KR19980702173A

KR19980702173A - 아실기 전이활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자

Info

Publication number: KR19980702173A
Application number: KR1019970705568A
Authority: KR
Inventors: 도시히코 아시카리; 요시카즈 다나카; 히로유키 후지와라; 마사히로 나카오; 유코 후쿠이; 게이코 요네쿠라; 마사코 미즈타니; 다카아키 구스미
Original assignee: 도리이 신이치로; 산토리가부시키가이샤
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-02-16
Publication date: 1998-07-15
Also published as: WO1996025500A1; EP0810287A4; JP3950986B2; AU701065B2; ES2336162T3; ATE449179T1; AU4676196A; DE69638078D1; JPH0970290A; EP0810287B1; KR100559061B1; CA2213082C; US7105719B1; NZ301355A; CA2213082A1; EP0810287A1

Abstract

방향족 아실기 전이효소활성을 갖는 단백질, 이것을 암호화하는 유전자계, 및 이 유전자계를 사용하는 상기 단백질의 제조방법, 및 상기 유전자 및 단백질의 용도를 제공한다. 이 유전자 및 효소단백질은, 식물의 안토시아닌 등의 색소를 아실화함에 의해 색조를 변화시켜, 종래 그 식물이 갖지 않는 색을 갖는 식물, 특히 꽃을 제공한다.

Description

아실기 전이활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자

화초산업은 신규 또한 여러가지의 품종을 개발하는 것에 노력하고 있다. 신규인 품목의 육성을 위한 유효한 방법의 하나로서 꽃의 빛깔을 바꾸는 일이 있고, 고전적인 육종방법을 사용하여, 대부분의 상업적 품종에 대하여 광범위한 빛깔을 만들어 내는 것에 성공하고 있다. 그러나, 이 방법으로서는 종마다 유전자급원이 제한되어 있으므로, 단일의 종이 광범위한 종류의 착색품종을 가지는 일은 드물다.

꽃의 빛깔은 주로 2개의 타입의 색소, 즉 후라보노이드 및 카로티노이드에 근거하며, 후라보노이드는 노란색으로부터 빨강 내지 청색의 범위에 기여하며, 카로티노이드는 오렌지 또는 노란색의 색조에 기여한다. 꽃의 색깔에 주된 기여를 하는 후라보노이드 분자는 시아니딘, 델피니딘, 피튜니딘, 페오니딘, 말비딘 및 페랄고니딘의 배당체인 안토시안이고, 다른 안토시안이 현저한 꽃의 빛깔의 변화를 가져온다. 또한 꽃의 빛깔은 무색의 후라보노이드의 보조발색, 금속착체형성, 글리코실화, 아실화, 메틸화 및 액포의 pH에 의해 영향을 받는다(Forkmann, Plant Breeding 106:1, 1991).

아실화된 안토시안은 시네라리아(Senecio cruentus) 유래의 시네라린(Goto et al., Tetrahedron 25:6021, 1984), 달개비(Commelina communis)유래의 아오바닌(Goto and Kondo, Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 30:17, 1991) 및 오야마 용담(Gentiana Makinoi) 유래의 겐티오델핀(Yoshida et al., Tetrahedron 48:4313, 1992)를 비롯하여, 자연계에서의 수많은 분리예가 보고되어 있다(송명화(松明花:타이마츠바나):Kondo et al., Tetrahedron 26:5879; 차조기, 팬지:goto et al., Tetrahedron 27:2413, 1987:시마후무라사키 달개비:Idaka et al., Tetrahedorn 28:1901, 1987; 참마:Shoyama et al., Phytochemistry 29:2999, 1990; 빨강 캐비지, 도라지, 로벨리아, 락스퍼, 나비콩:goto and Kondo, Angew. Chem., Int. Ed. Engl.30:17, 1991; 당근:glabgen et al., Phytochemistry 31:1593, 1992; 나팔꽃:Lu et al., Phytochemistry 32; 659, 1992; Saito et al., Phytochemistry 40:1283, 1995; 금창(金倉:키란소우), 탑화(塔花:토우바나), 광대수염, 라벤더, 개박하, 오오기세와타, 프렉트란서스, 채화(花:우쯔보구사), 사루비아, 네지리이모:Saito and Harborne, Phytochemistry 31:3009, 1992; 큰가시연:Strack et al., Phytochemistry 31:989, 1992; 캠패뉼러:Brandt et al., 33:209, 1993; 용담:Hosokawa et al., Phytochemistry 40:941, 1995; 히야신스:Hosokawa et al., Phytochemistry 40:567, 1995; ).

이것들의 안토시안을 포함하는 후라보노이드를 수식하는 아실기는 구조적으로 2종류로 나누어진다. 하나는 하이드록시 계피산을 중심으로 하는 방향족 아실기이고, 또 하나는 말로닐기와 같은 지방족 아실기이다. 이것들의 아실기 전이반응중, 글루코오스를 통해 방향족 아실기, 바람직하게는 쿠말산이나 커피산이 결합한 안토시안은 그 흡수극대가 장파장측으로 이동하는 것이 나팔꽃(Pharbitis nil)의 안토시안계 색소를 사용한 실험에 의해 관찰된다(Dangele et al. Phytochemistry 34:1119, 1993).

또한, 시네라리아(Senecio cruentus) 유래의 시네라린는 1개의 지방족 아실기와 3개의 방향족 아실기를 가지지만, 시네라린으로부터의 방향족 아실기의 해리에 의해, 중성의 수용액중에서 색소의 안정성이 저하하는 것이 보고되어 있다(Goto et al., Tetrahedorn 25:6021, 1984). 또한, 용담(Gentiana makinoi)에 유래하는 겐티오델핀은 그 분자내에 존재하는 2개의 방향족 아실기에 의해, 샌드위치형의 분자내 스태킹이 발생하여, 수용액속에서 색소가 안정화되는 것이 보고되어 있다(Yoshida et al., Tetrahedron 48:4313, 1992). 또한, 요시다 등은, 용담의 안토시아닌에는 안토시아닌의 5위치의 글루코오스와 3' 위치의 글루코오스의 각각에 아실기가 결합하고 있는 것을 밝혔다(Tetrahedron 48, 4313, 1992). 또한, 차조기(Perilla ocimoides)의 잎의 안토시아닌은 시아니딘 3,5-디클루코시드의 3위치의 글루코오스에 쿠말산이 결합된 시소닌인 것도 보고되어 있다(Tetrahedorn Letters 27, 2413-2416, 1978).

그러나, 이것들의 연구는 유기화학적 측면으로부터 천연색소의 구조학적 연구에 있어서 이루어지고 있고, 아실기를 전이하는 효소를 단리하는 등의 생화학적 측면으로부터의 연구는 이루어지고 있지 않다.

또한, 식물에 있어서의 안토시안계 색소에의 아실기 전이효소중, 지방족 아실기인 말로닐기 전이효소에 관하여는 파슬리의 배양세포(Matern et al., Arch. Biochem. Biophys. 208:233, 1981; Matern et al., Arch. Biochem, Biophys. 226:206, 1983; Matern et al., Arch. Biochem. Biophys. 234:513, 1984)으로부터의 것을 비롯하여 많은 보고가 이루어지고 있다.

또한, 방향족 아실기 전이반응은 1980년에 패랭이꽃과의 식물인 Silene(Kamsteeg et al., Biochem. Physiol. Pflanzen 175:403, 1980)에서 처음으로 나타나고, Matthiola의 가용화 효소 분획분에도 동일한 방향족 아실기 전이효소 활성이 발견되고 있다(Teush et al., Phytochemistry 26:991, 1986).

그러나, 이것들의 보고에서는 효소활성의 존재를 나타내는 것만으로 머물러 있고, 대응하는 효소단백질을 특정하거나, 그 일차구조나 그위에 그것을 암호화하는 유전자에 관하여는 하등의 지견이 얻어지고 있지 않다. 이것 이외의 방향족 아실기 전이효소에 관해서도 단백질이나 유전자의 일차구조를 밝힌 보고는 없고, 또한 이 안토시안계 색소의 아실화반응을 꽃의 색깔폭의 확대에 적극적으로 이용하여 꽃을 육종한 예나, 아실화를 사용하여 안토시안의 안정화를 도모한 보고도 없다.

한편, 피튜니아(Pitunia hybrida)의 안토시안의 생합성경로는 잘 연구되어 있고(Wiering, H. and de Vlaming, P. Inheritance and biochemistry of pigments, Petunia, P 49-65, (1984), griesbash, R.J., asen, S. and Leonhardt, B. A., Phytochemistry, 30, 1729-1731, 1991), 아실기를 포함하는 안토시아닌이 존재하는 것이 공지되어 있다. 피튜니아의 안토시아닌의 아실기는 쿠말산 혹은 카페산이 공지되어 있고, 안토시아닌의 3위치의 루치노시드에 1분자의 쿠말산 또는 카페산이 결합하고 있고, 화학구조는 안토시아니딘이 말비딘인 경우, 각각 3-0-(6-0-(4-0-쿠마로일)-α- D-글루코필라노실(-5-0-β-D-글루코필라노실-말비딘, 3-0-(6-0-(4-0-카페오일)-α-D-글루코필라노실)-5-0-β-D-글루코필라노실-말비딘으로 되어 있었다. 그러나, 아실기를 2개 가지는 안토시아닌에 대한 보고예는 없었다.

[발명의 요약]

본 발명은, 방향족 아실기 전이활성을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자 및 그 이용에 관한 것이다. 즉, 당해 이용에 관해서는, 식물에 있어서, 후라보노이드, 바람직하게는 안토시안에의 아실기 전이반응을 제어하는 방법을 들 수 있고, 이것에 의하여 단일종이 광범위한 꽃의 색깔을 발현하는 가능성을 제공한다. 특히, 방향족 아실기의 전이에 의해, 안토시안의 흡수극대가 장파장측으로 이동하기 때문에, 기존의 꽃의 색깔에 파란기운을 가지게 하는 경우에 유효하다고 생각된다.

이것들의 기술을 실현화시키기 위해서는 방향족 아실기 전이반응을 관장하는 효소를 밝히고, 그 효소를 암호화하는 cDNA를 분리할 필요가 있다. 또한, 하나의 아실기 전이효소의 cDNA에서 유전자의 상동성을 이용하여 다른 아실기 전이효소 유전자의 분리가 가능하게 된다. 또한, 아실화에 의해 안토시안의 안정성이 높아지기 때문에, 안정한 안토시안 색소의 생산도 가능하게 된다.

본 발명자들은, 용담의 꽃잎으로부터 아실기 전이효소를 정제하고, 그 일차 구조를 결정하였다. 또한, 유전자 재조합 기술을 사용하여 용담, 피튜니아, 차조기 및 시네라리아의 아실기 전이효소의 cDNA를 단리하고, 구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 즉, 본 발명은 용담, 피튜니아, 시네라리아의 꽃잎 및 차조기의 잎에 존재하는 아실기 전이효소를 암호화하고 있는 DNA서열을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명과 관계되는 효소를 사용하여 안토시안계 색소를 아실화함에 의해 꽃의 색깔을 변화시킬 수 있어, 안토시안의 안정성을 높일 수 있다.

본 발명은, 방향족 아실기 전이활성을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자 및 그 이용에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 용담(Gentiana triflora var. japonica), 피튜니아(Petunia hybrida), 차조기(Perilla ocimoides) 및 시네라리아(Senecio cruentus)유래의 방향족 아실기 전이활성을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자 및 그 이용에 관한 것이다.

아실기 전이효소를 암호화하는 유전자는 예를 들면 다음과 같이 하여 수득하는 것이 가능하다. 즉, 우선, 용담의 꽃잎에서 아실기 전이효소를 정제한다. 종래, 본 발명이 이루어지기 이전에, 방향족 아실기 전이효소의 정제에 성공한 예는 없고, 본 발명자등은 각종의 크로마토그래피법, 특히 시바크론 블루-3gA(Cibacron Blue 3GA)를 고정한 수지(예를 들면, 블루 세파로스(등록상표) 수지등)를 사용한 친화성-크로마토그래피법을 행하는 것에 의해 처음으로 해당 효소의 정제에 성공하였다.

다음에, 일상법에 따라서 아실기 전이효소의 부분 아미노산 서열을 해명하고, 이것들의 아미노산 서열에 대응하는 합성뉴클레이오티드를 제작한다.

한편, 동일한 용담의 꽃잎에서 poly A+ RNA를 추출하여, 일상법에 의해, 이중사슬 cDNA를 합성하고, 또한 cDNA library를 제작한다. 상술한 이중사슬 cDNA를 주형으로 하여, 상술한 합성 DNA와 cDNA를 합성할 때에 사용한 합성 DNA 프라이머를 사용하여, PCR법에 의해, 아실기 전이효소 유전자에 특이적인 DNA 단편을 취득한다. 다음에, 이 DNA단편을 프로브로 하여, 상술한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여, 양성 클론을 수득한다. 그리고 이 클론으로부터 회수되는 플러스미드 DNA를 분리하여, DNA 염기서열을 결정한다. 또한 정제한 아실기 전이효소의 분석에 의해 얻어진 아미노산 서열과 DNA 염기서열로부터 추정한 아실기 전이효소의 아미노산 서열을 비교함에 의해, 양성 클론이 요구하는 cDNA 클론인 것을 확인한다.

또한, 본 발명자등은, 피튜니아 품종 사피니아 퍼플(산토리(주))의 꽃의 색깔이 통상의 빨강자주로부터 자주로 변화한 변이주(VM)를 찾아내고, 안토시아닌의 구조결정을, 예를 들면 요시다등의 문헌(Yoshida et al., Tetrahedron 48; 4313, 1992에 기재된 방법에 따라서 행하였다.

본 발명의 DNA로서는, 예를 들면 서열 1 내지 6의 어느것인가에 기재하는 아미노산 서열을 암호화하는 것을 들 수 있다. 그러나, 복수개의 아미노산의 부가, 제거 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수직된 아미노산 서열을 가지는 단백질도, 원래의 단백질과 동일한 효소활성을 유지하는 것이 알려져 있다. 따라서 본 발명은, 서열 1 내지 6의 어느것인가에 기재된 아미노산 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가, 제거 및/또는 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 수직된 아미노산 서열을 가지며, 또한, 방향족 아실기 전이활성을 유지하고 있는 단백질을 암호화하는 유전자도 본 발명에 속한다.

