FR2464299A1 - Procede de preparation de souches productrices d'acides amines - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE L'INDUSTRIE MICROBIOLOGIQUE, ET, PLUS PRECISEMENT, UN PROCEDE DE PREPARATION DE SOUCHES PRODUCTRICES D'ACIDES AMINES. CONFORMEMENT A L'INVENTION, LE PROCEDE DE PREPARATION DE SOUCHES PRODUCTRICES D'ACIDES AMINES CONSISTE A REUNIR UN FRAGMENT D'ADN DU CHROMOSOME D'UN MICRO-ORGANISME DONNEUR, CONTENANT DES GENES CONTROLANT LA SYNTHESE D'UN ACIDE AMINE CHOISI ET AYANT UNE MUTATION TROUBLANT LA REGULATION NEGATIVE DE LA SYNTHESE DE CET ACIDE AMINE, A UNE MOLECULE D'ADN VECTORIELLE AVEC FORMATION D'UNE MOLECULE D'ADN HYBRIDE, EN UTILISANT A CET EFFET UNE MOLECULE D'ADN VECTORIELLE CAPABLE D'ASSURER UNE AMPLIFICATION DE LA MOLECULE D'ADN HYBRIDE; ON TRANSFORME AVEC LA MOLECULE D'ADN HYBRIDE OBTENUE LES CELLULES D'UNE SOUCHE RECEPTRICE, QUI PORTE UNE MUTATION BLOQUANT LA SYNTHESE DE L'ACIDE AMINE CHOISI DANS CETTE SOUCHE ET UNE MUTATION BLOQUANT PARTIELLEMENT UNE ETAPE CONNEXE DU METABOLISME DE CET ACIDE AMINE, AVEC OBTENTION D'UNE SOUCHE POSSEDANT UNE PRODUCTIVITE ELEVEE EN ACIDE AMINE CHOISI.

Description

La présente invention concerne l'industrie microbiologique, et plus précisément, un procédé de préparation de souches productrices d'acides aminés.

Les acides aminés obtenus à l'aide de micro-organismes trouvent de larges applications dans l'agriculture et l'industrie alimentaire à titre d'additif au fourrage et aux aliments, sous forme de composants de divers mélanges nutritifs à destination médicale et sont utilisés comme réac-tifs dans les industries pharmaceutique et chimique.

Les termes suivants sont utilisés dans la suite de la description de l'invention.

Sous le terme "ADN" il faut comprendre l'acide désoxyribonucléique.

Les "plasmides" sont des éléments génétiques, existant dans les cellules de bactéries indépendamment des chromosomes.

Sous le terme "réplication" il faut comprendre la reproduction du matériau génétique.

Sous le terme "transformation" on entend le transfert du matériau génétique des bactéries dans la cellule bactérienne à l'aide d'ADN éliminé.

La "transversion" désigne le transfert du matériau génétique du bactériophage dans la cellule bactérienne à l'aide d'ADN éliminé.

Sous le terme "moléoules vectorielles" il faut comprendre des molécules d'ADN des plasmides et des bactériophages, assurant le transfert du matériau génétique étranger dans la cellule et- sa réplication autonome.

Sous le terme de "molécules d'ADN recombinantes (hybrides)" il faut comprendre des molécules d'ADN obtenues in vitro à la suite de la réunion des molécules d'tDN hétérogènes dans une molécule, dont l'une est vectorielle.

Sous le terme de "clone-" il faut comprendre la descendance génétiquement homogène d'une cellule.

Sous le terme de "donation" de gènes (clonation moléculaire) il faut comprendre l'obtention de clones de bactéries, contenant les gènes indiqués sur le plasmide hybride.

"L'amplification", c'est l'augmentation du nombre de gènes dans la cellule.

La "eonjugaison" désigne le transfert du matériau génétique au cours du contact des cellules bactériennes.

La "transduction" désigne le transfert du matériau génétique à l'aide du bactériophage.

Sous le terme "souche autotrophe" il faut comprendre des microorganismes mutants, incapables de synthétiser des acides aminés ou autres facteurs de la croissance et eroissant seulement sur un milieu nutritif en présence de ces facteurs.

Sous le terme "souches prototrophes" il faut comprendre des microorganismes du type sauvage, capables de crotte sur des milieux nutritifs minimaux au glucosesolution saline.

"L'operon" est un groupe de gènes réglables en commun, qui contrôlent habituellement la synthèse d'un produit, par exemple l'acide aminé.

Le terme "catabolisme" désigne le processus de transformation de composés compliqués en composés simples.

Sous le terme "répression" il faut comprendre l'exclusion du fonctionnement des gènes ou des opérons, exelusion conduisant à l'arrêt de la synthèse des enzymes.

Sous le terme"répresseur" il faut comprendre une protéine régulatrice éliminant le fonctionnement des gènes à l'aide de cofacteurs de la répression (habituellement des produits finis de la vo-ie (ligne) de biosynthèse ou leurs dérivés).

Sous le terme "endonucléase (bestrietase) spéci figue" il faut comprendre une enzyme, coupant la molécule d'ADN à deux caténaires en fragments en des points avec des bases à séquence déterminée.

La polynucléotidelygase est une enzyme réalisant la réunification des fragments formés sous l'action des endonucléases.

Sous le terme de "réplicon" il faut comprendre un matériau génétique capable de réplication.

Le terme "phénotype" désigne a manifestation des indices génétiques dans les conditions extérieures données.

On connatt des procédés de préparation de souches productrices d'acides aminés, par exemple la L-lysine, la
L-thréonine, la L-isoleucine et d'autres, par utilisation de divers facteurs mutagènes (UV, radiation ionisante, mutagènes chimiques). Les souches de microorganismes mutantes obtenues présentent certaines perturbations génétiquement conditionnées dans la régulation du métabolisme et, à cause de ces perturbations, ils libèrent dans le milieu nutritif, c'est-à-dire produisent, certains acides aminés.

