TW202233840A - Ｌ－胺基酸之製造法 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供L-麩胺酸等L-胺基酸之製造法。藉由將以具有選自下述(A)～(E)的改良中之1種或其以上的改良之方式進行改良而得之具有L-胺基酸生產能力之棒狀桿菌型細菌(coryneform bacterium)在培養基中進行培養，並從該培養基及/或該細菌的菌體中採取L-胺基酸，而製造L-胺基酸： (A)醋酸激酶的活性增大之改良； (B)果糖-1,6-雙磷酸酶的活性增大之改良； (C)丙酮酸去氫酶的活性降低之改良； (D)天冬胺酸轉胺酶的活性降低之改良； (E)蘋果酸酶的活性降低之改良。

Description

Ｌ－胺基酸之製造法
本發明係關於透過使用細菌之發酵法之L-麩胺酸等L-胺基酸之製造法。L-胺基酸係作為調味料原料等而在產業上有用。
L-胺基酸係藉由例如使用具有L-胺基酸生產能力之細菌等微生物之發酵法來予以工業生產(非專利文獻1)。作為該種微生物，係使用例如從自然界中所分離出之菌株或該等之變異株。此外，可藉由重組DNA技術而使微生物的L-胺基酸生產能力提升。 [先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]明石邦彥等人著 胺基酸發酵，學會出版中心，195～215頁，1986年
[發明所欲解決之課題]
本發明之課題為開發出使細菌的L-胺基酸生產能力提升之新穎的技術，提供有效率的L-胺基酸之製造法。 [解決課題之手段]
本發明者為了解決上述課題而致力進行研究之結果，發現藉由以具有選自下述(A)～(E)的改良中之1種或其以上的改良之方式改良棒狀桿菌型細菌(coryneform bacterium)，便可使同一細菌的L-胺基酸生產能力提升，遂完成本發明： (A)醋酸激酶(acetate kinase)的活性增大之改良； (B)果糖-1,6-雙磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase)的活性增大之改良； (C)丙酮酸去氫酶(pyruvate dehydrogenase)的活性降低之改良； (D)天冬胺酸轉胺酶(aspartate transaminase)的活性降低之改良； (E)蘋果酸酶(malic enzyme)的活性降低之改良。
即，本發明可例示如下。 [1] 一種L-胺基酸之製造方法，其包含 將具有L-胺基酸生產能力之棒狀桿菌型細菌在培養基中進行培養，將L-胺基酸蓄積於該培養基中及/或該細菌的菌體內，以及 從前述培養基及/或前述菌體中採取前述L-胺基酸， 前述L-胺基酸為麩胺酸系L-胺基酸， 前述細菌具有下述(X)及/或(Y)的改良： (X)經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的利用性提升之改良； (Y)細胞內之草醯醋酸池(oxaloacetate pool)增大之改良。 [2] 如前述方法，其中，前述細菌具有至少前述(X)的改良。 [3] 如前述方法，其中， 前述(X)的改良為選自下述(A)、(B)及(C)的改良中之1種或其以上的改良； 前述(Y)的改良為選自下述(D)及(E)的改良中之1種或其以上的改良： (A)醋酸激酶的活性增大之改良； (B)果糖-1,6-雙磷酸酶的活性增大之改良； (C)丙酮酸去氫酶的活性降低之改良； (D)天冬胺酸轉胺酶的活性降低之改良； (E)蘋果酸酶的活性降低之改良。 [4] 一種L-胺基酸之製造方法，其包含 將具有L-胺基酸生產能力之棒狀桿菌型細菌在培養基中進行培養，將L-胺基酸蓄積於該培養基中及/或該細菌的菌體內，以及 從前述培養基及/或前述菌體中採取前述L-胺基酸， 前述L-胺基酸為麩胺酸系L-胺基酸， 前述細菌具有選自下述(A)～(E)的改良中之1種或其以上的改良： (A)醋酸激酶的活性增大之改良； (B)果糖-1,6-雙磷酸酶的活性增大之改良； (C)丙酮酸去氫酶的活性降低之改良； (D)天冬胺酸轉胺酶的活性降低之改良； (E)蘋果酸酶的活性降低之改良。 [5] 如前述方法，其中，前述細菌具有至少前述(A)的改良。 [6] 如前述方法，其中， 前述天冬胺酸轉胺酶係由aspT基因所編碼出； 前述蘋果酸酶係由malE基因所編碼出； 前述丙酮酸去氫酶係由poxB基因所編碼出； 前述醋酸激酶係由ack基因所編碼出；且/或 前述果糖-1,6-雙磷酸酶係由glpX基因所編碼出。 [7] 如前述方法，其中， 前述天冬胺酸轉胺酶的活性係藉由使編碼出天冬胺酸轉胺酶之基因的表現降低或藉由破壞該基因而降低； 前述蘋果酸酶的活性係藉由使編碼出蘋果酸酶之基因的表現降低或藉由破壞該基因而降低； 前述丙酮酸去氫酶的活性係藉由使編碼出丙酮酸去氫酶之基因的表現降低或藉由破壞該基因而降低； 前述醋酸激酶的活性係藉由使編碼出醋酸激酶之基因的表現上升而增大；且/或 前述果糖-1,6-雙磷酸酶的活性係藉由使編碼出果糖-1,6-雙磷酸酶之基因的表現上升而增大。 [8] 如前述方法，其中， 編碼出醋酸激酶之基因的表現係藉由提高該基因的拷貝數及/或改良該基因的表現調節序列而上升；且/或 編碼出果糖-1,6-雙磷酸酶之基因的表現係藉由提高該基因的拷貝數及/或改良該基因的表現調節序列而上升。 [9] 如前述方法，其中， 前述天冬胺酸轉胺酶為下述(1a)、(1b)或(1c)所記載之蛋白質： (1a)包含SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列之蛋白質； (1b)包含在SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列中含有1～10個胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或附加之胺基酸序列，且具有天冬胺酸轉胺酶活性之蛋白質； (1c)包含相對於SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列而言具有90%以上的同一性之胺基酸序列，且具有天冬胺酸轉胺酶活性之蛋白質； 前述蘋果酸酶為下述(2a)、(2b)或(2c)所記載之蛋白質： (2a)包含SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列之蛋白質； (2b)包含在SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列中含有1～10個胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或附加之胺基酸序列，且具有蘋果酸酶活性之蛋白質； (2c)包含相對於SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列而言具有90%以上的同一性之胺基酸序列，且具有蘋果酸酶活性之蛋白質； 前述丙酮酸去氫酶為下述(3a)、(3b)或(3c)所記載之蛋白質： (3a)包含SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列之蛋白質； (3b)包含在SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列中含有1～10個胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或附加之胺基酸序列，且具有丙酮酸去氫酶活性之蛋白質； (3c)包含相對於SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列而言具有90%以上的同一性之胺基酸序列，且具有丙酮酸去氫酶活性之蛋白質； 前述醋酸激酶為下述(4a)、(4b)或(4c)所記載之蛋白質： (4a)包含SEQ ID NO：8或10所示之胺基酸序列之蛋白質； (4b)包含在SEQ ID NO：8或10所示之胺基酸序列中含有1～10個胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或附加之胺基酸序列，且具有醋酸激酶活性之蛋白質； (4c)包含相對於SEQ ID NO：8或10所示之胺基酸序列而言具有90%以上的同一性之胺基酸序列，且具有醋酸激酶活性之蛋白質；且/或 前述果糖-1,6-雙磷酸酶為下述(5a)、(5b)或(5c)所記載之蛋白質： (5a)包含SEQ ID NO：12或14所示之胺基酸序列之蛋白質； (5b)包含在SEQ ID NO：12或14所示之胺基酸序列中含有1～10個胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或附加之胺基酸序列，且具有果糖-1,6-雙磷酸酶活性之蛋白質； (5c)包含相對於SEQ ID NO：12或14所示之胺基酸序列而言具有90%以上的同一性之胺基酸序列，且具有果糖-1,6-雙磷酸酶活性之蛋白質。 [10] 如前述方法，其中，前述細菌係進一步以相較於非改良株而言磷酸酮醇酶的活性增大之方式進行改良。 [11] 如前述方法，其中，前述磷酸酮醇酶為D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶及/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶。 [12] 如前述方法，其中，前述細菌為棒狀桿菌屬( Corynebacterium)細菌。 [13] 如前述方法，其中，前述細菌為麩胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum)。 [14] 如前述方法，其中，前述麩胺酸系L-胺基酸為選自L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-脯胺酸、L-精胺酸、L-瓜胺酸及L-鳥胺酸中之1種或其以上的L-胺基酸。 [15] 如前述方法，其中，前述麩胺酸系L-胺基酸為L-麩胺酸。 [16] 如前述方法，其中，前述L-麩胺酸為L-麩胺酸銨或L-麩胺酸鈉。
以下，詳細地說明本發明。
本發明之方法為一種L-胺基酸之製造方法，其包含將具有L-胺基酸生產能力之棒狀桿菌型細菌在培養基中進行培養，將L-胺基酸蓄積於該培養基中及/或該細菌的菌體內，以及從前述培養基及/或前述菌體中採取前述L-胺基酸，其中，前述細菌係以具有特定的性質之方式進行改良。亦將用於同一方法之細菌稱為「本發明之細菌」。
＜1＞本發明之細菌 本發明之細菌為以具有特定的性質之方式進行改良而得之具有L-胺基酸生產能力之棒狀桿菌型細菌。
＜1-1＞具有L-胺基酸生產能力之細菌 在本發明中，所謂「具有L-胺基酸生產能力之細菌」，係指在培養基中進行培養時，具有生成作為目標之L-胺基酸並蓄積於培養基中及/或菌體內至可回收之程度之能力之細菌。具有L-胺基酸生產能力之細菌可為相比於非改良株而言可將較多量的作為目標之L-胺基酸蓄積於培養基中及/或菌體內之細菌。所謂「非改良株」，係指未以具有特定的性質之方式進行改良之對照株。即，作為非改良株，可列舉野生株或親株。此外，具有L-胺基酸生產能力之細菌亦可為可將較佳為0.5g/L以上，更佳為1.0g/L以上的量的作為目標之L-胺基酸蓄積於培養基中之細菌。
本發明中所製造之L-胺基酸為麩胺酸系L-胺基酸(L-amino acid of glutamate family)。所謂「麩胺酸系L-胺基酸」，係L-麩胺酸及以L-麩胺酸作為中間體所生合成之L-胺基酸的總稱。作為以L-麩胺酸作為中間體所生合成之L-胺基酸，可列舉L-麩醯胺酸、L-脯胺酸、L-精胺酸、L-瓜胺酸、L-鳥胺酸。作為麩胺酸系L-胺基酸，特定而言，可列舉L-麩胺酸。本發明之細菌可僅具有1種L-胺基酸的生產能力，亦可具有2種或其以上的L-胺基酸的生產能力。
在本發明中，「胺基酸」之用語在沒有特別記載之前提下，係意味L-胺基酸。此外，在本發明中，「L-胺基酸」之用語在沒有特別記載之前提下，係意味游離體的L-胺基酸、其鹽或該等之混合物。針對鹽加以後述。
作為棒狀桿菌型細菌，可列舉隸屬於棒狀桿菌屬( Corynebacterium)、短桿菌屬( Brevibacterium)及微桿菌屬( Microbacterium)等屬之細菌。
作為棒狀桿菌型細菌，具體而言，可列舉如下述之種。 嗜醋酸棒狀桿菌( Corynebacterium acetoacidophilum) 醋麩酸棒狀桿菌( Corynebacterium acetoglutamicum) 解烷棒狀桿菌( Corynebacterium alkanolyticum) 帚石南棒狀桿菌( Corynebacterium callunae) 鈍齒棒狀桿菌( Corynebacterium crenatum) 麩胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum) 百合棒狀桿菌( Corynebacterium lilium) 棲糖蜜棒狀桿菌( Corynebacterium melassecola) 熱產胺棒狀桿菌(有效棒狀桿菌)( Corynebacterium thermoaminogenes( Corynebacterium efficiens)) 力士棒狀桿菌( Corynebacterium herculis) 分歧短桿菌(麩胺酸棒狀桿菌)( Brevibacterium divaricatum( Corynebacterium glutamicum)) 黃色短桿菌(麩胺酸棒狀桿菌)( Brevibacterium flavum( Corynebacterium glutamicum)) 未成熟短桿菌(Brevibacterium immariophilum) 乳糖發酵短桿菌(麩胺酸棒狀桿菌)( Brevibacterium lactofermentum( Corynebacterium glutamicum)) 玫瑰色短桿菌( Brevibacterium roseum) 解糖短桿菌( Brevibacterium saccharolyticum) 生硫短桿菌( Brevibacterium thiogenitalis) 產氨棒狀桿菌(停滯棒狀桿菌)( Corynebacterium ammoniagenes( Corynebacterium stationis)) 白色短桿菌( Brevibacterium album) 蠟狀短桿菌( Brevibacterium cerinum) 嗜氨微桿菌( Microbacterium ammoniaphilum)
作為棒狀桿菌型細菌，特定而言，可列舉麩胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum)(舊名稱：乳糖發酵短桿菌( Brevibacterium lactofermentum))。
作為棒狀桿菌型細菌，具體而言，可列舉如下述之菌株。
Figure 02_image001
作為棒狀桿菌型細菌，進一步特定而言，可列舉 Brevibacterium lactofermentum(新名稱： Corynebacterium glutamicum)ATCC 13869。
另外，在棒狀桿菌屬細菌中，亦包含以往被分類成短桿菌屬，但現在被統合成棒狀桿菌屬之細菌(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991))。此外，在停滯棒狀桿菌中，亦包含以往被分類成產氨棒狀桿菌，但藉由16S rRNA的鹼基序列解析等而被重新分類成停滯棒狀桿菌之細菌(Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010))。
此等菌株可例如從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(地址12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)接受分讓。即，已賦予對應於各菌株之登錄編號，可利用此登錄編號接受分讓(參照http：//www.atcc.org/)。對應於各菌株之登錄編號係記載於美國典型培養物保藏中心之目錄。此外，此等菌株可例如得自寄存各菌株之寄存機構。
本發明之細菌可為本來就具有L-胺基酸生產能力者，亦可為以具有L-胺基酸生產能力之方式進行改良而得者。具有L-胺基酸生產能力之細菌可例如藉由對如上述之細菌賦予L-胺基酸生產能力或藉由增強如上述之細菌的L-胺基酸生產能力而取得。
L-胺基酸生產能力的賦予或增強可藉由以往棒狀桿菌型細菌或埃希氏菌屬( Escherichia)細菌等胺基酸生產菌的育種中所採用之方法來施行(參照胺基酸發酵，學會出版中心(股)，1986年5月30日初版發行，第77～100頁)。作為該種方法，可列舉例如營養需求性變異株的取得、L-胺基酸的類似物耐性株的取得、代謝控制變異株的取得、L-胺基酸的生合成系統酵素的活性受到增強之重組株的創製。在L-胺基酸生產菌的育種中，所賦予之營養需求性、類似物耐性、代謝控制變異等性質可為單獨的，亦可為2種或3種以上。此外，在L-胺基酸生產菌的育種中，活性受到增強之L-胺基酸生合成系統酵素亦可為單獨的，亦可為2種或3種以上。再者，亦可將營養需求性、類似物耐性、代謝控制變異等性質的賦予及生合成系統酵素的活性的增強進行組合。
具有L-胺基酸生產能力之營養需求性變異株、類似物耐性株或代謝控制變異株可藉由將親株或野生株供予通常的變異處理，從所獲得之變異株之中，選擇顯示出營養需求性、類似物耐性或代謝控制變異且具有L-胺基酸生產能力者而取得。作為通常的變異處理，可列舉X射線或紫外線的照射、透過N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)等變異劑之處理。
此外，L-胺基酸生產能力的賦予或增強亦可藉由增強參與目標L-胺基酸的生合成之酵素的活性而施行。酵素活性的增強可藉由例如以編碼出同一酵素之基因的表現增強之方式改良細菌而施行。增強基因的表現之方法係記載於WO00/18935或EP1010755A等。針對增強酵素活性之詳細的手法加以後述。
此外，L-胺基酸生產能力的賦予或增強亦可藉由使催化從目標L-胺基酸的生合成路徑分支出而生成目標L-胺基酸以外之化合物之反應之酵素的活性降低而施行。另外，在此處所提及之「催化從目標L-胺基酸的生合成路徑分支出而生成目標L-胺基酸以外之化合物之反應之酵素」中，亦包含參與目標胺基酸的分解之酵素。針對使酵素活性降低之手法加以後述。
以下，針對L-胺基酸生產菌及賦予或增強L-胺基酸生產能力之方法具體地進行例示。另外，如以下所例示之L-胺基酸生產菌所具有之性質及用於賦予或增強L-胺基酸生產能力之改良皆可單獨使用，亦可適宜組合使用。
＜L-麩胺酸生產菌＞ 作為用於賦予或增強L-麩胺酸生產能力之方法，可列舉例如以選自L-麩胺酸生合成系統酵素中之1種或其以上的酵素的活性增大之方式改良細菌之方法。作為該種酵素，並無特別限制，可列舉麩胺酸去氫酶(gdhA)、麩醯胺酸合成酶(glnA)、麩胺酸合酶(gltBD)、異檸檬酸去氫酶(icdA)、烏頭酸水合酶(acnA、acnB)、檸檬酸合酶(gltA)、甲基檸檬酸合酶(prpC)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸去氫酶(aceEF、lpdA)、丙酮酸激酶(pykA、pykF)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸變位酶(pgmA、pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸去氫酶(gapA)、磷酸丙糖異構酶(tpiA)、果糖雙磷酸醛醇酶(fbp)、葡萄糖磷酸異構酶(pgi)、6-磷酸葡萄糖酸脫水酶(edd)、2-酮-3-去氧-6-磷酸葡萄糖酸醛醇酶(eda)、轉氫酶(pntAB)。另外，括號內為編碼出該酵素之基因之一例(在以下記載中亦相同)。在此等酵素之中，較佳係增強例如選自麩胺酸去氫酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及甲基檸檬酸合酶中之1種或其以上的酵素的活性。