본 발명은 또한, 서열 1 내지 6의 어느것인가에 기재된 염기서열 또는 그 부분, 예를 들면 컨센서스 영역의 6개 이상의 아미노산을 암호화하는 부분에 대하여, 예를 들면 2 내지 5×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 방향족 아실기 전이활성을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 또한, 알맞은 하이브리다이제이션 온도는 염기서열이나 그 길이에 따라 다르고, 염기서열이 짧게 됨에 따라서 하이브리다이제이션 온도는 낮게 하는 것이 바람직하고, 예를 들면 아미노산 6개를 암호화하는 염기서열(18염기)인 경우는, 50℃ 이하의 온도가 바람직하다. 본 발명은 또한, 서열 1 내지 6의 어느것인가에 기재된 아미노산 서열에 대햐여 15% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 예를 들면 30% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또한 방향족 아실기 전이활성을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다.

원래의 염기서열을 가지는 DNA는, 실시예에 구체적으로 기재하는 것같이, 예를 들면 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 의해 얻어진다.

또한, 수직된 아미노산 서열을 가지는 효소를 암호화하는 DNA는, 원래의 염기서열을 가지는 DNA를 기초로 하여, 상용의 부위 특정 변이유발이나 PCR법을 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들면, 수식을 도입하고자 하는 부위를 포함하는 DNA단편을, 상기에 의해 얻어진 cDNA 또는 게노믹 DNA의 제한효소 소화에 의해 수득하고, 이것을 주형으로 하여, 원하는 변이를 도입한 프라이머를 사용하여 부위특정변이유발 또는 PCR법을 실시하여, 원하는 수식을 도입한 DNA단편을 수득하여, 이것을, 목적으로 하는 효소의 다른 부분을 암호화하는 DNA에 연결하면 된다.

혹은 또한, 단축된 아미노산 서열을 가지는 효소를 암호화하는 DNA를 얻기 위해서는, 예를 들면 목적으로 하는 아미노산 서열보다 긴 아미노산 서열, 예를 들면 전체길이 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를, 원하는 제한효소에 의해 절단하여, 수득된 DNA 단편이 목적으로 하는 아미노산 서열의 전체를 암호화하지 않고 있는 경우에는, 부족부분을 합성 DNA를 연결함에 의해 보충하면 좋다.

또한, 이 클론을 대장균 및 효모에서의 유전자 발현계를 사용하여 발현시켜, 효소활성을 측정함에 의해, 수득된 유전자가 아실기 전이효소를 암호화하고 있는 것을 확인하고, 아실기 전이효소 유전자의 해독영역을 분명히 함에 의해 본 발명과 관계되는 아실기 전이효소를 암호화하는 유전자가 수득되며, 또한, 해당 유전자를 발현시키는 것에 의해 유전자산물인 목적의 아실기 전이효소 단백질을 수득할 수 있다.

혹은 또한, 서열 1 내지 6의 어느것인가에 기재된 아미노산 서열에 대한 항체를 사용하여도, 상기 단백질을 수득할 수 있다.

따라서 본 발명은 또한, 상기의 DNA를 포함하여 이루어지는 재조합 벡터, 특히 발현 벡터, 및 해당 벡터에 의해 형질전환된 숙주에 관한 것이다. 숙주로서는, 원핵생물 또는 진핵생물을 사용할 수 있다. 원핵생물로서는, 세균, 예를 들면 에스케리치아(Escherichia) 속에 속하는 세균, 예를들면 대장균(Escherichia coil), 바실러스(Bacillus)속 미생물, 예를 들면 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)등의 상용의 숙주를 사용할 수있다.

진핵성 숙주로서는, 하등진핵생물, 예를 들면 진핵성 미생물, 예를 들면 진균인 효모 또는 사상균을 사용할 수 있다. 효모로서는, 예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces)속 미생물, 예를 들면 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyce cerevisiae) 등을 들 수 있고, 또한 사상균으로서는 아스페르질러스(Aspergillus)속 미생물, 예를 들면 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus orizae), 아스페르질러스 나이저(Aspergillus niger), 페니실륨(Penicillium)속 미생물 등을 들 수 있다. 또한, 동물 세포 또는 식물세포를 사용할 수 있고, 동물세포로서는, 마우스, 햄스터, 원숭이, 인간 등의 세포계가 사용된다. 또한, 곤충세포, 예를 들면 누에의 세포, 또는 누에의 성충 그 자체도 숙주로서 사용된다.

본 발명의 발현 벡터는, 이것들을 도입하여야 할 숙주의 종류에 의존하여 발현제어영역, 예를 들면 프로모터 및 터미네이터, 복제기점 등을 함유한다. 세균용 발현벡터의 프로모터로서는, 상용의 프로모터, 예를들면 trc 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터 등이 사용되고, 효모용 프로모터로서는, 예를 들면 글리세르 알데히드 3인산 디하이드로게나제 프로모터, PH05 프로모터 등이 사용되고, 사상균용 프로모터로서는 예를 들면 아밀라제, trp C등이 사용된다. 또한, 동물세포숙주용 프로모터로서는 바이러스성 프로모터, 예를 들면 SV 40 아리 프로모터, SV40 레이트 프로모터 등이 사용된다.

발현 벡터의 제작은, 제한효소, 리가제 등을 사용하여 일상법에 따라서 행할 수있다. 또한, 발현 벡터에 의한 숙주의 형질전환도, 일상법에 따라서 행할 수 있다.

상기 단백질의 제조방법에 있어서는, 상기의 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양, 재배 또는 사육하여, 배양물 등으로부터 일상법에 따라서, 예를 들면, 여과, 원심분리, 세포의 파쇄, 겔여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등에 의해 목적으로 하는 단백질을 회수, 정제할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서는 용담, 피튜니아, 차조기 및 시네라리아 유래의 아실기 전이효소에 대하여 서술하고 있지만, 해당 효소의 정제법을 그대로 또는 일부를 개변하여, 다른 식물의 아실기 전이효소를 정제하여, 해당 효소와 관계되는 아미노산 서열을 결정함에 의해, 해당 효소를 암호화하는 유전자를 클로닝할 수 있다. 또한, 본 발명과 관계되는 용담 유래의 아실기 전이효소의 cDNA를 프로브로서 사용하는 것에 의해, 용담으로부터 별도의 아실기 전이효소의 cDNA, 피튜니아로부터 별도의 아실기 전이효소의 cDNA를 수득할 수 있었다. 따라서, 아실기 전이효소의 유전자의 일부 또는 전부를 사용하면, 다른 아실기 전이효소 유전자를 수득할 수 있다. 또한, 이것들의 아미노산 서열을 비교한 바, 보존되어 는 아미노산 서열이 있었다. 이 영역을 사용하여, 차조기 및 시네라리아 유래의 아실기 전이효소의 cDNA를 수득하는 것에 서옹하였지만 동일한 수법을 사용하는 것에 의해, 다른 식물에 응용하여, 유사한 아실기 전이효소의 cDNA 또는 염색체 DNA 클론을 수득하는 것이 가능하다.

또한, 본 명세서에 있어서 도시한 바와 같이, 용담, 피튜니아, 차조기 및 시네라리아 유래의 아실기 전이효소를 정제하여, 일상법에 따라서 해당 효소에 대한 항체를 수득함에 의해, 그 항체와 반응하는 단백질을 만드는 cDNA 또는 염색체 DNA를 클로닝할 수 있다. 따라서, 본 발명은 용담, 피튜니아, 차조기 및 시네라리아 유래의 아실기 전이효소의 유전자에만 한정되지 않고, 널리 방향족 아실기 전이효소에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 아실기 전이효소의 유전자를 도입함에 의해, 빛깔이 조절된 식물 또는 빛깔이 조절된 식물의 자손 또는 이들의 조직에 관한 것이고, 그 형태는 자른 꽃가지라도 좋다.

또한, 본 명세서에 있어서는 안토시안을 포함하는 후라보노이드의 아실기 전이 반응에 있어서, 아실기의 공여체로서 p-쿠말로일-CoA 또는 카페오일-CoA 등의 CoA 에스테르를 들었지만, p-쿠말로일, 펠로일 또는 시나포일-1-0-글루코오스라고 하는 하이드록시 신나모일-1-0-글루코오스도 방향족 아실기의 공여체로서의 이용이 가능하기 때문에(Glassgen and Seitz, Planta 186:582,1992), 본 발명과 관계되는 효소를 사용한 이용이 가능하다.

[실시예]

이하에 본 발명을 실시예에 기초하여 상세히 설명한다. 실험의 순서는 특히 기술하지 않는 한 Sambrook 등의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 따랐다.

[실시예 1]

식물로부터의 아실기 전이효소의 검색

(1) 기질의 조제

델피니딘 3,5-디클루코시드 및 시아니딘 3,5-디클루코시드는 버베나(Verbena hybrida)의 일품종인 타피안 바이오렛트(산토리(주)에서 구입가능)의 꽃잎으로부터 각각의 디아세틸체를 추출하여, 탈아세틸화함에 의해 취득하였다. 타피안 바이오렛트의 꽃잎(348g)을 액체질소와 함께 호모게나이저로 마쇄하고, 50%(v/v) 아세트니트릴, 0.2% 트리플루오로 아세트산(TFA) 용액 1.5L에 담구어 3일간 방치하였다.

여과지상에 규조토(# 100)를 깔아채워 흡인통과하여, 로터리 증류기로 약 반량으로 농축하여, HP-20(파마시아사)으로써, 겔여과를 행하였다. 800ml의 증류수로 세정후, 50% 아세트 니트릴, 0.1% TFA 800ml로 색소 분획분을 용출하였다. 증류기로 농축후, 동결건조하고, 조색소(租色素:7.3g)을 수득했다.

타피안의 주색소는 델피니딘 및 시아니딘의 3,5-디아세틸 글루코시드이기 때문에, 이하의 탈 아세틸화 조작을 행하였다. 조색소 1g를 메탄올 50ml에 용해하여, 질소가스를 15분간 통풍하여 용존산소를 제외한 후, 빙냉하였다.

한편으로, 1N 수산화 나트륨 50ml에서 마찬가지로 용존산소를 제외하고, 빙냉하에서 앞의 색소용액에 교반하면서 적하하고, 또한 30분간 교반하여 가수분해반응을 시켰다. 6N 염산 1ml를 가하여 반응을 정지시키고, 증류수 15ml를 가하여 증류기로 약 반량으로 농축하고, 최종농도 10%가 되도록 메탄올을 가하여 2ml씩 Sep Pac Cl8 칼럼(워터즈 어소시에이션사)에 적용하여, 증류수 5ml로 세정한 후, 30% 아세토니트릴, 0.6% 2ml로 용출하였다.

용출액을 전부 모아 증류기로 농축하여, HPLC에 의한 분취를 행하였다. DEVELOSIL OSD-1020(50×300m; 노무라가가쿠(주)) 칼럼을 사용하여, 120분간에서 TFA가 0.1% 로부터 0.3%, 아세토니트릴이 10%로부터 30%의 직선농도구배에의해서 용출시켰다. 매분 32ml의 유속으로 0.5분마다 분취하여, 각 분획분의 색소 분획분의 흡수 스펙트럼을 측정하여, 델피니딘 3,5-디클루코시드 및 시아니딘 3,5-디클루코시드를 분리하여 각각을 농축, 동결건조한다(피니딘 3,5-클루코시드 75mg, 시아니딘 3,5-디클루코시드 50mg). 각각을 1.5mg/ml가 되도록 0.5% TFA에 용해하여, 사용할 때까지 -80℃에 보존하였다.

벌써 한쪽의 기질인 하이드록시 신나모일-CoA의 합성은 이하의 방법으로 행하였다. 최초에, 문헌(Stockigt and Zentk, Z. Naturforsch. 30:352, 1975)에 따라서 카페산(나카라이데스크사)과 N-하이드록시 스크신 이미드(머크(Merck0사)에서 에스테르를 합성하였다. 이 에스테르 0.5mmol을 2ml의 아세톤에 용해하고, 한편으로 코엔자임 A(CoA:KOHJIN) 0.1mmol과 탄산수소 나트륨 1mmol을 20ml의 물에 용해하고, 이것에 앞의 에스테르 용액을 1방울씩 가하였다.

교반하면서 질소가스하에서 실온에서 하루밤 반응시킨 후, 로터리 증류기로 농축하여, 원심(27000×g, 10분)에 의해서 불용물을 제외하고, HPLC에서 목적의 생성물을 분리취득하였다. DEVELOSIL 0DS-10/20(50×300mm; 노무라가가쿠(주)) 칼럼을 사용하여 0.1% TFA 존재하에서 아세트 니트릴이 40분간으로 18%에서 36%의 직선농도구배에 의해서 용출시켰다. 매분 32ml의 유속으로 0.8분마다 분리취득하여, 각 분획분의 흡광스펙트럼(200 내지 400nm)을 조사하여 344 내지 348nm로 극대흡수를 가지는 분획분을 카페오리 CoA 분획분으로서 모았다. 이것들을 로터리 증류기로 농축한 후, 동일한 컬럼으로 다시 분리하였다.

단, 아세트 니트릴 18%, TFA 0.1%의 등농도 크로마토그래피로 분리를 행하고, 마찬가지로, 흡광스펙트럼을 조사하여, 목적의 화합물을 포함하는 분획분을 로터리 증류기로 농축하여, 동결건조하였다. 이 방법으로 35μmol의 생성물이 수득되었다. 또한, 상기의 방법중 카페산의 대신에 쿠말산을 사용하는 것에 의해 p-쿠말로일-CoA를 합성할 수 있고 2mg/ml이 되도록 증류수에 용해하여, 사용할 때까지 -80℃로 보존하였다.