On obtient des souches de microorganismes mutantes du type nécessaire par des procédés connus : soit suivant un certain besoin nutritif du mutant (auxotrophicité), soit sur la base de la résistance du mutant à un analogue quelconque d'acide aminé inhibant la croissance de la souche de départ (brevets de Grande-Bretagne N s 1258380, 1186988 et 1316888 ; brevet
Japonais nO 51-6237).

On connatt également un procédé de préparation de mutants producteurs d'acides aminés, basé sur la résistance simultanée à un antimétabolite (antibiotique ou analogue d'un acide aminé) et un co-inhibiteur (de l'acide aminé déterminé) (brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 3756916).

Dans tous les cas cités on obtient des souches mutantes capables de produire des acides aminés, du fait de l'induction unique ou successive de mutations dans la structure génétique (génome) de la souche initiale ne libérant pas l'acide aminé.

On ne connaît pas jusqu'à présent de souches chez lesquelles l'accroissement de la production de l'acide aminé est réalisé du fait de l'augmentation de la dose de gènes indispensables pour sa biosynthèse, ou à la suite de l'introduction de matériau génétique étranger dans la cellule. On ne connatt pas de souches chez lesquelles l'accroissement de la production d'acide aminé est obtenu par utilisation de procédés de génie génétique, c'est-à-dire de méthodes de travail avec des molécules d'ADN recombinantes.

Dans la pratique des recherches génétiques, on utilise à l'heure actuelle des méthodes qui aboutissent à l'obtention in vitro de molécules d'ADN hybrides, capables de réplication autonome et d'une amplification, et à l'in troduction de ces molécules par transformation ou transversion dans la souche réceptrice. A titre de molécules vectorielles on utilise un plasmide d'ADN ou des bactériophages modérés d'ADN. Ces méthodes sont étudiées en détail dans les travaux de :
1. Cohen S.N., Chang A.C. Y, Boyer H.W. and
Helling R.B. Proc.Rat.Aead.Sci.USA ., 70,3240, 1973.

2. Green P.J., Betlach M.C., Boyer H.W., Goodman
H.N. Methods in Molecular Biology, 7, 87, 1974.

3. lanaka T., Weisblum B.I., Bacteriol., 121, 354, 1975.

4. Clarke L., Carbon J. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 72, 4361, 1975.

5. Bolivar F., Rodrigues R.L., Green P.I.

Betlach N.C. Heyneker H.L., Boyer H.W. Gene 2, 95, 1977.

6. Koslov I.I., Kalinina N.A., Gening L.V.

Rebentish B.A., Strongin A.I., Bogush V.G., Debabov V.G.

Molee.Gen. Genetics, 150, 211, 1977.

Certains aspects pratiques de l'utilisation de méthodes d'ingénierie ont trouvé leur reflet dans un procédé de préparation de souches de Pseudomonas, assurant la dégradation d'un complexe de substances organiques (hydrocarbures du pétrole) (brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 3923603).

Dans ce travail, des molécules hybrides ont été obtenues in vivo par une recombinaison intracellulaire.

Cependant, on ne connait pas actuellement de méthodes de préparation de souches productrices d'acides aminés avec utilisation du matériel du génie génétique.

On s'est donc proposé d'utiliser les techniques du génie génétique pour augmenter la dose de gènes indispensable pour la biosynthèse d'un acide aminé qui est requise pour obtenir des souches productrices d'acides aminés douées d'une capacité élevée de production des acides aminés et n'exigeant pas de facteurs de croissance additionnels.

La solution consiste en çe que, pour obtenir des souches productrices d'acides aminés, un fragment d'ADN du chromosome d'un microorganisme donneur contenant des gènes contrôlant la synthèse de l'acide aminé choisi et ayant une mutation perturbant la régulation négative de la syn thèse de cet acide aminé, est réuni, conformément à l'invention, avec une molécule vectorielle d'ADN avec formation d'une molécule hybride d'ADN, en utilisant à cet effet une molécule vectorielle d 'AD9D capable d'assurer une amplification de la molécule d'ADN hybride, on transforme les cellules de la souche réceptrice avec la molécule hybride d'ADN obtenue, souche ayant une mutation bloquant la synthèse de l'aci- de aminé choisi dans cette souche et une mutation bloquant en partie une étape connexe du métabolisme de cet acide aminé, avec obtention d'une souche possédant une haute productivité en acide aminé choisi.

Pour éliminer le matériau génétique résiduel (ballast) et augmenter la stabilité du plasmide hybride, et pour élever le nombre de ses copies dans la cellule, il est avantageux avant la transformation des cellules de la souche réceptriee, de traiter la molécule hybride d'ADN obtenue avec des endonucléases spécifiques assurant la décomposition de la molécule d'ADN hybride en des points déterminés de la molécule, avec réunification ultérieure des fragments d'ADN exigés par traitement avec une enzyme, la polynucléotidelygase.