作為以麩胺酸合酶基因(gltBD)的表現增大之方式進行改良而得之棒狀桿菌型細菌，可列舉WO99/07853所揭示者。
此外，作為用於賦予或增強L-麩胺酸生產能力之方法，亦可列舉例如以選自催化從L-麩胺酸的生合成路徑分支出而生成L-麩胺酸以外之化合物之反應之酵素中之1種或其以上的酵素的活性降低之方式改良細菌之方法。作為該種酵素，並無特別限制，可列舉異檸檬酸裂解酶(aceA)、α-酮戊二酸去氫酶(sucA、odhA)、乙醯乳酸合酶(ilvI)、甲酸乙醯基轉移酶(pfl)、乳酸去氫酶(ldh)、醇去氫酶(adh)、麩胺酸去羧酶(gadAB)、琥珀酸去氫酶(sdhABCD)。在此等酵素之中，較佳係例如使α-酮戊二酸去氫酶活性降低或缺損。
α-酮戊二酸去氫酶活性降低或缺損之棒狀桿菌型細菌及該等之取得方法係記載於WO2008/075483。作為α-酮戊二酸去氫酶活性降低或缺損之棒狀桿菌型細菌，具體而言，可列舉例如下述株。 Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium lactofermentum)L30-2株(日本專利特開2006-340603) Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium lactofermentum)ΔS株(WO95/34672) Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium lactofermentum)AJ12821(FERM BP-4172；法國專利第9401748號公報) Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium flavum)AJ12822(FERM BP-4173；法國專利第9401748號公報) Corynebacterium glutamicumAJ12823(FERM BP-4174；法國專利第9401748號公報)
此外，作為L-麩胺酸生產菌或用於衍生出該等之親株，亦可列舉α-酮戊二酸去氫酶(sucA)活性及琥珀酸去氫酶(sdh)活性兩者降低或缺損之株(日本專利特開2010-041920)。作為該種株，具體而言，可列舉例如 Corynebacterium glutamicumATCC14067株之odhAsdhA雙重缺損株( Corynebacterium glutamicum8L3GΔSDH株)(日本專利特開2010-041920)。
此外，作為用於賦予或增強L-麩胺酸生產能力之方法，亦可列舉例如增強yhfK基因(WO2005/085419)或ybjL基因(WO2008/133161)等L-麩胺酸排出基因的表現。
此外，作為針對棒狀桿菌型細菌賦予或增強L-麩胺酸生產能力之方法，亦可列舉賦予對有機酸類似物或呼吸阻礙劑等之耐性之方法，或賦予對於細胞壁合成阻礙劑之感受性之方法。作為該種方法，具體而言，可列舉例如賦予單氟醋酸耐性之方法(日本專利特開昭50-113209)、賦予腺嘌呤耐性或胸腺嘧啶耐性之方法(日本專利特開昭57-065198)、使脲酶弱化之方法(日本專利特開昭52-038088)、賦予丙二酸耐性之方法(日本專利特開昭52-038088)、賦予對苯并哌喃酮類或萘醌類之耐性之方法(日本專利特開昭56-1889)、賦予HOQNO耐性之方法(日本專利特開昭56-140895)、賦予α-酮丙二酸耐性之方法(日本專利特開昭57-2689)、賦予胍耐性之方法(日本專利特開昭56-35981)、賦予對於青黴素之感受性之方法(日本專利特開平4-88994)。
作為此種耐性菌或感受性菌之具體例，可列舉如下述之菌株。 Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium flavum) AJ3949(FERM BP-2632；日本專利特開昭50-113209) Corynebacterium glutamicumAJ11628(FERM P-5736；日本專利特開昭57-065198) Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium flavum) AJ11355(FERM P-5007；日本專利特開昭56-1889) Corynebacterium glutamicumAJ11368(FERM P-5020；日本專利特開昭56-1889) Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium flavum) AJ11217(FERM P-4318；日本專利特開昭57-2689) Corynebacterium glutamicumAJ11218(FERM P-4319；日本專利特開昭57-2689) Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium flavum) AJ11564(FERM P-5472；日本專利特開昭56-140895) Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium flavum) AJ11439(FERM P-5136；日本專利特開昭56-35981) Corynebacterium glutamicumH7684(FERM BP-3004；日本專利特開平04-88994) Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium lactofermentum)AJ11426(FERM P-5123；日本專利特開平56-048890) Corynebacterium glutamicumAJ11440(FERM P-5137；日本專利特開平56-048890) Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium lactofermentum)AJ11796(FERM P-6402；日本專利特開平58-158192)
此外，作為針對棒狀桿菌型細菌賦予或增強L-麩胺酸生產能力之方法，亦可列舉增強yggB基因的表現之方法，或導入在編碼區域內導入變異而得之變異型yggB基因之方法(WO2006/070944)。即，本發明之細菌可以yggB基因的表現增大之方式進行改良，亦可以保持(具有)變異型yggB基因之方式進行改良。
yggB基因為編碼出機械式感應通道(mechanosensitive channel)之基因。作為yggB基因，可列舉棒狀桿菌型細菌的yggB基因。作為棒狀桿菌型細菌的yggB基因，具體而言，可列舉例如 Corynebacterium glutamicumATCC13869、 Corynebacterium glutamicumATCC13032、 Corynebacterium glutamicumATCC14967、 Corynebacterium melassecolaATCC17965的yggB基因(WO2006/070944)。 Corynebacterium glutamicumATCC13032的yggB基因在以GenBank Accession No. NC_003450登錄於NCBI資料庫之基因體序列中，相當於1,336,091～1,337,692的序列之互補序列，亦稱為NCgl1221。 Corynebacterium glutamicumATCC13032的yggB基因所編碼出之YggB蛋白質係登錄為GenBank accession No. NP_600492。此外，將 Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的yggB基因的鹼基序列及同一基因所編碼出之YggB蛋白質的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：15及16。
在本發明中，亦將具有後述之「特定的變異」之yggB基因稱為變異型yggB基因，將由其所編碼出之蛋白質稱為變異型YggB蛋白質。此外，在本發明中，亦將不具有後述之「特定的變異」之yggB基因稱為野生型yggB基因，將由其所編碼出之蛋白質稱為野生型YggB蛋白質。另外，就YggB蛋白質而言，亦將由yggB基因中之「特定的變異」所引起之胺基酸序列的變化稱為「特定的變異」。在此處所提及之所謂「野生型」，係方便用於與「變異型」進行區別之記載，在不具有「特定的變異」之前提下，並不限定於天然獲得者。作為野生型YggB蛋白質，可列舉上述所例示之YggB蛋白質，例如具有SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列之蛋白質。此外，作為野生型YggB蛋白質，亦可列舉屬於上述所例示之YggB蛋白質之保守性變體(維持原來的機能之變體)且不具有「特定的變異」者。針對YggB蛋白質之所謂「原來的機能」，例如可為作為機械式感應通道(mechanosensitive channel)之機能，亦可為在棒狀桿菌型細菌中使表現上升時會使棒狀桿菌型細菌的L-麩胺酸生產能力提升之性質。
「特定的變異」只要是使如上述之野生型YggB蛋白質的胺基酸序列發生變化，並使棒狀桿菌型細菌的L-麩胺酸生產能力提升之變異，即無特別限制。作為「特定的變異」，可列舉C末端側變異或跨膜區域的變異(WO2006/070944)。此外，「特定的變異」亦可為該等變異之組合。
(1)C末端側變異 C末端側變異為野生型yggB基因中之編碼出野生型YggB蛋白質的419～533位的胺基酸殘基之區域中之變異。C末端側變異可被導入至同一區域中之1或其以上之處。由C末端側變異所引起之胺基酸序列的變化的種類並無特別限制。C末端側變異可引起例如胺基酸殘基的取代(錯義變異)、胺基酸殘基的插入、胺基酸殘基的缺失、終止密碼子的出現(無義變異)、框移變異或該等之組合。作為C末端側變異，較佳為例如插入序列(以下，亦稱為「IS」)或轉位子等鹼基序列的插入。
(1-1)鹼基序列的插入 作為C末端側變異，可列舉例如在編碼出野生型YggB蛋白質的419位的纈胺酸殘基之處插入鹼基序列之變異(2A-1型變異)。2A-1型變異可引起例如野生型YggB蛋白質的419～533位的胺基酸殘基的一部分或全部的缺失或取代。作為具有2A-1型變異之變異型yggB基因，具體而言，可列舉例如在僅次於SEQ ID NO：15的1255位的「G」之後插入IS，編碼出相比於原來的野生型YggB蛋白質(SEQ ID NO：16)而言較短的全長423個胺基酸殘基的變異型YggB蛋白質之yggB基因。將此變異型yggB基因(V419：：IS)的鹼基序列及同一基因所編碼出之變異型YggB蛋白質(V419：：IS)的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：17及18。SEQ ID NO：17中，1～1269位為變異型YggB蛋白質(V419：：IS)的CDS。作為具有變異型yggB基因(V419：：IS)之L-麩胺酸生產菌，具體而言，可列舉例如 C. glutamicum2256ΔsucAΔldhA yggB *株(WO2014/ 185430)。
(1-2)脯胺酸殘基的取代 作為C末端側變異，亦可列舉例如將存在於野生型YggB蛋白質的419～533位之脯胺酸殘基取代成其他胺基酸之變異。作為該種脯胺酸殘基，可列舉野生型YggB蛋白質的424位、437位、453位、457位、462位、469位、484位、489位、497位、515位、529位及533位的脯胺酸殘基。在該等之中，較佳係將424位及/或437位的脯胺酸殘基取代成其他胺基酸。「其他胺基酸」只要是脯胺酸以外之天然型胺基酸，即無特別限制。作為「其他胺基酸」，可列舉Lys、Glu、Thr、Val、Leu、Ile、Ser、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、Met、Phe、Trp、Tyr、Gly、Ala、His。例如，424位的脯胺酸殘基較佳係可取代成疏水性胺基酸(Ala、Gly、Val、Leu或Ile)，更佳係可取代成分枝鏈胺基酸(Leu、Val或Ile)。此外，例如，437位的脯胺酸殘基較佳係可取代成在側鏈具有羥基之胺基酸(Thr、Ser或Tyr)，更佳係可取代成Ser。
(2)跨膜區域的變異 經推測YggB蛋白質具有5個跨膜區域。跨膜區域係分別相當於野生型YggB蛋白質的1～23位(第1跨膜區域)、25～47位(第2跨膜區域)、62～84位(第3跨膜區域)、86～108位(第4跨膜區域)、110～132位(第5跨膜區域)的胺基酸殘基。跨膜區域的變異為野生型yggB基因中之編碼出此等跨膜區域之區域中之變異。跨膜區域的變異可被導入至同一區域中之1或其以上之處。跨膜區域的變異較佳係引起1或數個胺基酸的取代、缺失、附加、插入或倒位，且未伴隨框移變異及無義變異。所謂「1或數個」，係意味較佳為1～20個，更佳為1～10個，再佳為1～5個，特佳為1～3個。作為跨膜區域的變異，可列舉野生型YggB蛋白質之在14位的白胺酸殘基與15位的色胺酸殘基間插入1或數個胺基酸(例如Cys-Ser-Leu)之變異、將100位的丙胺酸殘基取代成其他胺基酸殘基(例如在側鏈具有羥基之胺基酸(Thr、Ser或Tyr)，較佳為Thr)之變異、將111位的丙胺酸殘基取代成其他胺基酸殘基(例如Val或在側鏈具有羥基之胺基酸(Thr、Ser或Tyr)，較佳為Val或Thr)之變異等。
在本發明中，所謂「野生型YggB蛋白質的X位的胺基酸殘基」，在沒有特別記載之前提下，係意味相當於SEQ ID NO：16中之X位的胺基酸殘基之胺基酸殘基。胺基酸序列中之所謂「X位」，係意味從同一胺基酸序列的N末端算起第X個位置，N末端的胺基酸殘基為1位的胺基酸殘基。另外，胺基酸殘基的位置係表示相對位置，其絕對位置有時會因胺基酸的缺失、插入、附加等而前後變化。例如，所謂「野生型YggB蛋白質的419位的胺基酸殘基」，係意味相當於SEQ ID NO：16中之419位的胺基酸殘基之胺基酸殘基，在相比於419位而言N末端側的1個胺基酸殘基缺失之情況，從N末端起第418個胺基酸殘基係視為「野生型YggB蛋白質的419位的胺基酸殘基」。此外，在相比於419位而言在N末端側插入1個胺基酸殘基之情況，從N末端起第420個胺基酸殘基係視為「野生型YggB蛋白質的419位的胺基酸殘基」。具體而言，例如，在 Corynebacterium glutamicumATCC14967株之YggB蛋白質中，419～529位的胺基酸殘基係相當於野生型YggB蛋白質的419～533位的胺基酸殘基。
在任意的YggB蛋白質的胺基酸序列中，何胺基酸殘基為「相當於SEQ ID NO：16中之X位的胺基酸殘基之胺基酸殘基」可藉由施行該YggB蛋白質的胺基酸序列與SEQ ID NO：16的胺基酸序列之比對而決定。比對可利用例如公知的基因解析軟體來施行。作為具體的軟體，可列舉日立Solutions製的DNASIS或GENETYX製的GENETYX等(Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987)。
變異型yggB基因可藉由以具有上述「特定的變異」之方式改良野生型yggB基因而取得。DNA的改良可藉由公知的手法來施行。具體而言，例如，作為在DNA的目標部位中導入目標變異之部位特異性變異法，可列舉使用PCR之方法(Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press(1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382(1987))或使用噬菌體之方法(Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987))。此外，變異型yggB基因亦可藉由化學合成而取得。
以具有變異型yggB基因之方式改良細菌可藉由將變異型yggB基因導入細菌中而達成。此外，以具有變異型yggB基因之方式改良細菌亦可藉由通過自然變異或變異原處理在細菌所具有之yggB基因中導入變異而達成。
另外，賦予或增強L-麩胺酸的生產能力之方法亦可有效於賦予或增強以L-麩胺酸作為中間體所生合成之L-胺基酸(例如L-麩醯胺酸、L-脯胺酸、L-精胺酸、L-瓜胺酸、L-鳥胺酸)的生產能力。即，具有此等以L-麩胺酸作為中間體所生合成之L-胺基酸的生產能力之細菌可適宜具有如上述之L-麩胺酸生產菌所具有之性質。例如，具有此等以L-麩胺酸作為中間體所生合成之L-胺基酸的生產能力之細菌亦可以α-酮戊二酸去氫酶及/或琥珀酸去氫酶的活性降低之方式進行改良。
＜L-麩醯胺酸生產菌＞ 作為用於賦予或增強L-麩醯胺酸生產能力之方法，可列舉例如以選自L-麩醯胺酸生合成系統酵素中之1種或其以上的酵素的活性增大之方式改良細菌之方法。作為該種酵素，並無特別限制，可列舉麩胺酸去氫酶(gdhA)或麩醯胺酸合成酶(glnA)。另外，麩醯胺酸合成酶的活性亦可藉由破壞麩醯胺酸腺苷醯基轉移酶基因(glnE)或破壞PII控制蛋白質基因(glnB)而增強(EP1229121)。
此外，作為用於賦予或增強L-麩醯胺酸生產能力之方法，亦可列舉例如以選自催化從L-麩醯胺酸的生合成路徑分支出而生成L-麩醯胺酸以外之化合物之反應之酵素中之1種或其以上的酵素的活性降低之方式改良細菌之方法。作為該種酵素，並無特別限制，可列舉麩醯胺酸酶。
作為L-麩醯胺酸生產菌或用於衍生出該等之親株，具體而言，可列舉例如增強麩胺酸去氫酶(gdhA)及/或麩醯胺酸合成酶(glnA)的活性而得之棒狀桿菌型細菌(EP1229121、EP1424398)或麩醯胺酸酶活性降低之棒狀桿菌型細菌(日本專利特開2004-187684)。
此外，作為針對棒狀桿菌型細菌賦予或增強L-麩醯胺酸生產能力之方法，可列舉賦予6-重氮-5-側氧基-正白胺酸耐性之方法(日本專利特開平3-232497)、賦予嘌呤類似物耐性及甲硫胺酸亞碸耐性之方法(日本專利特開昭61-202694)、賦予α-酮丙二酸耐性之方法(日本專利特開昭56-151495)。作為具有L-麩醯胺酸生產能力之棒狀桿菌型細菌，具體而言，可列舉例如以下株。 Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium flavum) AJ11573(FERM P-5492；日本專利特開昭56-151495) Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium flavum) AJ11576(FERM BP-10381；日本專利特開昭56-151495) Corynebacterium glutamicum( Brevibacterium flavum) AJ12212(FERM P-8123；日本專利特開昭61-202694)