(2) 조효소액의 추출방법

효소를 추출하는 식물조직(꽃잎이나 식용부분등) 3g을 액체질소로 동결시켜 유발상에서 마쇄하였다. 10ml의 추출용 완충액(100mM) 인산완충액(pH 7.5), 10mM 아스코르빈산 나트륨, 14mM 2-머캅토에탄올)을 가하여 다시 마쇄하여, 가제 3층으로 여과하였다. DOWEX(1-X2, 100-200mesh; 무로마치가가쿠고교(주)) 3g을 첨가하여 10분간 교반한 후에 흡인여과에 의해서 수지를 제거하여, 원심분리(27000×g, 20분)에 의해서 식물체 잔사를 제거하였다. 70% 포화황산암모니아로 염석을 행하여, 단백질을 침전시켰다. 침전을 1ml의 용해중 완충액(20mM 인산완충액(pH 7.5), 14mM 2-머캅토에탄올)에 현탁하여, 원심분리(27000×g, 5분)에 의해서 불용물을 제거한 후, 용해용 완충액으로 평형화시킨 Sephadexg-25칼럼(NAP-10; 파마시아사)을 사용하여 탈염한 용액을 조효소액으로서 사용사였다.

(3) 효소활성의 측정방법

100mM 인산완충액(pH 8.5), 델피니딘 3,5-디클루코시드 24nmol, 카페오일-CoA 21.5nmol, 및 효소액 20μl를 포함하는 반응액 50μl를 30℃로 10분간 반응시켰다. 13.8%(v/v) 아세트산을 포함하는 아세트 니트릴 50μl를 가하여 반응을 정지시켜, 원심분리(18000×g, 5분)에 의해서 불용물을 제외한 후, 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 분석은 C18 역상컬럼(YMC-Pack ODS-A, 6.0×150mm; 와이엠시사)을 사용하고, 21.6% 아세트 니트릴 0.1% 트리플루오로 아세트산을 매분 1ml의 유속으로 흘려, 반응액 20μl를 분석하였다. 화합물의 검출에는 삼차원 크로마토그래피 시스템(CLASS-LC10; (주) 시마즈세이사쿠쇼)을 사용하며, 생성물은, 기질에는 없는 330nm 부근에 극ㄷ대흡수를 가지는 것, 및 가시부의 흡수극대값이 519nm에서 525nm와 약 6nm 장파장측으로 이동하고 있기 때문에, 아실기(카페산)가 결합하여, 델피니딘 3-글루코실 5-카페오일글루코시드를 생성하고 있는 것을 확인하였다.

520nm의 파장으로 검출하여, 기질(델피니딘 3,5-디클루코시드)과 생성물(델피디딘 3-글루코실 5-카페오일 글루코시드)과의 피크면적의 합에 대한 생성물의 피크면적의 비를 구하여, 생성물의 몰수를 계산하여 효소활성(kat)으로 했다. 이 HPLC분석에 있어서의 각 화합물의 전개시간은 다음과 같다. 카페오일-CoA:6.3분, 델피니딘 3,5-디글루코시드:3.3분, 델피니딘 3-글루코실 5-카페오일 글루코시드:5.3분.

단지, 이 반응조건하에 있어서는 반응액중의 델피니딘 3,5-디글루코시드가 아실기 전이효소에 의해, 카페산으로 수식되는 것에 의해, 반응액의 빛깔이 농청색으로부터 적자색으로 변화하기 때문에, 간편한 방법으로서, 마이크로 타이터 플레이트속에서 반응을 행하여, 빛깔의 변화에 의해서 효소활성을 조사할 수 있다.

또한, 반응후의 플레이트를 실온에서 장기간(1일 내지 1주간)방치하면, 아실화되어 있지 않은 델피니딘 3,5-디글루코시드는 무색화하는데 대하여, 효소의 작용에 따라서 아실화된 델피디딘 3,5-디클루코시드에서는 적자색이 남아있기 때문에, 델피니딘 3,5-디클루코시드가 아실화되는 것에 따라 중성으로부터 알칼리성의 수용액중에서의 안정화가 인정되었다. 동일하게 시아니딘 3,5-디클루코시드를 기질로 한 경우도 반응액의 빛깔이 적자색으로부터 농청색으로 변화하고, 색소가 안정화하는 점에서, 간이적인 효소 검정 방법에서의 효소활성의 검출이 가능하다.

한편, 카페오일-CoA의 대신에 p-쿠말로일-CoA를 기질로 한 경우도 아실화에 의한 빛깔의 변화 및 안토시아닌의 안정화가 인정되지만, 색조의 변화의 정도는 카페오일-CoA인 경우와 비교하여 적다.

(4) 아실기 전이효소의 검색

각종의 식물(용담, 아이리스, 델피니움, 자라난화, 터키도라지, 패랭이꽃, 스위트피이, 라쿠스파, 팬지, 시네라리아(이상, 꽃잎), 적양배추, 적양파, 금시당근, 서양당근, 자주감자, 차조기(이상, 식용부분) 및 가지(과실상피부분))로부터 상기의 방법에 의해서 조효소액을 추출하여, 효소활성을 측정한 바, 터키도라지, 패랭이꽃 및, 용담에 각각 0.63, 0.0012 및 21.8nkat/mg 단백질의 아실기 전이활성이 확인되었다. 추출단백질에 있어서의 아실기 전이효소활성이 가장 높은 용담을 효소정제의 재료로서 사용하는 것으로 하였다.

또한, 단백질 농도의 정량에는 Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad사)를 사용하였다.

[실시예 2]

용담유래의 아실기 전이효소의 정제

(1) 효소의 정제

에조용담(Gentiana triflora var.iaponia)의 꽃잎으로부터 효소의 정제를 행하였다. 이하의 실험은 기재가 없는 한, 0 내지 4℃로 행하였다. 에조용담의 꽃잎 3kg을 액체질소 존재하에서 엑셀·오토·호모게나이저(DX-3; 니혼세이기 세이사쿠쇼)를 사용하여 마쇄하였다. 8L의 추출용 완충액(100mM 트리스염산(pH7.0), 10mM 아스코르빈산 나트륨, 10μM p-아미디노페닐 플루오르화 메탄 술포닐 염산염(p-APMSF; 와코쥰야쿠고교(주)), 5mM 디티오스레이틀(DTT; 나카라이데스크사))과 폴리크랄 SB-100(와코쥰야쿠고교(주)) 500g를 가하여 폴리트론으로 완전하게 분쇄하였다.

분쇄액을 가제 4층으로 짠 후, 또한 원심분리(11000×g, 30분)하여 세포잔사를 제거하였다. 40% 포화황산암모니아로 염석을 행하여, 불용물을 제거한 후에 70% 포화황산암모니아로 다시 염석을 행하였다. 침전을 250ml의 용해중 완충액(20mM 트리스염산(pH 7.0), 10μMp-APMSF, 1mM DTT)에 현탁하여, 원심분리에 의해서 불용물을 제거한 후, 동일 완충액으로 평형화시킨 Sephadexg-25(95×110mm; 파마시아사)의 컬럼을 사용하여 탈염하였다. 단백질을 포함하는 분획분을 모아(860ml), 이하의 크로마토그래피에 제공하였다.

또한, Q-Sepharose Fast Flow, HiTrap Blue 및 Phenyl Superose의 각 크로마토그래피는 실온에서 FPLC시스템(파마시아사)을 사용하여 행하였다.

우선, 용해용 완충액으로 평형화시킨 Q-Sepharose Fase Flow(26×100mm; 파마시아사)에 적용하여, 동일한 완충액으로 충분히 세정한 후, 염화나트륨 농도를 60분간으로 0M에서 0.4M에서 변화시키는 직선구배에 의해 용출했다(8ml/min). 효소 활성이 있는 분획분을 모은(130ml)후, 어피니티 크로마토그래피를 행하였다. 용해용 완충액으로 평형화시킨 HiTrap Blue(5ml, 16×25mm; 파파시아사)를 3개 직렬로 이온 컬럼에 적용하여, 동일 완충액으로 충분히 세정한 후, 1M 염화나트륨을 포함하는 동일 완충액으로 용출하였다. 활성 분획분을 70% 포화의 황산암모니아로 염석하여, 단백질의 침전을 수득했다.

이 침전물을 1ml의 용해용 완충액으로 현탁하여 원심분리에 의해서 불용물을 제거한 후, 용해용 완충액으로 평형화시킨 Sephacryl S-200(25×1150mm; 파마시아사)에 적용하였다. 매분 0.2ml의 유속으로, 약 3ml씩 분리취득하여, 다시 활성 분획분을 모아(27ml), 1M이 되도록 황산암모니아를 가하였다. 충분히 교반한 후, 원심분리(39000×g, 10분)에 의해 불용물을 제거하여, 1M 황산암모니아를 포함하는 용해용 완충액으로 평형화시킨 Phenyl Superose 5/5(5.0×5.0mm; 파마시아사)에 적용하였다.

매분 0.5ml의 유속으로, 충분히 세정한 후, 황산암모니아 농도를 60분간 1M에서 0M로 직선적으로 내리는 것에 의해 단백질을 유출시키었다. 0.5ml씩 분리취득한 각 분획분의 효소활성을 측정하여, SDS-폴리 아크릴 아마이드 겔 전기영동(10% 아크릴 아마이드겔; 다이이찌가가쿠(주))로 분석한 결과, 거의 단일의 단백질로서 분자량 약 50,000의 밴드가 인정되고, 또한 이 단백질량과 화렁의 상관이 확인되기 때문에, 이 단백질이 목적의 아실기 전이효소라고 단정하였다. 또한 단일표준품을 얻기 위해서 활성을 가지는 분획분(12ml)을 역상 HPLC에 의해 정제하였다.

컬럼은 DEVELOSIL 300C4-HG-5(4.6×250mm; 노무라가가쿠(주))를 사용하고, 매분 1ml의 유속으로, 트리플루오르 아세트산 0.1% 존재하에서, 30분으로 아세트니트릴 농도를 40.5%로부터 56.7%의 직선농도구배로 변화시키는 것에 의해 용출하였다. 280nm의 흡수를 모니터하면서 1ml씩 분획하고, 또한 각 분획분을 SDS-폴리아크릴 아마이드겔 전기 영동으로 분석하여 분자량 약 50,000의 단백질을 포함하는 분획분을 모았다. 이 HPLC의 조작을 30회 반복하고, 스피드백(사반트사)으로 농축함에 의해 약 0.2mg의 단일 단백질 표준품을 수득할 수 있었다.

(2) 정제 단백질의 분석

500pmol의 정제표준품을 아미노산 시퀀서( PSQ-1; (주) 시마즈세이사쿠쇼)에 제공한 바, 에드맨 분해의 제일단째에서 200pmol의 글루타민산, 또한 제2단째에서도 90pmo1의 글루타민산이 검출되었지만, 삼단째 이후는 판독불능이기 때문에, 본 효소의 N말단은 어떠한 형으로 차단되어 있다고 생각된다.

그러나, N 말단이 글루타민산인 경우에는 피로글타밀기가 생겨, 에드맨 분해에 의한 시퀀스에서는 상술한 바와 동일한 결과를 나타내는 것이 공지되어 있기 때문에 본 효소의 N말단은 글루타민산일 가능성이 높다.

나머지의 침전을 80μl의 45mM 트리스염산(pH 8.5), 3.6M 요소, 0.09% SDS를 포함하는 용액에 용해하여, 리실 엔드 펩티다제(Lysyl Endopeptidase : Achromobactor lyticus 유래; 와코쥰야쿠고교(주)) 16pmol을 가하여, 37℃로 6시간 반응시켰다. 반응액을 그래도 DEVELOSIL 300C4-HG-5 컬럼으로 분리하였다.

분리조건은, 0.1% 트리플루오르 아세트산하에, 70분으로 아세트 니트릴농도가 0% 부터 80%의 직선농도구배, 매분 0.7ml의 유속으로, 210nm의 흡수를 모니터하면서 흡수의 피크 분획분만을 분리취득하였다. 수득된 13개의 피크 분획분중, 아세트 니트릴농도가 32%부터 40%의 시점에서 용출된 피크 분획분의 3개를, 스피드백에 의한 농축후, 또한 OSD 관련(DEVELOSIL 300 ODS-HG-5; 노무라가가쿠(주))를 사용하여, 전과 동일한 조건으로 분리 및 정제를 행하였다.

각 피크 분획분을 스피드백으로 농축·건조고체화하여, 40% 아세트 니트릴 30μl에 용해시켜, 아미노산 시퀀서에 제공하였다. 그 결과 6개의 펩티드의 아미노산 서열을 판독할 수 있었다.

이하에, 각각의 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다(아미노말단에서 카르복실말단의 방향으로 나타낸다).

[실시예 3]

용담유래의 아실기 전이효소의 cDNA 클로닝(1)

(1) cDNA 라이브러리의 제작

시판되고 있는 용담(Gentiana triflora var. janonica)으로부터 꽃을 모아, 액체질소속에서 유발로 마쇄하였다. 이 마쇄물로부터, 구아니딘 티오시아네이트/염화세슘을 사용하는 방법에 의해 RNA를 수득하여, 올리고텍스(니혼롯슈)를 사용하여, 제조자가 추장하는 방법으로써, poly A+RNA를 수득했다. 수아니딘 티오시아네이트/염화세슘을 사용하는 방법은, R. McGookin, Robert J. Slater등의, Methods in Molecular Biology vol 2, (Humana Press Inc. 1984)에 상세히 나타나고 있는 방법에 따랐다.

수득된 poly A+RNA를 주형으로 하여, ZAP-cDNA합성 키트(스트라타진사제)를 사용하여 이중사슬 cDNA를 합성하여, 파아지벡터-λ-ZAPII로의 클리닝을 행하였다. 또한, 동사의 gigapackIIgold Packaging Extract 키트를 사용하여, 해당 키트에 기재된 방법으로 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

(2) 합성 DNA 프라이머의 설계

실시예 2에서 수득된 부분의 아미노산 서열중, Ile-His-Met-Asp-Ala-Phe-Ala-Lys(서열 13)로 나타나는 서열은, 리딜엔드 펩티다제의 특이성을 생각하면, Lys-Ile-His-Met-Asp-Ala-Phe-Ala-Lys(서열 14)라고 생각된다. 이 서열의 속의 아미노산서열; Lys-Ile-His-Met-Asp-Ala-Phe-Ala(서열 15)로 나타나는 부분을 사용하여, 올리고 뉴클레오티드를 합성했다.

단, 특히 기재하 없는 한, 핵산의 서열은 IUPAC-IBU 준거의 핵산암호화표에 따라서 1문자로 표기한다. 즉, A:아데닌, C:시토신, g:구아닌, T:티민, Y:C 또는 T, R:A 또는 g, H;A 또는 C 또는 T, 및 I는 이노신을 나타낸다.

