KR102541987B1

KR102541987B1 - 3종의 재조합 항원을 이용하는 아프리카 돼지열병 진단용 항원 조성물 및 이를 포함하는 진단용 키트

Info

Publication number: KR102541987B1
Application number: KR1020210062542A
Authority: KR
Inventors: 나진주; 최지다; 김용주; 강해은; 이현정; 민동숙; 엄윤철; 장상호; 강보규
Original assignee: 주식회사 메디안디노스틱; 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2021-05-14
Publication date: 2023-06-12
Also published as: KR20220154952A

Abstract

본 발명은 아프리카돼지열병 바이러스 (African swine fever Virus; ASFV) 감염 여부를 진단하기 위해 3종의 재조합 항원을 포함하는 아프리카돼지열병 진단용 항원 조성물, 이를 이용하는 아프리카 돼지열병 진단용 키트 및 아프리카 돼지열병 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 본 발명의 항원 조성물을 이용하면 아프리카 돼지열병 항체를 검출함으로써, 진단 정확도가 우수하고, 키트로 제공되어 사용이 간편하고 신속하다.

Description

3종의 재조합 항원을 이용하는 아프리카 돼지열병 진단용 항원 조성물 및 이를 포함하는 진단용 키트 {COMPOSITION FOR DIAGNOSTIC AFRICAN SWINE FEVER USING THREE RECOMBINANT ANTIGENS AND DIAGNOSTIC KITS COMPRISING THEREOF}

본 발명은 아프리카돼지열병 바이러스 (African swine fever Virus; ASFV) 감염 여부를 진단하기 위해 3종의 재조합 항원을 이용하는 아프리카돼지열병 진단용 항원 조성물, 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 진단용 키트 및 아프리카 돼지열병 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

아프리카 돼지열병 (African swine fever; ASF)은 아스파비리대(Asfarviridae)에 속하는 아프리카 돼지열병 바이러스 (African swine fever virus; ASFV) 감염에 의한 돼지 전염병이다. 1921년 케냐에서 최초 발생 보고가 있은 후, 주로 사하라 이남 지역에서 발생 보고가 있었고, 2007년 이후로 흑해 연안인 죠지아 (Georgia), 아르메니아 (Armenia), 아제르바이잔 (Azerbaijan) 등 아프리카 이외 지역에서 그 발생 범위가 늘어나기 시작하였다. 특히 최근에는 러시아에서 동서로 그 발생이 확산되고 있으며, 우리나라와 교류가 많은 중국 및 동남아시아에서의 발병 사례가 급증하고 있다.

아프리카 돼지열병 바이러스는 일반 환경에 매우 저항성이 강하다. 아프리카 돼지열병 바이러스의 감염력은 실온에서 18개월 이상, 햄과 같은 식육제품에서는 6개월 이상 유지된다. 또한, 열에도 매우 강하여 56 ℃에서 최소 1시간 이상 노출하여야만 감염력이 없어지는 특성이 있는 것으로 알려져 있다.

아프리카 돼지열병은 돼지에 감염시 폐사율이 100%에 이르는 심각한 질병임에도 불구하고 이 질병에 대한 상용화된 백신은 없는 상태이다. 유럽지역에서 아프리카 돼지열병이 다시 확산되고 아시아 대륙까지 전파되면서 과거 제대로 진행되지 못했던 백신의 개발 연구에 이목이 집중되고 있다. 하지만 안전성 문제로 약독화 생독 백신은 개발이 제한적인 상황이고 이전의 실험적 연구에서도 큰 효과를 거두지 못하였다. 사독 백신 또한 방어에 효과적인 제품을 개발하는데 넘어야 산이 많다. 예를 들어, ASFV는 다른 바이러스보다 크고 복잡한 구조를 가지고 있어 무력화시키기에 효과적인 부위가 명확히 알려져 있지 않다.

아프리카 돼지열병 바이러스는 일반적인 RNA 바이러스들의 10배 수준으로 많은 유전자를 가지고 있다. 유전자가 크다 보니 유전자로부터 만들어질 수 있는 단백질 종류도 많으며, ASFV 유전체 (genome)는 통상 적어도 151개의 ORF를 암호화하는 것으로 알려져 있다. 아프리카 돼지열병 바이러스는 구조 단백질 개수도 많아 바이러스의 크기 자체가 다른 바이러스보다 훨씬 커서 돼지 써코바이러스 (Porcine circovirus)의 10배 이상, 돼지생식기 호흡기증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PRRS)의 4~5 배 크기에 달한다. 이렇게 아프리카 돼지열병 바이러스가 크고 복잡하다 보니 면역도 어려워 아직도 효과적인 백신이 개발되어 있지 못한 실정이다.

