WO1996025500A1 - Genes codant pour des proteines ayant une activite acyltransferase - Google Patents

Genes codant pour des proteines ayant une activite acyltransferase Download PDF

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WO1996025500A1
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plant
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Toshihiko Ashikari
Yoshikazu Tanaka
Hiroyuki Fujiwara
Masahiro Nakao.
Yuuko Fukui
Keiko Yonekura
Masako Mizutani
Takaaki Kusumi
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Suntory Limited
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/445—The saccharide radical is condensed with a heterocyclic radical, e.g. everninomycin, papulacandin

Definitions

  • the present invention relates to a gene encoding a protein having an aromatic acyl transfer activity and its use. For more information, see Window
  • the flower industry is striving to develop new and different varieties.
  • One of the effective ways to breed new varieties is to change the color of the flowers, using classical breeding methods to produce a wide range of colors for most commercial varieties This has been successful. However, it is rare for a single species to have a wide variety of colored varieties, as this method limits the gene pool by species.
  • Flower color is mainly based on two types of pigments: flavonoids and lip tines, with flavonoids contributing to the range from yellow to red or blue, and carotenoids being orange. Contributes to orange or yellow tones.
  • the flavonoid molecules that make a major contribution to flower color are anthocyans, glycosides of cyanidin, delphinidin, petunidin, zonidin, malvidin and peranolegonidin.
  • different anthocyans result in noticeable flower color changes.
  • the color of the flower is an auxiliary color of colorless flavonoids, metal complex formation, glycosylation, acylation, methylation and liquid Influenced by pH of vesicles (Forkmann, Plant Breedin 106: 1,1991)
  • the anthocyans that were defeated by Anrui were derived from cineralin (Goto et al., Tetrahedron 25: 6021, 1984) derived from cinerine (Senecio cruent us), and from cinnamon (Comme 1 ina communis).
  • cineralin Goto et al., Tetrahedron 25: 6021, 1984
  • cinerine Setrahedron
  • cinnamon cinnamon
  • Gento Delfin Gotoiana and Kindo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 17, 1991
  • Gentiodelphin Yoshida et al., Tetrahedron 48
  • the acyl groups that modify flavonoids containing these anthocyanes are structurally divided into two types. Is an aromatic acyl group centered on hydroxycinnamic acid, and another is an aliphatic group such as a malonyl group. It is an acyl group.
  • acyl group transfer reactions the absorption maximum of an aromatic cyano group, preferably anthocyan, to which coumaric acid or coffee acid is bonded via glucose, moves to the longer wavelength side. This was observed in experiments using asthocyan dyes from Asaga (Pharbi tis nil) (Dangle et al. Phy tochemi stry 34: 1119, 1993).
  • cineralin from sinecio (Senecio cruentus) has a strong ability to dissociate aromatic acyl groups from cineralin with one aliphatic and three aromatic acyl groups.
  • Stabilization has been reported (Yoshida et al., Tetrahedron 48: 4313, 1992).
  • malonyltransferase which is an aliphatic acyl
  • cultured parsley cells (Matern et al., Arch. Biochem. Biophys. . 208: 233, 1 981; Matern et al., Arch. Biochem. Biophys. 226: 206, 1983; Matern et al., Eur. J. Biocem. 133: 439, 1983) and seedlings of Cicer arrientium (Koster et al. al., Arch. Biochem. Biophys. 234: 513, 1984).
  • Petunia hybrida the biosynthetic pathway of anthocyanins in Petunia (Petunia hybrida) has been well studied (Wiering, H. and de Vlaming, P. Inheritance and biochemistry of pigments. Petunia, P49-). 65, (1984), Griesbach, RJ, asen, S. and Leonhardt, BA, Phytochemistry, 30, 1729-1731, 1991), and it is known that an anthocyanin containing an acyl group exists.
  • the acyl group of petunia anthocyanin is known to be coumaric acid or carboxylic acid, and one molecule of coumaric acid or carboxylic acid binds to the 3-position rutinoside of anthocyanin.
  • the chemical structure is 3-0- (6-0- (4-0-coumaroinole) -H-D-glucovilanosyl) -5-0- / 3 -D- Glucopirano Sinore-manolevidin, 3-0- (6-0- (4-0-force phenol) - ⁇ -D-glucopyranosyl) -5-0--D-glucopyranosyl-malvidin It was supposed to be. However, there were no reports on anthocyanins having two acyl groups. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a gene encoding a protein having an aromatic acyl transfer activity and its use. That is, for such use, there is a method of controlling the transamination reaction of flavonoids, preferably to anthocyanin, in plants, whereby a single species exhibits a wide range of flower colors. Offer the possibility to do. In particular, the transfer of the aromatic acyl group shifts the absorption maximum of anthocyan to the longer wavelength side, which is considered to be effective when the existing flower color has a bluish color. In order to realize these technologies, it is necessary to identify the enzyme responsible for the aromatic acyl transfer reaction and to isolate the cDNA encoding the enzyme.
  • the present inventors have purified acyltransferase from petals of gentian and determined its primary structure. Furthermore, the cDNAs of gentian, petunia, perilla, and sineria transacylases were isolated using gene recombination techniques, and the nucleotide sequences of the structural genes were determined. That is, the present invention provides a DNA sequence encoding an acyltransferase present in gentian, petunia, cineraria petals and perilla leaves. In addition, the flower color can be changed by acylating an anthocyan dye using the enzyme according to the present invention, and the safety of anthocyan is reduced. The qualitative can be increased. Specific description
  • a gene encoding an acyltransferase can be obtained, for example, as follows. That is, first, an acyltransferase is purified from petals of gentian. Heretofore, there has been no example of successful purification of an aromatic acyltransferase before the present invention was carried out, and the present inventors have proposed various chromatographic methods, particularly Shibakurombo method. Purification of the enzyme for the first time by carrying out affinity chromatography using a resin to which 3GA (Cibacron Blue 3GA) is immobilized (for example, Blue Sepharose (registered trademark) resin, etc.) succeeded in.
  • 3GA Cibacron Blue 3GA
  • the partial amino acid sequence of the acyltransferase is elucidated according to a conventional method, and a synthetic nucleotide corresponding to the amino acid sequence is produced.
  • ⁇ 1yA + RNA is extracted, a double-stranded cDNA is synthesized by a conventional method, and a cDNA library is prepared.
  • the above-mentioned double-stranded cDNA is converted into type II, and a DNA fragment specific to the acyltransferase gene is obtained by PCR using the synthetic DNA primers used in synthesizing the above-mentioned synthetic DNA and cDNA. Get Next, using the DNA fragment as a probe, the aforementioned cDNA library is screened to obtain a positive clone.
  • plasmid DNA recovered from this clone is separated, and the DNA base sequence is determined. Positive results were obtained by comparing the amino acid sequence obtained from the analysis of the purified aminotransferase with the amino acid sequence of the acyltransferase deduced from the DNA base sequence. Confirm that the clone is the desired cDNA clone.
  • the present inventors have proposed a petunia cultivar Saffinia Purple (Sun TREE Co., Ltd.) found a mutant (VM) in which the flower color changed from normal magenta to purple, and determined the structure of anthocyanin.
  • VM mutant
  • Examples of the DNA of the present invention include those encoding the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • a protein having an amino acid sequence modified by addition or removal of a plurality of amino acids and replacement by amino or other amino acids also has the same enzymatic activity as the original protein. It is known to maintain Therefore, the present invention relates to the addition or removal of one or more amino acids to / from the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6 and / or the use of other amino acids.
  • a gene encoding a protein having a substituted amino acid sequence that has been substituted and maintaining an aromatic acyl group transfer activity belongs to the present invention.
  • the present invention also relates to a nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 or a portion thereof, for example, a portion of the consensus region encoding 6 or more amino acids,
  • the present invention relates to a gene that hybridizes under the condition of 5 ⁇ SSC at 50 ° C. and encodes a protein having an activity of transferring an aromatic acyl group.
  • the optimal hybridization temperature depends on the nucleotide sequence and its length, and it is preferable that the hybridization temperature be lowered as the nucleotide sequence becomes shorter.For example, six amino acids may be used to reduce the hybridization temperature. In the case of a base sequence to be sequenced (18 bases), a temperature of 50 ° C or lower is preferable.
  • the present invention further provides an amino acid having 15% or more, preferably 25% or more, for example, 30% or more homology to the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the present invention relates to a gene encoding a protein having a amino acid sequence and having an aromatic acyl transfer activity.
  • the DNA having the native nucleotide sequence is specifically described in the Examples. For example, it can be obtained by screening a cDNA library. DNA encoding an enzyme having a modified amino acid sequence can be synthesized using conventional site-directed mutagenesis or PCR based on DNA having a native nucleotide sequence. You. For example, a DNA fragment containing a site into which a modification is to be introduced can be obtained by digestion of the cDNA or genomic DNA obtained as described above with a restriction enzyme, and this is transformed into type III to introduce the desired mutation. The site-specific mutagenesis or PCR method is performed using the primer thus obtained to obtain a DNA fragment into which the desired modification has been introduced, and this may be ligated to DNA encoding another part of the target enzyme.
  • a DMA encoding an enzyme having a shortened amino acid sequence for example, an amino acid sequence longer than the desired amino acid sequence, for example, a full-length amino acid sequence
  • the obtained DNA fragment does not encode the entire amino acid sequence of interest, the missing DNA is ligated to the synthesized DNA. You can catch it by doing it.
  • this clone was expressed using a gene expression system in Escherichia coli and yeast, and the enzyme activity was measured to confirm that the obtained gene encoded an acyltransferase.
  • the gene encoding the acyltransferase according to the present invention can be obtained, and further, the gene can be expressed.
  • the desired acyltransferase protein which is a gene product, can be obtained.
  • the protein can also be obtained using an antibody against the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the present invention also relates to a recombinant vector comprising said DNA, in particular an expression vector, and a host transformed with said vector.
  • Prokaryotes or eukaryotes can be used as hosts.
  • Prokaryotes include bacteria, such as bacteria belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli, and Bacillus.
  • a conventional host such as a microorganism of the genus (Bacillus), for example, Bacillus subtilis, can be used.
  • lower eukaryotes for example, eukaryotic microorganisms, for example, fungi such as yeast or filamentous fungi
  • yeast include microorganisms belonging to the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces * cerevisiae
  • filamentous fungi include Aspergillus.
  • Genus microorganisms for example, Aspergillus oryzae, Aspergillus J., Microorganisms of the genus Penicillium, Aspergillus niger, and the like.
  • animal cells or plant cells can be used, and as animal cells, cell lines such as mouse, hamster, monkey, and human can be used, and insect cells such as silkworm cells or silkworm cells can be used.
  • insect cells such as silkworm cells or silkworm cells can be used.
  • Adult moss itself is also used as a host.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region, for example, a promoter and a terminator, an origin of replication, and the like, depending on the type of host into which they are to be introduced.
  • Conventional promoters such as trc promoter, tac promoter, lac promoter and the like are used as promoters for bacterial expression vectors, and glyceroaldehyde 3-phosphate dehydrogenase as yeast promoters.
  • Genase promoter, PH05 promoter and the like are used, and as a promoter for filamentous fungi, for example, amylase, trpC and the like are used.
  • viral promoters such as SV40 early promoter and SV40 late promoter are used.
  • the expression vector can be prepared by using a restriction enzyme, ligase, or the like according to a conventional method. Transformation of the host with the expression vector Can be carried out in accordance with the usual method.
  • the host transformed by the expression vector is cultured, cultivated or bred, and the culture is subjected to a conventional method such as filtration, centrifugation, and cell disruption.
  • the target protein can be recovered and purified by gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, or the like.
  • acyltransferases derived from gentian, petunia, perilla, and sineria By purifying a plant acyltransferase and determining the amino acid sequence of the enzyme, a gene encoding the enzyme can be cloned. Furthermore, by using as a probe the cDNA of an acyltransferase derived from a window according to the present invention, the cDNA of another acyltransferase from the window and a petunia can be obtained.
  • cDNA of another acyltransferase can be obtained.
  • the present invention relates to window, petunia, perilla and signage.
  • the present invention is not limited to only the gene for an acyltransferase derived from an aromatic acyltransferase, but broadly relates to an aromatic acyltransferase.
  • the present invention relates to a plant or a progeny thereof or a progeny thereof whose color has been regulated by introducing a gene for an acyltransferase, the form of which is a cut flower. There may be.
  • P-coumaroyl is used as a donor of the acyl group in the transacylation reaction of flavonoids containing anthocyanin.
  • Delphinidin 3,5-diglucoside and cyanidin 3,5-diglucoside are purchased from Tabian Biolet, a kind of Verbena hybrida, purchased from Suntory Ltd. (Possible) Extracted diacetyl bodies from petals and deacetylated them. Evening Petals of petals (348 g) were ground with a homogenizer together with liquid nitrogen to obtain 50% (V / V) acetonitrile, 0.2% Immerse in 1.5 L of trifluoroacetic acid (TFA) solution for 3 days I left it.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the main pigment of tapian is 3,5-diacetyl glucoside of delphinidin and cyanidin
  • the following deacetylation operation was performed. 1 g of the crude pigment was dissolved in 50 ml of methanol, and nitrogen gas was passed through for 15 minutes to remove dissolved oxygen, followed by cooling with ice.
  • the dissolved oxygen was similarly removed from 50 ml of 1N sodium hydroxide, and the mixture was added dropwise with stirring to the dye solution under ice cooling, and further stirred for 30 minutes to carry out the hydrolysis reaction. I let it.
  • the reaction is stopped by adding 1 ml of 6 N hydrochloric acid, 5 ml of distilled water is added, the mixture is concentrated to about half with an evaporator, and methanol is added to a final concentration of 10%.
  • m) was applied to a SepPac CI 8 column (Waters Association), washed with distilled water (5 m), and then washed with 30% acetate two torr. Elution was performed with 2 ml of 6% TFA.
  • Delphinidin 3,5 didarcoside And cyanidin 3,5—diglucosides were separated, concentrated and lyophilized (Delphinidin 3 , 5 — diglucoside 75 mg, cyanidin 3,5 — diglucoside 50 mg). Each was dissolved in 0.5% TFA to 1.5 mg / ml and stored at 180 ° C until use.
  • the other substrate, hydrokincinnamoyl-CoA was synthesized in the following manner.
  • esters were obtained from carboxylic acid (Nacalai Tesque) and N-hydroxyxine simimid (Merck). Synthesized. 0.5 mmo1 of this ester was dissolved in 2 ml of acetonitrile, while 0.1 mmo1 of coenzyme A (CoA: KOHJIN) and 1 mmo1 of sodium bicarbonate were dissolved. Was dissolved in 2 O ml of water, and the above ester solution was added dropwise thereto.
  • the sample is collected every 0.8 minutes at a flow rate of 32 m1 per minute, and the absorption spectrum (200 to 400 nm) of each fraction is checked to find that it is 344 to 348 nm
  • the fraction having the highest absorption was collected as the caffeoyl CoA fraction. After concentrating them on a rotary evaporator, they were separated again on the same column. However, separation is carried out using an equal-density chromatographic graph with acetonitrile concentration of 18% and TFA of 0.1%, and the absorption spectrum is similarly examined to determine the fraction containing the target compound. Was concentrated on a rotary evaporator and freeze-dried. In this way, 35 mo 1 of product were obtained. Also, by using coumaric acid in place of caffeic acid in the above method, P — bear mouth — CoA can be synthesized and dissolved in distilled water so as to be 2 mg / m 1. And stored at 180 ° C until use.
  • the precipitate is suspended in 1 ml of a lysis buffer (20 mM phosphate buffer (pH 7.5), 14 mM 2 — menolecaptoethanol), and centrifuged (2700 xg). , 5 minutes) to remove insolubles, and then desalted the solution using a Sephadex G-25 column (NAP-10; Pharmacia) equilibrated with a lysis buffer. It was used as a crude enzyme solution.
  • a lysis buffer (20 mM phosphate buffer (pH 7.5), 14 mM 2 — menolecaptoethanol), and centrifuged (2700 xg). , 5 minutes) to remove insolubles, and then desalted the solution using a Sephadex G-25 column (NAP-10; Pharmacia) equilibrated with a lysis buffer. It was used as a crude enzyme solution.
  • the reaction was performed for 10 minutes.
  • the reaction was stopped by adding acetonitrile 501 containing 13.8% (vZv) acetic acid, and the insoluble matter was removed by centrifugation (1800 Xg, 5 minutes). After removing high-performance liquid chromatography
  • the product For compound detection Using a three-dimensional chromatographic system (CLASS-LCI 0; Shimadzu Corporation), the product must have a maximum absorption near 330 nm, which is not present in the substrate, Since the absorption maximum moves from 519 nm to 5255 nm on the longer wavelength side by about 6 nm, the acyl group (cafic acid) binds and delphinidin 3 — It was confirmed that Darcosyl 5-caffeoyl glucoside was produced.
  • CLASS-LCI 0 Shimadzu Corporation
  • the color of the reaction solution was dark blue due to the modification of delphinidin 3,5—diglucoside in the reaction solution with carboxylic acid by acyltransferase.
  • the reaction can be performed in a microtiter plate, and the enzymatic activity can be examined based on the change in color.
  • p-coumarole-indium-CoA instead of p-co-inoleone-coa also shows color change and stabilization of anthocyanin due to acylation.
  • Force ⁇ The degree of color change is less than that of cuff oil-C 0 A.
  • the protein concentration was determined using Bi0-RadProtineAssay (Bio-Rad).
  • This precipitate is suspended in 1 ml of lysis buffer and centrifuged. After removing the insoluble matter, Sephacry 1 S—200 (25 ⁇ 115 mm; Pharmacia) equilibrated with a lysis buffer was applied. Approximately 3 ml was collected at a flow rate of 0.2 ml per minute, the active fraction was collected again (27 ml), and ammonium sulfate was added to 1 M. After thorough stirring, the insolubles were removed by centrifugation (390,000 xg, 10 minutes), and Pheny 1 Supperose 5 equilibrated with a lysis buffer containing 1 M ammonium sulfate. / 5 (5.0 x 50 mm; Pharmacia).
  • the protein was eluted by reducing the ammonium sulfate concentration linearly from 1 M to 0 M in 60 min.
  • the enzymatic activity of each 0.5 ml fraction was measured and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (10% acrylamide gel; Daiichi Kagaku Co., Ltd.). As a result, a band having a molecular weight of about 500,000 was recognized as a substantially single protein, and a correlation was observed between the protein amount and the activity. It was determined to be a transferase. Further, in order to obtain a single preparation, the active fraction (12 ml) was purified by reverse-phase HPLC.
  • the column used was DEVELOSIL 300 C 4-HG-5 (4.6 x 250 mm; Nomura Chemical Co., Ltd.) at a flow rate of 1 ml per minute and 0.1% trifluoroacetic acid.
  • elution was carried out by changing the concentration of acetonitril from a linear concentration gradient of 40.5% to 56.7%.
  • fractionate 1 ml at a time, and analyze each fraction by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis to obtain a molecular weight of about 50,000.
  • Fractions containing protein were collected. This HPLC operation was repeated 30 times, and by concentrating with Speedback (Savant), about 0.2 mg of a single protein standard was obtained.
  • N-terminus is glutamic acid
  • a pyroglutamic acid group is generated, and it is known that the sequence by Edman degradation shows the above-mentioned results. It is likely to be glutamate.
  • the remaining precipitate was dissolved in a solution containing 801 of 45 mM Tris-HCl (pH 8.5), 3.6 M urea, and 0.09% SDS, and the solution was dissolved in lysylendifactin. (Lysyl Endopeptidase: Derived from Achromob actor lyticus; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 16 pmo 1 was added and reacted at 37 ° C. for 6 hours. The reaction solution was directly separated on a DEVELOSSIL 300 C 4 —HG-5 column.
  • Separation conditions were as follows: 0.1% trifluoroacetic acid, linear concentration gradient from 0% to 80% in acetonitrile concentration in 70 minutes, flow rate of 0.7 mI / min Then, while monitoring the absorption at 210 nm, only the peak fraction of the absorption was collected. Of the 13 peak fractions obtained, three of the peak fractions eluted when the acetonitrile concentration was between 32% and 40% were concentrated by speedback. Separation and purification were also carried out using a 0 DS column (DEVEL 0 SIL 300 DS-HG-5; Nomura Chemical Co., Ltd.) under the same conditions as above.
  • Each peak fraction was concentrated and dried by speedback, dissolved in 40% acetonitrile 30a1, and subjected to amino acid sequencer. As a result, the amino acid sequences of the six peptides could be read. The amino acid sequence of each peptide is shown below (in the direction from the amino terminus to the lipoxyl terminus).
  • Amino acid sequence (AT83); Val-Arg-Ala-Thr-Tyr-Val-Leu-Ser-Leu-Ala-Glu-lie-Gin-Lys (SEQ ID NO: 12)
  • RNA is obtained by a method using guanidinium thiosinate cesium chloride, and poly A + is obtained using oligotex (Nippon Roche) according to the method recommended by the manufacturer. RNA was obtained.
  • the method using guanidinium thiocin Z cesium chloride is described in detail in R. McGookin, Robert J. Slater et al., Methods in Molecular Biology vol.2, (Humana Press 1 nc. 1984).
  • a double-stranded cDNA was synthesized using a ZAP-cDNA synthesis kit (Stratagene). , Fuzz vector; Cloning to IZAPII. Furthermore, using the company's Gigapackll Old Packaging Extract kit, a cDNA library was prepared by the method described in the kit.
  • the sequence represented by Ile-His-Meto Asp-Ala-Phe-Ala-Lys is a lysyl dendopidase. Considering the specificity of the protein, it is considered to be Lys-1 le-His-Me or Asp-Ala-Phe-Ala-Lys (SEQ ID NO: 14). 7 amino acid sequence in this sequence; Lys-1 le-His-Meto Asp-Ala-Phe-Ala (SEQ ID NO: 15), using the following oligonucleotides Synthesized ⁇
  • nucleic acid sequences are represented by one letter according to the IUPAC-IBU-compliant nucleic acid code table.
  • oligonucleotides were also synthesized based on the primers used at the time of preparing the above-mentioned cDNA library.
  • Nucleotide sequence (oligo 2); 5'-CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  • a PCR reaction was carried out using about 0.1 double-stranded cDNA derived from RNA of petal of gentian as a template and oligos 1 and 2 as primers.
  • the reaction was performed at 95 ° C for 1 minute, at 45 ° C for 1 minute, and at ⁇ 2 ° C for 2 minutes using the Polymerase Reaction Kit Gene Amp (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • One cycle was performed for 35 cycles, and the resulting reaction product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. As a result, a specific DNA fragment of about 400 bp was observed.
  • This DNA fragment was recovered, and 1 ng thereof was subjected to the above-mentioned PCR reaction for 25 cycles using a DIG-nucleotide mixture (Boehringer) and synthetic nucleotides I and II. A DNA fragment labeled with DIG was obtained.
  • the phage library obtained as described above is infected with Escherichia coli XL1-1B1ue strain (Stratagene) and contains 50,000 plaques per plate. One plate (13.5 cm in diameter) was screened.
  • the filter is removed from the filter.
  • the DNA-labeled DNA fragment described above was added to the hybridization solution, and the incubation was further performed for 16 hours.
  • an enzyme immunoassay using a DIG-specific antibody labeled with alkaline phosphatase (Berry Ngar's Mannheim Co., Ltd.) and detected by the color reaction of 5-bromo-4—black mouth 3—indolinolenic acid and nitrobanolate triazonium salt. The detection method followed the manufacturer's instructions.
  • Plasmid was extracted from the obtained clones, and the above-mentioned 9 clones were extracted using ABI 373 A DNA Sequencer (PerkinElmer) by the Diodeoxy sequencing method using the fluorescent reagent recommended by the company. Of the clones, six clones (pGAT2, pGAT3, pGAT4, pGAT7, pGAT8 and pGAT11) which are considered to contain the full length The nucleotide sequence was determined.
  • these clones had the same nucleotide sequence and had different lengths of cDNA.
  • the entire nucleotide sequence of pGAT4 was determined. The nucleotide sequence was determined using a deletion kit for Kilo-Sequence (Takara Shuzo Co., Ltd.), obtaining a series of deletion clones, and using each clone as described above. went.
  • the cDNA inserted into PGAT4 was 103 bases, in which an open reading frame (0RF) consisting of 141 bases (including a stop codon) was found. This sequence is shown in Sequence Listing and SEQ ID NO: 1. Since the partial amino acid sequence of the acyltransferase revealed in Example 2 is entirely present as the amino group ij in the ORF, the cloned cDNA was used. Is a transcriptase from gentian ⁇ We concluded that it was a dengue. Regarding the start codon, it was inferred from the analysis of the amino terminal that glutamate was the residue at the amino terminal. ATG was presumed to be the start codon.
  • cDNA related to pGAT8 was not considered to be a full-length cDNA because the 5 ′ side is 7 bases shorter than pGAT4.
  • pTrc99A (Pharmacia), an Escherichia coli expression vector, was used.
  • This ⁇ Trc99A contains the trc promoter of Escherichia coli inducible with isopropyl _ — D-thiogalactosylanoside (IPTG).
  • IPTG isopropyl _ — D-thiogalactosylanoside
  • restriction enzyme Nc0I site was introduced using the ATG sequence, which is the start codon, and recombination at the Nc0I site allowed for the initiation of the target gene from the start codon. Direct expression is possible.
  • Oligonucleotide (GAT_NcoI); 5'-TTCACCATGGAGCAA ATCCAAATGGT-3 '(Rooster system number: 18)
  • Oligonucleotide (GAT—ScaI); 5′-CGAGTCGCCCTCATC AC-3 ′ (SEQ ID NO: 19)
  • pGAT4 One ng of pGAT4 was designated as type I, and a PCR reaction was carried out using the above-mentioned oligonucleotides as primers. The reaction was performed at 95 ° C for 1 minute, 56 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes using a Polymerase Chain Reaction Kit Gene Amp (Takara Shuzo Co., Ltd.). After 15 cycles, the obtained reaction product was subjected to 1% agarose electrophoresis, and a specific DNA fragment of about 300 bp was observed. This DNA fragment is recovered, cut with restriction enzymes Ncol and Aatl, and pGATlOl is converted to Nc
  • PGAT102 was constructed by ligation with an approximately 6 kb fragment obtained by digestion with 0I and AatI. It was confirmed that the nucleotide sequence of the portion amplified by the PCR method was the same as pGAT4 after construction of pGAT102.
  • the host to be transformed here is not particularly limited as long as it is Escherichia coli that can be used as a host for transformation, and is generally used for gene recombination, and is easily understood by those skilled in the art.
  • E. coli (For example, JM109 and DH5) can be used.
  • the transformation of E. coli was performed according to the method of Hanahan (J. Mo I. Biol., 166, 557-, 1983).
  • the transformed Escherichia coli was transformed into 2 m] LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g / ml) (10 g of tripton, 5 g of yeast extract, 10 g of sodium chloride).