＜L-脯胺酸生產菌＞ 作為用於賦予或增強L-脯胺酸生產能力之方法，可列舉例如以選自L-脯胺酸生合成系統酵素中之1種或其以上的酵素的活性增大之方式改良細菌之方法。作為該種酵素，可列舉麩胺酸-5-激酶(proB)、γ-麩胺醯基-磷酸還原酶、吡咯啉-5-羧酸還原酶(putA)。在酵素活性的增強中，可適合地利用例如編碼出L-脯胺酸所引發之反饋抑制已被解除之麩胺酸-5-激酶之proB基因(德國專利第3127361號)。
此外，作為用於賦予或增強L-脯胺酸生產能力之方法，可列舉例如以參與L-脯胺酸分解之酵素的活性降低之方式改良細菌之方法。作為該種酵素，可列舉脯胺酸去氫酶或鳥胺酸胺基轉移酶。
＜L-精胺酸生產菌＞ 作為用於賦予或增強L-精胺酸生產能力之方法，可列舉例如以選自L-精胺酸生合成系統酵素中之1種或其以上的酵素的活性增大之方式改良細菌之方法。作為該種酵素，並無特別限制，可列舉N-乙醯基麩胺酸合酶(argA)、N-乙醯基麩胺酸激酶(argB)、N-乙醯基麩胺醯基磷酸還原酶(argC)、乙醯基鳥胺酸轉胺酶(argD)、乙醯基鳥胺酸去乙醯酶(argE)、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(argF、argI)、精胺基琥珀酸合酶(argG)、精胺基琥珀酸裂解酶(argH)、鳥胺酸乙醯基轉移酶(argJ)、胺甲醯基磷酸合酶(carAB)。作為N-乙醯基麩胺酸合酶(argA)基因，若使用例如編碼出相當於野生型的15位～19位之胺基酸殘基已被取代且L-精胺酸所引發之反饋抑制已被解除之變異型N-乙醯基麩胺酸合酶之基因，則較適合(EP1170361A)。
此外，作為L-精胺酸生產菌或用於衍生出該等之親株，亦可列舉使屬於精胺酸阻遏子之ArgR缺損而得之株(US2002-0045223A)或使細胞內之麩醯胺酸合成酶活性上升而得之株(US2005-0014236A)等棒狀桿菌型細菌。
此外，作為L-精胺酸生產菌或用於衍生出該等之親株，亦可列舉具有對胺基酸類似物等之耐性之棒狀桿菌型細菌之變異株。作為該種株，可列舉例如除了2-噻唑丙胺酸耐性以外，尚具有L-組胺酸、L-脯胺酸、L-蘇胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸或L-色胺酸需求性之株(日本專利特開昭54-44096)；對酮丙二酸、氟丙二酸或單氟醋酸具有耐性之株(日本專利特開昭57-18989)；對精胺醇具有耐性之株(日本專利特公昭62-24075)；對X-胍(X為脂肪鏈或其衍生物)具有耐性之株(日本專利特開平2-186995)；對精胺酸異羥肟酸鹽及6-氮雜尿嘧啶具有耐性之株(日本專利特開昭57-150381)。作為具有L-精胺酸生產能力之棒狀桿菌型細菌之具體例，可列舉如下述之菌株。
Figure 02_image003
＜L-瓜胺酸生產菌及L-鳥胺酸生產菌＞ L-瓜胺酸及L-鳥胺酸為L-精胺酸生合成路徑中之中間體。因此，作為用於賦予或增強L-瓜胺酸及/或L-鳥胺酸的生產能力之方法，可列舉例如以選自L-精胺酸生合成系統酵素中之1或其以上的酵素的活性增大之方式改良細菌之方法。作為該種酵素，並無特別限制，針對L-瓜胺酸，可列舉N-乙醯基麩胺酸合酶(argA)、N-乙醯基麩胺酸激酶(argB)、N-乙醯基麩胺醯基磷酸還原酶(argC)、乙醯基鳥胺酸轉胺酶(argD)、乙醯基鳥胺酸去乙醯酶(argE)、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(argF、argI)、鳥胺酸乙醯基轉移酶(argJ)、胺甲醯基磷酸合酶(carAB)。此外，作為該種酵素，並無特別限制，針對L-鳥胺酸，可列舉N-乙醯基麩胺酸合酶(argA)、N-乙醯基麩胺酸激酶(argB)、N-乙醯基麩胺醯基磷酸還原酶(argC)、乙醯基鳥胺酸轉胺酶(argD)、乙醯基鳥胺酸去乙醯酶(argE)、鳥胺酸乙醯基轉移酶(argJ)。
此外，L-瓜胺酸生產菌可藉由例如從任意的L-精胺酸生產菌，使由argG基因所編碼出之精胺基琥珀酸合酶的活性降低而輕易地獲得。此外，L-鳥胺酸生產菌可藉由例如從任意的L-精胺酸生產菌，使由argF及argI兩基因所編碼出之鳥胺酸胺甲醯基轉移酶的活性降低而輕易地獲得。
此外，作為賦予或增強L-胺基酸生產能力之方法，可列舉例如以從細菌的細胞中排出L-胺基酸之活性增大之方式改良細菌之方法。排出L-胺基酸之活性可藉由例如使編碼出排出L-胺基酸之蛋白質之基因的表現上升而增大。作為編碼出排出各種胺基酸之蛋白質之基因，可列舉例如b2682基因(ygaZ)、b2683基因(ygaH)、b1242基因(ychE)、b3434基因(yhgN)(日本專利特開2002-300874)。
此外，作為賦予或增強L-胺基酸生產能力之方法，可列舉例如以參與醣代謝之蛋白質或參與能量代謝之蛋白質的活性增大之方式改良細菌之方法。
作為參與醣代謝之蛋白質，可列舉參與醣的攝入之蛋白質或醣解系統酵素。作為編碼出參與醣代謝之蛋白質之基因，可列舉葡萄糖-6-磷酸異構酶基因(pgi；WO01/02542)、丙酮酸羧化酶基因(pyc；WO99/18228、EP1092776A)、磷酸葡萄糖變位酶基因(pgm；WO03/04598)、果糖二磷酸醛醇酶基因(pfkB、fbp；WO03/04664)、轉醛醇酶基因(talB；WO03/008611)、富馬酸酶基因(fum；WO01/02545)、非PTS蔗糖攝入基因(csc；EP1149911A)、蔗糖同化性基因(scrAB操縱子；美國專利第7,179,623號)。
作為編碼出參與能量代謝之蛋白質之基因，可列舉轉氫酶基因(pntAB；美國專利第5,830,716號)、細胞色素bo型氧化酶(cytochrome bo type oxidase)基因(cyoB；EP1070376A)。
此外，作為用於賦予或增強L-胺基酸等有用物質的生產能力之方法，亦可列舉例如以磷酸酮醇酶的活性增大之方式改良細菌之方法(WO2006/016705)。即，本發明之細菌可以磷酸酮醇酶的活性增大之方式進行改良。特定而言，同一方法可有效於賦予或增強L-麩胺酸等麩胺酸系L-胺基酸的生產能力。作為磷酸酮醇酶，可列舉D-木酮糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶。D-木酮糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶活性及果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性係可增強任一者，亦可增強兩者。
所謂D-木酮糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶活性，係意味消耗磷酸而將木酮糖-5-磷酸轉換成甘油醛-3-磷酸及乙醯磷酸並釋放出一分子的H 2O之活性。此活性可藉由Goldberg, M.等人的文獻(Methods Enzymol., 9, 515-520(1966))或L. Meile的文獻(J. Bacteriol.(2001)183；2929-2936)所記載之方法來予以測定。作為D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶，可列舉隸屬於醋桿菌屬( Acetobacter)、雙歧桿菌屬( Bifidobacterium)、乳桿菌屬( Lactobacillus)、硫桿菌屬( Thiobacillus)、鏈球菌屬( Streptococcus)、甲基球菌屬( Methylococcus)、丁酸弧菌屬( Butyrivibrio)或纖維桿菌屬( Fibrobacter)之細菌，或隸屬於念珠菌屬( Candida)、紅酵母屬( Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬( Rhodosporidium)、畢赤酵母屬( Pichia)、亞羅酵母屬( Yarrowia)、漢遜酵母屬( Hansenula)、克魯維酵母屬( Kluyveromyces)、酵母屬( Saccharomyces)、絲孢酵母屬( Trichosporon)或溫格酵母屬( Wingea)之酵母之D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶。D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶及編碼出該等之基因之具體例係揭示於WO2006/016705。
此外，所謂果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性，係意味消耗磷酸而將果糖-6-磷酸轉換成赤藻糖-4-磷酸及乙醯磷酸並釋放出一分子的H 2O之活性。此活性可藉由Racker, E.的文獻(Methods Enzymol., 5, 276-280(1962))或L. Meile的文獻(J. Bacteriol.(2001)183；2929-2936)所記載之方法來予以測定。作為果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶，可列舉隸屬於醋桿菌屬、雙歧桿菌屬、綠菌屬( Chlorobium)、布氏桿菌屬( Brucella)、甲基球菌屬或加德納桿菌屬( Gardnerella)之細菌，或隸屬於紅酵母屬、念珠菌屬、酵母屬等之酵母之果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶。果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶及編碼出該等之基因之具體例係揭示於WO2006/016705。
亦可能會有由單一種酵素(D-木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶)保持兩種磷酸酮醇酶活性之情形。
L-胺基酸生產菌的育種中所使用之基因及蛋白質可分別具有例如上述所例示之基因及蛋白質等公知的基因及蛋白質的鹼基序列及胺基酸序列。此外，L-胺基酸生產菌的育種中所使用之基因及蛋白質亦可分別為上述所例示之基因及蛋白質等公知的基因及蛋白質之保守性變體。具體而言，例如，L-胺基酸生產菌的育種中所使用之基因在維持原來的機能之前提下，亦可為編碼出在公知的蛋白質的胺基酸序列中具有在1或數個位置之1或數個胺基酸經取代、缺失、插入或附加之胺基酸序列之蛋白質之基因。針對基因及蛋白質之保守性變體，可適用後述之關於標的基因及標的蛋白質之保守性變體之記載。
＜1-2＞特定的性質 本發明之細菌係以具有特定的性質之方式進行改良。本發明之細菌可藉由將具有L-胺基酸生產能力之細菌以具有特定的性質之方式進行改良而取得。此外，本發明之細菌亦可藉由在以具有特定的性質之方式改良細菌後，賦予或增強L-胺基酸生產能力而取得。另外，本發明之細菌亦可為藉由以具有特定的性質之方式進行改良而獲得L-胺基酸生產能力者。本發明之細菌係除了以具有特定的性質之方式進行改良以外，尚可適宜具有例如如上述之L-胺基酸生產菌所具有之性質。用於構築本發明之細菌之改良可以任意的順序來施行。
藉由以具有特定的性質之方式改良細菌，便可使細菌的L-胺基酸生產能力提升，即，可使透過同一細菌之L-胺基酸生產增大。作為「L-胺基酸生產的增大」，可列舉L-胺基酸在培養基中之蓄積量的提升(增大)。
作為特定的性質，可列舉細胞內之草醯醋酸(OAA)池增大之改良。所謂「細胞內之草醯醋酸(OAA)池增大」，可意味細胞內之草醯醋酸(OAA)的蓄積量增大。
此外，作為特定的性質，可列舉經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的利用性提升之改良。所謂「經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的利用性提升」，可意味磷酸酮醇酶路徑的通量(即，經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的代謝量)增大，及/或可生成自經由磷酸酮醇酶路徑所代謝而得之碳源之副產物的蓄積量降低。作為副產物，可列舉醋酸。醋酸可例如因磷酸酮醇酶路徑的通量增大而蓄積。作為經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的利用性提升之改良，可列舉磷酸酮醇酶路徑的通量增大之改良或醋酸的同化性提升之改良。
此外，作為特定的性質，可列舉以下(A)～(E)的改良： (A)醋酸激酶(acetate kinase)的活性增大之改良； (B)果糖-1,6-雙磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase)的活性增大之改良； (C)丙酮酸去氫酶(pyruvate dehydrogenase)的活性降低之改良； (D)天冬胺酸轉胺酶(aspartate transaminase)的活性降低之改良； (E)蘋果酸酶(malic enzyme)的活性降低之改良。
上述(D)及(E)的改良可為細胞內之草醯醋酸(OAA)池增大之改良之一例。上述(A)、(B)及(C)的改良可為經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的利用性提升之改良之一例。具體而言，上述(A)及(C)的改良可為醋酸的同化性提升之改良之一例。具體而言，上述(B)的改良可為磷酸酮醇酶路徑的通量增大之改良之一例。
本發明之細菌可具有選自上述所例示之性質中之1種或其以上的性質。
本發明之細菌可具有例如細胞內之草醯醋酸(OAA)池增大之改良及/或經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的利用性提升之改良。本發明之細菌可具有例如至少經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的利用性提升之改良。即，具體而言，本發明之細菌例如在細胞內之草醯醋酸(OAA)池增大之改良及經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的利用性提升之改良之內，可僅具有經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的利用性提升之改良，亦可具有經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的利用性提升之改良及細胞內之草醯醋酸(OAA)池增大之改良之組合。
本發明之細菌可具有例如細胞內之草醯醋酸(OAA)池增大之改良、磷酸酮醇酶路徑的通量增大之改良及/或醋酸的同化性提升之改良。本發明之細菌可具有例如至少醋酸的同化性提升之改良。即，具體而言，本發明之細菌例如在細胞內之草醯醋酸(OAA)池增大之改良、磷酸酮醇酶路徑的通量增大之改良及醋酸的同化性提升之改良之內，可僅具有醋酸的同化性提升之改良，亦可具有醋酸的同化性提升之改良以及細胞內之草醯醋酸(OAA)池增大之改良及/或磷酸酮醇酶路徑的通量增大之改良之組合。
本發明之細菌可具有例如選自上述(A)～(E)的改良中之1種或其以上，例如1種、2種、3種、4種或全部5種的改良。具體而言，本發明之細菌可具有例如(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(A)+(B)、(A)+(C)、(A)+(D)、(A)+(E)、(B)+(C)、(B)+(D)、(B)+(E)、(C)+(D)、(C)+ (E)、(D)+(E)、(A)+(B)+(C)、(A)+(B)+(D)、(A)+(B) +(E)、(A)+(C)+(D)、(A)+(D)+(E)、(B)+(C)+(D)、(B)+(C)+(E)、(B)+(D)+(E)、(C)+(D)+(E)、(A)+(B)+(C)+ (D)、(A)+(B)+(C)+(E)、(A)+(B)+(D)+(E)、(A)+(C)+(D) +(E)、(B)+(C)+(D)+(E)、(A)+(B)+(C)+(D)+(E)的改良。所謂「(A)+(B)的改良」，係意味(A)的改良及(B)的改良之組合。此說明亦可適用於其他組合。本發明之細菌可具有例如至少上述(A)的改良。即，具體而言，本發明之細菌例如在上述(A)～(E)的改良之內，可僅具有上述(A)的改良，亦可具有上述(A)的改良以及選自上述(B)～(E)的改良中之1種或其以上，例如1種、2種、3種或全部4種的改良之組合。此外，本發明之細菌亦可具有例如至少上述(B)的改良。
所謂「天冬胺酸轉胺酶(aspartate transaminase)」，可意味具有催化天冬胺酸及/或麩胺酸的胺基轉移反應之活性之蛋白質(例如EC 2.6.1.1)。亦將同一活性稱為「天冬胺酸轉胺酶活性」。具體而言，天冬胺酸轉胺酶活性可為催化將L-天冬胺酸及α-酮戊二酸轉換成草醯醋酸及L-麩胺酸之反應及/或其逆反應之活性。亦將天冬胺酸轉胺酶稱為「麩胺酸草醯醋酸轉胺酶(glutamic-oxaloacetic transaminase)」。亦將編碼出天冬胺酸轉胺酶之基因稱為「天冬胺酸轉胺酶基因」。作為天冬胺酸轉胺酶基因，可列舉aspT基因。所改良之細菌所具有之aspT基因等天冬胺酸轉胺酶基因的鹼基序列及由該等所編碼出之AspT蛋白質等天冬胺酸轉胺酶的胺基酸序列可例如從NCBI等公開資料庫中取得。將 Corynebacterium glutamicumATCC 13869的aspT基因(CGBL_0102840)的鹼基序列及同一基因所編碼出之蛋白質的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：1及2。
所謂「蘋果酸酶(malic enzyme)」，可意味具有催化蘋果酸的氧化去羧反應之活性之蛋白質(例如EC EC 1.1.1.38、EC 1.1.1.39或EC 1.1.1.40)。亦將同一活性稱為「蘋果酸酶活性」。具體而言，蘋果酸酶活性可為在電子受體的存在下催化將蘋果酸進行去羧而生成丙酮酸之反應之活性。作為電子受體，可列舉NAD +或NADP +。蘋果酸酶只要可利用至少1種電子受體即可。蘋果酸酶亦可進一步具有催化草醯醋酸的去羧反應(具體而言，將草醯醋酸轉換成丙酮酸及二氧化碳之反應)之活性。亦將蘋果酸酶稱為「蘋果酸去氫酶(malate dehydrogenase)」。亦將編碼出蘋果酸酶之基因稱為「蘋果酸酶基因」。作為蘋果酸酶基因，可列舉malE基因。所改良之細菌所具有之malE基因等蘋果酸酶基因的鹼基序列及由該等所編碼出之MalE蛋白質等蘋果酸酶的胺基酸序列可例如從NCBI等公開資料庫中取得。將 Corynebacterium glutamicumATCC 13869的malE基因(CGBL_0129850)的鹼基序列及同一基因所編碼出之蛋白質的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：3及4。
所謂「丙酮酸去氫酶(pyruvate dehydrogenase)」，可意味具有催化丙酮酸的氧化去羧反應之活性之蛋白質(例如EC 1.2.5.1)。亦將同一活性稱為「丙酮酸去氫酶活性」。具體而言，丙酮酸去氫酶活性可為在電子受體的存在下催化將丙酮酸進行去羧而生成醋酸之反應之活性。作為電子受體，可列舉泛醌等醌。丙酮酸去氫酶只要可利用至少1種電子受體即可。亦將編碼出丙酮酸去氫酶之基因稱為「丙酮酸去氫酶基因」。作為丙酮酸去氫酶基因，可列舉poxB基因。所改良之細菌所具有之poxB基因等丙酮酸去氫酶基因的鹼基序列及由該等所編碼出之PoxB蛋白質等丙酮酸去氫酶的胺基酸序列可例如從NCBI等公開資料庫中取得。將 Corynebacterium glutamicumATCC 13869的poxB基因(CGBL_0125410)的鹼基序列及同一基因所編碼出之蛋白質的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：5及6。