Conformément à l'invention, le procédé de préparation d'une souche productrice d'acide aminé, par exemple la
L-thréonine, consiste à réunir le fragment d'ADN du ohromo- some de la souche de donneur E.coli VNllGenetica MG442, obtenu à l'aide de l'endonucléase Hind III et contenant des gènes de l'opéron de thréonine dont les produits enzymatiques du gène thrA provenant de la mutation sont stables à l'inhibition par la thréonine, avec une molécule vectorielle d'ADN, au titre de laquelle on utilise le plasmide pBR322, avec formation d'un plasmide hybride qui présente un poids moléculaire de 11,2 mégadaltons et renferme deux copies du plasmide pBR322 et le fragment d'ADN indiqué du chromosome de la souche de donneur, qui assure la stabilité des cellules à la pénicilline et la tétracycline et peut se trouver dans les cellules au stade de la croissance logarithmique à raison de 10 copies environ ; on transforme à l'aide du plasmide obtenu, des cellules d'une souche réceptrice E.coli
VL334 ayant des mutations bloquant la synthèse de la B- thréonine et la L-isoleucine, le blocage relatif à l'isoleucine étant partiel et pouvant être compensé par une haute teneur en thréonine dans la cellule, les mutations indiquées assurant un avantage sélectif aux cellules contenant le plasmide hybride, au cours du processus de culture par comparaison avec les cellules l'ayant perdu ; on obtient la souche
E.coli VNIIGenetica VL334 (pYN6) productrice de L-thréonine, déposée au Musée central des microorganismes industriels de l'institut de l'Union de recherches de la génétique et de la sélection des microorganismes industriels, ayant le numéro de dépôt (d'enregistrement) RsYPM B-1649. Le terme VNII
Genetica est le nom abrégé de l'Institut de l'Union de recherches de la génétique et de la sElectiondes microerganisrnes industriels de l'U.R.S.S.Une autre variante du procédé de préparation d'une souche productrice de l'acide aminé L-thréonine consiste à réunir le fragment d'ADN du chromosome de la souche de donneur E.coli VNîlGenetica MG442 obtenu à l'aide de l'endonucléase Hind III contenant des gènes de l'opéron de thréonine, chez lequel les produits enzymatiques du gène thr A provenant de la mutation sont stables à l'inhibition par la thréonine, avec une molécule vectorielle d'ADN, au titre de laquelle on utilise le plasmide pBR 322, avec formation d'un plasmide hybride, qui présente un poids moléculaire de 11,2 mégadaltons et renferme 2 copies du plasmide p3R 322 et le fragment d'ADN indiqué du chromosome de la souche de donneur ; on traite le plasmide hybride obtenu par les endonucléases spécifiques Hind III et Bam H1 et on réunit les fragments formés par traitement avec la polynucléotidelygase, le plasmide hybride formé ayant un poids moléculaire de 5,7 mégadaltons, étant constitué par une molécule du plasmide pBss322 et le fragment d'BDN indiqué du chromosome de la souche de donneur, le plasmide assurant la stabilité des cellules à la pénicilline et pouvant se trouver dans les cellules au stade de la croissance logarithmique en quantité d'environ 20 copies ; on transforme avec ce plasmide hybride obtenu des cellules d'une souche réceptrice de E.coli VL334 ayant des mutations bloquant la synthèse de L-thréonine et L-isoleucine, le blocage relatif à l'isoleucine étant partiel et pouvant entre compensé par une teneur élevée en thréonine dans la cellule ; les mutations indiquées assurant un avantage sélectif aux cellules contenant le plasmide hybride au cours du processus de culture ; on obtient la souche E.coli VNîlGenetica VL334 (pYN7), productrice de L-thréonine, déposée au Musée Central des microorganismes industriels de l'Institut de l'Union de recherches de la génétique et de la sélection des microorganismes industriels, ayant le numéro de dépôt (d'enregistrement) RsMPMB-1684.

Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre de la manière suivante :
Pour préparer une souche productrice d'un acide aminé déterminé, on choisit une souche de donneur d'un microorganisme dont le fragment d'ADN du chromosome contient des gènes contrôlant la synthèse de l'acide aminé choisi. La souche de donneur est caractérisée par l'existence de mutations dans les gènes à cloner ou dans la région régulatrice adhérant à ces gènes, mutations qui perturbent la régulation négative de la synthèse de l'acide aminé en question.De telles mutations assurent an accroissement de la synthèse de l'acide aminé voulu chez la souche de donneur, par comparaison avec la souche du type sauvage, et elles peuvent être obtenues par des méthodes connues e On choisit une molécule vectorielle d'ADN, par exemple le plasmide, qui garantit la réplication du matériau génétique étranger incorporé dans le plasmide, et on détermine un ou plusieurs indices à sélec- tionner, par exemple on détermine la stabilité aux antibiotiques. Pour obtenir les molécules hybrides, c'est-à-dire pour réunir le fragment d'ADN du chromosome de la souche de donneur avec la molécule d'ADN vectorielle, on les détruit en fragments séparés à l'aide d'une endonucléase spécifique ou par un autre moyen, après quoi on traite le mélange obtenu avec la polynucléotidelygase, rattachant ainsi les fragments de manière aléatoire.On utilise le mélange obtenu pour une transformation génétique des bactéries, au cours de laquelle on réalise une sélection des plasmides hybrides à fragments du chromosome du donneur, lequel porte des gènes contrôlant la synthèse de l'acide aminé donné Q A titre de récepteur, lors de la transformation, on utilise une souche bactérienne dont au moins un des gènes contr8lant la syn thèse dudit acide aminé est endommagé, et qui, en raison de cela, est auxotrophe vis-à-vis de l'acide aminé donné. La transformation terminée, on sélectionne les transformants prototrophes qui portent simultanément des indices sélectifs déterminables avec le plasmide vectoriel. De telles transformants peuvent constituer plusieurs classes phénotypiques.

On isole des plasmides hybrides à partir des transformants de chaque classe phénotypique par un des procédés connus.

Ces plasmides hybrides peuvent porter des fragments d'ADN du chromosome de la souche de donneur de diverses grandeurs et contenir un nombre différent de copies de la molécule vectorielle. On contrôle les plasmides hybrides isolés pour l'existence dans ceux-ci du fragment du chromosome de la souche de donneur contenant des gènes contrôlant la synthèse de l'acide aminé donné. Pour ce faire, on transforme les souches auxotrophes comportant les mutations sur chacun des gènes à cloner, à l'aide des plasmides hybrides. Le rétablissement de la prototrophicité des transformants indique dans ce cas la présence du gène approprié dans la composition du plasmide hybride. Pour le travail ultérieur de construction de la souche productrice de l'acide aminé, on utilise des plasmides hybrides contenant tous les gènes choisis contrôlant la synthèse de cet acide aminé.Dans ce cas, si les plasmides isolés ne contiennent pas tous les gènes nécessaires, on répète les opérations précitées, en modifiant le procédé de fragmentation d'ADN, par exemple par utilisation d'une autre endonucléase spécifique.