아프리카 돼지열병의 확진을 위해서는 진단 검사가 필수적이다. 진단 검사는 혈액 및 내부 장기에서 ASFV를 검출하거나 감염 돼지의 혈청에서 항체를 검출하는 방법이 있다. 항체를 검사하는 경우, 샘플은 감염 후 8~21일 사이의 회복기에 있는 감염 돼지의 혈청이 이상적이다. 감염돈의 혈청을 이용한 항체 검출법은 상용화된 효소면역분석법 (Enzyme Linked Immunosorbent assay; ELISA) 등을 이용하여 1차 선별검사를 진행하고 면역탁본법 (Immunoblot test; IB), 면역과산화효소시험 (immuno-peroxidase test; IPT), 간접형광항체법 (Indirect Immunofluorescence; IFA)을 통해 최종 평가할 수 있다. ASF는 질병의 진행 단계가 빠르고 다양하며 불현성 감염된 돼지도 존재할 수 있으므로 실험실에서는 반드시 항원 및 항체 검사를 함께 수행하여 정확하게 감염 여부를 파악해야 한다.

이에, 상업적으로 제공이 가능하고, 사용이 간편하며 신속ㆍ정확하게 ASFV의 감염 여부를 진단할 수 있는 관련 기술의 개발이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 아프리카 돼지열병 (African swine fever; ASF)의 감염여부를 신속하고 간편하면서도 높은 정확도로 진단할 수 있는 항원 조성물 및 이를 이용한 아프리카 돼지열병 진단용 키트를 제작하기 위해 노력하였다.

그 결과 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 이용하는 진단용 항원 조성물, 및 이를 포함하는 키트는 신속ㆍ간편하고 높은 정확도로 아프리카 돼지열병을 진단할 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 아프리카 돼지열병 (ASF) 진단용 항원 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 아프리카 돼지열병 항원 단백질 발현용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아프리카 돼지열병 (ASFV) 항원 단백질을 암호화하는 염기서열 증폭용 프라이머 세트 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아프리카 돼지열병 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아프리카 돼지열병 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 아프리카 돼지열병 (African swine fever; ASF) 진단용 항원 조성물, 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 진단용 키트 및 아프리카 돼지열병 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드;를 포함하는 아프리카 돼지열병 (African swine fever; ASF) 진단용 항원 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 아프리카 돼지열병 바이러스의 구조 단백질인 p22로부터 유래된 재조합 항원 단백질일 수 있다.

본 발명에 있어서 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 아프리카 돼지열병 바이러스의 구조 단백질인 p30로부터 유래된 재조합 항원 단백질일 수 있다.

본 발명에 있어서 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 아프리카 돼지열병 바이러스의 구조 단백질인 p54로부터 유래된 재조합 항원 단백질일 수 있다.

재조합 항원 단백질은 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 예를 들어, 이와 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 상동성을 가져 기능적으로 동등한 단백질일 수 있다.

본 발명에 있어서 항원 조성물에 포함된 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 0.3 내지 0.7 ug/mL, 0.3 내지 0.6 ug/mL, 0.4 내지 0.7 ug/mL, 0.4 내지 0.6 ug/mL 또는 0.5 ug/mL일 수 있으며, 예를 들어, 0.5 ug/mL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 항원 조성물에 포함된 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 0.7 내지 1.3 ug/mL, 0.7 내지 1.2 ug/mL, 0.7 내지 1.1 ug/mL, 0.8 내지 1.3 ug/mL, 0.8 내지 1.2 ug/mL, 0.8 내지 1.1 ug/mL, 0.9 내지 1.3 ug/mL, 0.9 내지 1.2 ug/mL 또는 0.9 내지 1.1 ug/mL일 수 있으며, 예를 들어, 1.0 ug/mL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 항원 조성물에 포함된 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 3.0 내지 5.0 ug/mL, 3.0 내지 4.8 ug/mL, 3.0 내지 4.5 ug/mL, 3.0 내지 4.2 ug/mL, 3.2 내지 5.0 ug/mL, 3.2 내지 4.8 ug/mL, 3.2 내지 4.5 ug/mL, 3.2 내지 4.2 ug/mL, 3.5 내지 5.0 ug/mL, 3.5 내지 4.8 ug/mL, 3.5 내지 4.5 ug/mL, 3.5 내지 4.2 ug/mL, 3.8 내지 5.0 ug/mL, 3.8 내지 4.8 ug/mL, 3.8 내지 4.5 ug/mL 또는 3.8 내지 4.2 ug/mL일 수 있으며, 예를 들어, 4.0 ug/mL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 항원 조성물에 포함된 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 0.5 ug/mL이고, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 1.0 ug/mL이며, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 4.0 ug/mL일 수 있다.

본 발명의 다른 일 예는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 제1 재조합 벡터; 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 제2 재조합 벡터; 및 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 제3 재조합 벡터;를 포함하는 아프리카 돼지열병 (ASF) 항원 단백질 발현용 벡터에 관한 것이다.

서열번호 7의 염기서열은 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열일 수 있다.

서열번호 8의 염기서열은 서열번호 11의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열일 수 있다.

