ES2336162T3 - Genes que codifican proteinas que tienen actividad aciltransferasa. - Google Patents

Abstract

PROTEINAS QUE POSEEN ACTIVIDAD AROMATICO-ACILTRANSFERASA; UN SISTEMA DE GENES QUE LAS CODIFICA; UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE LAS PROTEINAS UTILIZANDO EL SISTEMA DE GENES; Y USOS DE LOS GENES Y DE LAS PROTEINAS. LOS GENES Y LAS PROTEINAS ACILAN PIGMENTOS DE PLANTAS TALES COMO ANTOCIANINA, CAUSANDO CAMBIOS DEL TONO DEL COLOR, OBTENIENDOSE DE ESTE MODO PLANTAS, EN PARTICULAR FLORES, CON COLORES QUE NO LES SON INHERENTES.

Description

Genes que codifican proteínas que tienen actividad aciltransferasa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias aisladas de ADN que codifican proteínas que tienen actividad transferasa de grupos acilo aromáticos y al uso de las mismas, tal y como se define en las reivindicaciones. Más particularmente, la presente invención se refiere a secuencias aisladas de ADN que codifican proteínas que tienen actividad transferasa de grupos acilo aromáticos, obtenidas a partir de gencianas (Gentiana triflora, var. Japonica), petunias (Petunia hybrida), perillas (Perilla ocymoides), cinerarias (Senecio cruentus) y lavandas (Lavandula angustifolia) y al uso de las mismas tal y como se define en las reivindicaciones.

Técnica anterior

La industria floral está haciendo esfuerzos para desarrollar variedades nuevas y diversas. Un método eficaz para producir una nueva variedad implica cambiar el color de una flor, para lo cual se han empleado los métodos de cultivo tradicionales para producir una amplia variedad de colores para casi todas las variedades comerciales. Sin embargo, con los métodos anteriores, es raro que una sola especie produzca variedades de color que promuevan una amplia gama de colores diferentes, ya que para cada especie hay un grupo de genes limitado.

Los colores de las flores se basan principalmente en dos tipos de pigmentos, los flavonoides y los carotenoides. Los flavonoides confieren principalmente colores en la gama del amarillo al rojo y azul, mientras que los carotenoides confieren los tonos naranjas o amarillos. Las moléculas de los flavonoides que más contribuyen al color de las flores son las antocianinas que son glicósidos de cianidina, delfinidina, petunidina, peonidina, malvidina y pelargonidina. Diferentes antocianinas imparten cambios evidentes en el color de las flores. Además, el color de las flores está afectado por la copigmentación con flavonoides incoloros, la formación de complejos metálicos, la glicosilación, la acilación, la metilación y el pH de las vacuolas (Forkman, Plant Breeding 106: 1, 1991).

Existe una pluralidad de artículos sobre antocianinas aciladas, aisladas en la naturaleza que incluyen cinerarina, obtenida a partir de las cinerarias (Senecio cruentus) (Goto y col., Tetrahedron 25: 6021, 1984), awobanina obtenida a partir de Commelina communis (Goto y Kondo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 17, 1991) y gentiodelfina, obtenida a partir de Gentiana makinoi (Yoshida y col., Tetrahedron 48: 4313, 1992) (Monarda didyma: Kondo y col., Tetrahedron 26: 5879, 1985; perillas, pensamientos (Goto y col., Tetrahedron 27: 2413, 1987); amor de hombre: Idaka y col., Tetrahedron 28: 1901, 1987; Dioscorea japonica: Shoyama y col., Phytochemistry 29: 2999, 1990; lombarda, Platycodon grandiflorum, lobelia, delfinios, centros: Goto y Kondo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 17, 1991; zanahorias: Glabgen y col., Phytochemistry 31: 1593, 1992; ipomoea: Lu y col., Phytochemistry 32: 659, 1992; Saito y col., Phytochemistry 40: 1283, 1995; Ajuga decumbens, Clinopodium gracile, Lamiums, lavanda, nepeta, Leonurus macranthus, Plectranthus, Prunellas, Salvia splendens Sella, crosne del Japón: Saito y Harborne, Phytochemistry 31: 3009, 1992; nenúfar gigante: Strack y col., Phytochemistry 31: 989, 1992; campanillas: Brandt y col., 33: 209, 1993; gencianas: Hosokawa y col., Phytochemistry 40: 941, 1995; jacintos: Hosokawa y col., Phytochemistry 40: 567,
1995).

Los grupos acilo que modifican estos flavonoides que contienen antocianinas, se dividen en dos clases, basándose en su estructura: una es la de los grupos acilo aromáticos que se centran en ácidos hidroxi cinnámicos y la otra clase es la de los grupos acilo alifáticos, tales como el grupo malonilo. Se ha observado en el experimento que emplea el pigmento antocianina de las ipomoea nil (Pharbitis nil), que entre las reacciones de transferencia de grupos acilo, las antocianinas a las que se une un grupo acilo aromático, preferentemente ácido cumárico o ácido cafeico, muestran un desplazamiento del máximo de absorción a la longitud de onda lateral (Dangle y col., Phytochemistry 34: 1119, 1993).

Además, para la cineranina obtenida a partir de cineraria (Senecio cruentus) que sólo tiene un grupo acilo alifático y tres grupos acilo aromáticos, se ha descrito que la estabilidad del pigmento disminuye en una solución acuosa neutra, eliminando los grupos acilo aromáticos (Goto y col., Tetrahedron 25: 6021, 1984). Para la genciodelfina obtenida a partir de gencianas (Gentiana makinoi), también se ha descrito que tiene lugar un apilamiento intramolecular de tipo sándwich, debido a la presencia de dos grupos acilo aromáticos en la molécula, lo que produce una estabilización del pigmento en una solución acuosa (Yoshida y col., Tetrahedron 48: 4313, 1992). Además, Yoshida y col. han mostrado que cada glucosa en la posición 5 y cada glucosa en la posición 3' de la antocianina, tienen un grupo acilo unido a las mismas (Tetrahedron 48: 4313, 1992). También se ha descrito que la antocianina en las hojas de perillas (Perilla ocymoides) es shisonin en la que el ácido cumárico está unido a glucosa en la posición 3 del 3,5-diglucósido de cianidina (Tetrahedron Letters 27: 2413-2416, 1978).

Sin embargo, estos estudios se han desarrollado desde el punto de vista de la química orgánica, tal como estudios estructurales de pigmentos naturales, y no desde el punto de vista de la bioquímica, como los esfuerzos para aislar enzimas que transfieren grupos acilo.

De las transferasas que transfieren grupos acilo a los pigmentos de antocianina, hay muchos estudios sobre las transferasas de grupos malonilo que transfieren un acilo alifático, incluyendo las procedentes de un cultivo celular de perejil (Matern y col., Arch. Biochem. Biophys. 208: 233, 1981; Matern y col., Arch. Biochem. Biophys. 226: 206, 1983; Matern y col., Eur. J. Biochem. 133: 439, 1983), de semillas de Cicer arientium (Koster y col., Arch. Biochem. Biophys. 234: 513, 1984) y similares.

La reacción de transferencia de acilos aromáticos fue descrita en primer lugar para silene, un miembro de las Caryophyllaceae (Kamsteeg y col., Biochem. Physiol. Pflanzen 175: 403, 1980), y la actividad aciltransferasa aromática se encontró de forma similar en la fracción soluble enzimática de Matthiola (Teusch y col., Phytochemistry 26: 991, 1986).

Sin embargo, estos estudios se han limitado a una mera demostración de la presencia de actividad enzimática y no se han especificado las proteínas enzimáticas correspondientes, ni se ha obtenido una determinación de las propiedades de la estructura primaria de las enzimas, aún menos los genes que las codifican. Para otras transferasas de acilos aromáticos, los estudios no han aclarado tampoco la estructura primaria de las proteínas o los genes. Adicionalmente, no hay informes de ejemplos en los que las reacciones de acilación de pigmentos de antocianina se emplearan de forma positiva para expandir la gama de colores de las flores y para hacerlas crecer, o ejemplos en los que la acilación se empleaba en un intento de estabilizar las antocianinas.

Por otro lado, la ruta bioquímica de la síntesis de antocianinas de Petunia hybrida está bien estudiada (Wiering, H. y de Vlaming, P. Inheritance and biochemistry of pigments. Petunia, P49-65 (1984), Griesbach, R.J., Asen, S. y Leonhardt, B.A., Phytochemistry, 30: 1729-1731, 1991), y es conocida la presencia de antocianinas que contienen un grupo acilo. Como grupo acilo de las antocianinas de Petunia, se conoce el ácido cumárico o el ácido cafeico. Una molécula de ácido cumárico o ácido cafeico está unida a una rutinosida en la posición 3 de la antocianina, cuya estructura química asignada, cuando la antocianidina es malvidina, es 3-O-(6-O-(4-O-cumaroil)-\alpha-D-glucopiranosil)-5-O-\beta-D-glucopiranosil-malvidina y 3-O-(6-O-(4-O-cafeoil)-\alpha-D-glucopiranosil)-5-O-\beta-D-glucopiranosil-malvidina, respectivamente. Sin embargo, no había información sobre antocianinas que tuvieran dos grupos acilo.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ADN aisladas tal y como se definen en las reivindicaciones, que codifican proteínas que tienen actividad transferasa de grupos acilo aromáticos y al uso de las mismas, tal y como se define en las reivindicaciones. Por tanto, en relación con dicho uso, se describe un método para controlar una reacción de transferencia de un grupo acilo a flavonoides, preferentemente antocianinas, que proporciona una posibilidad de obtener una amplia gama de colores florales para una sola especie. En particular, dicho método se considera que es útil para impartir tintes azulados al color existente en las flores, porque el máximo de absorción de la antocianina se desplaza en dirección de la longitud de onda larga mediante la transferencia de grupos acilo aromáticos.

Para llevar a cabo la tecnología anterior, es necesario aclarar la identidad de las enzimas responsables de las reacciones de transferencia de acilos aromáticos, y separar el ADNc que codifica dichas enzimas. Además, empleando la homología de genes, es posible separar los genes de otras enzimas transferasas de grupos acilo. Asimismo, la producción de pigmentos estables de antocianina se puede realizar mediante acilación puesto que la acilación conduce a una estabilidad incrementada de las antocianinas.

Los inventores han aislado una aciltransferasa a partir de los pétalos de gencianas y han determinado la estructura primaria de la misma. Además, empleando tecnología recombinante, también hemos aislado de ADNc de aciltransferasas de gencianas, petunias, perillas, cinerarias y lavandas, y hemos determinado las secuencias de nucleótidos de los genes estructurales. Por tanto, la presente invención proporciona secuencias de ADN aisladas que codifican aciltransferasas que están presentes en los pétalos de gencianas, petunias, cinerarias y lavandas, y las hojas de perillas. Asimismo, las enzimas de la presente invención se pueden emplear para cambiar los colores de las flores, acilando los pigmentos de antocianina y para incrementar la estabilidad de las antocianinas.

Descripción específica

Los genes que codifican aciltransferasas se pueden obtener, por ejemplo, del modo siguiente. En primer lugar, se purifica una aciltransferasa a partir de los pétalos de gencianas. Antes de la presente invención, todos los intentos de purificar aciltransferasas aromáticas habían fallado. Los inventores de la presente invención han tenido éxito al purificar dicha enzima por primera vez, empleando diversos métodos cromatográficos, especialmente la cromatografía de afinidad, empleando una resina (por ejemplo, resina Blue Sepharose®, etc.) sobre la que se inmoviliza, por ejemplo, Cibacron Blue 3GA.

A continuación, la secuencia parcial de aminoácidos de la aciltransferasa se esclarece empleando el método convencional y se prepara un nucleótido sintético que se corresponde con dicha secuencia de aminoácidos.

Por otro lado, se extrae un ARN poli A^{+} a partir de los pétalos de la misma genciana, a partir del cual se sintetiza un ADNc bicatenario empleando el método convencional y se produce adicionalmente una genoteca de ADNc. Empleando el ADNc bicatenario anterior como molde, se obtiene un fragmento de ADN específico del gen de la aciltransferasa, mediante el método de la PCR, empleando los cebadores de ADN sintético que se habían utilizado para la síntesis de dicho ADN y ADNc sintéticos. A continuación, empleando este fragmento de ADN como sonda, se escruta la genoteca de ADNc mencionada anteriormente, para obtener clones positivos. El ADN plasmídico que se recupera a partir de los clones, se separa y se determinan sus secuencias de nucleótidos. Después, se compara la secuencia de aminoácidos obtenida a partir del análisis de la aciltransferasa purificada, con la secuencia de aminoácidos de la aciltransferasa deducida a partir de la secuencia de nucleótidos de ADN, para confirmar que el clon anterior positivo es el clon de ADNc deseado.

Los inventores también encontraron un mutante de petunia (VM), una cepa mutante de petunia var. Surfinia purple (VM) (Suntory Ltd.), en la que el color de la flor había cambiado del rojo púrpura al morado, y determinaron la estructura de las antocianinas según el método tal y como describen, por ejemplo, Yoshida y col. (Yoshida y col., Tetrahedron 48: 4313, 1992).

Como ADN de la presente invención, se menciona un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos tal y como se describe en cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 6. Sin embargo, se sabe que las proteínas que tienen secuencias de aminoácidos modificadas en las que se han añadido, eliminado y/o sustituido varios aminoácidos por otros aminoácidos, tienen una actividad enzimática similar a la proteína original. Por tanto, los genes que codifican proteínas que tienen secuencias de aminoácidos modificadas, en las que uno o varios aminoácidos se han añadido, eliminado y/o sustituido por otros aminoácidos y que conservan la actividad transferasa de grupos acilo aromáticos, están incluidos en la presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones.

