) é aumentada quando comparada com uma cepa não modificada. A bactéria da presente invenção pode ser obtida modificando-se uma bactéria corineforme tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido de modo que a atividade de um carreador de absorção de α-KG seja aumentada. A bactéria da presente invenção também pode ser obtida modificando-se uma bactéria corineforme de modo que a atividade de um carreador de absorção de α-KG seja aumentada, e depois comunicar ou realçar uma capacidade para produzir L- aminoácido. A bactéria da presente invenção também pode ser uma bactéria que tenha adquirido uma capacidade para produzir L-aminoácido por ser modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de α-KG seja aumentada. A bactéria da presente invenção pode ter uma tal propriedade possuída por uma bactéria produtora de L-aminoácido como descrita acima, como requerido. Por exemplo, a bactéria da presente invenção pode ter sido modificada de modo que a atividade de fosfocetolase seja aumentada. As modificações para construir a bactéria da presente invenção podem ser realizadas em uma ordem arbitrária.

[0072] Modificando-se uma bactéria corineforme de modo que a atividade de um carreador de absorção de α-KG seja aumentada, uma capacidade para produzir L-aminoácido da bactéria corineforme pode ser melhorada, e isto é, a produção de um L-aminoácido usando-se a bactéria corineforme pode ser aumentada. Em particular, modificando-se uma bactéria corineforme de modo que a atividade de um carreador de absorção de α-KG seja aumentada, uma capacidade para produzir L-aminoácido da bactéria corineforme sob condições onde α-KG é produzido como um subproduto pode ser melhorada.

[0073] A seguir, os carreadores de absorção de α-KG e os genes que os codificam serão explicados.

[0074] Na presente invenção, o termo “carreador de absorção de α-KG” se refere a uma proteína tendo atividade de absorção de α-KG. Na presente invenção, o termo “atividade de absorção de α-KG” se refere a uma atividade para capturar α-KG no lado de dentro de uma célula a partir do lado de fora da célula. Um gene que codifica um carreador de absorção de α-KG também é aludido como “gene carreador de absorção de α-KG”.

[0075] Os exemplos do carreador de absorção de α-KG incluem proteína KgtP, que é codificada pelo gene kgtP. Os exemplos de gene kgtP incluem aqueles de Escherichia coli, Pantoea ananatis, Salmonella enterica, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Burkholderia pseudomallei, Bradyrhizobium diazoefficiens, Campilobacter jejuni, e Ralstonia solanacearum. As sequências de nucleotídeo dos genes kgtP derivados destes vários organismos e as sequências de aminoácido das proteínas KgtP codificadas por estes genes podem ser facilmente obtidas das bases de dados públicas tais como NCBI. O gene kgtP de Escherichia coli K-12 MG1655 corresponde à sequência complementar à sequência nas posições 2724448 a 2725746 na sequência genômica registrada na base de dados NCBI como Acesso do GenBank NC_000913 (VERSÃO NC_000913,3 GI:556503834). Além disso, a proteína KgtP de Escherichia coli K-12 MG1655 é registrada como Acesso do GenBank NP_417082 (versão NP_417082,1 GI:16130512). A sequência de nucleotídeo do gene kgtP da cepa MG1655 e a sequência de aminoácido da proteína KgtP codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 7 e 8, respectivamente. Isto é, o gene carreador de absorção de α-KG pode ser, por exemplo, um gene tendo a sequência de nucleotídeo de qualquer um dos genes kgtP exemplificadas acima, tal como a sequência de nucleotídeo mostrada como a SEQ ID NO: 7. Também, o carreador de absorção de α-KG pode ser, por exemplo, uma proteína tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das proteínas KgtP exemplificadas acima, tais como a sequência de aminoácido mostrada como a SEQ ID NO: 8. A expressão “um gene ou proteína tem um nucleotídeo ou sequência de aminoácido” abrange casos onde um gene ou proteína compreende a sequência de nucleotídeo ou aminoácido, e casos onde um gene ou proteína consistem da sequência de nucleotídeo ou aminoácido.

[0076] O gene carreador de absorção de α-KG pode ser uma variante de qualquer um dos genes carreadores de absorção de α-KG exemplificados acima (por exemplo genes kgtP exemplificados acima), contanto que a função original do mesmo seja mantida. Similarmente, o carreador de absorção de α-KG pode ser uma variante de qualquer um dos carreadores de absorção de α- KG exemplificados acima (por exemplo proteínas KgtP exemplificadas acima), contanto que a função original do mesmo seja mantida. Uma tal variante que mantém a função original da mesma também é aludida como “variante conservativa”. O termo “gene kgtP” inclui não apenas os genes kgtP exemplificados acima, mas também inclui variantes conservativas do mesmo. Similarmente, o termo “proteína KgtP” inclui não apenas as proteínas KgtP exemplificadas acima, mas também inclui variantes conservativas das mesmas. Os exemplos das variantes conservativas incluem, por exemplo, homólogos e versões artificialmente modificadas do carreador de absorção de genes α-KG e carreadores de absorção de α-KG exemplificados acima.

[0077] A expressão “a função original é mantida” significa que uma variante de gene ou proteína tem uma função (tal como atividade ou propriedade) correspondente à função (tal como atividade ou propriedade) do gene ou proteína originais. A expressão “a função original é mantida” usada para um gene significa que uma variante do gene codifica uma proteína que mantém a função original. Isto é, a expressão “a função original é mantida” usada para o gene carreador de absorção de α-KG significa que uma variante do gene codifica uma proteína tendo atividade de absorção de α-KG. A expressão “a função original é mantida” usada para o carreador de absorção de α-KG significa que uma variante da proteína tem atividade de absorção de α-KG.

[0078] A atividade de absorção de α-KG de uma proteína pode ser medida, por exemplo, incubando-se as células que expressam a proteína com α-KG, e medindo a absorção de α-KG dentro das células dependentes da proteína (Seol W, Shatkin AJ. Escherichia coli kgtP encodes an alpha-ketoglutarate transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 1 de maio de 1991; 88(9): 3802-6).

[0079] A seguir, exemplos das variantes conservativas serão explicadas.

[0080] Homólogos dos genes carreadores de absorção de α-KG ou homólogos dos carreadores de absorção de α-KG podem ser facilmente obtidos das bases de dados públicas, por exemplo, pela pesquisa BLAST ou pesquisa FASTA usando qualquer uma das sequências de nucleotídeo dos genes carreadores de absorção de α-KG exemplificadas acima ou qualquer uma das sequências de aminoácido dos carreadores de absorção de α-KG exemplificadas acima como uma sequência. Além disso, homólogos dos genes carreadores de absorção de α-KG podem ser obtidos, por exemplo, pela PCR usando um cromossoma de vários organismos tais como bactérias corineformes como o padrão, e oligonucleotídeos preparados com base em qualquer uma das sequências de nucleotídeo destes genes carreadores de absorção de α-KG conhecidos como iniciadores.

[0081] O gene carreador de absorção de α-KG pode ser um gene que codifica uma proteína tendo qualquer uma das sequências de aminoácido anteriormente mencionadas (por exemplo a sequência de aminoácido mostrada como SEQ ID NO: 8), mas que inclui substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições, contanto que a função original seja mantida. Por exemplo, o terminal N e/ou o terminal C da proteína codificada podem ser alongados ou encurtados. Embora o número pretendido pelo termo “um ou vários” mencionado acima possa diferir dependendo das posições dos resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína ou dos tipos de resíduos de aminoácido, especificamente, o mesmo é, por exemplo, de 1 a 50, de 1 a 40, ou de 1 a 30, preferivelmente de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10, ainda mais preferivelmente de 1 a 5, de modo particularmente preferível de 1 a 3.

[0082] A substituição, deleção, inserção, e/ou adição anteriormente mencionada de um ou vários resíduos de aminoácido são cada uma mutação conservativa que mantém a função normal da proteína. Os exemplos típicos da mutação conservativa são substituições conservativas. A substituição conservativa é uma mutação em que a substituição ocorre mutuamente entre Phe, Trp, e Tyr, se o sítio de substituição é um aminoácido aromático; entre Leu, Ile, e Val, se o mesmo é um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se o mesmo é um aminoácido polar; entre Lys, Arg, e His, se o mesmo é um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se o mesmo é um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se o mesmo é um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Os exemplos de substituições considerados como substituições conservativas incluem, especificamente, substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His, ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His, ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu, ou Gln por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp, ou Arg por Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys, ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg, ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Val, ou Phe por Ile, substituição de Ile, Met, Val, ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His, ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Val, ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile, ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe, ou Trp por Tyr, e substituição de Met, Ile, ou Leu por Val. Além disso, tal substituição, deleção, inserção, adição, inversão, ou os semelhantes de resíduos de aminoácido como mencionados acima incluem uma mutação de ocorrência natural devido a uma diferença individual, ou uma diferença de espécie do organismo a partir do qual o gene é derivado (mutante ou variante).