所謂「醋酸激酶(acetate kinase)」，可意味具有催化醋酸的磷酸化反應之活性之蛋白質(例如EC 2.7.2.1)。亦將同一活性稱為「醋酸激酶活性」。具體而言，醋酸激酶活性可為在磷酸基供體的存在下催化將醋酸進行磷酸化而生成乙醯磷酸之反應之活性。作為磷酸基供體，可列舉ATP。醋酸激酶只要可利用至少1種磷酸基供體即可。亦將編碼出醋酸激酶之基因稱為「醋酸激酶基因」。作為醋酸激酶基因，可列舉ack基因。作為ack基因等醋酸激酶基因，可列舉棒狀桿菌型細菌或隸屬於腸內細菌科之細菌等各種生物的基因。作為ack基因，具體而言，可列舉 Corynebacterium glutamicum或 E. coli的ack基因。各種生物的ack基因等醋酸激酶基因的鹼基序列及由該等所編碼出之Ack蛋白質等醋酸激酶的胺基酸序列可例如從NCBI等公開資料庫中取得。將 Corynebacterium glutamicumATCC 13869的ack基因(CGBL_0126910)的鹼基序列及同一基因所編碼出之蛋白質的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：7及8。將 E. coliMG1655的ack基因的鹼基序列及同一基因所編碼出之蛋白質的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：9及10。
所謂「果糖-1,6-雙磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase)」，可意味具有催化果糖-1,6-雙磷酸的去磷酸化反應之活性之蛋白質(例如EC 3.1.3.11)。亦將同一活性稱為「果糖-1,6-雙磷酸酶活性」。具體而言，果糖-1,6-雙磷酸酶活性可為催化將果糖-1,6-雙磷酸轉換成果糖-6-磷酸之反應之活性。亦將編碼出果糖-1,6-雙磷酸酶之基因稱為「果糖-1,6-雙磷酸酶基因」。作為果糖-1,6-雙磷酸酶基因，可列舉glpX基因。作為glpX基因等果糖-1,6-雙磷酸酶基因，可列舉棒狀桿菌型細菌或隸屬於腸內細菌科之細菌等各種生物的基因。作為glpX基因，具體而言，可列舉 Corynebacterium glutamicum或 E. coli的glpX基因。各種生物的glpX基因等果糖-1,6-雙磷酸酶基因的鹼基序列及由該等所編碼出之GlpX蛋白質等果糖-1,6-雙磷酸酶的胺基酸序列可例如從NCBI等公開資料庫中取得。將 Corynebacterium glutamicumATCC 13032的glpX基因(NCgl0976)的鹼基序列及同一基因所編碼出之蛋白質的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：11及12。將 E. coliMG1655的glpX基因的鹼基序列及同一基因所編碼出之蛋白質的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：13及14。
針對使蛋白質的活性降低之手法加以後述。蛋白質的活性可例如藉由使編碼出同一蛋白質之基因的表現降低或藉由破壞同一基因而降低。此種使蛋白質的活性降低之手法可單獨使用或適宜組合使用。
針對使蛋白質的活性增大之手法加以後述。蛋白質的活性可例如藉由使編碼出同一蛋白質之基因的表現上升而增大。基因的表現可例如藉由提高基因的拷貝數或藉由改良基因的表現調節序列而上升。此種使蛋白質的活性增大之手法可單獨使用或適宜組合使用。
亦將在特定的性質中活性降低或增大之蛋白質總稱為「標的蛋白質」。亦將編碼出標的蛋白質之基因總稱為「標的基因」。
標的基因可例如為具有上述所例示之標的基因的鹼基序列(例如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13所示之鹼基序列)之基因。此外，標的蛋白質可例如為具有上述所例示之標的蛋白質的胺基酸序列(例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14所示之胺基酸序列)之蛋白質。另外，「具有(胺基酸或鹼基)序列」之表達方式在沒有特別記載之前提下，係意味該「包含(胺基酸或鹼基)序列」，亦含括該「由(胺基酸或鹼基)序列所構成」之情況。
標的基因在維持原來的機能之前提下，亦可為上述所例示之標的基因(例如具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13所示之鹼基序列之基因)之變體。同樣地，標的蛋白質在維持原來的機能之前提下，亦可為上述所例示之標的蛋白質(例如具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14所示之胺基酸序列之蛋白質)之變體。另外，有將該種維持原來的機能之變體稱為「保守性變體」之情形。「aspT基因」、「malE基因」、「poxB基因」、「ack基因」及「glpX基因」之用語係分別視為除了上述所例示之aspT基因、malE基因、poxB基因、ack基因及glpX基因以外，尚含括該等之保守性變體。同樣地，「AspT蛋白質」、「MalE蛋白質」、「PoxB蛋白質」、「Ack蛋白質」及「GlpX蛋白質」之用語係分別視為除了上述所例示之AspT蛋白質、MalE蛋白質、PoxB蛋白質、Ack蛋白質及GlpX蛋白質以外，尚含括該等之保守性變體。作為保守性變體，可列舉例如上述所例示之標的基因或標的蛋白質之同源物或人為改良體。
所謂「維持原來的機能」，係指基因或蛋白質之變體具有對應於原來的基因或蛋白質的機能(例如活性或性質)之機能(例如活性或性質)。針對基因之所謂「維持原來的機能」，係指基因之變體編碼出維持原來的機能之蛋白質。即，針對各標的基因之所謂「維持原來的機能」，可意味基因之變體編碼出具有下列各標的蛋白質的活性之蛋白質：針對天冬胺酸轉胺酶而言為天冬胺酸轉胺酶活性；針對蘋果酸酶而言為蘋果酸酶活性；針對丙酮酸去氫酶而言為丙酮酸去氫酶活性；針對醋酸激酶而言為醋酸激酶活性；針對果糖-1,6-雙磷酸酶而言為果糖-1,6-雙磷酸酶活性。此外，針對各標的蛋白質之所謂「維持原來的機能」，可意味蛋白質之變體具有下列各標的蛋白質的活性：針對天冬胺酸轉胺酶而言為天冬胺酸轉胺酶活性；針對蘋果酸酶而言為蘋果酸酶活性；針對丙酮酸去氫酶而言為丙酮酸去氫酶活性；針對醋酸激酶而言為醋酸激酶活性；針對果糖-1,6-雙磷酸酶而言為果糖-1,6-雙磷酸酶活性。
天冬胺酸轉胺酶活性可藉由例如將酵素與所對應之基質(例如L-天冬胺酸及α-酮戊二酸)進行保溫培養，測定酵素及基質依賴性對應之產物(例如草醯醋酸及L-麩胺酸)的生成而予以測定。
蘋果酸酶活性可藉由例如在電子受體的存在下將酵素與所對應之基質(例如蘋果酸)進行保溫培養，測定酵素及基質依賴性對應之產物(例如丙酮酸)的生成而予以測定。
丙酮酸去氫酶活性可藉由例如在電子受體的存在下將酵素與所對應之基質(例如丙酮酸)進行保溫培養，測定酵素及基質依賴性對應之產物(例如醋酸)的生成而予以測定。
醋酸激酶活性可藉由例如在磷酸基供體的存在下將酵素與所對應之基質(例如醋酸)進行保溫培養，測定酵素及基質依賴性對應之產物(例如乙醯磷酸)的生成而予以測定。
果糖-1,6-雙磷酸酶活性可藉由例如將酵素與所對應之基質(例如果糖-1,6-雙磷酸)進行保溫培養，測定酵素及基質依賴性對應之產物(例如果糖-6-磷酸)的生成而予以測定。
以下，針對保守性變體予以例示。
標的基因之同源物或標的蛋白質之同源物可藉由例如使用上述所例示之標的基因的鹼基序列或上述所例示之標的蛋白質的胺基酸序列作為查詢序列之BLAST檢索或FASTA檢索而從公開資料庫中輕易地取得。此外，標的基因之同源物可藉由例如以各種生物的染色體當作模板並使用基於此等公知的標的基因的鹼基序列所製作而得之寡核苷酸作為引子之PCR而取得。
標的基因在維持原來的機能之前提下，亦可為編碼出在上述胺基酸序列(例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14所示之胺基酸序列)中具有在1或數個位置之1或數個胺基酸經取代、缺失、插入及/或附加之胺基酸序列之蛋白質之基因。例如，所編碼出之蛋白質亦可延長或縮短其N末端及/或C末端。另外，上述所謂「1或數個」，亦依胺基酸殘基在蛋白質的立體結構中之位置或種類而有所不同，具體而言，係意味例如1～50個、1～40個、1～30個，較佳為1～20個，更佳為1～10個，再佳為1～5個，特佳為1～3個。
上述1或數個胺基酸的取代、缺失、插入及/或附加為正常地維持蛋白質的機能之保守性變異。保守性變異之具代表性者為保守性取代。所謂保守性取代，在取代部位為芳香族胺基酸之情況，係在Phe、Trp、Tyr間互相取代之變異，在取代部位為疏水性胺基酸之情況，係在Leu、Ile、Val間互相取代之變異，在極性胺基酸之情況，係在Gln、Asn間互相取代之變異，在鹼性胺基酸之情況，係在Lys、Arg、His間互相取代之變異，在酸性胺基酸之情況，係在Asp、Glu間互相取代之變異，在持有羥基之胺基酸之情況，係在Ser、Thr間互相取代之變異。作為被視為保守性取代之取代，具體而言，可列舉從Ala向Ser或Thr之取代、從Arg向Gln、His或Lys之取代、從Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp之取代、從Asp向Asn、Glu或Gln之取代、從Cys向Ser或Ala之取代、從Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg之取代、從Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp之取代、從Gly向Pro之取代、從His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr之取代、從Ile向Leu、Met、Val或Phe之取代、從Leu向Ile、Met、Val或Phe之取代、從Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg之取代、從Met向Ile、Leu、Val或Phe之取代、從Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu之取代、從Ser向Thr或Ala之取代、從Thr向Ser或Ala之取代、從Trp向Phe或Tyr之取代、從Tyr向His、Phe或Trp之取代及從Val向Met、Ile或Leu之取代。此外，在如上述之胺基酸的取代、缺失、插入或附加中，亦包含因基於基因來源之生物的個體差、物種的差異之情況等天然產生之變異(mutant或variant)所產生者。
此外，標的基因在維持原來的機能之前提下，亦可為編碼出相對於上述胺基酸序列整體而言具有例如50%以上、65%以上、80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再佳為97%以上，特佳為99%以上的同一性之胺基酸序列之蛋白質之基因。
此外，標的基因在維持原來的機能之前提下，亦可為在嚴格的條件下會與從上述鹼基序列(例如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13所示之鹼基序列)所調製獲得之探針，例如相對於上述鹼基序列的整體或一部分之互補序列進行雜交之基因(例如DNA)。所謂「嚴格的條件」，係指會形成所謂的特異性雜交物且不會形成非特異性雜交物之條件。若示出一例，可列舉同一性較高的DNA彼此，例如具有50%以上、65%以上、80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再佳為97%以上，特佳為99%以上的同一性之DNA彼此會進行雜交，且同一性比其低的DNA彼此不會進行雜交之條件；或者在通常的南方雜交(Southern hybridization)之清洗條件，即相當於60℃、1×SSC、0.1%SDS，較佳為60℃、0.1×SSC、0.1%SDS，更佳為68℃、0.1×SSC、0.1%SDS之鹽濃度及溫度下洗淨1次，較佳為2～3次之條件。
如上述，用於上述雜交之探針亦可為基因之互補序列的一部分。該種探針可藉由以基於公知的基因序列所製作而得之寡核苷酸作為引子並以包含上述基因之DNA片段作為模板之PCR而予以製作。例如，作為探針，可使用300bp左右的長度的DNA片段。在使用300bp左右的長度的DNA片段作為探針之情況，作為雜交之清洗條件，可列舉50℃、2×SSC、0.1%SDS。
此外，由於密碼子的簡併性係依宿主而有所不同，因而標的基因亦可為將任意的密碼子取代成與其等價的密碼子而得者。即，標的基因亦可為由遺傳密碼的簡併所造成之上述所例示之標的基因之變體。例如，標的基因可以因應於所使用之宿主的密碼子使用頻率而具有最適的密碼子之方式進行改良。
另外，胺基酸序列間之所謂「同一性」，係意味藉由blastp使用預設設定的Scoring Parameters (Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence=11, Extension=1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment)所算出之胺基酸序列間之同一性。此外，鹼基序列間之所謂「同一性」，係意味藉由blastn使用預設設定的Scoring Parameters (Match/Mismatch Scores=1,-2；Gap Costs=Linear)所算出之鹼基序列間之同一性。
另外，關於上述基因或蛋白質之保守性變體之記載亦可適用於L-胺基酸生合成系統酵素等任意的蛋白質及編碼出該等之基因。
＜1-3＞使蛋白質的活性增大之手法 以下，針對使蛋白質的活性增大之手法加以說明。
所謂「蛋白質的活性增大」，係意味同一蛋白質的活性相較於非改良株而言增大。所謂「蛋白質的活性增大」，具體而言，係意味同一蛋白質的每細胞之活性相較於非改良株而言增大。在此處所提及之所謂「非改良株」，係意味未以標的蛋白質的活性增大之方式進行改良之對照株。作為非改良株，可列舉野生株或親株。作為非改良株，具體而言，可列舉各細菌種之基準株(type strain)。此外，作為非改良株，具體而言，亦可列舉在細菌的說明中所例示之菌株。即，在一態樣中，蛋白質的活性可相較於基準株(即，本發明之細菌所隸屬之種之基準株)而言增大。此外，在另一態樣中，蛋白質的活性亦可相較於 C. glutamicumATCC 13869株而言增大。此外，在另一態樣中，蛋白質的活性亦可相較於 C. glutamicumATCC 13032株而言增大。此外，在另一態樣中，蛋白質的活性亦可相較於 C. glutamicumAJ12036(FERM BP-734)而言增大。此外，在另一態樣中，蛋白質的活性亦可相較於 C. glutamicumYDK010株而言增大。另外，亦將「蛋白質的活性增大」稱為「蛋白質的活性受到增強」。所謂「蛋白質的活性增大」，更具體而言，可意味相較於非改良株而言，同一蛋白質的每細胞之分子數增加，及/或同一蛋白質的每分子之機能增大。即，提及「蛋白質的活性增大」之情況之所謂「活性」，並不限於蛋白質的催化活性，亦可意味編碼出蛋白質之基因的轉錄量(mRNA量)或轉譯量(蛋白質的量)。所謂「蛋白質的每細胞之分子數」，可意味同一蛋白質的分子數之每細胞之平均值。此外，在「蛋白質的活性增大」中，不僅含括在原本具有標的蛋白質的活性之菌株中使同一蛋白質的活性增大，亦含括對原本不存在標的蛋白質的活性之菌株賦予同一蛋白質的活性。此外，在就結果而言蛋白質的活性增大之前提下，亦可使宿主本來所具有之標的蛋白質的活性降低或消失之後，再賦予適合的標的蛋白質的活性。
蛋白質的活性的增大程度只要蛋白質的活性相較於非改良株而言增大，即無特別限制。蛋白質的活性可上升至例如非改良株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。此外，在非改良株不具有標的蛋白質的活性之情況，只要藉由導入編碼出同一蛋白質之基因而生成同一蛋白質即可，例如，同一蛋白質可被生產至可測定其活性之程度。
蛋白質的活性增大之改良可藉由例如使編碼出同一蛋白質之基因的表現上升而達成。所謂「基因的表現上升」，係意味同一基因的表現相較於野生株或親株等非改良株而言增大。所謂「基因的表現上升」，具體而言，係意味同一基因的每細胞之表現量相較於非改良株而言增大。所謂「基因的每細胞之表現量」，可意味同一基因的表現量之每細胞之平均值。所謂「基因的表現上升」，更具體而言，可意味基因的轉錄量(mRNA量)增大，及/或基因的轉譯量(蛋白質的量)增大。另外，亦將「基因的表現上升」稱為「基因的表現受到增強」。基因的表現可上升至例如非改良株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。此外，在「基因的表現上升」中，不僅含括在原本標的基因會進行表現之菌株中使同一基因的表現量上升，亦含括在原本標的基因不會進行表現之菌株中使同一基因進行表現。即，所謂「基因的表現上升」，亦可意味例如在未保持標的基因之菌株中導入同一基因，使同一基因進行表現。
基因的表現的上升可藉由例如使基因的拷貝數增加而達成。
基因的拷貝數的增加可藉由向宿主的染色體導入同一基因而達成。基因向染色體之導入可利用例如同源重組來施行(Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory)。作為利用同源重組之基因導入法，可列舉例如Red驅動整合(Red-driven integration)法(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97：6640-6645(2000))等使用直鏈狀DNA之方法、使用包含溫度感受性複製起點之質體之方法、使用能夠接合轉移之質體之方法、使用未持有在宿主內發揮機能之複製起點之自殺載體之方法、使用噬菌體之轉導(transduction)法。具體而言，藉由以包含標的基因之重組DNA將宿主進行轉形，與宿主的染色體上之標的部位發生同源重組，便可將該基因導入宿主的染色體上。用於同源重組之重組DNA的結構只要是以所期望的態樣發生同源重組者，即無特別限制。例如，藉由以包含標的基因之線狀DNA將宿主進行轉形，該線狀DNA為在該基因的兩端分別具備與染色體上之標的部位的上游及下游同源的鹼基序列之線狀DNA，使其在標的部位的上游及下游分別發生同源重組，便可將標的部位取代成該基因。用於同源重組之重組DNA可具備用於選擇轉形體之標記基因。基因可僅導入1個拷貝，亦可導入2個拷貝或其以上。例如，可藉由以在染色體上存在多數個拷貝之鹼基序列作為標的來施行同源重組而向染色體導入基因的多數個拷貝。作為在染色體上存在多數個拷貝之鹼基序列，可列舉重複DNA序列(repetitive DNA)、存在於轉位子的兩端之反向重複序列。此外，亦可以目標物質的生產所不需要的基因等染色體上之適當的鹼基序列作為標的來施行同源重組。此外，基因亦可使用轉位子或Mini-Mu隨機地導入染色體上(日本專利特開平2-109985號公報、US5,882,888、EP805867B1)。另外，此種利用同源重組之染色體的改良手法並不限於標的基因的導入，可利用於表現調節序列的改良等染色體的任意改良。
已在染色體上導入標的基因的確認可藉由使用持有與同一基因的全部或一部分互補的序列之探針之南方雜交或使用基於同一基因的序列所作成之引子之PCR等來進行確認。