La presente invención tal y como se define en las reivindicaciones, también se refiere a secuencias de ADN aisladas que codifican proteínas que se hibridan con la secuencia de nucleótidos, tal y como se describe en cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6 o una porción de las mismas, por ejemplo, la porción que codifica seis o más aminoácidos de la región de consenso, con la condición de tener, por ejemplo, 2 a 5 x SSC y 50ºC, y tener actividad transferasa de grupos acilo. Además, la temperatura óptima para la hibridación depende de la secuencia de nucleótidos y de su longitud. Preferentemente, la temperatura de la hibridación baja, cuando la secuencia de nucleótidos se acorta. Por ejemplo, en el caso de la secuencia de nucleótidos (18 bases) que codifica seis aminoácidos, se prefiere una temperatura de 50ºC o inferior. La presente invención tal y como se define en las reivindicaciones, también se refiere a secuencias aisladas de ADN que codifican proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 15% o superior preferentemente 25% o superior, por ejemplo 30% o superior, con la secuencia de aminoácidos tal y como se describe en cualquiera de las SEQ ID No. 1 a 6, y que tienen una actividad transferasa de grupos acilo aromáticos.

El ADN que tiene la secuencia de nucleótidos original se obtiene, tal y como se describe específicamente en los Ejemplos, mediante escrutinio, por ejemplo, de una genoteca de ADNc.

El ADN que codifica la enzima que tiene una secuencia de aminoácidos modificada se puede sintetizar mediante mutagénesis dirigida al sitio convencional o un método de la PCR basado en que el ADN tenga la secuencia de nucleótidos original. Por ejemplo, un fragmento de ADN que tiene un sitio que se desea modificar, se obtiene mediante digestión con enzimas de restricción del ADNc o del ADNc genómico obtenido tal y como se ha indicado anteriormente, el cual se emplea a continuación como molde para obtener el fragmento de ADN que tiene la modificación deseada, insertada en el mismo mediante mutagénesis dirigida al sitio o un método de la PCR, y ligando éste con el ADN que codifica otras partes de la enzima deseada.

Alternativamente, para obtener ADN que codifica una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos reducida, el ADN que codifica una secuencia de aminoácidos más larga que la secuencia de aminoácidos deseada, por ejemplo, el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de longitud completa, se corta con la enzima de restricción deseada. Cuando el fragmento de ADN resultante no codifica la secuencia de aminoácidos completa deseada, la porción perdida se puede complementar ligando el ADN sintético.

Un gen que codifica una aciltransferasa de acuerdo con la presente invención, se puede obtener expresando el clon anterior en Escherichia coli y en levadura empleando sistemas de expresión génica, lo que confirma que el gen obtenido codifica la aciltransferasa y especificando la región traductora del gen de la aciltransferasa. Además, al expresar dicho gen un producto genético, se puede obtener la proteína de la aciltransferasa deseada.

Alternativamente, también es posible obtener dicha proteína empleando un anticuerpo contra la secuencia de aminoácidos descrita en cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 6.

Por tanto, la presente invención se refiere a un vector recombinante que comprende dicho ADN, en particular un vector de expresión, y un hospedador transformado con dicho vector. Como hospedador, se puede emplear un organismo eucariótico o procariótico. Los organismos procarióticos que se pueden emplear incluyen una bacteria que pertenece al género Escherichia, por ejemplo, Escherichia coli, una bacteria que pertenece al género Bacillus, por ejemplo, Bacillus subtilis, o cualquier otro hospedador convencional.

Los organismos eucarióticos que se pueden utilizar, incluyen eucariotas inferiores, por ejemplo, microorganismos eucarióticos, por ejemplo, hongos tales como levadura u hongos filamentosos. Como levadura, se puede mencionar Saccharomyces, tales como Saccharomyces cerevisiae y como microorganismos filamentosos se puede mencionar Aspergillus, tales como Aspergillus oryzae y Aspergillus niger, y Penicillium y similares. Asimismo, se pueden utilizar células animales o vegetales. Las células animales que se pueden usar incluyen líneas celulares de ratón, hámster, mono, ser humano y similares. Además, se puede utilizar como hospedador células de insecto, tales como células de gusano de seda o larvas de gusano de seda o el mismo gusano de seda.

Los vectores de expresión de la presente invención contienen regiones que regulan la expresión, por ejemplo, promotor y terminador, origen de replicación y similares, dependiendo del tipo de hospedador en el que se introducen. Como promotor para vectores de expresión bacteriana, se pueden utilizar convencionalmente el promotor trc, el promotor tac, el promotor lac, etc. Como promotor para levadura se puede utilizar, por ejemplo, el promotor de la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, el promotor PH05 y similares. Como promotor para los organismos filamentosos, se puede utilizar, por ejemplo, la amilasa, trp C y similares. Como promotor para hospedadores de células animales, se puede utilizar promotores víricos, tales como el promotor temprano de SV40, el promotor tardío de SV40 y similares.

La construcción de un vector de expresión se puede realizar según un método convencional, empleando enzimas de restricción, ligasa y similares. La transformación de los hospedadores con un vector de expresión también se puede realizar según un método convencional.

En la preparación de dichas proteínas, la proteína deseada se puede obtener cultivando, dejando crecer o cosechando un hospedador transformado con el vector de expresión mencionado anteriormente, y sometiendo a continuación el cultivo a una filtración en gel, centrifugación, rotura celular, cromatografía con filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y similares, para recuperar y/o purificar dicha proteína.

Aunque la invención se ha descrito haciendo referencia específica a aciltransferasas obtenidas a partir de gencianas, petunias, perillas, cinerarias y lavandas, se debe tener en cuenta que el método de purificación de dicha enzima se puede modificar total o parcialmente para purificar aciltransferasas de otras plantas y a continuación las secuencias de aminoácidos de dichas enzimas se determinan para clonar los genes que codifican dichas enzimas. Empleando una sonda de ADNc de la aciltransferasa obtenida a partir de una genciana de acuerdo con la presente invención, también fue posible obtener ADNc de otra aciltransferasa procedente de una genciana y el ADNc de otra aciltransferasa procedente de una petunia. Por tanto, empleando parte o todo el gen de la aciltransferasa, es posible obtener el gen de otra aciltransferasa. La comparación de estas secuencias de aminoácidos mostró la presencia de una región de una secuencia de aminoácidos conservada. Empleando esta región, fue posible también obtener el ADNc de la aciltransferasa de una perilla y de una cineraria. Se puede aplicar un método similar a otras plantas para obtener clones de ADNc o de ADN cromosómico de una aciltransferasa similar.

Tal y como se ha descrito anteriormente, mediante la purificación de aciltransferasas obtenidas a partir de una genciana, una petunia, una perilla, una cineraria y una lavanda, y mediante la obtención a continuación de un anticuerpo contra dicha enzima, según un método convencional, es posible clonar el ADNc o el ADN cromosómico que produce una proteína capaz de reaccionar con dicho anticuerpo, Por tanto, la presente invención no está limitada a las aciltransferasas obtenidas a partir de gencianas, petunias, perillas, cinerarias y lavandas, sino que se refiere ampliamente a aciltransferasas aromáticas tal y como se definen en las reivindicaciones.

Además, la presente invención se refiere a plantas, tal y como se definen en las reivindicaciones, cuyos colores han sido intervenidos introduciendo el gen de la aciltransferasa en las mismas, o en progenies de las mismas o en sus tejidos, y pueden estar en forma de flores cortadas.

Adicionalmente, en la presente memoria descriptiva se mencionan ésteres de CoA, tales como p-cumaroil-CoA o cafeoil-CoA, etc., como un donante de un grupo acilo en la reacción de transferencia de un grupo acilo de flavonoides, que implica antocianinas, y además p-cumaroil, feruloil o hidroxicinamoil-1-O-glucosa tal como sinapoil-1-O-glucosa, se pueden utilizar como donantes de un grupo acilo aromático (Glassegen y Seitz, Planta 186: 582, 1992), y por tanto, se pueden utilizar las enzimas de acuerdo con la presente invención.

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Ejemplos

La presente invención se aclara ahora haciendo referencia a las siguientes realizaciones específicas. Los procedimientos experimentales empleados eran los de "Molecular Cloning" de Sambrook (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), a no ser que se indique de otro modo.

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Ejemplo 1

Búsqueda de aciltransferasa a partir de plantas (1) Preparación del sustrato

La delfinidina 3,5-diglucósido y la cianidina 3,5-diglucósido se obtuvieron a partir de pétalos de Tapian violet (Suntory Ltd.), una variedad de Verbena hybrida, extrayendo una forma diacetilada de cada una de las anteriores y desacetilándolas a continuación. Los pétalos (348 g) de Tapian violet se homogeneizaron con nitrógeno líquido en un homogeneizador, se sumergieron en 1,5 L de 50% (v/v) de acetonitrilo y 0,2% de ácido trifluoro acético (TFA), y a continuación se dejaron reposar durante tres días.

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El producto así obtenido se filtró bajo aspiración a través de tierra de diatomeas (nº 100) diseminada sobre el papel de filtro, a continuación se concentró hasta la mitad del volumen en un evaporador con rotación, seguido de filtración en gel con HP-20 (Pharmacia). Después de lavar con 800 ml de agua destilada, la fracción de pigmento se eluyó con 800 ml de acetonitrilo al 50% y 0,1% de TFA. Después de concentrar en un evaporador, se liofilizó hasta obtener el pigmento bruto (7,3 g).

Puesto que los pigmentos principales en Tapian son 3,5-diacetilglucósido de delfinidina y cianidina, se llevó a cabo el siguiente procedimiento de desacetilación. Un gramo del pigmento bruto se disolvió en 50 ml de metanol y se aireó con nitrógeno gas durante 15 minutos hasta eliminar el oxígeno disuelto y a continuación se enfrió sobre hielo.

De forma separada, el oxígeno disuelto se eliminó de forma similar desde 50 ml de hidróxido sódico 1 N, añadiendo gota a gota la solución anterior de pigmento mientras que se agitaba en hielo, y se agitó durante 30 minutos adicionales para efectuar la hidrólisis. Un ml de ácido clorhídrico 6 N fue añadido a la misma para detener la reacción. A continuación, se añadieron 5 ml de agua destilada y se concentró hasta tener la mitad del volumen en un evaporador, al que se añadió metanol hasta obtener una concentración final de 10%. Dos ml de partes alícuotas se aplicaron sobre una columna de Sep Pac C18 (Waters Association), que se lavó a continuación con 5 ml de agua destilada y se eluyó con 2 ml de acetonitrilo al 30% y TFA al 0,6%.

Todo el material eluido se recogió y se concentró en un evaporador, y a continuación se fraccionó mediante HPLC. Empleando una columna DEVELOSIL ODS-10/20 (50 x 300 mm; Nomura Kagaku K.K.), se efectuó la elución con un gradiente lineal de TFA desde 0,1% hasta 0,3% y acetonitrilo desde 10% hasta 30% durante 120 minutos. Las fracciones se recogieron cada 0,5 minutos con un caudal de 32 ml por minuto. El espectro de absorción de cada fracción de pigmento se midió por separado para la delfinidina-3,5-diglucósido y la cianidina 3,5-diglucósido, las cuales se concentraron a continuación y se liofilizaron (delfinidina-3,5-diglucósido, 75 mg y cianidina 3,5-diglucósido, 50 mg). Cada una se disolvió en TFA al 0,5% hasta tener una concentración de 1,5 mg/ml y se almacenaron a -80ºC hasta el uso.

La síntesis de otro sustrato, hidroxi cinamoil-CoA se realizó de la siguiente manera. En primer lugar, se sintetizó un éster a partir de ácido cafeico (Nakalai tesque) y N-hidroxisuccinimida (Merck) según la bibliografía (Stockigt y Zenk, Z. Naturforsch. 30: 352, 1975). Este éster (0,5 mmol) se disolvió en 2 ml de acetona. De forma separada, se disolvieron 0,1 mmol de Coenzima A (CoA: KOHJIN) y 1 mmol de hidrógeno carbonato sódico en 20 ml de agua, a la que se añadió gota a gota la solución de éster preparada anteriormente.

Después de dejar reaccionar la mezcla durante una noche, con agitación, bajo nitrógeno gas a temperatura ambiente, se concentró en un evaporador con rotación y se centrifugó (27.000 x g, 10 min) para eliminar la materia insoluble y se recogió el producto deseado empleando HPLC. Empleando una columna DEVELOSIL ODS-10/20 (50 x 300 mm; Nomura Kagaku K.K.), se efectuó la elución con un gradiente lineal de acetonitrilo desde 18% hasta 36% en presencia de 0,1% de TFA durante 40 minutos. Las fracciones se recogieron cada 0,8 minutos con un caudal de 32 ml por minuto. El espectro de absorción de cada fracción se midió (200 a 400 nm) para recoger las fracciones que tenían un máximo de absorción en el intervalo de 344 hasta 348 nm, como la fracción de cafeoil CoA. Después de concentrar en un evaporador con rotación, se separaron empleando la misma columna de nuevo.

Sin embargo, la elución se realizó mediante cromatografía isocrática con acetonitrilo al 18% y 0,1% de TFA, y el espectro de absorción se midió simultáneamente para concentrar las fracciones que contenían los compuestos deseados en un evaporador con rotación, las cuales se liofilizaron a continuación. Este método produjo 35 \mumol de los productos. Al sustituir el ácido cafeico anterior por ácido cumárico, se sintetizó p-cumaroil-CoA. El producto se disolvió en agua destilada con 2 mg/ml y se almacenó a -80ºC hasta su uso.