[0083] O gene carreador de absorção de α-KG pode ser um gene que codifica uma proteína tendo uma sequência de aminoácido mostrando uma homologia, por exemplo, de 50% ou mais, 65% ou mais, ou 80% ou mais, preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, ainda mais preferivelmente 97% ou mais, de modo particularmente preferível 99% ou mais, para a sequência de aminoácido total de qualquer uma das sequências de aminoácido anteriormente mencionadas, contanto que a função original seja mantida. Nesta descrição, “homologia” significa “identidade”.

[0084] O gene carreador de absorção de α-KG também pode ser um gene, tal como um DNA, que é capaz de hibridizar sob condições severas com uma sonda que pode ser preparada a partir de qualquer uma das sequências de nucleotídeo anteriormente mencionadas (por exemplo a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID NO: 7), tal como uma sequência complementar a uma sequência parcial ou inteira de qualquer uma das sequências de nucleotídeo anteriormente mencionadas, contanto que a função original seja mantida. As “condições severas” se referem às condições sob as quais um chamado híbrido específico é formado, e um híbrido não específico não é formado. Os exemplos das condições severas incluem aquelas sob as quais DNAs altamente homólogos hibridizam entre si, por exemplo, DNAs não menores do que 50%, 65%, ou 80% homólogos, preferivelmente não menores do que 90% homólogos, mais preferivelmente não menos do que 95% homólogos, ainda mais preferivelmente não menores do que 97% homólogos, de modo particularmente preferível não menores do que 99% homólogos, hibridizam entre si, e DNAs menos homólogos do que o acima não hibridizam entre si, ou condições de lavagem de hibridização de Southern típicas, isto é, condições de lavagem uma vez, preferivelmente 2 ou 3 vezes, em uma concentração salina e temperatura correspondendo a 1 x SSC, 0,1% de SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 68°C.

[0085] A sonda usada para a hibridização anteriormente mencionada pode ser uma parte de uma sequência que é complementar ao gene como descrita acima. Uma tal sonda pode ser preparada pela PCR usando oligonucleotídeos preparados com base em uma sequência de gene conhecida como iniciadores e um fragmento de DNA contendo qualquer um dos genes anteriormente mencionados como um padrão. Como a sonda, por exemplo, um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 pares de base podem ser usados. Quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 pares de base é usado como a sonda, as condições de lavagem da hibridização podem ser, por exemplo, 50 °C, 2 x SSC e 0,1 % de SDS.

[0086] Além disso, visto que a degenerescência dos códons difere dependendo do hospedeiro, códons arbitrários no gene carreador de absorção de α-KG podem ser substituídos com os respectivos códons equivalentes. Isto é, o gene carreador de absorção de α-KG pode ser uma variante de qualquer um dos genes carreadores de absorção de α-KG exemplificados acima devido à degenerescência do código genético. Por exemplo, o gene carreador de absorção de α-KG pode ser um gene modificado de modo que o mesmo tenha códons ótimos de acordo com as frequências de códon em um hospedeiro a ser usado.

[0087] A porcentagem da identidade de sequência entre duas sequências pode ser determinada, por exemplo, usando-se um algoritmo matemático. Os exemplos não limitantes de um tal algoritmo matemático incluem o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4: 11-17, o algoritmo de homologia local de Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, o método para pesquisar a homologia de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-2448, e uma versão modificada do algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264, tal como aquele descrito em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877.

[0088] Usando-se um programa com base em um tal algoritmo matemático, a comparação de sequência (isto é, o alinhamento) para determinar a identidade de sequência pode ser realizada. O programa pode ser apropriadamente executado por um computador. Os exemplos de um tal programa incluem, mas não são limitados a, CLUSTAL do programa PC/Gene (disponível da Intelligenetics, Mountain View, Calif.), programa ALIGN (Versão 2.0), e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA da Wisconsin Genetics Software Package, Versão 8 (disponível da Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USA). O alinhamento usando estes programas pode ser realizado usando-se, por exemplo, parâmetros iniciais. O programa CLUSTAL é bem descrito em Higgins et al. (1988) Gene 73: 237-244 (1988), Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151-153, Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881-90, Huang et al. (1992) CABIOS 8: 155-65, e Pearson et al. (1994) Met. Mol. Biol. 24: 307-331.

[0089] De modo a obter uma sequência de nucleotídeo homólogos para uma sequência de nucleotídeo alvo, em particular, por exemplo, a pesquisa de nucleotídeo BLAST pode ser realizada usando-se o programa BLASTN com contagem de 100 e comprimento de palavra de 12. De modo a obter uma sequência de aminoácido homóloga a uma proteína alvo, em particular, por exemplo, a pesquisa de proteína BLAST pode ser realizada usando-se o programa BLASTX com contagem de 50 e comprimento de palavra de 3. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov para a pesquisa de nucleotídeo BLAST e pesquisa de proteína BLAST. Além disso, BLAST com intervalos (BLAST 2.0) pode ser usado de modo a se obter um alinhamento incluindo intervalo(s) para o propósito de comparação. Além disso, PSI-BLAST pode ser usado de modo a realizar pesquisa repetitiva para detectar relações distantes entre as sequências. Ver Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 para BLAST com intervalo e PSI-BLAST. Quando do uso de BLAST, BLAST com intervalo, ou PSI-BLAST, os parâmetros iniciais de cada programa (por exemplo BLASTN para as sequências de nucleotídeo, e BLASTX para as sequências de aminoácido) podem ser usados. O alinhamento também pode ser realizado manualmente.

[0090] A identidade de sequência entre duas sequências é calculada como a razão de resíduos que se igualam nas duas sequências quando alinhando as duas sequências de modo a ajustar de modo máximo entre si.

[0091] As descrições anteriormente mencionadas concernentes às variantes conservativas dos genes e proteínas podem ser aplicadas mutatis mutandis às variantes de proteínas arbitrárias tais como as enzimas do sistema da biossíntese de L-aminoácido e genes que codifica os mesmos. <1-3> Métodos para aumentar a atividade da proteína [0092] A seguir, os métodos para aumentar a atividade de uma proteína tal como o carreador de absorção de α-KG serão explicados.

[0093] A expressão “a atividade de uma proteína é aumentada” significa que a atividade da proteína é aumentada quando comparada com uma cepa não modificada. Especificamente, a expressão “a atividade de uma proteína é aumentada” pode significar que a atividade da proteína por célula é aumentada quando comparada com aquela de uma cepa não modificada. O termo “cepa não modificada” aqui usado se refere a uma cepa de controle que não foi modificada de modo que a atividade de uma proteína objeto seja aumentada. Os exemplos da cepa não modificada incluem uma cepa do tipo selvagem e cepa precursora. Os exemplos específicos da cepa não modificada incluem os respectivos tipos de cepa das espécies de bactérias. Os exemplos específicos da cepa não modificada também incluem as cepas exemplificadas acima em relação à descrição de bactérias. Isto é, em uma modalidade, a atividade de uma proteína pode ser aumentada quando comparada com um tipo de cepa, isto é, o tipo de cepa da espécie à qual uma bactéria corineforme pertence. Em uma outra modalidade, a atividade de uma proteína também pode ser aumentada quando comparada com C. glutamicum ATCC 13869. Em uma outra modalidade, a atividade de uma proteína também pode ser aumentada quando comparada com C. glutamicum ATCC 13032. A declaração de que “a atividade de uma proteína é aumentada” também pode ser expresso como “a atividade de uma proteína é realçada”. Mais especificamente, a expressão “a atividade de uma proteína é aumentada” pode significar que o número de moléculas da proteína por célula é aumentado, e/ou a função de cada molécula da proteína é aumentada quando comparada com aquelas de uma cepa não modificada. Isto é, o termo “atividade” na expressão “a atividade de uma proteína é aumentada” não é limitada à atividade catalítica da proteína, mas também pode significar a quantidade de transcrição de um gene (isto é, a quantidade de mRNA) que codifica a proteína, ou a quantidade de tradução da proteína (isto é, a quantidade da proteína). Além disso, a declaração de que “a atividade de uma proteína é aumentada” inclui não apenas um estado que a atividade de uma proteína objetiva é aumentada em uma cepa inerentemente tendo a atividade da proteína objeto, mas também um estado que a atividade de uma proteína objeto é comunicada a uma cepa não inerentemente tendo a atividade da proteína objeto. Além disso, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente aumentada, a atividade de uma proteína objeto inerentemente contida em um hospedeiro pode ser atenuada e/ou eliminada, e depois um tipo apropriado da proteína objeto pode ser comunicada ao hospedeiro.

[0094] O grau do aumento na atividade de uma proteína não é particularmente limitado, contanto que a atividade da proteína seja aumentada quando comparada com uma cepa não modificada. A atividade da proteína pode ser aumentada, por exemplo, para 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais daquela de uma cepa não modificada. Além disso, quando a cepa não modificada não tem a atividade da proteína objeto, é suficiente que a proteína seja produzida como um resultado da introdução do gene que codifica a proteína, e por exemplo, a proteína pode ser produzida a um tal grau que a atividade do mesmo pode ser medida.