此外，基因的拷貝數的增加亦可藉由將包含同一基因之載體導入宿主中而達成。例如，藉由將包含標的基因之DNA片段與在宿主中發揮機能之載體進行連結而構築同一基因的表現載體，並以該表現載體將宿主進行轉形，便可使同一基因的拷貝數增加。包含標的基因之DNA片段可藉由例如以具有標的基因之微生物的基因體DNA作為模板之PCR而取得。作為載體，可使用能夠在宿主的細胞內自主複製之載體。載體較佳為多拷貝載體。此外，為了選擇轉形體，載體較佳係具有抗生物質耐性基因等標記。此外，載體亦可具備用於表現所插入之基因之啟動子或終止子。載體可例如為源自細菌質體之載體、源自酵母質體之載體、源自噬菌體之載體、黏質體(cosmid)或噬質體(phagemid)等。作為能夠在棒狀桿菌型細菌中自主複製之載體，具體而言，可列舉例如pHM1519(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；將此等進行改良而得之具有藥劑耐性基因之質體；pCRY30(日本專利特開平3-210184)；pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及pCRY3KX(日本專利特開平2-72876、美國專利5,185,262號)；pCRY2及pCRY3(日本專利特開平1-191686)；pAJ655、pAJ611及pAJ1844(日本專利特開昭58-192900)；pCG1(日本專利特開昭57-134500)；pCG2(日本專利特開昭58-35197)；pCG4及pCG11(日本專利特開昭57-183799)；pVK7(日本專利特開平10-215883)；pVK9(US2006-0141588)；pVC7(日本專利特開平9-070291)；pVS7 (WO2013/069634)。
在導入基因之情況，基因只要能夠進行表現地保持於宿主中即可。具體而言，基因只要以接受透過在宿主中發揮機能之啟動子之控制而進行表現之方式加以保持即可。啟動子只要是在宿主中發揮機能者，即無特別限制。所謂「在宿主中發揮機能之啟動子」，係指在宿主中具有啟動子活性之啟動子。啟動子可為源自宿主之啟動子，亦可為源自異種之啟動子。啟動子可為所導入之基因的固有的啟動子，亦可為其他基因的啟動子。作為啟動子，亦可利用例如如後述之更強力的啟動子。
在基因的下游，可配置用於終結轉錄之終止子。終止子只要是在宿主中發揮機能者，即無特別限制。終止子可為源自宿主之終止子，亦可為源自異種之終止子。終止子可為所導入之基因的固有的終止子，亦可為其他基因的終止子。
關於能夠在各種微生物中加以利用之載體、啟動子、終止子，係詳細地記載於例如「微生物學基礎講座8 基因工學，共立出版，1987年」，能夠利用該等。
此外，在導入2種或其以上的基因之情況，各基因只要能夠進行表現地保持於宿主中即可。例如，各基因可全部保持於單一表現載體上，亦可全部保持於染色體上。此外，各基因可個別保持於複數個表現載體上，亦可個別保持於單一或複數個表現載體上及染色體上。此外，亦可以2種或其以上的基因構成操縱子而進行導入。作為「導入2種或其以上的基因之情況」，可列舉例如導入分別編碼出2種或其以上的蛋白質(例如酵素)之基因之情況、導入分別編碼出構成單一蛋白質複合體(例如酵素複合體)之2種或其以上的次單元之基因之情況及該等之組合。
所導入之基因只要是編碼出在宿主中發揮機能之蛋白質者，即無特別限制。所導入之基因可為源自宿主之基因，亦可為源自異種之基因。所導入之基因可例如使用基於同一基因的鹼基序列所設計而得之引子，以具有同一基因之生物的基因體DNA或搭載同一基因之質體等作為模板，藉由PCR而取得。此外，所導入之基因亦可例如基於同一基因的鹼基序列而予以全合成(Gene, 60(1), 115-127(1987))。所取得之基因可依原樣或加以適宜改良而利用。即，藉由改良基因，便可取得其變體。基因的改良可藉由公知的手法來施行。例如，藉由部位特異性變異法，便可在DNA的目標部位中導入目標變異。即，例如，藉由部位特異性變異法，便可以所編碼出之蛋白質在特定的部位包含胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或附加之方式改良基因的編碼區域。作為部位特異性變異法，可列舉使用PCR之方法(Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press(1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382(1987))或使用噬菌體之方法(Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987))。或者，亦可全合成基因之變體。
另外，在蛋白質係以由複數種次單元所構成之複合體之形式發揮機能之情況，在就結果而言蛋白質的活性增大之前提下，可改良該等複數種次單元全部，亦可僅改良一部分。即，例如，在藉由使基因的表現上升而使蛋白質的活性增大之情況，可增強編碼出該等次單元之複數種基因全部的表現，亦可僅增強一部分的表現。通常，較佳係增強編碼出該等次單元之複數種基因全部的表現。此外，構成複合體之各次單元在複合體具有標的蛋白質的機能之前提下，可源自1種生物，亦可源自2種或其以上的不同生物。即，例如，可將編碼出複數種次單元之源自同一種生物之基因導入宿主中，亦可將分別源自不同生物之基因導入宿主中。
此外，基因的表現的上升可藉由使基因的轉錄效率提升而達成。此外，基因的表現的上升可藉由使基因的轉譯效率提升而達成。基因的轉錄效率或轉譯效率的提升可藉由例如改良表現調節序列而達成。所謂「表現調節序列」，係影響基因的表現之部位的總稱。作為表現調節序列，可列舉例如啟動子、Shine-Dalgarno(SD)序列(亦稱為核糖體結合部位(RBS))及RBS與起始密碼子之間之間隔區域。表現調節序列可使用啟動子檢索載體或GENETYX等基因解析軟體來決定。此等表現調節序列的改良可藉由例如使用溫度感受性載體之方法或Red驅動整合法(WO2005/010175)來施行。
基因的轉錄效率的提升可藉由例如將染色體上之基因的啟動子取代成更強力的啟動子而達成。所謂「更強力的啟動子」，係意味基因的轉錄相比於原本存在之野生型啟動子而言提升之啟動子。作為可在棒狀桿菌型細菌中加以利用之更強力的啟動子，可列舉例如人為設計變更而得之P54-6啟動子(Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679(2000))、可在棒狀桿菌型細菌內以醋酸、乙醇、丙酮酸等進行誘導之pta、aceA、aceB、adh、amyE啟動子、屬於在棒狀桿菌型細菌內表現量較多的強力的啟動子之cspB、SOD、tuf(EF-Tu)啟動子(Journal of Biotechnology 104(2003)311-323；Appl Environ Microbiol. 2005 Dec；71(12)：8587-96.)、lac啟動子、tac啟動子、trc啟動子。此外，作為更強力的啟動子，亦可藉由使用各種報導基因而取得原有的啟動子之高活性型者。例如，藉由使啟動子區域內之-35、-10區域接近於共有序列，便可提高啟動子的活性(國際公開第00/18935號)。作為高活性型啟動子，可列舉各種tac樣啟動子(Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574)或pnlp8啟動子(WO2010/027045)。啟動子的強度的評估法及強力的啟動子之例係記載於Goldstein等人的論文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128(1995))等。
基因的轉譯效率的提升可藉由例如將染色體上之基因的Shine-Dalgarno(SD)序列(亦稱為核糖體結合部位(RBS))取代成更強力的SD序列而達成。所謂「更強力的SD序列」，係意味mRNA的轉譯相比於原本存在之野生型SD序列而言提升之SD序列。作為更強力的SD序列，可列舉例如源自噬菌體T7之基因10的RBS(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。再者，已知RBS與起始密碼子之間之間隔區域，特定而言，起始密碼子所緊鄰之上游的序列(5’-UTR)中之數個核苷酸的取代或插入或缺失對mRNA的安定性及轉譯效率極度帶來影響，亦可藉由改良此等而使基因的轉譯效率提升。
基因的轉譯效率的提升亦可藉由例如改良密碼子而達成。例如，藉由將存在於基因中之稀有密碼子置換成以更高頻率利用之同義密碼子，便可使基因的轉譯效率提升。即，所導入之基因可例如以因應於所使用之宿主的密碼子使用頻率而具有最適的密碼子之方式進行改良。密碼子的取代可藉由例如部位特異性變異法來施行。此外，亦可全合成密碼子經取代之基因片段。多種生物中之密碼子的使用頻率係揭示於「密碼子使用資料庫」(http：//www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292(2000))。
此外，基因的表現的上升亦可藉由將使基因的表現上升之調節子進行增幅或將使基因的表現降低之調節子進行缺失或弱化而達成。
如上述之使基因的表現上升之手法可單獨使用，亦可以任意的組合使用。
此外，蛋白質的活性增大之改良亦可藉由例如增強蛋白質的比活性而達成。在比活性的增強中，亦包含反饋抑制的脫敏(desensitization to feedback inhibition)。比活性受到增強之蛋白質可例如探索多種生物而取得。此外，亦可藉由在原有的蛋白質中導入變異而取得高活性型者。所導入之變異可例如為在蛋白質的1或數個位置之1或數個胺基酸經取代、缺失、插入及/或附加者。變異的導入可藉由例如如上述之部位特異性變異法來施行。此外，變異的導入亦可藉由例如突變處理來施行。作為突變處理，可列舉X射線的照射、紫外線的照射以及透過N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)及甲磺酸甲酯(MMS)等變異劑之處理。此外，亦可在活體外(in vitro)將DNA直接以羥基胺進行處理，誘發隨機變異。比活性的增強可單獨使用，亦可與如上述之增強基因的表現之手法任意地組合使用。
轉形的方法並無特別限定，可使用以往所知的方法。作為棒狀桿菌型細菌的轉形的方法，可列舉原生質體法(Gene, 39, 281-286(1985))、電穿孔法(Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989))、電脈衝法(日本專利特開平2-207791號公報)。
蛋白質的活性已增大可藉由測定同一蛋白質的活性而予以確認。
蛋白質的活性已增大亦可藉由確認編碼出同一蛋白質之基因的表現已上升而予以確認。基因的表現已上升可藉由確認同一基因的轉錄量已上升或確認由同一基因所表現之蛋白質的量已上升而予以確認。
基因的轉錄量已上升的確認可藉由將由同一基因所轉錄之mRNA的量與野生株或親株等非改良株進行比較而施行。作為評估mRNA的量之方法，可列舉北方雜交(Northern hybridization)、RT-PCR、微陣列、RNA-seq等(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001)。mRNA的量(例如每細胞之分子數)可上升至例如非改良株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。
蛋白質的量已上升的確認可使用抗體藉由西方墨點法(Western blot)來施行(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001)。蛋白質的量(例如每細胞之分子數)可上升至例如非改良株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。
上述之使蛋白質的活性增大之手法可利用於任意蛋白質的活性增強或任意基因的表現增強。
＜1-4＞使蛋白質的活性降低之手法 以下，針對使蛋白質的活性降低之手法加以說明。
所謂「蛋白質的活性降低」，係意味同一蛋白質的活性相較於非改良株而言降低。所謂「蛋白質的活性降低」，具體而言，係意味同一蛋白質的每細胞之活性相較於非改良株而言降低。在此處所提及之所謂「非改良株」，係意味未以標的蛋白質的活性降低之方式進行改良之對照株。作為非改良株，可列舉野生株或親株。作為非改良株，具體而言，可列舉各細菌種之基準株(type strain)。此外，作為非改良株，具體而言，亦可列舉在細菌的說明中所例示之菌株。即，在一態樣中，蛋白質的活性可相較於基準株(即，本發明之細菌所隸屬之種之基準株)而言降低。此外，在另一態樣中，蛋白質的活性亦可相較於 C. glutamicumATCC 13869株而言降低。此外，在另一態樣中，蛋白質的活性亦可相較於 C. glutamicumATCC 13032株而言降低。此外，在另一態樣中，蛋白質的活性亦可相較於 C. glutamicumAJ12036(FERM BP-734)而言降低。此外，在另一態樣中，蛋白質的活性亦可相較於 C. glutamicumYDK010株而言降低。另外，在「蛋白質的活性降低」中，亦含括同一蛋白質的活性完全地消失之情況。所謂「蛋白質的活性降低」，更具體而言，可意味相較於非改良株而言，同一蛋白質的每細胞之分子數降低，及/或同一蛋白質的每分子之機能降低。即，提及「蛋白質的活性降低」之情況之所謂「活性」，並不限於蛋白質的催化活性，亦可意味編碼出蛋白質之基因的轉錄量(mRNA量)或轉譯量(蛋白質的量)。所謂「蛋白質的每細胞之分子數」，可意味同一蛋白質的分子數之每細胞之平均值。另外，在「蛋白質的每細胞之分子數降低」中，亦含括同一蛋白質完全不存在之情況。此外，在「蛋白質的每分子之機能降低」中，亦含括同一蛋白質的每分子之機能完全地消失之情況。蛋白質的活性的降低程度只要蛋白質的活性相較於非改良株而言降低，即無特別限制。蛋白質的活性可降低至例如非改良株的50%以下、20%以下、10%以下、5%以下或0%。
蛋白質的活性降低之改良可藉由例如使編碼出同一蛋白質之基因的表現降低而達成。所謂「基因的表現降低」，係意味同一基因的表現相較於野生株或親株等非改良株而言降低。所謂「基因的表現降低」，具體而言，係意味同一基因的每細胞之表現量相較於非改良株而言降低。所謂「基因的每細胞之表現量」，可意味同一基因的表現量之每細胞之平均值。所謂「基因的表現降低」，更具體而言，可意味基因的轉錄量(mRNA量)降低，及/或基因的轉譯量(蛋白質的量)降低。在「基因的表現降低」中，亦含括同一基因完全不表現之情況。另外，亦將「基因的表現降低」稱為「基因的表現受到弱化」。基因的表現可降低至例如非改良株的50%以下、20%以下、10%以下、5%以下或0%。
基因的表現的降低可例如由轉錄效率的降低所造成，亦可由轉譯效率的降低所造成，亦可由該等之組合所造成。基因的表現的降低可藉由例如改良基因的啟動子、Shine-Dalgarno(SD)序列(亦稱為核糖體結合部位(RBS))、RBS與起始密碼子之間之間隔區域等表現調節序列而達成。在改良表現調節序列之情況，表現調節序列較佳係改良1個鹼基以上，更佳為2個鹼基以上，特佳為3個鹼基以上。基因的轉錄效率的降低可藉由例如將染色體上之基因的啟動子取代成更弱的啟動子而達成。所謂「更弱的啟動子」，係意味基因的轉錄相較於原本存在之野生型啟動子而言弱化之啟動子。作為更弱的啟動子，可列舉例如誘導型啟動子。即，誘導型啟動子可在非誘導條件下(例如在誘導物質不存在下)作為更弱的啟動子發揮機能。此外，亦可使表現調節序列的一部分或全部區域發生缺失(缺損)。此外，基因的表現的降低亦可藉由例如操作與表現控制相關之因子而達成。作為與表現控制相關之因子，可列舉與轉錄或轉譯控制相關之低分子(誘導物質、阻礙物質等)、蛋白質(轉錄因子等)、核酸(siRNA等)等。此外，基因的表現的降低亦可藉由例如在基因的編碼區域中導入基因的表現降低之變異而達成。例如，藉由將基因的編碼區域的密碼子置換成在宿主中以更低頻率利用之同義密碼子，便可使基因的表現降低。此外，藉由例如如後述之基因的破壞，基因的表現本身便可降低。
此外，蛋白質的活性降低之改良可藉由例如破壞編碼出同一蛋白質之基因而達成。所謂「基因受到破壞」，係意味以不會產生正常地發揮機能之蛋白質之方式改良同一基因。在「不會產生正常地發揮機能之蛋白質」中，含括完全不由同一基因產生蛋白質之情況，或由同一基因產生每分子之機能(例如活性或性質)降低或消失之蛋白質之情況。
基因的破壞可藉由例如使染色體上之基因發生缺失(缺損)而達成。所謂「基因的缺失」，係指基因的編碼區域的一部分或全部區域的缺失。再者，亦可包含染色體上之基因的編碼區域之前後的序列在內，使基因整體發生缺失。在基因的編碼區域之前後的序列中，可包含例如基因的表現調節序列。在可達成蛋白質的活性的降低之前提下，所缺失之區域可為N末端區域(編碼出蛋白質的N末端側之區域)、內部區域、C末端區域(編碼出蛋白質的C末端側之區域)等中之任何區域。通常，所缺失之區域越長，越可確實地將基因予以去活化。所缺失之區域可例如為基因的編碼區域全長的10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上或95%以上的長度的區域。此外，所缺失之區域之前後的序列較佳係閱讀框不一致。由於閱讀框的不一致，可在所缺失之區域的下游發生框移。
此外，基因的破壞亦可藉由例如在染色體上之基因的編碼區域中導入胺基酸取代(錯義變異)、導入終止密碼子(無義變異)或導入1～2個鹼基的附加或缺失(框移變異)等而達成(Journal of Biological Chemistry 272：8611-8617(1997)；Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998)；Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991))。
此外，基因的破壞亦可藉由例如在染色體上之基因的編碼區域插入其他鹼基序列而達成。插入部位可為基因的任何區域，所插入之鹼基序列越長，越可確實地將基因予以去活化。此外，插入部位之前後的序列較佳係閱讀框不一致。由於閱讀框的不一致，可在插入部位的下游發生框移。作為其他鹼基序列，只要是使所編碼出之蛋白質的活性降低或消失者，即無特別限制，可列舉例如抗生物質耐性基因等標記基因或有用於目標物質的生產之基因。
特定而言，基因的破壞可以所編碼出之蛋白質的胺基酸序列發生缺失(缺損)之方式實施。換言之，蛋白質的活性降低之改良可例如藉由使蛋白質的胺基酸序列(胺基酸序列的一部分或全部區域)發生缺失，具體而言，藉由以編碼出經缺失胺基酸序列(胺基酸序列的一部分或全部區域)之蛋白質之方式改良基因而達成。另外，所謂「蛋白質的胺基酸序列的缺失」，係指蛋白質的胺基酸序列的一部分或全部區域的缺失。此外，所謂「蛋白質的胺基酸序列的缺失」，係指在蛋白質中原來的胺基酸序列變得不存在，亦含括原來的胺基酸序列變化成另一胺基酸序列之情況。即，例如，藉由框移而變化成另一胺基酸序列之區域可視為已發生缺失之區域。由於蛋白質的胺基酸序列的缺失，典型地，蛋白質的全長會縮短，但亦可能會有蛋白質的全長沒有變化或延長之情形。例如，藉由基因的編碼區域的一部分或全部區域的缺失，便可在所編碼出之蛋白質的胺基酸序列中，使該已發生缺失之區域所編碼出之區域發生缺失。此外，例如，藉由終止密碼子向基因的編碼區域之導入，便可在所編碼出之蛋白質的胺基酸序列中，使該導入部位起下游的區域所編碼出之區域發生缺失。此外，例如，藉由基因的編碼區域中之框移，便可使該框移部位所編碼出之區域發生缺失。針對胺基酸序列的缺失中之所缺失之區域的位置及長度，可適用基因的缺失中之所缺失之區域的位置及長度的說明。