Pour éliminer le matériau génétique résiduel (ballast) et pour augmenter la stabilité du plasmide hybride et le nombre de ses copies dans la cellule, il est avantageux, avant la transformation ultérieure des cellules de la souche réceptrice, de traiter le plasmide hybride obtenu avec des endonucléases spécifiques, assurant sa décomposition en des points donnés de la molécule, avec réunification ultérieure des fragments cherchés par traitement de ceux-ci avec une enzyme, la polynucléotidelygase.

Le plasmide hybride obtenu, contenant tous les gènes choisis, contrôlant la synthèse de l'acide aminé chez le microorganisme donné, est utilisé pour la transformation génétique des cellules de la souche réceptrice, laquelle est capable, après la transformation, de garantir un niveau élevé de synthèse de l'acide aminé donné. La souche réceptrice présente une mutation bloquant la synthèse de l'acide aminé en question dans cette souche, ce qui permet de sélectionner facilement les transformants portant le plasmide hybride avec les gènes contrôlant la synthèse de l'acide aminé choisi.De plus, la souche réceptrice doit porter une mutation bloquant partiellement une étape intermédiaire du métabolisme de l'acide aminé choisi Un bloc partiel contigu, par exemple de l'étape ultérieure du métabolisme de l'acide aminé donné, doit conduire à un besoin en haute concentra- tion de cet acide aminé pour la synthèse du métabolite, dont le précurseur est l'acide aminé choisi. En conséquence, les cellules réceptrices avec les plasmides hybrides capables de garantir la synthèse d'une grande quantité d'acide aminé choisi, possèdent un avantage sélectif par comparaison avec des variantes sans plasmides, puisqu'elles sont capables de crotte sur un milieu sans l'acide aminé choisi et le métabolite, dont il est le précurseur.Il est avantageux également que la souche réceptrice ait une mutation perturbant la répression des gènes appropriés et des mutations bloquant le catabolisme et les transformations de l'acide aminé donné.

Les souches obtenues par le procédé de l'invention sont utilisées pour préparer divers acides aminés, par exemple la thréonine, par une méthode de fermentation sur un milieu nutritif contenant des sources assimilables de carbone, d'azote minéral, de sels minéraux et assurant un développement préférentiel de la population des cellules portant le plasmide hybride.

On a effectué des expériences de donation de gènes de l'opéron de thréonine dans les cellules d'E.coli
K12, dont les résultats démontrent la justesse du procédé de l'invention.

Les expérienees ont été effectuées de la manière suivante. A titre de souche de donneur, on a utilisé une souche E.coli W3350, portant un opéron de thréonine du type sauvage, et à titre de molécule d'ADN vectorielle, on a utilisé le plasmide pBR322 En utilisant l'endonucléase restrictive EcoR I pour préparer des fragments d'ADN, on a obtenu le plasmide hybride pEK 1. Un traitement ultérieur du plasmide pEX 1 avec l'endonucléase Hind III et la polynucléotidelygase a conduit à la création du plasmide pYN 1, lequel se distingue du plasmide pEX 1 en ce qu'il porte un fragment du chromosome parmi les régions de décomposition à l'endo- nucléase Hind III.Les plasmides pSE 1 et pYN 1 renferment seulement deux des trois gènes de l'opéron de thréonine, les gènes thrA et thrB, comme représenté aux Fig. 1 et 2 du dessin annexé.

La Fig. 1 représente une carte restrictive du plasmide pEX 1 sur laquelle un secteur du plasmide vectoriel pBR322 est désigné par un arc en trait épais et un fragment cloné d'ADN de chromosome par un arc en trait mince. L'arc en pointillé montre un secteur du plasmide éloigné au cours de la construction du plasmide pYN 1. Les flèches montrent les endroits de la décomposition du plasmide par diverses endonucléases, et les chiffres entre elles indiquent l'écart en mégadaltons.Les reotangles noire avec les flèches représentent les parties fpromotrices aet structurales respectivement des gènes de stabilité à la tétracycline (T), à la pénicilline (gap), des gènes de réplication (PO) et de l'opé- ron de thréonine.

La Fig. 2 représente une carte restrictive du plasmide pYNî.'Les désignations sont les mêmes que sur la
Fig. 1. La transformation de la souche E.coli C600 avec les plasmides hybrides obtenus n'a pas provoqué d'accroissement notable de la synthèse de la thréonine par les cellules.

En utilisant la même souche de donneur et le plasmide PBR 322 en qualité de vecteur, mais en employant l'endonucléase spécifique Hind III, on obtient le plasmide hybride pYN 11 contenant l'ensemble des trois gènes de l'opéron de thréonine. La Fig. 3 représente une carte restrictive du plasmide pYN11. Les désignations sont les mêmes que sur la Fig. 1.

La transformation du plasmide hybride de la souche réceptrice E.coli VL334 obtenu a conduit à une production élevée de thréonine au cours du processus de fermentation,
Jusqu'à 4 g/l d'acide aminé s'étant accumulé dans la liqueur de culture. On a trouvé de cette façon que, pour augmenter le rendement en thréonines il est nécessaire d'amplifier les trois gènes de l'opéron de thréonine. De plus, les expériences réalisées ont permis de choisir l'endonucléase iiind III pour la préparation du fragment du chromosome d'E.