  • ampicillin 50 ⁇ g / ml
  • 5 g of yeast extract 10 g of sodium chloride
  • the PGAT 4-encoded acyl group was found to catalyze the transfer of the acyl group to the 5-position glucose of anthocyanidin 3,5-diglucoside.
  • pYE22m described in JP-A-4-278078 was used as a yeast expression vector.
  • pYGAT4 has the ability to translate from the first methionine ⁇
  • pYGAT8 lacks the 5'-side of the isolated cDNA, so the translation initiation methionine of the acyltransferase is missing. Translation from the following methionine (amino acid sequence number in SEQ ID NO: 1; 5) instead of amino acid sequence number in amino acid sequence (SEQ ID NO: 1;-1) .
  • the cDNA encoding acyltransferase is linked downstream of the glyceroaldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, one of the yeast constitutive promoters. The transcription is controlled by the promoter.
  • yeast Saccharomyces ce rev isi ae G1315 Ash i kar iet al., App 1. icrobiol. Biotech nol. 30, 515-520, 1989.
  • Transformed yeasts were selected by restoring the ability to synthesize tributophan.
  • the yeast host used for the transformation is not particularly limited, and any strain may be used as long as it is a strain exhibiting the requirement for tripfan due to the incomplete TRP1 gene.
  • the cells are washed with the same amount of a cell disruption buffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.5, 30 mM sodium chloride), and then 1 m Suspended to the same buffer and moved to a 1.5 ml 1 Etbendlf tube. After centrifugation, the supernatant was removed, and the precipitated cells were resuspended with the same buffer of 0.4 ml, and 400 mg of Glass Beads 425- The yeast cells were disrupted by adding 600 microns A cid (Wash, Sigma) and shaking vigorously.
  • a cell disruption buffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.5, 30 mM sodium chloride
  • Delphinidin 3,5-diglucoside acylated by an acyltransferase produced in yeast is also converted to an acyltransferase obtained by purifying gentian.
  • stable color development was exhibited even when left at room temperature for a long period of time.
  • Example 3 (4) Washing was performed at 50 ° C. in a washing solution (5 ⁇ SSC, 0.1% SDS), and the color was developed as described in Example 3 (4). Dozens of clones developed, but in Example 3 (4), none of the developed clones developed color. I got 12 clones. The cDNA sequences of these clones were determined from the 5 'side by the method described above, and as a result, 11 clones matched the nucleotide sequence of PGAT4, but 1 clone did not. Did not match. This was designated as p GAT106.
  • the entire base sequence of pGAT106 was determined as described above.
  • the cDNA inserted into pGAT106 was 1622 bases, of which 0RF consisting of 144 bases (including the termination codon) was found. This is shown in Sequence Listing and SEQ ID NO: 2.
  • the ⁇ RF contained in SEQ ID NO: 2 was examined for homology over the entire region with the amino acid sequence encoded by pGAT4. Its homology was 38%.
  • amino acid sequence encoded by pGAT106 is homologous to the enzyme encoded by pGAT4, which is an acyltransferase, similar enzymatic activity, that is, anthocyanin It is presumed that it has activity to catalyze the transfer of acyl groups.
  • pGAT106 is attached to glucose at the 3'-position of anthocyanin because the acyl group is bonded to glucose at the 5- and 3-positions. It suggests that it catalyzes an enzymatic reaction that translocates.
  • Example 7 Petunia Anthocyanin
  • the petunia (Petunia hybrida) cultivar Safinia purple (Suntory Co., Ltd.) has anthocyanin of a mutant (VM) in which the flower color has changed from a normal magenta to purple, and its petals.
  • VM mutant
  • the structure of the earthenware pots Chino one compound with FABMS, 1 HN ⁇ R, 1 3 CNMR, and rollers were analyzed in detail, and found a novel A down bets Xia Nin. The structure is shown below.
  • the structure is 3-0- (6-0- (4-0- (4-0- (6-0-capioyl-S-D-Gnorecopyranone))-bear. ⁇ ⁇ ------/ / / / / / / / / / / / / / / / / / /-/ / / / / / / / / / / One bound anthocyanin.
  • This anthocyanin is present not only in the petals of VM but also in the dark purple petals such as Flucon Blue (Sakata Seed Co., Ltd.) and Old Glory BlueCBal 1 Seeds. I understood. In other words, it is considered that anthocyanin having two acyl groups contributes to the deep purple color of petunia.
  • acyltransferases related to petunia-derived anthocyanin include enzymes that catalyze the reaction of transferring coumaric acid or caffeic acid to the 3-position rutinoside of anthocyanin, and those that are monotonic. This suggests that there are two types of enzymes that catalyze the transfer of coumaric acid or cafudiic acid to acylmalvidin via glucose.
  • the pGAT4 described in Example 3 (6) that is, the cDNA portion of pGAT4 having the DNA described in Sequence Listing and SEQ ID NO: 1 was DIG-labeled by the method described above, and a petunia (Petunia hybrida) variety was used.
  • the cDNA library of the old groves, one petal and one petal was screened by the method of plaque hybridization. Hybridization and washing were performed under the same conditions as in Example 6.
  • p PAT5 The nucleotide sequence was determined, multiple DNAs had been inserted into PPAT5. That is, a sequence similar to the C-terminal sequence of the protein encoded by pGAT4 and pGA106 was present on the reverse primer side of the plasmid. Therefore, under the primer primer, the nucleotide 5′-AACAGCTATGACCATG-3 ′ (SEQ ID NO: 20) was synthesized, and this oligonucleotide was used as an RP primer.
  • the petunia petal cDNA library described above was screened using the plaque hybridization technique. Washing after hybridization was performed at 0.2 ⁇ SSC at 65 ° C. for 1 hour.
  • pPAT48 was strong and contained the same sequence as pPAT5. This is shown in Sequence Listing and Sequence No. 3. This sequence had 20% and 16% homologs at the amino acid sequence level with respect to pGAT4 and pGAT106, respectively.
  • Red young leaves were collected from perilla (Peri 11a ocimoides) cultivar red tilimen, and the crude enzyme solution was extracted according to the method described in Example 1 (2).
  • Final concentration 50 mM potassium phosphate (pH 8.5), 0.48 mM delphinidin 3,5-diglucoside, 0.43 mM phenol
  • a mixture of CoA and 501 containing the enzyme solution of 201 was reacted at 30 ° C for 10 minutes.
  • the reaction was terminated by adding 50 u] of acetonitrile containing 13.8% acetic acid to the reaction mixture. 1 5 0
  • 101 of the supernatant was analyzed by HPLC under the following conditions.
  • the column was YMC-Pack ODS-A (6.0 x 15 cm), and the sample was run at a flow rate of lml / min with a solvent of 0.1% trifluoroacetic acid and 21.6% acetonitrile. separated. Detection was performed at 520 nm. Delphinidin 3,5—diglucoside unreacted under these conditions is 3 minutes, and the transfer of carboxylic acid to the 3rd position of delphinidin 3,5-diglucosid is 4 minutes. Eluted at 7 minutes, the absorption maximum of this compound is 7 "at 531 nm.
  • Example 2 Purification of the persyltransferase was performed according to Example 2 (1). 3 kg of perilla leaves were frozen with liquid nitrogen and ground while homogenized with a homogenizer. In powdered form, add 101 extraction buffer (100 mM sodium phosphate, pH 6.8, 100 mM sodium ascorbate, 5 mM dithiothrate) In 10 / M p-APMSF, 5% (wZv) poly (SB-100), again with a homogenizer. This was filtered through a gauze layered in four layers, and then centrifuged (800 rotations, 4 degrees, 30 minutes). Add ammonium sulfate to the supernatant so that it is 40% saturated, dissolve, and then under the same conditions Centrifuge.
  • 101 extraction buffer 100 mM sodium phosphate, pH 6.8, 100 mM sodium ascorbate, 5 mM dithiothrate
  • 10 / M p-APMSF 10 / M p-APMSF, 5% (wZ
  • the desalted sample was subjected to ion exchange chromatography using Q-Sepharose earth flow 26/10.
  • a linear gradient of 0 to 0.5 M sodium chloride based on the desalting buffer was run at a flow rate of 8 m1 over 1 hour.
  • the active fraction eluted at a salt concentration of about 0.15 to 0.3 M.
  • the active fraction was adsorbed to a column of four HiTrapBlue (5 ml) equilibrated with a desalting buffer connected in series. After washing the column well with the same buffer, the column was eluted with a linear gradient of 0 to 1 M sodium chloride (2 hours, flow rate 5 ml) based on the desalting buffer.
  • the active fraction was eluted at a sodium chloride concentration of 0.8 to 0.9 M. This fraction was then chromatographed on a hydrokin apatite ram (ceramic type 1140 mm; Nokuiorad). Column with buffer A (5 OmM sodium phosphate, pH 6.8, ImM dithiothreitol, 10 Mp—APMSF, 10% glycerol) After washing well, buffer A to buffer B (40 OmM sodium phosphate, pH 6.8, ImM dithiothreitol, 10 / Mp—APMSF, 10 % Glycerol), the enzyme was eluted with a linear concentration gradient (1 hour, flow rate of 2.5 ml / min), and eluted with about 0.2 M sodium phosphate.
  • cyanidin 3 As the acceptor of the acyl group, cyanidin 3—glucoside, cyanidin 3,5—diglucoside, It was possible to use either rufinidine 3-glucoside or delphinidin 3, 5-diglucoside. As a donor of a carbyl group, it has been possible to use either Coumaroinol CoA or Caffeoyl CoA. In addition, the molecular weight was about 50,000 from SDS polyacrylamide electrophoresis. The isoelectric point was determined to be 5.3 using a Mono-P force ram (Pharmacia).
  • Example 11 cDNA Cloning of Peroxyl-Derived Acyltransferase
  • the structures of pGAT4, pGAT106 and PPAT48 cloned in Example 3, Example 6 and Example 8 are shown below.
  • the amino acid sequence Asp-Phe-Gly-Trp-G-Lys (SEQ ID NO: 21) was conserved. Therefore, this structure is expected to be conserved in the acyltransferase. Therefore, based on this sequence, a nucleotide sequence; 5′-GA (TC) TT (TC) GG1TGGGG1AA-3 ′ (SEQ ID NO: 22) was synthesized, and this oligonucleotide was converted to ATC. Primers were used.
  • RNA was extracted from young perilla leaves by the method described in Example 3, and a cDNA library was similarly prepared using a ZAP-cDNA synthesis kit (Stratagene). Produced. Approximately 50 ng of the double-stranded cDNA obtained at this time was converted into type II, and the PCR kit was used in a final volume of 501 by using 100 ng of each of the ATC primer and the oligo 2 primer. PCR (produced by Takara Shuzo Co., Ltd.) was performed. The reaction was performed 25 times at 95 ° C for 1 minute, at 50 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute as 1 cycle.
  • the obtained DNA fragment of about 40 Obp was recovered and cloned into a vector using a TA cloning kit (Invitrogen).
  • a TA cloning kit Invitrogen
  • the clone designated as pSAT104 showed a high homology to pGAT4.
  • 1 ng p SAT l 04 is shaped into a ⁇ and the ATC primer and A PCR reaction was performed using a PCR kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) in a final volume of 501 using 100 ng of each Rigo 2 primer. The reaction was carried out for 15 cycles at 95 ° C for 1 minute, 50 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. Using 11 of this reaction product, an ATC primer and an Oligo 2 primer were used in 10 ng each, and a PCR reaction was carried out in a final volume of 501 using the same PCR kit.
  • a PCR kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • the cDNA library of perilla leaves was screened by the plaque hybridization method. Wash 1 x SSC, 65. C for 1 hour. When the nucleotide sequence of the hybridized clone was determined, the clones such as pSAT206, pSAT207, pSAT208, pSAT209, and pSAT210 were found. Was found to contain the base sequence of pSAT104. When the nucleotide sequence at the 5 'side of these clones was compared with pGAT4, none of the clones had a shorter amino terminal than pGAT4 and no initiation codon was found. In addition, pSAT206 and pSAT208, and 580 and 309 have the same base sequence on the 5 'side. PSAT207 was 6 residues shorter than pSAT206, and PSAT209 was 5 residues shorter than PSAT206.
  • these cDNAs are in a form that can be fused to the vector acZ gene.
  • pSAT206, pSAT208, and pSAT207 were expressed as fusion proteins with the 3-galactosidase of Escherichia coli encoding LacZ.
  • the forces that can be expressed, p SAT 209 and p SAT 210 are Since the frame is shifted, it does not become a fusion protein.
  • p SAT206, pSAT207, pSAT209, and pSAT210 are expressed in E. coli using delphinidin 3,5—diglucoside and caffeoinole CoA.
  • E. coli containing PSAT207 shows an enzymatic activity to acylate 48% of delphinidin 3,5-diglucoside, and E. coli containing PSAT207 also shows 24% The enzyme showed activity for silylation. Based on this, the obtained PSAT206, pSAT207, etc., encode a gene having an enzymatic activity to transfer an acyl group to the glucose at position 3 of perilla anthocyanin. We proved that we were able to row.
  • the base sequence derived from the cDNA of pSAT208 was determined. This is shown in the sequence listing and SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence shows 37%, 29% and 15% homologues to pGAT4, pGAT106 and pPAT48.
  • this sequence is not a full-length cDNA, but it expresses an active enzyme by providing an appropriate initiation codon, such as a fusion gene with LacZ. it can.
  • Example 1 2 ⁇ cDNA clone of acyltransferase derived from cinerea —Ning
  • RNA was extracted from petals of Sinecio (Senecio cruentus) cultivar Jupiter Blue (Sakata no Tane) by the method described in Example 3, and PoIyA + RNA was further purified.
  • a cDNA library was prepared using a ZAP-cDNA synthesis kit (Stratagene).
  • a PCR reaction was performed using a PCR kit. The reaction was carried out for 25 cycles at 95 ° C for 1 minute, at 50 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute as 1 cycle.
  • the obtained DNA fragment of about 400 bp was recovered and cloned in a vector using a TA cloning kit (Invitrogen). When the nucleotide sequence of the obtained clone was determined, the clone designated as JAT4 showed a high homology to pGAT4.
  • This DNA fragment a DNA fragment of about 0.75 kb obtained by digesting pUCGAcho4 with Xbal and Bglll, and plasmid p2113G (for example, Aida et al., Acta Horticulture 392, 219-225, 1995) was digested with Xbal and Sacl, and the resulting DNA fragment was ligated.
  • the resulting plasmid was designated as PBEGA4.
  • This plasmid is a solid vector, and the gentyl acyltransferase cDNA is used in plant cells to carry the enzymatically-enhanced cariflora mosquito. It is under the control of the virus 35S promoter and the nonoline synthase terminator.
  • the promoter and the terminator are not limited to those described in the description, and may be a constitutive promoter or a specific one that acts on a petal such as a promoter of a chalcone synthase gene. It may be something.
  • transmutation is not limited to the window transferase gene contained in pGAT4, but other transferases can be introduced into plants and expressed in plants. . Also, as a species of plant, it is a powerful, rose-fed plant that transforms many other plants (eg carnation, chrysanthemum, tobacco, petunia, gerbera, petunia, etc.). Since methods have been reported, it is possible to introduce acyltransferases into many plant species by using known methods.
  • Shisoa sill sulfotransferase gene C DNA, PSAT 2 0 8 the force enzymes that are active as mentioned earlier that code ⁇ , Tsuta Naka in full length. Therefore, a full-length cDNA containing an initiation codon was synthesized based on the nucleotide sequence of the peptidyltransferase gene pGAT4. That is, the following DNA was synthesized.
  • the amino acid sequence to be coded is also shown.
  • the first underline is the BamHl recognition sequence for cloning, and the second underline is the sequence contained in pSAT208. After the BamHl recognition sequence, the sequence AACA, which is often found immediately before the translation initiation codon in plants, is inserted.
  • a PCR reaction containing 100 ng of each of this primer and -20 primer; 5'-GTAAAACGACGGCCAT-3 '(SEQ ID NO: 28) and 10 ng of pSAT208 was performed in a final volume of 501. I went in. The reaction was carried out for 15 cycles at 95 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes as 1 cycle. After the reaction, DNA fragments were recovered from the reaction solution using Genecean (BiolOl) according to the method recommended by the manufacturer. Recovered DNA After digestion with BamHl and EcoRl, agarose gel electrophoresis was performed to recover a DNA fragment of about 200 bp.
  • This DNA fragment was ligated with an about 3.3 kb DNA fragment obtained by digesting pSAT208 with EcoRI, and the resulting plasmid was designated as PSATF208.
  • the nucleotide sequence of this plasmid was determined from the 5 'end of the cDNA, and the nucleotide sequence was confirmed.
  • Example 16 Expression of peroxytransferase gene in yeast in yeast According to the method described in Example 5, PSAT208 was expressed in yeast, and the enzyme activity was measured. That is, a DNA fragment of about 8 kb obtained by digesting pYE22m with BamHI and Sail, and an about 1.6 kb DNA fragment obtained by digesting pSATF208 with BamHI and Sail. The plasmid obtained by ligating the DNA fragment was designated as pYSAT208.o
  • Yeast G1315 was transformed with PYSAT208, and the resulting transformant was assayed for the acyltransferase activity.
  • the yeast into which pYSAT208 was introduced 24 nmol of delphinidin 3,5-1 diglucoside and 21.5 nmo 1 of caffeoinole 1
  • the formation of denolefinidine 3—force phenol oleoreside 5—glucose was observed. Therefore, it was confirmed that the synthesized full-length cDNA contained in pSATRF208 encoded the activity of acyltransferase.
  • Plasmid pEl2QGUS is expressed in the GUS gene expression unit on plasmid p2113G (Aida et al., Acta Horticulture, 392, 219-225, 1995). Approval of Hind II 1 and EcoR 1 of plasmid pUC 19 This is a plasmid inserted into the recognition site.
  • pEl20011 8 is digested with 5 & cl, blunt-ended with DNA-Blanching Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), and ligated with Xhol Linker (Toyobo Co., Ltd.).
  • the plasmid into which the obtained Xho1 linker was inserted was designated as pE12 ⁇ GUSX.
  • acyltransferase genes cDNA and pCAT8 from sineria were not full-length as described above. Therefore, a full-length cDNA containing an initiation codon was synthesized based on the nucleotide sequence of the gentyl acyltransferase gene pGAT4. That is, the following DNA was synthesized.
  • the amino acid sequence to be coded is also shown.
  • the first underline is the BamH1 recognition sequence for cloning, and the second underline is the sequence contained in pCAT8.
  • a PCR reaction containing 10 ng of each of this primer and 120 primers and 1 ng of pCAT8 was performed in a final volume of 50 ⁇ l. The reaction was carried out for 15 cycles, with 95 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes as 1 cycle. After the reaction, a DNA fragment was recovered from the reaction solution using Geneclean (BiolOl) according to the method recommended by the manufacturer. The collected DNA was digested with BamHl and Mval, and then subjected to agarose gel electrophoresis to recover a DNA fragment of about 200 bp.
  • Geneclean BiolOl
  • This DNA fragment is obtained by ligating a DNA fragment of about 1.3 kb obtained by digesting pCAT8 with Mval and Xhol, and pB1uescript I1SK digested with BamHI and Xhol.
  • the plasmid was designated PCATF 8.
  • the nucleotide sequence of this plasmid was determined from the 5 'end of cDNA and the nucleotide sequence was confirmed.o
  • Lavender (Lavandula—angus tifo 1 ia) from the petals of the Labiatae c
  • a DNA library was prepared by the method described in Example 3, and the same method described in Example 3 was used to produce approximately 300,000 clones using the plaque hybridization method.
  • the labeled cDNA fragment was added to a hybridization solution, and the mixture was kept at 37 ° C. for 16 hours, followed by hybridization.
  • the filter is washed with a washing solution (5 x SSC, 1% SDS), and the enzyme is assayed with an enzyme-linked immunosorbent assay (Boehringer Mannheim) using a DIG-specific antibody labeled with alkaline phosphatase. 4 Positive clone was detected by the color reaction between 4-indole 3-dolinuric acid and 2-nitrobutrazole salt. The detection method followed the manufacturer's instructions.
  • the cDNA was vectorized from plasmid blue pBluescript 11 SK- from the phage vector using the method recommended by Straus Gene. And recovered.
  • a plasmid was extracted from the obtained clone, and this was designated as pLATl.
  • the 5 'end of the pLAT1 cDNA was The nucleotide sequence was determined.
  • the amino acid sequence derived from the obtained nucleotide sequence shows high homology to the amino acid sequence of perilla peroxidase, and pLAT1 is lavender transacylase.
  • the amino acid sequence encoded by pLAT1 is shorter than the amino acid sequence of perilla peroxidase, and encodes the entire length of the transaminases. It was thought that it was not enough. Therefore, using a cDNA fragment of pLAT1 labeled with DIG as a probe, a cDNA library derived from lavender petals was screened under the same conditions as described above.
  • the probe used was type I with about 1 ng of pLAT1 plasmid, the final containing the following primers and 500 ng of each of the oligo2 and dNTP-labeled mixture (Boehringer) 81 shown below. Labeling was performed by PCR reaction in a volume of 50 51.
  • the PCR reaction was performed for 25 minutes at 95 ° C for 1 minute, at 42 ° C for 2 minutes, and at 72 ° C for 3 minutes, and then at 72 ° C for 7 minutes to complete the extension reaction. Held.
  • the black hybridization was described above except that the formamide concentration in the hybridization buffer was 50%, and the filter was washed with 2 XSSC and 1% SDS.
  • the nucleotide sequence near the 5 'end of the obtained positive clone was determined in the same manner as described above, so that Shihatcho 1 also obtained 11-long clone, PLAT 21. This is shown in the sequence listing, SEQ ID NO: 6.
  • pLAT21 also contained no starting methionine codon and was a clone that was less than the full length of the acyltransferase.
  • pLAT21 a cDNA which is thought to encode lavender transacylase, does not contain an initiation methionine codon, an initiation methionine codon is added at the 5 'end of the cDNA for expression in yeast. Need to be added. Thus, PCR was performed using the following primers to synthesize a fragment in which an initiation methionine codon was added to the 5 ′ end of the cDNA of pLAT21.
  • LAT— AT G is a sequence consisting of 20 bases at the 5 'end of pLAT21, an initiation methionine codon, and a conserved sequence AACA for gene expression in a plant which is said to be located upstream and adjacent thereto, and Designed to include the restriction enzyme BamHl recognition site GGATCC required for ligation to the yeast expression vector in the 3 'direction from the 5' upstream.
  • LAT-ATG primer SEQ ID NO: 31
  • PCR reaction about 100 ng of p LAT21 plasmid was used as the type I, and the PCR reaction was performed with a final volume of 50 u1 containing LAT-ATG primer and 50 ng of each of Oligo2. Was. The reaction was performed for 10 cycles at 95 ° C for 1 minute, at 42 ° C for 2 minutes, and at 72 ° C for 3 minutes, and then for 7 minutes at 72 ° C to complete the extension reaction. Held. The obtained DNA fragment was digested with BamHI and EcoRl, and a DNA fragment of about 550 bp was recovered. This DNA fragment was subcloned into BamH1 of plasmid pBluescript 11 SK- and an EcoRI site to obtain pLATPCR11.
  • the nucleotide sequence of pLATPCR11 was determined in the same manner as described above, and this DNA fragment amplified by PCR had the same sequence from the 5 * end of pLAT21c DNA to the EcoRl site. LAT—Confirmed that it contained the initiation methionine codon in the ATG primer, a conserved sequence for gene expression in plants, and the BamHI recognition site for the restriction enzyme necessary for ligation to the yeast expression vector.
  • nucleotide sequence of the cDNA portion of pLAT21 was determined in the same manner as in the determination of the nucleotide sequence of the same DNA as PGAT4.
  • the amino acid sequences predicted to be coded by this cDNA correspond to p SAT208, pGAT4, pCAT8, pGAT106 and pPAT48, respectively. 6 9%, 38%, 37%, 37%, 19% Morology was shown.
  • yeast expression vector The plasmid obtained by ligating an approximately 8 kb DNA fragment obtained by cutting pYE22m with BamHI and Sail was designated as PYELAT21. As described above, yeast G1315 was transformed with this plasmid and the acyltransferase activity was measured.
  • Example 23 Construction of a binary vector containing a lavender acyltransferase gene
  • pBELA11 Approximately 550 bP DNA fragment cleaved with BamHI and EcoRl, approximately lkb DNA fragment obtained by cutting EcoRl and Xhol from pLAT21, and pBEGUSX A plasmid obtained by ligating a DNA fragment of about 1 kb obtained by digestion with BamHl and Xhol was designated as pBELA11. This was transformed into Agr10 strain of Agr obteri urn tumefacience by the method described above, and subjected to transformation of petunia and rose.
  • GAT4 protein was expressed in large amounts in Escherichia coli using Bulk and Redi Pack GST Purification Modules (Pharmacia Biotech), from which purification was performed.
  • PGEX-4T-11 was used for expression of the acyltransferase gene in Escherichia coli. Using this pGEX-4T-11 to produce a fusion protein with glutathione S-transferase, it is effective by using an affinity column for glutathione S-transferase. Efficient purification can be performed.
  • E. coli JM109 was transformed with PGEXGAT4.
  • the transformation of E. coli followed the method of Hanahan (J. Mo 1. Bio 1., 166, 557-, 1 983).
  • the transformed E. coli was transformed into 2 XYT medium containing ampicillin (100 / g / ml) and 2% glucose (16 g of tripton, 10 g of yeast extract, Dissolve 5 g of sodium chloride in 1 liter of distilled water and adjust the pH to 7.0 with sodium hydroxide.) Inoculate 50 ml and incubate at 37 ° C. ⁇ ⁇ 40 ml of this culture was inoculated into 400 ml of ampicillin (100 / g Zml) and 2 XYT medium containing 2% glucose, and cultured at 37 ° C for 3 hours.
  • the purification of the aromatic acyltransferase derived from the gentian, the cloning of the cDNA of the enzyme, and the determination of the nucleotide sequence of the cDNA were performed.
  • the isolated cDNA encodes an aromatic acyltransferase.
  • anthocyanin can be modified in a plant or in a test tube to provide more stable anthocyanin.