또한, 먼저 서술한 cDNA 라이브러리 제작시에 사용한 프라이머를 바탕으로 이하의 다른 올리고 뉴클레오티드도 합성하였다.

(3) 아실기 전이효소 유전자 단편의 클로닝

용담의 꽃잎의 RNA에 유래하는 이중사슬 cDNA 약 0.1μg을 주형으로 올리고 1과 올리고 2를 프라이머로서, PCR 반응을 행하였다. 반응은 폴리머라제 체인 반응키트 gene Amp(다까라주조(주))를 사용하여, 95℃ 1분, 45℃1분, 72℃ 2분을 1사이클로 하여, 35사이클 행하여, 수득된 반응물을 1% 아가로스 전기영동한 바, 약 400bp의 특이적인 DNA 단편이 관찰되었다. 이 DNA 단편을 회수하여, 그 10ng을 DIG-뉴클레오티드 혼합액(베링거사)과 합성뉴클레오티드 Ⅰ과 Ⅱ를 사용하여, 상술한 PCR 반응을 25사이클 행하여, DIG로 표지한 DNA단편을 수득했다.

(4) 아실기 전이효소의 cDNA의 클로닝

상기한 바와 같이 하여 수득된 λ파아지 라이브러리를 대장균 XL1-Blue 주(스트라타진사)에 감염시켜, 1플레이트에 대해 플라크 5만개를 포함하는 5매의 플레이트(직경 13.5cm)를 스크리닝하였다.

파아지를 필터(Hybond N+, 아마샴사)에 흡착시켜, 제조자가 추장하는 방법으로 처리한 후, 이 필터를 하이브리다이제이션 버퍼(5×SSC, 50% 포름아미드, 50nM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.0). 7% SDS, 2% Biocking reagent(베링거사), 0.1% 라울로 일살코신, 80mg/ml 연어정자 DNA)속에서 42℃로 1시간 유지하였다. DIG 표지한 상술한 DNA단편을 하이브리다이제이션액중에 가하고, 또한 16시간의 인큐베이션을 행하였다.

세정액(0.2×SSC, SDS)으로 필터를 세정하여, 알카리 호스파타제로 표지된 DIG특이적인 항체에 의한 효소면역측정법(베링거·맨하임 가부시키가이샤)에 의해 5-브로모 4-클로로 3-인드릴 인산과 블루 테트라 조륨염의 발색반응에 의해서, 검출하였다. 검출방법은 제조자에 의한 사용설명서에 따랐다.

이 결과, 수십개의 양성 클론이 수득되어지고, 그중 20클론을 스트라타진사의 추장하는 방법으로, cDNA를 플러스미드 pBluescript SK상에 회수하였다. 아가로오스겔 전기영동으로 cDNA의 삽입을 조사한 바, 모든 클론에 있어서 각종 크기의 cDNA의 삽입이 확인되고, 그 중 최장의 것은 1.7kb이었다. 이 들중에서 적당히 9클론을 선택하여 제한효소에 의한 해석을 행한 바, 크기는 다르지만 모든 클론으로 동일한 제한효소 패턴을 나타내었다.

(5) 염기서열의 결정

수득된 클론으로부터 플러스미드를 추출하여, ABI373A-DNA 시퀀서(파킨엘마사)를 사용하여, 동사가 추장하는 형광시약에 의한 다이데옥시 시퀀스법으로, 상술한 9클론중 전체 길이를 포함한다고 생각되는 6개의 클론(pGAT2, pGAT3, pGAT4, pGAT7, pGAT8 및 pGAT11)에 대하여 cDNA의 5' 측의 염기서열을 결정하였다.

그 결과, 이것들의 클론은 상호 동일한 염기서열을 가지고 있고, cDNA의 길이가 다른 것으로 생각되었다. 이것들의 클론중 pGAT4의 전체 염기서열을 결정하였다. 염기서열의 결정은, Kilo-Sequence용 Deletion Kit(다까라주조(주))를 사용하여, 일련의 결실 클론을 얻은 후, 각각의 클론을 사용하여 상술의 방법에 의해 행하였다.

(6) 염기서열과 아미노산 서열의 비교

pGAT4에 삽입된 cDNA는 1703염기이고 그 속에서 1410염기(종지코든를 포함한다)로부터 이루어지는 오픈리딩프레임(0RF)이 발견되었다. 이 서열을 서열표·서열 1에 나타낸다. 실시예 2에서 분명하게 된 아실기 전이효소의 부분 아미노산 서열의 모두가 0RF중의 아미노서열로서 존재하기 때문에, 클로닝된 cDNA는, 용담 유래의 아실기 전이효소 유전자라고 결론하였다. 개시코든에 대하여는, 아미노말단의 해석으로부터 글루타민산이 아미노말단의 잔기라도 추측되었기 때문에, cDNA의 염기서열상에서, 5' 측에서 최초의 ATG가 개시코든으로 추정관찰하였다.

한편, pGAT8에 관계되는 cDNA는, 5'측이 pGAT4보다도 7염기 짧으므로, 완전한 길이의 cDNA가 아니라고 생각되었다.

[실시예 4]

(1) 발현플러스미드의 구축

대장균에서의 아실기 전이효소 유전자의 발현에서는, 대장균의 발현 벡터인 pTrc 99A(파마시아사)를 사용하였다. 이 pTrc 99A는 이소프로필-β-D-티오갈락토 필라노시드(IPTG)로 유도가능한 대장균의 trc 프로모터를 포함하며, 그 하류에 목적유전자를 삽입함에 의해, 대장균에서의 유전자 발현이 가능하게 된다.

또한, 제한효소 NcoI 부위가 개시코든인 ATG 서열을 이용하여 도입되어 있고, NcoI 부위에서 재조합함에 의해, 목적유전자의 개시코든으로부터의 직접 발현이 가능하다.

pGAT4를 해당 벡터내에 존재하는 제한효소부위 Ec0RI과 KpnI에서 소화하여 수득되는 약 1.8kb의 DNA단편(서열표·서열 1기재의 염기서열을 모두 포함한다)을 상술한 pTrc 99A의 EcoRI, KpnI 부위에 재조합함에 의해, pGAT101을 구축하였다.

아실기 전이효소의 개시코든 부분에 NcoI 부위의 도입을 행하기 위해서, 개시코든 부근, 및 아실기 전이효소 유전자 내부(개시코든으로부터 300염기째 부근)에 대응하는 이하의 2종류의 올리고 뉴클레오티드를 합성하였다.

10ng의 pCAT4를 주형으로 하여, 상기의 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로서 PCR 반응을 행하였다. 반응은 폴리메라제 쳬인반응 키트 gene Amp(다까라주조(주))를 사용하여, 95℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 2분을 1사이클로 하여, 15사이클행하여, 수득된 반응물을 1% 아가로스 전기영동한 바, 약 300bp의 특이적인 DNA단편이 관찰되었다. 이 DNA단편을 회수하여, 제한효소 NcoI과 AatI에서 절단 후, pGAT101을 NcoI와 AatI으로 절단하여 수득되어지는 약 6kb의 단편과 연결함에 의해, pGAT102를 구축하였다. PCR법에 의해 증폭한 부분의 염기서열은 pGAT102 구축후에 pGAT4와 동일한 것을 확인하였다.

(2) 아실기 전이효소 유전자의 대장균에서의 발현

pGAT102에서 대장균 MM294(supE44 hsdR endAl pro thi)(Meselson and Yuan, Nature, 217, 1110-, 1968)를 형질전환하였다. 또한, 여기에서 형질전환되는 숙주는, 형질전환용의 숙주로서 이용가능한 대장균이면 특히 특정되지 않고, 유전자 재조합에 일반적으로 사용되고, 당업자가 용이하게 입수할 수 있는 그 밖의 주(예를 들면, JM109나 DH5등)을 이용할 수 있다. 또한, 대장균의 형질전환방법은 Hanahan의 방법에 따른다(J. Mol. Biol., 166, 557-, 1983). 형질전환된 대장균을 암피실린(50μg/ml)을 포함하는 2ml의 LB배지(트립톤 10g, 효모엑시스 5g, 염화나트륨 10g을 1리터의 증류수에 녹이고, 수산화 나트륨으로 pH을 7.2로 조정한다) 에 식균하여, 37℃로 밤새 배양하였다.

이 배양액 1ml를 10ml의 M9배지(인산-수소 나트륨 0.6%, 인산 이수소칼륨 0.3%, 염화나트륨 0.5%, 염화아모늄 0.1%, 글루코오스 0.5%, 황산마그네슘 1mM, 비타민 B1 4μg/ml, pH 7.2)에 카자미노산 0.5%와 암피실린 50μg/ml를 가하여 배지에 접종하고, 37℃로 3시간 배양후, 0.5M의 IPTG를 40μl 첨가(최종농도 2mM)하고, 또한 5시간 배양을 계속하였다. 집균후, 30mM 염화나트륨을 포함하는 30mM 트리스염산 버퍼(pH 7.5)로 세정하여, 세정균체를 동일한 버퍼 1ml에 현탁하였다. 1mg 리조팀, 0.25M EDTA를 25μl 가하여 30분간 0℃로 방치한 후, 동결·융해를 3회 반복하여 균체를 파괴하였다.

이것을 15000rpm, 30분간 원심분리를 하여 얻은 상청액을 조효소액으로 하여, 실시예 1(3)에 나타낸 효소활성측정법에 의해 효소활성을 측정하였다. 마이크로 타이터 플레이트법에 의해, pGAT102를 도입한 대장균에서는 아실기 전이반응이 확인되었기 때문에, HPLC에 의한 분석을 하였다.

그 결과, pGAT102를 도입한 대장균에서는 24nmol의 델피니딘 3,5-디클루시드와 21.5nmol의 카페오일-CoA로부터 18.3nmol의 델피니딘 3-글루코실 5-카페오일 글루코시드의 생성이 인정되었다.

이 결과와, 용담의 안토시아닌에 있어서는 5위치와 3' 위치의 글루코오스에 아실기가 결합하고 있다고 하는 이미 공지된 사실과 겸해서 생각하면, pGAT4가 암호화하는 아실기 전이효소는 안토시아니딘 3,5-디클루코시드의 5위치의 글루코오스에 아실기를 전이하는 반응을 촉매하는 것을 알았다.

또한, 대장균에서 생산된 아실기 전이효소에 의해 아실화된 델피니딘 3,5-디클루코시드도, 용담으로부터 정제하여 수득된 아실기 전이효소에 의해 아실화된 것과 같이 실온에서 장기간 방치하여도 안정한 발색을 나타내었다.

[실시예 5]

효모에 있어서의 유전자의 발현

(1) 효모의 발현 벡터

효모의 발현 벡터는, 일본 특허 공개 평 4-228078에 기재된 pYE22m를 사용하였다.

(2) 아실기 전이효소 유전자의 효모에서의 발현

pGAT4 또는 pGAT8을 해당 각 벡터내에 존재하는 제한효소 부위 EcoRI과 KpnI에서 소화하여 수득하여지는 약 1.8kb의 DNA 단편과 pYE22m를 동일하게 EcoRI과 KpnI에서 소화하여 수득하여지는 약 8kb의 DNA단편을 연결하여 효모발현 플라스미드 pYGAT4와 pYGAT8을 각각 구축하였다. pYGAT4는 제1번째의 메치오닌으로부터의 해독을 행하지만, pYGAT8에서는 분리한 cDNA의 5'측의 일부가 빠져있기 때문에, 아실기 전이효소의 해독개시 메치오닌(서열표·서열 1에 있어서의 아미노산 서열번호; -1)에서는 아니고, 다음의 메치오닌(서열표·서열 1에 있어서의 아미노산 서열5)로부터의 해독이 행하여진다.

이것들의 효모발현 플라스미드에서는 아실기 전이효소를 암호화하고 있는 cDNA는 효모의 구성적인 프로모터의 하나인 글리세르 알데히드-3 인산탈수소효소의 프로모터의 하류에 연결되어 있고, 동일 프로모터에 의해 전사가 제어되고 있다.

이토 등의 방법(Ito et al. J. Bacteriol., 153, 163-168, 1983)을 사용하여, pYGAT4 및 pYGAT8에서, 효모 Saccharomyces cerevisiaeg1315(Ashikari et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 30, 515-520, 1989)를 형질전환하였다. 형질전환된 효모는 트립토판의 합성능의 회복에 의해 선택하였다.

또한, 여기에서 형질전환에 사용하는 효모의 숙주는 특히 한정되지 않고, TRP1 유전자가 불완전하기 때문에 트립토판의 요구성을 나타내는 주이면 어느쪽의 것이라도 사용할 수 있다(예를 들면, 이스트·제네틱·스톡·센터에서 구입가능(Yesstgenetic Stock Center; Berkeley, CA, USA; 카탈로그 제7판(1991년) 제36페이지).

수득된 형질전환주를 10ml의 1% 카자미노산(Difco 사)를 포함하는 버크홀더배지(Burkholderm, Amer. J. Bot. 30, 206-210)로써, 30℃에서 40시간 진탕배양하였다. 아울러, 대조실험을 위해, 트립토판의 합성능을 자연스럽게 회복한 효모도 같이 배양하였다.

이들을 집균후, 동일량의 균체파쇄용 버퍼(30mM 트리스염산 pH 7.5, 30mM 염화나트륨)로 세정하고, 또한 1ml의 동일한 버퍼에 현탁하고, 1.5ml의 에펜도르프튜브로 옮겼다. 원심분리후, 상청액을 제외 하고 0.4ml의 동일한 버퍼로 침전균체를 재차 현탁하여, 400mg의 유리 구슬(Glass Beads 425-600 microns Acid-Wash, 시그마사)를 가하여 심하게 진탕함에 의해, 효모균체를 파쇄하였다.

원심분리후의 상청액을 조효소액으로 하여 실시예 1(3)에서 나타낸 효소활성 측정법에 의해 효소활성을 측정하였다. 마이크로 타이터 플레이트법에 의해, pYGAT4 및 pYGAT8를 도입한 효모는 어느쪽도 아실기 전이반응이 확인되었기 때문에, HPLC에 의한 분석을 하였다. 또한, 대조에 사용한 효모에서는 아실기 전이활성은 확인되지 않았다.