Coli contenant tous les gènes de l'opéron de thréonine. La détermination de l'activité spécifique de l'homosérinedéshydrogènase I (produit du gène thrA) dans les extraite de cellules de la souche Ecoli VL334 (pvN11) a montré qu'elle surpasse de plus de 60 fois l'activité spécifique de cette enzyme dans les extraits de cellules contenant une seule copie du gène thrA.En même tempe, d'après le niveau de production de la thréonines la souche Ecoli VL334 (pYN 11), portant le plasmide hybride avec l'opéron de thréonine du type sauvage, surpasse faiblement la fsouche E.coli VNII Genetica Mg442 sans plasmide 9 ayant une mutation dans le gène thrA, laquelle perturbe l'inhibition allostérique dos produits enzymatiques de ce gène avec la thréonine On pense done qu'un bas taux de synthèse se la thréonine avec les cellules de la suche B.coli VL334 (pYN11) est lié au fait que la thréonine accumulée inhibe l'activité des enzymes contrôlant la synthèse de la thréonine et partieulièrement l'homoséine-déshydrogénase I.En rapport avec cela, il s'avère avantageux d'utiliser, en qualité de souche de donneur pour la clonation, 1'opéron de thrénoine de la souche E.coli VNIIGenstica MG442, chez laquelle la régulation négative de la synthèse de la thréonine est perturbée En utilisant la souche E.coli VNIIGenetica MG442 en qualité de donneur et le plasmide pER322 en qualité de vecteur et en employant l'endonucléase Find III pour préparer les fragments d'AND, on a constitué un plasmide hybride pYN10, dont la carte restrictive ne se se distingue pas de la carte de pYN 11 représentée à la Fig. 3.Après la transformation de la souche réceptrice E.coli VL334 avec le plasmide pYN10, on a obtenu une souche E.coli VL334 (pYN 10) possédant une haute productivité en thréonine et synthétisant de 12 à 13 g/1 de thréonien.

Ainsi, pour préparer une souche productrice d'acide aminé à l'aide des plasmides hybrides, on a besoin de la présence d'une mutation chez le fragment à cloner, muta tion troublant la régulation négative de la synthèse d'acide aminé.

Les essais avec des plasmides hybrides de divers poids moléculaire ont montré, conformément aux données connues, que le nombre de copies des plasmides hybrides compte tenu du chromosome bactérien varie de 10 à 22 et dépend de leurs dimensions. Plus le poids moléculaire du plasmide est bas, plus le nombre de ses copies contenues dans la cellule est grand. L'accroissement du nombre de copies du plasmide agit favorablement, comme on le sait, sur sa conservation dans les cellules, c'est-à-dire sur sa stabilité. D'autre part, l'activité des enzymes, contrôlable avec les gènes situés sur le plasmide, est accrue proportionnellement au nombre de copies du plasmide. En rapport avec ce qui préeède, il est avantageux de diminuer la dimension du plasmide hybride portant des gènes qui contrôlent la synthèse de l'acide aminé donné, après avoir éliminé le matériau génétique résiduel (ballast).

La détermination de l'activité de l'homosérine- déshydrogénase I dans les extraits de cellules portant des plasmides hybrides a montré que des concentrations élevées (i mg/ml) de thréonine et d'isoleucine dans un milieu inhibent de 3 à 4 fois l'activité de cette enzyme. Ce fait est considéré comme une manifestation de la répression de 1'opé- ron de thréonine amplifié. Ainsi, pour une manifestation maximale de l'opéron de thréonine amplifié, il est avantageux de créer des conditions de dérépression.

Les conditions de dérépression dans la souche réceptrice peuvent être créées par une détérioration du gène régulateur contrôlant la synthèse de la protéinerépresseur, ou par perturbation de la synthèse du cofacteur de la répression. Particulièrement, de la derépression deltopé- ron de thréonine peut être réalisée par introduction dans la souche réceptrice d'une mutation altérant la synthèse de l'isoleucine, qui participe à la répression de l'opéron de thréonine. On a montré que la synthèse de la thréonine sous contrôle du plasmide hybride est augmentée de 4 à 5 fois par la présence d'une mutation ilvA, bloquant partiellement la synthèse de l'isoleucine dans la souche récep trice VL334.

Comme on l'a montré plus haut, la souche VL334, chez laquelle, à la suite de la mutation thrC la synthèse de la thréonine est bloquée et à la suite de la mutation ilvA l'étape eonnexe du métabolisme de la thréonine (sa transformation en isoleucine) est bloquée partiellement, est également capable de crottre sur un milieu à haute concentration en thréonine en l'absence d'isoleucine. Il est évident que les cellules avec les plasmides hybrides, capables de synthétiser une grande quantité de thréonine, posséderont également une aptitude à la croissance sur un milieu sans isoleucine.En effet, les cellules acquièrent la capacité de crotte sur un milieu glucose-minéral ne contenant pas de facteurs de crois sance additionnels, après la transformation de la souche VL 334 avec les plasmides hybrides portant l'ensemble des trois gènes de l'opéron de thréonine.

Les cellules contenant les plasmides hybrides avec l'opéron de thréonine total (entier) perdent facilement le plasmide hybride dans des conditions non sélectives, et décomposent la souche réceptrice initiale, auxotrophe vis-à-vis de la thréonine et l'isoleucine. Cependant, au cours de la croissance sur un milieu minimal ne renfermant pas de facteurs de croissance additionnels, les cellules portant le plasmide hybride ont un avantage sélectif sur les cellules ayant perdu le plasmide.

Dans ces conditions, on synthétise une grande quantité de thréonine, qui est libérée dans le milieu. La thréonine s'accumulant dans le milieu peut stimuler la croissance des cellules qui ont perdu le plasmide hybride. Toute-
Sois, c'est sous une concentration de thréonine de 10 à 15 g/l seulement que la vitesse de croissance des cellules sans plasmide de la souche VL334 s'approche de la vitesse de croissance des cellules portant le plasmide hybride, lequel renferme l'opéron de thréonine total (entier), à partir de ;la souche de donneur B t coli VmlZGenetica MG442. Ainsi, la mutation bloquant partiellement une étape eonnexe du métabolisme de l'acide aminé donnd, assure un développement stable de la population des cellules portant le plasmide hybride avec les gènes contrôlant la synthèse de l'acide aminé déter miné dans des conditions de fermentation.