  • Organism name Gentian (Gentiana tri flora var. Japon i ca)
  • Tissue Type (TISSUE TYPE): Petal (petal)
  • VOV 101 311 01V VVO LL3 110 IVO VVO 01V VVO OVV 3 J ⁇ 'I "1" J' VOV VVO
  • Organism name Gentian (Gentiana tri flora var. Japon i ca)
  • Tissue Type (TISSUE TYPE): Petal (petal)
  • J3S n9q J3 ⁇ J9g s an jag ja ⁇ 3j j d ⁇ aqj s jas usy OJd z 331 113 301 031 VVV ⁇ ⁇ V DDI VOX IXV 31V ⁇ ⁇ ⁇ VVV 101 OVV ODD ⁇ !) ⁇
  • Organism name (ORGANISM): Petunia (Petunia ybrida)
  • Tissue Type (TISSUE TYPE): Petal (petal)
  • CAA GGC AAA AAT GGA GGA AGA AGC ATT GAT GTG GAG ATT ACT TTG GAA 1356
  • Organism name Perilla (Perilla ocimoides)
  • Tissue type (TISSUE TYPE): leaf
  • Organism name Sinecio cruentus
  • Tissue Type (TISSUE TYPE): Petal (petal)
  • Tissue type (TISSUE TYPE): Petal (petal)
  • OOC 562 062 ds 311 OJd 3 [I naq aqj aqj BJV 3JV s dsy dsy dsy ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ dsv s
  • Sequence type SEQUENCE TYPE: amino acid TOPOLOGY: linear sequence type (MOLECULE TYPE): peptide
  • Sequence type SEQUENCE TYPE: amino acid TOPOLOGY: linear (linear) sequence type (MOLECULE TYPE): peptide
  • Sequence type SEQUENCE TYPE: amino acid (amino acid)
  • Topology TOPOLOGY: linear (linear)
  • Sequence type SEQUENCE TYPE: amino acid TOPOLOGY: linear sequence type (MOLECULE TYPE): peptide
  • Lys lie His Met Asp Ala Phe Ala
  • Sequence type SEQUENCE TYPE: Nucleic acid Number of chains (STRANDEDNESS): single
  • Sequence type SEQUENCE TYPE: Nucleic acid Number of chains (STRANDEDNESS): single
  • Sequence type SEQUENCE TYPE: Nucleic acid Number of chains (STRANDEDNESS): single

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Description

明 細 書 ァ シル基転移活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子 発明の属する技術分野
本発明は、 芳香族ァ シル基転移活性を有する蛋白質をコー ドする 遺伝子及びその利用に関する ものである。 更に詳し く は、 リ ン ドウ
( Gent i ana t r i f 1 ora var. j apon i ca) 、 ペチュニア (Petunia ybrida ) 、 シ ソ （Peri lla ocimoides ) 及びサイネ リ ア (Sene cio cruentus) 由来の芳香族ァシル基転移活性を有する蛋白質を コー ドする遺伝子及びその利用に関する ものである。 背景技術
花産業は新規かつ種々の品種を開発するこ とに努力 している。 新 規な品種の育成のための有効な方法の一つと して花の色を変えるこ とがあり、 古典的な育種方法を用いて、 ほとんどの商業的品種につ いて広範囲な色を作出する こ とに成功している。 しかしながら、 こ の方法では種ごとで遺伝子プールが制限されている こ とから、 単一 の種が広範囲の種類の着色品種を有する こ とは稀である。
花の色は主と して 2 つのタイプの色素、 即ちフラボノ ィ ド及び力 口チノ ィ ドに基づき、 フラボノ ィ ドは黄色から赤ない し青色の範囲 に寄与し、 カ ロチノ ィ ドはオ レ ン ジ又は黄色の色調に寄与する。 花 色に主たる寄与をするフラボノ ィ ド分子はシァニジ ン、 デルフ ィ 二 ジ ン、 ペチュニ ジ ン、 ぺォニ ジ ン、 マルビジ ン及びペラノレゴニ ジ ン の配糖体であるア ン ト シア ンであり、 異なるア ン ト シア ンが顕著な 花の色の変化をもたらす。 さ らに花の色は無色のフラボノ ィ ドの補 助発色、 金属錯体形成、 グリ コ シル化、 ァ シル化、 メ チル化及び液 胞の p Hによ り影響される （Forkmann, Plant Breedin 106 ： 1, 1 991 )
アンルイ匕されたアン ト シア ンは、 サイネ リ ア （Senecio cruent us) 由来のシネ ラ リ ン （Goto et al. , Tetrahedron 25: 6021, 198 4 ) 、 ツユクサ ( Comme 1 i na communis) 由来のァ才 zくニ ン (Goto and Kondo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30： 17， 1991) 及びォ ャマ リ ン ドウ （Gentiana akinoi ) 由来のゲンチオデルフ ィ ン （ Yoshida et al. , Tetrahedron 48 ： 4313, 1992) を始め、 自然界か らの数多 く の分離例が報告されている （タイマツバナ： Kondo et a 1. , Tetrahedron 26： 5879, 1985； シソ、 ンジ一： Goto et al. ,
Tetrahedron 27： 2413, 1987; シマフムラサキツユクサ： Idaka et al. , Tetrahedron 28: 1901， 1987； ャマノ ィ モ ： Shoyama e t a 1. , Phytochemistry 29: 2999, 1990; ァカキャベツ、 キキヨ ウ、 ロベリ ア、 ラーク スノ、。一、 チ ョ ウマメ ： Goto and Kondo, Angew. C hem. Int. Ed. Engl. 30: 17, 1991； ニ ン ジ ン ： Glabgen et al. , Phytochemistry 31: 1593, 1992； アサガオ： Lu et al. , Phy toch emi stry 32; 659, 1992;Sai to et al. , Phytochemistry 40: 1283, 1995; キラ ンソゥ、 ト ウバナ、 ォ ド リ コ ソゥ、 ラベンダー、 ィ ヌハ ッ カ、 ォォキセヮ タ、 プレク ト ラ ンサス、 ゥ ッボグサ、 ヒ ゴロモ ソ ゥ、 ネ ジ リ イ モ ： Sai to and Harborne, Phytochemistry 31 : 3009,
1992； ォォォ二バス ： Strack et al. , Phytochemistry 31: 989，
1992; カ ン 二ユラ ： Brandt et al. , 33: 209, 1993; リ ン ド ゥ ： Hosokawa et a 1. , Phytochemistry 40: 941， 1995; ヒャシ ン ス ： Hosokawa et a 1. , Phytochemistry 40: 567, 1995;)
これらのア ン ト シア ンを含むフ ラボノ ィ ドを修飾するァ シル基は 構造的に 2 種類に分けられる。 はハイ ドロキシ桂皮酸を中心と する芳香族ァ シル基であり、 もう はマロニル基のよ う な脂肪族 ァ シル基である。 これらのァ シル基転移反応のう ち、 グルコースを 介して芳香族ァ シル基、 好ま し く はクマル酸ゃコー ヒー酸が結合し たア ン ト シア ンはその吸収極大が長波長側に移動するこ とがアサガ ォ (Pharbi tis ni l ) のア ン ト シア ン系色素を用いた実験によ り 観察された （Dangle et al. Phy tochemi stry 34 ： 1119， 1993) 。
さ らに、 サイネ リ ア （Senecio cruentus) 由来のシネラ リ ンは 1 個の脂肪族ァシル基と 3個の芳香族ァシル基を有する力く、 シネラ リ ンからの芳香族ァ シル基の解離によ り、 中性の水溶液中で色素の 安定性が低下する こ とが報告されている （Goto et al. , Tetrahedr on 25 ： 6021， 1984 ) 。 また、 リ ン ドウ （Gentiana makinoi) に由来するゲンチォデルフ ィ ンはその分子内に存在する 2 つの芳香 族ァ シル基により、 サン ドィ ツチ型の分子内スタ ッキングが起こ り 、 水溶液中で色素が安定化されるこ とが報告されている （Yoshida et al. , Tetrahedron 48 ： 4313, 1992) 。 さ らに、 吉田 らは、 リ ン ドウのア ン ト シァニ ンにはア ン ト シァニンの 5位のグルコ ースと 3 ' 位のグルコースのそれぞれにァ シル基が結合している こ とを明ら かに した （Tetrahedron 48, 4313, 1992) 。 また、 シ ソ （Peri lla ocimoi des ) の葉のア ン ト シァニ ンは シァニ ジ ン 3， 5 — ジ ダルコ シ ドの 3 位のグルコースにクマール酸が結合したシソニンである こ と も報告されている （Tetrahedron Letters 27, 2413-2416, 1978
) o
しかしながら、 これらの研究は有機化学的側面から天然色素の構 造学的研究においてなされており、 ァ シル基を転移する酵素を単離 するなどの生化学的側面からの研究はなされていない。
また、 植物におけるア ン ト シア ン系色素へのァ シル基転移酵素の う ち、 脂肪族ァシルであるマロニル基転移酵素についてはパセ リ の 培養細胞 （Matern et al. , Arch. Biochem. Biophys. 208： 233， 1 981； Matern e t al. , Arch. B i ochem. Biophys. 226： 206, 1983； Matern et al. , Eur. J. Bioc em. 133： 439， 1983) や Cicer ar ie nt ium の実生 (Koster et al. , Arch. Biochem. Biophys. 234： 51 3， 1984 ) からのものを始めと して多く の報告が為されている。
また、 芳香族アンル基転移反応は 1980年にナデシコ科の植物であ る Si lene ( Kams teeg et a 1. , Biochem. Physiol. Pf 1 anzen 175： 403, 1980) で初めて示され、 Matthiola の可溶化酵素画分にも同 様の芳香族ァシル基転移酵素活性が見い出されている （Teusch et al. , Phy tochemistry 26： 991, 1986 ) 。
しかしながら、 これらの報告では酵素活性の存在を示したのみに 留ま っており、 対応する酵素蛋白質を特定したり、 その一次構造や さ らにはそれをコ一 ドする遺伝子についてはなんら知見が得られて いない。 それ以外の芳香族ァシル基転移酵素についても蛋白質ゃ遗 伝子の一次構造を明らかにした報告はなく、 さ らにこのアン ト シァ ン系色素のァシル化反応を花色幅の拡大に積極的に利用 して花を育 種した例や、 ァ シル化を用いてア ン ト シア ンの安定化をはかった報 告もない。
—方、 ペチュニア （Petunia hybrida ) のア ン ト シァニ ンの生 合成経路はよ く研究されており （Wiering, H. and de Vlaming, P. Inh er i tance and biochemistry of pi gments. Petunia, P49-65, (1984) 、 Griesbach, R. J. , asen, S. and Leonhardt, B. A. , Phytochemistry, 30 , 1729- 1731, 1991 ) 、 ァ シル基を含むア ン ト シァニンが存在する こ とが知られている。 ペチュニアのア ン ト シァニ ンのァ シル基はクマ ル酸あるいはカフ ヱ酸が知られており、 ア ン ト シァニンの 3 位のル チノ シ ドに一分子のクマル酸又はカフ ヱ酸が結合していて、 化学構 造はア ン ト シァニジ ンがマルビジンの場合、 それぞれ 3- 0-(6- 0- (4- 0-クマロ イノレ）-ひ - D- グルコ ビラ ノ シル）- 5- 0- /3 -D- グルコ ピラ ノ シノレ- マノレビジ ン、 3 - 0-(6- 0-(4-0 -力 フ エオイ ル）- α - D - グルコ ピ ラ ノ シル） - 5-0- - D- グルコ ピラ ノ シル一マルビジ ンである と され ていた。 しかし、 ァ シル基を 2 つ持つア ン ト シァニ ンについての報 告例はなかった。 発明の開示
本発明は、 芳香族ァ シル基転移活性を有する蛋白質をコー ドする 遺伝子及びその利用に関する ものである。 即ち、 当該利用に関して は、 植物において、 フラボノ イ ド、 好ま し く はア ン ト シア ンへのァ シル基転移反応を制御する方法が挙げられ、 それによ り単一種が広 範囲の花色を発現する可能性を提供する。 特に、 芳香族ァ シル基の 転移により、 ア ン 卜 シア ンの吸収極大が長波長側に移動するこ とか ら、 既存の花色に青味を持たす場合に有効である と考えられる。 これらの技術を実現化させるためには芳香族ァシル基転移反応を つかさ どる酵素を明らかに し、 その酵素をコー ドする c D N Aを分 離する必要がある。 更に、 一つのァ シル基転移酵素の c D N Aから 遺伝子の相同性を利用 して他のァ シル基転移酵素遺伝子の分離が可 能となる。 また、 ァ シル化によ り ア ン ト シア ンの安定性が増すこ と から、 安定なア ン ト シア ン色素の生産も可能となる。
本発明者らは、 リ ン ドウの花弁からァ シル基転移酵素を精製し、 その一次構造を決定した。 更には、 遺伝子組換え技術を用いてリ ン ドウ、 ペチュニア、 シソ及びサイネ リ アのァシル基転移酵素の c D N Aを単離し、 構造遺伝子の塩基配列を決定した。 即ち、 本発明は リ ン ドウ、 ペチュニア、 サイネ リ アの花弁及びシ ソの葉に存在する ァ シル基転移酵素をコー ドしている D N A配列を提供する ものであ る。 また、 本発明に係る酵素を用いてア ン ト シア ン系色素をァ シル 化する こ とにより花色を変化させるこ とができ、 ア ン ト シア ンの安 定性を増すこ とができ る。 具体的な記載
ァ シル基転移酵素をコ 一 ドする遺伝子は例えば次のよ う に して得 るこ とが出来る。 即ち、 まず、 リ ン ドウの花弁よ り ァ シル基転移酵 素を精製する。 従来、 本発明が成される以前に、 芳香族ァ シル基転 移酵素の精製に成功 した例はな く 、 本発明者らは各種のク ロマ ト グ ラフ ィ 一法、 特にシバク ロ ンブル一 3 G A (Cibacron Blue 3GA ) を固定した樹脂 （例えば、 ブルーセフ ァ ロース （登録商標） 樹脂等 ) を用いたァフ ィ 二ティ 一ク ロマ ト グラフ ィ 一法を行う こ とにより 初めて当該酵素の精製に成功した。
次に、 常法に従ってァ シル基転移酵素の部分ア ミ ノ酸配列を解明 し、 それらのア ミ ノ酸配列に対応する合成ヌ ク レオチ ドを作製する 一方、 同 じ リ ン ドウの花弁よ り ρ ο 1 y A + R N Aを抽出 し、 常法により、 2本鎖 c D N Aを合成し、 更に c D N Aライブラ リ ー を作製する。 前述の 2本鎖 c D N Aを铸型にし、 前述の合成 D N A と c D N Aを合成する際に使用 した合成 D N Aプライマーを用い、 P C R法によ り、 ァ シル基転移酵素遺伝子に特異的な D N A断片を 取得する。 次に、 この D N A断片をプローブに して、 前述の c D N Aライ ブラ リ 一をスク リ ーニングし、 陽性ク ロ一 ンを得る。 そ して 、 このク ロ ー ンから回収されるプラス ミ ド D N Aを分離し、 D N A 塩基配列を決定する。 更に精製したァ シル基転移酵素の分析によ り 得られたァ ミ ノ酸配列と D N A塩基配列から推定したァ シル基転移 酵素のア ミ ノ酸配列とを比較する こ とによ り、 陽性ク ロー ンが求め る c D N Aク ロ ー ンである こ とを確認する。
また、 本発明者らは、 ペチュニア品種サフ ィ ニァパープル （サン ト リ ー （株） ） の花色が通常の赤紫から紫に変化した変異株 （ V M ) を見いだし、 ア ン ト シァニ ンの構造決定を、 例えば吉田 らの文献
(Yoshida et al. , Tetrahedron 48 ； 4313， 1992) に記載の方法に 従って行った。
本発明の DNAと しては、 例えば配列番号 ： 1 〜 6 のいずれかに記 載するァ ミ ノ酸配列をコー ドする ものが挙げられる。 しかしながら 、 複数個のア ミ ノ酸の付加、 除去及びノ又は他のア ミ ノ酸による置 換によ り修飾されたア ミ ノ酸配列を有する蛋白質も、 もとの蛋白質 と同様の酵素活性を維持する こ とが知られている。 従って本発明は 、 配列番号 ： 1 〜 6 のいずれかに記載のァ ミ ノ酸配列に対して 1 個 又は複数個のァ ミ ノ酸の付加、 除去及び/又は他のァ ミ ノ酸によ り 置換されている修飾されたア ミ ノ酸配列を有し、 なお、 芳香族ァ シ ル基転移活性を維持している蛋白質をコー ドする遺伝子も本発明に 属する。
本発明はまた、 配列番号 ： 1 〜 6 のいずれかに記載の塩基配列又 はその部分、 例えばコ ンセ ンサス領域の 6個以上のア ミ ノ酸をコー ドする部分に対して、 例えば 2 ないし 5 X SSC ， 50°Cの条件下でハ イブリ ダィズし、 且つ芳香族ァシル基転移活性を有する蛋白質をコ ー ドする遺伝子に関する。 なお、 最適なハイブリ ダィゼーシ ヨ ン温 度は塩基配列やその長さにより異り、 塩基配列が短く なるに従って ハィブリ ダイゼーシ ョ ン温度は低く するのが好ま し く 、 例えばァ ミ ノ酸 6 個をコー ドする塩基配列 （ 18塩基） の場合は、 50°C以下の温 度が好ま しい。 本発明はさ らに、 配列番号 ： 1 〜 6 のいずれかに記 載のア ミ ノ酸配列に対して 15%以上、 好ま し く は 25%以上、 例えば 30%以上の相同性を有するア ミ ノ酸配列を有し、 且つ芳香族ァ シル 基転移活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子に関する。
生来の塩基配列を有する DNAは、 実施例に具体的に記載するよ う に、 例えば cDNAライブラ リ ーのスク リ ーニングにより得られる。 また、 修飾されたア ミ ノ酸配列を有する酵素をコー ドする DNAは 、 生来の塩基配列を有する DNAを基礎にして、 常用の部位特定変異 誘発や PCR法を用いて合成する こ とができ る。 例えば、 修飾を導入 したい部位を含む DNA断片を、 上記によ り得られた cDNA又はゲノ ミ ッ ク DNAの制限酵素消化によ り得、 これを铸型に して、 所望の変異 を導人したプライマーを用いて部位特定変異誘発又は PCR法を実施 し、 所望の修飾を導入した DNA断片を得、 これを、 目的とする酵素 の他の部分をコー ドする DNAに連結すればよい。
あるいはまた、 短縮されたア ミ ノ酸配列を有する酵素をコー ドす る DMAを得るには、 例えば目的とするア ミ ノ酸配列よ り長いア ミ ノ 酸配列、 例えば全長ア ミ ノ酸配列をコー ドする DNAを、 所望の制限 酵素によ り切断し、 得られた DNA断片が目的とするァ ミ ノ酸配列の 全体をコー ドしていない場合には、 不足部分を合成 DNAを連結する こ とによ り捕えばよい。
また、 このク ロー ンを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて 発現させ、 酵素活性を測定する こ とにより、 得られた遺伝子がァシ ル基転移酵素をコー ドしている こ とを確認し、 ァ シル基転移酵素遺 伝子の翻訳領域を明らかにする こ とによ り本発明に係るァ シル基転 移酵素をコー ドする遺伝子が得られ、 更に、 当該遺伝子を発現させ る こ とによ り遺伝子産物である目的のァ シル基転移酵素蛋白を得る こ とができ る。
あるいはまた、 配列番号 1 〜 6 のいずれかに記載のァ ミ ノ酸配列 に対する抗体を用いても、 前記蛋白を得る こ とができる。
従って本発明はまた、 前記の DNAを含んでなる組換えベク ター、 特に発現ベク ター、 及び該ベク ターにより形質転換された宿主に関 する。 宿主と しては、 原核生物又は真核生物を用いる こ とができる 。 原核生物と しては、 細菌、 例えばェシ ヱ リ ヒ ア (Escherichia ) 属に属する細菌、 例えば大腸菌 （Escherichia col i) 、 バシルス
(Baci llus) 属微生物、 例えばバシルス ' ズブチ リ ス （Bacillus subti 1 is) 、 等常用の宿主を用いるこ とができる。
真核性宿主と しては、 下等真核生物、 例えば真核性微生物、 例え ば真菌である酵母又は糸状菌が使用できる。 酵母と しては、 例えば サ ッ カ ロ ミ セス （Saccharomyces ) 属微生物、 例えばサ ッ カロ ミ セ ス * セ レ ビシェ Saccharomyces cerevisiae) 等力く挙げられ、 ま た糸状菌と してはァスペルギルス (Aspergillus ) 属微生物、 例え ばァスペルギルス · ォ リ ゼ （Aspergillus oryzae) 、 ァスペルギ Jレス . 二力"一 (Aspergi llus— niger ) 、 ぺニ シ リ ウ ム (Penicill ium ) 属微生物等が挙げられる。 さ らに、 動物細胞又は植物細胞が 使用でき、 動物細胞と しては、 マウス、 ハムスター、 サル、 ヒ ト等 の細胞系が使用される。 さ らに、 昆虫細胞、 例えばカイ コの細胞、 又はカイ コの成虫それ自体も宿主と して使用される。
本発明の発現ベク ターは、 それらを導入すべき宿主の種類に依存 して発現制御領域、 例えばプロモーター及びター ミ ネータ一、 複製 起点等を含有する。 細菌用発現ベク ターのプロモータ一と しては、 常用のプロモーター、 例えば trc プロモーター、 tac プロモーター 、 lac プロモーター等が使用され、 酵母用プロモーターと しては、 例えばグリ セロアルデヒ ド 3 リ ン酸デヒ ドロゲナーゼプロモーター 、 PH05プロモータ一等が使用され、 糸状菌用プロモーターと しては 例えばア ミ ラーゼ、 trp C等が使用される。 また、 動物細胞宿主用 プロモーターと してはウィルス性プロモーター、 例えば SV40アー リ 一プロモーター、 SV40レー トプロモーター等が使用される。
発現ベク ターの作製は、 制限酵素、 リ ガーゼ等を用いて常法に従 つて行う こ とができる。 また、 発現ベク ターによる宿主の形質転換 も、 常法に従って行う こ とができ る。
前記蛋白質の製造方法においては、 前記の発現ベク ターによ り形 質転換された宿主を培養、 栽培又は飼育し、 培養物等から常法に従 つて、 例えば、 濾過、 遠心分離、 細胞の破砕、 ゲル濾過ク ロマ 卜 グ ラフ ィ 一、 イオン交換ク ロマ ト グラフ ィ ー等によ り 目的とする蛋白 質を回収、 精製する こ とができる。
なお、 本明細書においては リ ン ドウ、 ペチュニア、 シ ソ及びサイ ネ リ ア由来のァ シル基転移酵素について述べているが、 当該酵素の 精製法をそのまま又は一部を改変して、 他の植物のァ シル基転移酵 素を精製 し、 当該酵素に係るア ミ ノ酸配列を決定する こ とにより、 当該酵素をコー ドする遺伝子をク ローニ ングする こ とができ る。 更 に、 本発明に係る リ ン ドウ由来のァ シル基転移酵素の c D N Aをプ ローブと して用いるこ とによ り、 リ ン ドウから別のァ シル基転移酵 素の c D N A、 ペチュニアから別のァ シル基転移酵素の c D N Aを 得る こ とができた。 従って、 ァ シル基転移酵素の遺伝子の一部また は全部を用いると、 他のァ シル基転移酵素遺伝子を得る こ とができ る。 また、 これらのア ミ ノ酸配列を比較したと ころ、 保存されてい るア ミ ノ酸配列があった。 この領域を用いて、 シ ソ及びサイネ リ ア 由来のァ シル基転移酵素の c D N Aを得る こ とに成功 したが同様の 手法を用いる こ とにより、 他の植物に応用 し、 類似のァシル基転移 酵素の c D N A又は染色体 D N A ク ロー ンを得るこ とが可能である また、 本明細書において示したよ う に、 リ ン ドウ、 ペチュニア、 シソ及びサイ ネ リ ア由来のァ シル基転移酵素を精製し、 常法に従つ て当該酵素に対する抗体を得る こ とによ り、 その抗体と反応する蛋 白質を作る c 0 1 又は染色体 0 1 をク ローニングするこ とがで き る。 従って、 本発明は リ ン ドウ、 ペチュニア、 シ ソ及びサイネ リ ァ由来のァ シル基転移酵素の遺伝子のみに限定される ものではな く 、 広く 芳香族ァシル基転移酵素に関する ものである。
さ らに本発明は、 ァシル基転移酵素の遺伝子を導入する こ とによ り、 色が調節された植物も し く はその子孫又はそれらの組織に関す る ものであり、 その形態は切花であってもよい。
また、 本明細書においてはアン ト シア ンを含むフラボノ ィ ドのァ シル基転移反応において、 ァシル基の供与体と して P — クマロイル
- C 0 A又はカフ ェオイル一 C o A等の C o Aエステルを挙げたが 、 p —クマロイノレ、 フ ヱノレロイノレ又はシナボイノレ一 1 — 0—グルコ ースといったハイ ドロキシシンナモイノレ一 1 一〇一グルコースも芳 香族ァ シ ル基の供与体と しての利用が可能であるので （Glassgen a nd Seitz, Planta 186: 582, 1992 ) 、 本発明に係る酵素を用いた 利用が可能である。 実施例
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。 実験の手順は 特に記述しない限り Sambrookらの Molecular Cloning (Cold Spr in g Harbor Laboratory Press, 1989 ) に従った。
実施例 1 . 植物からのァ シ ル基転移酵素の検索
( 1 ) 基質の調製
デルフ ィ 二ジン 3， 5 — ジグルコ シ ドおよびシァニジン 3 ， 5 — ジグルコ シ ドはバーべナ （Verbena hybr ida ) の一品種であるタ ビア ンバイオ レ ッ ト （サン ト リ ー （株） より購入可能） の花弁から それぞれのジァセチル体を抽出 し、 脱ァセチル化するこ とによ り取 得した。 夕 ピア ン ノくィォ レ ツ 卜の花弁 （ 3 4 8 g ) を液体窒素と と もにホモジナイザーで摩砕し、 5 0 % ( V / V ) ァセ トニ ト リ ル、 0. 2 % ト リ フ ルォ口酢酸 （ T F A ) 溶液 1 . 5 Lに浸して 3 日間 放置した。
濾紙上にケイ ソゥ土 （ # 1 0 0 ) を敷き詰めて吸引ろ過し、 ロ ー タ リ ーエバポレーターで約半分量に濃縮して、 H P — 2 0 (フ アル マシア社） にて、 ゲル濾過を行った。 8 0 0 m 1 の蒸留水で洗浄後 、 5 0 %ァセ トニ 卜 リ ル、 0 . 1 % T F A 8 0 0 m l で色素画分 を溶出 した。 エバポ レーターで濃縮後、 凍結乾燥して、 粗色素 （ 7 . 3 g ) を得た。
タ ピア ンの主色素はデルフ ィ 二ジ ン及びシァニジ ンの 3 , 5 — ジ ァセチルグルコ シ ドであるため、 以下の脱ァセチル化操作を行った 。 粗色素 1 gをメ タ ノ ール 5 0 m 1 に溶解し、 窒素ガスを 1 5 分間 通気して溶存酸素を除いた後、 氷冷した。
一方で、 1 N水酸化ナ ト リ ウム 5 0 m l から同様に溶存酸素を除 き、 氷冷下で先の色素溶液に撹拌しながら滴下し、 更に 3 0 分間撹 拌して加水分解反応をさせた。 6 N塩酸 1 m 1 を加えて反応を停止 させ、 蒸留水 5 m 1 を加えてエバポ レーターで約半量に濃縮し、 終 澳度 1 0 %になるようにメ タ ノ ールを加えて 2 m 】 ずつ S e p P a c C I 8 カラム （ウ ォーターズ ア ソ シエー シ ョ ン社） にァプ ライ し、 蒸留水 5 m 】 で洗浄した後、 3 0 %ァセ 卜二 ト リ ル、 0. 6 % T F A 2 m l で溶出させた。
溶出液をすベて集めてエバポ レーターで濃縮し、 H P L Cによる 分取を行った。 D E V E L O S I L O D S — 1 0 / 2 0 ( 5 0 x 3 0 0 mm ; 野村化学 （株） ） カラムを用い、 1 2 0 分間で T F A 力く 0 . 1 %力、ら 0 . 3 %、 ァセ トニ ト リ ノレ力く 1 0 %力、ら 3 0 %の直 線濃度勾配によって溶出させた。 毎分 3 2 m 1 の流速で 0 · 5 分毎 に分取し、 各画分の色素画分の吸収スぺク トルを測定して、 デルフ ィ ニ ジ ン 3 , 5 — ジ ダルコ シ ドおよびシァニ ジ ン 3 , 5 — ジ グルコ シ ドを分離してそれぞれを濃縮、 凍結乾燥した （デルフ ィ 二ジ ン 3 , 5 — ジ グルコ シ ド 7 5 m g、 シァニ ジ ン 3 , 5 — ジグルコ シ ド 5 0 m g ) 。 各々 を 1 . 5 m g /m l になるように 0. 5 % T F Aに溶解して、 使用するまで一 8 0 °Cに保存した。