[0095] A modificação para aumentar a atividade de uma proteína pode ser atingida, por exemplo, aumentando-se a expressão de um gene que codifica a proteína. A expressão “a expressão de um gene é aumentada” significa que a expressão do gene é aumentada quando comparada com uma cepa não modificada tal como uma cepa do tipo selvagem e cepa precursora. Especificamente, a expressão “a expressão de um gene é aumentada” pode significar que a quantidade de expressão do gene por célula é aumentada quando comparada com aquela de uma cepa não modificada. Mais especificamente, a expressão “a expressão de um gene é aumentada” pode significar que a quantidade de transcrição do gene (isto é, a quantidade de mRNA) é aumentada, e/ou a quantidade de tradução do gene (isto é, a quantidade da proteína expressa a partir do gene) é aumentada. A declaração de que “a expressão de um gene é aumentada” também é aludido como “a expressão de um gene é realçada”. A expressão de um gene pode ser aumentada, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais daquela de uma cepa não modificada. Além disso, a declaração de que “a expressão de um gene é aumentada” inclui não apenas uma declaração de que a quantidade de expressão de um gene objeto é aumentada em uma cepa que inerentemente expressa o gene objeto, mas também uma declaração de que o gene é introduzido em uma cepa que não expressa inerentemente o gene objeto, e aí expresso. Isto é, a frase “a expressão de um gene é aumentada” também pode significar, por exemplo, que um gene objeto é introduzido em uma cepa que não possui o gene, e é aí expresso.

[0096] A expressão de um gene pode ser aumentada, por exemplo, aumentando-se o número de cópia do gene.

[0097] O número de cópia de um gene pode ser aumentado introduzindo-se o gene dentro do cromossoma de um hospedeiro. Um gene pode ser introduzido em um cromossoma, por exemplo, usando-se a recombinação homóloga (Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). Os exemplos do método de transferência de gene utilizando a recombinação homóloga incluem, por exemplo, um método usando um DNA linear tal como integração dirigida a Red (Datsenko, K. A., e Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 66406645 (2000)), um método de usar um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura, um método de usar um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método de usar um vetor suicida não tendo uma origem de replicação que funcione em um hospedeiro, e um método de transdução usando um fago. Apenas uma cópia, ou duas ou mais cópias de um gene podem ser introduzidas. Por exemplo, realizando-se a recombinação homóloga usando uma sequência que está presente em cópias múltiplas em um cromossoma como um alvo, cópias múltiplas de um gene podem ser introduzidas dentro do cromossoma. Os exemplos de uma tal sequência que está presente em cópias múltiplas em um cromossoma incluem DNAs repetitivos, e repetições invertidas localizadas em ambas as extremidades de um transposon. Alternativamente, a recombinação de homólogos pode ser realizada usando-se uma sequência apropriada em um cromossoma tal como um gene desnecessário para a produção de uma substância objeto como um alvo. Além disso, um gene também pode ser aleatoriamente introduzido em um cromossoma usando-se um transposon ou Mini-Mu (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2-109985, Patente U.S. No. 5.882.888, EP 805867 B1).

[0098] Introdução de um gene alvo em um cromossoma pode ser confirmada pela hibridização de Southern usando uma sonda tendo uma complementaridade de sequência para o gene inteiro ou uma parte do mesmo, PCR usando iniciadores preparados com base na sequência do gene, ou os semelhantes.

[0099] Além disso, o número de cópia de um gene também pode ser aumentado introduzindo-se um vetor contendo o gene em um hospedeiro. Por exemplo, o número de cópia de um gene alvo pode ser aumentado ligando-se um fragmento de DNA contendo o gene alvo com um vetor que funciona em um hospedeiro para construir um vetor de expressão do gene, e transformar o hospedeiro com o vetor de expressão. O fragmento de DNA contendo o gene alvo pode ser obtido, por exemplo, pela PCR usando o DNA genômico de um micro-organismo tendo o gene alvo como o padrão. Como o vetor, um vetor autonomamente replicável na célula do hospedeiro pode ser usado. O vetor é preferivelmente um vetor de cópia múltipla. Além disso, o vetor preferivelmente tem um marcador tal como um gene de resistência a antibiótico para a seleção de transformante. Além disso, o vetor pode ter um promotor e/ou terminador para expressar o gene introduzido. O vetor pode ser, por exemplo, um vetor derivado de um plasmídeo bacteriano, um vetor derivado de um plasmídeo de levedura, um vetor derivado de um bacteriófago, cosmídeo, fagomídeo, ou os semelhantes. Os exemplos específicos de vetor autonomamente replicável em bactérias corineformes incluem pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); plasmídeos obtidos pela melhora destas e tendo um gene de resistência a medicamento; plasmídeo pCRY30 descrito na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 3-210184; plasmídeos pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, e pCRY3KX descritos na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 272876 e Patente U.S. No. 5.185.262; plasmídeos pCRY2 e pCRY3 descritos na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 1-191686; pAJ655, pAJ611, e pAJ1844 descrito na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 58-192900; pCG1 descrito na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-134500; pCG2 descrito na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 58-35197; pCG4 e pCG11 descritos na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-183799; pVK7 descrito na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 10-215883; pVK9 descrito na WO2007/046389; pVS7 descrito na WO2013/069634; e pVC7 descrito na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 9-070291.

[00100] Quando um gene é introduzido, é suficiente que o gene seja expressivamente abrigado por um hospedeiro. Especificamente, é suficiente que o gene seja abrigado por um hospedeiro de modo que o mesmo seja expresso sob o controle de um promotor que funciona no hospedeiro. O termo “um promotor que funciona em um hospedeiro” se refere a um promotor que mostra uma atividade promotora no hospedeiro. O promotor pode ser um promotor derivado do hospedeiro, ou um promotor heterogêneo. O promotor pode ser o promotor nativo do gene a ser introduzido, ou um promotor de um outro gene. Como o promotor, por exemplo, um tal promotor mais forte como mencionado mais tarde também pode ser usado.

[00101] Um terminador para a terminação da transcrição de gene pode estar localizado a jusante do gene. O terminador não é particularmente limitado contanto que o mesmo funcione em um hospedeiro. O terminador pode ser um terminador derivado do hospedeiro, ou um terminador heterogêneo. O terminador pode ser o terminador nativo do gene a ser introduzido, ou um terminador de um outro gene.

[00102] Vetores, promotores, e terminadores disponíveis em vários micro-organismos são divulgados em detalhes em “Fundamental Microbiology Vol. 8, Genetic Engineering, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD, 1987”, e estes podem ser usados.

[00103] Além disso, quando dois ou mais dos genes são introduzidos, é suficiente que os genes cada um seja expressivamente abrigado por um hospedeiro. Por exemplo, todos os genes podem ser carregados por um único vetor de expressão ou um cromossoma. Além disso, os genes podem ser separadamente carregados por dois ou mais vetores de expressão, ou separadamente carregados por um único ou dois ou mais vetores de expressão e um cromossoma. Um operão constituído por dois ou mais genes também pode ser introduzido. O caso de “introduzir dois ou mais genes” incluem, por exemplo, casos de introduzir os respectivos genes que codificam dois ou mais tipos de proteínas (tais como enzimas), introduzir os respectivos genes que codificam duas ou mais subunidades ou mais subunidades constituindo um único complexo de proteína (tal como complexo de enzima), e uma combinação dos casos anteriores.

[00104] O gene a ser introduzido não é particularmente limitado contanto que o mesmo codifique uma proteína que funciona no hospedeiro. O gene a ser introduzido pode ser um gene derivado do hospedeiro, ou pode ser um gene heterogêneo. O gene a ser introduzido pode ser obtido, por exemplo, pela PCR usando iniciadores planejados com base na sequência de nucleotídeo do gene, e usando o DNA genômico de um organismo tendo o gene, um plasmídeo que carrega o gene, ou os semelhantes como um padrão. O gene a ser introduzido também pode ser totalmente sintetizado, por exemplo, com base na sequência de nucleotídeo do gene (Gene, 60(1), 115127 (1987)). O gene obtido pode ser usado como tal, ou depois de ser modificado como requerido. Isto é, uma variante de um gene pode ser obtida modificando-se o gene. Um gene pode ser modificado por uma técnica conhecida. Por exemplo, uma mutação objeto pode ser introduzida em um sítio objeto de DNA pelo método de mutação específica de sítio. Isto é, a região codificadora de um gene pode ser modificada pelo método de mutação específica de sítio de modo que um sítio específico da proteína codificada inclua substituição, deleção, inserção, ou adição de resíduos de aminoácido. Os exemplos do método de mutação específica de sítio incluem o método utilizando PCR (Higuchi, R., 61, em PCR Technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton Press (1989); Carter, P., Met. in Enzymol., 154, 382 (1987)), e o método utilizando fago (Kramer, W. e Frits, H. J., Met. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Met. in Enzymol., 154, 367 (1987)). Alternativamente, uma variante de um gene pode ser totalmente sintetizada.

[00105] Além disso, quando uma proteína funciona como um complexo consistindo de uma pluralidade de subunidades, uma parte ou toda da pluralidade de subunidades pode ser modificada, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente aumentada. Isto é, por exemplo, quando a atividade de uma proteína é aumentada aumentando-se a expressão de um gene, a expressão de uma parte ou toda da pluralidade de genes que codificam / as subunidades podem ser realçadas. É usualmente preferível realçar a expressão de toda da pluralidade de genes que codificam as subunidades. Além disso, as subunidades que constituem o complexo podem ser derivadas de um único tipo de organismo ou dois ou mais tipos de organismos, contanto que o complexo tenha uma função da proteína objeto. Isto é, por exemplo, genes do mesmo organismo que codificam uma pluralidade de subunidades podem ser introduzidos em um hospedeiro, ou genes de organismos diferentes que codificam uma pluralidade de subunidades pode ser introduzida em um hospedeiro.