그 결과, pYGAT4 및 pYGAT8를 도입한 효모에서는 24nmol의 델피니딘 3,5-디클루코시드와 21.5nmol의 카페오일-CoA에서 각각 16.6nmol과 20.9nmol의 델피니딘 3-글루코실 5-카페오일 글루코시드의 생성이 인정되었다. pYGAT4와 pYGAT8로부터 생산되는 단백질은 그 아미노말단이 다르지만, 동시에 아실기 전이효소활성을 유지하고 있었다.

또한 효모에서 생산된 아실기 전이효소에 의해 아실화된 델피니딘 3,5-디클루코시드도, 용담으로부터 정제하여 수득된 아실기 전이효소에 의해 아실화된 것과 마찬가지로 실온에서 장기간 방치하여도 안정한 발색을 나타내었다.

[실시예 6]

용담유래의 아실기 전이효소의 cDNA 클로닝(2)

실시예6(6)에 기재된 pGAT4, 즉 서열표·서열 1 기재의 DNA를 가지는 pGAT4를, 제한효소 EcoRI과 NdeI에서 소화하여 수득하여지는 DNA 단편중, 아실기 전이효소의 해독영역을 포함하는 DNA단편 2개를 정리하여 회수하여, 상술한 방법으로 DIG 표지하였다. 이것을 프로브로서 실시예 3(4)에 기재한 용담의 꽃잎의 cDNA라이브러리의 파아지를 흡착시킨 필터(Hybond N+, 아마샴사)를, 제조자(아마샴사)가 추장하는 방법으로 필터에 결합한 색소 및 DIG표지를 제거하여 재생한 후, 저농도 포름아미드 하이브리다이제이션 버퍼(5×SSC, 30% 포름아미드, 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% SDS)중에서 42도로 16시간 하이브리드화하였다.

세정액(5×SSc, 0.1% SDS)중에서 50도로 세정하고, 실시예 3(4)에서 기재한 것 같이 발색시켰다. 수십개의 클론이 발색하였지만, 발색한 클론중에, 실시예 3(4)에서는 발색하지 않은 클론을 12개 수득했다. 이것들의 클론의 cDNA의 염기서열을 먼저 서술하였던 것과 동일한 방법을, 5'측에서 결정한 바, 11클론을 pGAT4의 염기서열과 일치하였지만, 1클론은 일치하지 않았다. 이것을 pGATT106으로 하였다.

pGAT106의 전체염기서열을 먼저 설명한 바와 같이 하여 결정하였다. pGAT106에 삽입된 cDNA는 1622염기이고 그 속에 1440 염기(종지코돈을 포함한다)로 이루어지는 ORF가 발견되었다. 이것을 서열표·서열 2에 나타낸다. 서열 2가 포함하는 ORF에 대하여, pGAT4가 암호화하는 아미노산 서열과 전체영역에 걸쳐서, 상동성을 조사하였다. 그 상동성은 38%였다.

pGAT106이 암호화하는 아미노산 서열은, 아실기 전이효소인 pGAT4가 암호화하고 있는 효소와 상동하기 때문에, 동일한 효소활성, 결국 안토시아닌에 아실기 전이를 촉매하는 활성을 가지고 있다고 추측된다. 용담의 안토시아닌은, 5위치와 3' 위치의 글루코오스에 아실기가 결합하고 있기 때문에, pGAT106이 안토시아닌의 3' 위치의 글루코오스에 아실기를 전이하는 효소반응을 촉매하는 것을 시사한다. 또한, 이 결과는 아실기 전이효소는, 아실기를 전이하는 안토시아닌의 당의 위치는 달라도, 아미노산 서열 및 그것을 암호화하고 있는 염기서열은 상동한 것을 나타내고 있다.

앞서 서술한 것같이 아실기를 가지는 안토시아닌은 다수 존재하고, 이들 화합물의 아실기의 수나 위치는 다양성이 풍부하고, 아실기의 전이반응을 촉매하는 효소도 다수있는 것이 추측되지만, 이것들의 효소의 아미노산 서열은, 여기에서 수득된 pGAT4 및 pGAT106의 아미노산 서열과 상동성을 볼 수 있는 적은 용이하게 유추할 수 있고, 이것에 근거하여, 다른 아실기 전이효소 유전자를 수득할 수 있다.

[실시예 7]

피튜니아의 안토시아닌

피튜니아(Petunnia hybrida)품종 사피니아 퍼플(산토리(주))의 꽃의 색깔이 통상의 빨강자주로부터 자주로 변이한 변이주(VM)의 안토시아닌을, 그 꽃잎을 액체 질소속에서 분쇄하고, 50% 아세트 니트릴, 0.1% TFA 수용액으로 추출하였다. 여과후, 여과액을 ODS, ODP의 역상컬럼크로마토그래피로 분리, 정제하였다. 그 속의 하나의 화합물의 구조를 FABMS,¹H NMR,¹³C NMR를 사용하여, 상세히 해석한 바, 신규의 안토시아닌을 찾아내었다. 그 구조를 이하에 나타낸다.

즉, 이 구조는 3-0-(6-0-(4-0-(4-0(6-0-카페오일-β-D-글루코 필라노실)쿠말로일)-α- L-람노실)-β-글루코 필라노실)-5-0-β-D-글루코 필라노실-말비딘이고, 아실기가 2개 결합한 안토시아닌이었다.

또한, 3-0-(6-0-(4-0-(4-0-(6-0-쿠말로일-β-D-글루코 필라노실)-쿠말로일)-α-L-람노실)-β- D-글루코 필라노실)-5-0-β-D-글루코 필라노실-말비딘, 3-0-(6-0-(4-0-(4-0-(6-0-카페오일-β-D-글루코 필라노실)-카페오일)-α-L-람노실)-β-D-글루코 필라노실)-5-0-β-D-글루코 필라노실-말비딘, 3-0-(6-0-(4-0-(4-0-(6-0-쿠말로일-β-D-글루코 필라노실)-카페오일)-α-L-람노실)-β-D-클루코 필라노실)-5-0-β-D-글루코 필라노실-말비딘도 검출되었다. 이 안토시아닌은, VM의 꽃잎뿐만 아니라, 플루콘 블루(사카타노타네(주)), Oldglory Blue(Ball Seeds) 등의 짙은 보라색의 꽃잎에도 존재하고 있는 것을 알았다. 즉, 아실기를 2개 가지는 안토시아닌은 피튜니아의 짙은 보라색에 기여하고 있다고 생각된다.

따라서, 피튜니아 유래의 안토시아닌에 관한 아실기 전이효소에는, 안토시아닌의 3위치의 루치노시드에 쿠말산 또는 카페산을 전이하는 반응을 촉매하는 효소와, 모노아실말비딘에 글루코오스를 통하여 쿠말산 또는 카페산을 전이하는 반응을 촉매하는 효소의 2종류가 있는 것을 시사한다.

[실시예 8]

피튜니아 유래의 아실기 전이효소의 cDNA 클로닝

실시예 5(6)에 기재된 pGAT4, 즉 서열표·서열 1기재의 DNA를 가지는 pGAT4의 cDNA 부분을, 상술한 방법으로 DIG 표지하고, 피튜니아(Peutunia hybrida)품종 오르도 글로리 블루의 꽃잎의 cDNA 라이브러리(Nature, 366, 276-279, 1993)를 플라크 하이브리다이제이션의 수법에 의해, 스크리닝하였다. 하이브리다이제이션과 세정은, 실시예 6과 동일한 조건으로 행하였다.

약 20만 클론을 스크리닝하여, 약하게 하이브리다이즈하는 클론을 1개 수득했다. 이 클론을 pPAT5로 하였다. 염기서열을 결정한 바, pPAT5에는 복수의 DNA가 삽입되어 있다. 즉, 플러스미드의 리버스 프라이머측에, pGAT4 및 pGAT106이 암호화하는 단백질의 C 말단의 서열에 닮은 서열이 존재하였다. 그리하여, 리버스 프라이머 하에, 뉴클레오티드 서열; 5'AACAGCTATGACCATG-3'(서열 20)를 합성하고, 이 올리고 뉴클레오티드를 RP 프라이머로 하였다.

pPAT5의 cDNA의 완전길이를 취득하기 위해서, RP 프라이머, 올리고 2프라이머 각 100ng, XhoI에서 소화한 pPAT5·10ng을 최종체적 50μl로, PCR 반응을 행하였다. 반응은, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하고, 20사이클 행하였다. 수득된 약 600bp의 DNA 단편을 아가로스 전기영동후, 딘크린으로 정제하였다. 이 단편을 Smal에서 효소 소화한 후, 약 400bp의 DNA단편을 마찬가지로 정제하였다. 이 DNA 단편을 상술한 DIG에서 표지하였다.

이 표지한 DNA 단편을 사용하여, 상술한 피튜니아의 꽃잎 cDNA 라이브러리를 플라크 하이브리다이제이션의 수법을 사용하여, 스크링하였다. 하이브리다이제이션후의 세정은, 0.2XSSC, 65℃, 1시간으로 하였다. 수득된 클론으로부터 회수한 플러스미드의 염기서열을 결정한 바, pPAT48이, pPAT5와 동일한 서열을 포함하는 것을 알았다. 이것을 서열표·서열 3에 나타낸다. 이 서열은, pGAT4와 pGAT106에 대하여, 아미노산 서열레벨로, 각각 20%, 16%의 상동성가 있었다.

[실시예 9]

차조기 유래의 조효소액의 추출

차조기(Perilla ocimoides)·품종 빨강 칠리맨의 식물체로서부터, 빨갛고 어린 잎을 채집하여, 실시예 1(2)에 기재된 방법에 따라서, 조효소액의 추출을 행하였다. 최종농도 50nm인산칼륨(pH 8.5), 0.48mM 델피니딘 3,5-디클루코시드, 0.43mM 카페오일-CoA와 20μl의 효소액을 포함하는 50μl의 혼합물을 30℃에서 10분간 반응시켰다. 반응액에 13.8%의 아세트산을 포함하는 50μl의 아세트 니트릴을 가하여 반응을 정지하였다. 15000회전으로 5분간 원심분리한 후, 상청액중의 10μl를 이하의 조건으로 HPLC에서 해석하였다.

컬럼은 YMC-Pack ODS-A(6.0×15cm)를 사용하고, 0.1% 트리플루오로 아세트산, 21.6% 아세트 니트릴의 용매로, 유속 1ml/분의 조건으로 샘플을 분리하였다. 검출은, 520nm에서 행하였다. 이 조건에서 미반응의 델피니딘 3,5-디클루코시드는, 3분으로, 델피니딘 3,5-디클루코시드의 3위치에 카페산이 전이한 것은, 4.7분에 용출되고, 이 화합물의 흡수극대값은, 531nm이었다.

기질로서, 델피디닌 3-글루코시드를 사용한 경우도, 카페산에 의한 수식이 보였다. 또한, 아실기의 공여체로서, 쿠말로일 CoA을 사용하여도, 쿠말기의 전이가 보였다. 차조기는 천연에는 안토시아닌으로서 델피니딘 글루코시드는 포함하지 않지만, 차조기의 아실기 전이효소는 델피니딘 3-글루코시드와 델피니딘 3,5-디클루코시드를 아실기 수용체로서, 쿠말로일-CoA를 아실기 공여체로서 이용할 수 있는 것을 알았다.

[실시예 10]

차조기 유래의 아실기 전이효소의 정제

차조기 아실기 전이효소의 정제는, 실시예 2(1)에 준하여 행하였다. 3kg의 차조기의 잎을, 액체질소로 동결시켜, 동결한 채로 호모게나이저로 분쇄하였다. 분말상으로 된 것에 101의 추출완충액(100mM) 인산 나트륨, pH 6.8, 10mM 아스코르빈산 나트륨, 5mM 디티오스레오틀, 10μM p-APMSF, 5%(w/v) 폴리크랄 SB-100)중에서, 다시, 호모게나이저로 마쇄하였다. 이것을 4층으로 포갠 가제로 여과후, 원심분리(8000회전, 4번, 30분)를 행하였다. 상청액에 40% 포화가 되도록 황산암모늄을 가하여, 용해후, 동일한 조건으로 원심분리를 행한다. 상청액에 70% 포화가 되도록 황산암모늄을 가하여, 용해후, 동일한 조건으로 원심분리를 행한다. 침전을 최소량의 탈염완충액(비스트리스 염산, pH 6.3, 1mM 디티오스레이틀, 10μM p-APMSF, 10% 글리세롤)에 용해한 후, 동일한 완충액으로 평형화한 세파텍스g-25메이둠(파마시아사, 9.5×45cm)으로 탈염하였다.

탈염한 샘플을 Q-세파로스 파스트플로 26/10을 사용한 이온교환 크로마토그래피를 행하였다. 탈염완충액을 바탕으로 한 염화 나트륨의 0으로부터 0.5M의 직선농도구배를 8ml/분의 유속으로 1시간에 걸쳐 행하였다. 활성 분획분은, 식염농도 0.15로부터 0.3M 부근에서 용출되었다. 이 활성 분획분을, 탈염완충액으로 평형화한 HiTrap Blue(5ml)를 4개 직렬에 접속한 컬럼에 흡착시켰다. 동일한 완충액으로 컬럼을 잘 세정한 후, 탈염완충액을 바탕으로 한 0으로부터 1M의 염화 나트륨의 직선 농도구배(2시간, 유속 5ml/분)로 용출하였다. 활성 분획분은 염화 나트륨 농도 0.8로부터 0.9M에서 용출하였다. 이 분획분을 다음에 하이드록시 아파타이트 컬럼(세라믹타입 Ⅱ 40mM; 바이오레드사)으로 크로마토그래피를 행하였다. 완충액 A(50mM 인산 나트륨, pH 6.8 1mM 디티오스레이틀, 10μM p-APMSF, 10% 그리세롤)으로, 샘플을 걸어 컬럼을 잘 세정하고, 완충액 A에서 완충액 B(400mM 인산 나트륨, pH 6.8, 1mM 디티오스레이틀, 10μM p-APMSF, 10% 그리세롤)로의 직선농도구배(1시간, 유속 2.5ml/분)로 효소를 용출한 바, 약 0.2M 인산 나트륨으로 용출했다. 이 활성 분획분을 사용하여 효소의 생화학적 성질을 조사하였다.