もう一方の基質である ヒ ドロキンシ ンナモイル— C o Aの合成は 以下の方法で行った。 最初に、 文献 （Stockigt and Zenk, Z. Natu rforsch. 30: 352, 1975) に従ってカフ ヱ酸 （ナカライテスク社） と N— ヒ ドロキシスク シンイ ミ ド （メ ルク （M e r c k ) 社） よ り エステルを合成した。 このエステル 0. 5 mm o 1 を 2 m I のァセ ト ンに溶解し、 一方でコェンザィ ム A ( C o A : K O H J I N) 0 . 1 m m o 1 と炭酸水素ナ ト リ ウ ム l mm o 1 とを 2 O m l の水に 溶解して、 これに先のエステル溶液を 1 滴ずつ加えた。
撹拌しながら窒素ガスの下で室温で一晩反応させた後、 ロータ リ 一エバポレーターで濃縮し、 遠心 （ 2 7 0 0 0 X g、 1 0分） によ つて不溶物を除いて、 H P L Cで目的の生成物を分取した。 D E V E L O S I L 0 D S - 1 0 / 2 0 ( 5 0 x 3 0 0 mm ; 野村化学 (株） ） カラムを用い、 0. 1 % T F A存在下でァセ トニ ト リ ルが 4 0分間で 1 8 %から 3 6 %の直線濃度勾配によって溶出させた。 毎分 3 2 m 1 の流速で 0. 8分毎に分取し、 各画分の吸光スぺク ト ル （ 2 0 0〜 4 0 0 n m ) を調べて 3 4 4 〜 3 4 8 n mに極大吸収 を持つ画分をカフ ェオイル C o A画分と して集めた。 それらをロー タ リ ーエバボレーターで濃縮した後、 同 じカラムで再び分離した。 但し、 ァセ トニ ト リ ノレ 1 8 %、 T F A 0. 1 %の等濃度ク ロマ ト グラ フ ィ 一で分離を行い、 同様に吸光スぺク トルを調べて、 目的の 化合物を含む画分をロータ リ ーエバポレーターで濃縮し、 凍結乾燥 した。 この方法で 3 5 m o 1 の生成物が得られた。 また、 上記の 方法中カフ ヱ酸のかわり にクマル酸を用いる こ とにより P — クマ口 ィル— C o Aが合成でき 2 m g /m 1 になるよう に蒸留水に溶解し て、 使用するまで一 8 0 °Cに保存した。
( 2 ) 粗酵素液の抽出方法
酵素を抽出する植物組織 （花弁や食用部分等） 3 gを液体窒素で 凍結させて乳鉢上で磨砕した。 1 O m l の抽出用緩衝液 （ 1 0 O m M リ ン酸緩衝液 （ p H 7 . 5 ) 、 1 0 mMァス コル ビ ン酸ナ ト リ ウ 厶、 1 4 mM 2 —メ ルカプ トエタ ノ ール） を加えて更に磨砕し、 ガ ーゼ 3 層で濾過した。 D OW E X ( 1 — X 2 、 1 0 0 - 2 0 0 m e s h ； 室町化学工業 （株） ） 3 gを添加して 1 0 分間撹拌した後に 吸引ろ過によって樹脂を除去し、 遠心分離 （ 2 7 0 0 0 X g、 2 0 分） によって植物体残査を除いた。 7 0 %飽和硫安で塩析を行い、 タ ンパク質を沈殿させた。 沈殿を l m l の溶解用緩衝液 （ 2 0 mM リ ン酸緩衝液 （ p H 7 . 5 ) 、 1 4 mM 2 — メ ノレカプ トエタ ノ ール ) に懸濁し、 遠心分離 （ 2 7 0 0 0 x g、 5 分） によ って不溶物を 除去した後、 溶解用緩衝液で平衡化させた S e p h a d e x G— 2 5 カラム （ N A P— 1 0 ； フ アルマシア社） を用いて脱塩した溶 液を粗酵素液と して用いた。
( 3 ) 酵素活性の測定方法
1 0 0 m M リ ン酸緩衝液 （ p H 8 . 5 ) 、 デルフ ィ 二ジ ン 3 ， 5 — ジ グルコ シ ド 2 4 n m o 1 、 カフ ェオイノレ一 C 0 A 2 1 . 5 n m o 1 、 及び酵素液 2 0 1 を含む反応液 5 0 u 1 を 3 0 °Cで
1 0 分間反応させた。 1 3 . 8 % ( v Z v ) 酢酸を含むァセ トニ 卜 リ ノレ 5 0 1 を加えて反応を停止させ、 遠心分離 （ 1 8 0 0 0 X g 、 5 分） によ って不溶物を除いた後、 高速液体ク ロマ ト グラフ ィ ー
( H P L C ) で分析した。 分析は C 1 8逆相カ ラ ム （ Y M C — P a c k O D S — A、 6. O x i 5 0 mm ; ヮ イ エム シ ィ 社） を用い 、 2 1 . 6 %ァセ トニ ト リ ル、 0 . 1 % ト リ フ ルォ ロ酢酸を毎分 1 m 1 の流速で流し、 反応液 2 0 μ. 1 を分析した。 化合物の検出には 三次元ク ロマ ト グラ フ ィ ーシステム （ C L A S S — L C I 0 ； (株 ) 島津製作所） を使用 し、 生成物は， 基質にはない 3 3 0 n m付近 に極大吸収をもつこ と、 及び可視部の吸収極大値が 5 1 9 n mから 5 2 5 n mへと約 6 n m長波長側に移動しているこ とから、 ァ シル 基 （カ フ ヱ酸） が結合し、 デルフ ィ 二ジ ン 3 — ダルコ シル 5 — カ フ ュオイルグルコ シ ドが生成しているこ とを確認した。
5 2 0 n mの波長で検出 し、 基質 （デルフ ィ 二ジ ン 3 ， 5 — ジグ ルコ シ ド） と生成物 （デルフ ィ 二 ジ ン 3 — ダルコ シノレ 5 — 力 フ エ ォ ィルグルコ シ ド） とのピーク面積の和に対する生成物のピーク面積 の比を求め、 生成物のモル数を計算して酵素活性 （ k a t ) と した 。 この H P L C分析における各化合物の展開時間は次の通りである 。 カフ ェオイノレ一 C 0 A ： 6 . 3 分、 デルフ ィ 二ジン 3 , 5 — ジグ ルコ シ ド ： 3 . 3 分、 デルフ ィ 二ジン 3 — ダルコ シノレ 5 —カフ ェォ ィルグルコ シ ド ： 5 . 3分。
但し、 この反応条件下においては反応液中のデルフ ィ 二ジ ン 3 , 5 — ジグルコ シ ドがァ シル基転移酵素により、 カフ ヱ酸で修飾され るこ とにより、 反応液の色が濃青色から赤紫色に変化するため、 簡 便な方法と して、 マイ ク ロ タイ タープレー ト中にて反応を行い、 色 の変化によ って酵素活性を調べる こ とができ る。
なお、 反応後のプレー トを室温で長期間 （ 1 曰〜 1 週間） 放置す ると、 ァシル化されていないデルフ ィ 二ジン 3 , 5 — ジグルコ シ ド は無色化するのに対して、 酵素の働きによってァ シル化されたデル フ ィ ニジ ン 3 , 5 — ジグルコ シ ドでは赤紫色が残る こ とから、 デル フ ィ ニジ ン 3 ， 5 — ジグルコ シ ドがァシル化されるこ とによって中 性からアル力 リ性の水溶液中での安定化が認められた。 同様にシァ 二ジ ン 3 , 5 — ジダルコ シ ドを基質と した場合も反応液の色が赤紫 色から濃青色に変化し、 色素が安定化するこ とから、 簡易的酵素ァ ッセィ方法での酵素活性の検出が可能である。
—方、 カ フ ェ オイ ノレ一 C o Aのかわり に p — ク マ ロ イ ノレ一 C o A を基質と した場合もァ シル化による色の変化及びア ン 卜 シァニ ンの 安定化が認められる力 <、 色調の変化の度合いはカフ ヱオイル— C 0 Aの場合に比べ少ない。
( 4 ) ァ シル基転移酵素の検索
各種の植物 （ リ ン ドウ、 アイ リ ス、 デルフ ィ 二ゥム、 ス ト ッ ク、 トルコキキ ヨ ウ、 ナデシコ、 スイー ト ピー、 ラ一ク スパー、 パンジ 一、 サイ ネ リ ア （以上、 花弁） 、 赤キ ャベツ、 赤タマネギ、 金時二 ンジ ン、 西洋ニ ン ジ ン、 ムラサキイモ、 シ ソ （以上、 食用部分） 及 びナス （果実上皮部分） ） から上記の方法によって粗酵素液を抽出 し、 酵素活性を測定したと ころ、 トルコキキ ヨ ウ、 ナデシコ及び、 リ ン ドウに各々 0. 6 3、 0. 0 0 1 2及び 2 し 8 n k a t /m g蛋白質のァ シル基転移活性が認められた。 抽出タ ンパク質当たり のァ シル基転移酵素活性が最も高い リ ン ドウを酵素精製の材料と し て用いる こ とにした。
なお、 タ ンパク質濃度の定量には B i 0 - R a d P r o t e i n A s s a y ( B i o— R a d社） を用いた。
実施例 2. リ ン ドウ由来のァシル基転移酵素の精製
( 1 ) 酵素の精製
ェゾリ ン ドウ (Gent i ana tr i f 1 ora var. j apon i ca) の花弁カヽり 酵素の精製を行った。 以下の実験は記載がない限り、 0〜 4 °Cで行 つた。 ェゾリ ン ドウの花弁 3 k gを液体窒素存在下でェクセル · ォ ー ト · ホモ ジナイザー （ D X— 3 ； 日本精機製作所） を用い磨砕し た。 8 Lの抽出用緩衝液 （ 1 0 O mM ト リ ス塩酸 （ p H 7. 0 ) 、
1 0 mMァス コノレ ビン酸ナ ト リ ウ ム、 1 0 M p — ア ミ ジ ノ フ エ 二ルフ ッ化メ タ ンスルフ ォ ニル塩酸塩 （ p — A P M S F ； 和光純薬 工業 （株） ） 、 5 mMジチオス レィ トール （ D T T ； ナカライテス ク社） ） とポ リ ク ラール S B— 1 0 0 (和光純薬工業 （株） ） 5 0 0 gを加えてポ リ ト ロ ンで完全に粉砕した。
粉砕液をガーゼ 4層で搾ったのち、 さ らに遠心分離 （ 1 1 0 0 0 x g、 3 0分） して細胞残查を除去した。 4 0 %飽和硫安で塩析を 行い、 不溶物を除去した後に 7 0 %飽和硫安で再び塩析を行った。 沈殿を 2 5 O m l の溶解用緩衝液 （ 2 O mM ト リ ス塩酸 （ p H 7. 0 ) 、 I 0 M p — A P M S F、 1 mM D T T) に懸濁し、 遠 心分離によって不溶物を除去した後、 同緩衝液で平衡化させた S e p h a d e x G - 2 5 ( 9 5 x 1 1 O mm ; フ アルマシア社） の カラムを用いて脱塩した。 蛋白質を含む画分を集め （ 8 6 O m l ) 、 以下のク ロマ ト グラフ ィ ーに供した。
なお、 Q - S e p h a r o s e F a s t F l o w、 H i T r a p B l u e及び P h e n y l S u p e r o s eの各ク ロマ ト グラフ ィ 一は室温で F P L C システム （フ アルマシア社） を用いて 行った。
まず、 溶解用緩衝液で平衡化させた Q— S e p h a r o s e F a s t F 1 o w ( 2 6 X 1 0 0 mm ; フ アルマシア社） にァプラ ィ し、 同 じ緩衝液で十分に洗浄した後、 塩化ナ ト リ ウム濃度を 6 0 分間で 0 Mから 0. 4 Mに変化させる直線勾配により溶出させた （ 8 m l ノ m i n ) 。 酵素活性のある画分を集めた （ 1 3 0 m l ) 後 、 ァフ ィ 二ティ ク ロマ ト グラフ ィ ーを行った。 溶解用緩衝液で平衡 ィ匕させた H i T r a p B l u e ( 5 m l 、 1 6 x 2 5 mm ; フ ァ ルマシア社） を 3本直列に繫いだカラムにアプライ し、 同緩衝液で 十分に洗浄した後、 1 M塩化ナ ト リ ウムを含む同緩衝液で溶出させ た。 活性画分を 7 0 %飽和の硫安で塩析し、 蛋白質の沈殿を得た。
この沈殿物を 1 m 1 の溶解用緩衝液に懸濁して遠心分離によ って 不溶物を除いた後、 溶解用緩衝液で平衡化させた S e p h a c r y 1 S — 2 0 0 ( 2 5 X 1 1 5 0 m m ; フ ア ルマ シア社） にァプラ ィ した。 毎分 0. 2 m l の流速で、 約 3 m l ずつ分取し、 再び活性 画分を集めて （ 2 7 m l ) 、 1 Mになるよう に硫安を加えた。 十分 に撹拌した後、 遠心分離 （ 3 9 0 0 0 X g、 1 0分） によ り不溶物 を除去し、 1 M硫安を含む溶解用緩衝液で平衡化させた P h e n y 1 S u p e r o s e 5 / 5 ( 5 . 0 x 5 0 mm ; フ ア ルマ シア 社） にアプライ した。
毎分 0 . 5 m 1 の流速で、 十分に洗浄した後、 硫安濃度を 6 0 分 間で 1 Mから 0 Mに直線的に下げる こ とによ り蛋白質を流出させた 。 0 . 5 m 1 ずつ分取した各画分の酵素活性を測定し、 S D S —ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 （ 1 0 % ア ク リ ルア ミ ドゲル ； 第 一化学 （株） ） で分析した結果、 ほぼ単一の蛋白質と して分子量約 5 0， 0 0 0 のバン ドが認められ、 且つこの蛋白量と活性との相関 が認められるこ とから、 この蛋白質が目的のァ シル基転移酵素であ ると断定した。 更に単一標品を得るために活性を持つ画分 （ 1 2 m 1 ) を逆相 H P L C によ り精製した。
カラムは D E V E L O S I L 3 0 0 C 4 - H G - 5 ( 4 . 6 x 2 5 0 m m ； 野村化学 （株） ） を用い、 毎分 1 m 1 の流速で、 ト リ フ ルォロ酢酸 0 . 1 %存在下、 3 0分でァセ トニ ト リ ル濃度を 4 0 . 5 %から 5 6 . 7 %の直線濃度勾配で変化させる こ とによ り溶出 させた。 2 8 0 n mの吸収をモニター しながら 1 m 1 ずつ分画し、 さ らに各画分を S D S —ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動で分析し て分子量約 5 0 , 0 0 0 の蛋白質を含む画分を集めた。 この H P L C操作を 3 0 回繰り返し、 ス ピー ドバッ ク （サバン 卜社） で濃縮す る こ と によ り約 0 . 2 m gの単一蛋白質標品を得る こ とができ た。 ( 2 ) 精製蛋白質の分析 5 0 0 p m o 1 の精製標品をア ミ ノ酸シークェ ンサ一 （ P S Q— 1 ； (株） 島津製作所） に供したと ころ、 エ ドマ ン分解の第一段目 で 2 0 0 p m 0 I のグルタ ミ ン酸、 更に第二段でも 9 0 p m o 1 の グルタ ミ ン酸が検出されたが、 三段目以降は判読不能であったため
、 本酵素の N末端は何らかの形でプロ ッ ク されている と考えられた o
しかしながら、 N末端がグルタ ミ ン酸である場合にはピログルタ ミ ル基が生じ、 ェ ドマン分解による シークェンスでは上述のよ うな 結果を示すこ とが知られている こ とから本酵素の N末端はグルタ ミ ン酸である可能性が高い。
残りの沈殿を 8 0 1 の 4 5 mM ト リ ス塩酸 （ p H 8. 5 ) 、 3 . 6 M尿素、 0. 0 9 % S D Sを含む溶液に溶解し、 リ シルエン ド ぺフ チタ一で ( L y s y l E n d o p e p t i d a s e ： Achromob actor lyticus 由来 ； 和光純薬工業 （株） ） 1 6 p m o 1 を加えて 、 3 7 °Cで 6時間反応させた。 反応液をそのまま D E V E L O S I L 3 0 0 C 4 — H G— 5 カラムで分離した。
分離条件は、 0. 1 % ト リ フ ルォロ酢酸のもと、 7 0分でァセ ト 二 卜 リ ル濃度が 0 %から 8 0 %の直線濃度勾配、 毎分 0. 7 m I の 流速で、 2 1 0 n mの吸収をモニタ一 しながら吸収のピーク画分の みを分取した。 得られた 1 3本のピーク画分のう ち、 ァセ トニ ト リ ル濃度が 3 2 %から 4 0 %の時点で溶出されたピーク画分の 3本を 、 スピー ドバッ クによる濃縮後、 さ らに 0 D Sカラム （ D E V E L 0 S I L 3 0 0 0 D S - H G - 5 ； 野村化学 （株） ） を用い、 先 と同 じ条件で分離及び精製を行った。
各ピーク画分をスピー ドバッ クで濃縮 · 乾固させ、 4 0 %ァセ ト 二 卜 リ ル 3 0 a 1 に溶解させ、 ア ミ ノ酸シークェンサ一に供した。 その結果 6本のべプチ ドのア ミ ノ酸配列を判読する こ とができた。 以下に、 各々のペプチ ドのア ミ ノ酸配列を示す （ァ ミ ノ末端から力 ルポキシル末端の方向に示す） 。
ァ ミ ノ酸配列 （ A T 7 3 ) ； Arg-Phe-Leu-Gly - 1 le-Thr-Gly-Ser- Pro- Lys (配列番号 ： 7 )
ア ミ ノ酸配列 （ A T 7 2 ) ； I le-Hi s-Met-Asp-Ala-Phe-Ala-Lys( 配列番号 ： 8 )
ァ ミ ノ酸配列 （ A T 7 4 1 一 1 ) ； Gly-Val-Glu-I le-Gly-Val-Se r- Leu- Pro- Lys (配列番号 ： 9 )
Ύ ミ ノ酸配列 （ A T 7 4 1 - 2 ) ； Ala-Ser-Leu-Ser-Leu-Thr-Le u-Lys (配列番号 ： 10)
ア ミ ノ酸配列 （A T 9 ) ； His-Tyr-Val-Pro-Leu-Ser-Gly-Asn-L eu-Leu-Met-Pro-I le-Lys (配列番号 ： 11)
ア ミ ノ酸配列 （A T 8 3 ) ； Val-Arg-Ala-Thr-Tyr-Val-Leu-Ser- Leu-Ala- Glu- lie- Gin- Lys (配列番号 ： 12)
塞施^ 3. リ ン ドウ由来のァ シル基転移酵素の c D N A ク ロ—二
ング （ 1 )
( 1 ) c D N Aライブラ リ —の作製
市販されている リ ン ドウ (Gent iana tr i f 1 ora var. janoni ca) から花弁を集め、 液体窒素中で乳鉢で磨砕した。 この磨砕物から、 グァニジ ンチオシァネー ト 塩化セ シウ ムを用いる方法によ り R N Aを得、 オ リ ゴテ ッ ク ス （日本ロ ッ シュ） を用い、 製造者が推奨す る方法にて、 p o l y A + R N Aを得た。 グァニジ ンチオシァネ 一 卜 Z塩化セ シウ ムを用いる方法は、 R. McGookin, Robert J. Slate r らの、 Methods in Molecular Biology vol 2 , (Humana Press 1 nc.1984 ) に詳細に示されている方法に従った。
得られた p o l y A + R N Aを铸型と し、 Z A P — c D N A合 成キ ッ ト （ス ト ラ タ ジー ン社製） を用いて 2 本鎖 c D N Aを合成し 、 フ ァ ー ジベク ター ； I Z A P I I へのク ローニ ングを行った。 更に 、 同社の G i g a p a c k l l G o l d P a c k a g i n g E x t r a c t キ ッ トを用いて、 当該キッ 卜に記載された方法で c D N Aライブラ リ ーを作製した。
( 2 ) 合成 D N Aプライマーの設計
実施例 2 で得られた部分ア ミ ノ酸配列のう ち、 I le- His- Me卜 Asp- Ala- Phe- Ala- Lys (配列番号 ： 13) で示される配列は、 リ ジルェン ドぺプチダーゼの特異性を考える と、 Lys-1 le- His- Meい Asp-Ala-Ph e-Ala-Lys (配列番号 ： 14) であると考えられる。 この配列の中の 7 ミ ノ酸配列 ； Lys-1 le- His- Me卜 Asp-Ala- Phe-Ala (配列番号 ： 15 ) で示される部分を用いて、 以下のオ リ ゴヌ ク レオチ ドを合成した ο
ヌ ク レオチ ドの配列 （オ リ ゴ 1 ) ； 5' - AARATHCAYATGGAYGCITTYGC -3" (配列番号 ： 16)
但し、 特に記載のないかぎり、 核酸の配列は I U P A C — I B U 準拠の核酸コー ド表に従って一文字で表記する。 即ち、 A ： アデ二 ン、 C : シ ト シ ン、 G : グァニ ン、 T : チ ミ ン、 Y : C又は T、 R ： Α又は G、 H ： A又は C又は丁、 及び I はイ ノ シ ンを示す。
また、 先に述べた c D N Aライブラ リ ー作製時に使用 したプラ イ マーをもとに以下の他のオ リ ゴヌ ク レオチ ドも合成した。
ヌ ク レオチ ドの配列 （オ リ ゴ 2 ) ； 5' -CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTT -3' (配列番号 ： 17)
( 3 ) ァ シル基転移酵素遺伝子断片のク ローニング
リ ン ドウの花弁の R N Aに由来する 2本鎖 c D N A約 0 . 1 を铸型にオ リ ゴ 1 とオ リ ゴ 2 をプライマーと して、 P C R反応を行 つた。 反応はポ リ メ ラ一ゼチヱイ ン反応キッ ト G e n e A m p ( 宝酒造 （株） ） を用いて、 9 5 °C 1 分、 4 5 °C 1 分、 Ί 2 °C 2 分を 1 サイ クルと し、 3 5 サイ クル行い、 得られた反応物を 1 %ァガロ ース電気泳動したと ころ、 約 4 0 0 b pの特異的な D N A断片が観 察された。 この D N A断片を回収し、 その 1 O n gを D I G— ヌ ク レオチ ド混合液 （ベー リ ンガー社） と合成ヌ ク レオチ ド I と I I を 用いて、 前述の P C R反応を 2 5サイ クル行い、 D I Gで標識した D N A断片を得た。
( 4 ) ァ シル基転移酵素の c D N Aのク ローニング
上記のよ う に して得られた ス フ ァー ジライブラ リ 一を大腸菌 X L 1 一 B 1 u e株 （ス ト ラ タ ジー ン社） に感染させ、 1 プレー ト当り プラーク 5万個を含む 5枚のプレー ト （直径 1 3. 5 c m) をスク リ ーニングした。
フ ァージをフ ィ ルター （H y b o n d N +、 アマ一 シ ャ ム社） に吸着させ、 製造者の推奨する方法で処理した後、 このフ ィ ルター をノヽイ ブリ ダィゼー シ ヨ ンノく ッ フ ァー （ 5 X S S C、 5 0 %ホルム ア ミ ド、 5 0 mM リ ン酸ナ ト リ ウムノく ッ フ ァー （ p H 7. 0 ) 、 7 % S D S、 2 % B l o c k i n g r e a g e n t (ベー リ ン ガー社） 、 0. 1 %ラ ウ ロイルサルコ シ ン、 8 0 m g Zm l サケ精 子 D N A ) 中で 4 2 °Cで 1 時間保持した。 D I G標識した前述の D N A断片をハイプリ ダイゼーシ ョ ン液中に加え、 さ らに 1 6時間の ィ ンキュベー シ ョ ンを行った。
洗浄液 （ 0. 2 x S S C、 0. 1 % S D S ) でフ ィ ルタ一を洗浄 し、 ア ルカ リ ホ スフ ァ ターゼで標識された D I G特異的な抗体によ る酵素免疫測定法 （ベ一 リ ンガー ' マ ンハイ ム株式会社） によ り 5 一ブロモ 4 — ク ロ 口 3 —イ ン ド リ ノレリ ン酸とニ ト ロブノレーテ 卜 ラ ゾ リ ウム塩の発色反応によ って検出 した。 検出方法は製造者による使 用説明書に従った。
この結果、 数十個の陽性ク ロ ー ンが得られ、 う ち 2 0 ク ロー ンを ス ト ラタ ジーン社の推奨する方法で、 c D N Aをプラス ミ ド p B l u e s c r i p t S K 上に回収した。 ァガロースゲル電気泳動 で c D N Aの挿入を調べたと ころ、 全てのク ローンにおいて各種サ ィ ズの c D N Aの揷入が認められ、 そのう ち最長のものは 1 . 7 k bであった。 それらのう ちから適当に 9 ク ローン選び制限酵素によ る解析を行ったと ころ、 サイズは異なるが全てのク ロ ー ンで同様の 制限酵素パター ンを示した。
( 5 ) 塩基配列の決定
得られたク ロー ンからプラス ミ ドを抽出 し、 A B I 3 7 3 A · D N A シークェンサ一 （パーキンエルマ一社） を用い、 同社の推奨 する蛍光試薬によるダイデォキシ シ― クエンス法で、 前述の 9 ク ロー ンのう ち全長を含むと考えられる 6つのク ロー ン （ p G A T 2 、 p G A T 3、 p G A T 4 、 p G A T 7、 p G A T 8及び p G A T 1 1 ) について c D N Aの 5 ' 側の塩基配列を決定した。
その結果、 これらのク ローンは互いに同じ塩基配列を持っており 、 c D N Aの長さが異なる ものと考えられた。 これらのク ロー ンの う ち p G A T 4 の全塩基配列を決定した。 塩基配列の決定は、 K i l o— S e q u e n c e用 D e l e t i o n K i t (宝酒造 （ 株） ） を用いて、 一連の欠失ク ロー ンを得た後、 各々のク ロー ンを 用いて上述の方法により行った。
( 6 ) 塩基配列とァ ミ ノ酸配列の比較
P G A T 4 に挿入された c D N Aは 1 Ί 0 3塩基でありその中に 1 4 1 0塩基 （終止コ ドンを含む） からなるオープン リ ーディ ング フ レーム （ 0 R F ) が見い出された。 この配列を配列表 · 配列番号 1 に示す。 実施例 2で明らかになったァ シル基転移酵素の部分ア ミ ノ酸配列の全てが O R F中のァ ミ ノ配歹 ijと して存在する こ とから、 ク ロ—ニ ングされた c D N Aは、 リ ン ドウ由来のァシル基転移酵素 遗伝子であると結論した。 開始コ ド ンについては、 ァ ミ ノ末端の解 析からグルタ ミ ン酸がァ ミ ノ末端の残基である と推測されたので、 c D N Aの塩基配列の上で、 5 ' 側から最初の A T Gが開始コ ドン であると推察した。
—方、 p G A T 8に係る c D N Aは、 5 ' 側が p G A T 4 よ り も 7塩基短いため、 完全長の c D NAではないと考えられた。
実施例 4. 大腸菌における遺伝子の発現
( 1 ) 発現ブラス ミ ドの構築
大腸菌でのァシル基転移酵素遺伝子の発現には、 大腸菌の発現べ ク タ一である p T r c 9 9 A (フ アルマシア社） を用いた。 この ρ T r c 9 9 Aはイ ソプロ ピル _ — D—チォガラ ク 卜 ビラ ノ シ ド （ I P T G) で誘導可能な大腸菌の t r cプロモーターを含み、 その 下流に目的遺伝子を挿入する こ とにより、 大腸菌での遺伝子発現が 可能になる。
また、 制限酵素 N c 0 I部位が開始コ ドンである AT G配列を利 用 して導入されており、 N c 0 I部位で組換える こ とにより、 目的 遗伝子の開始コ ドンからの直接発現が可能である。
P G A T 4を当該ベク ター内に存在する制限酵素部位 E c 0 R I と K p n I で消化して得られる約 1. 8 k bの D N A断片 （配列表 • 配列番号 1記載の塩基配列を全て含む） を前述の p T r c 9 9 A の E c o R I 、 K p n I部位に組換えるこ とにより、 p G A T I O 1 を構築した。
ァ シル基転移酵素の開始コ ドン近傍に N c 0 I部位の導入を行う ために、 開始コ ド ン近傍、 及びァ シル基転移酵素遺伝子内部 （開始 コ ドンから 3 0 0塩基目付近） に対応する以下の 2種類のオ リ ゴヌ ク レオチ ドを合成した。
オ リ ゴヌ ク レオチ ド （ G A T _ N c o I ) ； 5' -TTCACCATGGAGCAA ATCCAAATGGT-3' (酉己歹リ番号 ： 18)
オ リ ゴヌ ク レオチ ド （ G A T— S c a I ) ; 5' -CGAGTCGCCCTCATC AC- 3' (配列番号 ： 19)
1 O n gの p G A T 4 を铸型と し、 上記のオ リ ゴヌ ク レオチ ドを プライマーと して P C R反応を行った。 反応はポ リ メ ラーゼチエイ ン反応キッ ト G e n e A m p (宝酒造 （株） ） を用いて、 9 5 °C 1 分、 5 6 °C 1 分、 7 2 °C 2 分を 1 サイ クルと し、 1 5 サイ クル行 い、 得られた反応物を 1 %ァガロース電気泳動したと ころ、 約 3 0 0 b pの特異的な D N A断片が観察された。 この D N A断片を回収 し、 制限酵素 N c o l と A a t l で切断後、 p G A T l O l を N c
0 I と A a t I で切断して得られる約 6 k bの断片と連結するこ と によ り、 P G A T 1 0 2 を構築した。 P C R法により増幅した部分 の塩基配列は p G A T 1 0 2構築後に p G A T 4 と同じであるこ と を確認した。
( 2 ) ァシル基転移酵素遺伝子の大腸菌での発現
P G A T 1 0 2 で大腸菌 MM 2 9 4 (supE44 hsdR endAl pro th
1 ) (Meselson and Yuan, Nature, 217, 1110-, 1968 ) を形質転 換した。 なお、 こ こで形質転換される宿主は、 形質転換用の宿主と して利用可能な大腸菌であれば特に特定される ものではな く 、 遺伝 子組換えに一般に用いられ、 当業者が容易に入手できるその他の株
(例えば、 J M 1 0 9 や D H 5 等） を利用するこ とができ る。 また 、 大腸菌の形質転換方法は H a n a h a nの方法に従った （J. Mo I . Biol. , 166， 557-, 1983) 。 形質転換された大腸菌をア ンピシ リ ン （ 5 0 〃 g /m l ) を含む 2 m 】 の L B培地 （ 卜 リ プ ト ン 1 0 g、 酵母エキス 5 g、 塩化ナ ト リ ウ ム 1 0 gを 1 リ ツ ターの蒸 留水に溶か し、 水酸化ナ ト リ ウムで p Hを 7 . 2 に調整する） に植 菌 し、 3 7 °Cで一晩培養した。 この培養液 l m l を 1 O m l の M 9培地 （ リ ン酸一水素ナ ト リ ウ ム 0. 6 %、 リ ン酸二水素カ リ ウ ム 0. 3 %、 塩化ナ ト リ ウ ム 0. 5 %、 塩化ア ンモニゥ ム 0. 1 %、 グルコ ース 0. 5 %
、 硫酸マグネ シウ ム 1 m M、 ビタ ミ ン B 1 4 〃 g Z m 1 、 p H 7. 2 ) にカザ ミ ノ 酸 0. 5 %と ア ン ピン リ ン 5 0 g /m l を加 えた培地に接種し、 3 7 °Cで 3 時間培養後、 0. 5 1^の 1 丁 0を 4 0 n 1 添加 （終濃度 2 mM) し、 更に 5時間培養を続けた。 集菌 後、 3 0 m M塩化ナ ト リ ウ ムを含む 3 0 m M ト リ ス塩酸バ ッ フ ァ ー ( p H 7. 5 ) で洗浄し、 洗浄菌体を同 じバ ッ フ ァ ー 1 m 1 に懸濁 した。 l m g リ ゾチーム、 0. 2 5 M E D T Aを 2 5 〃 1 加えて 3 0分間 0 °Cに放置 した後、 凍結 · 融解を 3回繰り返して菌体を破 壊した。
これを 1 5 0 0 0 r p m、 3 0分間遠心をして得た上清を粗酵素 液と し、 実施例 1 ( 3 ) で示した酵素活性測定法により酵素活性を 測定した。 マイ ク ロ タイ タ一プレー ト法により、 p G A T l 0 2 を 導入した大腸菌ではァ シル基転移反応が確認されたので、 H P L C による分析を行った。