Le procédé de l'invention de préparation de souches productrices d'acides aminés permet d'obtenir des souches qui n'ont pas besoin de facteurs de croissance additionnels et qui présentent une haute capacité de production de l'acide aminé voulu, par des techniques de génie génétique, et par augmentation de la dose de gènes indispensables pour la biosynthèse de l'acide aminé demandé.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples concrets de mise en oeuvre du procédé de préparation de souches productrices d'acides aminés.

Exemple 1
A titre de souche de donneur on utilise la souche
E.coli VIIGenetica NG442. La souche est stable à l'analogue de la thréonine (f3-hydroxynorvaline) et porte une mutation dans le gène thrt, troublant l'inhibition allostérique à la thréonine de l'activité de l'homosérine-déshydrogénase I (enzyme clé de la biosynthèse de la thréonine). A titre de molécule d'ADN vectorielle, on utilise le plasmide pBR322.

Ce plasmide est formé à base du réplicon CoLEl et porte des gènes de la résistance à l'ampieilline/pénicilline (Ap) et à la tétracycline (!e). On isole le fragment d'ADN du chromosome de la souche de donneur E.coli VNIIGenetica MG442 et le plasmidé p3R322 par des procédés bien connus. Pour créer des plasmides hybrides, on traite le fragment d'ADN du chromosome de la souche de donneur et le plasmide pBR 322 avec l'endonucléase Hind III pendant 1,5 h à la température de 370C ; on chauffe à la température de 650C pendant 10 min et on effectue le rattachement (réunification) des enzymes avec la polynucléotidelygase du phage 4 à la température de 60C pendant 18 heures. On transforme les cellules de la souche C600 thr' leu- avec le mélange obtenu.

On sélectionne les transformants dans un milieu contenant 500 mcg/ml de pénicilline et 50 mcg/ml de leucine. On obtient des bactéries de deux classes phénotypiques Apt To8 Ehr+Leu et AprEcrlhr+Leu . Pour isoler et analyser l'ADN d'extrachromosome, on choisit à volonté par un clone des transformants de chaque classe.On isole le plasmide hybri de pYN 10 contenant un fragment du plasmide pBR322 et un fragment du chromosome du donneur pesant 5,8 mégadaltons à partir du transformant de la première classe à phénotype Aprlc9thr+Leu . On transforme les souches d'E.eoli à mutations en divers gènes de l'opéron de thréonine avec le plasmide hybride obtenu, pour eontrôler la présence et le fonctionnement de l'ensemble des trois gènes de l'opéron de thréonine dans ce plasmide.On transforme avec le plasmide hybride obtenu les souches d'E.coli avec les mutations dans les gènes de l'opéron de thréonine suivants : Gt14 (thrA1), GiflO2 (thrA2), Gt25 thrB-), VL334 (thrC ). Dans tous les cas les bactéries transformées deviennent prototrophes vis-à-vis de la thréonine, ce qui témoigna de la présence de l'ensemble des trois gènes de l'opéron de thréonine (thrA, thrB et thrC) sur le plasmide. Bineorporation du fragment d'ADN de chromosome dans le plasmide pBR322, décomposé par l'endonucléase Hind III, conduit à une inactivation des gènes du plasmide déterminant la résistance à la tétracy dine, puisque la zone de décomposition avec cette endonucléase se trouve dans le promoteur de ces gènes, ce qui est montré à la Fig. 1. On isole un plasmide de poids moléculaire 11,4 mégadaltons à partir des bactéries de la deuxième classe phénotypique AprTcrThr+Leu-. L'analyse restrictive de ce plasmide, désigne par pYN6, a montré qui est constitué par un fragment d'ADN de chromosome Hind III (5,8 mégadaltons) et par deux copies du plasmide pBR322, réunies suivant le type "tête - queue, ce qui est illustré à la
Fig. 4, dans laquelle une carte restrictive du plasmide pYN6 est représentée. Les fragments du plasmide, à partir desquels le plasmide pYN7 a été formé, sont indiqués par des arcs en pointillé. Les autres désignations sont les mêmes que pour la Fig. 1.La décomposition du plasmide pBR 322 avec l'endonucléase Hind III conduit à la rupture du promoteur des gènes déterminant la résistance à la tétracy dinde. La combinaison successive des fragments formés dans une des deux orientations possibles conduit à une réduction précise de la structure du promoteur et à un fonctionnement des gènes déterminant la résistance à la tétracycline.

C'est pourquoi les cellules contenant le plasmide pYN6 sont stables à cet antibiotique. La transformation des souches d'E.coli, contenant des mutations dans divers gènes de l'opéron de thréonine avec le plasmide pYN6, montre que l'ensemble des trois gènes de l'opéron de thréonine assistent et fonctionnent dans ce plasmide. Pour préparer la souche productrice de la thréonine, on utilise le plasmide hybride pYN6 obtenu, avec lequel on transforme la souche réceptrice, E.coli VL334, portant les mutations thrO1010 et ilvA442. La mutation thrC1010 trouble la synthèse de la thréonine, ce qui permet de sélectionner les transformants qui ont reçu le plasmide hybride.La mutation ilvA442 bloque partiellement l'étape connexe du métabolisme de la thréonine (première réaction dans la voie de la transformation de la thréonine en isoleucine) et ainsi perturbe la transformation de la thréonine et la synthèse de l'isoleucine, laquelle participe à la répression de l'opéron de thréonine.

Le bloc de la synthèse de l'isoleucine est incomplet et peut être compensé par une teneur élevée en thréonine dans la cellule.