如上述改良染色體上之基因可藉由例如下列方式來達成：製作以不會產生正常地發揮機能之蛋白質之方式進行改良而得之破壞型基因，以包含該破壞型基因之重組DNA將宿主進行轉形，使其在破壞型基因與染色體上之野生型基因發生同源重組，藉此將染色體上之野生型基因取代成破壞型基因。此時，若在重組DNA中依照宿主的營養需求性等性狀而預先包含標記基因，則易於操作。作為破壞型基因，可列舉經缺失基因的編碼區域的一部分或全部區域之基因、經導入錯義變異之基因、經導入無義變異之基因、經導入框移變異之基因、經插入轉位子或標記基因等插入序列之基因。由破壞型基因所編碼出之蛋白質即便生成，亦具有與野生型蛋白質不同的立體結構，機能降低或消失。用於同源重組之重組DNA的結構只要是以所期望的態樣發生同源重組者，即無特別限制。例如，藉由以包含破壞型基因之線狀DNA將宿主進行轉形，該線狀DNA為在兩端分別具備染色體上之野生型基因的上游及下游的序列之線狀DNA，使其在野生型基因的上游及下游分別發生同源重組，便可將野生型基因取代成破壞型基因。透過此種利用同源重組之基因取代之基因破壞已確立，有被稱為「Red驅動整合(Red-driven integration)」之方法(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97：6640-6645(2000))、將Red驅動整合法及源自λ噬菌體之切除系統(Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184：5200-5203(2002))進行組合而得之方法(參照WO2005/010175號)等使用直鏈狀DNA之方法，或使用包含溫度感受性複製起點之質體之方法、使用能夠接合轉移之質體之方法、使用未持有在宿主內發揮機能之複製起點之自殺載體之方法等(美國專利第6303383號、日本專利特開平05-007491號)。另外，此種利用同源重組之染色體的改良手法並不限於標的基因的破壞，可利用於表現調節序列的改良等染色體的任意改良。
此外，蛋白質的活性降低之改良亦可藉由例如突變處理來施行。作為突變處理，可列舉X射線的照射、紫外線的照射以及透過N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)及甲磺酸甲酯(MMS)等變異劑之處理。
另外，在蛋白質係以由複數種次單元所構成之複合體之形式發揮機能之情況，在就結果而言蛋白質的活性降低之前提下，可改良該等複數種次單元全部，亦可僅改良一部分。即，例如，可將編碼出該等次單元之複數種基因全部進行破壞等，亦可僅將一部分進行破壞等。此外，在於蛋白質中存在複數種同功酶之情況，在就結果而言蛋白質的活性降低之前提下，可使複數種同功酶全部的活性降低，亦可僅使一部分的活性降低。即，例如，可將編碼出該等同功酶之複數種基因全部進行破壞等，亦可僅將一部分進行破壞等。
如上述之使蛋白質的活性降低之手法可單獨使用，亦可以任意的組合使用。
蛋白質的活性已降低可藉由測定同一蛋白質的活性而予以確認。
蛋白質的活性已降低亦可藉由確認編碼出同一蛋白質之基因的表現已降低而予以確認。基因的表現已降低可藉由確認同一基因的轉錄量已降低或確認由同一基因所表現之蛋白質的量已降低而予以確認。
基因的轉錄量已降低的確認可藉由將由同一基因所轉錄之mRNA的量與非改良株進行比較而施行。作為評估mRNA的量之方法，可列舉北方雜交、RT-PCR、微陣列、RNA-seq等(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001)。mRNA的量(例如每細胞之分子數)可降低至例如非改良株的50%以下、20%以下、10%以下、5%以下或0%。
蛋白質的量已降低的確認可使用抗體藉由西方墨點法來施行(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001)。蛋白質的量(例如每細胞之分子數)可降低至例如非改良株的50%以下、20%以下、10%以下、5%以下或0%。
基因已受到破壞可因應用於破壞之手段，藉由決定同一基因的一部分或全部鹼基序列、限制酵素圖譜或全長等而予以確認。
上述之使蛋白質的活性降低之手法可利用於任意蛋白質的活性降低或任意基因的表現降低。
＜2＞本發明之L-胺基酸之製造方法 本發明之方法為一種L-胺基酸之製造方法，其包含將本發明之細菌在培養基中進行培養，將L-胺基酸蓄積於該培養基中及/或該細菌的菌體內，以及從前述培養基及/或前述菌體中採取前述L-胺基酸。針對L-胺基酸，係如上述。在本發明中，可製造1種L-胺基酸，亦可製造2種或其以上的L-胺基酸。
所使用之培養基在本發明之細菌可進行增殖，且生產出目標L-胺基酸之前提下，並無特別限制。作為培養基，可使用例如用於棒狀桿菌型細菌等細菌的培養之通常的培養基。作為培養基，可使用例如視需要含有選自碳源、氮源、磷酸源、硫源、其他各種有機成分或無機成分中之成分之培養基。培養基成分的種類或濃度可因應所使用之細菌的種類等諸條件而適宜設定。
作為碳源，具體而言，可列舉例如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、廢糖蜜、澱粉水解物、生質的水解物等醣類；醋酸、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸類；甘油、粗甘油、乙醇等醇類；脂肪酸類。作為碳源，特定而言，可列舉醣類。作為碳源，進一步特定而言，可列舉葡萄糖或果糖。葡萄糖或果糖等醣類可單獨地或與其他碳源進行組合而用作碳源。作為碳源，亦可使用例如以果糖作為構成醣之醣。作為以果糖作為構成醣之醣，可列舉果糖、蔗糖、果寡糖。以果糖作為構成醣之醣可單獨地或與其他碳源進行組合而用作碳源。另外，作為碳源，可適合地使用源自植物之原料。作為植物，可列舉例如玉米、米、小麥、大豆、甘蔗、甜菜、棉。作為源自植物之原料，可列舉例如根、莖、幹、枝、葉、花、種子等器官、包含該等之植物體、該等植物器官的分解產物。源自植物之原料的利用形態並無特別限制，可以例如未加工品、榨汁、粉碎物、精製物等任何形態進行利用。此外，木糖等五碳醣、葡萄糖等六碳醣或該等之混合物可例如從植物生質中取得並加以利用。具體而言，此等醣類可藉由將植物生質供予水蒸氣處理、濃酸水解、稀酸水解、透過纖維素酶等酵素之水解、鹼處理等處理而取得。另外，一般而言，半纖維素相比於纖維素而言較易於水解，因而亦可預先將植物生質中之半纖維素進行水解而使五碳醣游離，接著，將纖維素進行水解而生成六碳醣。此外，木糖亦可例如使本發明之細菌保有從葡萄糖等六碳醣向木糖之轉換路徑，藉由從六碳醣之轉換而供給。作為碳源，可使用1種碳源，亦可組合使用2種或其以上的碳源。
作為氮源，具體而言，可列舉例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等銨鹽；蛋白腖、酵母萃取物、肉萃取物、大豆蛋白質分解物等有機氮源；氨、脲。亦可將用於pH調整之氨氣或氨水利用作為氮源。作為氮源，可使用1種氮源，亦可組合使用2種或其以上的氮源。
作為磷酸源，具體而言，可列舉例如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽；焦磷酸等磷酸聚合物。作為磷酸源，可使用1種磷酸源，亦可組合使用2種或其以上的磷酸源。
作為硫源，具體而言，可列舉例如硫酸鹽、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽等無機硫化合物；半胱胺酸、胱胺酸、麩胱甘肽等含硫胺基酸。作為硫源，可使用1種硫源，亦可組合使用2種或其以上的硫源。
作為其他各種有機成分或無機成分，具體而言，可列舉例如氯化鈉、氯化鉀等無機鹽類；鐵、錳、鎂、鈣等微量金屬類；維生素B1、維生素B2、維生素B6、菸鹼酸、菸鹼酸醯胺、維生素B12等維生素類；胺基酸類；核酸類；含有此等之蛋白腖、酪蛋白胺基酸、酵母萃取物、大豆蛋白質分解物等有機成分。作為其他各種有機成分或無機成分，可使用1種成分，亦可組合使用2種或其以上的成分。
此外，在使用在生長中需要胺基酸等之營養需求性變異株之情況，較佳係補添培養基所需要之營養素。
此外，亦較佳係限制培養基中之生物素量，或在培養基中添加界面活性劑或青黴素。
培養條件在本發明之細菌可進行增殖，且生產出目標L-胺基酸之前提下，並無特別限制。培養可例如在用於棒狀桿菌型細菌等細菌的培養之通常的條件下施行。培養條件可因應所使用之細菌的種類等諸條件而適宜設定。
培養可使用液體培養基來施行。在培養時，可將本發明之細菌在瓊脂培養基等固體培養基中進行培養並將所得之物直接接種至液體培養基中，亦可將本發明之細菌在液體培養基中進行種培養並將所得之物接種至主培養用的液體培養基中。即，培養亦可分成種培養及主培養而施行。在此情況，種培養及主培養的培養條件可相同，亦可不同。在培養開始時培養基中所含有之本發明之細菌的量並無特別限制。主培養可藉由例如將種培養液1～50%(v/v)植菌至主培養的培養基中而施行。
培養可藉由批式培養(batch culture)、饋料批式培養(fed-batch culture)、連續培養(continuous culture)或該等之組合來實施。另外，亦將培養開始時之培養基稱為「初始培養基」。此外，亦將在饋料批式培養或連續培養中供給至培養系統(發酵槽)之培養基稱為「饋料批式培養基」。此外，亦將在饋料批式培養或連續培養中將饋料批式培養基供給至培養系統稱為「批式饋料」。另外，在將培養分成種培養及主培養而施行之情況，可例如皆以批式培養施行種培養及主培養。此外，亦可例如以批式培養施行種培養，以饋料批式培養或連續培養施行主培養。
在本發明中，各培養基成分可含在初始培養基、饋料批式培養基或該兩者中。初始培養基中所含有之成分的種類與饋料批式培養基中所含有之成分的種類可相同，亦可不同。此外，初始培養基中所含有之各成分的濃度與饋料批式培養基中所含有之各成分的濃度可相同，亦可不同。此外，亦可使用所含有之成分的種類及/或濃度不同的2種或其以上的饋料批式培養基。例如，在間歇地施行複數次批式饋料之情況，各次饋料批式培養基中所含有之成分的種類及/或濃度可相同，亦可不同。
培養基中之碳源的濃度在本發明之細菌可進行增殖，且生產出L-胺基酸之前提下，並無特別限制。培養基中之碳源的濃度例如在不會阻礙L-胺基酸的生產之範圍中可盡可能地提高。培養基中之碳源的濃度例如就初始濃度(初始培養基中之濃度)而言，可為1～30w/v%，較佳為3～10w/v%。此外，亦可適宜將碳源額外地添加至培養基中。例如，亦可因應隨著發酵的進行之碳源的消耗，將碳源額外地添加至培養基中。
培養可例如在好氧條件下施行。所謂好氧條件，係指液體培養基中之溶氧濃度為屬於透過氧膜電極之檢測極限之0.33ppm以上，較佳係可為1.5ppm以上。氧濃度亦可控制於例如相對於飽和氧濃度而言5～50%，較佳為10%左右。具體而言，在好氧條件下之培養可以通氣培養、振盪培養、攪拌培養或該等之組合來施行。培養基的pH值可例如為pH3～10，較佳為pH4.0～9.5。在培養中，可視需要調整培養基的pH值。培養基的pH值可使用氨氣、氨水、碳酸鈉、重碳酸鈉、碳酸鉀、重碳酸鉀、碳酸鎂、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂等各種鹼性或酸性物質來予以調整。培養溫度可例如為20～40℃，較佳為25℃～37℃。培養期可例如為10小時～120小時。培養亦可繼續進行至例如培養基中之碳源被消耗為止，或本發明之細菌的活性消失為止。藉由在此種條件下培養本發明之細菌，L-胺基酸便蓄積於培養基中及/或菌體內。
此外，在製造L-麩胺酸之情況，亦可使用已調整成L-麩胺酸析出之條件之液體培養基，一面使L-麩胺酸在培養基中析出，一面施行培養。作為L-麩胺酸析出之條件，可列舉例如pH5.0～4.0，較佳為pH4.5～4.0，再佳為pH4.3～4.0，特佳為pH4.0的條件(EP1078989A)。此外，在使用已調整成L-麩胺酸析出之條件之液體培養基之情況，藉由將泛酸添加至培養基中，便可效率更佳地進行晶析(WO2004/111258)。此外，在使用已調整成L-麩胺酸析出之條件之液體培養基之情況，藉由將L-麩胺酸的結晶作為種晶添加至培養基中，便可效率更佳地進行晶析(EP1233069A)。此外，在使用已調整成L-麩胺酸析出之條件之液體培養基之情況，藉由將L-麩胺酸的結晶及L-離胺酸的結晶作為種晶添加至培養基中，便可效率更佳地進行晶析(EP1624069A)。
此外，在製造鹼性胺基酸之情況，培養步驟(發酵步驟)亦可以重碳酸離子及/或碳酸離子成為鹼性胺基酸之相對離子之方式實施。亦將該種發酵形態稱為「碳酸鹽發酵」。根據碳酸鹽發酵，可在消減以往被利用作為鹼性胺基酸之相對離子之硫酸離子及/或氯化物離子的使用量之同時，發酵生產鹼性胺基酸。碳酸鹽發酵可例如以US2002-025564A、EP1813677A、日本專利特開2002-65287所記載之方式實施。
發酵液可例如以液體旋風器進行處理。作為液體旋風器，可使用例如呈一般的形狀，圓筒部直徑為10～110mm之陶瓷製、不鏽鋼製或樹脂製者。發酵液向液體旋風器之饋送量可例如因應發酵液中之菌體濃度或L-胺基酸濃度而設定。發酵液向液體旋風器之饋送量可例如為2～1200L/分鐘。
L-胺基酸已生成可藉由用於化合物的檢測或鑑定之公知的手法來予以確認。作為該種手法，可列舉例如HPLC、LC/MS、GC/MS、NMR。此等手法可單獨地或適宜組合使用。
從發酵液中回收L-胺基酸可藉由用於化合物的分離精製之公知的手法來施行。作為該種手法，可列舉例如離子交換樹脂法(Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710)、沉澱法、膜分離法(日本專利特開平9-164323、日本專利特開平9-173792)、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646)。此等手法可單獨地或適宜組合使用。另外，在將L-胺基酸蓄積於菌體內之情況，可例如將菌體藉由超音波等進行破碎，藉由離子交換樹脂法等從藉由離心分離去除菌體所獲得之上清液中回收L-胺基酸。所回收之L-胺基酸可為游離體、其鹽或該等之混合物。作為鹽，可列舉例如硫酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽、銨鹽、鈉鹽、鉀鹽。在製造L-麩胺酸之情況，具體而言，所回收之L-麩胺酸亦可例如為游離體的L-麩胺酸、L-麩胺酸鈉(例如monosodium L-glutamate；MSG)、L-麩胺酸銨(例如monoammonium L-glutamate)或該等之混合物。例如，藉由加入酸使發酵液中之L-麩胺酸銨進行晶析，並對結晶添加等莫耳的氫氧化鈉，而獲得L-麩胺酸鈉(MSG)。另外，亦可在晶析前後加入活性碳來進行脫色(參照麩胺酸鈉的工業晶析 日本海水學會誌 56卷 5號 川喜田哲哉)。L-麩胺酸鈉結晶可用作例如鮮味調味料。L-麩胺酸鈉結晶亦可與同樣地具有鮮味之鳥苷酸鈉或肌苷酸鈉等核酸進行混合而用作調味料。
此外，在L-胺基酸係在培養基中析出之情況，可藉由離心分離或過濾等來進行回收。此外，在培養基中所析出之L-胺基酸亦可在將溶解於培養基中之L-胺基酸進行晶析後，一併進行單離。
另外，所回收之L-胺基酸係除了L-胺基酸以外，亦可包含細菌菌體、培養基成分、水分及細菌的代謝副產物等成分。L-胺基酸亦可精製至所期望的程度。所回收之L-胺基酸的純度可例如為50%(w/w)以上，較佳為85%(w/w)以上，特佳為95%(w/w)以上(JP1214636B、USP5,431,933、USP4,956,471、USP4,777,051、USP4,946,654、USP5,840,358、USP6,238,714、US2005/0025878)。 [實施例]
以下，參照非限定性實施例來進一步具體地說明本發明。
＜1＞ Corynebacterium glutamicum的改良株的構築 ＜1-1＞aspT基因缺損用載體的構築 藉由以 C. glutamicumATCC 13869的染色體DNA作為模板並使用經適宜設計之引子之PCR，將編碼出天冬胺酸轉胺酶之aspT基因(CGBL_0102840)的5’側上游約1kbp的DNA片段及3’側下游約1kbp的DNA片段各自進行增幅。將經增幅之DNA片段藉由In-Fusion反應插入pBS5T(WO2006/057450)的SmaI部位，藉此獲得aspT基因缺損用載體。
＜1-2＞malE基因缺損用載體的構築 藉由以 C. glutamicumATCC 13869的染色體DNA作為模板並使用經適宜設計之引子之PCR，將編碼出蘋果酸酶之malE基因(CGBL_0129850)的5’側上游約1kbp的DNA片段及3’側下游約1kbp的DNA片段各自進行增幅。將經增幅之DNA片段藉由In-Fusion反應插入pBS5T(WO2006/ 057450)的SmaI部位，藉此獲得malE基因缺損用載體。
＜1-3＞poxB基因缺損用載體的構築 藉由以 C. glutamicumATCC 13869的染色體DNA作為模板並使用經適宜設計之引子之PCR，將編碼出丙酮酸去氫酶之poxB基因(CGBL_0125410)的5’側上游約1kbp的DNA片段及3’側下游約1kbp的DNA片段各自進行增幅。將經增幅之DNA片段藉由In-Fusion反應插入pBS5T (WO2006/057450)的SmaI部位，藉此獲得poxB基因缺損用載體。
＜1-4＞ack基因的表現載體的構築 藉由以 C. glutamicumATCC 13869的染色體DNA作為模板並使用SEQ ID NO：19及20的引子之PCR，將包含編碼出醋酸激酶之ack基因(CGBL_0126910)之DNA片段進行增幅。以In-Fusion反應將經增幅之DNA片段與經以bamHI及pstI切割之pVK9(US2006-0141588)進行連結，藉此獲得ack基因的表現載體pVK9-Plac ackA。
此外，以 C. glutamicumATCC 13869的染色體DNA作為模板並使用SEQ ID NO：21及22的引子來施行PCR，將包含源自 C. glutamicum之msrA基因的上游序列(包含啟動子區域，369bp)之DNA片段進行增幅。另，藉由以 C. glutamicumATCC 13869的染色體DNA作為模板並使用SEQ ID NO：23及20的引子之PCR，將包含ack基因(CGBL_0126910)之DNA片段進行增幅。以In-Fusion反應將經增幅之兩種DNA片段與經以bamHI及pstI切割之pVK9(US2006-0141588)進行連結，藉此獲得ack基因的表現載體pVK9-PmsrA ackA。
＜1-5＞glpX基因的表現載體的構築 藉由以 E. coliK-12 MG1655(ATCC 47076)的染色體DNA作為模板並使用SEQ ID NO：24及25的引子之PCR，將包含編碼出果糖-1,6-雙磷酸酶之glpX基因之DNA片段進行增幅。以In-Fusion反應將經增幅之DNA片段與經以bamHI及pstI切割之pVK9(US2006-0141588)進行連結，藉此獲得glpX基因的表現載體pVK9-Plac glpX。
＜1-6＞ Corynebacterium glutamicum的改良株的構築 以所構築之各基因缺損用載體將 C. glutamicum2256ΔsucAΔldhA yggB *株(WO2014/185430)進行轉形。依照WO2006/057450所記載之方法從所獲得之轉形體中施行菌株的選擇，獲得aspT基因缺損株、malE基因缺損株及poxB基因缺損株。