その結果、 p G A T l 0 2を導入した大腸菌では 2 4 n m o 1 の デルフ ィ 二 ジ ン 3， 5 — ジグルコ シ ドと 2 1 . 5 n m 0 1 のカ フ ェ オイ ル一 C o Aカヽら 1 8. 3 n m o l のデルフ ィ 二 ジ ン 3 — ダルコ シル 5 — カ フ ヱオイ ルグルコ シ ドの生成が認め られた。
この結果と、 リ ン ドウのア ン ト シァニ ンにおいては 5位と 3 ' 位 のグルコースにァ シル基が結合しているという既知の事実と併せて 考える と、 P G A T 4 がコー ドするァ シル基転移酵素はア ン ト シァ 二 ジ ン 3， 5 — ジ グルコ シ ドの 5位の グルコ ースにァ シル基を転移 する反応を触媒する こ とが判った。
また、 大腸菌で生産されたァ シル基転移酵素によ り ァ シル化され たデルフ ィ 二ジ ン 3， 5 — ジグルコ シ ド も、 リ ン ドウ力、ら精製して 得られたァシル基転移酵素によりァシル化されたものと同様に室温 で長期間放置しても安定な発色を示した。
実施例 5. 酵母における遺伝子の発現
( 1 ) 酵母の発現べク 夕一
酵母の発現ベク ターは、 特開平 4 一 2 2 8 0 7 8 に記載の p Y E 2 2 mを使用 した。
( 2 ) ァ シル基転移酵素遺伝子の酵母での発現
P G A T 4又は p G A T 8 を当該各ベク ター内に存在する制限酵 素部位 E c o R I と K p n l で消化して得られる約 1 . 8 k bの D N A断片と p Y E 2 2 mを同じ く E c o R I と K p n I で消化して 得られる約 8 k bの D N A断片を連結して酵母発現プラ ス ミ ド p Y G A T 4 と p Y G A T 8 を各々構築した。 p Y G A T 4 は第 1 番目 のメ チォニンからの翻訳を行う力 <、 p Y G A T 8では分離した c D N Aの 5 ' 側の一部が欠けているため、 ァ シル基転移酵素の翻訳開 始メ チォニ ン （配列表 · 配列番号 1 におけるァ ミ ノ酸配列番号 ； ― 1 ) ではな く 、 次のメ チォニン （配列表 · 配列番号 1 におけるア ミ ノ酸配列番号 ； 5 ) からの翻訳が行われる。
これらの酵母発現プラス ミ ドでは、 ァ シル基転移酵素をコー ド し ている c D N Aは酵母の構成的なプロモーターのひとつであるグリ セロアルデヒ ドー 3 リ ン酸脱水素酵素のプロモーターの下流に連結 されており、 同プロモーターにより転写が制御されている。
伊藤らの方法 （ Uo et al. J. Bacteriol. , 153, 163-168, 1983 ) を用い p Y G A T 4及び p Y G A T 8で、 酵母 Saccharomyces ce rev i s i ae G1315 Ash i kar i e t al. 、 App 1. icrobiol. Biotech nol. 30, 515-520, 1989) を形質転換した。 形質転換された酵母は ト リ ブ ト フ ア ンの合成能の回復によ り選択した。 なお、 こ こで形質転換に用いる酵母の宿主は特に限定される もの ではな く 、 T R P 1 遺伝子が不完全なために ト リ プ ト フ ァ ンの要求 性を示す株であれば何れのものでも用いる こ とができる （例えば、 イース ト · ジエネテイ ク · ス ト ッ ク · センターより購入可能 （Y e a s t G e n e t i c S t o c k し e n t e r ； B e r k e l e y、 C A、 U S A ; カ タ ロ グ第 7版 （ 1 9 9 1 年） 第 3 6頁 得られた形質転換株を 1 O m l の 1 %カザ ミ ノ酸 （D i f c o社 ) を含むバーク ホルダ一培地 （Burkholder, Amer. J. Bot. 30， 20 6-210 ) にて、 3 0 °Cで 4 0時間振盪培養した。 併せて、 対照実験 のために、 ト リ ブ トフ ァ ンの合成能を自然に回復した酵母も同様に iロ し 。
これらを集菌後、 同量の菌体破砕用バッ フ ァ一 （ 3 0 mM ト リ ス塩酸 p H 7. 5 , 3 0 mM 塩化ナ ト リ ウム） で洗浄し、 さ らに 1 m 】 の同 じバ ッ フ ァ ーにサスペン ド し、 1 . 5 m 1 のエツベン ド ルフ チュ ーブに移 した。 遠心分離後、 上清を除き 0. 4 m 1 の同 じ バ ッ フ ァ ーで沈殿菌体を再度サスペン ド し、 4 0 0 m gのグラ ス ビ —ズ ( G l a s s B e a d s 4 2 5 - 6 0 0 m i c r o n s A c i d —W a s h、 シグマ社） を加えて激し く 振盪する こ とによ り、 酵母菌体を破砕した。
遠心分離後の上清を粗酵素液と し実施例 1 ( 3 ) で示した酵素活 性測定法によ り酵素活性を測定した。 マイ ク ロ タイ タープレー ト法 によ り、 p Y G A T 4及び P Y G A T 8 を導入した酵母は何れもァ シル基転移反応が確認されたので、 H P L Cによる分析を行った。 なお、 対照に用いた酵母ではァ シル基転移活性は認められなかった その結果、 p Y G A T 4 及び p Y G A T 8 を導入した酵母では 2 4 n m o 1 のデノレフ ィ ニ ジ ン 3 , 5 — ジグノレコ シ ドと 2 1 . 5 n m o l のカ フ ェオイノレ一 C o Aカヽら各々 1 6. 6 n m o l と 2 0. 9 n m 0 1 のデルフ ィ 二 ジ ン 3 — グルコ シル 5 — カ フ ェオイ ノレグルコ シ ドの生成が認められた。 p Y G A T 4 と p Y G A T 8から生産さ れる蛋白質はそのア ミ ノ末端が異なるが、 と もにァシル基転移酵素 活性を保持していた。
また酵母で生産されたァ シル基転移酵素により ァシル化されたデ ルフ ィ 二ジン 3， 5 — ジグルコ シ ドも、 リ ン ドウから精製して得ら れたァシル基転移酵素によ り ァ シル化されたものと同様に室温で長 期間放置しても安定な発色を示した。
実施例 6. リ ン ドウ由来のァシル基転移酵素の c D N Aク ロ一二 ング （ 2 )
実施例 3 ( 6 ) に記載の p G A T 4、 即ち配列表 · 配列番号 1 記 載の D N Aを有する p G A T 4 を、 制限酵素 E c o R I と N d e I で消化して得られる D N A断片のうち、 ァシル基転移酵素の翻訳領 域を含む D N A断片 2つをま とめて回収し、 前述の方法で D I G標 識した。 これをプローブと して実施例 3 ( 4 ) に記載した リ ン ドウ の花弁の c D N Aライブラ リ ーのフ ァージを吸着させたフ イ ノレター (H y b o n d N +、 アマ一シ ャ ム社） を、 製造者 （アマー シ ャ ム社） が推奨する方法でフ ィ ルターに結合した色素及び D I G標識 を除去して再生した後、 低濃度ホルムア ミ ドハイ ブリ ダィゼー シ ョ ンノく ッ フ ァ ー （ 5 x S S C、 3 0 %ホルムア ミ ド、 5 0 mM Tris- HC1 、 pH 7.5、 1 % S D S ) 中で 4 2度で 1 6 時間ハイブリ ダィ ズ した。
洗浄液 （ 5 x S S C、 0. 1 % S D S ) 中で 5 0度で洗浄し、 実 施例 3 ( 4 ) に記載したよ う に発色させた。 数十のク ロー ンが発色 したが、 発色したク ロー ンのう ちで、 実施例 3 ( 4 ) では発色しな かったク ローンを 1 2 個得た。 これらのク ロー ンの c D N Aの塩基 配列を先に述べたよ う な方法で、 5 ' 側から決定したと ころ、 1 1 ク ローンは P G A T 4 の塩基配列と一致したが、 1 ク ロー ンは一致 しなかった。 これを p G A T l 0 6 と した。
p G A T 1 0 6 の全塩基配列を先に述べたよ う に して決定した。 p G A T 1 0 6 に挿入された c D N Aは 1 6 2 2塩基でありその中 に 1 4 4 0 塩基 （終止コ ド ンを含む） からなる 0 R Fが見い出され た。 これを配列表 · 配列番号 2 に示す。 配列番号 2 が含む〇 R Fに ついて、 p G A T 4 がコー ドするア ミ ノ酸配列と全領域にわたって 、 相同性を調べた。 そのホモロ ジ一は、 3 8 %であった。
p G A T 1 0 6 のコー ドするァ ミ ノ酸配列は、 ァシル基転移酵素 である p G A T 4 のコー ドしている酵素と相同であるため、 同様な 酵素活性、 つま り ア ン ト シァニ ンにァ シル基転移を触媒する活性を 持っている と推測される。 リ ン ドウのア ン ト シァニ ンは、 5 位と 3 ， 位のグルコースにァ シル基が結合しているので、 p G A T 1 0 6 がア ン ト シァニンの 3 ' 位のグルコースにァ シル基を転移する酵素 反応を触媒するこ とを示唆する。 また、 この結果はァ シル基転移酵 素は、 ァ シル基を転移するア ン ト シァニ ンの糖の位置は異なってい ても、 ア ミ ノ酸配列及びそれをコー ドしている塩基配列は相同であ る こ とを示している。
先に述べたよ う にァシル基を有するア ン ト シァニンは多数存在し 、 これら化合物のァ シル基の数や位置は多様性に富み、 ァ シル基の 転移反応を触媒する酵素も多数ある こ とが推測されるが、 それらの 酵素のア ミ ノ酸配列は、 こ こで得られた p G A T 4 及び p G A T 1 0 6 のア ミ ノ酸配列と相同性がみられる こ とは容易に類推でき、 こ れに基づき、 他のァ シル基転移酵素遺伝子を得る こ とができ る。
実施例 7 . ペチ ュニアのア ン ト シァニ ン ペチ ュ ニア （Petunia hybr i da ) 品種サ フ ィ ニァパープル （サ ン 卜 リ ー （株） ） の花色が通常の赤紫から紫に変異した変異株 （ V M) のア ン ト シァニンを、 その花弁を液体窒素中で粉砕し、 5 0 % ァセ トニ ト リ ル、 0 . 1 % T F A水溶液で抽出 した。 濾過後、 濾液 を O D S、 O D Pの逆相カラムク ロマ ト グラ フ ィ ーで分離、 精製し た。 そのう ちの一つの化合物の構造を F A B M S、 1 H N λΐ R、 1 3 C N M Rを用いて、 詳細に解析したと ころ、 新規なア ン ト シァ ニンを見いだした。 その構造を以下に示す。
Figure imgf000033_0001
即ち、 こ の構造は 3-0- (6- 0- (4-0-(4-0- (6- 0-カ フ ヱオ イ ル- S - D - グノレ コ ピラ ノ ンノレ）-ク マ ロ イ ノレ）- -し- ラ ム ノ ンノレ）- /3 - D - グル コ ピラ ノ シル） -5- 0_ /3 - D- グルコ ビラ ノ シル- マルビジ ンであり、 ァ シル基力く 2 つ結合したア ン ト シ ァニンであった。
また、 3-0- (6-0- ( 0-(4-0- (6-0-クマロイル- S -D- ダルコ ビラ ノ シノレ）-ク マ ロ イ ノレ） -ひ -し- ラ ム ノ シル）- 5 - D- ダルコ ビ ラ ノ ンノレ )-5-0- β -D- グル コ ピラ ノ シル - マル ビ ジ ン、 3- 0-(6-0-(4-0- (4-0 -(6-0-カ フ ェ オ イ ル - 3 -D- グル コ ピラ ノ シル） -カ フ ェ オ イ ノレ）-ひ - L- ラ ム ノ シル） - /3 -D- グルコ ビラ ノ シル）- 5- 0- /9 -D- ク"ノレコ ピ ラ ノ シル - マル ビ ジ ン、 3-0- (6-0-(4-0-(4- 0-(6- 0-ク マ ロ イ ル - - D - ダルコ ピラ ノ シル） -カ フ ェオイ ル）-ひ - L- ラ ム ノ シル） - /3 - D- グ ルコ ビラ ノ シル） - 5-0- /3 - D - グルコ ピラ ノ シル- マルビジ ン も検出 された。 このア ン ト シァニ ンは、 V Mの花弁のみな らず、 フ ルコ ン ブルー （サカ タのタネ （株） ） 、 Old Glory BlueCBal 1 Seeds)など の濃い紫色の花弁にも存在しているこ とがわかった。 即ち、 ァ シル 基を 2 つ持つア ン ト シァニンはペチュニアの濃い紫色に寄与してい る と思われる。
従って、 ペチュニア由来のア ン ト シァニ ンに関するァ シル基転移 酵素には、 アン ト シァニ ンの 3 位のルチノ シ ドにクマル酸又はカ フ ェ酸を転移する反応を触媒する酵素と、 モ ノ ァ シルマルビジ ンにグ ルコースを介してクマル酸又はカフ 二酸を転移する反応を触媒する 酵素の 2 種類がある こ とを示唆する。
実施例 8 . ペチュニア由来のァ シル基転移酵素の c D N A ク ロー 二ング
実施例 3 ( 6 ) に記載の p G A T 4 、 即ち配列表 · 配列番号 1 記 載の D N Aを有する p G A T 4 の c D N A部分を、 前述の方法で D I G標識し、 ペチュニア （Petunia hybr ida ) 品種オール ドグロ 一リ ーブル一の花弁の c D N Aライブラ リ ー （Nature, 366, 276-27 9, 1993) をプラークハイブリ ダィゼー シ ヨ ンの手法により、 スク リ 一二ングした。 ハイ ブリ ダィゼ一シ ヨ ンと洗浄は、 実施例 6 と同様 の条件で行った。
約 2 0 万ク ロー ンをスク リ ーニングし、 弱く ハイ ブリ ダィ ズする ク ロー ンを 1 つ得た。 このク ロー ンを p P A T 5 と した。 塩基配列 を決定したと ころ、 P P A T 5 には複数の D N Aが挿入されていた 。 すなわち、 プラ ス ミ ドの リ バースプラ イマー側に、 p G A T 4 お よび p G A丁 1 0 6 のコー ドする蛋白質の C末端の配列に似た配列 が存在した。 そこで、 リ ノく一スプライマーのもとに、 ヌ ク レオチ ド 配列 ； 5' -AACAGCTATGACCATG- 3' (配列番号 ： 20) を合成し、 このォ リ ゴヌ ク レオチ ドを R Pプライマーと した。
P P A T 5 の c D N Aの完全長を取得するために、 R Pプライマ 一、 オ リ ゴ 2 プライマー各 1 0 0 n g、 X h o I で消化した p P A T 5 · 1 0 n gを最終体積 5 0 1 で、 P C R反応を行った。 反応 は、 9 5 °C 1 分、 5 5 °C 1 分、 7 2て 1 分を 1 サィ クルと し、 2 0 サイ クル行った。 得られた約 6 0 0 b pの D N A断片をァガロース 電気泳動後、 ジー ンク リ ー ンで精製した。 この断片を S m a l で酵 素消化した後、 約 4 0 0 b pの D N A断片を同様に精製した。 この D N A断片を前述の D I Gで標識した。
この標識した D N A断片を用いて、 前述のペチュニアの花弁 c D N Aライブラ リ ーをプラークハイブリ ダイゼーシ ョ ンの手法を用い て、 スク リ ーニングした。 ハイブリ ダィゼーシ ヨ ン後の洗浄は、 0 . 2 X S S C、 6 5 °C、 1 時間と した。 得られたク ローンから回収 したプラス ミ ドの塩基配列を決定したところ、 p P A T 4 8 力く、 p P A T 5 と同じ配列を含むこ とがわかつた。 これを配列表 · 配列番 号 3 に示す。 この配列は、 p G A T 4 と p G A T 1 0 6 に対して、 ア ミ ノ酸配列レベルで、 それぞれ 2 0 %、 1 6 %のホモロ ジ一があ つた。
実施例 9 . シソ由来の粗酵素液の抽出
シ ソ (Peri 11a ocimoides ) · 品種赤チ リ メ ンの植物体から、 赤い若い葉を採集し、 実施例 1 ( 2 ) に記載の方法に従って、 粗酵 素液の抽出を行った。 最終濃度 5 0 m M リ ン酸カ リ ウ ム （ p H 8 . 5 ) 、 0 . 4 8 m Mデルフ ィ 二ジ ン 3， 5 — ジグルコ シ ド、 0 . 4 3 mMカ フ ェオイ ル一 C o A と 2 0 1 の酵素液を含む 5 0 1 の 混合物を 3 0 °Cで 1 0 分間反応させた。 反応液に 1 3. 8 %の酢酸 を含む 5 0 u ] のァセ トニ ト リ ルを加えて反応を停止した。 1 5 0 0 0 回転で 5 分間遠心した後、 上清のう ちの 1 0 1 を以下の条件 で H P L Cにて解析した。
カラムは YMC- Pack ODS- A (6.0 X 15cm) を用い、 0 . 1 % ト リ フ ルォロ酢酸、 2 1 . 6 %ァセ トニ ト リ ルの溶媒で、 流速 l m l /分 の条件でサンプルを分離した。 検出は、 5 2 0 n mで行った。 この 条件で未反応のデルフ ィ 二ジ ン 3 , 5 — ジグルコ シ ドは、 3 分で、 デルフ ィ 二ジ ン 3， 5 ー ジグルコ シ ドの 3 位にカフ ヱ酸が転移 した ものは、 4 . 7 分に溶出され、 この化合物の吸収極大値は、 5 3 1 n mであ つ 7"こ。
基質と して、 デルフ ィ 二ジン 3 —グルコ シ ドを用いた場合も、 力 フ エ酸による修飾が見られた。 また、 ァシル基の供与体と して、 ク マロイルー C o Aを用いても、 クマール基の転移が見られた。 シ ソ は天然にはア ン ト シァニンと してデルフ ィ 二ジングルコ シ ドは含ま ない力く、 シ ソのァ シル基転移酵素はデルフ ィ 二ジ ン 3 — グルコ シ ド とデルフ ィ 二ジ ン 3， 5 — ジグルコ シ ドをァシル基受容体と して、 クマロイルー C o Aをァシル基供与体と して利用できるこ とがわか つ た。
実施例 1 0. シ ソ由来のァ シル基転移酵素の精製
シ ソ ァ シル基転移酵素の精製は、 実施例 2 ( 1 ) に準じて行った 。 3 k gの シ ソの葉を、 液体窒素で凍結させ、 凍結したままホモ ジ ナイザーで、 粉砕した。 粉末状になったものに 1 0 1 の抽出緩衝液 ( l O O mM リ ン酸ナ ト リ ウム、 p H 6 . 8、 l O mMァスコルビ ン酸ナ ト リ ウ ム、 5 mMジチオス レォ ト ール、 1 0 / M p - A P M S F、 5 % (wZ v ) ポ リ ク ラ一ノレ S B — 1 0 0 ) 中で、 再び、 ホモジナイザーで磨砕した。 これを 4 層に重ねたガーゼで濾過後、 遠心分離 （ 8 0 0 0 回転、 4 度、 3 0 分） を行った。 上清に 4 0 % 飽和になるよう に硫酸ア ンモニゥムを加えて、 溶解後、 同 じ条件で 遠心分離を行う。 上清に 7 0 %飽和になるよう に硫酸ア ンモニゥム を加え、 溶解後、 同 じ条件で遠心分離を行う。 沈殿を最小量の脱塩 緩衝液 （ ビス ト リ ス塩酸、 ρ Η 6 · 3、 I mMジチオス レイ ト 一ル 、 1 0 〃 M p _ A P M S F、 1 0 %グリ セ ロ ール） に溶解した後 、 同 じ緩衝液で平衡化したセフ アデッ クス G— 2 5 メ ディ ウム （フ ア ルマ シア社、 9. 5 X 4 5 c m) で脱塩した。
脱塩したサ ンプルを Q—セフ ァ ロ ースフ アース ト フ ロー 2 6 / 1 0 を用いたイ オ ン交換ク ロマ 卜 グラ フ ィ 一を行った。 脱塩緩衝液を もとに した塩化ナ 卜 リ ウムの 0から 0. 5 Mの直線濃度勾配を 8 m 1 分の流速で 1 時間かけて行った。 活性画分は、 食塩濃度 0. 1 5から 0. 3 M付近で溶出された。 この活性画分を、 脱塩緩衝液で 平衡化した HiTrapBlue ( 5 m l ) を 4本直列に接続したカ ラ ムに吸 着させた。 同じ緩衝液でカラムを良く 洗浄した後、 脱塩緩衝液をも とに した 0から 1 Mの塩化ナ ト リ ウムの直線濃度勾配 （ 2時間、 流 速 5 m l 分） で溶出 した。 活性画分は塩化ナ ト リ ウム濃度 0. 8 カヽら 0. 9 Mで溶出 した。 この画分を次にヒ ドロキンアパタイ ト 力 ラム （セラ ミ ッ ク タイプ 11 4 0 mm ; ノくィオラ ド社） でク ロマ ト グラ フ ィ ーを行った。 緩衝液 A ( 5 O mMリ ン酸ナ ト リ ウ ム、 p H 6. 8 、 I mMジチオス レィ ト ール、 1 0 M p — A P M S F、 1 0 %グリ セロール） で、 サンプルをかけたカラムをよ く 洗浄し、 緩衝液 Aから緩衝液 B ( 4 0 O mMリ ン酸ナ ト リ ウム、 p H 6. 8 、 I mMジチオス レイ ト 一ル、 1 0 / M p — A P M S F、 1 0 % グリ セロ ール） への直線濃度勾配 （ 1 時間、 流速 2. 5 m 1 ノ分） で酵素を溶出 したと ころ、 約 0. 2 Mリ ン酸ナ ト リ ウ ムで溶出 し
。 この活性画分を用いて酵素の生化学的性質を調べた。
粗酵素標品を用いた場合と同様に、 ァ シル基の受容体と しては、 シァニ ジ ン 3 — グルコ シ ド、 シァニ ジ ン 3， 5 — ジ グルコ シ ド、 デ ルフ ィ 二ジ ン 3 — グルコ シ ド、 デルフ ィ 二ジ ン 3 ， 5 — ジ グルコ シ ドのいずれを用いる こ とができた。 ァシル基の供与体と しては、 ク マロ イ ノレ 一 C o Aでも、 カ フ ヱ オイ ル一 C o Aで も用いる こ とがで きた。 また、 S D S ポ リ ア ク リ ルア ミ ド電気泳動から、 分子量は約 5 0 0 0 0 であった。 等電点は、 Mono-P力ラム （フ アルマシア社） を用いて、 5 . 3 と決定した。
実施例 1 1 · シソ由来のァ シル基転移酵素の c D N A ク ロ ーニン 実施例 3 、 実施例 6 及び実施例 8 でク ローニングした p G A T 4 、 p G A T 1 0 6 . P P A T 4 8 の構造を比較する と、 ア ミ ノ酸配 列 ； Asp- Phe-Gly-Trp- G - Lys (配列番号 ： 21) が保存されている こ とがわかった。 従って、 この構造は、 ァシル基転移酵素において保 存されているこ とが予想される。 そこで、 この配列をもとに、 ヌ ク レオチ ド配列 ； 5' - GA(TC)TT(TC)GG1TGGGG1AA- 3' (配列番号 ： 22) を 合成し、 このォ リ ゴヌ ク レオチ ドを A T Cプライマーと した。
シ ソの若い葉から R N Aを実施例 3 に記載の方法で抽出 し、 同 じ く 、 Z A P — c D N A合成キ ッ ト （ス ト ラ タ ジー ン社製） を用い、 c D N Aライブラ リ ーを作製した。 この際にできた 2 本鎖の c D N A約 5 0 n gを铸型に して、 A T Cプライマーとオ リ ゴ 2 プライマ —を各 1 0 O n g用い、 最終体積 5 0 1 にて、 P C Rキ ッ ト （宝 酒造 （株） 製） を用いて、 P C R反応を行った。 反応は、 9 5 °C 1 分、 5 0 °C 1 分、 7 2 °C 1 分を 1 サイ クルと し、 2 5 サイ クル行つ た。 得られた約 4 0 O b pの D N A断片を回収し、 T A ク ローニン グキッ ト （ Invi trogen社） を用いて、 ベク タ一にク ロ一ニングした 。 得られたク ロー ンの塩基配列を決定したと ころ、 p S A T l 0 4 と したク ロー ンが p G A T 4 に対して高いホモロ ジ一を示 した。
1 O n gの p S A T l 0 4 を铸型に して、 A T Cプラ イマーとォ リ ゴ 2 プライマーを各 1 0 0 n g用いて、 最終体積 5 0 1 にて、 P C Rキッ ト （宝酒造 （株） 製） を用いて、 P C R反応を行った。 反応は、 9 5 °C 1 分、 5 0 °C 1 分、 7 2 °C 1 分を 1 サイ クルと し、 1 5 サイ クル行った。 この反応物の 1 1 を用い、 A T Cプライマ 一とオ リ ゴ 2 プライマーを各 1 0 O n g用いて、 最終体積 5 0 1 にて、 同様に P C Rキッ 卜を用いて、 P C R反応を行った。
ただし、 この際デォキシヌ ク レオチ ド溶液と して、 D I G標識ヌ ク レオチ ド溶液 （ベー リ ンガー社製） を 4 〃 1 用いた。 反応終了後 、 5 1 の 3 M酢酸ナ ト リ ウムと 1 0 0 1 のエタ ノ ールを加え、 エタ ノ ール沈殿を行い、 以後の実験に用いた。
この P S A T 1 0 4 由来の標識 D N Aを用いて、 シソの葉の c D N Aライ ブラ リ ーをプラークハイブリ ダイゼ一シ ョ ンの手法でスク リ ーニングした。 洗浄は、 1 X S S C、 6 5 。Cで 1 時間行った。 ノヽ イブリ ダイ ズしたク ロー ンの塩基配列を決定したと ころ、 p S A T 2 0 6 、 p S A T 2 0 7 , p S A T 2 0 8 、 p S A T 2 0 9 、 p S A T 2 1 0 などのク ロー ンが p S A T 1 0 4 の塩基配列を含んでい る こ とがわかった。 これらのク ロー ンの 5 ' 側の塩基配列を p G A T 4 と比較したと ころ、 どのク ローンも p G A T 4 よりア ミ ノ末端 が短く 開始コ ド ンも見られなかった。 また、 p S A T 2 0 6 と p S A T 2 0 8 、 5 八丁 2 0 9 と 0 3 八丁 2 1 0 は、 5 ' 側の塩基配 列は同一であった。 P S A T 2 0 7 は、 p S A T 2 0 6 よ り 6 残基 、 P S A T 2 0 9 は P S A T 2 0 6 よ り 5 残基短かった。
ベク ター pBluescript SK 上で、 これらの c D N Aは、 ベク ター のし a c Z遺伝子と融合でき る形となっている。 上のク ロー ンの内 、 p S A T 2 0 6 、 p S A T 2 0 8 、 p S A T 2 0 7 は、 L a c Z のコー ド している大腸菌の 3ガラ ク ト シダーゼと融合蛋白と して発 現できる形になっている力く、 p S A T 2 0 9 と p S A T 2 1 0 は、 フ レームがずれているので融合蛋白質とはな らない。 p S A T 2 0 6 、 p S A T 2 0 7 、 p S A T 2 0 9 、 p S A T 2 1 0 を大腸菌で 発現させ、 デルフ ィ 二ジン 3 ， 5 — ジグルコ シ ドとカフ ェオイノレ一 C o Aを用いて、 3位のグルコースへのァ シル基転移酵素活性を測 定した。 発現の誘導などの方法は、 実施例 4 に記載の方法に従った p S A T 2 0 9 、 p S A T 2 1 0 を含む大腸菌は、 ァ シル基転移 酵素活性を全く 示さなかったが、 p S A T 2 0 6 を含む大腸菌は、 デルフ ィ 二 ジ ン 3， 5 — ジ グルコ シ ドの 4 8 %をァ シル化する酵素 活性を示し、 P S A T 2 0 7 を含む大腸菌は同 じ く 2 4 %をァ シル 化する酵素活性を示した。 このこ とから、 得られた P S A T 2 0 6 、 p S A T 2 0 7 などは、 シ ソのア ン ト シァニ ンの 3位の グルコ 一 スにァ シル基を転移する酵素活性を持つ遺伝子をク ローニ ングでき たこ とが証明できた。
これらのク ロー ンの内、 p S A T 2 0 8 の c D N A由来の塩基配 列を決定した。 これを配列表 · 配列番号 4 に示す。 その塩基配列か ら推定されるア ミ ノ酸配列は、 p G A T 4 、 p G A T 1 0 6 、 p P A T 4 8 に対して、 3 7 %、 2 9 %、 1 5 %のホモロ ジ一を示した 先に述べたよう にこの配列は、 完全長の c D N Aではないが、 L a c Z との融合遺伝子などと して、 適当な開始コ ド ンを与える こ と で、 活性のある酵素を発現でき る。
また、 このよ う に本発明で明らかになったァ シル基転移酵素のァ ミ ノ酸配列を比較する こ とによ り、 保存されている領域が明らかに なった。 こ の領域のア ミ ノ酸配列をもとにすれば、 ア ン ト シァニ ン の他の位置の糖を修飾するァ シル基転移酵素をク ローニ ングする こ とができ る。
実施例 1 2 · サイネ リ ア由来のァ シル基転移酵素の c D N A ク ロ —ニング
サイネ リ ア （Senecio cruentus) 品種ジュ ピターブルー （サカ タ ノ タネ） の花弁から実施例 3 に記載の方法で R N Aを抽出 し、 さ らに P o 1 y A + R N Aを精製した。 Z A P — c D N A合成キッ ト (ス トラ タ ジーン社製） を用いて、 c D N Aライブラ リ ーを作製し た。
この際にできた 2 本鎖の c D N A約 5 O n gを铸型に して、 A T Cプライマ一とオ リ ゴ 2 プライマ一を各 1 0 O n g用い、 最終体積 5 0 1 にて、 宝の P C Rキッ トを用いて、 P C R反応を行った。 反応は、 9 5 °C 1 分、 5 0 °C 1 分、 7 2 °C 1 分を 1 サイ クルと し、 2 5 サイ クル行った。 得られた約 4 0 0 b pの D N A断片を回収し 、 T A ク ローニングキッ ト （ Invi trogen社） を用いて、 ベク タ一に ク ローニングした。 得られたク ローンの塩基配列を決定したと ころ 、 J A T 4 と したク ローンが p G A T 4 に対して高いホモロ ジ一 を示した。
次にサイネ リ アの花弁 c D N Aライブラ リ ーを p J A T 4 でスク リ ーニングした。 いく つかのク ローンが得られた力く、 それらの c D N Aの 5 ' 末端側の塩基配列から類推したア ミ ノ酸配列は、 p G A T 4 のコー ドしている蛋白質の配列と比較してみると、 サイネ リ ア のク ローンの c D N Aはいずれも完全長ではなかった。 そのう ち、 P C A T 8 と したク ローンの c D N Aの前塩基配列を決定した。 こ れを配列表 · 配列番号 5 に示す。 その塩基配列から推定されるァ ミ ノ酸配列は、 p G A T 4 、 p G A T 1 0 6 、 p P A T 4 8 、 p S A T 2 0 8 に対してそれぞれ 2 8 %、 3 5 %、 1 6 %、 3 7 %のホモ 口 ジーを示 した。
実施例 13. リ ン ドウ由来のァシル基転移酵素遺伝子を含むバイ ナ