(2) Método de extracción de la solución enzimática bruta

Se congelaron en nitrógeno líquido tres gramos de tejido vegetal (pétalos, partes comestibles, etc.) a partir de los cuales se iban a extraer las enzimas, y se homogeneizó en un mortero. Se homogeneizó adicionalmente añadiendo 10 ml del tampón de extracción (tampón fosfato 100 mM, pH 7,5, ascorbato sódico 10 mM, 2-mercaptoetanol 14 mM) y se filtró a través de tres capas de gasa. Después de añadir 3 g de DOWEX (1-X2, 100-200 de malla; Muromachi Kagaku Kogyo K.K.) y agitar durante 10 minutos, se retiró la resina mediante filtración con aspiración y el resto de los tejidos vegetales se eliminó por centrifugación (27.000 x g, 20 minutos). A continuación, se sometió a precipitación salina con sulfato de amonio saturado al 70% para precipitar las proteínas. El material precipitado se suspendió en 1 ml del tampón de solubilización (tampón fosfato 20 mM, pH 7,5, 2-mercaptoetanol 14 mM) y la materia insoluble se retiró por centrifugación (27.000 x g, 5 minutos). Después se desalinizó empleando una columna Sephadex G-25 (NAP-10; Pharmacia) que se había equilibrado con el tampón de solubilización y la solución así obtenida se empleó como solución de enzima bruta.

(3) Método para medir la actividad enzimática

Cinco \mul de una mezcla de reacción que contenía tampón fosfato 100 mM, pH 8,5, 24 nmol de delfinidina 3,5-diglucósido, 21,5 nmol de cafeoil-CoA, y 20 \mul de la solución de la enzima, se dejaron reaccionar a 30ºC durante 10 minutos. Después de detener la reacción añadiendo 50 \mul de acetonitrilo que contenía 13,8% (v/v) de ácido acético y de eliminar el material insoluble por centrifugación (18.000 x g, 5 minutos), se analizó por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Veinte \mul de la mezcla de reacción se analizaron empleando una columna C18 de fase inversa (YMC-Pack ODS-A, 6,0 x 150 mm; YMC) y 21,6% de acetonitrilo y 0,1% de ácido trifluoroacético con un caudal de 1 ml por minuto. Los compuestos se detectaron empleando un sistema cromatográfico tridimensional (CLASS-LC10; Shimazu Seisakusho, K.K.) y se observó que el producto tiene un máximo de absorción en aproximadamente 330 nm, el cual está ausente en el sustrato y que el máximo de absorción en la gama de luz visible, se desplaza aproximadamente 6 nm, desde 519 nm hasta 525 nm, confirmando que se une un grupo acilo (ácido cafeico), y que se ha producido delfinidina 3-glucosil 5-cafeoil glucósido.

Durante la detección a una longitud de onda de 520 nm, la proporción del área pico del producto (delfinidina 3-glucosil 5-cafeoil glucósido) frente a la suma de las áreas pico del sustrato (delfinidina 3,5-diglucósido) y el producto (delfinidina 3-glucosil 5-cafeoil glucósido), se determinó para calcular el número molar del producto, el cual se definió como la actividad enzimática (kat). El tiempo de retención para cada compuesto en este análisis con HPLC fue el siguiente: cafeoil-CoA, 6,3 min; delfinidina 3,5-diglucósido, 3,3 min; delfinidina 3-glucosil 5-cafeoilglucósido, 5,3 min.

Puesto que con esta reacción se modifica el estado de la delfinidina 3,5-diglucósido en la mezcla de reacción con ácido cafeico, por la acción de la aciltransferasa, dando como resultado un cambio del color de la mezcla de reacción desde azul oscuro a rojo púrpura, la actividad enzimática se puede determinar con un método simple, llevando a cabo la reacción en una placa de microtitulación.

Cuando se deja reposar la placa después de la reacción, a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo prolongado (de un día a una semana), la delfinidina 3,5-diglucósido que no se ha acilado se vuelve incolora, mientras que la delfinidina 3,5-diglucósido que se ha acilado con la acción de la enzima, conserva el color rojo púrpura, de modo que se observó la estabilización de la delfinidina 3,5-diglucósido en un solución de neutra a alcalina, debido a su acilación. De forma similar, cuando la cianidina 3,5-diglucósido se empleaba como sustrato, el color de la mezcla de reacción cambió de rojo púrpura a azul oscuro y el pigmento se estabilizó, y, por tanto, es posible detectar la actividad enzimática con un simple ensayo.

Por otro lado, cuando se sustituye cafeoil-CoA por p-cumaroil-CoA, se observa el cambio de color producido por la acilación y la estabilización de la antocianina, pero el grado de cambio en el tono del color es menor que con cafeoil-CoA.

(4) Búsqueda de la aciltransferasa

Se extrajeron soluciones de enzima bruta a partir de una variedad de plantas, que incluían gencianas, iris, delfinios, alhelíes, Eustoma russellianum Griseb, clavelinas, guisantes de olor, espuelas del caballero, pensamientos, cinerarias (pétalos de las plantas anteriores), lombardas, cebollas rojas, zanahorias de Kintoki, zanahorias del oeste, patatas moradas, perillas (partes comestibles de las plantas anteriores y berenjenas (la parte epitelial del fruto), y se determinaron sus actividades enzimáticas. Como resultado se detectaron actividades de aciltransferasa de 0,63, 0,0012 y 21,8 nkat/mg de proteína en los extractos procedentes de Eustoma russellianum Griseb, clavelinas y gencianas, respectivamente. La genciana, que tenía la actividad aciltransferasa por proteína extraída, más elevada, se empleó como material para la purificación enzimática.

La determinación de la concentración de proteína se realizó empleando el ensayo de proteínas de Bio-Rad (Bio-Rad).

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Ejemplo 2

Purificación de la aciltransferasa obtenida a partir de gencianas (1) Purificación de la enzima

La enzima se extrajo a partir de pétalos de Gentiana triflora var. japonica. El siguiente experimento se realizó de 0º hasta 4ºC, a no ser que se indique de otro modo. Se homogeneizaron tres kilos de pétalos de Gentiana triflora var. japonica en presencia de nitrógeno líquido, empleando el homogeneizador de Excell "Auto Homogenizer" (DX-3; Nihoh Seiki Seisakusho). Después de añadir 8 L del tampón de extracción (tampón fosfato 100 mM, pH 7,0, ascorbato sódico 10 mM, clorhidrato de fluoruro de p-amidinofenil metanosulfonilo 10 \muM (p-APMSF; Wako Pure Chemicals K.K.)), ditiotreitol 5 mM (DTT; Nakalaitesk) y 500 g de polyclar SB-100 (Wako Pure Chemicals K.K.), se pulverizó completamente.

A continuación, el líquido pulverizado se extrajo con 4 capas de gasa, se centrifugó adicionalmente (11.000 x g, 30 min) para eliminar los desechos celulares. Después se realizó una precipitación salina con 40% de sulfato de amonio saturado y la materia insoluble se retiró antes de otra precipitación salina con sulfato de amonio saturado al 70%. El material precipitado se suspendió en 250 ml de tampón de solubilización (Tris-HCl 20 mM, pH 7,0, p-APMSF 10 \muM, DTT 1 mM), y la materia insoluble se eliminó por centrifugación. Después se desalinizó empleando una columna G-25 de Sephadex (95 x 110 mm; Pharmacia) que se había equilibrado con el mismo tampón. Las fracciones que contenían las proteínas se recogieron (860 ml) y se sometieron a la siguiente cromatografía.

Cada una de las cromatografías con "Q-Sepharose Fast Flow", "HiTrap Blue" y Superosa de fenilo, se realizaron empleando el sistema de FPLC (Pharmacia).

En primer lugar, las muestras se aplicaron a la Q-Sepharose Fast Flow (26 x 100 mm; Pharmacia) que se había equilibrado con el mismo tampón. Después de lavar de forma adecuada la columna con el mismo tampón, se eluyó con un gradiente lineal de cloruro sódico desde 0 M hasta 0,4 M, en 60 minutos (8 ml/min). Después de reunir las fracciones que contenían actividad enzimática (130 ml), se sometieron a cromatografía de afinidad. A continuación se aplicó a tres columnas de HiTrap Blue (5 ml, 16 x 25 mm; Pharmacia) conectadas en serie, lavadas de forma adecuada con el mismo tampón, y se eluyeron con el mismo tampón que contenía cloruro sódico 1 M. Las fracciones activas se precipitaron con sales de sulfato de amonio saturado al 70% hasta obtener un precipitado proteico.

El material precipitado se suspendió en 1 ml del tampón de solubilización y la materia insoluble se retiró por centrifugación, y a continuación se aplicó a Sephacryl S-200 (25 x 1150 mm; Pharmacia) que se había equilibrado con el tampón de solubilización. Con un caudal de 0,2 ml por minuto, se recogieron aproximadamente 3 ml de fracciones y después las fracciones activas se recogieron de nuevo (27 ml), el amonio sódico se añadió al mismo con una concentración de 1 M. Después de agitar completamente, se centrifugó (39.000 x g, 10 min) para eliminar la materia insoluble y se aplicó a la Superosa de fenilo 5/5 (5.0 x 50 mm; Pharmacia) que se había equilibrado con el tampón de solubilización que contenía amonio sódico 1 M.

Después de lavar adecuadamente con un caudal de 0,5 ml, la concentración de amonio sódico disminuyó linealmente desde 1 M hasta 0 M durante 60 minutos hasta eluir la proteína. Una parte alícuota de 0,5 ml de cada fracción se midió en busca de actividad enzimática. En un análisis con electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, se observó una banda de peso molecular aproximadamente 50.000 como una proteína casi aislada, y puesto que se observó una correlación entre esta proteína y la actividad, se llegó a la conclusión de que la proteína era la aciltransferasa deseada. Las fracciones (12 ml) que tenían actividad, se purificaron adicionalmente por HPLC en fase inversa para obtener un producto aislado.

Empleando una columna de DEVELOSIL 300 C4-HG-5 (4,6 x 250 mm; Nomura Kagaku K.K.), se llevó a cabo la elución con un gradiente lineal de acetonitrilo desde 40,5% hasta 56,7% en presencia de ácido trifluoroacético al 0,1%, durante 30 min, con un caudal de 1 ml por minuto. Se recogieron fracciones de 1 ml mientras que se vigilaba la absorbancia a 280 nm. Cada fracción se analizó adicionalmente mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, hasta recoger las fracciones que contenían proteína de peso molecular aproximadamente 50.000. Repitiendo esta HPLC 30 veces y concentrando en una centrífuga a vacío "Speed Vac Concentrator" (Savant), se obtuvieron aproximadamente 0,2 ml de la proteína aislada.

(2) Análisis de la proteína purificada

Cuando se sometieron 500 pmol de producto purificado al secuenciador de aminoácidos (PSQ-1; Shimazu Seisakusho K.K.), se detectaron 200 pmol de ácido glutámico en la primera etapa de la degradación de Edman y 90 pmol de ácido glutámico en la segunda etapa, pero no en la tercera etapa y en las posteriores. Por tanto, se dedujo que el extremo N-terminal de la enzima se bloqueaba de algún modo.

Sin embargo, ya que se sabe que cuando el extremo N-terminal es ácido glutámico, se forma ácido piroglutámico y se observa la secuencia tal y como se ha descrito anteriormente con la degradación de Edman, es muy probable que el extremo N-terminal de la enzima sea ácido glutámico.

El resto del material precipitado se disolvió en una solución que contenía 80 \mul de Tris-HCl 45 mM, pH 8,5, urea 3,6 M y SDS al 0,09%, al que se añadieron 16 pmol de lisil-endopeptidasa (lisil-endopeptidasa; obtenida a partir de Achromobactor lyticus; Wako Pure Chemicals K.K.) y se dejó reaccionar a 37ºC durante 6 horas. La mezcla de la reacción se separó directamente con una columna de DEVELOSIL 300 C4-HG-5.

Los requerimientos de la separación eran un caudal de 0,7 ml de un gradiente lineal de acetonitrilo desde 0% hasta 80%, durante 70 minutos en presencia de 0,1% de ácido trifluoroacético. Durante la vigilancia de la absorbancia, se recogieron a 210 nm los fragmentos que tenían un pico de absorbancia. De las 13 fracciones con pico obtenidas de este modo, tres fracciones que eluían con concentraciones de acetonitrilo de 32% a 40%, se concentraron en la centrífuga al vacío "Speed Vac Concentrator" y a continuación se separaron y se purificaron empleando una columna ODS (DEVELOSIL 300 ODS-HG-5; Nomura Kagaku K.K.), con los mismos requerimientos que antes.

Cada fracción se concentró hasta sequedad en el Speed Vac Concentrator, se disolvieron en 30 \mul de acetonitrilo al 40% y, a continuación, se sometieron a la secuenciación de aminoácidos. Como resultado, se podían analizar las secuencias de aminoácidos de seis péptidos. La secuencia de aminoácidos de cada péptido se muestra a continuación (la secuencia se muestra en la dirección desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxi terminal):

Secuencia de aminoácidos (AT73):

Arg-Phe-Leu-Gly-Ile-Thr-Gly-Ser-Pro-Lys

(SEQ ID No. 7)

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Secuencia de aminoácidos (AT72):

Ile-His-Met-Asp-Ala-Phe-Ala-Lys

(SEQ ID No. 8)

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Secuencia de aminoácidos (AT741-1):

Gly-Val-Glu-Ile-Gly-Val-Ser-Leu-Pro-Lys

(SEQ ID No. 9)

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Secuencia de aminoácidos (AT741-2):

Ala-Ser-Leu-Ser-Leu-Thr-Leu-Lys

(SEQ ID No. 10)

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Secuencia de aminoácidos (AT9):

His-Tyr-Val-Pro-Leu-Ser-Gly-Asn-Leu-Leu-Met-Pro-Ile-Lys

(SEQ ID No. 11)

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Secuencia de aminoácidos (AT83):

Val-Arg-Ala-Thr-Tyr-Val-Leu-Ser-Leu-Ala-Glu-Ile-Gln-Lys

(SEQ ID No. 12)

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Ejemplo 3

Clonación del ADNc de la aciltransferasa obtenida a partir de gencianas (1) (1) Construcción de una genoteca de ADNc

Los pétalos se recogieron de gencianas comerciales (Gentiana triflora var. japonica) y se homogeneizaron bajo nitrógeno líquido en un mortero. Se obtuvo ARN a partir del material homogeneizado, por el método que emplea tiocianato de guanidina/cloruro de cesio y a continuación se obtuvo el ARN poli A+ empleando "Oligotex" (Nihon Roche) según el método recomendado por los fabricantes. El método que emplea tiocianato de guanidina/cloruro de cesio se realizó según el método descrito detalladamente por R. McGookin, Robert J. Slater y col., Methods in Molecular Biology vol. 2 (Human Press Inc. 1984).