On sélectionne les transformants ayant reçu le plasmide pYN6 sur un milieu contenant 500 mcg/ml de pénicilline et 20 ncg/ml de tétracycline, mais sans thréonine et isoleucine. On désigne la souche obtenue par E.eoli
VNIIGenetica VL334 (pYN6). Elle est stable à la pénicilline et à la tétracycline et est capable de croRtre sur un milieu sans acides aminés. L'aptitude à la croissance sans isoleucine est liée à une teneur élevée en thréonine dans les cellules de la souche E.coli VNIIGenetica VL334 (pYN6), laquelle est assurée par une amplification de l'opéron de thréonine mutant, ce qui donne un avantage sélectif aux cellules portant le plasmide hybride, vis-à-vis des cellules qui l'ont perdu. Les cellules de la souche E.coli VNII
Genetica VL334(pYN6) obtenues contiennent près de 10 copies du plasmide pYN6 par chromosome. Les résultats de l'essai de productivité de la souche obtenue sont donnés dans l'exemple 3.

Exemple 2
Le plasmide pYN6 ou pYNlO, obtenu suivant le procédé décrit dans l'exemple 1, est traité par les endonu cléases spécifiques Hind III et Bam H1. Après inactivation des enzymes par chauffage à la température de 650C pendant lO minutes, on traite le mélange à la polynucléotidelygase de phage ?4. On transforme des bactéries de la souche C600 avec la préparation obtenue et on sélectionne des clones à phénotype AprTesThr+. On isole un plasmide désigné par pYN7 à poids moléculaire de 5,7 mégadaltons à partir d'un clone choisi à volonté.Comme l'analyse restrictive l'a montré, deux fragments sont formés au cours de la décomposition de ce plasmide avec les endonucléases Hind III et
Bam H1, un de ces fragments correspond à une partie plus grande du plasmide pBR322 (2,7 Md) et l'autre est un fragment d'ADN du chromosome de la souche VNîîGenetica MG442 (3,0 Md), ce qui est représenté à la Fig. 5. Ces fragments sont représentés par des arcs en pointillé (cf. Fig. 4) dans la carte schématique du plasmide pYN7. La transforma- tion des souches avec les mutations dans divers gènes de l'opéron de thréonine avec le plasmide pYN7, montre que l'ensemble des trois gènes del'opéron de thréonine fonctionnent dans ce plasmide.

Pour préparer la souche productrice de thréonine, on utilise le plasmide pYN7 pour transformer la souche E.

coli VNIIGenetica VL334 portant des mutations dans les gènes thrC et ilvA. Les transformants, qui ont reçu le plasmide pYN7, sont sélectionnés dans un milieu contenant 500 mg/ml de pénicilline mais sans thréonine ni isoleucine. La souche obtenue est nomnée E.coli VNIIGenetica VL334 (pYN7). Elle est stable à la pénicilline et est capable de croItre sur un milieu sans acides aminés.

Dans les cellules de la souche VNIIGenetica
VL 334 (pYN7) obtenue se trouvent près de 20 copies du plasmide pYN7 par chromosome. Les résultats de l'essai de productivité de la souche obtenue sont résumés dans l'exem- ple 3.

Exemple 3
Les souches obtenues suivant le procédé de l'invention décrit dans les exemples 1 et 2, c'est-à-dire la souche E.coli VNîlGenetica VL334 (pYN6), la souche E.coli VNIIGenetiea VL334 (pYN7) et la souche E.coli VNIIGenetica
MG442 (pour comparer la productivité) sont ensemencées avec une boucle du milieu à l'agar incliné d'Adams, contenant 0,5 mg/ml de sel de potassium de benzylpénicilline, dans des fioles coniques de 250 ml de capacité renfermant 30 ml de milieu d'dams liquide (1% glucose) chacune. Aussitôt après l'ensemencement, on place les fioles sur une secoueuse circulaire (200 t/min) et on fait incuber à la température de 370C pendant 18 heures.La semence cultivée de cette façon est utilisée à raison de 1 ml pour l'ensemencement d'un milieu de fermentation préalablement stérilisé par le procédé susmentionné et versé à raison de 15 ml dans chacune des fioles coniques de 250 ml de capacité.

Les milieux de fermentation présentent la composition suivante, en g/l :
Milieu NO 1 Milieu NO 2 Milieu NO 3 glucose 30 50 80 (NH4)2S04 10 15 20 KH2P04 2 2 2 MgSO4 1 1 1 CaC03 20 20 30
On stérilise les milieux de fermentation dans un autoclave sous une pression excédentaire de 0,5 atm. pendant 15 minutes. On stérilise séparément de la craie et on l'introduit dans le milieu après la stérilisation. Après l'addition de la craie, le pH du milieu est de 6,8 à 7,2.

Après l'ensemencement avec les cultures des souches indiquées, les fioles contenant les milieux indiqués sont placées sur une secoueuse circulaire (220 t/min) et sont incubées à la température de 370C pendant 48 heures. Après la fermentation, 95* des cellules conservent la capacité de croître sans thréonine ni isoleucine et sont stables à l'ampicilline, ce qui témoigne de la présence des plasmides dans les cellules de ces souches.

La quantité de thréonine obtenue à l'aide des souches est montrée dans le tableau 1 ci-après.

Pour préparer la L-thréonine dans un fermenteur, on transfère de la souche E.coli VNIIGenetica VL334 (pYN7), obtenue comme est décrit dans l'exemple 2, à raison de 25 ml dans un fermenteur de laboratoire dans lequel on a préala blement placé 250 ml du milieu NO 1 mentionné ci-dessus.

Le régime de fermentation est le suivant : température 370C, quantité d'air entrant dans l'appareil - 1,1 (au rotamètre), vitesse de brassage - 900 t/min. 28 heures après le début de la fermentation, on procède à l'introduction d'une alimentation d'appoint constituée d'un concentré décuple du milieu de fermentation N01 de la composition duquel la craie est exclue. On effectue l'alimentation d'appoint à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit de 1,5 ml/h. 51 heures après le début de la fermentation, la thréonine s'accumule dans le milieu à raison de 20 g/l. 95 % des cellules contiennent après la fermentation le plasmide pYN7. Les résultats des essais sont présentés dans le tableau 1.