リ ベク タ一の作製 リ ン ドウのァシル基転移酵素遺伝子 p G A T 4 を Kpn 1で完全に消 化した後、 Xba Iで部分消化して得られる約 1 . 6 k bの D N A断片 を回収した。 この D N A断片を p U C l 9 の Kpnlと Xbalの制限酵素 認識部位を用いてサブク ロー ニ ングし、 プラ ス ミ ド p U C G A T 4 を得た。 p U C G A T 4 を Bgl 11 で完全消化したのち、 Saclで部分 消化し、 約 0 . 9 5 k bの D N A断片を回収した。 この D N A断片 と、 p U C G A丁 4 を Xbalと Bgl l l で消化して得られる約 0 . 7 5 k bの D N A断片と、 プラス ミ ド p 2 1 1 3 G (たとえば、 Aida e t al. , Acta Horticulture, 392, 219-225, 1995に g己載されている ) を Xbalと Saclで消化して得られる D N A断片をライゲ一シ ョ ン し て得られるプラ ス ミ ドを P B E G A 4 と した。 このプラ ス ミ ドは、 ノくイ ナ リ 一ベク ターであり、 リ ン ドウのァ シル基転移酵素 c D N A は、 植物細胞内においては、 ェンハンサ一を有するカ リ フ ラ ワ ーモ ザイ ク ウ ィ ルス 3 5 S プロモーターと ノ ノ リ ン合成酵素ター ミ ネ 一 ターの制御下にある。 また、 リ ン ドウ ァ シル基転移酵素 c D N Aの 5 ' 末端に、 Ω配列と呼ばれる翻訳のェンハンサーを含んでいる。 この際、 プロモータ一やター ミ ネータ一は本記載に限定される もの ではな く 、 構成的なプロモーターであっても、 また、 カルコ ン合成 酵素遺伝子のプロモーター等のように花弁で特異的に働く ものであ つても良い。
実施例 . リ ン ドウ由来のァシル基転移酵素遺伝子の植物への導
Λ
p B E G A 4 を Plant Molecular Biology Manual (K 1 uwer Acade mi c Publ ishers) に言己載さ 1ている方法で、 Agrobac ter i urn tumef a cienceの A g 1 0 株 ( Lazo et al. , Bio/Technology, 9, 963-967, 1991)に導入した。 一方、 バラ品種ラバンデの茎頂を、 M S培地に B A ( 6 —ベン ジルァ ミ ノ プ リ ン） 2 . 2 5 m g / G A 3 ( シ べ レ リ ン酸） 3 . 4 6 m g Z l 、 蔗糖 3 0 g Z l 、 ジ ヱラ ンガム 2 g / 1 を加えた固体培地で培養して Embriogenic Callus ( E C ) を 得た。 前述の A g l 0株を L B培地で一晩振と う培養したものを 2 0 g /m 1 のァセ ト シロ ンゴンを含む M S液体培地に懸濁し、 約 5 X 1 0 " c e 1 1 s Zm l の濃度に調整した。 この菌液中に E C を 5 分間浸潰した後、 滅菌濾紙で余分な液を十分に拭き取り、 B A 2 . 2 5 m g / U G A 3 0 . 3 5 m g Z l 、 蔗糖 3 0 g Z l 、 ジエラ ンガム 2 g / 1 を加えた M S培地に移植し培養するこ とによ り、 形質転換体を得る こ とができる。 得られたカナマイ シ ン抵抗性 カルスから、 ト リ ゾ一ル （ライ フテ ッ クオ リ エンタル社） を用いて R N Aを得た。 この R N Aを铸型にして、 P G A T 4 の塩基配列を もとに して合成したヌ ク レオチ ド G A T— 1 ； 5' -TGGCAACTGTCTTGC GTCATG-3' (配列番号 ： 23) と、 ヌ ク レオチ ド G A T— 2 ； 5' -CCATG TCAGGTGTGAGGTTCAAC-3' (配列番号 ： 24) をプライマ一と して用いて 、 アクセス R T— P C R システム （プロメ ガ社） を使用 して、 R T— P C R反応を行った。 また、 同 じ R N Aを铸型と して、 バイナ リ 一べク ター上の np U I の塩基配列にもとづいて合成したオ リ ゴヌ ク レオチ ド K a n — 1 ； 5' -ATCGTTTCGCATGATTGAAC-3' (配列番号 ： 25) と、 ヌ ク レオチ ド K a n — 2 ； 5' -TCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3' ( 配列番号 ： 26) とを用いて、 同様に R T— P C R反応を行った。 反 応は、 9 4 °C 3 0秒、 6 0 °C 1 分、 6 8 °C 2 分を 1 サイ クノレと し、 4 0 サイ クル行った。 形質転換体のカルスからは、 p G A T 4 に由 来するバン ド及び npti l に由来するバン ドが観察されたが、 非形質 転換体のカルスからはこれらに対応するバン ドは検出できなかった
。 この結果は、 リ ン ドウのァシル基転移酵素遺伝子をバラに導入で きたこ とを示す。
また、 こ こ に述べたバイナ リ 一べク ターの構築や植物への形質転 換は、 p G A T 4 に含まれる リ ン ドウのァ シル基転移酵素遺伝子に 限られる ものではな く 、 他のァ シル基転移酵素も、 植物への導入と 植物での遺伝子発現が可能である。 また、 植物の種と して、 こ こで は、 バラをあげた力く、 他の多 く の植物で （たとえば、 カーネー シ ョ ン、 キク、 タバコ、 ペチュニア、 ガーベラ、 ペチュニアなど） 形質 転換の方法が報告されているので、 公知の方法を用いれば、 多 く の 植物種にァ シル基転移酵素の導入が可能である。
実施例 15. 完全長のシ ソ由来のァ シル基転移酵素の c D N Aの合
座
シソァ シル基転移酵素遺伝子 C D N A、 P S A T 2 0 8 は、 先に 述べたよう に活性のある酵素はコー ド している力 <、 完全長ではなか つた。 そこで、 リ ン ドウのァ シル基転移酵素遺伝子 p G A T 4 の塩 基配列をもとに開始コ ド ンを含む完全長 c D N Aを合成した。 すな わち、 以下に示す D N Aを合成した。 また、 そのコー ドするァ ミ ノ 酸配列を併記した。 最初の下線はク ローニングのための BamHl 認識 配列で、 次の下線は p S A T 2 0 8 に含まれる配列である。 また、 BamHl の認識配列の後に植物で翻訳開始コ ド ンの直前によ く 見られ る配列 AACAを挿入してある。
5' GGGATCCAACA ATG GAG CAA ATC CAA ATG GTG GCC GTG ATC GAA ACG TGT AGA 3'
Met Glu Gin lie Gin Met Val Ala Val lie Glu T r Cys Arg
(配列番号 ： 27)
このプラ イマーと— 2 0 プライマー ； 5' -GTAAAACGACGGCCAT -3' (配 列番号 ： 28) とをそれぞれ 1 0 0 n g、 p S A T 2 0 8 を 1 0 n g を含む P C R反応を最終体積 5 0 1 で行った。 反応は、 9 5 °C 1 分、 5 5 °C 1 分、 7 2 °C 2 分を 1 サイ クノレと し、 1 5 サイ クル行つ た。 反応後、 反応液から D N A断片を G e n e c 1 e a n (BiolOl 社） を用いて製造者の推奨する方法で、 回収した。 回収した D N A を BamHl と EcoRl で消化した後、 ァガロースゲル電気泳動し、 約 2 0 0 b pの D N A断片を回収した。 この D N A断片を、 p S A T 2 0 8 を EcoRI で消化して得られる約 3 . 3 k bの D N A断片とライ ゲ一シ ヨ ン し、 得られたプラス ミ ドを P S A T F 2 0 8 と した。 こ のプラス ミ ドの塩基配列を c D N Aの 5 ' 末端から決定し、 塩基配 列を確認した。
実施例 16. シ ソ由来のァ シル基転移酵素遺伝子の酵母における発 実施例 5 で述べた方法に従って、 P S A T F 2 0 8 を酵母で発現 させ、 酵素活性の測定を行った。 すなわち、 p Y E 2 2 mを BamH I と Sai lで消化して得られる約 8 k bの D N A断片と、 p S A T F 2 0 8 を BamH I と Sai lで消化して得られる約 1 . 6 k bの D N A断片 をライゲーシ ヨ ン し得られたプラス ミ ドを p Y S A T 2 0 8 と した o
P Y S A T 2 0 8で酵母 G 1 3 1 5 を形質転換し、 得られた形質 転換体のァシル基転移酵素活性を測定した。 その結果、 p Y S A T 2 0 8 を導入した酵母では、 2 4 n m o l のデルフ ィ 二ジ ン 3， 5 一 ジグルコ シ ドと 2 1 . 5 n m o 1 のカフ ェオイノレ一 C o Aカヽら 1 0 n m o 1 のデノレフ ィ ニジ ン 3 — 力 フ エ オイ ノレグルコ シ ド 5 — グル コ シ ドの生成が認められた。 従って、 p S A T F 2 0 8 に含まれる 合成した完全長 c D N Aは、 ァ シル基転移酵素活性をコー ドする こ とが確認できた。
実施例 17. シ ソ由来のァ シル基転移酵素遺伝子を含むバイナ リ ー ベク ターの作製
プラ ス ミ ド p E l 2 Q G U S は、 プラ ス ミ ド p 2 1 1 3 G (Aida et al. , Acta Horticul ture, 392， 219-225, 1995) 上の G U S遺 伝子の発現ュニッ 卜がプラス ミ ド p U C 1 9 の H i nd I I 1 と EcoR 1 認 識部位に挿入されているプラス ミ ドである。 p E l 2 0011 8を5& clで消化し、 DNA ブラ ンテ ィ ングキ ッ ト （宝酒造 （株） ） で、 平滑 末端化 した後、 Xholリ ンカ一 （東洋紡 （株） ） とライゲー シ ヨ ン し た。 得られた Xho 1リ ンカ一の挿入されたプラス ミ ドを p E 1 2 Ω G U S X と した。 このプラス ミ ドを Hind 111 と EcoRl で消化して得ら れる約 2. 8 k bの D N A断片を、 Hind 111 と EcoRl で消化した p B i n 1 9 とライゲ一シ ヨ ン し、 得られたプラス ミ ドを p B E G U S x と した。 p B E G U S xを BamH I と Xho 1で消ィ匕して得られる 1 l k bの D N A断片と、 p S A T F 2 0 8を BamHl と Xholで消化し て得られる D N A断片をライ ゲーシ ョ ン して得られるプラス ミ ドを P B E S A 2 0 8 と した。 このプラ ス ミ ド上で、 シ ソのァ シル基転 移遺伝子は、 ェンハンサーを含む力 リ フラ ヮ一モザィ ク ゥ ィ ルスの プロモーターと ノパリ ン合成酵素遺伝子のター ミ ネーターの制御下 にある。
実施例 18. シ ソ由来のァシル基転移酵素遗伝子の植物への導入 p B E S A 2 0 8 を Plant Molecular Biology Manual ( luwer
Academic Publ ishers) に言己載されている方法で、 Agrobacter i urn tumef ac i ence の A g 1 0栎 ( Lazo e t 1. , Bio/Technology, 9， 963-967, 1991 ) に導入した。 A g l 0株の形質転換体を用いて、 Plant Molecular Biology Manual (Kluwer Academic Publishers ) に記載されている方法を用いて、 ペチュニア フルコ ン レ ツ ド （ サカ タのタネ） 、 バカラ レ ツ ド （サカ タのタネ） 、 タイ タ ン レ ツ ド
(サカ タのタネ） に形質転換した。 なお、 これらのペチュニアの花 弁には シァニ ジ ン 3 — グルコ シ ドが主なア ン ト シァニ ン と して含ま れている。
また、 先に述べた方法でバラ品種ラバンデにも形質転換を行った 実施例 19. 完全長のサイネ リ ァ由来のァシル基転移酵素の c D N Aの合成
サイネ リ ア由来のァ シル基転移酵素遺伝子 c D N A、 p C A T 8 は、 先に述べたよう に完全長ではなかった。 そこで、 リ ン ドウのァ シル基転移酵素遺伝子 p G A T 4 の塩基配列をもとに開始コ ドンを 含む完全長 c D N Aを合成した。 すなわち、 以下に示す D N Aを合 成した。 そのコー ドするア ミ ノ酸配列を併記した。 最初の下線はク ローニングのための BamH 1 認識配列で、 次の下線は p C A T 8 に含 まれる配列である。
5' -GGGATCCAACA ATG GAG CAA ATC CAA ATG GTC AAC ΑΠ CTC GAA C-3'
Met Glu Gin He Gin Met Val Asn lie Leu Glu
(配列番号 ： 29)
このプライマーと一 2 0 プライマーをそれぞれ 1 0 O n g、 p C A T 8 を 1 O n gを含む P C R反応を最終体積 5 0 μ. 1 で行った。 反応は、 9 5 °C 1 分、 5 5 °C 1 分、 7 2 °C 2 分を 1 サイ クルと し、 1 5 サイ クル行った。 反応後、 反応液から D N A断片を Geneclean (BiolOl社） を用いて製造者の推奨する方法で、 回収した。 回収し た D N Aを BamHl と Mvalで消化した後、 ァガロースゲル電気泳動し 、 約 2 0 0 b pの D N A断片を回収した。 この D N A断片を、 p C A T 8 を Mvalと Xholで消化して得られる約 1 . 3 k bの D N A断片 と、 BamHI と Xhol で消化した pB 1 uescr i p t I 1SKとをライ ゲーシ ョ ン し、 得られたプラス ミ ドを P C A T F 8 と した。 このプラス ミ ド の塩基配列を c D N Aの 5 ' 末端から決定し、 塩基配列を確認した o
実施例 20. ラベンダー由来のァシル基転移酵素をコー ドする c D
N Aのク ロ一ニング
シソ科のラベンダー （Lavandula— angus t i f o 1 i a) の花弁由来の c D N Aラ イブラ リ 一を、 実施例 3 で述べた方法で作製し、 同 じ く 実施例 3 に述べた方法で、 プラークハイブラ リ ダイゼーシ ョ ンの方 法を用いて、 約 3 0 万ク ローンをスク リ ーニングした。 すなわち、 プローブには、 合成ヌ ク レオチ ドの R I プラ イマー ； 5' -CTCGGAGGA ATTCGGCACGAC-3' (配列番号 ： 30) とオ リ ゴ 2 をそれぞれ 1 0 0 g 、 P S A T 2 0 8 を 1 0 n g用い、 ヌ ク レオチ ドと して D I G標識 ヌ ク レオチ ドを使用 し、 最終体積 5 0 1 で P C Rを行って得られ たものを使用 した。 反応は、 9 5 °C 1 分、 5 0 °C 1 分、 7 2 °C 2 分 を 1 サイ クルと し、 2 5 サイ クル行った。
標識した c D N A断片をハイプリ ダイゼ一 シ ョ ン液中に加え、 さ らに 1 6 時間、 3 7 °Cに保持し、 ハイ ブリ ダィゼー シ ヨ ンを行った 。 洗浄液 （ 5 x S S C、 1 % S D S ) でフ ィ ルタ一を洗浄し、 アル カ リ ホスフ ァ ターゼで標識された D I G特異的抗体による酵素免疫 測定法 （ベー リ ンガーマ ンハイ ム社） による 5 —ブロモ 4 一 ク ロ 口 3 ーィ ン ド リ ルリ ン酸と二 ト ロブルーテ ト ラ ゾリ ゥ厶塩の発色反応 によって陽性ク ロー ンを検出 した。 なお、 検出方法は製造社による 使用説明書に従った。
この結果 1 個の陽性ク ロー ンが得られ、 この c D N Aをス ト ラ 夕 ジー ン社の推奨する方法で フ ァージをベク タ一とする形からブラ ス ミ ド pBluescript 11 SK- をベク ターとする形に回収した。 得ら れたク ロー ンからプラ ス ミ ドを抽出 し、 これを p L A T l と した。 先に述べたよ う に、 AB1373 DNA シークェンサ一 （パーキンエルマ 一社） を用い、 同社の推奨する蛍光色素によるダイデォキシシーク エ ン ス法で、 p L A T 1 の c D N Aの 5 ' 末端付近の塩基配列を決 定した。 得られた塩基配列から導かれるア ミ ノ酸配列は、 シソゃ リ ン ドウのァ シル基転移酵素のア ミ ノ酸配列と高い相同性を示 し、 p L A T 1 がラベンダーのァ シル基転移酵素をコ一 ドする こ とが推察 された。 し力、し、 p L A T 1 のコー ドするア ミ ノ酸配列はシソゃリ ン ドウのァ シル基転移酵素のァ ミ ノ酸配列と比べて短く 、 ァ シル基 転移酵素の全長をコー ドするには満たないと考えられた。 そこで D I Gで標識した p L A T 1 の c D N Aフラ グメ ン 卜をプローブと し 、 ラベンダーの花弁由来の c D N Aライブラ リ ーを上に述べたのと 同様の条件でスク リ ーニングした。 プローブは、 p L A T 1 プラ ス ミ ド約 l n gを铸型と し、 下記に示す R I プライマーとオ リ ゴ 2各 5 0 0 n g、 d N T P標識混合液 （ベー リ ンガー） 8 1 を含む最 終体積 5 0 〃 1 の P C R反応により標識した。 P C R反応は 9 5 °C 1 分、 4 2て 2分、 7 2 °C 3分からなるサイ クルを 2 5 サイ クル行 い、 さ らに伸長反応を完全にするため 7 2 °Cに 7分保持した。 ブラ ークハイブリ ダィゼー シ ヨ ンは、 ハイブリ ダィゼー シ ヨ ンバッ フ ァ 一中のホルムア ミ ド濃度は 5 0 %、 フ ィ ルタ ーの洗浄は 2 X S S C 、 1 % S D Sで行った以外は上に述べたのと同様であった。 得られ た陽性ク ロー ンの 5 ' 末端付近の塩基配列を前述同様に して決定し 、 し八丁 1 ょり も 1 1 長ぃク ロー ン、 P L A T 2 1 を得た。 これを配列表、 配列番号 6 に示す。 しかし p L A T 2 1 も開始メ チ ォニ ンコ ド ンを含まず、 ァシル基転移酵素の全長をコー ドするには 満たないク ローンであった。
実施例 21. 完全長のラベンダー由来のァシル基転移酵素の c D N
Aの合成
ラベンダーのァシル基転移酵素をコー ドすると考えられる c D N A、 p L A T 2 1 は開始メ チォニ ンコ ドンを含まないため、 酵母で の発現のためには c D N Aの 5 ' 末端に開始メ チォニンコ ドンを付 加する必要がある。 そこで、 下記の様なプライマ一を用いて、 P C Rを行い、 開始メ チォニ ンコ ドンを p L A T 2 1 の c D N Aの 5 ' 末端に付加したフラ グメ ン 卜を合成した。 プラ イマ一 L A T— A T Gは p L A T 2 1 の 5 ' 末端 2 0塩基の配列に加えて、 開始メ チォ ニンコ ドンと、 その上流に隣接して存在するといわれている植物で の遺伝子発現のための保存配列 AACA 、 および酵母発現ベク ターへ の連結に必要な制限酵素 BamHl 認識部位 GGATCC を 5 ' 上流から 3， 方向に含むよう にデザイ ンされている。 LAT- ATG プライマー （ 配列番号 ： 31)
5' AGTCGGATCCAACA ATG_ACC ACC CTC CTC GAA TCC 3'
Thr Thr Leu Leu Glu Ser
P C R反応は p L A T 2 1 プラス ミ ド約 1 0 O n gを铸型と し、 L A T— A T Gプライマーとオ リ ゴ 2 各 5 0 O n g、 を含む最終体 積 5 0 u 1 で P C R反応を行った。 反応は 9 5 °C 1 分、 4 2 °C 2 分 、 7 2 °C 3 分からなるサイ クルを 1 0 サイ クル行い、 さ らに伸長反 応を完全にするため 7 2 °Cに 7 分保持した。 得られた D N A断片を BamHI と EcoRl で切断し、 約 5 5 0 b pの D N A断片を回収した。 この D N A断片をプラス ミ ドベク ター pBluescript 11 SK- の BamH 1 と EcoRI サイ トにサブク ローニングし、 p L A T P C R l 1 と し た。 前述同様にして p L A T P C R l 1 の塩基配列を決定し、 P C Rによ って増幅されたこの D N A断片が、 p L A T 2 1 c D N Aの 5 * 末端から EcoRl サイ 卜までと同一の配列をもち、 L A T— A T Gプライマ ー中の開始メ チォニンコ ドンと植物での遺伝子発現のた めの保存配列、 および酵母発現ベク ターへの連結に必要な制限酵素 BamH I認識部位を含むものであるこ とを確認した。
さ らに、 p L A T 2 1 の c D N A部分の全塩基配列を P G A T 4 の じ D N Aの塩基配列を決めたのと同様な方法で決定した。 この c D N Aがコー ドしている と予想されるア ミ ノ酸配列は、 p S A T 2 0 8 、 p G A T 4 、 p C A T 8 、 p G A T 1 0 6 、 p P A T 4 8 に 対して、 それぞれ、 6 9 %、 3 8 %、 3 7 %、 3 7 %、 1 9 %のホ モ ロ ジーを示した。
実施例 22. ラベンダー由来のァシル基転移酵素遺伝子の酵母にお ける発現
p L A T P C R l 1 力、ら BamHI と EcoRl で切断される約 5 5 0 b pの D N A断片と、 P L A T 2 1 から EcoRI と Xholで切断して得ら れる約 1 k bの D N A断片と、 酵母発現ベク ター p Y E 2 2 mを Ba mHI と Sai lで切断して得られる約 8 k bの D N A断片をライゲ一シ ヨ ン して得られるプラス ミ ドを P Y E L A T 2 1 と した。 先に述べ たよ う に、 酵母 G 1 3 1 5をこのプラス ミ ドで形質転換し、 ァ シル 基転移酵素活性を測定した。
その結果、 P Y E L A T 2 1 を導入した酵母では、 2 4 n m o 1 のデルフ ィ 二ジ ン 3 , 5 — ジグルコ シ ドと 2 1 . 5 n m 0 1 のカ フ ェオイノレ一 C o Aカヽら 1 9. 9 n m o l のデルフ ィ 二ジ ン 3 — カ フ ェオイルグルコ シ ド 5 —グルコ シ ドの生成が認められた。 従って、 P Y E L A T 2 1 に含まれる合成した完全長 c D N Aは、 ァ シル基 転移酵素活性をコー ドするこ とが確認できた。
実施例 23. ラベンダーァシル基転移酵素遺伝子を含むバイナ リ ー ベク タ一の作製
p L A T P C R l 1 力、ら BamHI と EcoRl で切断される約 5 5 0 b Pの D N A断片と、 p L A T 2 1 から EcoRl と Xholで切断して得ら れる約 l k bの D N A断片と、 p B E G U S Xを BamHl と Xholで消 化して得られる約 1 l k bの D N A断片をライゲーシ ヨ ンして得ら れるプラ ス ミ ドを p B E L A l 1 と した。 これを先に述べた方法で Agr obac t er i urn tumefacienceの A g l 0株に幵；質転換し、 ペチュニ ァとバラの形質転換に供した。
実施例 24. ァ シル基転移酵素に対する抗体の作製
ある酵素に対して、 ァ ミ ノ酸配列が似ている酵素の遺伝子をとる 方法の一つと して、 ある酵素に対する抗体で、 発現型の c D N Aラ イ ブラ リ ーをスク リ ーニングする方法が上げられる。 こ こでは、 以 下のよう に して、 リ ン ドウの p G A T 4 のコー ドするァ シル基転移 酵素に対する抗体を作製した。 同様に して、 他のァ シル基転移酵素 の抗体を作製するこ とが可能である。
ます、 Bulk and Red i Pack GST Purification Modules ( pharmac i a Biotech ) を用いて大腸菌で G A T 4 タ ンパク質を大量発現させ 、 そこから精製を行った。
( 1 ) 発現プラ ス ミ ドの構築
大腸菌でのァ シル基転移酵素遺伝子の発現には P G E X— 4 T一 1 を用いた。 この p G E X— 4 T一 1 を用いてグルタチオン S — ト ラ ンスフ ェ ラーゼとの融合タ ンパク質をつく り、 その後グルタチォ ン S — ト ラ ンスフ ェラーゼのァフ ィ ニティ カラムを用いるこ とで効 率的な精製が行える。
p G E X - 4 T一 1 を Sma 1と Xho iで消化した後、 D N Aブラ ンテ イ ングキ ッ 卜 （宝酒造 （株） ） を用いて平滑末端化した。 得られた 約 4 . 9 k bの D N A断片をアルカ リ ホスフ ァ ターゼ B A P C 7 5 (宝酒造 （株） ） を用いて脱リ ン酸化した。 P G A T 4 を当該べ ク タ一内に存在する制限酵素部位 Smalと Kpnlで消化して得られる約 1 . 6 k bの D N A断片を前述と同 じよう に平滑末端化し、 前述の p G E X - 4 T— 1 を Sma 1と Xho 1で消化した後平滑末端化した部位 に組み換えて、 P G E X G A T 4 を構築した。 EcoRI と Bgl l l で消 化して P G A T 4 上の c D N Aとダルタチオン S — ト ラ ンスフ ェ ラ ーゼの向きが同方向である こ とを確認した。
( 2 ) ァ シル基転移酵素の大腸菌における発現
P G E X G A T 4 で大腸菌 J M 1 0 9 を形質転換した。 大腸菌の 形質転換法は Hanahan の方法に従った （ J. Mo 1. B i o 1. , 166, 557 -, 1 983)。 形質転換された大腸菌をア ンピシ リ ン （ 1 0 0 / g /m l ) 及び 2 %グルコースを含む 2 X Y T培地 （ ト リ プ ト ン 1 6 g、 ィー ス トエキス ト ラ ク 卜 1 0 g、 塩化ナ ト リ ウム 5 gを 1 リ ツ ト ルの蒸 留水に溶かし、 水酸化ナ ト リ ウムで p Hを 7. 0 に調製する） 5 0 m l に植菌し、 3 7 °Cでー晚培養した。 この培養液 4 0 m l を 4 0 0 m l のア ン ピシ リ ン （ 1 0 0 / g Zm l ) 及び 2 %グルコ ースを 含む 2 X Y T培地に接種し、 3 7 °Cで 3 時間培養後、 0. 1 Mの I P T Gを 4 4 0 1 (終濃度 1 0 mM) 添加し、 さ らに 5 時間培養 した。 集菌後、 1 0 Μの A P M S Fを含む 1 X P B S (塩化ナ ト リ ウ ム 8. 2 g、 塩化カ リ ウ ム 2. 0 g、 リ ン酸水素ニナ ト リ ウ ム 1 . 4 3 g、 リ ン酸二水素カ リ ウム 2. 4 5 gを 1 リ ッ トルの蒸留 水に溶かした） 1 0 0 m 1 に懸濁した。 この懸濁液を超音波破砕し た後、 2 0 % ト リ ト ン X— 1 0 0を 5 m 】 （終濃度 1 % ) 添加した 。 氷中で冷却しながら 3 0分振蕩した後、 1 2 0 0 0 r p mで 1 0 分間遠心し、 得られた沈殿を 】 2 m 〗 の 6 Mの U r e aに懸濁し等 量の 2 x S D Sサンプルバッ フ ァーを加えて 9 0 °C、 5分間処理し 試料と して用いた。
この試料 0. 8 m l をディ ス ク ゲル電気泳動 （分離ゲル 7. 5 % ア ク リ ルア ミ ド、 濃縮ゲル 5 %ア ク リ ルア ミ ド ； ATT0 (株） B 10 PH ORES IS I I I I ) にて分離し、 0. 8 m l ずつ分取した。 各画分を S D S — ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 （分離ゲル 1 0 %ア ク リ ル ア ミ ド、 濃縮ゲル 4. 5 %アク リ ルア ミ ド） で分析した結果、 p G A T 4 のコ 一 ドするァ シル基転移酵素とグルタ チオ ン S— ト ラ ンス フ ェ ラ ーゼの融合蛋白質の大きさ と一致する分子量約 7 5 0 0 0 の 蛋白質が単一の蛋白質と して存在する画分があった。
この画分 （ 3. 2 m l ) を Centricon 10 (am icon社） で濃縮 し約 0. 3 gの融合蛋白質を得た。 この試料を用いて、 B A L B Z C マウ スを用いて常法に従い、 抗体を作製した。 この抗体を用いて、 ァ シル基転移酵素のホモログを取得するこ とができ る。 産業上の利用可能性
以上のよう に、 本発明においては リ ン ドウ由来の芳香族ァ シル基 転移酵素の精製、 当該酵素の c D N Aのク ローニ ング及び当該 c D N Aの塩基配列の決定を行った。 また、 大腸菌と酵母での活性発現 を行う こ とによ り、 分離した c D N Aが芳香族ァ シル基転移酵素を コ ー ドする ものである こ とを確認した。
従って、 本発明に係る c D N Aを適当な植物発現ベク ターに接続 し、 植物に導入する こ とにより、 ァ シル化反応を植物の花色調節に 利用する こ とが可能となった。
また、 本酵素活性を利用するこ とにより、 植物の中であるいは試 験管内でア ン ト シア ンの構造を改変し、 より安定なア ン ト シア ンを 提供する こ とができ る。
〔配列表〕
配列番号 （SEQ ID NO ) : 1
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 7 0 3
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 二本鎖 （double)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： cDNA to mRNA
ハイポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
ア ンチセ ンス （ANT卜 SENSE) ： No
起源 （ORIGINAL SOURCE )
生物名 （ORGANISM) ： リ ン ドウ （Gentiana tri flora var. japon i ca )
組織の種類 （TISSUE TYPE ) ： 花弁 （petal )
直接の起源 （IMMEDIATE SOURCE)
ライブラ リ ー名 （LIBRARY ) ： cDNA library
ク ロー ン名 （CLONE ) ： pGAT4
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
TCATT ATG GAG CAA ATC CAA ATG GTG AAG GTT CTT GAA AAA TGC CAA 47 Met Glu Gin lie Gin Met Val Lys Val Leu Glu Lys Cys Gin
- 1 1 5 10
GTT ACA CCA CCA TCT GAC ACA ACA GAT GTC GAG TTA TCG CTA CCG GTA 95 Val Thr Pro Pro Ser Asp Thr Thr Asp Val Glu Leu Ser Leu Pro Val
15 20 25
ACA TTC TTC GAT ATC CCC TGG TTG CAC TTG AAT AAG ATG CAG TCC CTT 143 Thr Phe Phe Asp lie Pro Trp Leu His Leu Asn Lys Met Gin Ser Leu
30 35 40 45 981 081 911