[00106] Além disso, a expressão de um gene pode ser aumentada melhorando-se a eficiência de transcrição do gene. Além disso, a expressão de um gene também pode ser aumentada utilizando-se a eficiência de tradução do gene. A eficiência de transcrição do gene e a eficiência de tradução do gene pode ser melhorada, por exemplo, modificando-se uma sequência de controle de expressão do gene. O termo “sequência de controle de expressão” coletivamente se refere a sítios que afetam a expressão de um gene. Os exemplos da sequência de controle de expressão incluem, por exemplo, promotor, sequência de Shine-Dalgarno (SD (também aludida como sítio de ligação de ribossoma (RBS)), e região espaçadora entre RBS e o códon de início. As sequências de controle de expressão podem ser identificadas usando-se um vetor de pesquisa de promotor ou software de análise de gene tal como GENETYX. Estas sequências de controle de expressão podem ser modificadas, por exemplo, por um método de usar um vetor sensível à temperatura, ou o método de integração dirigido a Red (WO2005/010175).

[00107] A eficiência de transcrição de um gene pode ser melhorada, por exemplo, substituindo-se o promotor do gene em um cromossoma com um promotor mais forte. O termo “promotor mais forte” significa um promotor fornecendo uma transcrição melhorada de um gene comparado com um promotor do gene do tipo selvagem inerentemente existente. Os exemplos de promotores mais fortes utilizáveis nas bactérias corineformes incluem o promotor P54-6 artificialmente modificado (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)), promotores pta, aceA, aceB, adh, e amyE indutíveis nas bactérias corineformes com ácido acético, etanol, ácido pirúvico, ou os semelhantes, promotores cspB, SOD, e tuf (EF-Tu), que são promotores potentes capazes de fornecer uma quantidade de expressão grande nas bactérias corineformes (Journal of Biotechnology, 104 (2003) 311-323; Appl. Environ. Microbiol., dezembro de 2005; 71 (12): 8587-96), assim como promotor lac, promotor tac, e promotor trc. Além disso, como o promotor mais forte, um tipo altamente ativo de um promotor existente também pode ser obtido usando-se vários genes repórter. Por exemplo, fabricando-se as regiões -35 e -10 em uma região promotora mais próxima da sequência de consenso, a atividade do promotor pode ser realçada (WO00/18935). Os exemplos de promotor tipo altamente ativo incluem vários promotores iguais a tac (Katashkina JI et al., Pedido de Patente da federação Russa No. 2006134574). Os métodos para avaliar a força de promotores e exemplos de promotores fortes são descritos no documento de Goldstein et al. (Prokaryotic Promotors in Biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)), e assim por diante.

[00108] A eficiência de tradução de um gene pode ser melhorada, por exemplo, substituindo-se a sequência de Shine-Dalgarno (SD) (também aludida como sítio de ligação de ribossoma (RBS)) para o gene em um cromossoma com uma sequência SD mais forte. A “sequência SD mais forte” significa uma sequência SD que fornece uma tradução melhorada de mRNA comparada com a sequência SD do tipo selvagem inerentemente existente do gene. Os exemplos de sequências SD mais fortes incluem, por exemplo, RBS do gene 10 derivadas de fago T7 (Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235). Além disso, é conhecido que a substituição, inserção, ou deleção de vários nucleotídeos em uma região espaçadora entre RBS e o códon de partida, especialmente em uma sequência imediatamente a montante do códon de partida (5’-UTR), significantemente afeta a estabilidade e eficiência de tradução de mRNA, e consequentemente, a eficiência de tradução de um gene também pode ser melhorada modificando-os.

[00109] A eficiência de tradução de um gene também pode ser melhorada, por exemplo, modificando-se os códons. Por exemplo, a eficiência de tradução do gene pode ser melhorada substituindo-se um códon raro presente no gene com um códon sinônimo mais frequentemente usado. Isto é, o gene a ser introduzido pode ser modificado, por exemplo, de modo a conter códons ideais de acordo com as frequências de códons observadas em um hospedeiro a ser usado. Os códons podem ser substituídos, por exemplo, pelo método de mutação específica de sítio para introduzir uma mutação objeto em um sítio objeto de DNA. Alternativamente, um fragmento de gene no qual códons objetos são substituídos pode ser totalmente sintetizado. As frequências de códons em vários organismos são divulgadas na “Base de Dados de Uso de Códon” (http://www.kazusa.ou.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)).

[00110] Além disso, a expressão de um gene também pode ser aumentada amplificando-se um regulador que aumenta a expressão do gene, ou deletando ou atenuando um regulador que reduz a expressão do gene.

[00111] Tais métodos para aumentar a expressão de gene como mencionado acima podem ser usados independentemente ou em uma combinação arbitrária.

[00112] Além disso, a modificação que aumenta a atividade de uma proteína também pode ser atingida, por exemplo, realçando-se a atividade específica da enzima. O realce da atividade específica também inclui a dessensibilização para a inibição de retroalimentação. Isto é, quando uma proteína é submetida à inibição de retroalimentação por um metabólito, a atividade da proteína pode ser aumentada fabricando-se um hospedeiro que abriga um gene que codifica uma proteína mutante que foi dessensibilizada para a inibição de retroalimentação. Na presente invenção, a “dessensibilização para a inibição de retroalimentação” inclui a atenuação e eliminação da inibição de retroalimentação. Uma proteína mostrando uma atividade específica realçada pode ser obtida, por exemplo, pesquisando-se vários organismos. Além disso, um tipo altamente ativo de uma proteína existente também pode ser obtida introduzindo-se uma mutação dentro da proteína existente. A mutação a ser introduzida pode ser, por exemplo, substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições da proteína. A mutação pode ser introduzida, por exemplo, por um tal método de mutação específica de sítio como mencionado acima. A mutação também pode ser introduzida, por exemplo, por um tratamento de mutagênese. Os exemplos do tratamento de mutagênese incluem irradiação de raio X, irradiação de ultravioleta, e um tratamento com um agente de mutação tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS), e metanossulfonato de metila (MMS). Além disso, uma mutação aleatória pode ser induzida tratando-se diretamente DNA in vitro com hidroxilamina. O realce da atividade específica pode ser independentemente usado, ou pode ser usado em uma combinação arbitrária com tais métodos para realçar a expressão de gene como mencionado acima.

[00113] O método para a transformação não é particularmente limitado, e métodos convencionalmente conhecidos podem ser usados. A transformação de bactérias corineformes pode ser realizada, por exemplo, pelo método do protoplasto (Gene, 39, 281-286 (1985)), pelo método da eletroporação (Bio/Technology, 7, 1067-1070 (1989)), ou pelo método do pulso elétrico (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2-207791).

[00114] Um aumento na atividade de uma proteína pode ser confirmado medindo-se a atividade da proteína.

[00115] Um aumento na atividade de uma proteína também pode ser confirmado confirmando-se um aumento na expressão de um gene que codifica a proteína. Um aumento na expressão de um gene pode ser confirmado confirmando-se um aumento na quantidade de transcrição do gene, ou confirmando-se um aumento na quantidade de uma proteína expressa a partir do gene.

[00116] Um aumento da quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmado comparando-se a quantidade de mRNA transcrito a partir do gene com aquela de uma cepa não modificada tal como uma cepa do tipo selvagem ou cepa precursora. Os exemplos do método para avaliar a quantidade de mRNA incluem hibridização de Northern, RT-PCR, e assim por diante (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). A quantidade de mRNA pode aumentar, por exemplo, para 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais daquela de uma cepa não modificada.

[00117] Um aumento na quantidade de uma proteína pode ser confirmado pela Western blotting usando anticorpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). A quantidade da proteína pode aumentar, por exemplo, para 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais daquela de uma cepa não modificada.

[00118] Os métodos anteriormente mencionados para aumentar a atividade de uma proteína podem ser usados para o realce das atividades de proteínas arbitrárias tais como enzimas da biossíntese de L-aminoácido, e realce da expressão de genes arbitrários tais como genes que codificam aquelas proteínas arbitrárias, além do realce do carreador de absorção da atividade de α-KG. <1-4> Método para reduzir a atividade da proteína [00119] A seguir, os métodos para reduzir a atividade de uma proteína serão explicados.