조효소 표준품을 사용한 경우와 같이, 아실기의 수용체로서는, 시아니딘 3-글루코시드, 시아니딘 3,5-디클루코시드, 델피니딘 3-글루코시드, 델피니딘 3,5-디클루코시드의 어느것을 사용할 수 있었다. 아실기의 공여체로서는, 쿠말로일-CoA라도, 카페오일-CoA라도 사용할 수 있었다. 또한, SDS 폴리아크릴 아마이드 전기 영동을 한 결과, 분자량은 약 50000이었다. 등전점은, Mono-P 컬럼(파마시아사)을 사용하여 5.3으로 결정하였다.

[실시예 11]

차조기 유래의 아실기 전이효소의 cDNA 클로닝

실시예 3, 실시예 6 및 실시예 8에서 클로닝한 pGAT4, pGAT106, pGAT48의 구조를 비교하면, 아미노산 서열; Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys(서열 21)가 보존되어 있는 것이 예상된다. 그리하여, 이 서열을 바탕으로, 뉴클레오티드서열; 5'-GA(TC)TT(TC)GGITGGGGIAA-3'(서열 22)을 합성하고, 이 올리고 뉴클레오티드를 ATC 프라이머로 하였다.

차조기의 어린잎으로부터 RNA를 실시예 3에 기재한 방법으로 추출하여, 동일하게, ZAP-cDNA 합성 키트(스트라타진사 제)를 사용하여, cDNA 라이브러리를 제작하였다. 이 때에 생긴 이중사슬의 cDNA 약 50ng을 주형으로 하여, ATC 프라이머와 올리고 2프라이머를 각 100ng 사용하여, 최종부피 50μl로써, PCR 키트(다까라 슈조(주)제)를 사용하여, PCR 반응을 행하였다. 반응은, 95℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여, 25사이클 행하였다. 수득된 약 400bp의 DNA 단편을 회수하여, TA 클로닝킷트(Invitrogen사)를 사용하여, 벡터에 클로닝하였다. 수득된 클론의 염기서열을 결정한 바, pSAT104로 한 클론이 pGAT4에 대하여 높은 상동성을 나타내었다.

10ng의 pSAT104을 주형으로 하여, ATC 프라이머와 올리고 2프라이머를 각 100ng 사용하여, 최종부피 50μl로써, PCR키트(다까라슈조(주)제)를 사용하여, PCR반응을 행하였다. 반응은, 95℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여, 15사이클 행하였다. 이 반응물의 1μl를 사용하여, ATC 프라이머와 올리고 2프라이머를 각 100ng 사용하여, 최종부피 50μl로써, 마찬가지로 PCR키트를 사용하여, PCR 반응을 행하였다.

단, 이때 데옥시 뉴클레오티드 용액으로서, DIG 표지 뉴클레오티드 용액(베링거사제)를 4μl 사용하였다. 반응종료후, 5μl의 3M 아세트산 나트륨과 100μl의 에탄올을 가하여, 에탄올침전을 행하여, 이후의 실험에 사용하였다.

이 pSAT104 유래의 표지 DNA를 사용하여, 차조기의 잎의 cDNA 라이브러리를 플라크 하이부리다이제이션의 수법으로 스크리닝하였다. 세정은, 1×SSC, 65℃로 1시간 행하였다. 하이브리다이즈한 클론의 염기서열을 결정한 바, pSAT206, pSAT207, pSAT209, pSAT210등의 클론이 pSAT104의 서열을 포함하고 있는 것을 알았다. 이것들의 클론의 5'측의 염기서열을 pGAT4와 비교한 바, 어떤 클론도 pGAT4보다 아미노말단이 짧아 개시코든도 보이지 않았다. 또한, pSAT206과 pSAT208, pSAT209와 pSAT210는, 5'측의 염기서열은 동일하였다. pSAT207은, pSAT206보다 6잔기, pSAT209는 pSAT206보다 5잔기 짧았다.

벡터-pBluescript SK상에서, 이것들의 cDNA는, 벡터의 Lac Z 유전자와 융합할 수 있는 형으로 되어 있다. 위의 클론중, pSAT206, pSAT208, pSAT207은, LacZ가 암호화하고 있는 대장균의 β 갈락토시다제와 융합단백질로서 발현할 수 있는 모양이 되고 있지만, pSAT209와 pSAT210는, 프레임이 어긋나고 있기 때문에 융합단백질로는 않된다. pSAT206, pSAT207, pSAT209, pSAT210를 대장균으로 발현시켜, 데피니딘 3,5-디클루코시드와 카페오일-CoA을 사용하여, 3위치의 글루코스로의 아실기 전이효소활성을 측정하였다. 발현의 유도등의 방법은, 실시예 4에 기재된 방법에 따라 수행한다.

pSAT209, pSAT210을 포함하는 대장균은, 아실기 전이효소활성을 완전히 나타내지 않았지만, pSAT206을 포함하는 대장균은, 델피니딘 3,5-디클루코시드의 48%를 아실화하는 효소활성을 나타내고, pSAT207을 포함하는 대장균은 마찬가지로 24%를 아실화하는 효소활성을 나타내었다. 이것으로부터, 수득된 pSAT206, pSAT207등은, 차조기의 안토시아닌의 3위치의 글루코오스에 아실기를 전이하는 효소활성을 가지는 유전자를 클로닝할 수 있는 것을 증명할 수 있었다.

이것들의 클론중, pSAT208의 cDNA유래의 염기서열을 결정하였다. 이것을 서열표·서열 4에 나타낸다. 그 염기서열로부터 추정되는 아미노산 서열은, pSAT4, pSAT106, pSAT48에 대하여, 37%, 29%, 15%의 상동성를 나타내었다. 먼저 말한 것처럼 이 서열은, 완전한 길이의 cDNA가 아니지만, LzcZ와의 융합유전자등으로서, 적당한 개시코든을 주는 것으로, 활성이 있는 효소를 발현할 수 있다.

또한, 이와 같이 본 발명에서 분명히 된 아실기 전이효소의 아미노산 서열을 비교함에 의해, 보존되어 있는 영역이 분명하게 되었다. 이 영역의 아미노산 서열을 바탕으로 하면, 안토시아닌의 다른 위치의 당을 수식(修飾)하는 아실기 전이효소를 클로닝할 수 있다.

[실시예 12]

시네라리아 유 래의 아실기 전이효소의 cDNA 클로닝

시네라리아(Senecio cruentus) 품종 주피터 블루(사카타노타네)의 꽃잎으로 부터 실시예 3에 기재한 방법으로 RNA를 추출하고, 또한 PolyA+RNA를 정제하였다. ZAP-cDNA 합성 키트(스트라타진사 제)를 사용하여, cDNA 라이브러리를 제작하였다.

이때에 할 수 있는 이중사슬의 cDNA 약 50ng을 주형으로 하여, ATC 프라이머와 올리고 2프라이머를 각 100ng 사용하여, 최종부피 50μl로써, 다까라의 PCR 키트를 사용하여, PCR 반응을 행하였다. 반응은, 95℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로하여, 25사이클 행하였다. 수득된 약 400bp의 DNA단편을 회수하여 TA 클로닝킷트(Invitrogen사)를 사용하여, 벡터에 클로닝하였다. 수득된 클론의 염기 서열을 결정한 바, pJAT4로 한 클론이 pGAT4에 대하여 높은 상동성을 나타내었다.

다음에 시네라리아의 꽃잎 cDNA 라이브러리를 pJAT4로 스크리닝하였다. 몇개의 클론이 수득되었지만, 그것들의 cDNA의 5' 말단측의 염기서열로부터 유출한 아미노산 서열은, pGAT4가 암호화하고 있는 단백질의 서열과 비교하여 보면, 시네라리아의 클론의 cDNA는 어느 것이나 완전한 길이가 아니었다. 그중, pCAT8로 한 클론의 cDNA의 전염기서열을 결정하였다. 이것을 서열표·서열 5에 나타낸다. 그 염기서열로부터 추정되는 아미노산 서열은, pGAT4, pGAT106, pGAT48, pSAT208에 대하여 각각 28%, 35%, 16%, 37%의 상동성을 나타내었다.

[실시예 3]

용담 유래의 아실기 전이효소 유전자를 포함하는 바이너리벡터의 제작

용담의 아실기 전이효소 유전자 pGAT4를 Kpnl로 완전히 소화한 후, Xbal로 부분소화하여 수득하여지는 약 1.6kb의 DNA단편을 회수하였다. 이 DNA 단편을 pUC 19의 Kpnl와 Xbal의 제한효소인식부위를 사용하여 서브클로닝하여, 플러스미드 pUCGAT4를 수득했다. pUCCGAT4를 BglII로 완전소화한 후, Sac1로 부분소화하고, 약 0.95kb의 DNA단편을 회수하였다. 이 DNA단편과, pUCGAT4를 Xbal과 BglII로 소화하여 수득하여지는 약 0.75kb의 DNA단편과, 플러스미드 p2113G(예를 들면, Aida et al., Acta Horticulture, 392, 219-225, 1995에 기재되어 있다)를 Xbal과 Sacl로 소화하여 수득하여지는 DNA단편을 라이게이션하여 수득하여지는 플러스미드를 pBEGA4로 하였다. 이 플러스미드는, 바이너리 벡터이고, 용담의 아실기 전이효소 cDNA는, 식물세포내에 있어서는, 인헨서를 가지는 캘리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로머터와 노바린 합성효소 터미네이터의 제어하에 있다. 또한, 용담아실기 전이효소 cDNA의 5' 말단에, Ω서열이라고 불리는 해독의 인헨서를 포함하고 있다. 이때, 프로모터나 터미네이터는 본 기재에 한정되지 않고, 구성적인 프로모터라도, 또한 캘콘합성효소 유전자의 프로모터 등과 같이 꽃잎으로 특이적으로 작용하는 것이라도 좋다.

[실시예 14]

용담 유래의 아실기 전이효소 유전자의 식물로의 도입

pBEGA4를 Plant Molecular Biology Manual(Kluwer Academic Publishers)에 기재되어 있는 방법으로, Agrobacterium tumefacience의 Ag 10주(Lazo et al., Bio/Technology, 9, 963-967, 1991)에 도입하였다. 한편, 장미품종 라반데의 줄기 정상을, MS 배지에 BA(6-벤질아미노푸린) 2.25mg/1,gA3(시베레린산) 3.4mg/l, 수쿠로오스 30g/l, 제란검 2g/l를 가한 고체배지로 배양하여 Embriogenic Callus(EC)를 수득했다. 상술한 Ag 10주를 LB배지로 하루밤 진탕 배양한 것을 20μg/ml의 아세트시론곤을 포함하는 MS 액체배지에 현탁하여, 약 5×10⁸cells/ml의 농도로 조정하였다. 이 균액중에 EC를 5분간 침적한 후, 멸균여과지로 여분인 액을 충분히 닦아내고, BA 2.25mg/l, gA 30.35mg/l, 수쿠로오스 30g/l, 제란검 2g/l를 가한 MS배지에 이식하여 배양함에 의해, 형질전환체를 수득할 수 있다. 수득된 카나마이신 저항성 칼스로부터, 트리졸(라이테크오리엔탈사)을 사용하여 RNA를 수득했다. 이 RNA를 수득했다. 이 RNA를 주형으로 하여, pGAT4의 염기서열을 바탕으로 하여 합성한 뉴클레오티드 gAT-1; 5'-TGGCAACTGTCTTGCGTCATG-3'(서열 23)와, 뉴클레오티드 gAT-2; 5'CCATGTCAGGTGTGAGGTTCAAC-3'(서열 24)를 프라이머로서 사용하여 액세스 RT-PCR시스템(프로메가사)을 사용하여, RT-PCR 반응을 행하였다. 또한, 동일한 RNA를 주형으로서, 바이너리 벡터상의 nptII의 염기서열에 의거하여 합성한 올리고 뉴클레오티드 Kan-1; 5'-ATCGTTTCGCATGATTGAAC-3'(서열 25)와, 뉴클레오티드 Kan-2; 5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3'(서열 26)를 사용하여, 마찬가지로 RT-PCR반응을 행하였다. 반응은, 94℃ 30초, 60℃ 1분, 68℃ 2분을 1 사이클로 하여, 40사이클 행하였다. 형질전환체의 칼스로부터는, pGAT4에 유래하는 밴드 및 nptII에 유래하는 밴드가 관찰되었지만, 비형질전환체의 칼스로부터는 이들에 대응하는 밴드는 검출할 수 없었다. 이 결과는, 용담의 아실기 전이효소 유전자를 장미에 도입할 수 있던 것을 나타낸다.

또한, 여기에 서술한 바이너리 벡터의 구축이나 식물로의 형질전환은, pGAT4에 포함되는 용담의 아실기 전이효소 한정되는 것이 아니라, 다른 아실기 전이효소도, 식물에의 도입과 식물에서의 유전자발련이 가능하다. 또한, 식물의 종류로서, 여기에서는, 장미를 들었지만, 다른 많은 식물로(예를 들면, 카네이션, 국화, 담배, 피튜니아, 거베라, 피튜니아 등) 형질전환의 방법이 보고되어 있기 때문에, 공지의 방법을 사용하면, 많은 식물종에 아실기 전이효소의 도입이 가능하다.

[실시예 15]

완전한 길이의 차조기 유래의 아실기 전이효소의 cDNA의 합성

차조기 아실기 전이효소 유전자 cDNA, pSAT208는, 앞서 서술한 것같이 활성이 있는 효소는 암호화하고 있지만, 완전한 길이는 아니었다. 그리하여, 용담의 아실기 전이효소 유전자 pGAT4의 염기서열을 바탕으로 개시코든을 포함하는 완전한 길이의 cDNA를 합성하였다. 즉, 이하에 나타내는 DNA를 합성하였다. 또한, 그 암호화하는 아미노산 서열을 병기하였다. 최초의 밑줄은 클로닝을 위한 BamHI 인식 서열이고, 다음 밑줄은 pSAT208에 포함되는 서열이다. 또한, BamHI의 인식서열의 후에 식물에서 해독개시코든의 직전에 잘 보이는 서열 AACA를 삽입하고 있다.