TABLEAU 1
NO du plasmide NO du milieu Accumu
Souche dans les cel- de fermenta- lation
lules de la tion de la
thréonine
souche g/1
E.coli VNIIGene- pas de plasmide 1 3,0 tica MG442 2 3,3
3
E.coli VNII plasmide pYN6 1 7,0
Genetica VL334 2 11,2
3 14,4 (pYN6)
E.coli VNIIGene- plasmide pYN7 1 20,0* tica VL334 (pYN7) 2 13,3
3 16,5
* Dans le fermenteur à alimentation d'appoint avec un milieu nutritif.

On isole la L-thréonine à partir de la liqueur de culture par des méthodes connues.

Comme on le voit d'après les données du tableau, le plus haut niveau de formation d'acide aminé est présenté par les souches contenant le plasmide hybride.

Claims (4)

REVENDICATIONS

1.- Procédé de préparation de souches productrices d'acides aminés, caractérisé en ce qu'on réunit un fragment d'ADN du chromosome d'un microorganisme donneur, contenant des gènes contrôlant la synthèse d'un acide aminé choisi et ayant une mutation troublant la régulation négative de la synthèse de cet acide aminé, avec une molécule d'ADN vectorielle, avec formation d'une molécule d'axe hybride, en utilisant à cet effet une molécule d'ADN vectorielle capable d'assurer une amplification de la molécule d'ADN hybride ; on transforme avec la molécule d'ADN hybride obtenue les cellules de la souche réceptrice, laquelle porte une mutation bloquant la synthèse de l'acide aminé choisi dans cette souche et une mutation bloquant partiellement une étape connexe du métabolisme de cet acide aminé, avec obtention d'une souche possédant une haute productivité en l'acide aminé choisi.

2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'avant la transformation des cellules de la souche réceptrice et pour éliminer le matériau génétique résiduel, on traite la molécule d'ADN hybride obtenue avec des endonucléases spécifiques, assurant une décomposition de la molécule d'ADN hybride en des points donnés de la molécule, avec réunification ultérieure des fragments d'ADN demandés par traitement de ceux-ci avec une enzyme, la polynucléotidelygase.

Recherches de la génétique et la sélection des microorganismes industriels, et ayant le numéro de dépSt RsMPMB-1649.

3.- Procédé suivant la revendication l pour la préparation d'une souche productrice de L-thréonifle, caractérisé en ce qu'on réunit un fragment d'ADN du chromosome de la souche de donneur E.coli VNIIGenetica MG442, obtenu à l'aide de l'endonucléase Hind III, fragment contenant des gènes de l'opéron de thréonine, dont les produits enzymatiques du gène thrA sont stables à l'inhibition avec la thréonine à la suite de la mutation, avec une molécule d'ADN vectorielle, au titre de laquelle on utilise le plasmide pBR322, avec formation d'un plasmide hybride, qui a un poids moléculaire de 11,2 mégadaltons, contient deux copies du plasmide pBR322 et un fragment d'ADN du chromosome de la souche de donneur, assure la résistance des cellules à la pénicilline et la tétracycline et peut se trouver dans les cellules au stade de la croissance logarithmique à raison de 10 copies ; on transforme avec le plasmide hybride obtenu des cellules de la souche réceptrice E.coli VL334 ayant des mutations bloquant la synthèse de la L-thréonine et la L-isoleucine, le blocage vis-à-vis de l'isoleucine étant partiel et pouvant être compensé par une haute teneur en thréonine dans la cellule et les mutations indiquées assurant un avantage sélectif aux cellules contenant le plasmide hybride amplifié par comparaison avec les cellules ayant perdu le plasmide au cours du processus de culture et on obtient la souche E.coli VNIIGenetica VL334(pYN6) produisant la L-thréonine, déposée au Musée central des microorganismes industriels de l'Institut de l'Union de

4.- Procédé suivant la revendication 1 ou 2 pour la préparation d'une souche productrice de L-thréonine, caractérisé en ce qu'on réunit un fragment d'ADN du chromosome de la souche de donneur E.coli VNIIGenetica MG442, obtenu à l'aide de l'endonucléase Hind III, contenant des gènes de l'opéron de thréonine, chez lequel à la suite de la mutation les produits enzymatiques du gène thrA sont stables à une inhibition à la thréonine, avec une molécule d'ADN vectorielle, au titre de laquelle on utilise le plasmide pBR322, avec formation d'un plasmide hybride, qui présente un poids moléculaire de 11,2 mégadaltons et renferme 2 copies du plasmide pBR322 et le fragment d'ADN indiqué du chromosome de la souche de donneur ; on traite le plasmide hybride obtenu avec les endonucléases spécifiques Hind III et Bam H7 et on réunit les fragments formés par traitement avec la polynucléotidelygase, le plasmide hybride formé présentant un poids moléculaire de 5,7 mégadaltons, renfermant une molécule du plasmide pBR322 et le fragment d'ADN indiqué du chromosome de la souche de donneur, assurant la résistance des cellules à la pénicilline et pouvant se trouver dans les cellules au stade de la croissance logarithmique à raison de 20 copies ; on transforme avec le plasmide hybride obtenu des cellules de la souche réceptrice E.coli VL334 ayant des mutations bloquant la synthèse de la L-thréonine et la L-isoleucine, le blocage vis-à-vis de l'isoleucine étant partiel et pouvant être compensé par une teneur élevée en thréonine dans la cellule, ces mutations assurant un avantage sélectif aux cellules contenant le plasmide hybride amplifié au cours du processus de culture et on obtient la souche E.Coli

VNIIGenetica VL334 (pYN7) produisant la L-thréonine, déposée au Musée central des microorganismes industriels de l'Institut de l'Union de Recherches de la génétique et de la sélection des microorganismes industriels, ayant le numéro de dépôt RsMPMB-1684.