BIV 丄 EIV usv ail 叫 d Ι^Λ aild ^ sAq ¾iv dsy ¾IV 911 J9S 9iS 330001130 IVV 31V 31101V VIO 11110V VVV 130 IVO VOO丄丄 V VOL
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ΙΒΛ n9q uio S!H S Η9Ί 丄 dsy ^^d dsy dsy J3S "10 ¾IV VXD 0X0 VV3 IVO 109 VVV 110 OVI 3V0丄丄丄 1V9 OVD OVO 1D1 OVO 030
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OOZ S6T 061 ri3i usy BIV J3S na naq dsy ^IV dsy sAq sAq usy 91 1 丄
229 113 IVV 030 331 DU OXX OVO 030 OVO VVV VVV OVV LLV IVl 議蘭 OOSSZ/96 OA1 GGC AAC TGT CTT GCG TCA TGC GTT GCA AAA GCA ACA CAT AAA GAG TTA 1055 Gly Asn Cys Leu Ala Ser Cys Val Ala Lys Ala Thr His Lys Glu Leu
335 340 345
GTT GGG GAT AAA GGG CTT CTT GTT GCA CTT GCA GCT ATT GGA GAA GCC 1103 Val Gly Asp Lys Gly Leu Leu Val Ala Val Ala Ala lie Gly Glu Ala
350 355 360 365
ATT GAA AAG AGG TTG CAC AAC GAA AAA GGC GTT CTT GCA GAT GCA AAA 1151 lie Glu Lys Arg Leu His Asn Glu Lys Gly Val Leu Ala Asp Ala Lys
370 375 380
ACT TGG TTA TCG GAA TCT AAT GGA ATC CCT TCA AAA ACA TTT CTC GGG 1199 Thr Trp Leu Ser Glu Ser Asn Gly lie Pro Ser Lys Arg Phe Leu Gly
385 390 395
ATT ACC GGA TCG CCT AAG TTC GAT TCG TAT GGT GTA GAT TTT GGA TGG 1247 lie Thr Gly Ser Pro Lys Phe Asp Ser Tyr Gly Val Asp Phe Gly Trp
400 405 410
GGA AAG CCT GCA AAA TTT GAC ATT ACC TCT GTT GAT TAT GCA GAA TTG 1295 Gly Lys Pro Ala Lys Phe Asp lie Thr Ser Val Asp Tyr Ala Glu Leu
415 420 425
ATT TAT GTG ATT CAG TCC AGG GAT TTT GAA AAA GGT GTG GAG ATT GGA 1343 He Tyr Val lie Gin Ser Arg Asp Phe Glu Lys Gly Val Glu lie Gly 430 435 440 445
GTA TCA TTG CCT AAG ATT CAT ATG GAT GCA TTT GCA AAA ATC TTT GAA 1391 Val Ser Leu Pro Lys lie His Met Asp Ala Phe Ala Lys lie Phe Glu
450 455 460
GAA GGC TTT TGC TCT TTG TCA TAGTCTCTTT AATAGAACCA TATTTGCTGC 1442 Glu Gly Phe Cys Ser Leu Ser
465 468 AATAAAGTAC CAAGTCCHT AGTAACACTA CACCAAACCC TACTTTCGAG GCGCGAACAC 1502 CACAACGAGG TTCAATCACT AGAAGGTTGT ACHCATAAA HCCAGAGGT CGAATATACA 1532 CCGTTGTCCT CTGAAAAGTT GAACCTCACA CCTGACATGG TGTTACGATA GGTATTGTAT 1622 AATGCCATTA TATACTTCCA TAAAGTATCC TATGCAATAG AGAACATGTT ATGTGTTAAA 1682 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 1703 配列番号 （SEQ ID NO ) ： 2
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 6 2 2
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 二本鎖 （double)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： cDNA to mRNA
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
ア ンチセ ンス （ANT1- SENSE) ： No
起源 （ORIGINAL SOURCE )
生物名 （ORGANISM) ： リ ン ドウ （Gentiana tri flora var. japon i ca )
組織の種類 （TISSUE TYPE ) ： 花弁 （petal )
直接の起源 （ IMMEDIATE SOURCE)
ライブラ リ 一名 （LIBRARY ) ： cDNA 1 ibrary
ク ロー ン名 （CLONE ) ： pGAT106
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
GAACCATTGA ATCCAATTAA TCTGATTTAT TAAG ATG GCA GGA AAT TCC GAG 52
Met Ala Gly Asn Ser Glu
1 5
GAT ATC AAA GTT CTT GAG AAA TGC CGT GTT GCG CCA CCA CCG GAC GCC 100 Asp lie Lys Val Leu Glu Lys Cys Arg Val Ala Pro Pro Pro Asp Ala
10 15 20 591 091 SSi
IO 311 s/iQ an ^ID Jm usv J3S 3Md [ΕΛ J 1ΒΛ uiO "91 ^iy aqd
VOO 11V 301 V1V 109 33V OVV 331 311 OiO 03V 910 0V3 VII 130丄丄丄
09ΐ QH OH 9£ΐ nsi OJd na \ \ no dsy [9 J3S J¾ Ι¾Λ 311 OJd nio OJJ na UJO 8 113 V33 V丄丄 VIO VVO OVO 300 33133V VIO 11V 933 VVO V33 013 OVO
OCT S2l 021
OJd an dsy usv 3Md s J J3S dsy 3J\/ uio s|H dsy A19 B^y
9S 033 丄丄 V Oil IVO 3VV 3丄丄 VVV 1V1 IOX IVO 00V OVO 1V3 IVO VOO 339
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OOI g6 06 dsy AJO sAq sA 丄 3 naq njg OJJ 3jy dsy Jas J9S dsy ί¾Λ
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9ΐ6 301 VDV 901 31V 913 VDO 131 VOV 010 03V 311 13V V31 013 IVV 1V1
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092 592 0
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AAT AGT CTC CAT GTG AGG AGC CCT TIQ TAAGAAAAAA GTGGTATCAA 1491 Asn Ser Leu His Val Arg Ser Pro Leu
475 479
TGTATAAAAA AGACAGACAA GTTATGATGC AACAAATGTT TTAGGAGATT ACAAATCCAT 1551 GGGAAGATGT ATCAAACTCA TCTCTCTATA TATATATATT CAATTGTTTT AAAAAAAAAA 1611 AAAAAAAAAA A 1622 配列番号 （SEQ ID NO ) ： 3
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 6 0 5
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 二本鎖 （double)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： cDNA to mRNA
ハイポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
ア ンチセ ンス （ANT卜 SENSE) ： No
起源 （ORIGINAL SOURCE )
生物名 （ORGANISM) ： ペチュニア （Petunia ybrida )
組織の種類 （TISSUE TYPE ) ： 花弁 （petal )
直接の起源 （ IMMEDIATE SOURCE)
ライブラ リ 一名 （LIBRARY ) ： cDNA l ibrary
ク ロー ン名 （CLONE ) ： pPAT48
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
TGTCGACGAA ATCCATTTCA TTTCCTCTTC TTTCTTGTTT TTCTAATTTC GTCATCATTG 60 HATCC ATG GCA GGT GAA GTA GCA AAA CAA GAA GTT ACA AAA GTG AAA 108 Met Ala Gly Glu Val Ala Lys Gin Glu Val Thr Lys Val Lys
1 5 10
GTC CTG AAA AAA ACA AAC GTG AAA CCA CAT AAA CCA CTA GGA AAA AAA 156 Val Leu Lys Lys Thr Asn Val Lys Pro His Lys Pro Leu Gly Lys Lys 15 20 25 30
GAG TGT CAA TTG GTA ACA TTT GAT CTT CCT TAC CTA GCT TTC TAT TAC 204 Glu Cys Gin Leu Val Thr Phe Asp Leu Pro Tyr Leu Ala Phe Tyr Tyr
35 40 45
AAC CAA AAA TTT CTC ATC TAT AAA GGT GCT GAA AAC TTT GAC GAG ACG 252 Asn Gin Lys Phe Leu lie Tyr Lys Gly Ala Glu Asn Phe Asp Glu Thr
50 55 60
GTG GAA AAA ATT AAA GAT GGA CTG GCC TTA GTA TTG GTG GAT TTC TAT 300 Val Glu Lys lie Lys Asp Gly Leu Ala Leu Val Leu Val Asp Phe Tyr
65 70 75
CAA CTA GCT GGG AAA CTT GGA AAA GAT GAA GAA GGG GTT TTC AGG GTG 348 Gin Leu Ala Gly Lys Leu Gly Lys Asp Glu Glu Gly Val Phe Arg Val
80 85 90
GAA TAC GAC GAT GAC ATG GAT GGT GTA GAG GTG ACA GTG GCT GTT GCA 396 Glu Tyr Asp Asp Asp Met Asp Gly Val Glu Val Thr Val Ala Val Ala 95 100 105 110
GAA GAG ATA GAA GTT GCA GAT CTT ACT GAT GAA GAA GCC ACC ACC AAA 444 Glu Glu lie Glu Val Ala Asp Leu Thr Asp Glu Glu Gly Thr Thr Lys
115 120 125
TTC CAG GAC TTG ATT CCT TGT AAT AAA ATC TTG AAT TTG GAA GGG CTT 492 Phe Gin Asp Leu lie Pro Cys Asn Lys He Leu Asn Leu Glu Gly Leu
130 135 140 ε 9
582 082 ζίΖ
sAq naq UIQ 8JV ^I 3 J 丄 Ι^Λ ¾IV Η3Ί dj丄 I¾ SIH ¾IV s naq 6 9VV 010 VVO 303 9301D0 VOV 010330 VIO 9910193V3 VOO DDI DID
QLZ S92 092 9S2
J3S uiO 3Md JM1 J3S 3Ud ojj JHi njQ io J9S USV ¾IV usy [¾Λ 丄
9 8 V31 VVO Oli VOV 331 Oil VOO 03V 0V9 VOO VOL OVV 300 IVV 310 VOV
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828 V3X OVV 31V VVV 3V9 ILV VOO VU 0V93013Π OVV 31L VIO VOV VVO
SCZ 022
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08L 303113133 VOO DVO VIO 3VV 30003D D1C 1V9190 OVV DOV VOO VOL
022 912 012
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902 002 S6I
3-iV J¾ usv 3J B1V sxq J¾ 3JV nio "31 3Ud OJd OJJ Ι¾Λ J3S ail i^89 VOO 1DV OVV 193130 OVV 30V VOO VVO 113 3丄丄 VOO VOO 310131 XIV 061 981 081 511
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QL\ S9T 091
JM1 J3S JMI dsy "31 m ¾1V s!H usy aqd V -»M1
885 OOV 03113V 100 iVO 0139101301V3 OVV XXI VOO Vll VOO OIV 33V
S9T 051 9^ΐ
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0 S 310 0003V0 OVV 0139VV 30V 313 OVO 010130 VIO 113133 390 IVO 96df/XDd OOSSZ/96 OAV CCC GAG GAC TAC ACT GTG TAC ACT GTG TTT GCT GAT TGC AGG AAA AGG 972
Pro Glu Asp Tyr Thr Val Tyr Thr Val Phe Ala Asp Cys Arg Lys Arg
290 295 300
GTT GAT CCT CCA ATG CCA GAA ACT TAC TTC GGC AAC CTA ATT CAG GCA 1020
Val Asp Pro Pro Met Pro Glu Ser Tyr Phe Gly Asn Leu He Gin Ala
305 310 315
ATT TTC ACA GTG ACC GCG GCA GGT TTG TTA CTA GCA AGC CCG ATC GAG 1068 lie Phe Thr Val Thr Ala Ala Gly Leu Leu Leu Ala Ser Pro lie Glu
320 325 330
TTC GCT GGT GGG ATG ATA CAA CAA GCG ATC GTG AAG CAT GAC GCT AAG 1116
Phe Ala Gly Gly Met lie Gin Gin Ala lie Val Lys His Asp Ala Lys
335 340 345 350
GCC ATT GAT GAA AGA AAC AAG GAG TGG GAG AGC AAC CCG AAG ATC TTT 1164
Ala lie Asp Glu Arg Asn Lys Glu Trp Glu Ser Asn Pro Lys lie Phe
355 360 365
CAG TAC AAA GAT GCT GGA GTG AAC TGT GH GCT GTT GGA ACT TCG CCA 1212
Gin Tyr Lys Asp Ala Gly Val Asn Cys Val Ala Val Gly Ser Ser Pro
370 375 380
AGG TTC AAG GTT TAC GAC GTG GAT TTT GGA TGG GGA AAG CCA GAG ACT 1260
Arg Phe Lys Val Tyr Asp Val Asp Phe Gly Trp Gly Lys Pro Glu Ser
385 390 395
GTG AGG ACT GGT TCG AAC AAT AGG TTT GAT GGA ATG GTG TAT TTG TAC 1308
Val Arg Ser Gly Ser Asn Asn Arg Phe Asp Gly Met Val Tyr Leu Tyr
400 405 410
CAA GGC AAA AAT GGA GGA AGA AGC ATT GAT GTG GAG ATT ACT TTG GAA 1356
Gin Gly Lys Asn Gly Gly Arg Ser lie Asp Val Glu lie Ser Leu Glu
415 420 425 430 GCA AAT GCT ATG GAG AGG TTG GAG AAA GAT AAA GAG TTC CTC ATG GAA 1404 Ala Asn Ala Met G】u Arg Leu Glu Lys Asp Lys Glu Phe Leu Met Glu
435 440 445
ACT GCT TAATTTGCTT AGCTTGGACT CAACTGGCTA CACTTTATTT ATGAGCTGCT 1460 Thr Ala
ATGACTCACA TGCATGTATG TTTATTTTTT HGGAGGGGT TCTTTCCTTT TATTGTTTTC 1520 TATGTTTTTT CTTTCTTGTA CGHATGAAG AGAAACCGAG TATAAAGGAA TAATGTTTTC 1580 AGTTATTAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1605 配列番号 （SEQ ID NO ) ： 4
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 4 7 9
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 二本鎖 （double)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： cDNA to mRNA
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
ア ンチセ ンス （ANT1- SENSE) ： No
起源 （ORIGINAL SOURCE )
生物名 （ORGANISM) ： シ ソ （Perilla ocimoides )
組織の種類 （TISSUE TYPE ) ： 葉 （leaf)
直接の起源 （IMMEDIATE SOURCE)
ライブラ リ 一名 （LIBRARY ) ： cDNA library
ク ロー ン名 （CLONE ) ： PSAT208
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
CC GTG ATC GAA ACG TGT AGA GTT GGG CCG CCG CCG GAC TCG GTG GCG 47 Val He Glu Thr Cys Arg Val Gly Pro Pro Pro Asp Ser Val Ala
1 5 10 15 GAG CAA TCG GTG CCG CTC ACA TTC TTC GAC ATG ACG TGG CTG CAT TTT 95 Glu Gin Ser Val Pro Leu Thr Phe Phe Asp Met Thr Trp Leu His Phe
20 25 30
CAT CCC ATG CTT CAG CTC CTC TTC TAC GAA TTC CCT TGT TCC AAG CAA 143 His Pro Met leu Gin Leu Leu Phe Tyr Glu Phe Pro Cys Ser Lys Gin
35 40 45
CAT TTT TCA GAA TCC ATC GTT CCA AAA CTC AAA CAA TCT CTC TCT AAA 191 His Phe Ser Glu Ser lie Val Pro Lys Leu Lys Gin Ser Leu Ser し ys
50 55 60
ACT CTC ATA CAC TTC TTC CCT CTC TCA TGC AAT TTA ATC TAC CCT TCA 239 Thr Leu lie His Phe Phe Pro Leu Ser Cys Asn Leu lie Tyr Pro Ser
65 70 75
TCC CCG GAG AAA ATG CCG GAG TTT CGG TAT CTA TCC GGG GAC TCG GTT 287 Ser Pro Glu Lys Met Pro Glu Phe Arg Tyr し eu Ser Gly Asp Ser Val 80 85 90 95
TCT TTC ACC ATC GCA GAA TCT AGC GAC GAC TTC GAT GAT CTC GTC GGA 335 Ser Phe Thr lie Ala Glu Ser Ser Asp Asp Phe Asp Asp Leu Val Gly
100 105 110
AAT CGT CCA GAA TCT CCC GTT AGG CTC TAC AAC TTT GTC CCT AAA TTG 383 Asn Arg Pro Glu Ser Pro Val Arg Leu Tyr Asn Phe Val Pro Lys Leu
115 120 125
CCG CCC ATT GTC GAA GAA TCC GAT AGA AAA CTC TTC CAA GTT TTC GCC 431 Pro Pro lie Val Glu Glu Ser Asp Arg Lys Leu Phe Gin Val Phe Ala
130 135 140
GTG CAG GTG ACT CTT TTC CCA GGC CGA GGC GTC GGT ATT GGA ATA GCA 479 Val Gin Val Thr Leu Phe Pro Gly Arg Gly Val Gly lie Gly lie Ala
145 150 155 L 9
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3JV OJJ 3jy naq dsy 八 OJd d\\ naq ai aiid BIV DSV "10 usy dsy
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OZZ 5Ϊ2 012
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06Ϊ S8I 081
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9A9 VV9 IVO WO 1V9 WO IVV WO ILV OVO VVV 30V 01V VOX 131001130
SiT Oil 591 091
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Ι9Π V13 OVV 30V 031 V90 VOO 010 DDI ILL XVI VOX VVV OVO Oil 030 VVV
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JA丄 η3Ί usy ^IO 3Md 丄 usv niO 0Jd Ι^Λ OJd OJd dsy naq 6S6 OVI 031 VLL 3013VV 900 Oil OVI XVV VV9133110033033 IVO VIX £00/96dT/X3d 00SSZ/96 ΟΛ TAATAAATGT ATGTAATTAA ACTAATATTA TTATGTAACA ATTAATTAAG TGTTGAGTAA 1400 CGTGAAGAAT AATCCCTATT ATATATTTAT GATTTGGTTC AAATAAAGTG TAAAGCCTCT 1460 TGAAAAAAAA AAAAAAAAA 1479 配列番号 （SEQ ID NO ) ： 5
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 5 0 8
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 二本鎖 （double)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： cDNA to mRNA
ハイポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
ア ンチセ ンス （ANT卜 SENSE) ： No
起源 （ORIGINAL SOURCE )
生物名 （ORGANISM) ： サイネ リ ア （Senecio cruentus)
組織の種類 （TISSUE TYPE ) ： 花弁 （petal )
直接の起源 （ IMMEDIATE SOURCE)
ライブラ リ 一名 （LIBRARY ) ： cDNA library
ク ロー ン名 （CLONE ) ： pCAT8
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
TG AAC ATT CTC GAA CAT GCC CGA ATA TCG GCC CCC TCG GGC ACC ATC 47 Asn lie Leu Glu His Ala Arg He Ser Ala Pro Ser Gly Thr lie
1 5 10 15
GGC CAT CGC TCG TTA TCT CTT ACT TTC TTC GAC ATT ACT TGG CTA CTC 95 Gly His Arg Ser Leu Ser Leu Thr Phe Phe Asp lie Thr Trp Leu Leu
20 25 30
TTC CCT CCG GTC CAC CAT CTT TTC TTC TAT GAC TTT CCA CAT TCT AAA 143 Phe Pro Pro Val His His Leu Phe Phe Tyr Asp Phe Pro His Ser し ys
35 40 45 0 ί
061 m 08ΐ
Ι¾Λ ^19 J3S "ID ail a J3S dj丄 Αΐ9 s/iq naq 9 usy 9Md v
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95ΐ 05ΐ
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6 iOO 031000003 ILL丄丄丄 03V 010 VVO XIO VOX 111113 VOO 31003V
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Asp Arg Ser Phe Leu Thr Lys Gly Ser Pro Pro Val Phe Asp Arg Leu
195 200 205
ATT AAC ATC CCA CAT TTA GAT GAA AAT AAG TTG AGA CAT ACA AGG CTC 671
He Asn lie Pro His Leu Asp Glu Asn Lys Leu Arg His Thr Arg Leu
210 215 220
GAA AGT TTT TAT AAA CCT TCG AGC CTT GTT GGT CCC ACT GAT AAA GTT 719
Glu Ser Phe Tyr Lys Pro Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Asp Lys Val
225 230 235
CGG TCA ACG TTT GTG TTG ACC CGA ACT AAT ATC AAT CTA CTA AAG AAA 767
Arg Ser Thr Phe Val Leu Thr Arg Thr Asn lie Asn Leu Leu Lys Lys
240 245 250 255
AAG GTC TTA ACC CAA GTG CCA AAC TTG GAG TAC ATG TCA TCT ΤΠ ACG 815
Lys Val Leu Thr Gin Val Pro Asn Leu Glu Tyr Met Ser Ser Phe Thr
260 265 270
GTA ACT TGT GGT TAT ATA TGG AGT TGC ATA GCG AAA TCA CTC GTA AAA 863
Val Thr Cys Gly Tyr lie Trp Ser Cys lie Ala Lys Ser Leu Val Lys
275 280 285
ATA GGA GAA AGA AAG GGC GAA GAC GAG Tl GAA CAG TTC ATA ATC ACC 911 lie Gly Glu Arg Lys Gly Glu Asp Glu Leu Glu Gin Phe lie lie Thr
290 295 300
ATT GAT TGT CGA TCT CGT CTT GAT CCA CCA ATT CCC ACA GCC TAC TTT 959 lie Asp Cys Arg Ser Arg Leu Asp Pro Pro lie Pro Thr Ala Tyr Phe
305 310 315
GGT AAC TGT GGT GCA CCA TGT GTC CCG ACC TTA AAA AAT GTC GTT TTG 1007
Gly Asn Cys Gly Ala Pro Cys Val Pro Thr Leu Lys Asn Val Val Leu
320 325 330 335 9 ： ( ON αι eas) ½ ½2ΐ
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配列の型 (SEQUENCE TYPE ) ：核酸 (nuclei c aci d)
鎖の数 (STRANDEDNESS) ：二本鎖 (doubl e)
トポロジー (TOPOLOGY) ：直鎖状 ( 1 i near)