(서열 27)

이 프라이머와 -20 프라이머; 5'-GTAAAACGACGGCCAT-3'(서열 28)를 각각 100ng, pSAT208을 10ng을 포함하는 PCR 반응을 최종부피 50μl로 행하였다. 반응은, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분을 1 사이클로 하여, 15사이클 행하였다. 반응후, 반응액으로부터 DNA 단편을 geneclean(Bio101사)을 사용하여 제조자가 추장하는 방법으로 회수하였다. 회수한 DNA를 BamHI와 EcoRI으로 소화한 후, 아가로스겔 전기영동하여, 약 200bp의 DNA 단편을 회수하였다. 이 DNA단편을, pSAT208을 EcoRI으로 소화하여 수득하여지는 약 3.3kb의 DNA단편과 라이게이션하여 수득된 플러스미드를 pSATF208로 하였다. 이 플러스미드의 염기서열을 cDNA의 5'말단에서 결정하여 염기서열을 확인하였다.

[실시예 16]

차조기 유래의 아실기 전이효소유전자의 효모에 있어서의 발현

실시예 5에서 서술한 방법에 따라서, pSATF208을 효모로 발현시켜, 효소활성의 측정을 행하였다. 즉, pYE22m를 BamHI과 SalI로 소화하여 수득하여지는 약 8kb의 DNA단편과, pSATF208을 BamHI과 SalI로 소화하여 수득하여지는 약 1.6kb의 DnA단편을 라이게이션하여 수득하여지는 플러스미드를 pYSAt208로 했다.

pYSAT208에서 효모 g1315를 형질전환하여, 수득된 형질전환체의 아실기 전이효소활성을 측정하였다. 그 결과, pYSAT208을 도입한 효모에서는 24nmol의 델피니딘 3,5-디글루코시드와 21.5nmol의 카페오일-CoA에서 10nmol의 델피니딘 3-카페오일 글루코시드 5-글루코시드의 생성이 인정되었다. 따라서, pSATF 208에 포함되는 합성한 완전길이 cDNA는, 아실기 전이효소활성을 암호화하는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 17]

차조기유래의 아실기 전이효소 유전자를 포함하는 바이너리 벡터의 제작

플러스미드 pE12ΩGUS는, 플러스미드 p113G(Aida et al., Acta Horticulture, 392, 219-225, 1995)상의 gUS유전자의 발현유닛이 플러스미드 pUC19의 HindIII와 EcoRI인식부위에 삽입되어 있는 플러스미드이다. pE12ΩGUS를 SacI로 소화하여, DNA블랜팅 킷트(다까라주조(주))로, 평활말단화한 후, XholI링커(동양방(주))와 라이게이션하였다. 수득된 XhoI 링커의 삽입된 플러스미드를 pE12ΩgUSx로 하였다. 이 플러스미드를 HindIII과 EcoRI으로 소화하여 수득하여시는 약 2.8kb의 DNA단편을, HindIII와 EcoRI으로 소화한 pBin19과 라이게이션하여, 수득된 플러스미드를 pBEGUSx로 하였다. pBEGUSx를 BamHI과 Xhol로 소화하여 수득하여지는 11kb의 DNA단편과, pSATF208을 BamHI과 XhoI으로 소화하여 수득하여지는 DNA단편을 라이게이션하여 수득하여지는 플러스미드를 pBESA208로 하였다. 이 플러스미드상에서, 차조기의 아실기 전이유전자는, 인헨서를 포함하는 캘리 플라워 모자이크 바이러스의 프로모터와 노바린 합성효소 유전자의 터미네이터의 제어하에 있다.

[실시예 18]

차조기유래의 아실기 전이효소유전자의 식물로의 도입

pBESA208를 Plant Molecular Biology Manual(Kluwer Academic Publishers)에 기재되어 있는 방법으로, Agrobacterium tumefacience의 Ag 10주(Lazo et al., Bio/Technology, 9, 963-967, 1991)에 도입하였다. Ag 10주의 형질전환체를 사용하여, Plant Molecular Biology Manual(Kluwer Academic Publishers)에 기재되어 있는 방법을 사용하여, 피튜니아 플루콘 레드(사카타노타네), 바카라 레드(사카타노타네), 타이탄 레드(사카타노타네)로 형질전환하였다. 또한, 이것들의 피튜니아의 꽃잎에는 시아니딘 3-글루코시드가 주된 안토시아닌으로서 포함되어 있다.

또한, 먼저 서술한 방법으로 장미품종 라반데에도 형질전환을 행하였다.

[실시예 19]

완전한 길이의 시네라리아 유래의 아실기 전이효소의 cDNA의 합성

시네라리아 유래의 아실기 전이효소 유전자 cDNA, pCAT8는, 먼저 말한것처럼 완전한 길이가 아니었다. 그리하여, 용담의 아실기 전이효소 유전자 pGAT4의 염기서열을 바탕으로 개시코돈을 포함하는 완전한 길이의 cDNA를 합성하였다. 즉, 이하에 나타내는 DNA를 합성하였다. 그 암호화는 아미노산 서열을 병기하였다. 최초의 밑줄은 클로닝을 위한 BamHI 인식서열로, 다음 밑줄은 pCAT8에 포함되는 서열이다.

(서열 29)

이 프라이머와 -20프라이머를 각각 100ng, pCAT8을 10ng을 포함하는 PCR 반응을 최종부피 50μl로 행하였다. 반응은, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분을 1사이클로 하여 15사이클 행하였다. 반응후, 반응액으로부터 DNA단편을 geneclean(Bio101사)을 사용하여 제조자가 추장하는 방법으로 회수하였다. 회수한 DNA를 BamHI과 MvaI로 소화한 후, 아가로스 겔 전기영동하여, 약 200bp의 DNA단편을 회수하였다. 이 DNA단편을, pCAT8을 MvaI와 XhoI로 소화하여 수득하여지는 약 1.3kb의 DNA단편과, BamHI와 XhoI로 소화한 pBluescript IISK를 라이게이션하여 수득된 플러스미드를 pCATF8로 하였다. 이 플러스미드의 염기서열을 cDNA의 5' 말단에서 결정하여 염기서열을 확인했다.

[실시예 20]

라벤더 유래의 아실기 전이효소를 암호화하는 cDNA의 클로닝

차조기과의 라벤더(Lavandula angustl folia)의 꽃잎 유래의 cDNA 라이브러리를 실시예 3에서 서술한 방법으로 제작하고, 마찬가지로 실시예 3에 서술한 방법으로, 플라크 하이브리다이제이션의 방법을 사용하여, 약 30만 클론을 스크리닝하였다. 즉, 프로브에서는, 합성뉴클레오티드의 RI 프라이머; 5'CTCGGAGCAATTCgCCACGAC-3'(서열 30)와 올리고 2를 각각 100μg, pSAT208을 10ng 사용하여, 뉴클레오티드로서 DIG 표지뉴클레오티드를 사용하여, 최종부피 50μl로 PCR을 행하여 수득된 것을 사용하였다. 반응은, 95℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분을 1사이클로 하여, 25사이클 행하였다.

표지한 cDNA 단편을 하이브리다이제이션액 중에 가하고, 또한 16시간, 37℃로 유지하여, 하이브리다이제이션을 행하였다. 세정액(5×SSC, 1% SDS)으로 필터를 세정하여, 알카리 포스파타제로 표지된 DIG 특이적 항체에 의한 효소면역측정법(베링거맨하임사)에 의한 5-브로모 4-클로로 3-인드릴 인산과 니트로 블루 테트라 졸륨염의 발색반응에 의해서 양성 클론을 검출하였다. 또한, 검출방법은 제조사에 의한 사용설명서에 따랐다.

이 결과 1개의 양성 클론이 수득되어져, 이 cDNA를 스트라타진사가 추장하는 방법으로 λ파지를 벡터로 하는 형으로부터 플러스미드 pBluescript II SK-를 벡터로 하는 형으로 회수하였다. 수득된 클론으로부터 플러스미드를 추출하여, 이것을 pLAT1으로 하였다. 먼저 말한것처럼, ABI373 DNA 시퀀서(파킨엘마사)를 사용하여, 동사가 추장하는 형광색소에 의한 다이 데옥시 시퀀스법으로, pLAT1의 cDNA의 5' 말단부근의 염기서열을 결정하였다. 수득된 염기서열로부터 이끌어지는 아미노산 서열은, 차조기나 용담의 아실기 전이효소의 아미노산 서열과 높은 상동성을 나타내어, pLAT1이 라벤더의 아실기 전이효소를 암호화하는 것이 추정관찰되었다. 그러나, pLAT1이 암호화하는 아미노산 서열은 차조기나 용담의 아실기 전이효소의 아미노산서열과 비교하여 짧고, 아실기 전이효소의 전체 길이를 암호화하기 위해서는 만족되지 않는다고 생각되었다. 그리하여 DIG에서 표지한 pLAT1의 cDNA 프래그먼트를 프로브로 하여 라벤더의 꽃잎 유래의 cDNA 라이브러리를 위에 서술한 것과, 동일한 조건으로 스크리닝하였다. 프로브는, pLAT1프러스미드 약 1ng을 주형으로 하여, 하기에 나타내는 RI 프라이머와 올리고 2각 500ng, dNTP 표지혼합액(베링거)8μl를 포함하는 최종부피 50μl의 PCR반응에 의해 표지하였다. PCR반응은 95℃ 1분, 42℃ 2분, 72℃ 3분으로 이루어지는 사이클을 25사이클 행하고, 또한 신장반응을 완전히 하기 위해서 72℃로 7분 유지하였다. 플라크 하이브리다이제이션은, 하이브리다이제이션 버퍼중의 포름아미드농도는 50%, 필터의 세정은 2×SSC, 1% SDS에서 행한 이외는 위에 서술한 것과 같았다. 수득된 양성 클론의 5' 말단부근의 염기서열을 상술한 바와 같이하여 결정하여, pLAT1보다도 11bp 긴 클론, pLAT21를 수득했다. 이것을 서열표, 서열 6에 나타낸다. 그러나 pLAT21도 개시메치오닌코든을 포함하지 않고, 아실기 전이효소의 전체 길이를 암호화 하기 위해서는 만족되지 않는 클론이었다.

[실시예 21]

완전한 길이의 라벤더 유래의 아실기 전이효소의 cDNA의 합성

라벤더의 아실기 전이효소를 암호화한다고 생각되는 cDNA, pLAT21는 개시메치오닌코든을 포함하지 않기 때문에, 효모에서의 발현을 위해서는 cDNA의 5' 말단에 개시메치오닌코든을 부가할 필요가 있다. 그리하여, 하기의 동일한 프라이머를 사용하여, PCR을 행하여, 개시메치오닌코든을 부가할 필요가 있다. 그리하여, 하기의 동일한 프라이머를 사용하여, PCR을 행하여, 개시메치오닌코든을 pLAT21의 cDNA을 5' 말단에 부가한 프래그먼트를 합성하였다. 프라이머 LAT-ATG는 pLAT21의 5' 말단 20염기의 서열에 가하여, 개시메치오닌코든과, 그 상류에 인접하여 존재한다고 되어 있는 식물에서의 유전자발현을 위한 보존서열 AACA, 및 효모발현 벡터에의 연결에 필요한 제한 효소 BamHi 인식부위 gGATCC를 5' 상류에서 3' 방향으로 포함하도록 디자인되어 있다. LAT-ATG 프라이머(서열 31)

PCR 반응은 pLAT21 플러스미드 약 100ng을 주형으로 하여, LAT-ATG 프라이머와 올리고 2 각 500ng을 포함하는 최종부피 50μl로 PCR 반응을 행하였다. 반응은 95℃ 1분, 42℃ 2분, 72℃ 3분으로 이루어지는 사이클을 10사이클 행하고, 또한 신장 반응을 완전히 하기 위해서 72℃로 7분 유지하였다. 수득된 DNA 단편을 BamHI과 EcoRI으로 절단하여, 약 550bp의 DNA단편을 회수하였다. 이 DNA단편을 플러스미드 벡터 pBluescript II SK-의 BamHI와 EcoRI 사이트에 서브클로닝하여, pLATPCR11로 하였다. 상술한 바와 같이 하여 pLATPCR11의 염기서열을 결정하여, PCR에 의해서 증폭된 이 DNA단편이, pLAT21cDNA의 5'말단에서 EcoRI 사이트까지와 동일한 서열을 가지며, LAT-ATG 프라이머중의 개시메치오닌코든과 식물에서의 유전자발현을 위한 보존서열, 효모발현 벡터의 연결에 필요한 제한효소 BamHI 인식부위를 포함하는 것을 확인하였다.

또한, pLAT21의 cDNA부분의 전염기서열을 pGAT4의 cDNA의 염기서열을 정한 것과 동일한 방법으로 결정하였다. 이 cDNA가 암호화하고 있다고 예상되는 아미노산서열은, pSAT208, pGAT4, pCAT8, pGAT106, pPAT48에 대하여, 각각, 69%, 38%, 37%, 37%, 19%의 상동성을 나타내었다.

[실시예 22]

라벤더 유래의 아실기 전이효소 유전자의 효모에 있어서의 발현

pLATPCR11로 BamHI와 EcoRI으로 절단되는 약 550bp의 DNA 단편과, pLAT21로 부터 EcoRI와 XhoI로 절단하여 수득하여지는 약 1kb의 DNA단편과, 효모발현 벡터 pYE22m을 BamHI과 SalI으로 절단하여 수득하여지는 약 8kb의 DNA 단편을 라이게이션하여 수득하여지는 플러스미드를 pYELAT21로 하였다:먼저 말한것처럼, 효모 g1315를 이 플러스미드로 형질전환하여, 아실기 전이효소활성을 측정하였다.

이 결과, pYELAT21을 도입한 효모에서는 24nmol의 델피니딘 3,5-디클루코시드와 21.5nmol의 카페오일-CoA에서 19.9nmoll의 델피니딘 3-카페오일 글루코시드 5-글루코시드의 생성이 안정되었다. 따라서, pYELAT21에 포함되는 합성한 완전한 길이 cDNA는, 아실기 전이효소활성을 암호화하는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 23]

라벤더 아실기 전이효소 유전자를 포함하는 바이너리 벡터의 제작

pLATPCR11에서 BamHI과 EcoRI으로 절단되는 약 550bp의 DNA단편과, pLAT21로부터 EcoRI와 XhoI로 절단하여 수득하여지는 약 1kb의 DNA단편과, pBEGUSx를 BamHI과 XhoI으로 소화하여 수득하여지는 약 11kb의 DNA단편을 라이게이션하여 수득하여지는 플러스미드를 pBELA11로 하였다. 이것을 먼저 서술한 방법으로 Agrobacterium tumefacience의 Ag 10주에 형질전환하여, 피튜니아와 장미의 형질전환에 제공하였다.