藉由將所構築之ackA基因的表現載體pVK9-Plac ackA或pVK9-PmsrA ackA單獨地或與pVS7-xfp(US2018-0282773)進行組合而導入 C. glutamicum2256ΔsucAΔldhA yggB *株(WO2014/185430)中，而獲得ack基因的表現增強株。pVS7-xfp為源自 B. longumJCM1217之磷酸酮醇酶基因(xfp)的表現載體(US2018-0282773)。
藉由將所構築之glpX基因的表現載體pVK9-Plac glpX及pVS7-xfp(US2018-0282773)導入 C. glutamicum2256ΔsucAΔldhA yggB *株(WO2014/185430)中，而獲得glpX基因的表現增強株。
將pVK9單獨地或與pVS7-xfp(US2018-0282773)進行組合而導入 C. glutamicum2256ΔsucAΔldhA yggB *株(WO2014/185430)中，獲得對照株。
C. glutamicum2256ΔsucAΔldhA yggB *株為衍生自 C. glutamicum2256株(ATCC 13869)之L-麩胺酸生產株，其缺損ldhA基因及sucA基因，在yggB基因具有IS變異(V419：：IS)。將此變異型yggB基因(V419：：IS)的鹼基序列及由同一基因所編碼出之變異型YggB蛋白質(V419：：IS)的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：17及18。
＜2＞L-麩胺酸生產培養 使用所構築之各菌株(即，對照株以及其ack基因的表現增強株及glpX基因的表現增強株)來實施L-麩胺酸生產培養。將所使用之培養基的組成示於表1。亦將碳源為葡萄糖(glucose)之培養基稱為「Glc培養基」，將碳源為果糖(fructose)之培養基稱為「Frc培養基」。
表1  培養基組成
葡萄糖或果糖 80　　g/L
(NH 4) 2SO 4 30　　g/L
KH 2PO 4 　1　　g/L
MgSO 4･7H 2O 0.4　　g/L
FeSO 4･7H 2O 0.01　　g/L
MnSO 4･5H 2O 0.01　　g/L
VB 1 　200　　μg/L
生物素 　300　　μg/L
豆濃(Mameno) 0.48　　g/L
CaCO 3 　50　　g/L
琥珀酸 　　1　　g/L
製作經以KOH調整成pH8.0之上述組成的培養基，藉由高壓釜(115℃，10分鐘)進行滅菌。以成為終濃度50g/L之方式將經乾熱滅菌(180℃，6小時)之碳酸鈣添加至滅菌後之培養基中而用於培養。
將各菌株植菌至已裝入粗試驗管中之上述培養基(包含50g/L碳酸鈣)5mL中，使用31.5℃的箱式振盪器(ABLE ML-190)以120rpm進行振盪培養。在培養開始25或30小時後實施培養液的取樣。使用Biotech Analyzer AS-310(Sakura SI)將培養液中之L-麩胺酸濃度進行定量，算出L-麩胺酸的對糖產率。
將結果示於圖1～4。ack基因的表現增強株(2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9-Plac ackA/pVS7-xfp、2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9-PmsrA ackA/pVS7-xfp、2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9-Plac ackA及2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9-PmsrA ackA)在以葡萄糖作為碳源之情況，相比於所對應之對照株(針對2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9-Plac ackA/pVS7-xfp及2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9-PmsrA ackA/pVS7-xfp而言為2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9/pVS7-xfp；針對2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9-Plac ackA及2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9-PmsrA ackA而言為2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9)而言顯示出較高的L-麩胺酸的蓄積量及L-麩胺酸的對糖產率(圖1及2)。此外，glpX基因的表現增強株(2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9-Plac glpX/pVS7-xfp)在以果糖作為碳源之情況，相比於所對應之對照株(2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9/pVS7-xfp)而言顯示出較高的L-麩胺酸的蓄積量(圖3)，在以葡萄糖作為碳源之情況，相比於所對應之對照株(2256ΔsucAΔldhA yggB */pVK9/pVS7-xfp)而言顯示出較高的L-麩胺酸的對糖產率(圖4)。
此外，藉由針對aspT基因缺損株、malE基因缺損株及poxB基因缺損株以同樣的程序實施L-麩胺酸生產培養，而確認L-麩胺酸生產的提升。 [產業上之可利用性]
根據本發明，可使棒狀桿菌型細菌的L-胺基酸生產能力提升，可效率佳地製造L-胺基酸。
[序列表的說明] SEQ ID NO：1： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的aspT基因的鹼基序列 SEQ ID NO：2： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的AspT蛋白質的胺基酸序列 SEQ ID NO：3： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的malE基因的鹼基序列 SEQ ID NO：4： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的MalE蛋白質的胺基酸序列 SEQ ID NO：5： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的poxB基因的鹼基序列 SEQ ID NO：6： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的PoxB蛋白質的胺基酸序列 SEQ ID NO：7： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的ack基因的鹼基序列 SEQ ID NO：8： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的Ack蛋白質的胺基酸序列 SEQ ID NO：9： Escherichia coliK-12 MG1655的ack基因的鹼基序列 SEQ ID NO：10： Escherichia coliK-12 MG1655的Ack蛋白質的胺基酸序列 SEQ ID NO：11： Corynebacterium glutamicumATCC 13032的glpX基因的鹼基序列 SEQ ID NO：12： Corynebacterium glutamicumATCC 13032的GlpX蛋白質的胺基酸序列 SEQ ID NO：13： Escherichia coliK-12 MG1655的glpX基因的鹼基序列 SEQ ID NO：14： Escherichia coliK-12 MG1655的GlpX蛋白質的胺基酸序列 SEQ ID NO：15： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的yggB基因的鹼基序列 SEQ ID NO：16： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的YggB蛋白質的胺基酸序列 SEQ ID NO：17： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的變異型yggB基因(V419：：IS)的鹼基序列 SEQ ID NO：18： Corynebacterium glutamicum2256 (ATCC 13869)的變異型YggB蛋白質(V419：：IS)的胺基酸序列 SEQ ID NO：19～25：引子
[圖1]示出以葡萄糖作為碳源之情況之對照株及ack基因的表現增強株的L-麩胺酸的蓄積量之圖。 [圖2]示出以葡萄糖作為碳源之情況之對照株及ack基因的表現增強株的L-麩胺酸的對糖產率之圖。 [圖3]示出以果糖作為碳源之情況之對照株及glpX基因的表現增強株的L-麩胺酸的蓄積量之圖。 [圖4]示出以葡萄糖作為碳源之情況之對照株及glpX基因的表現增強株的L-麩胺酸的對糖產率之圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016

Claims (16)

  1. 一種L-胺基酸之製造方法，其包含 將具有L-胺基酸生產能力之棒狀桿菌型細菌在培養基中進行培養，將L-胺基酸蓄積於該培養基中及/或該細菌的菌體內，以及 從前述培養基及/或前述菌體中採取前述L-胺基酸， 前述L-胺基酸為麩胺酸系L-胺基酸， 前述細菌具有下述(X)及/或(Y)的改良： (X)經由磷酸酮醇酶路徑之碳源的利用性提升之改良； (Y)細胞內之草醯醋酸池(oxaloacetate pool)增大之改良。
  2. 如請求項1之方法，其中，前述細菌具有至少前述(X)的改良。
  3. 如請求項1或2之方法，其中， 前述(X)的改良為選自下述(A)、(B)及(C)的改良中之1種或其以上的改良； 前述(Y)的改良為選自下述(D)及(E)的改良中之1種或其以上的改良： (A)醋酸激酶的活性增大之改良； (B)果糖-1,6-雙磷酸酶的活性增大之改良； (C)丙酮酸去氫酶的活性降低之改良； (D)天冬胺酸轉胺酶的活性降低之改良； (E)蘋果酸酶的活性降低之改良。
  4. 一種L-胺基酸之製造方法，其包含 將具有L-胺基酸生產能力之棒狀桿菌型細菌在培養基中進行培養，將L-胺基酸蓄積於該培養基中及/或該細菌的菌體內，以及 從前述培養基及/或前述菌體中採取前述L-胺基酸， 前述L-胺基酸為麩胺酸系L-胺基酸， 前述細菌具有選自下述(A)～(E)的改良中之1種或其以上的改良： (A)醋酸激酶的活性增大之改良； (B)果糖-1,6-雙磷酸酶的活性增大之改良； (C)丙酮酸去氫酶的活性降低之改良； (D)天冬胺酸轉胺酶的活性降低之改良； (E)蘋果酸酶的活性降低之改良。
  5. 如請求項3或4之方法，其中，前述細菌具有至少前述(A)的改良。
  6. 如請求項3至5中任一項之方法，其中， 前述天冬胺酸轉胺酶係由aspT基因所編碼出； 前述蘋果酸酶係由malE基因所編碼出； 前述丙酮酸去氫酶係由poxB基因所編碼出； 前述醋酸激酶係由ack基因所編碼出；且/或 前述果糖-1,6-雙磷酸酶係由glpX基因所編碼出。
  7. 如請求項3至6中任一項之方法，其中， 前述天冬胺酸轉胺酶的活性係藉由使編碼出天冬胺酸轉胺酶之基因的表現降低或藉由破壞該基因而降低； 前述蘋果酸酶的活性係藉由使編碼出蘋果酸酶之基因的表現降低或藉由破壞該基因而降低； 前述丙酮酸去氫酶的活性係藉由使編碼出丙酮酸去氫酶之基因的表現降低或藉由破壞該基因而降低； 前述醋酸激酶的活性係藉由使編碼出醋酸激酶之基因的表現上升而增大；且/或 前述果糖-1,6-雙磷酸酶的活性係藉由使編碼出果糖-1,6-雙磷酸酶之基因的表現上升而增大。
  8. 如請求項7之方法，其中， 編碼出醋酸激酶之基因的表現係藉由提高該基因的拷貝數及/或改良該基因的表現調節序列而上升；且/或 編碼出果糖-1,6-雙磷酸酶之基因的表現係藉由提高該基因的拷貝數及/或改良該基因的表現調節序列而上升。
  9. 如請求項3至8中任一項之方法，其中， 前述天冬胺酸轉胺酶為下述(1a)、(1b)或(1c)所記載之蛋白質： (1a)包含SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列之蛋白質； (1b)包含在SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列中含有1～10個胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或附加之胺基酸序列，且具有天冬胺酸轉胺酶活性之蛋白質； (1c)包含相對於SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列而言具有90%以上的同一性之胺基酸序列，且具有天冬胺酸轉胺酶活性之蛋白質； 前述蘋果酸酶為下述(2a)、(2b)或(2c)所記載之蛋白質： (2a)包含SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列之蛋白質； (2b)包含在SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列中含有1～10個胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或附加之胺基酸序列，且具有蘋果酸酶活性之蛋白質； (2c)包含相對於SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列而言具有90%以上的同一性之胺基酸序列，且具有蘋果酸酶活性之蛋白質； 前述丙酮酸去氫酶為下述(3a)、(3b)或(3c)所記載之蛋白質： (3a)包含SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列之蛋白質； (3b)包含在SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列中含有1～10個胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或附加之胺基酸序列，且具有丙酮酸去氫酶活性之蛋白質； (3c)包含相對於SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列而言具有90%以上的同一性之胺基酸序列，且具有丙酮酸去氫酶活性之蛋白質； 前述醋酸激酶為下述(4a)、(4b)或(4c)所記載之蛋白質： (4a)包含SEQ ID NO：8或10所示之胺基酸序列之蛋白質； (4b)包含在SEQ ID NO：8或10所示之胺基酸序列中含有1～10個胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或附加之胺基酸序列，且具有醋酸激酶活性之蛋白質； (4c)包含相對於SEQ ID NO：8或10所示之胺基酸序列而言具有90%以上的同一性之胺基酸序列，且具有醋酸激酶活性之蛋白質；且/或 前述果糖-1,6-雙磷酸酶為下述(5a)、(5b)或(5c)所記載之蛋白質： (5a)包含SEQ ID NO：12或14所示之胺基酸序列之蛋白質； (5b)包含在SEQ ID NO：12或14所示之胺基酸序列中含有1～10個胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或附加之胺基酸序列，且具有果糖-1,6-雙磷酸酶活性之蛋白質； (5c)包含相對於SEQ ID NO：12或14所示之胺基酸序列而言具有90%以上的同一性之胺基酸序列，且具有果糖-1,6-雙磷酸酶活性之蛋白質。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中，前述細菌係進一步以相較於非改良株而言磷酸酮醇酶的活性增大之方式進行改良。
  11. 如請求項10之方法，其中，前述磷酸酮醇酶為D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶及/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中，前述細菌為棒狀桿菌屬( Corynebacterium)細菌。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中，前述細菌為麩胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum)。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中，前述麩胺酸系L-胺基酸為選自L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-脯胺酸、L-精胺酸、L-瓜胺酸及L-鳥胺酸中之1種或其以上的L-胺基酸。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中，前述麩胺酸系L-胺基酸為L-麩胺酸。
  16. 如請求項14或15之方法，其中，前述L-麩胺酸為L-麩胺酸銨或L-麩胺酸鈉。
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Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS50113209A (zh) 1974-02-13 1975-09-05
JPS5238088A (en) 1975-09-19 1977-03-24 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid
JPS5444096A (en) 1977-09-13 1979-04-07 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-arginine by fermentation
JPS561889A (en) 1979-06-20 1981-01-10 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS5832596B2 (ja) 1979-08-10 1983-07-14 味の素株式会社 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造方法
JPS5810075B2 (ja) 1979-08-31 1983-02-24 味の素株式会社 新規変異株
JPS56140895A (en) 1980-04-02 1981-11-04 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS56151495A (en) 1980-04-25 1981-11-24 Ajinomoto Co Inc Production of l-glutamine through fermentation