Empleando el ARN poli A+ obtenido como molde, se sintetizó ADNc bicatenario utilizando el equipo de reactivos para la síntesis de ZAP-ADNc (fabricado por Stratagene) y se clonó en el vector del fago \lambdaZAPII. Además, empleando el equipo de reactivos de GigapackII Gold Packaging Extract de la misma compañía, se construyó una genoteca de ADNc con el método que se describe en el equipo de reactivos incluido.

(2) Diseño de cebadores de ADN sintéticos

Entre las secuencias de aminoácidos obtenidas en el Ejemplo 2, la secuencia representada por Ile-His-Met-Asp-Ala-Phe-Ala-Lys (SEQ ID No. 13) es muy probable que sea Lys-Ile-His-Met-Asp-Ala-Phe-Ala-Lys (SEQ ID No. 14) considerando la especificidad de la lisil-endopeptidasa. Empleando la porción representada por la secuencia de aminoácidos: Lys-Ile-His-Met-Asp-Ala-Phe-Ala (SEQ ID No. 15) en esta secuencia, se sintetizó el siguiente oligonucleótido:

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Secuencia de nucleótidos (Oligo 1):

5'-AARATHCAYATGGAYGCITTYGC-3'

(SEQ ID No. 16)

Aquí, la secuencia de ácidos nucleicos se muestra con el código de una letra, de acuerdo con la IUPAC-IBU. Es decir, A: adenina, C: citosina, G: guanina, T: timina, Y: C o T, R: A o G, H: A o C o T, e I: inosina.

Además, otro oligonucleótido mostrado a continuación, también se sintetizó basándose en el cebador empleado para la construcción de la genoteca de ADNc mencionada anteriormente:

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Secuencia de nucleótidos (Oligo 2):

5'-CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'

(SEQ ID No. 17)

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(3) Clonación de fragmentos del gen de la aciltransferasa

Empleando aproximadamente 0,1 \mug de ADNc bicatenario obtenido a partir del ARN de pétalos de gencianas y los Oligo 1 y Oligo 2 como cebadores, se llevó a cabo la reacción de la PCR. La reacción se realizó empleando el equipo de reactivos para la reacción en cadena de la polimerasa de Gene Amp (Takara Shuzo K.K.) durante 35 ciclos, comprendiendo un ciclo 95ºC durante 1 minuto, 45ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos. Cuando el producto de la reacción así obtenido se separó en una electroforesis en gel de agarosa al 1%, se observó un fragmento de ADN específico de aproximadamente 400 pb. Este fragmento de ADN se recuperó y 10 ng del mismo se sometieron a 25 ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa mencionada anteriormente, empleando la mezcla de nucleótidos DIG (Boehringer) y el nucleótido sintético I y II para obtener fragmentos de ADN marcados con DIG.

(4) Clonación del ADNc de aciltransferasa

Una genoteca de fagos obtenida tal y como se ha indicado anteriormente, se infectó con E. coli cepa XL1-Blue (Stratagene) para escrutar cinco placas (diámetro 13,5 cm) que contenían 50.000 manchas por placa.

El fago se adsorbió a un filtro (Hybond N+, Amersham) y se trató con el método recomendado por el fabricante, y a continuación se dejó reposar el filtro en el tampón de hibridación (5 x SSC, 50% de formamida, tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, 7% de SDS, 2% de reactivo de bloqueo (Boehringer), 0,1% de lauroil sarcosina, 80 mg/ml de ADN de esperma de salmón) a 42ºC durante 1 hora. El fragmento de ADN marcado con DIG obtenido anteriormente, se añadió a la solución de hibridación y se incubó durante 16 horas.

El filtro se lavó con una solución de lavado (0,2 x SSC, 0,1% de SDS) y a continuación se realizó el enzimoinmunoensayo (Boehringer Mannheim) empleando el anticuerpo específico de DIG marcado con fosfatasa alcalina, para detectar la formación de color, empleando 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato y sal azul de tetrazolio. El método de detección se empleó según las instrucciones del fabricante.

Como resultado, se obtuvieron unas pocas docenas de clones positivos. De 20 clones positivos, se recogió el ADNc sobre el plásmido pBluescript SK-. La inserción del ADNc se examinó mediante electroforesis en gel de agarosa y se encontró que la inserción de los ADNc de distintos tamaños se observaba en todos los clones y el más largo entre ellos tenía 1,7 kb. Entre ellos, se eligieron 9 clones y se sometieron a análisis con enzimas de restricción. Por tanto, se encontró que se observaban patrones similares de corte con enzimas de restricción, aunque sus tamaños variaban.

(5) Determinación de la secuencia de nucleótidos

Se extrajo el plásmido de los clones así obtenidos. Empleando el secuenciador de ADN AB1373A (Perkin Elmer), para seis clones (pGAT2, pGAT3, pGAT4, pGAT7, pGAT8 y pGAT11) de los nueve que se consideraban que contenían la longitud completa, se determinó la secuencia de nucleótidos del extremo 5' terminal del ADNc, mediante el método de secuenciación didesoxi usando reactivos fluorógenos recomendados por el mismo fabricante.

El resultado sugería que estos clones tienen la misma secuencia de nucleótidos y difieren en la longitud del ADNc. Entre estos clones, se determinó la secuencia de nucleótidos completa de pGAT4. La determinación de la secuencia de nucleótidos se realizó para cada clon, después de haber obtenido una serie de clones delecionados empleando el equipo de reactivos para deleción de Kilo-Sequence (Takara Shuzo, K.K.).

(6) Comparación de la secuencia de nucleótidos con la secuencia de aminoácidos

El ADNc que se había insertado en pGAT4 representaba 1703 bases, entre las cuales se observó que había un marco de lectura abierto (ORF) que comprendía 1410 bases (que contenía el codón de detención). La secuencia se muestra en el listado de secuencias SEQ ID No. 1. Puesto que todas las secuencias parciales de aminoácidos de la aciltransferasa mostradas en el Ejemplo 2, aparecían como secuencias de aminoácidos en el ORF, se llegó a la conclusión de que el ADNc clonado era el gen de la aciltransferasa obtenido a partir de gencianas. El análisis del extremo amino terminal del codón de iniciación, sugería que el ácido glutámico es el residuo del extremo amino terminal, de modo que se dedujo que el primer ATG desde el extremo 5', era el codón de iniciación en la secuencia de nucleótidos del ADNc.

Por otro lado, puesto que el ADNc de pGAT8 es más corto que pGAT4 en 7 bases en el extremo 5' terminal, se sugirió que éste no era el ADNc de longitud completa.

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Ejemplo 4

Expresión de los genes en E. coli (1) Construcción de un plásmido de expresión

pTrc99A (Pharmacia), un vector de expresión de E. coli, se empleó para la expresión del gen de la aciltransferasa de E. coli. Este pTrc99A contiene el promotor trc de E. coli que se puede inducir con isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y, por ello, al insertar el gen deseado aguas debajo de dicho promotor, el gen se puede expresar en E. coli.

Un sitio de la enzima de restricción NcoI se insertó en el mismo, empleando el codón de iniciación, la secuencia ATG, de modo que fuera posible la expresión directa del gen deseado desde el codón de iniciación, recombinándolo con NcoI.

pGAT10 se construyó recombinando el fragmento de ADN de 1,8 kb (que contenía todas las secuencias de nucleótidos, tal y como se describe en SEQ ID No. 1) obtenido por digestión de pGAT4 con EcoRI y KpnI que están presentes en el vector presente, con sitios para EcoRI y KpnI del pTrc99A mencionado anteriormente.

Para introducir un sitio NcoI en la proximidad del codón de iniciación de la aciltransferasa, se sintetizaron los dos oligonucleótidos siguientes, que se corresponden con la proximidad del codón de iniciación y están dentro de la aciltransferasa (aproximadamente a 300 bases desde el codón de iniciación):

Oligonucleótido (GAT-NcoI):

5'-TTCACCATGGAGCAAATCCAAATGGT-3'

(SEQ ID No. 18)

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Oligonucleótido (GAT-ScaI):

5'-CGAGTCGCCCTCATCAC-3'

(SEQ ID No. 19)

Con 10 ng de pGAT4 como molde, se realizó una reacción de PCR empleando los oligonucleótidos anteriores como cebadores. La reacción se realizó empleando el equipo de reactivos de la reacción en cadena de la polimerasa de Gene Amp (Takara Shuzo K.K.) durante 15 ciclos, comprendiendo un ciclo 95ºC durante 1 minuto, 56ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos. Cuando el producto de la reacción así obtenido se separó con una electroforesis en gel de agarosa al 1%, se observó un fragmento de ADN específico de aproximadamente 300 pb. Este fragmento de ADN se recogió y se cortó con las enzimas de restricción NcoI y AatI. A continuación, se ligó a un fragmento de 6 kb que se había obtenido cortando pGAT101 con NcoI y AatI para construir pGAT102. Se confirmó que la secuencia de nucleótidos de la porción amplificada con la PCR era la misma que la de pGAT4 después de la construcción de pGAT102.

(2) Expresión del gen de la aciltransferasa en E. coli

pGAT102 se empleó para transformar E. coli MM294 (supE44 hsdR endA1 pro thi) (Meselson y Yuan, Nature, 217: 1110-, 1968). El hospedador empleado aquí no se tiene que definir específicamente y puede ser cualquier hospedador de E. coli que se pueda utilizar como hospedador para la transformación, y otras cepas, tales como JM109, DH5, etc.) que se emplean generalmente para la transformación y que son fáciles de conseguir para que los expertos en la técnica las puedan emplear. El método para la transformación de E. coli era tal y como lo describe Hanahan (J. Mol. Biol., 166: 557-, 1983). La E. coli transformada fue inoculada en 2 ml de medio LB (triptona 10 g, extracto de levadura 5 g, cloruro sódico 10 g, se disolvieron en un litro de agua destilada y el pH se ajustó a 7,2 con hidróxido sódico) y se incubó durante una noche a 37ºC.

Un ml del líquido del cultivo se inoculó en 10 ml de medio M9 (hidrógeno fosfato sódico al 0,6%, dihidrógeno fosfato potásico al 0,3%, cloruro sódico al 0,5%, cloruro de amonio al 0,1%, glucosa al 0,5%, sulfato de magnesio 1 mM, 4 \mug/ml de vitamina B1, pH 7,2) al cual se añadieron 0,5% de casaminoácidos y 50 \mug/ml de ampicilina, y se cultivó a 37ºC durante 3 horas, y a continuación se añadieron 40 \mul de IPTG 0,5 M (la concentración final, 2 mM) y el cultivo se continuó durante 5 horas más. Después de recolectar las células, se lavaron con tampón de Tris-HCl 30 mM, pH 7,5, que contenía cloruro sódico 30 mM, y después las células lavadas se suspendieron en 1 ml del mismo tampón. A las células se añadió 1 mg de lisozima, 25 \mul de EDTA 0,25 M y se dejó reposar a 0ºC durante 30 minutos. A continuación, las células se congelaron y se descongelaron tres veces hasta romper las células.

Después de centrifugar a 15.000 rpm durante 30 minutos, el material sobrenadante obtenido se empleó como una solución de enzima bruto y su actividad enzimática se determinó con el método de determinación de la actividad enzimática, tal y como se describe en el Ejemplo 1(3). En el método de la placa de microtitulación, la reacción de transferencia de grupos acilo se confirmó en E. coli en la que se introdujo pGAT102. Por tanto, se analizaron con HPLC.

Como resultado se encontró que en la E. coli en la que se había introducido pGAT102, se formaron 18,3 nmol de delfinidina 3-glucosil 5-cafeoil glucósido a partir de 24 nmol de delfinidina 3,5-diglucósido y 21,5 nmol de cafeoil-CoA.

Al combinar este resultado con el hecho conocido de que en la antocianina de genciana el grupo acilo se une a la glucosa en la posición 5 y la posición 3', se mostró que la aciltransferasa codificada por pGAT4 cataliza la reacción de transferencia de un grupo acilo a glucosa en la posición 5 de la antocianina 3,5-diglucósido.

Además, la delfinidina 3,5-diglucósido que se había acilado mediante la aciltransferasa producida por E. coli, también mostró que aparecía un color estable cuando se permitía el reposo a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo prolongado, de forma similar al de la acilada con la aciltransferasa obtenida purificando a partir de genciana.

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Ejemplo 5

Expresión de genes en levadura (1) Vector de expresión en levadura

Como vector de expresión de levadura, se empleó pYE22m tal y como se describe en el documento de publicación de patente japonesa sin examinar (Kokai) nº 4-228078.

(2) Expresión del gen de la aciltransferasa en levadura

Aproximadamente 1,8 kb del fragmento de ADN obtenido por digestión de pGAT4 o pGAT8 en los sitios de las enzimas de restricción, EcoRI y KpnI, presentes en cada uno de dichos vectores, se ligó con aproximadamente 8 kb del fragmento de ADN obtenido mediante digestión similar de pYE22m, en los sitios de EcoRI y KpnI, para construir los vectores de expresión de levaduras pYGAT4 y pYGAT8. pYGAT4 inicia la traducción en la primera metionina pero YGAT8 que carece de parte del extremo 5' terminal del ADNc aislado, inicia la traducción no en la metionina de inicio de la traducción de la aciltransferasa (número de secuencia de aminoácidos en la lista de aminoácidos SEQ ID No: 1), sino en la siguiente metionina (número de secuencia de aminoácidos en la lista de secuencias SEQ ID No: 5).