[00120] A expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” significa que a atividade da proteína é reduzida quando comparada com uma cepa não modificada. Especificamente, a expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” pode significar que a atividade da proteína por célula é reduzida quando comparada com aquela de uma cepa não modificada. O termo “cepa não modificada” aqui usada se refere a uma cepa de controle que não foi modificada de modo que a atividade de uma proteína objeto seja reduzida. Os exemplos da cepa não modificada incluem uma cepa do tipo selvagem e cepa precursora. Os exemplos específicos da cepa não modificada incluem os respectivos tipos de cepas da espécie de bactérias. Os exemplos específicos da cepa não modificada também incluem cepas exemplificadas acima em relação à descrição de bactérias. Isto é, em uma modalidade, a atividade de uma proteína pode ser reduzida quando comparada com um tipo de cepa, isto é, o tipo de cepa da espécie à qual uma bactéria corineforme pertence. Em uma outra modalidade, a atividade de uma proteína também pode ser reduzida quando comparada com C. glutamicum ATCC 13869. Em uma outra modalidade, a atividade de uma proteína também pode ser reduzida quando comparada com C. glutamicum ATCC 13032. A declaração de que “a atividade de uma proteína é reduzida” também inclui uma declaração de que a atividade da proteína completamente desapareceu. Mais especificamente, a expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” pode significar que o número de moléculas da proteína por célula é reduzido, e/ou a função de cada molécula da proteína é reduzida quando comparada com aquelas de uma cepa não modificada. Isto é, o termo “atividade” na expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” não é limitada à atividade catalítica da proteína, mas pode também significar a quantidade de transcrição de um gene (isto é, a quantidade de mRNA) que codifica a proteína ou a quantidade de tradução da proteína (isto é, a quantidade da proteína). A declaração de que “o número de moléculas da proteína por célula é reduzido” também inclui uma declaração de que a proteína não existe de modo algum. A declaração de que “a função de cada molécula da proteína é reduzida” também inclui uma declaração de que a função de cada molécula de proteína completamente desapareceu. O grau da redução na atividade de uma proteína não é particularmente limitado, contanto que a atividade seja reduzida quando comparada com aquela de uma cepa não modificada. A atividade de uma proteína pode ser reduzida, por exemplo, para 50 % ou menos, 20 % ou menos, 10 % ou menos, 5 % ou menos, ou 0 % daquela de uma cepa não modificada.

[00121] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína pode ser atingida, por exemplo, reduzindo-se a expressão de um gene que codifica a proteína. A frase “a expressão de um gene é reduzida” significa que a expressão do gene é reduzida quando comparada com uma cepa não modificada tal como uma cepa do tipo selvagem e cepa precursora. Especificamente, a frase “a expressão de um gene é reduzida” pode significar que a expressão do gene por célula é reduzida quando comparada com aquela de uma cepa não modificada tal como uma cepa do tipo selvagem e cepa precursora. Mais especificamente, a frase “a expressão de um gene é reduzida” pode significar que a quantidade de transcrição do gene (isto é, a quantidade de mRNA) é reduzida, e/ou a quantidade de tradução do gene (isto é, a quantidade da proteína expressa a partir do gene) é reduzida. A declaração de que “a expressão de um gene é reduzida” também inclui uma declaração de que o gene não é expresso de modo algum. A declaração de que “a expressão de um gene é reduzida” também é aludida como “a expressão de um gene é atenuada”. A expressão de um gene pode ser reduzida, por exemplo, para 50 % ou menos, 20 % ou menos, 10 % ou menos, 5 % ou menos, ou 0 % daquela de uma cepa não modificada.

[00122] A redução na expressão de gene pode ser devida, por exemplo, a uma redução na eficiência de transcrição, uma redução na eficiência de tradução, ou uma combinação das mesmas. A expressão de um gene pode ser reduzida modificando-se uma sequência de controle de expressão do gene tal como promotor, Sequência de Shine-Dalgarno (SD) (também aludida como sítio de ligação de ribossoma (RBS)), e região espaçadora entre RBS e o códon de partida do gene. Quando uma sequência de controle de expressão é modificada, preferivelmente um ou mais nucleotídeos, mais preferivelmente dois ou mais nucleotídeos, de modo particularmente preferível três ou mais nucleotídeos, da sequência de controle de expressão são modificadas. Por exemplo, a eficiência de transcrição de um gene pode ser reduzida, por exemplo, substituindo-se o promotor do gene em um cromossoma com um promotor mais fraco. O termo “promotor mais fraco” significa um promotor fornecendo uma transcrição atenuada de um gene comparado com um promotor do tipo selvagem inerentemente existente do gene. Os exemplos de promotores mais fracos incluem, por exemplo, promotores indutíveis. Isto é, um promotor indutível pode funcionar como um promotor mais fraco sob uma condição não induzida, tal como na ausência do indutor correspondente. Além disso, uma parte ou o todo de uma sequência de controle de expressão podem ser deletados. A expressão de um gene também pode ser reduzida, por exemplo, manipulando-se um fator responsável pelo controle de expressão. Os exemplos do fator responsável pelo controle de expressão incluem moléculas baixas responsáveis pelo controle de transcrição ou tradução (indutores, inibidores, etc.), proteínas responsáveis pelo controle de transcrição ou tradução (fatores de transcrição, etc.), ácidos nucléicos responsáveis pelo controle de transcrição ou tradução (siRNA etc.), e assim por diante. Além disso, a expressão de um gene também pode ser reduzida, por exemplo, introduzindo-se uma mutação que reduz a expressão do gene na região codificadora do gene. Por exemplo, a expressão de um gene pode ser reduzida substituindo-se um códon na região codificadora do gene com um códon sinônimo usado menos frequentemente em um hospedeiro. Além disso, por exemplo, a expressão de gene pode ser reduzida devido ao rompimento de um gene como descrito mais tarde.

[00123] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína também pode ser atingida, por exemplo, rompendo-se um gene que codifica a proteína. A expressão “um gene é rompido” significa que um gene é modificado de modo que uma proteína que pode funcionar normalmente não é produzida. A declaração de que “uma proteína que normalmente funciona não é produzida” inclui uma declaração de que a proteína não é produzida de modo algum a partir do gene, e uma declaração de que a proteína da qual a função (tal como atividade ou propriedade) por molécula é reduzida ou eliminada é produzida a partir do gene.

[00124] O rompimento de um gene pode ser atingido, por exemplo, deletando-se uma parte ou o todo da região codificadora do gene em um cromossoma. Além disso, o todo de um gene incluindo sequências a montante e a jusante do gene em um cromossoma pode ser deletado. A região a ser deletada pode ser qualquer região tal como uma região de terminal N, uma região interna, ou uma região de terminal C, contanto que a atividade da proteína possa ser reduzida. A deleção de uma região mais longa pode usualmente de forma mais segura inativar o gene. Além disso, é preferido que os quadros de leitura das sequências a montante e a jusante da região a serem deletados não sejam os mesmos.

[00125] O rompimento de um gene também pode ser atingido, por exemplo, pela introdução de uma mutação para uma substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), um códon de parada (mutação sem sentido), uma mutação de deslocamento do quadro de leitura que adiciona ou deleta um ou dois resíduos de nucleotídeo, ou os semelhantes na região codificadora do gene em um cromossoma (Journal of Biological Chemistry, 272: 8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 26 116, 2083320839 (1991)).

[00126] O rompimento de um gene também pode ser atingido, por exemplo, inserindo-se uma outra sequência em uma região codificadora do gene em um cromossoma. O sítio da inserção pode estar em qualquer região do gene, e a inserção de uma região mais longa pode usualmente de modo mais seguro inativar o gene. É preferido que quadros de leitura das sequências a montante e a jusante do sítio de inserção não são os mesmos. A outra sequência não é particularmente limitada contanto que uma sequência qu8e reduza ou elimine a atividade da proteína codificada é escolhida, e exemplos do mesmo incluem, por exemplo, um gene marcador tal como genes de resistência a antibiótico, e um gene útil para a produção de uma substância objetiva.

[00127] Tal modificação de um gene em um cromossoma como descrita acima pode ser atingida, por exemplo, preparando-se um gene tipo deficiente modificado de modo que o mesmo seja incapaz de produzir uma proteína que normalmente funciona, e transformar um hospedeiro com um DNA recombinante contendo o gene tipo deficiente para causar a recombinação homóloga entre o gene tipo deficiente e o gene tipo selvagem em um cromossoma e substituir deste modo o gene tipo deficiente no lugar do gene tipo selvagem no cromossoma. Neste procedimento, se um gene marcador selecionado de acordo com as características do hospedeiro tais como auxotrofia é incluído no DNA recombinante, a operação se torna mais fácil. Os exemplos do gene tipo deficiente incluem um gene incluindo a deleção de todo ou uma parte do gene, gene incluindo uma mutação de sentido errado, gene incluindo uma mutação sem sentido, gene incluindo uma mutação de deslocamento do quadro de leitura, e gene incluindo a inserção de um transposon ou gene marcador. A proteína codificada pelo gene tipo deficiente tem uma conformação diferente daquela da proteína do tipo selvagem, mesmo se a mesma é produzida, e assim a função da mesma é reduzida ou eliminada. Tal rompimento de gene com base na substituição de gene utilizando recombinação de homólogos já foi estabelecido, e existem métodos de usar um DNA linear tal como um método chamado “integração dirigida por Red” (Datsenko, K. A, e Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 6640-6645 (2000)), e um método utilizando a integração dirigida por Red em combinação com um sistema de excisão derivado do fago λ (Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F., J. Bacteriol., 184: 5200-5203 (2002)) (reportar-se à WO2005/010175), um método de usar um plasmídeo tendo uma origem de replicação sensível à temperatura, um método de usar um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método de utilizar um vetor suicida não tendo uma origem de replicação que funciona em um hospedeiro (Patente U.S. No. 6.303.383, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 05-007491), e assim por diante.