JPS5718989A (en) 1980-07-09 1982-01-30 Ajinomoto Co Inc Production of l-arginine through fermentation
JPS5765198A (en) 1980-10-09 1982-04-20 Ajinomoto Co Inc Fermentative production of l-glutamic acid
JPS57134500A (en) 1981-02-12 1982-08-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Plasmid pcg1
JPS572689A (en) 1981-03-23 1982-01-08 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid
JPS57183799A (en) 1981-04-17 1982-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel plasmid
DE3127361A1 (de) 1981-07-08 1983-02-03 Schering Ag, 1000 Berlin Und 4619 Bergkamen Herstellung und anwendung von plasmiden mit genen fuer die biosynthese von l-prolin
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
JPS5816872B2 (ja) 1982-02-12 1983-04-02 協和醗酵工業株式会社 コリネバクテリウム・グルタミクム変異株
JPS58158192A (ja) 1982-03-15 1983-09-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造方法
JPS58192900A (ja) 1982-05-04 1983-11-10 Ajinomoto Co Inc 複合プラスミド
EP0163836B1 (de) 1984-04-07 1988-10-12 Bayer Ag Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Granulaten
JPS61202694A (ja) 1985-03-07 1986-09-08 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法
JPS6224075A (ja) 1985-07-25 1987-02-02 Toyota Motor Corp 車両用駆動装置
FR2603581B1 (fr) 1986-04-28 1993-08-13 Ajinomoto Kk Procede pour isoler et purifier des aminoacides par chromatographie
US4777051A (en) 1986-06-20 1988-10-11 Ajinomoto Co., Inc. Process for the production of a composition for animal feed
JPH01191686A (ja) 1988-01-26 1989-08-01 Mitsubishi Petrochem Co Ltd 複合プラスミド
FR2627508B1 (fr) 1988-02-22 1990-10-05 Eurolysine Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede
JP2537260B2 (ja) 1988-02-23 1996-09-25 東陶機器株式会社 和風便器の施工方法
US5185262A (en) 1988-07-27 1993-02-09 Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. DNA fragment containing gene which encodes the function of stabilizing plasmid in host microorganism
JP2678995B2 (ja) 1988-09-08 1997-11-19 三菱化学株式会社 トリプトフアンシンターゼの製造法
JP2817155B2 (ja) 1989-01-12 1998-10-27 味の素株式会社 発酵法によるｌ‐アルギニンの製造法
JPH02207791A (ja) 1989-02-07 1990-08-17 Ajinomoto Co Inc 微生物の形質転換法
JP2973446B2 (ja) 1990-01-11 1999-11-08 三菱化学株式会社 新規プラスミドベクター
JPH03232497A (ja) 1990-02-08 1991-10-16 Asahi Chem Ind Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミンの製造方法
JPH0488994A (ja) 1990-07-30 1992-03-23 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法
JPH07108228B2 (ja) 1990-10-15 1995-11-22 味の素株式会社 温度感受性プラスミド
DE4130868C2 (de) 1991-09-17 1994-10-13 Degussa Tierfuttermittelsupplement auf der Basis einer Aminosäure und Verfahren zu dessen Herstellung
JP2817400B2 (ja) 1993-10-28 1998-10-30 味の素株式会社 物質の製造法
ES2160167T3 (es) 1994-06-14 2001-11-01 Ajinomoto Kk Gen de alfa-cetoglutarato-deshidrogenasa.
DK0805867T3 (da) 1995-01-23 2004-04-13 Novozymes As DNA integration ved transposition
JPH0970291A (ja) 1995-06-30 1997-03-18 Ajinomoto Co Inc 人工トランスポゾンを用いた遺伝子増幅方法
JP3861341B2 (ja) 1995-10-13 2006-12-20 味の素株式会社 発酵液の膜除菌方法
JPH09173792A (ja) 1995-10-23 1997-07-08 Ajinomoto Co Inc 発酵液の処理方法
DE19621930C1 (de) 1996-05-31 1997-12-11 Degussa Verfahren zur Herstellung eines Tierfuttermittel-Zusatzes auf Fermentationsbrühe-Basis
JP4168463B2 (ja) 1996-12-05 2008-10-22 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
ID23892A (id) 1997-08-12 2000-05-25 Ajinomoto Kk Metode pembuatan asam l-glutamat melalui fermentasi
US7267967B1 (en) 1997-10-04 2007-09-11 Forschungszentrum Julich Gmbh Nucleic acid encoding pyruvate carboxylase from coryneform glutamicum
AU4131699A (en) 1998-04-09 1999-11-01 Siemens Aktiengesellschaft Device and method for supplying an electric load with electric energy
SK7702000A3 (en) 1998-09-25 2000-10-09 Ajinomoto Kk Process for preparing coryneform bacteria having an improved amino acid- or nucleic acid-productivity
ATE483792T1 (de) 1998-12-18 2010-10-15 Ajinomoto Kk Verfahren zur fermentativen herstellung von l- glutaminsäure
JP2000262288A (ja) 1999-03-16 2000-09-26 Ajinomoto Co Inc コリネ型細菌の温度感受性プラスミド
US6238714B1 (en) 1999-05-05 2001-05-29 Degussa-Huls Ag Feedstuff additive which contains D-pantothenic acid and/or its salts and a process for the preparation thereof
JP2003159092A (ja) 1999-07-02 2003-06-03 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2003144160A (ja) 1999-07-02 2003-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP4427878B2 (ja) 1999-08-20 2010-03-10 味の素株式会社 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
RU2207376C2 (ru) 1999-10-14 2003-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
RU2212447C2 (ru) 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
US7160705B2 (en) 2000-04-28 2007-01-09 Ajinomoto Co., Inc. Arginine repressor deficient strain of coryneform bacterium and method for producing L-arginine
JP4682454B2 (ja) 2000-06-28 2011-05-11 味の素株式会社 新規変異型ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素及びｌ−アルギニンの製造法
JP4362959B2 (ja) 2000-08-24 2009-11-11 味の素株式会社 塩基性アミノ酸の製造方法
JP4560998B2 (ja) 2001-02-05 2010-10-13 味の素株式会社 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法及びｌ−グルタミン生産菌
BR122013017187B1 (pt) 2001-02-13 2016-03-01 Ajinomoto Kk bactéria transgênica produtora de l-aminoácido pertencente ao gênero escherichia, e, método para produzir l-aminoácido
JP4599726B2 (ja) 2001-02-20 2010-12-15 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
CA2453008C (en) 2001-07-06 2011-03-22 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
WO2003008605A2 (en) 2001-07-18 2003-01-30 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an enhanced male gene
JP2004187684A (ja) 2002-11-26 2004-07-08 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミンの製造法及びｌ−グルタミン生産菌
EP1460128B1 (en) 2003-03-03 2016-11-30 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-arginine or L-lysine by fermentation
KR20060015582A (ko) 2003-05-07 2006-02-17 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-글루탐산의 제조법
AU2004248005A1 (en) 2003-06-10 2004-12-23 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing L-glutamic acid
JP2006340603A (ja) 2003-06-23 2006-12-21 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸の製造法
DE10331366A1 (de) 2003-07-11 2005-01-27 Degussa Ag Verfahren zur Granulation eines Tierfuttermittel-Zusatzes
KR101073370B1 (ko) 2003-07-29 2011-10-17 아지노모토 가부시키가이샤 물질 생산에 영향을 미치는 대사 흐름을 결정하는 방법
US7344874B2 (en) 2004-03-04 2008-03-18 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
ATE463564T1 (de) 2004-08-10 2010-04-15 Ajinomoto Kk Verwendung von phosphoketolase zur herstellung geeigneter metabolite
KR20090023513A (ko) 2004-10-07 2009-03-04 아지노모토 가부시키가이샤 염기성 물질의 제조법
JP4595506B2 (ja) 2004-11-25 2010-12-08 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
CN101090911B (zh) 2004-12-28 2014-05-07 味之素株式会社 产生l-谷氨酸的微生物和产生l-谷氨酸的方法
US7794989B2 (en) 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
RU2418069C2 (ru) 2006-09-29 2011-05-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ конструирования рекомбинантных бактерий, принадлежащих к роду pantoea, и способ продукции l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду pantoea
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2008078646A1 (ja) 2006-12-22 2008-07-03 Ajinomoto Co., Inc. アミノ酸又は核酸の結晶の分離方法
BRPI0703692B1 (pt) 2006-12-25 2016-12-27 Ajinomoto Kk método para se obter os cristais de um hidrocloreto de aminoácido básico compreendendo gerar um aminoácido básico usando células microbianas por fermentação em um caldo de fermentação ou por um método enzimático em uma solução de reação de enzima usando as células como catalisadores
WO2008133161A1 (ja) 2007-04-17 2008-11-06 Ajinomoto Co., Inc. カルボキシル基を有する酸性物質の製造法
BRPI0918299B1 (pt) 2008-09-08 2018-08-14 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
CN103314101B (zh) * 2010-11-03 2016-05-18 加利福尼亚大学董事会 通过蛋白质生物质发酵的重组微生物的生物燃料和化学生产
JP2014036576A (ja) * 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
BR112013016373B1 (pt) 2011-11-11 2021-05-18 Ajinomoto Co., Inc método para produzir uma substância alvo
WO2014185430A1 (ja) 2013-05-13 2014-11-20 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
JP2016163540A (ja) * 2013-07-09 2016-09-08 味の素株式会社 有用物質の製造方法
KR101735935B1 (ko) * 2015-07-20 2017-05-16 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 또는 오르니틴 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 또는 오르니틴 생산방법
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
BR112020017374A2 (pt) * 2018-03-01 2020-12-29 Total Raffinage Chimie Vias metabólicas com rendimento de carbono aumentado

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