En estos vectores de expresión de levadura, el ADNc que codifica la aciltransferasa se liga aguas abajo del promotor de la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, uno de los promotores constitutivos de la levadura, y su transcripción está regulada por dicho promotor.

Empleando el método de Ito y col. (Ito y col., J. Bacteriol., 153: 163-168, 1983), se transformó una levadura de Saccharomyces cerevisiae G1315 (Ashikari y col., Appl. Microbiol. Biotechnol. 30, 515-520, 1989). La levadura transformada se seleccionó basándose en la recuperación de la capacidad de síntesis de triptófano.

Se debe tener en cuenta que el hospedador de la levadura, tal y como se emplea en esta memoria, para la transformación, no está limitado sino que puede ser cualquier cepa que muestre un requerimiento de triptófano debido a su gen TRP1 incompleto (por ejemplo, una disponible comercialmente en Yeast Genetic Stock Center; Berkely, CA, EE.UU.; Catalogure 7ª edición (1991), página 36).

El transformante obtenido se cultivó bajo agitación en 10 ml de medio de Burkholder (Burkholder, Amer. J. Bot. 30: 206-210) que contiene 1% de casaminoácidos. Como experimento testigo, la levadura que había recuperado de forma espontánea su capacidad de sintetizar de triptófano, se cultivó de forma similar.

Después de recolectar las células, se lavaron con la misma cantidad de tampón para destruir células (Tris-HCl 30 mM, pH 7,5, cloruro sódico 30 mM), y se suspendieron adicionalmente en 1 ml del mismo tampón y a continuación se transfirieron a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Después de centrifugar, el material sobrenadante se retiró y las células precipitadas se resuspendieron en 0,4 ml del mismo tampón, al que se habían añadido 400 mg de perlas de vidrio (perlas de vidrio de 425-600 micrones

\hbox{de
Acid-Wash, Sigma) y se agitó fuertemente para romper
 las células de levadura.}

El material sobrenadante después de la centrifugación se utilizó como solución enzimática bruta y se determinó su actividad enzimática con el método de determinación de determinación de la actividad enzimática, tal y como se describe en el Ejemplo 1(3). Puesto que se observó una reacción de transferencia de grupos acilo con el método de la placa de microtitulación en todas las levaduras en las que se había introducido pYGAT4 y pYGAT8, éstas se analizaron a continuación con HPLC. La levadura utilizada como testigo no mostraba ninguna actividad de transferencia de grupos acilo.

El resultado indicaba que se formaron 16,6 nmol y 20,9 nmol de delfinidina 3-glucosil 5-cafeoil glucósido a partir de 24 nmol de delfinidina 3,5-diglucósido y 21,5 nmol de cafeoil-CoA, respectivamente, en la levadura en la que se habían introducido pYGAT4 y pYGAT8. Ambas proteínas que se producían en pYGAT4 y pYGAT8, tenían actividad de transferencia de grupos acilo, aunque sus extremos amino terminales eran diferentes.

Además, la delfinidina 3,5-diglucósido que se había acilado con la aciltransferasa producida por la levadura, mostraba una coloración estable incluso cuando se dejaba reposar a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo prolongado, de forma similar a la acilada por la aciltransferasa obtenida con la purificación de gencianas.

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Ejemplo 6

Clonación de ADNc de la aciltransferasa obtenida a partir de genciana (2)

Entre los fragmentos de ADN obtenidos por digestión de pGAT4 tal y como se describe en el Ejemplo 3(6), es decir, pGAT4 que tiene el ADN tal y como se describe en el listado de secuencias SEQ ID No. 1, con las enzimas de restricción EcoRI y NdeI, se recogieron juntos dos fragmentos de ADN que contenían la región de traducción de la aciltransferasa y se marcaron con DIG como en los métodos descritos anteriormente. Empleando ésto como sonda, el fago de la genoteca de ADNc procedente de pétalos de gencianas, se adsorbió sobre un filtro (Hybond N+, Amersham) el cual se regeneró a continuación, eliminando los pigmentos y las marcas de DIG fijadas al filtro, según el método recomendado por el fabricante (Amersham), y se sometió a hibridación en un tampón de hibridación con una concentración baja de formamida (5 x SSC, 30% de formamida, Tris HCl 50 mM, pH 7,5, 1% de SDS) a 42ºC durante 16 horas.

Después de lavar a 50ºC en la solución de lavado (5 x SSC, 0,1% de SDS), se permitió que en el filtro apareciera color, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 3(4). En unas pocas docenas de clones apareció color, se obtuvieron 12 clones que no tenían color en el Ejemplo 3(4). Las secuencias de nucleótidos del ADNc de estos clones se determinaron a partir del extremo 5' terminal en el método mencionado anteriormente para encontrar que las secuencias de nucleótidos de 11 clones coincidían con la de pGAT4, pero un clon no, el cual se denominó pGAT106.

La secuencia completa de nucleótidos de pGAT106 se determinó tal y como se ha descrito anteriormente. El ADNc introducido en pGAT106 representaba 1622 bases de longitud, en las cuales se encontró un ORF que comprendía 1440 bases (que contenía el codón de detención). Esto se muestra en el listado de secuencias SEQ ID No. 2. En el ORF contenido en SEQ ID No. 2, se examinó su homología con la región completa de la secuencia de aminoácidos codificada por pGAT4. Se observó que la homología era del 38%.

Puesto que la secuencia de aminoácidos codificada por pGAT106 es homóloga a la de la enzima codificada por pGAT4, se dedujo que la anterior tiene una actividad enzimática similar, es decir, una actividad catalizadora de la transferencia de grupos acilo a antocianinas. El hecho de que la antocianina de las gencianas tenga grupos acilo en moléculas de glucosa en la posición 5 y 3', sugiere que pGAT106 cataliza la reacción enzimática de transferencia de un grupo acilo a la posición 3' de antocianina. El resultado indica que las aciltransferasas pueden ser diferentes en las posiciones de los azúcares, de las antocianinas a las que transfieren un grupo acilo, pero que las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos que las codifican son homólogas.

Tal y como se ha descrito anteriormente, existen muchas antocianinas que tienen grupos acilo, y estos compuestos varían mucho en la cantidad y la posición de los grupos acilo. Por tanto, se supone que hay una variedad de enzimas que catalizan la reacción de transferencia de grupos acilo. Se ha deducido fácilmente que las secuencias de aminoácidos de estas enzimas tienen homología con las secuencias de aminoácidos de pGAT4 y pGAT106 obtenidas en esta memoria. Basándose en esto, se pueden obtener otros genes de la aciltransferasa.

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Ejemplo 7

Antocianina de petunias

Las antocianinas encontradas en un mutante (VM) en el que el color de la flor había cambiado a violeta desde el color rojo púrpura original de Petunia hybrida var. Surfina purple (Suntory Ltd.), una variedad de la misma, se extrajeron pulverizando sus pétalos en nitrógeno líquido y a continuación extrayendo con acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1%. Después de filtrar, el material filtrado se separó y se purificó mediante cromatografías en columna de fase inversa ODS y ODP. Cuando uno de los compuestos se analizó con detalle mediante FABMS, ^{1}H RMN y ^{13}C RMN, se encontró una nueva antocianina. Su estructura se muestra a continuación:

1

Es decir, la estructura era

3-O-(6-O-(4-O-(4-O-(6-O-cafeoil-\beta-D-glucopiranosil)-cumaroil)-\alpha-L-ramnosil)-\beta-D-glucopiranosil)-5-O-\beta-D-
glucopiranosil-malvidina o una antocianina a la que estaban unidos dos grupos acilo.

Además,

3-O-(6-O-(4-O-(4-O-(6-O-cumaroil-\beta-D-glucopiranosil)-cumaroil)-\alpha-L-ramnosil)-\beta-D-glucopiranosil)-5-O-\beta-D-glucopiranosil-malvidina, 3-O-(6-O-(4-O-(4-O-(6-O-cafeoil-\beta-D-glucopiranosil)-cafeoil)-\alpha-L-ramnosil)-\beta-D-glucopiranosil)-5-O-\beta-D-glucopiranosil-malvidina, 3-O-(6-O-(4-O-(4-O-(6-O-cumaroil-\beta-D-glucopiranosil)-cafeoil)-\alpha-L-ramnosil)-\beta-D-glucopiranosil)-5-O-\beta-D-glucopiranosil-malvidina también se detectaron. Las antocianinas estaban presentes en los pétalos violeta oscuro de Fulcon Blue (Sakata Seed Corp.), Old Glory Blue (Ball Seeds), y similares. Por ello, las antocianinas que tienen dos grupos acilo, contribuyen posiblemente al color violeta oscuro de las petunias.

Por consiguiente, lo anterior sugiere que las aciltransferasas relacionadas con antocianinas obtenidas a partir de petunia, se presentan en dos tipos: la enzima que cataliza una reacción de transferencia del ácido cumárico o ácido cafeico a la rutinosida en la posición 3 de la antocianina, y la enzima que cataliza una reacción de transferencia del ácido cumárico o el ácido cafeico a la monoacil malvidina a través de la glucosa.

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Ejemplo 8

Clonación del ADNc de la aciltransferasa obtenida a partir de petunias

Una porción de ADNc de pGAT4 descrito en el Ejemplo 3(6), es decir pGAT4 que tiene un ADN tal y como se describe en el listado de secuencias SEQ ID No. 1, se marcó con DIG según el método descrito anteriormente, y la genoteca de ADNc de pétalos de Petunia hybrida var. Old Glory Blue, se escrutó según la técnica de hibridación en placa. La hibridación y el lavado se realizaron bajo condiciones similares a las descritas en el Ejemplo
6.

Se escrutaron aproximadamente 200.000 clones, a partir de los cuales se obtuvo uno que se hibridaba débilmente. Este clon se denominó pPAT5. La determinación de la secuencia de nucleótidos mostró que más de un ADN estaba insertado en pPAT5. Por tanto, era una secuencia similar a la del extremo C-terminal de la proteína codificada por pGAT4 y pGAT106 en el lado del cebador inverso del plásmido. Basándose en el cebador inverso, se sintetizó una secuencia de nucleótidos:

5'-AACAGCTATGACCATG-3' (SEQ ID No. 20) y el oligonucleótido se denominó el cebador RP.

Para obtener el ADNc de longitud completa de pPAT5, se sometieron 100 ng de cada uno de los cebadores RP y el cebador del oligo 2, y 10 ng de pPAT5 digerido con XhoI, a una reacción de PCR con un volumen final de 50 \mul. La reacción transcurrió durante 20 ciclos, comprendiendo un ciclo 95ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto. El fragmento de ADN de aproximadamente 600 pb obtenido de este modo, se dejó correr en una electroforesis en gel de agarosa y se purificó con GENECLEAN. Después de digerir enzimáticamente el fragmento con SmaI, el fragmento de ADN de aproximadamente 400 pb se purificó de forma similar. El fragmento de ADN se marcó con el DIG mencionado anteriormente.

Empleando el fragmento de ADN marcado, se escrutó la genoteca de ADNc anterior de pétalos de petunias, mediante la técnica de hibridación en placa. El lavado después de la hibridación se realizó en 0,2 x SSC a 65ºC durante 1 hora.

La determinación de la secuencia de nucleótidos del plásmido recuperado a partir del clon obtenido, mostró que pPAT48 contenía la misma secuencia que pPAT5. Esto se muestra en el listado de secuencias SEQ ID No. 3. Esta secuencia tenía una homología de 20% y 16% con pGAT4 y pGAT106, respectivamente, a nivel de secuencia de aminoácidos.

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Ejemplo 9

Extracción de la solución enzimática bruta a partir de perillas

Se recogieron hojas jóvenes rojas de los cuerpos vegetales de Perilla ocymoides var. Akachirimen, y se extrajo una solución enzimática bruta según el método descrito en el Ejemplo 1(2). Esta se hizo reaccionar con 50 \mul de una mezcla que contenía, como concentración final, fosfato potásico 50 mM, pH 8,5, delfinidina 3,5-diglucósido 0,48 mM, cafeoil-CoA 0,43 mM y 20 \mul de la solución de la enzima a 30ºC durante 10 minutos. Se añadieron 50 \mul de acetonitrilo que contenía 13,8% de ácido acético a la mezcla de la reacción para detener la reacción. Después de centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos, se analizó una parte alícuota de 10 \mul del material sobrenadante, mediante HPLC, bajo las siguientes condiciones.

La columna utilizada era YMC-Pack ODS-A (6,0 x 15 cm), y las muestras se separaron bajo los requerimientos de ácido trifluoroacético al 0,1%, acetonitrilo al 21,6% y un caudal de 1 ml/min. La detección se realizó a 520 nm. Bajo estas condiciones, la delfinidina 3,5-diglucósido sin reaccionar se eluyó a los 3 minutos y aquella en la que se había transferido el ácido cafeico a la posición 3 de la delfinidina 3,5-diglucósido, se eluyó a los 4,7 minutos, siendo el máximo de absorción de dicho compuesto 531 nm.

La modificación con el ácido cafeico también se observó cuando la delfinidina 3-glucósido se empleó como sustrato. Además, cuando se empleaba cumaroil-CoA como donante de grupos acilo, se observó la transferencia de un grupo cumaroilo. Se dedujó que, aunque las perillas naturales no contienen glucósido de delfinidina como antocianina, la aciltransferasa de las perillas puede usar delfinidina 3-glucósido y delfinidina 3,5-diglucósido como el receptor de grupos acilo y la cumaroil-CoA como el donante de grupos acilo.