[00128] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína também pode ser atingida, por exemplo, por um tratamento de mutagênese. Os exemplos do tratamento de mutagênese incluem a irradiação de raio X ou ultravioleta e tratamento com um agente de mutação tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS), e metanossulfonato de metila (MMS).

[00129] Quando uma proteína funciona como um complexo consistindo de uma pluralidade de subunidades, uma parte ou toda da pluralidade de subunidades podem ser modificadas, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente reduzida. Isto é, por exemplo, uma parte ou toda de uma pluralidade de genes que codificam as respectivas subunidades podem ser rompidas ou os semelhantes. Além disso, quando existe uma pluralidade de isozimas de uma proteína, uma parte ou toda das atividades da pluralidade de isozimas pode ser reduzida, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente reduzida. Isto é, por exemplo, uma parte ou toda de uma pluralidade de genes que codificam as respectivas isozimas podem ser rompidas ou os semelhantes.

[00130] Uma redução na atividade de uma proteína pode ser confirmada medindo-se a atividade da proteína.

[00131] Uma redução na atividade de uma proteína também pode ser confirmada confirmando-se uma redução na expressão de um gene que codifica a proteína. Uma redução na expressão de um gene pode ser confirmada confirmando-se uma redução na quantidade de transcrição do gene ou uma redução na quantidade da proteína expressa a partir do gene.

[00132] Uma redução na quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmada comparando-se a quantidade de mRNA transcrito a partir do gene com aquela de uma cepa não modificada. Os exemplos do método para avaliar a quantidade de mRNA incluem hibridização de Northern, RT-PCR, e assim por diante (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). A quantidade de mRNA é preferivelmente reduzida, por exemplo, para 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0%, daquela de uma cepa não modificada.

[00133] Uma redução na quantidade de uma proteína pode ser confirmada pela Western blotting usando anticorpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA) 2001). A quantidade da proteína é preferivelmente reduzida, por exemplo, para 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0%, daquela de uma cepa não modificada.

[00134] O rompimento de um gene pode ser confirmado determinando-se a sequência de nucleotídeo de uma parte ou do todo do gene, mapa de enzima de restrição, tamanho natural, ou os semelhantes do gene dependendo dos meios usados para o rompimento.

[00135] Os métodos anteriormente mencionados para reduzir a atividade de uma proteína como mencionado acima podem ser aplicados para redução nas atividades de proteínas arbitrárias tais como uma enzima que catalisa uma reação ramificando-se a partir do caminho da biossíntese de um L-aminoácido objeto para gerar um composto outro que não o L-aminoácido objeto, e redução na expressão de genes arbitrários tais como os genes que codificam estas proteínas arbitrárias. <2> Método para produzir o L-aminoácido da presente invenção [00136] O método da presente invenção é um método para produzir um L-aminoácido compreendendo cultivar a bactéria da presente invenção em um meio, e coletar o L-aminoácido do meio. O L-aminoácido a ser produzido na presente invenção é um L-aminoácido da família do glutamato. Na presente invenção, um tipo de L-aminoácido pode ser produzido, ou dois ou mais tipos de L-aminoácidos podem ser produzidos.

[00137] O meio a ser usado não é particularmente limitado, contanto que a bactéria da presente invenção possa proliferar no mesmo, e um L-aminoácido objeto possa ser produzido. Como o meio, por exemplo, um meio habitual usado para a cultura de bactérias tais como bactérias corineformes pode ser usado. Como o meio, por exemplo, um meio contendo fonte de carbono, fonte de nitrogênio, fonte de fósforo, e fonte de enxofre, assim como componentes selecionados de outros vários componentes orgânicos e inorgânicos como requerido podem ser usados. Tipos e concentrações dos componentes de meio podem ser apropriadamente determinados de acordo com várias condições tais como o tipo de bactéria corineforme a ser usada.

[00138] Os exemplos específicos da fonte de carbono incluem, por exemplo, sacarídeos tais como glicose, frutose, sacarose, lactose, galactose, xilose, arabinose, melaços não refinados, hidrolisados de amido, e hidrolisados de biomassa, ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido fumárico, ácido cítrico, e ácido succínico, álcoois tais como glicerol, glicerol bruto, e etanol, e ácidos alifáticos. Como a fonte de carbono, materiais derivados de planta podem ser preferivelmente usados. Os exemplos de materiais derivados de plantas incluem, por exemplo, milho, arroz, trigo, soja, cana de açúcar, beterraba e algodão. Os exemplos dos materiais derivados de plantas incluem, por exemplo, órgãos tais como raiz, haste, tronco, ramos, folha, flor, e semente, corpos de planta incluindo os mesmos, e produtos da decomposição destes órgãos de planta. As formas dos materiais derivados de planta no momento de uso dos mesmos não são particularmente limitadas, e eles podem ser usados em qualquer forma tal como produto não processado, suco, produto moído, e produto purificado. Pentoses tais como xilose, hexoses tais como glicose, ou misturas das mesmas podem ser obtidas, por exemplo, biomassa vegetal, e usadas. Especificamente, estes sacarídeos podem ser obtidos submetendo-se uma biomassa vegetal a um tal tratamento como tratamento com vapor, hidrólise com ácido concentrado, hidrólise com ácido diluído, hidrólise com uma enzima tal como celulase, e tratamento alcalino. Visto que a hemicelulose é no geral mais facilmente hidrolisada comparada com a celulose, a hemicelulose em uma biomassa vegetal pode ser hidrolisada de antemão para liberar pentoses, e depois a celulose pode ser hidrolisada para gerar hexoses. Além disso, xilose pode ser fornecida pela conversão das hexoses, por exemplo, comunicando-se um caminho para converter hexose tal como glicose para xilose à bactéria da presente invenção. Como a fonte de carbono, um único tipo de fonte de carbono pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de carbono podem ser usados em combinação.

[00139] Os exemplos específicos da fonte de nitrogênio incluem, por exemplo, sais de amônio tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, e fosfato de amônio, fontes de nitrogênio orgânico tais como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, e produtos da decomposição da proteína da soja, amônia e ureia. Gás amônia ou amônia aquosa usados para ajustar o pH também podem ser usados como a fonte de nitrogênio. Como a fonte de nitrogênio, um único tipo de fonte de nitrogênio pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de nitrogênio podem ser usados em combinação.

[00140] Os exemplos específicos da fonte de fosfato incluem, por exemplo, sais do ácido fosfórico tais como di-idrogeno fosfato de potássio e hidrogeno fosfato de dipotássio, e polímeros do ácido fosfórico tais como ácido pirofosfórico. Como a fonte de fosfato, um único tipo de fonte de fosfato pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de fosfato podem ser usados em combinação.

[00141] Os exemplos específicos da fonte de enxofre incluem, por exemplo, compostos de enxofre inorgânicos tais como sulfatos, tiossulfatos, e sulfitos, e aminoácidos contendo enxofre tais como cisteína, cistina e glutationa. Como a fonte de enxofre, um único tipo de fonte de enxofre pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de enxofre podem ser usados em combinação.

[00142] Os exemplos específicos de outros vários componentes orgânicos e componentes inorgânicos incluem, por exemplo, sais inorgânicos tais como cloreto de sódio e cloreto de potássio; metais traço tais como ferro, manganês, magnésio, e cálcio; vitaminas tais como vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, nicotinamida, e vitamina B12; aminoácidos; ácidos nucléicos; e componentes orgânicos contendo aqueles tais como peptona, casaminoácido, extrato de levedura, e produtos da decomposição de proteína da soja. Como outros vários componentes orgânicos e componentes inorgânicos, um único tipo de componente pode ser usado, ou dois ou mais tipos de componentes podem ser usados em combinação.

[00143] Além disso, quando um mutante auxotrófico que requer um nutriente tal como aminoácidos para o seu crescimento é usado, é preferível fornecer um nutriente requerido para o meio.

[00144] Além disso, também é preferível, por exemplo, restringir a quantidade de biotina no meio, ou adicionar um tensoativo ou penicilina ao meio.

[00145] As condições de cultura não são particularmente limitadas contanto que a bactéria da presente invenção possa proliferar, e um L-aminoácido objeto possa ser produzido. A cultura pode ser realizada, por exemplo, sob as condições habituais usadas para cultivar bactérias tais como bactérias corineformes. As condições de cultura podem ser apropriadamente ajustadas de acordo com várias condições tais como o tipo de bactéria corineforme a ser usada.

[00146] A cultura pode ser realizada usando-se um meio líquido. No momento da cultura, por exemplo, a bactéria da presente invenção cultivada em um meio sólido tal como meio de ágar pode ser diretamente inoculada em um meio líquido, ou a bactéria da presente invenção cultivada em um meio líquido como cultura de semente pode ser inoculada em um meio líquido para a cultura principal. Isto é, a cultura pode ser realizada como cultura de semente separada e cultura principal. Em um tal caso, as condições de cultura da cultura de semente e a cultura principal podem ser as mesmas ou não. A quantidade da bactéria da presente invenção contida no meio no momento do início da cultura não é particularmente limitada. A cultura principal pode ser realizada, por exemplo, inoculando-se um caldo de cultura de semente a um meio para a cultura principal em uma quantidade de 1 a 50 % (v/v).