[실시예 24]

아실기 전이효소에 대한 항체의 제작

어느 효소에 대하여, 아미노산 서열이 닯은 효소의 유전자를 취하는 방법의 하나로서, 어떤 효소에 대한 항체로, 발현형의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 들 수 있다. 여기에서는, 아래와 같이 하여, 용담의 pGAT4가 암호화하는 아실기 전이효소에 대한 항체를 제작하였다. 마찬가지로 하여, 다른 아실기 전이효소의 항체를 제작하는 것이 가능하였다.

우선, Bulk and RediPackgST Purification Mudules(phamarcia Biotech)를 사용하여 대장균에서 gAT4 단백질을 대량발현시켜, 여기서 정제를 행하였다.

(1) 발현 플러스미드의 구축

대장균에서의 아실기 전이효소 유전자의 발현에는 pGEX -4T-1를 사용하였다. 이 pGEX14T-1를 사용하여 글루타치온 S-트랜스페라제와의 융합단백질을 만들고, 그후 글루타치온 S-트랜스페라제의 어피니티 컬럼을 사용하는 것으로 효율적인 정제를 행할 수 있다.

pGEX-4T-1을 SmaI과 XhoI에서 소화한 후, DNA 블랜팅킷트(다까라슈조(주))를 사용하여 평활말단화하였다. 수득된 약 4.9kb의 단편을 알카리 포스파타제 BAPC75(다까라주조(주))를 사용하여 탈인산화하였다. pGAT4를 당해 당 벡터내에 존재하는 제한효소부위 SmaI과 KpnI에서 소화하여 수득하여지는 약 1.6kb의 DNA단편을 상술한 바와 같이 평활말단화하여, 상술한 pGEX-4T-1를 SmaI와 XhoI로 소화한 후 평활말단화한 부위에 재조합하고, pGEXGAT4를 구축하였다. EcoRI과 BglII로 소화하여 pGAT4상의 cDNA와 글루타치온 S-트랜스페라제의 방향이 동일한 방향인 것을 확인하였다.

(2) 아실기 전이효소의 대장균에 있어서의 발현

pGEXGAT4로 대장균 JM109를 형질전환하였다. 대장균의 형질전환법은 Hanahan의 방법에 따른(J.Mol.Biol., 166, 557-, 1983). 형질전환된 대장균을 암피실린(100μg/ml) 및 2% 글루코오스를 포함하는 2×YT 배지(트립톤 16g, 이스트 익스트렉트 10g, 염화나트륨 5g을 1liter의 증류수에 녹이고, 수산화 나트륨으로 pH을 7.0으로 조제한다) 50ml에 식균하여, 37℃로 밤새 배양하였다. 이 배양액 40ml를 400ml의 암피실린(100μg/ml) 및 2% 글루코오스를 포함하는 2×YT 배지에 접종하고, 37℃에서 3시간 배양후, 0.1M의 IPTG를 440μl(최종농도 10mM) 첨가하여, 또한 5시간 배양하였다. 집균후, 10μM의 APMSF를 포함하는 1×PBS(염화나트륨 8.2g, 염화칼륨 2.0g, 인산수소 이나트륨 1.43g, 인산 이수소칼륨 2.45g을 1리터의 증류수에 녹였다) 100ml에 현탁하였다. 이 현탁액을 초음파 파쇄한 후, 20% trition × 1100를 5ml(최종농도 1%)로 첨가하였다. 수중에서 냉각하면서 30분 진탕한 후, 12000rpm으로 10분간 원심하여, 수득된 침전을 12ml의 6M Urea에 현탁하고 등량의 2×SDS 샘플버퍼를 가하여 90℃, 5분간 처리하여 시료로서 사용하였다.

이 시료 0.8ml을 디스크 겔 전기영동(분리겔 7.5% 아크릴 아마이드, 농축겔 5% 아크릴 아마이드; ATTO(주) BIO PHORESISI III)로써 분리하고, 0.8ml씩 분리취득하였다. 각 분획분을 SDS-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동(분리겔 10% 아크릴아마이드, 농축겔 4.5% 아크릴 아마이드)로 분석한 결과, pGAT4가 암호화하는 아실이 전이효소와 글루타치온 S-트랜스페라제의 융합단백질의 크기와 일치하는 분자량 약 75000의 단백질이 단일의 단백질로서 존재하는 분획분이 있었다.

이 분획분(3.2ml)을 Centricon 10(amicon사)으로 농축하고 약 0.3μg의 융합단백질을 수득했다. 이 시료를 사용하여, BALB/C 마우스를 사용하여 일상법에 따라서, 항체를 제작하였다. 이 항체를 사용하여, 아실기 전이효소의 상동성을 취득할 수 있다.

상기와 같이, 본 발명에 있어서는 용담 유래의 방향족 아실기 전이효소의 정제, 해당 효소의 cDNA의 클로닝 및 해당 cDNA의 염기서열의 결정을 행하였다. 또한, 대장균과 효모에서의 활성발현을 행하는 것에 의해, 분리한 cDNA가 방향족 아실기 전이효소를 암호화하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명과 관계되는 cDNA를 적당한 식물 발현 벡터에 접속하여, 식물에 도입함에 의해, 아실화반응을 식물의 꽃의 색깔 조절에 이용하는 것이 가능하게 되었다.

또한, 본 효소활성을 이용함에 의해, 식물의 안에서 혹은 시험관내에서 안토시안의 구조를 개량변경하여, 보다 안정한 안토시안을 제공할 수 있다.

서열목록

서열 1

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):1703

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRADEDNESS):이본쇄(double)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):cDNA to mRNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

안티센스(ANTI-SENSE):없음

기원(ORIGINAL SOURCE)

생물명(ORGANISM):용담(Gentiana triflora var. japonica)

조직의 종류(TISSUE TYPE):꽃잎(petal)

직접의 기원(IMMEDIATE SOURCE)

라이브러리명(LIBRARY):cDNA 라이브러리

클론명(CLONE):pGAT4

[서열 1]

서열 2

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):1622

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):이본쇄(double)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

분자 형태(MOLECULE TYPE):cDNA 내지 mRNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

안티센스(ANTI-SENSE):없음

기원(ORIGINAL SOURCE)

생물명(ORGANISM);용담(Gentiana triflora var. japonica)

조직의 종류(TISSUE TYPE):꽃잎(petal)

직접의 기원(IMMEDIATE SOURCE)

라이브러리명(LIBRARY):cDNA 라이브러리

클론명(CLONE):pGAT106

[서열 2]

서열 3

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):1605

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):이본쇄(double)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):cDNA 내지 mRNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

안티센스(ANTI-SENSE):없음

기원(ORIGINAL SOURCE)

생물명(ORGANISM);피튜니아(Petunia hybrida)

조직의 종류(TISSUE TYPE):꽃잎(petal)

직접의 기원(IMMEDIATE SOURCE)

라이브러리명(LIBRARY):cDNA 라이브러리

클론명(CLONE):pPAT48

[서열 3]

서열 4

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):1479

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):이본쇄(double)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):cDNA 내지 mRNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

안티센스(ANTI-SENSE):없음

기원(ORIGINAL SOURCE)

생물명(ORGANISM):차조기(Petilla ocimoides)

조직의 종류(TISSUE TYPE):꽃잎(petal)

직접의 기원(IMMEDIATE SOURCE)

라이브러리명(LIBRARY):cDNA 라이브러리

클론명(CLONE):pGAT208

서열 5

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):1508

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):이본쇄(double)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):cDNA 내지 mRNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

안티센스(ANTI-SENSE):없음

기원(ORIGINAL SOURCE)

생물명(ORGANISM):시네라리아(Senecio cruentus)

조직의 종류(TISSUE TYPE):꽃잎(petal)

직접의 기원(IMMEDIATE SOURCE)

라이브러리명(LIBRARY):cDNA 라이브러리

클론명(CLONE):pGAT8

서열 6

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):1521

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):이본쇄(double)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):cDNA 내지 mRNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

안티센스(ANTI-SENSE):없음

기원(ORIGINAL SOURCE)

생물명(ORGANISM):라벤더(Lavandula angustifolia)

조직의 종류(TISSUE TYPE):꽃잎(petal)

직접의 기원(IMMEDIATE SOURCE)

라이브러리명(LIBRARY):cDNA 라이브러리

클론명(CLONE):pLAT21

서열 7

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):10

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):아미노산(amino acid)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):펩티드

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 7]

서열 8

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):8

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):아미노산(amino acid)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):펩티드

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 8]

서열 9

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):10

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):아미노산(amino acid)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):펩티드

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 9]

서열 10

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):8

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):아미노산(amino acid)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):펩티드

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 10]

서열 11

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):14

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):아미노산(amino acid)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):펩티드

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 11]

서열 12

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):14

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):아미노산(amino acid)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):펩티드

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 12]

서열 13

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):8

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):아미노산(amino acid)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):펩티드

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 13]

서열 14

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):9

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):아미노산(amino acid)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):펩티드

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 14]

서열 15

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):8

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):아미노산(amino acid)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):펩티드

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 15]

서열 16

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):23

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):synthetic DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 16]

서열 17

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):23

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 17]

서열 18

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):26

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 18]

서열 19

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):17

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 19]

서열 20

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):16

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 20]

서열 21

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):6

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):아미노산(amino acid)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):펩티드

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 21]

서열 22

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):17

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 22]

서열 23

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):21

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 23]

서열 24

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):23

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 24]

서열 25

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):20

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 25]

서열 26

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):20

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 26]

서열 27

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):53

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):이본쇄(double)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 27]

서열 28

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):16

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 28]

서열 29

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):45

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):이본쇄(double)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 29]

서열 30

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):21

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):일본쇄(single)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 30]

서열 31

서열의 길이(SEQUENCE LENGTH):35

서열의 형태(SEQUENCE TYPE):핵산(nucleic acid)

쇄의 수(STRANDEDNESS):이본쇄(double)

토폴로지(TOPOLOGY):선형(linear)

서열의 종류(MOLECULE TYPE):합성 DNA

하이포세티칼 서열(HYPOTHETICAL SEQUENCE):없음

[서열 31]

Claims

방향족 아실기 전이활성을 가지는 단백질 또는 이러한 효소활성을 갖는 유도체를 암호화함을 특징으로 하는 유전자.
제1항에 있어서, 서열 21에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 프라이머로서 사용하여 클로닝함에 의해 수득됨을 특징으로 하는 유전자.
제2항에 있어서, 상기 프라이머가 서열 22에 기재된 염기서열을 갖는 프라이머임을 특징으로 하는 유전자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 1 내지 6중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 이들 아미노산 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가, 제거 또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식되어 있는 아미노산 서열을 암호화함을 특징으로 하는 유전자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 1 내지 6중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열의 일부 또는 전부에 대하여, 5×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 또한 방향족 아실기 전이활성을 갖는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 유전자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 1 내지 6중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열의 일부 또는 전부에 대하여, 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 또한 방향족 아실기 전이활성을 갖는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 유전자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 1 내지 6중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대하여 15% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 방향족 아실기 전이활성을 갖는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 유전자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 1 내지 6중 어느 하나에 기재된 아미노산 서에 대하여 30% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 방향족 아실기 전이활성을 갖는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 유전자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 포함함을 특징으로 하는 벡터.
제9항에 기재된 벡터에 의해 형질전환됨을 특징으로 하는 숙주.
제10항에 있어서, 미생물 또는 동물세포임을 특징으로 하는 숙주.
제10항에 있어서, 식물세포 또는 식물체임을 특징으로 하는 숙주.
제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 기재된 유전자에 의해 암호화됨을 특징으로 하는 단백질.
식물체의 조효소 추출액을 시바크론 블루 3GA를 고정한 수지를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 처리하여 수득함을 특징으로 하는, 방향족 아실기 전이활성을 갖는 단백질.
제13항 또는 제14항에 기재된 단백질에 대한 항체와 특이적으로 결합할 수 있고 방향족 아실기 전이활성을 가짐을 특징으로 하는 단백질.
제10항에 기재된 숙주를 배양하거나 육성시키고, 이와 같은 숙주로부터 방향족 아실기 전이활성을 갖는 단백질을 채취함을 특징으로 하는, 방향족 아실기 전이활성을 갖는 단백질의 제조방법.
식물체의 조효소 추출액을 시바크론 블루 3GA를 고정한 수지를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 처리함을 특징으로 하는, 방향족 아실기 전이활성을 갖는 단백질의 제조방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 단백질에 대한 항체와 특이적으로 결합시킴을 포함하는, 방향족 아실기 전이활성을 갖는 단백질의 제조방법.
제13항 내지 제15항중 어느 한 항에 기재된 단백질을 색소에 작용시키는 것을 특징으로 하는, 색소의 아실화 방법.
제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 기재된 유전자를 식물체내에 도입하여, 상기 유전자를 발현시키고, 이와 같이 생성된 단백질에 의해 식물체내의 색소를 아실화함을 특징으로 하는, 식물체내에서의 색소의 아실화 방법.
제13항 내지 제15항중 어느 한 항에 기재된 단백질을 작용시켜 색소를 아실화함을 특징으로 하는, 색소의 안정화 방법.
제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 기재된 유전자를 식물체내에 도입하여, 상기 유전자를 발현시키고, 이와 같이 생성된 단백질에 의해 식물체내의 색소를 아실화함을 특징으로 하는, 식물체내에서의 색소의 안정화 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 식물체내에 도입하여, 상기 유전자를 발현시키고, 이와 같이 생성된 단백질에 의해 식물체내의 색소를 아실화함을 특징으로 하는, 식물의 꽃의 색깔 조절 방법.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 색소가 안토시아닌임을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 유전자가 도입되어 색이 조절된 식물 또는 이와 동일한 성질을 갖는 그의 자손 또는 이들의 조직.
제25항에 있어서, 상기 조직이 꽃인 식물의 조직.
제25항에 기재된 식물 또는 이와 동일한 성질을 갖는 그의 자손의 자른 꽃가지.