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Ejemplo 10

Purificación de la aciltransferasa obtenida a partir de perillas

La purificación de la aciltransferasa obtenida a partir de perillas, se realizó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2(1). Tres kilogramos de hojas de perillas se congelaron en nitrógeno líquido y se pulverizaron en forma congelada en un homogeneizador. El material pulverizado se homogeneizó de nuevo en 10 litros del tampón de extracción (fosfato sódico 100 mM, pH 6,8, ascorbato sódico 10 mM, ditiotreitol 5 mM), p-APMSF 10 \muM, 5% (p/v) de Polyclar SB-100) en un homogeneizador. Este se filtró con gasa apilada en cuatro capas y a continuación se centrifugó (8.000 rpm, 4ºC, 30 minutos). Se añadió sulfato de amonio al material sobrenadante hasta tener un 40% de saturación. Después de la disolución, la centrifugación se repitió bajo las mismas condiciones. Se añadió sulfato de amonio al material sobrenadante hasta tener un 70% de saturación. Después de disolver, se repitió la centrifugación bajo las mismas condiciones. El material precipitado se disolvió en una cantidad mínima de tampón de desalinización (bis Tris-HCl, pH 6,3, ditiotreitol 1 mM, pAPMSF 10 \muM, 10% de glicerol), y a continuación se desalinizó con medio G-25 de Sephadex (Pharmacia, 9,5 x 45 cm) que se había equilibrado con el mismo
tampón.

La muestra desalinizada se sometió a cromatografía de intercambio iónico empleando "Q-Sepharose Fast Flow" 26/10. Se dejó correr un gradiente lineal de cloruro sódico desde 0 hasta 0,5 M en el tampón de desalinización, con un caudal de 8 ml/min, durante 1 hora. Las fracciones activas se eluyeron con concentraciones de NaCl de aproximadamente 0,15 M hasta 0,3 M. Las fracciones activas se adsorbieron a cuatro columnas de HiTrap Blue (5 ml) conectadas en serie, que se habían equilibrado con la solución de desalinización. Después de lavar adecuadamente las columnas con el mismo tampón, se realizó la elución con un gradiente lineal de cloruro de sodio desde 0 hasta 1 M en el tampón de desalinización (2 horas, caudal 5 ml/min). Las fracciones activas se eluyeron con concentraciones de NaCl de 0,8 hasta 0,9 M. Estas fracciones se sometieron a cromatografía empleando una columna de hidroxiapatito (de tipo cerámico II 40 mm; Bio-Rad). La columna sobre la que se había aplicado una muestra, se lavó de forma adecuada con tampón A (fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, ditiotreitol 1 mM, p-APMSF 10 \muM, glicerol al 10%). A continuación, se eluyó la enzima con un gradiente lineal de tampón A hasta tampón B (fosfato sódico 400 mM, pH 6,8, ditiotreitol 1 mM, p-APMSF 10 \muM, glicerol al 10%), que se había eluido con fosfato sódico aproximadamente 0,2 M. Estas fracciones activas se emplearon para la caracterización bioquímica de la
enzima.

De una forma similar a la de cuando se empleó la muestra de enzima bruta, cualquier cianidina 3-glucósido, cianidina 3,5-diglucósido, delfinidina 3-glucósido, y delfinidina 3,5-diglucósido se podían utilizar como receptor del grupo acilo. Como donante del grupo acilo, se puede emplear cumaroil-CoA y cafeoil-CoA. El peso molecular se observó que era aproximadamente 50.000, con la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. El punto isoeléctrico se determinó que era 5,3, empleando una columna Mono-P (Pharmacia).

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Ejemplo 11

Clonación del ADNc de la aciltransferasa obtenido a partir de perillas

Al comparar las estructuras de pGAT4, pGAT106 y pGAT48 que se habían clonado en el Ejemplo 3, el Ejemplo 6 y el Ejemplo 8, respectivamente, se observó que la secuencia de aminoácidos: Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys (SEQ ID No. 21) se había conservado. Por tanto, se esperaría que esta estructura también esté conservada en las aciltransferasas. Basándose en esta secuencia, se sintetizó la secuencia de nucleótidos: 5'-GA(TC)TT(TC)GGITGGGGIAA-3' (SEQ ID No. 22) y este oligonucleótido se empleó como cebador de ATC.

A partir de hojas jóvenes de perillas, se extrajo ARN con el método descrito en el Ejemplo 3 y también se construyó una genoteca de ADNc empleando el equipo de reactivos para síntesis de ZAP-ADNc (Stratagene). Empleando 50 ng de ADNc bicatenario que se había formado aquí como molde y 100 ng de cada uno de los cebadores de ATC y el cebador del oligo 2, se realizó la reacción de PCR con un volumen final de 50 \mul, empleando el equipo de reactivos de la PCR (Takara Shuzo). La reacción tuvo lugar durante 25 ciclos, comprendiendo cada ciclo 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC y 1 minuto a 72ºC. Un fragmento de ADN de aproximadamente 400 pb obtenido de este modo, se recuperó y se clonó en un vector empleando el equipo de reactivos para clonación TA (Invitrogen). La determinación de la secuencia de nucleótidos del clon así obtenido indicaba que el clon denominado pSAT104 tenía una alta homología con
pGAT4.

Empleando 10 ng de pSAT104 como molde y 100 ng de cada uno de los cebadores ATC y el cebador del oligo 2, se realizó la reacción de PCR empleando el equipo de reactivos para PCR (Takara Shuzo K.K.) con un volumen final de 50 \mul. La reacción se realizó durante 15 ciclos, comprendiendo cada ciclo 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC y 1 minuto a 72ºC. Empleando 1 \mul de este producto y 100 ng de cada uno de los cebadores de ATC y el cebador del oligo 2, se realizó la reacción de PCR empleando el equipo de reactivos para la PCR con un volumen final de
50 \mul.

Sin embargo, 4 \mul de la solución de nucleótidos marcados con DIG (fabricada por Boehringer) se empleó aquí como solución de desoxinucleótidos. Después de completar la reacción, se añadieron 5 \mul de acetato de sodio 3 M y 100 \mul de etanol para producir la precipitación en etanol. El producto obtenido se empleó para el siguiente
estudio.

Empleando el fragmento de ADN marcado obtenido a partir de pSAT104, la genoteca de ADNC de hojas de perillas se escrutó con la técnica de hibridación en placa. Se lavó en 1 x SSC a 65ºC durante 1 hora. La determinación de la secuencia de nucleótidos del clon hibridado, mostró que los clones de pSAT206, pSAT207, pSAT208, pSAT209, pSAT210, etc. contienen la secuencia de nucleótidos de pSAT104. Cuando la secuencia de nucleótidos de los extremos 5' de estos clones se comparó con la de pGAT4, cada clon tenía un amino terminal más corto que pGAT4 y ninguno tenía el codón de iniciación. Las secuencias de nucleótidos de los extremos 5' de pSAT206 y pSAT208, y de pSAT209 y pSAT210 eran idénticas. pSAT207 era más corto que pSAT206 en 6 residuos y pSAT209 era más corto que pSAT206 en 5 residuos.

Sobre el vector pBluescript SK-, estos ADNc toman unas formas tales que les permiten fusionarse con el gen LacZ del vector. Aparte de los clones mencionados anteriormente, pSAT206, pSAT208 y pSAT207 tomaron unas formas tales que les permitieron la expresión como una proteína de fusión con \beta-galactosidasa, mientras que pSAT209 y pSAT210 tenían marcos de lectura desplazados, de modo que no podía formar una proteína de fusión. pSAT206, pSAT207, pSAT209 y pSAT210 se expresaban en E. coli, y a continuación se sometió a ensayo la actividad enzimática de transferencia de un grupo acilo hasta la posición 3 de la glucosa, empleando delfinidina 3,5-diglucósido y cafeoil-CoA. El método para inducir la expresión etc. se realizó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo
4.

Las E. coli que contenían pSAT209 y pSAT210 no mostraban ninguna actividad enzimática de transferencia de grupos acilo, pero la E. coli que contenía pSAT206 mostraba la actividad enzimática de acilación del 48% de la delfinidina 3,5-diglucósido y la E. coli que contenía pSAT207 mostraba una actividad enzimática similar de acilación del 24% de dicho compuesto. Estos resultados mostraban que pSAT206 y pSAT207 y similares, manifiestan la clonación del gen que tiene la actividad enzimática de transferir grupos acilo a la glucosa en la posición 3 de la antocianina de perillas.

Entre esos clones, se determinó la secuencia de nucleótidos obtenida a partir del ADNc de pSAT208. Esto se muestra en la lista de secuencias SEQ ID No. 4. La secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos, mostraba una homología de 37%, 29% y 15% con pGAT4, pGAT106 y pPAT48, respectivamente. Tal y como se ha descrito anteriormente en esta memoria, esta secuencia, aunque no es un ADNc de longitud completa, puede expresar enzimas activas proporcionando un codón de iniciación adecuado como gen de fusión con
LacZ.

Comparando las secuencias de aminoácidos de las aciltransferasas que se habían descrito en la presente invención, se aclaró la secuencia conservada. Basándose en la secuencia de aminoácidos de esta región, es posible clonar aciltransferasas que modifican azúcares en otras posiciones de las antocianinas.

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Ejemplo 12

Clonación del ADNc de la aciltransferasa obtenida a partir de cinerarias

A partir de pétalos de Senecio cruentus var. Jupiter Blue (Sakata Seed Corp.), se extrajo ARN según el método descrito en el Ejemplo 3 anterior, y el ARN poli A+ se purificó adicionalmente. Se construyó una genoteca de ADNc empleando el equipo de reactivos de síntesis de ZAP-cDNA (Stratagene).

Empleando 50 ng de ADNc bicatenario que se había formado aquí como molde y 100 ng de cada uno de los cebadores de ATC y el cebador de oligo 2, se realizó la reacción de PCR con un volumen final de 50 \mul, empleando el equipo de reactivos de la PCR (Takara Shuzo). La reacción tuvo lugar durante 25 ciclos, comprendiendo cada ciclo 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC y 1 minuto a 72ºC. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 400 pb obtenidos de este modo, se recogieron y se clonaron en un vector empleando el equipo de reactivos de clonación de TA (Invitrogen). La determinación de la secuencia de nucleótidos de los clones obtenidos, mostró que un clon denominado pJAT4 tenía una alta homología con pGAT4.

A continuación, la genoteca de ADNc de pétalos de cinerarias se escrutó con pJAT4. Se obtuvieron diversos clones. Cuando se compararon las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de las secuencias de nucleótidos del extremo 5' de estos ADNc, con la secuencia de la proteína que codifica pGAT4, ninguno de los ADNc de los clones de cinerarias tenía la longitud completa. Entre ellos, se determinó la secuencia de nucleótidos completa de ADNc del clon denominado pCAT8. Este se muestra en la lista de secuencias SEQ ID No. 5. La secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos obtenida, mostraba una homología del 28%, 35%, 16% y 37% con pGAT4, pGAT106, pPAT48 y pSAT208, respectivamente.

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Ejemplo 13

Construcción de un vector binario que contiene el gen de la aciltransferasa obtenida a partir de gencianas

Después de haber digerido completamente el gen de la aciltransferasa de gencianas, pGAT4, con KpnI, se recogió un fragmento de ADN de aproximadamente 1,6 kb que se había obtenido con la digestión parcial del mismo con XbaI. Este fragmento de ADN se subclonó empleando los sitos de reconocimiento de las enzimas de restricción, KpnI y XbaI, de pUC19 para obtener un plásmido pUCGAT4. Después de digerir completamente pUCGAT4 con BglII, se digirió parcialmente con SacI para recoger un fragmento de ADN de aproximadamente 0,95 kb. Un plásmido obtenido ligando este fragmento de ADN, fragmento de ADN de aproximadamente 0,75 kb obtenido por digestión de pUCGAT4 con XbaI y BglII, con un fragmento de ADN obtenido por digestión del plásmido p2113G (descrito, por ejemplo en Aida y col., Acta Horticulture, 392: 219-225, 1995) con XbaI y SacI, se denominó pBEGA4. Este plásmido es un vector binario y el ADNc de la transferasa de acilos de genciana está bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor que tiene potenciadores y el terminador de la síntesis de nopalina, dentro de las células vegetales. También tiene un potenciador de la traducción denominado secuencia \Omega, en el extremo 5' del ADNc de la aciltransferasa de genciana. Téngase en cuenta que el promotor y el terminador, tal y como se emplean en esta memoria, no están limitados a los descritos anteriores, sino que puede ser un promotor constitutivo o un promotor que actúa específicamente en los pétalos, tal como el promotor del gen de la sintasa de
chalcona.

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Ejemplo 14

Introducción en vegetales del gen de la aciltransferasa obtenido a partir de gencianas

pBEGA4 fue introducido en Agrobacterium tumefaciens cepa Ag10 (Lazo y col., Bio/Technology, 9: 963-967, 1991) por el método descrito en "Plant Molecular Biology Manual" (Kluwer Academic Publishers). Por otro lado, se cultivó un brote apical de una rosa var. Lavende en un medio sólido, en el que se había añadido 2,25 mg/l de BA (6-bencil aminopurina), 3,46 mg/l de GA3 (ácido giberélico), 30 g/l de sacarosa y 2 g/l de goma arábiga al medio MS, para obtener el callo embrionario (EC). Un cultivo durante una noche de la cepa AG10 en el medio LB, se suspendió en el medio líquido MS que contenía 20 \mug/ml de acetosiringona para ajustar hasta una concentración de 5 x 10^{\Box} células/ml. Después de sumergir el EC en este líquido de cultivo bacteriano, el exceso de líquidos se secó para limpiar con papel de filtro esterilizado. Mediante la trasplantación y el cultivo en el medio MS, donde se había añadido 2,25 mg/l de BA, 0,35 mg/l de GA3, 30 g/l de sacarosa y 2 g/l de goma arábiga, al medio MS, se puede obtener un transformante. A partir del callo resistente a la kanamicina obtenido, se obtuvo ARN empleando trizol (Lifetec Oriental). Empleando este ARN como molde, y el nucleótido GAT-1: 5'-TGGCAACTGTCTTGCGTCATG-3' (SEQ ID No. 23) y el nucleótido GAT-2: 5'-CCATGTCAGGTGTGAGGTTCAAC-3' (SEQ ID No. 24) sintetizados basándose en la secuencia de nucleótidos de pGAT4 como cebador, se realizó una reacción de RT-PCR empleando el sistema de RT-PCR de Access (Promega). Empleando el mismo ARN como molde, y el oligonucleótido Kan-1: 5'-ATCGTTTCG
CATGATTGAAC-3' (SEQ ID No. 25) y el oligonucleótido Kan-2: 5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3' (SEQ ID No. 26) sintetizados basándose en la secuencia de nucleótidos de nptII sobre el vector binario como cebador, se llevó a cabo de forma similar la reacción de RT-PCR. La reacción tuvo lugar durante 40 ciclos, comprendiendo cada ciclo 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 60ºC y 2 minutos a 68ºC. A partir del callo del transformante se observó una banda obtenida a partir de pGAT4 y una banda obtenida a partir de nptII, pero no se observaron bandas del callo no transformante que se correspondieran con las anteriores. El resultado indica que el gen de la aciltransferasa de gencianas se podía introducir en la rosa.