[00147] A cultura pode ser realizada como cultura de lote, cultura de lote alimentado, cultura contínua, ou uma combinação destes. O meio usado no momento do início da cultura também é aludido como “meio de partida”. O meio fornecido a um sistema de cultura (tanque de fermentação) em cultura de lote alimentado ou cultura contínua também é aludido como “meio alimentado”. Além disso, o fornecimento de um meio alimentado a um sistema de cultura na cultura de lote alimentado ou cultura contínua também é aludido como “alimentação”. Além disso, quando a cultura é realizada como cultura de semente separada e cultura principal, por exemplo, tanto a cultura de semente quanto a cultura principal podem ser realizadas como cultura por lote. Alternativamente, por exemplo, a cultura de semente pode ser realizada como cultura de lote, e a cultura principal pode ser realizada como cultura de lote alimentado ou cultura contínua.

[00148] A cultura pode ser realizada, por exemplo, sob uma condição aeróbica. O termo “condição aeróbica” se refere a uma condição onde a concentração de oxigênio dissolvido no meio líquido não é mais baixa do que 0,33 ppm, que é o limite de detecção para a detecção com um eletrodo de membrana de oxigênio, ou pode preferivelmente se referir a uma condição onde a concentração de oxigênio dissolvido no meio líquido não é mais baixa do que 1,5 ppm. A concentração de oxigênio pode ser controlada para ser, por exemplo, de 5 a 50%, preferivelmente de cerca de 10%, da concentração de oxigênio saturada. Especificamente, a cultura sob uma condição aeróbica pode ser realizada pela cultura aerada, cultura sacudida, cultura agitada, ou uma combinação das mesmas. O pH do meio pode ser, por exemplo, de 3 a 10, preferivelmente de 4,0 a 9,5. Durante a cultura, o pH do meio pode ser ajustado como requerido. O pH do meio pode ser ajustado usando-se várias substâncias alcalinas e ácidas tais como gás amônia, amônia aquosa, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, carbonato de magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, e hidróxido de magnésio. A temperatura de cultura pode ser, por exemplo, de 20 a 45°C, preferivelmente de 25 a 37°C. O período de cultura pode ser, por exemplo, de 10 a 120 horas. A cultura pode ser continuada, por exemplo, até que a fonte de carbono contida no meio seja consumida, ou até que a bactéria da presente invenção perca a atividade. Cultivando-se a bactéria da presente invenção sob tais condições como descritas acima, um L-aminoácido é acumulado no meio.

[00149] Além disso, quando ácido L-glutâmico é produzido, a cultura pode ser realizada usando-se um meio líquido ajustado para satisfazer uma condição sob a qual o ácido L-glutâmico é precipitado, enquanto precipita ácido L-glutâmico no meio. Os exemplos da condição sob as quais o ácido L-glutâmico é precipitado incluem, por exemplo, pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, de modo particularmente preferível em torno do pH 4,0 (EP 1078989 A).

[00150] A produção de um L-aminoácido pode ser confirmada por métodos conhecidos usados para a detecção ou identificação de compostos. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, HPLC, LC/MS, GC/MS, e RMN. Estes métodos podem ser independentemente usados, ou podem ser usados em uma combinação apropriada.

[00151] O L-aminoácido produzido pode ser coletado do caldo de fermentação pelos métodos conhecidos usados para separação e purificação de compostos. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, método da resina de troca iônica (Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710), precipitação, separação por membrana (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 9-164323 e Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 9-173792), e cristalização (WO2008/078448 e WO2008/078646). Estes métodos podem ser independentemente usados, ou podem ser usados em uma combinação apropriada. Quando o L-aminoácido é acumulado nas células bacterianas, as células bacterianas podem ser rompidas com, por exemplo, ondas ultrassônicas ou os semelhantes, e depois o L-aminoácido pode ser coletado pelo método da resina de troca iônica ou os semelhantes a partir do sobrenadante obtido pela remoção das células da suspensão rompida de célula pela centrifugação. O L-aminoácido a ser coletado pode ser um composto livre, um sal do mesmo, ou uma mistura do mesmo. Os exemplos do sal incluem, por exemplo, sulfato, cloridreto, carbonato, sal de amônio, sal de sódio, e sal de potássio. Quando o ácido L- glutâmico é produzido, o ácido L-glutâmico a ser coletado pode ser ácido L-glutâmico livre, L-glutamato de sódio (L-glutamato monossódico, MSG), L-glutamato de amônio (L-glutamato de monoamônio), ou uma mistura destes. Por exemplo, o L-glutamato monossódico (MSG) pode ser obtido adicionando-se um ácido ao caldo de fermentação para cristalizar o L-glutamato de amônio nele contido, e depois adicionando-se um equimolar de hidróxido de sódio aos cristais. Além disso, a descolorização pode ser realizada usando-se carbono ativado antes e/ou depois da cristalização (ver, Tetsuya KAWAKITA, “Industrial Crystallization for Monosodium L-glutamate.”, Bulletin of the Society of Sea Water Science, Japão, Vol. 56:5). O cristal do L-glutamato monossódico pode ser usado como, por exemplo, um tempero umami. O cristal do L-glutamato monossódico também pode ser usado como um tempero em combinação com um ácido nucléico tal como guanilato de sódio (sal dissódico de 5’-GMP) e inosinato de sódio (sal dissódico de 5’-IMP), que também têm sabor umami.

[00152] Quando o L-aminoácido é precipitado no meio, o mesmo pode ser coletado pela centrifugação, filtração, ou os semelhantes. O L-aminoácido precipitado no meio também pode ser isolado junto com o L-aminoácido dissolvido no meio, depois o L-aminoácido dissolvido no meio é cristalizado.

[00153] O L-aminoácido coletado pode conter componentes tais como células bacterianas, componentes de meio, umidade, e metabólitos de subproduto da bactéria além do L-aminoácido. O L-aminoácido coletado também pode ser purificado a um grau desejado. A pureza do L-aminoácido coletado pode ser, por exemplo, de 50 % (p/p) ou mais alta, preferivelmente de 85 % (p/p) ou mais alta, de modo particularmente preferível de 95 % (p/p) ou mais alta (JP1214636B, USP5.431.933, USP4.956.471, USP4.777.051, USP4.946.654, USP5.840.358, USP6.238.714, e US2005/0025878).

Exemplos [00154] A seguir, a presente invenção será mais especificamente explicada com referência aos exemplos. Entretanto, a presente invenção não é limitada por estes exemplos.

Exemplo: Cultura de produção de ácido glutâmico usando a cepa tendo expressão realçada do gene kgtP

[00155] Neste Exemplo, a produção de ácido glutâmico foi realizada usando-se uma cepa produtora do ácido glutâmico de C. glutamicum introduzida com o gene kgtP derivado de E. coli, e o efeito de uma expressão realçada do gene kgtP sobre a produção de ácido glutâmico foi avaliada. O gene kgtP é um gene que codifica um carreador de absorção do ácido α-cetoglutárico (α-KG). (1) Materiais [00156] Os materiais usados neste Exemplo são como segue.

Tabela 1: Iniciadores usados <Plasmídeos usados> pVK9 pVK9-kgtP pVK9-BL_xp pVK9-kgtP-BL_xp <Cepas usada> C. glutamicum 2256AsucAAldhA YggB* C. glutamicum 2256AsucAAldhA YggB*/pVK9 C. glutamicum 2256AsucAAldhA YggB*/pVK9-kgtP C. glutamicum 2256AsucAAldhA YggB*/pVK9-BL_xfp C. glutamicum 2256AsucAAldhA YggB*/pVK9-kgtP-BL_xfp (2) Construção de Plasmídeos e Cepas <Construção de pVK9-kgtP>

[00157] A PCR foi realizada usando o DNA genômico de K-12 MG1655 da E. coli (ATCC 47076) como o padrão, e os iniciadores 1 e 2, para amplificar um fragmento de DNA contendo o gene kgtP derivado da E. coli (GenBank: U00096,3 kgtP-ORF (1299 pares de base)). O fragmento de DNA obtido foi ligado a pVK9 (US2006-0141588) que foi digerido com BamHI e PstI usando-se in-fusion (TaKaRa Inc.), para construir um plasmídeo de expressão do gene kgtP, pVK9-kgtP. A sequência de nucleotídeo do gene kgtP da E. coli K-12 MG1655 e a sequência de aminoácido da proteína KgtP codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 7 e 8, respectivamente. <Construção de pVK9-BL_x/p>

[00158] A PCR foi realizada usando o DNA genômico de Bifidobacterium longum JCM1217 (ATCC 15707) como o padrão, e iniciadores 7 e 8, para amplificar um fragmento de DNA contendo o gene xfp derivado de Bifidobacterium longum JCM1217 (ORF NO: BL0959). O fragmento de DNA obtido foi digerido com XbaI e ligado no sítio XbaI de pVK9 usando-se T4 DNA ligase, para construir um plasmídeo de expressão do gene xfp, pVK9-BL_xfp. A sequência de nucleotídeo do gene xfp de Bifidobacterium longum JCM1217 e a sequência de aminoácido da proteína KgtP codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 9 e 10, respectivamente. <Construção de pVK9-kgtP-BL_χ/p>

[00159] A PCR foi realizada usando o plasmídeo pVK9-kgtP construído acima como o padrão, e iniciadores 3 e 4, para amplificar um fragmento de DNA contendo o vetor e o gene kgtP. Separadamente, a PCR foi realizada usando o plasmídeo pVK9-BL_x/p construído acima como o padrão, e iniciadores 5 e 6, para amplificar um fragmento de DNA contendo o vetor e o gene xfp. Os dois fragmentos de DNA obtidos foram ligados entre si usando-se in-fusion (TaKaRa Inc.), para construir um plasmídeo de co- expressão do gene kgtP e gene xfp, p\K9-kgtP-BL_xfp.