配列の種類 (MOLECULE TYPE ) ： cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列 (HYPOTHET I CAし SEQUENCE ) ： No
アンチセンス （ANT卜 SENSE) ： No
起源 (OR IGINAL SOURCE )
生物名 (ORGANISM) ： ラベンダー (Lavandula angus t i fol ia)
組織の種類 （TISSUE TYPE ) ：花弁 （petal )
直接の起源 （I刚 EDI ATE SOURCE)
ライブラリ一名 （LIBRARY ) ： cDNA l i brary
クローン名 （CLONE ) ： pLAT21
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
-TG ACC ACC CTC CTC GAA TCC TCC CGA GTG GCG CCG CCT CCA GGC ACG 47 Xxx Thr Thr Leu Leu Gl u Ser Ser Arg Val Ala Pro Pro Pro Gly Thr
1 5 10 15
GTG GCT GAG CAG TCA CTC CCG CTC ACC TTC TTC GAC ATG ACG TGG CTG 95 Val Ala Gl u Gin Ser Leu Pro Leu Thr Phe Phe Asp Met Thr Trp Leu
20 25 30
CAT TTC CAC CCC ATG CTT CAG CTT CTC TTC TAC GAA CTC CCC TGT TCC 143 Hi s Phe Hi s Pro Me t Leu Gi n Leu Leu Phe Tyr Glu Leu Pro Cys Ser
35 40 45
AAA CCC GCC TTC CTC GAA ACC GTC CTT CCG AAA CTC AAA CAA TCC TTA 191 Lys Pro Ala Phe Leu Gl u Thr Val Val Pro Lys Leu Lys Gin Ser Leu
50 55 60 TCT CTA ACC CTC AAA CAC TTC TTC CCC CTT TCA TGC AAT CTA ATC TAC 239
Ser Leu Thr Leu Lys His Phe Phe Pro Leu Ser Cys Asn Leu lie Tyr
65 70 75
CCT CTA TCG CCG GAG AAA ATG CCG GAG TTC CGG TAT CAG AAC GGT GAC 287
Pro Leu Ser Pro Glu Lys Met Pro Glu Phe Ser Val Ser Phe Thr He
80 85 90 95
TCG GTT TCT TTC ACG ATT ATG GAG TCT GTC GGA GAT CAT CCG CAT TCC 335
Met Glu Ser Ser Asp Asp Tyr Glu Asp Val Gly Asp His Pro His Ser
100 105 110
GCT CAT AAA TAC TAC TGC TTT GCC CCT AGC GAC GAT TAT GAA GAT CTC 383
Ala His Lys Tyr Tyr Cys Phe Ala Gin Leu Pro Pro He Val Glu Glu
115 120 125
CAG CTG CCG CCG ATA GTC GAG GAA TCT GAT CGG AAA TTT CAA GTT 431
Ser Asp Arg Lys Leu Phe Gin Val Pro Leu Arg Tyr Gin Asn Gly Asp
130 135 140
TTA GCC GTG CAA GTG ACT CTG TTT CCC GGT CGC GGG GTG TGC ATC GGA 479
Leu Ala Val Gin Val Thr Leu Phe Pro Gly Arg Gly Val Cys lie Gly
145 150 155
ATA ACG ACG CAC CAC ACC GTT AGC GAT GCT CCA TCG TTT GTA GGG TTT 527 lie Thr Thr His His Thr Val Ser Asp Ala Pro Ser Phe Val Gly Phe
160 165 170 175
ATG AAG AGT TGG GCT TCC ATC ACT AAA TTC GGA GGA GAT GAT GAA TTC 575
Met Lys Ser Trp Ala Ser lie Thr Lys Phe Gly Gly Asp Asp Glu Phe
180 185 190
TTG GAC GGA AAA GGT GAA TGT TTG CCG GTT TTC GAC CGA TCG CTC GTG 623
Leu Asp Gly Lys Gly Glu Cys Leu Pro Val Phe Asp Arg Ser Leu Val
195 200 205 5 L
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OLZ 592 09Z
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355 360 365
TCT GAG ATT CGC GAA GCC TTG CAA AAC TGT TAT TTC TCG GTG GCG GGA 1151 Ser Glu lie Arg Glu Ala Leu Gin Asn Cys Tyr Phe Ser Val Ala Gly
370 375 380
TCG AGC AGG CTT GAT CTT TAC GGC GCG GAT TTT GGA TGG GGT AAG GCG 1199 Ser Ser Arg Leu Asp Leu Tyr Gly Ala Asp Phe Gly Trp Gly Lys Ala
385 390 395
GTG AAG CAA GAG ATA CTC TCG ATT GAT GGA GAG AAG TTT ACG ATG TCG 1247 Val Lys Gin Glu lie Leu Ser He Asp Gly Glu Lys Phe Thr Met Ser
400 405 410 415
TTG TGT AAA CCG AGG GAT GCT GCC GGA GGA TTG GAG GTT GGA TTG TCT 1295 Leu Cys Lys Pro Arg Asp Ala Ala Gly Gly Leu Glu Val Gly Leu Ser
420 425 430
TTG CCA AAG GAG GAA TTG CAA GCT TTT GAT GAT TAT TTT GCG GAG GGA 1343 Leu Pro Lys Glu Glu Leu Gin Ala Phe Asp Asp Tyr Phe Ala Glu Gly
435 440 445
ATA AAG GGT TGATTAATCA TTTAATCATG TATTATGAAG TTGGATGAAA 1392 He Lys Gly
450
TCCTCTGTTT CATCTCTATT GTTTAAACAA TAATTTTTTT CCATTGAACT TTTTTGAGTC 1452 AATAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAATG AAAAAACTCA GTTATTTTTT TTTTTTTTTT 1512 TTTTTTTTT 1521 配列番号 （SEQ ID NO ) ： 7
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 0
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： ア ミ ノ酸 （amino acid) トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear) 配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： peptide
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No 配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
Arg Phe Leu Gly He Thr Gly Ser Pro Lys
1 5 10
配列番号 （SEQ ID NO ) ： 8
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) ： 8
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： ア ミ ノ酸 （amino acid) トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： peptide
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No 配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
lie His Met Asp Ala Phe Ala Lys
1 5
配列番号 （SEQ ID NO ) ： 9
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) 1 0
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： ァ ノ酸 (amino acid) トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： peptide
ハイポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No 配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
Gly Val Glu lie Gly Val Ser Leu Pro Lys
1 5 10
配列番号 （SEQ ID NO ) : 1 0
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) ： 8
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： ア ミ ノ酸 （amino acid) トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （ l inear) 配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： peptide
ハイポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No 配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
Ala Ser Leu Ser Leu Thr Leu Lys
1 5
配列番号 （SEQ ID NO ) : 1 1
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 4
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： ア ミ ノ酸 （amino acid) ト ポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： peptide
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No 配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
His Tyr V l Pro Leu Ser Gly Asn Leu Leu Met Pro He Lys
1 5 10
配列番号 （SEQ ID NO ) : 1 2
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 4
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： ア ミ ノ酸 （amino acid) トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （ l inear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： peptide
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No 配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
Val Arg Ala Thr Tyr Val Leu Ser Leu Ala Glu lie Gin Lys
1 5 10
配列番号 （SEQ ID NO ) : 1 3
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) ： 8
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： ア ミ ノ酸 （amino acid) トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear) 配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： peptide
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No 配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
lie His Met Asp Ala Phe Ala Lys
1 5
配列番号 （SEQ ID NO ) : 1 4
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) ： 9
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： ア ミ ノ酸 （amino acid) 卜ポロ ジ— （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： peptide
ハイポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No 配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
Lys He His Met Asp Ala Phe Ala Lys
1 5
配列番号 （SEQ ID NO ) : 1 5
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) ： 8
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： ア ミ ノ酸 （amino acid) トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： peptide
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No 配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
Lys lie His Met Asp Ala Phe Ala
1 5
配列番号 （SEQ ID NO ) : 1 6
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 2 3
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid) 鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 一本鎖 （single)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
AARATHCAYA TGGAYGCITT YGC 23 配列番号 （SEQ ID NO ) : 1 7
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 2 3
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 一本鎖 （single)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （ linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
CTCGAGTTTT TTTTTTTTTT TTT 23 配列番号 （SEQ ID NO ) : 1 8
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 2 6
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 一本鎖 （single)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
TTCACCATGG AGCAAATCCA AATGGT 26 配列番号 （SEQ ID NO ) : 1 9
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 7
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
8 o 鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 一本鎖 （single)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
CGAGTCGCCC TCATCAC 17 配列番号 （SEQ ID NO ) : 2 0
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 6
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 一本鎖 （single)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
AACAGCTATG ACCATG 16 配列番号 （SEQ ID NO ) : 2 1
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) ： 6
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： ア ミ ノ酸 （amino acid)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： peptide
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
Asp Phe Gly Trp Gly し ys
1 5
配列番号 （SEQ ID NO ) : 2 2
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 7
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid) 鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 一本鎖 （single)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 （SEQUENCE DESCRIPTION)
GAYHYGGIT GGGGIAA 17 配列番号 （SEQ ID NO ) : 2 3
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 2 1
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 一本鎖 （single)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイボセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
TGGCAACTGT CTTGCGTCAT G 21 配列番号 （SEQ ID NO ) : 2 4
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 2 3
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 一本鎖 （single)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （ linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
CCATGTCAGG TGTGAGGTTC AAC 23 配列番号 （SEQ ID NO ) : 2 5
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 2 0
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid) 鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 一本鎖 （single)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
ATCGTTTCGC ATGATTGAAC 20 配列番号 （SEQ ID NO ) : 2 6
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 2 0
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 一本鎖 （single)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （ linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
TCAGAAGAAC TCGTCAAGAA 20 配列番号 （SEQ ID NO ) : 2 7
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 5 3
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 二本鎖 （double)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
GGGATCCAAC A ATG GAG CAA ATC CAA ATG GTG GCC GTG ATC GAA ACG TGT 50
Met Glu Gin lie Gin Met Val Ala Val lie Glu Thr Cys
1 5 10 AGA 53 Arg
15
配列番号 （SEQ ID NO ) : 2 8
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 1 6
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 一本鎖 （single)
ト ポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （l inear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
GTAAAACGAC GGCCAT 16 配列番号 （SEQ ID NO ) : 2 9
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 4 5
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 二本鎖 （double)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイ ポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
GGGATCCAAC A ATG GAG CAA ATC CAA ATG GTG AAC ATT CTC GAA C 45
Met Glu Gin He Gin Met Val Asn lie Leu Glu
1 5 10
配列番号 （SEQ ID NO ) : 3 0
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 2 1
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： —本鎖 （single) トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （linear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
CTCGGAGGAA TTCGGCACGA C 21 配列番号 （SEQ ID NO ) : 3 1
配列の長さ （SEQUENCE LENGTH ) : 3 5
配列の型 （SEQUENCE TYPE ) ： 核酸 （nucleic acid)
鎖の数 （STRANDEDNESS) ： 二本鎖 （double)
トポロ ジー （TOPOLOGY) ： 直鎖状 （l inear)
配列の種類 （MOLECULE TYPE ) ： synthetic DNA
ハイポセティ カル配列 （HYPOTHETICAL SEQUENCE ) ： No
配列 (SEQUENCE DESCRIPTION)
AGTCGGATCC AACA ATG ACC ACC CTC CTC GAA TCC 35
Thr Thr Leu Leu Glu Ser
1 5

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 芳香族ァ シル基転移活性を有する蛋白質又は該酵素活性を有 する誘導体をコー ドする遺伝子。
2 . 配列番号 ： 21に記載のァ ミ ノ酸配列をコ一 ドする塩基配列を プライマ一と して用いてク ローニングする こ とによ り得られる請求 項 1 記載の遺伝子。
3 . 前記ブラィマーが配列番号 22に記載の塩基配列を有するブラ イマ一である請求項 2 記載の遺伝子。
4 . 配列番号 ： 1 〜 6 のいずれかに記載のア ミ ノ酸配列、 又はそ れらのア ミ ノ酸配列に対して 1 個又は複数個のア ミ ノ酸の付加、 除 去又は他のァ ミ ノ酸による置換によ り修飾されているァ ミ ノ酸配列 をコー ドする請求項 1 又は 2 に記載の遺伝子。
5 . 配列番号 ： 1 〜 6 のいずれかに記載のア ミ ノ酸配列をコー ド する塩基配列の一部又は全部に対して、 5 x SS C 、 50°Cの条件下で ハイ ブリ ダィズする こ とができ、 且つ芳香族ァ シル基転移活性を有 する蛋白質をコー ドする、 請求項 1 又は 2 に記載の遺伝子。
6 . 配列番号 ： 1 〜 6 のいずれかに記載のア ミ ノ酸配列をコー ド する塩基配列の一部又は全部に対して、 2 x SSC 、 50°Cの条件下で ハイ プリ ダイズするこ とができ、 且つ芳香族ァ シル基転移活性を有 する蛋白質をコー ドする、 請求項 1 又は 2 に記載の遺伝子。
7 . 配列番号 ： 1 ~ 6 のいずれかに記載のア ミ ノ酸配列に対して 少な く と も 15 %以上の相同性を有するア ミ ノ酸配列を有し、 且つ芳 香族ァ シル基転移活性を有する蛋白質をコー ドする、 請求項 1 又は 2 に記載の遺伝子。
8 . 配列番号 ： 1 〜 6 のいずれかに記載のア ミ ノ酸配列に対して 少な く と も 30 %以上の相同性を有するア ミ ノ酸配列を有し、 且つ芳 香族ァ シル基転移活性を有する蛋白質をコー ドする、 請求項 1 又は 2 に記載の遺伝子。
9 . 請求項 1 〜 8 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を含んで成るベ ク タ一。
10. 請求項 9 に記載のベク ターにより形質転換された宿主。
11. 前記宿主が微生物又は動物細胞である請求項 10に記載の宿主
12. 前記宿主が植物細胞又は植物体である請求項 10に記載の宿主
13. 請求項 1 〜 8 のいずれか 1 項に記載の遺伝子によ り コー ドさ れる蛋白質。
14. 植物体の粗酵素抽出液をシバク ロ ンブルー 3 GAを固定した樹 脂を用いたァフ ィ 二ティ ーク ロマ ト グラフ ィ ーにより処理して得ら れる、 芳香族ァ シル基転移活性を有する蛋白質。
15. 請求項 13又は 14に記載の蛋白質に対する抗体と特異的に結合 する こ とができ、 且つ、 芳香族ァシル基転移活性を有する蛋白質。
16. 請求項 10に記載の宿主を培養し、 又は成育させ、 そ して該宿 主から、 芳香族ァ シル基転移活性を有する蛋白質を採取するこ とを 特徴とする、 該蛋白質の製造方法。
17. 植物体の粗酵素抽出液をシバク ロ ンブルー 3 GAを固定した樹 月旨を用いたァフ ィ 二テ ィ ーク ロマ ト グラ フ ィ ーにより処理する こ と を特徴とする、 芳香族ァ シル基転移活性を有する蛋白質の製造方法
18. 芳香族ァシル基転移活性を有する蛋白質の製造方法において 、 請求項 13〜 15のいずれか 1 項に記載の蛋白質に対する抗体と特異 的に結合する こ とを含むこ とを特徴とする方法。
19. 色素のァ シル化方法であって、 請求項 13〜 15のいずれか 1 項 に記載の蛋白質を色素に作用せしめることを特徴とする方法。
20. 植物体内における色素のァ シル化方法であって、 請求項 1 ~ 8のいずれか 1 項に記載の遺伝子を植物体内に導入し、 該遺伝子を 発現せしめ、 そして生成した蛋白質により植物体内の色素をァ シル 化することを特徴とする方法。
2 1 . 色素の安定化方法であって、 請求項 1 3〜 1 5のいずれか 1 項に 記載の蛋白質を作用させて色素をァ シル化することを特徴とする方 法
22. 植物体内における色素の安定化方法であって、 請求項 1 〜 8 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を植物体内に導入し、 該遺伝子を発 現せしめ、 そして生成した蛋白質により植物体内の色素をァシル化 することを特徴とする方法。
23. 植物の花色調節方法であって、 請求項 1 ~ 8のいずれか 1 項 に記載の遺伝子を植物体内に導入し、 該遺伝子を発現せしめ、 そし て生成した蛋白質により植物体内の色素をァ シル化することを特徴 とする方法。
24. 色素がア ン ト シァニ ンである請求項 1 9〜 23のいずれか 1 項に 記載の方法。
25. 請求項 1 〜 8 のいずれか 1 項に記載の遺伝子が導入されてお り、 色が調節された植物も しく はこれと同じ性質を有するその子孫 又はそれらの組織。
26. 前記組織が花である、 請求項 25記載の植物の組織。
27. 請求項 25記載の植物又はこれと同じ性質を有するその子孫の 切花。
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