La construcción del vector binario mencionado anteriormente y su transformación en una planta, no están limitadas al gen de la aciltransferasa de gencianas contenido en pGAT4, sino que se pueden introducir otras aciltransferasas en plantas y sus genes se pueden expresar en las plantas. A modo de ejemplo de una planta, se ha descrito anteriormente una rosa. Pero puesto que los métodos de transformación se han descrito para muchas otras plantas (por ejemplo, claveles, crisantemos, tabaco, petunias, gerberas, etc.), la aciltransferasa se podría introducir en muchas especies vegetales empleando métodos publicados.

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Ejemplo 15

Síntesis del ADNc de longitud completa de la aciltransferasa obtenida a partir de perillas

El ADNc del gen de la aciltransferasa de perillas, pSAT208, codifica enzimas activas tal y como se ha descrito anteriormente, pero no de longitud completa. Por tanto, se sintetizó un ADNc de longitud completa que contenía el codón de iniciación, basándose en la secuencia de nucleótidos del gen de la aciltransferasa de gencianas, pGAT4. De este modo, se sintetizó el ADN mostrado más adelante. La secuencia de aminoácidos codificada por el ADN también se muestra. El primer tramo subrayado es una secuencia de reconocimiento de BamHI y el siguiente tramo subrayado es una secuencia contenida en pSAT208. Detrás de la secuencia de reconocimiento de BamHI, está insertada una secuencia AACA que aparece frecuentemente, inmediatamente antes del codón de iniciación de la traducción en las plantas.

2

(SEQ ID No. 27)

La reacción con la PCR se realizó con un volumen final de 50 \mul que contenía 100 ng de este cebador y del cebador -20: 5'-GTAAAACGACGGCCAT-3' (SEQ ID No. 28), y 10 ng de pSAT208. La reacción tuvo lugar durante 15 ciclos, comprendiendo cada ciclo 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 55ºC y 2 minutos a 72ºC. Después de la reacción, se recuperaron los fragmentos de ADN a partir de la mezcla de reacción, empleando GENECLEAN (Bio101) según el método recomendado por el fabricante. Después de digerir el ADN recuperado con BamHI y EcoRI, seguido de electroforesis en gel de agarosa, se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pb. Este fragmento de ADN se ligó con un fragmento de ADN de aproximadamente 3,3 kb, obtenido por la digestión de pSAT208 con EcoRI, y el plásmido obtenido se denominó pSATF208. La secuencia de nucleótidos de este plásmido se determinó a partir del extremo 5' del ADNc para confirmar la secuencia de nucleótidos.

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Ejemplo 16

Expresión en levaduras del gen de la aciltransferasa obtenida a partir de perillas

De acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 5, pSATF208 se expresó en levaduras y se sometió a ensayo la actividad enzimática. Por tanto, un plásmido obtenido ligando un fragmento de ADN de aproximadamente 8 kb, obtenido por digestión de pYE22m con BamHI y SalI, con un fragmento de ADN de aproximadamente 8 kb, obtenido por digestión de pSATF208 con BamHI y SalI, se denominó pYSAT208.

La levadura G1315 se transformó con pYSAT208 y se determinó la actividad aciltransferasa del transformante resultante. Como resultado, en la levadura en la que se había introducido pYSAT208, se observó la formación de 10 nmoles de delfinidina 3-cafeoilglucósido 5-glucósido a partir de 24 nmol de delfinidina 3,5-diglucósido y 21,5 nmol de cafeoil-CoA. Por tanto, se confirmó que el ADNc de longitud completa sintetizado, contenido en pSATF208, codifica la actividad aciltransferasa.

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Ejemplo 17

Construcción de un vector binario que contiene el gen de la aciltransferasa obtenida a partir de perillas

El plásmido pE12\OmegaGUS es uno en el que la unidad de expresión del gen GUS sobre el plásmido p2113G (Aida y col., Acta Horticulture, 392: 219-225, 1995) se ha insertado en los sitios de reconocimiento de HindIII y EcoRI de pUC19. Después de digerir pE12\OmegaGUS con SacI y formar extremos romos con el equipo de reactivos para modificar los extremos del ADN en romos (Takara Shuzo), se ligó con un enlazador de XhoI (Toyobo). El plásmido obtenido que tiene un enlazador de XhoI insertado en el mismo, se denominó pE12\OmegaGUSx. Un plásmido obtenido por ligación de un fragmento de ADN de aproximadamente 2,8 kb, obtenido por digestión de este plásmido con HindIII y EcoRI, con pBin19 digerido con HindIII y EcoRI, se denominó pBEGUSx. Un plásmido obtenido ligando un fragmento de ADN de aproximadamente 11 kb obtenido por la digestión de pBEGUSx con BamHI y XhoI, con un fragmento de ADN obtenido por la digestión de pSATF208 con BamHI y XhoI, se denominó pBESA208. En este plásmido, la aciltransferasa de las perillas está bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor que tiene potenciadores y el terminador de la sintasa de nopalina.

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Ejemplo 18

Introducción del gen de la aciltransferasa de perillas en vegetales

pBESA208 se introdujo en Agrobacterium tumefaciens cepa Ag10 (Lazo y col., Bio/Technology, 9: 963-967, 1991) según el método descrito en el Manual para Biología Molecular Vegetal (Kluwer Academic Publishers). El transformante de la cepa Ag10 se empleó para transformar las petunias Falcon red (Sakata Seed Co.), Baccarat red (Sakata Seed Co.), y Titan red (Sakata Seed Co.), según el método descrito en Manual para Biología Molecular Vegetal (Kluwer Academic Publishers). Estos pétalos de petunia contienen cianidina-3-glucósido como antocianina principal.

La transformación también se realizó con una rosa var. Lavande, según el método mencionado anteriormente.

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Ejemplo 19

Síntesis del ADNc de longitud completa de la aciltransferasa obtenida a partir de cinerarias

El ADNc del gen de la aciltransferasa de cineraria, pCAT208, tal y como se ha descrito anteriormente, no era de longitud completa. Por tanto, se sintetizó un ADNc de longitud completa que contenía el codón de iniciación, basándose en la secuencia de nucleótidos del gen de la aciltransferasa de gencianas, pGAT4. De este modo, se sintetizó el ADN mostrado más abajo. La secuencia de aminoácidos codificada por el ADN también se muestra. El primer tramo subrayado es una secuencia de reconocimiento de BamHI para la clonación y el siguiente tramo subrayado es una secuencia contenida en pCAT208.

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3

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(SEQ ID No. 29)

La reacción de la PCR se realizó con un volumen final de 50 \mul que contenía 100 ng de este cebador y del cebador -20, y 10 ng de pCAT8. La reacción tuvo lugar durante 15 ciclos, comprendiendo cada ciclo 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 55ºC y 2 minutos a 72ºC. Después de terminar la reacción, los fragmentos de ADN se recuperaron de la mezcla de reacción empleando GENECLEAN (Bio101) según el método recomendado por el fabricante. Después de digerir el ADN recuperado con BamHI y MvaI, seguido de electroforesis en gel de agarosa, se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pb. Este fragmento de ADN se ligó con un fragmento de ADN de aproximadamente 1,3 kb obtenido por digestión de pCAT8 con MvaI y XhoI y el plásmido pBluescript SK- digerido con BamHI y XhoI, y el plásmido obtenido se denominó pCATF208. La secuencia de nucleótidos de este plásmido se determinó a partir del extremo 5' terminal del ADNc, para confirmar la secuencia de nucleótidos.

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Ejemplo 20

Clonación del ADNc que codifica la aciltransferasa obtenida a partir de lavandas

Una genoteca de ADNc obtenida a partir de pétalos de lavanda de la familia perilla, Lavandula angustifolia, se construyó según el método descrito en el Ejemplo 3, y se escrutó con la técnica de hibridación en placa, detallada en el Ejemplo 3. Se escrutaron aproximadamente 300.000 clones. Para ello, la sonda empleada era la obtenida con la reacción PCR con un volumen final de 50 \mul, empleando 100 ng del cebador sintético RI de nucleótidos: 5'-CTCGGAGGAATTCGGCACGAC-3' (SEQ ID No. 30) y del oligo 2, 10 ng de pSAT208 y un nucleótido marcado con DIG como nucleótido. La reacción tuvo lugar durante 25 ciclos, comprendiendo cada ciclo 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC y 2 minutos a 72ºC.

El fragmento de ADNc marcado se añadió a la solución de hibridación y la hibridación se realizó a 37ºC durante otras 16 horas. El filtro se lavó con la solución de lavado (5 x SSC, 1% SDS) y a continuación se realizó un enzimoinmunoensayo (Boehringer Mannheim) empleando el anticuerpo específico de DIG, marcado con fosfatasa alcalina para detectar clones positivos gracias a la aparición de color, empleando 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato y sal nitro azul de tetrazolio. El método de detección empleado era como el descrito en las instrucciones del fabricante.

Como resultado, se obtuvo un clon positivo. Este ADNc se rescató empleando el plásmido pBluescript SK- como vector a partir de la forma que emplea un fago \lambda como vector, empleando el método recomendado por el fabricante. Se extrajo un plásmido a partir del clon obtenido y se denominó pLART1. Tal y como se ha descrito anteriormente, la secuencia de nucleótidos en la proximidad del extremo 5' del ADNc de pLAT1 se determinó empleando el secuenciador de ADN ABI373 (Perkin Elmer) con el método de secuenciación didesoxi y pigmento con el pigmento fluorógeno recomendado por el fabricante. La secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos así obtenida, tiene una alta homología con la secuencia de aminoácidos de la aciltransferasa de perillas y gencianas, sugiriendo que pLAT1 codifica la aciltransferasa de lavandas. Pero, la secuencia de aminoácidos codificada por pLAT1 es más corta que la de la aciltransferasa de perillas o gencianas y esta posiblemente no es lo suficientemente larga para codificar la longitud completa de la aciltransferasa. Por tanto, empleando el fragmento de ADNc de pLAT1 marcado con DIG como sonda, se escrutó la genoteca del ADNc de las lavandas bajo las mismas condiciones que las mencionadas anteriormente. La sonda se marcó con la reacción PCR con un volumen final de 50 \mul que contenía aproximadamente 1 ng del plásmido pLAT1 como molde, 500 ng del cebador RI descrito a continuación y del oligo 2, y 8 \mul de la mezcla de dNTPs marcados (Boehringer). La reacción PCR tuvo lugar durante 25 ciclos, comprendiendo cada ciclo, 1 minuto a 95ºC, 2 minutos a 42ºC y 3 minutos a 72ºC, y la reacción se mantuvo a 72ºC durante 7 minutos más para perfeccionar la reacción de elongación. La hibridación en placa se realizó por el método descrito anteriormente, exceptuando que la concentración de formamida en el tampón de hibridación era del 50% y que el filtro se lavó con 2 x SSC y 1% de SDS. La secuencia de nucleótidos en la proximidad del extremo 5' del ADNc del clon positivo obtenido, se determinó tal y como se ha descrito anteriormente, y se obtuvo un clon, pLAT21 que es 11 pb más largo que pLAT1. Este se muestra en la lista de secuencias SEQ ID No. 6. Sin embargo, pLAT21 no contenía el codón de iniciación de metionina y no era lo suficientemente largo para codificar la longitud completa.

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Ejemplo 21

Síntesis del ADNc de longitud completa de la aciltransferasa obtenida a partir de lavandas

Puesto que el ADNc, pLAT21, que se considera que codifica la aciltransferasa de lavandas, no contiene el codón de iniciación de metionina, este codón de iniciación de metionina se tiene que añadir al extremo 5' del ADNc, para permitir su expresión en levaduras. Por tanto, empleando un cebador, tal y como se ha descrito anteriormente, la reacción PCR se realizó para sintetizar un fragmento en el que el codón de iniciación de metionina se había añadido al extremo 5' de pLAT21. Se diseñó el cebador LAT-ATG de modo que, además de las secuencias de 20 nucleótidos en el extremo 5' de pLAT21, el codón de iniciación de metionina, contuviera la secuencia AACA para la expresión génica en vegetales, que se cree que está presente de modo adyacente aguas arriba y el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BamHI, necesario para la ligación con un vector de expresión de levadura en la dirección 5' aguas arriba de 3'. El cebador LAT-ATG (SEQ ID No. 31):

4

La PCR se realizó con un volumen final de 50 \mul que contenían aproximadamente 100 ng del plásmido pLAT21 como molde, y 500 ng del cebador LAT-ATG y del cebador del oligo 2. La reacción PCR tuvo lugar durante 10 ciclos, comprendiendo cada ciclo 1 minuto a 95ºC, 2 minutos a 42ºC y 3 minutos a 72ºC, y la reacción se mantuvo a 72ºC durante 7 minutos más para perfeccionar la reacción de elongación. El fragmento de ADN así obtenido, se cortó con BamHI y EcoRI y se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 550 pb. Este fragmento de ADN se subclonó en los sitios de BamHI y EcoRI del vector del plásmido pBluescript SK- y se denominó pLATPCR11. La secuencia de nucleótidos de pLATPCR11 se determinó tal y como se ha mencionado anteriormente, y se confirmó que este fragmento de ADN amplificado con la PCR tenía la misma secuencia que el fragmento desde el extremo 5' hasta el sitio de EcoRI del ADNc de pLAT21, y contenía el codón de iniciación de metionina en el cebador LAT-ATG y la secuencia conservada para la expresión génica en vegetales, y el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BamHI, necesario para la ligación con un vector de expresión de levadura.