[00160] Os plasmídeos cada um foi introduzido na C. glutamicum 2256AsucAAldhA YggB* (WO2014/185430), para construir cepas tendo uma expressão realçada do gene kgtP e/ou gene xfp. A cepa 2256AsucAAldhA YggB* é uma cepa produtora de ácido glutâmico derivado de C. glutamicum 2256 (ATCC 13869). A cepa 2256AsucAAldhA YggB* é deficiente no gene ldhA e gene sucA, e tem uma mutação IS (V419::IS) no gene YggB. A sequência de nucleotídeo deste gene mutante YggB (V419::IS) e a sequência de aminoácido da proteína mutante YggB codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 13 e 14, respectivamente. (3) Cultura de produção de ácido glutâmico [00161] A cultura de produção de ácido glutâmico foi realizada usando-se cada uma das cepas. As composições de meio usadas são mostradas na Tabela 2.

Tabela 2: Meios usados [00162] Os meios tendo as composições anteriormente mencionadas e ajustados ao pH 8,0 com KOH foram cada um preparados, e esterilizados pela autoclavagem a 115°C por 15 minutos. Depois da esterilização, CaCO3 foi adicionado aos meios em uma quantidade de 50 g/L, e a cultura foi realizada. *Mameno é hidrolisado de proteína de soja.

(3-1) Cultivo 1: Avaliação do efeito de realce único de kgtP

[00163] A cultura (isto é, a pré-cultura e a cultura principal) foi realizada usando-se o meio anteriormente mencionado contendo 50 g/L de CaCO3 contido em tubos de teste grandes com agitação em um agitador de caixa a 31,5 °C. Primeiramente, as cepas cada uma foram cultivadas em Meio 1 por 24 horas como pré-cultura. Depois, o caldo de pré-cultura obtido foi inoculado no Meio 2, para realizar a cultura principal. Um caldo de cultura foi amostrado 23 horas depois da inoculação. A glicose residual e o ácido glutâmico foram quantificados usando-se Biotech Analyzer AS-310 (Sakura SI).

[00164] Os resultados são mostrados na Tabela 3. A subprodução de α-KG foi observada para a cepa de controle 2256AsucAAldhA YggB7pVK9. Ao contrário, foi confirmado que a quantidade de subprodução de α-KG foi diminuída e o acúmulo de ácido glutâmico por açúcar consumido (isto é, rendimento de ácido glutâmico) foi melhorada na cepa kgtP realçada 2256AsucAAldhA YggB*/pVK9-kgtP, quando comparada com a cepa de controle. Portanto, foi considerado que o gene kgtP é um fator eficaz para a produção de ácido glutâmico.

Tabela 3: Avaliação do efeito de realce único de kgtP (3-2) Cultivo 2: Avaliação do efeito da realce de kgtP em cepa xfp realçada [00165] A cultura (isto é, a pré-cultura e a cultura principal) foi realizada usando-se o meio anteriormente mencionado contendo 50 g/L de CaCO3 contidos em tubos de teste grandes com agitação em um agitador de caixa a 31,5 °C. Primeiramente, as cepas cada uma foram cultivadas em Meio 1 por 24 horas como pré-cultura. Depois, o caldo da pré-cultura obtida foi inoculado em Meio 1, para realizar a cultura principal. Um caldo de cultura foi amostrado 16 horas depois da inoculação. A glicose residual e o ácido glutâmico foram quantificados usando-se Biotech Analyzer AS-310 (Sakura SI).

[00166] Os resultados são mostrados na Tabela 4. Foi confirmado que a quantidade de subprodução de α-KG foi aumentada na cepa realçada com xfp 2256AsucAAldhA YggB7pVK9-BL_xfb, quando comparada com a cepa de controle. Ao contrário, foi confirmado que a quantidade de subprodução de α-KG foi diminuído e o acúmulo de ácido glutâmico por açúcar consumido (isto é, rendimento de ácido glutâmico) foi melhorada na cepa realçada tanto do gene kgtP quanto do xfp, 2256AsucAAldhA YggB*/pVK9-kgtP-BL_xfp, quando comparada com a cepa xfp realçada. Portanto, foi considerado que o gene kgtP é um fator eficaz para a produção do ácido glutâmico também sob as condições de xfp realçadas.

Tabela 4: Avaliação do efeito de realce de kgtP na cepa xfp realçada Explicação da Listagem de Sequência [00167] SEQ ID NOS: 1-6: Iniciadores 7: Sequência de nucleotídeo do gene kgtP de Escherichia coli K-12 MG1655 8: Sequência de aminoácido da proteína KgtP de Escherichia coli K-12 MG1655 9: Sequência de nucleotídeo do gene xfp de Bifidobacterium longum JCM1217 10: Sequência de aminoácido da proteína Xfp de Bifidobacterium longum JCM1217 11: Sequência de nucleotídeo do gene YggB de Corinebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) 12: Sequência de aminoácido da proteína YggB de Corinebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) 13: Sequência de nucleotídeo do gene mutante YggB (V419::IS) de Corinebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) 14: Sequência de aminoácido da proteína codificada pelo gene mutante YggB (V419::IS) de Corinebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) 15 e 16: Iniciadores REIVINDICAÇÕES

Claims (18)

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade para produzir L-aminoácido em um meio; e coletar o L-aminoácido do meio, em que a bactéria foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção do ácido α-cetoglutárico (α-KG) seja aumentada quando comparada com uma cepa não modificada, e em que o L-aminoácido é um L-aminoácido da família do glutamato.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o carreador de absorção de α-KG é uma proteína codificada pelo gene kgtP.

3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o carreador de absorção de α-KG é uma proteína definida em (a), (b), ou (c) mencionados abaixo: (a) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8, mas que inclui substituição, deleção, inserção, e/ou adição de 1 a 10 resíduos de aminoácido, e tendo atividade de absorção de α-KG; (c) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido mostrando uma identidade de 90% ou mais alta com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8, e tendo atividade de absorção de α-KG.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a atividade do carreador de absorção de α-KG é aumentada aumentando-se a expressão de um gene que codifica o carreador de absorção de α-KG.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene é aumentada aumentando-se o número de cópia do gene e/ou modificando uma sequência de controle de expressão do gene.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi modificada ainda de modo que a atividade de fosfocetolase fosse aumentada quando comparada com uma cepa não modificada.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a fosfocetolase consiste de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase.

8. Método de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a atividade da fosfocetolase é aumentada aumentando-se a expressão de um gene que codifica a fosfocetolase.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi modificada ainda de modo que a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e/ou succinato desidrogenase fosse reduzida quando comparada com uma cepa não modificada.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactéria Corinebacterium.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Corinebacterium glutamicum.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido da família do glutamato consiste de um ou mais L-aminoácidos selecionados de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-citrulina e L-ornitina.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido da família do glutamato é o ácido L-glutâmico.

14. Método de acordo com as reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o ácido L-glutâmico é o L-glutamato de monoamônio ou L-glutamato monossódico.

15. Método de acordo com as reivindicações 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi modificada ainda de modo a abrigar um gene YggB mutante.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o gene YggB mutante é um gene YggB tendo uma mutação que melhore a capacidade de produzir ácido L-glutâmico da bactéria corineforme.

17. Método de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o gene YggB mutante é um gene YggB tendo uma mutação definida em (1), (2), ou (3) mencionados abaixo: (1) uma mutação na região que codifica os resíduos de aminoácido nas posições 419 a 533 de uma proteína YggB do tipo selvagem, (2) uma mutação na região que codifica uma região de transmembrana de uma proteína YggB do tipo selvagem, e (3) uma combinação dos mesmos.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a proteína YggB do tipo selvagem é uma proteína definida em (a), (b), ou (c) mencionados abaixo: (a) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12, mas que inclui substituição, deleção, inserção, e/ou adição de 1 a 10 resíduos de aminoácido, e tendo uma propriedade que uma expressão aumentada da mesma na bactéria corineforme fornece uma capacidade produtora de ácido L-glutâmico melhorada da bactéria corineforme;(c) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido mostrando uma identidade de 90% ou mais alta com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12, e tendo uma propriedade que uma expressão aumentada da mesma na bactéria corineforme fornece uma capacidade produtora de ácido L-glutâmico melhorada da bactéria corineforme.