Además, la secuencia completa de nucleótidos de pLAT21 se determinó con un método similar al usado para determinar la secuencia de nucleótidos del ADNc de pGAT4. La secuencia de aminoácidos que se suponía que iba a codificar este ADNc, tenía una homología de 69%, 38%, 37%, 37%, y 19% con pSAT208, pGAT4, pGAT8, pGAT106 y pPAT48, respectivamente.

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Ejemplo 22

Expresión del gen de la aciltransferasa obtenida a partir de lavandas en levaduras

Un plásmido obtenido por ligación de un fragmento de ADN de aproximadamente 550 pb, escindido a partir de pLATPCR11 con BamHI y EcoRI, un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kb obtenido por escisión de pLAT21 con EcoRI y XhoI, y un fragmento de ADN de aproximadamente 8 kb, obtenido por escisión de pYE22m con BamHI y SalI, se denominó pYELAT21. Tal y como se ha explicado anteriormente, la levadura G1315 se transformó este plásmido y se determinó la actividad aciltransferasa.

Como resultado, en la levadura en la que se había introducido pYELAT21, se observó la formación de 19,9 nmol de delfinidina 3-cafeoilglucósido 5-glucósido a partir de 24 nmol de delfinidina 3,5-diglucósido y 21,5 nmol de cafeoil-CoA. Por tanto, se confirmó que el ADNc sintetizado de longitud completa contenido en pYELAT21, codifica la actividad aciltransferasa.

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Ejemplo 23

Construcción de un vector binario que contiene el gen de la aciltransferasa obtenido a partir de lavandas

Un plásmido obtenido por ligación de un fragmento de ADN de aproximadamente 550 pb, escindido de pLATPCR11 con BamHI y EcoRI, un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kb obtenido por escisión de pLAT21 con EcoRI y XhoI, y un fragmento de ADN de aproximadamente 11 kb obtenido por digestión de pBEGUSx con BamHI y XhoI, se denominó pBELA11. Tal y como se ha explicado anteriormente, este se transformó en la cepa Ag1 de Agrobacterium tumefaciens y se aportó para la transformación de petunias y rosas.

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Ejemplo 24

Construcción de un anticuerpo para la aciltransferasa

Como una forma de obtener el gen de una enzima cuya secuencia de aminoácidos es similar a la de la enzima deseada, se menciona un método en el que la genoteca de ADNc de la forma de expresión, se escruta con el anticuerpo de una enzima. En este caso, se produjo un anticuerpo de la aciltransferasa codificada por pGAT4 de gencianas. De forma similar, es posible producir anticuerpos para otras aciltransferasas.

En primer lugar, empleando los módulos de purificación Bulk y Redipack GST (Pharmacia Biotech), la proteína GAT4 se expresó en grandes cantidades empleando E. coli, a partir de la cual se purificó el anticuerpo.

(1) Construcción del plásmido de expresión

pGEX-4T-1 se empleó para expresar el gen de la aciltransferasa en E. coli. Empleando este pGEX-4T-1, se puede preparar una proteína de fusión con la S-transferasa de glutatión, la cual se purifica de forma eficaz empleando una columna de afinidad de S-transferasa de glutatión.

Después de digerir pGEX-4T-1 con SmaI y XhoI, se modificaron los extremos en romos, empleando el equipo de reactivos para crear extremos romos en ADN (Takara Shuzo). El fragmento de ADN de aproximadamente 4,9 kb obtenido de esta forma, se desfosforiló empleando la fosfatasa alcalina BAP C75 (Takara Shuzo). Se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 1,6 kb, digiriendo pGAT4 con SmaI y KpnI presentes en dicho vector, en el cual se crearon extremos romos tal y como se ha descrito anteriormente, y se recombinó con el sitio de extremos romos mencionado anteriormente, después de una digestión de pGEX-4T-1 con SmaI y XhoI, para construir pGEXGAT4. Al digerir con EcoRI y BglII, se confirmó que el ADNc y la S-transferasa de glutatión sobre pGAT4, estaban en la misma dirección.

(2) Expresión de la aciltransferasa en E. coli

La cepa de E. coli, JM109, se transformó con pGEXGAT4. La transformación de E. coli se realizó según el método de Hanahan (J. Mol. Biol, 166: 557-, 1983). La E. coli transformada se inoculó en 50 ml de 2 x medio YT (16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura y 5 g de cloruro sódico se disolvieron en un litro de agua destilada y a continuación el pH se ajustó a 7,0 con hidróxido sódico) que contenía ampicilina (100 \mug/l) y 2% de glucosa, y a continuación se cultivó durante una noche a 37ºC. Cuarenta ml del cultivo se inocularon en 40 ml de 2 x medio YT que contenía ampicilina (100 \mug/l) y 2% de glucosa, seguido de incubación a 37ºC durante 3 horas, a lo que se añadieron 440 \mul de IPTG (concentración final 10 mM) y se cultivó durante 5 horas más. Después de recolectar, las células se suspendieron en 100 ml de 1 x PBS (8,2 g de cloruro sódico, 2,0 g de cloruro potásico, 1,43 g de hidrógeno fosfato disódico y 2,45 g de dihidrógeno fosfato potásico se disolvieron en un litro de agua destilada) que contenía 10 \muM de APMSF. Después, la suspensión se sometió a ultrasonidos para destruirla, se añadieron 5 ml de Triton X-100 al 20% (concentración final 1%). Después de agitar en hielo durante 30 minutos, se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 minutos. El material precipitado obtenido se suspendió en 12 ml de urea 6 M, a la que se había añadido una cantidad igual de 2 x SDS tampón de la muestra y se trató a 90ºC durante 5 minutos para preparar una muestra.

Esta muestra (0,8 ml) se separó con electroforesis en gel de disco (gel de separación 7,5% de acrilamida, gel de apilamiento 5% de acrilamida: ATTO BIO PHORESISI III) y se recogieron partes alícuotas de 0,8 ml. Se analizó cada fracción con electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (gel de separación 10% de acrilamida, gel de apilamiento 4,5% de acrilamida). El resultado indicaba que había una fracción en la que una proteína que tenía un peso molecular de aproximadamente 75.000, que se correspondía con el tamaño de una proteína de fusión de la aciltransferasa y la S-transferasa de glutatión codificada con pGAT4, estaba presente como una proteína aislada.

Esta fracción (3,2 ml) se concentró con Centricon 10 (Amicon) para obtener aproximadamente 0,3 \mug de la proteína de fusión. Empleando esta muestra, se produjo anticuerpo empleando ratones BALB/C según el método convencional. Empleando este anticuerpo, se pueden obtener homólogos de la aciltransferasa.

Aplicabilidad industrial

Tal y como se ha descrito anteriormente, de acuerdo con la presente invención, se purificó la aciltransferasa aromática a partir de gencianas, se clonó el ADNc de dicha enzima y se determinó la secuencia de nucleótidos de dicho ADNc. Además, al expresar la actividad en E. coli, y en levaduras, se confirmó que el ADNc separado era idéntico al que codificaba la aciltransferasa aromática.

Por tanto, conectando el ADNc de acuerdo con la presente invención con un vector de expresión vegetal adecuado e introduciéndolo a continuación en una planta, fue posible utilizar la reacción de acilación para controlar el color de las flores.

Asimismo, utilizando la actividad enzimática presente, es posible modificar las estructuras de las antocianinas en vegetales o in vitro, para proporcionar antocianinas más estables.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Suntory Limited

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(B)

CALLE: 1-40, Dojimahama 2-chome, Kita-ku, Osaka-shi

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(C)

CIUDAD: Osaka

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(E)

PAÍS: Japón

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): Osaka 530

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Un gen que codifica una proteína que tiene actividad de transferencia de {}\hskip4.6cm grupos acilo

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 31

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(iv)

FORMATO LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

APLICACIÓN: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

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(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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NÚMERO DE SOLICITUD: EP 96902462.9

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(vi)

DATOS DE UNA SOLICITUD PRIORITARIA:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: JP 7-67159

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 17-FEB-1995

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(vi)

DATOS DE UNA SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: JP 7-196915

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 29-JUN-1995

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(vi)

DATOS DE UNA SOLICITUD PRIORITARIA:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: JP 8-46534

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-ENE-1996

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1703 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Gentiana triflora var. japonica

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: pétalo

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BANCO: Banco de ADNc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: pGAT4

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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5

6

7

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\vskip1.000000\baselineskip

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1622 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Gentiana triflora var. japonica

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: pétalo

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BANCO: Banco de ADNc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: pGAT106

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1605 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Petunia hybrida

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: pétalo

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BANCO: Banco de ADNc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: pPAT48

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

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\vskip1.000000\baselineskip

11

12

13

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1479 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Perilla ocimoides

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: hoja

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BANCO: Banco de ADNc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: pSAT208

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1508 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Senecio cruentus

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: pétalo

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BANCO: Banco de ADNc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: pCAT8

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1521 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Lavandula angustifolia

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: pétalo

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BANCO: Banco de ADNc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: pLAT21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

24

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 18

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= ""N" es inosina"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AARATHCAYA TGGAYGCNTT YGC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCGAGTTTT TTTTTTTTTT TTT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCACCATGG AGCAAATCCA AATGGT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGTCGCCC TCATCAC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACAGCTATG ACCATG

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= ""N" es inosina"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 15

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= ""N" es inosina"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAYTTYGGNT GGGGNAA

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGCAACTGT CTTGCGTCAT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATGTCAGG TGTGAGGTTC AAC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGTTTCGC ATGATTGAAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDBDNESS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGAAGAAC TCGTCAAGAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAAACGAC GGCCAT

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCGGAGGAA TTCGGCACGA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

35

Claims (22)

1. Una secuencia de ADN aislada que codifica una proteína de origen vegetal que tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide o a un derivado de una proteína tal, que es un derivado que tiene dicha actividad enzimática, teniendo dicha proteína o derivado una homología de al menos 15% o superior con el conjunto de cualquiera de las secuencias de aminoácidos tal y como se expone en SEQ ID No. 1 a 6.

2. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 1, obtenible por clonación empleando como cebador una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos tal y como se describe en SEQ ID No. 21.

3. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 2, en la que dicho cebador tiene la secuencia de nucleótidos tal y como se describe en SEQ ID No. 22.

4. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 1 ó 2, que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos tal y como se describen en SEQ ID No. 1 a 6.

5. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 1 ó 2, que codifica una proteína, cuya secuencia de ADN es capaz de hibridarse con la secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos tal y como se describen en SEQ ID No. 1 a 6, con los requerimientos de 5 x SSC y 50ºC y cuya proteína tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide.

6. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 1 ó 2, que codifica una proteína, cuya secuencia de ADN es capaz de hibridarse con la secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos tal y como se describen en SEQ ID No. 1 a 6, con los requerimientos de 2 x SSC y 50ºC y cuya proteína tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide.

7. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 1 ó 2, que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos 30% o superior con cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID No. 1 a 6, y que tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide.

8. Un vector que comprende una secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un hospedador, distinto de un ser humano, transformado con un vector según la reivindicación 8.

10. Un hospedador según la reivindicación 9, en donde dicho hospedador es una célula microbiana o animal.

11. Un hospedador según la reivindicación 9, en donde dicho hospedador es una célula vegetal o un cuerpo
vegetal.

12. Proteína codificada por una secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide.

13. Un método para producir una proteína que tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide, en el que un hospedador de acuerdo con la reivindicación 9, se cultiva o se hace crecer y, a continuación, una proteína que tiene dicha actividad de transferencia de un grupo acilo aromático a un flavonoide, se recupera a partir de dicho hospedador.

14. Un método para acilar un pigmento, que comprende someter dicho pigmento a la acción de la proteína según la reivindicación 12.

15. Un método para acilar un pigmento en una planta, que comprende las etapas de introducir un gen según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en una planta, permitir la expresión de dicho gen y acilar el pigmento en la planta con la proteína producida.

16. Un método para estabilizar un pigmento, en donde dicho pigmento está acilado por la acción de la proteína de acuerdo con la reivindicación 12.

17. Un método para estabilizar un pigmento en una planta, que comprende las etapas de introducir la secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en una planta, permitir la expresión de dicha secuencia y acilar el pigmento en la planta con la proteína producida.

18. Un método para controlar el color de las flores, que comprende las etapas de introducir la secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en una planta, permitir que dicha secuencia de ADN se exprese y acilar el pigmento en la planta con la proteína producida.

19. El método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que el pigmento es antocianina.

20. Una planta cuyo color se ha controlado introduciendo en ella una secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o su progenie que tiene la misma propiedad, o tejidos de la misma, en donde la estructura de los flavonoides de la planta en la que se ha introducido la secuencia de ADN, se ha modificado en relación con las estructuras de los flavonoides de plantas en las que no se ha introducido la secuencia de ADN.

21. El tejido vegetal según la reivindicación 20, en el que dicho tejido es una flor.

22. Una flor cortada de la planta según la reivindicación 20, o su descendencia, que tiene la misma propiedad.