서열번호 9의 염기서열은 서열번호 12의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "벡터 (vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Chron, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 또한, 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

본 발명에 있어서 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

숙주로는 예를 들어, 대장균, 효모, 동물세포, 식물세포, 또는 곤충세포 등을 포함할 수 있다. 원핵세포는 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 서열번호 7의 염기서열 또는 이와 실질적 동일성을 갖는 염기서열; 서열번호 8의 염기서열 또는 이와 실질적 동일성을 갖는 염기서열; 및 서열번호 9의 염기서열 또는 이와 실질적 동일성을 갖는 염기서열;은 각기 하나의 벡터에 도입되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 “실질적 동일성”은 각각의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열이 각각의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 일 예는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트;를 포함하고,

아프리카 돼지열병 (ASF) 항원 단백질을 암호화하는 염기서열 증폭용 프라이머 세트 조성물에 관한 것이다.

증폭된 아프리카 돼지열병 항원 단백질을 암호화하는 염기서열은 아프리카 돼지열병 (ASF) 항원 단백질 발현용 벡터에 도입되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트는 아프리카 돼지열병 바이러스의 구조 단백질인 p22을 암호화하는 염기서열에 특이적인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트는 아프리카 돼지열병 바이러스의 구조 단백질인 p30을 암호화하는 염기서열에 특이적인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트는 아프리카 돼지열병 바이러스의 구조 단백질인 p54를 암호화하는 염기서열에 특이적인 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프라이머 (primer)"는 핵산 가닥 (템플레이트, template)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하에서, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재 시, 그리고 적합한 온도와 pH에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것일 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트 조성물은 해당 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 추가의 특징은 자연 발생 (naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드, 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

프라이머는, 중합제의 존재하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍 시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스 (source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정될 것이다.

본 명세서에서 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 템플레이트 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치 (apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 템플레이트 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "혼성화 (hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 일치하거나 일부 미스매치로 실질적으로 일치하는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다. 본 명세서에서의 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 조성물은 p22 항원 단백질을 암호화하는 염기서열과 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 조성물은 p30 항원 단백질을 암호화하는 염기서열과 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 조성물은 p54 항원 단백질을 암호화하는 염기서열과 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예는 본 발명의 또 다른 일 예는 아프리카 돼지열병 (African swine fever; ASF) 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 진단용 키트는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드;를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 키트에 포함된 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 0.3 내지 0.7 ug/mL, 0.3 내지 0.6 ug/mL, 0.4 내지 0.7 ug/mL, 0.4 내지 0.6 ug/mL 또는 0.5 ug/mL일 수 있으며, 예를 들어, 0.5 ug/mL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 키트에 포함된 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 0.7 내지 1.3 ug/mL, 0.7 내지 1.2 ug/mL, 0.7 내지 1.1 ug/mL, 0.8 내지 1.3 ug/mL, 0.8 내지 1.2 ug/mL, 0.8 내지 1.1 ug/mL, 0.9 내지 1.3 ug/mL, 0.9 내지 1.2 ug/mL 또는 0.9 내지 1.1 ug/mL일 수 있으며, 예를 들어, 1.0 ug/mL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 키트에 포함된 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 3.0 내지 5.0 ug/mL, 3.0 내지 4.8 ug/mL, 3.0 내지 4.5 ug/mL, 3.0 내지 4.2 ug/mL, 3.2 내지 5.0 ug/mL, 3.2 내지 4.8 ug/mL, 3.2 내지 4.5 ug/mL, 3.2 내지 4.2 ug/mL, 3.5 내지 5.0 ug/mL, 3.5 내지 4.8 ug/mL, 3.5 내지 4.5 ug/mL, 3.5 내지 4.2 ug/mL, 3.8 내지 5.0 ug/mL, 3.8 내지 4.8 ug/mL, 3.8 내지 4.5 ug/mL 또는 3.8 내지 4.2 ug/mL일 수 있으며, 예를 들어, 4.0 ug/mL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 키트에 포함된 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 0.5 ug/mL이고, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 1.0 ug/mL이며, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 농도는 4.0 ug/mL일 수 있다.

본 발명에 있어서 키트는 표면에 펩타이드가 코팅된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 키트는 항원-항체 반응을 이용하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 키트는 아프리카 돼지열병 바이러스 I형에 감염되거나, II형에 감염되거나, 또는 동시에 I형과 II형에 감염되었는지 여부를 진단하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 키트는 발색효소를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 발색효소는 Q dot (Quantum dot), HRPO (Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제 (Glucose Oxidase), 루시퍼라아제 (luciferase), 베타-디-갈락토시다아제 (β말산탈수소효소 (malate dehydrogenase; MDH) 및 아세틸콜린에스터라아제 (acetylcholinesterase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 효소와 프로틴 A가 컨쥬게이션 (conjugation)된 것일 수 있으며, 예를 들어, HRPO와 프로틴 A가 컨쥬게이션된 HRPO 컨쥬게이트 (HRPO Conjugate)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, HRPO 컨쥬게이트는 Protein A (Microprotein, cat. no. A100L20) 및 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase; HRP)와 프로틴 A (Protein A)를 컨쥬게이션 (Conjugation)함으로써 생성되는 것일 수 있다.

HRPO 컨쥬게이트는 검체 내 특이 항원에 대한 항체와 결합하여 발색 반응을 나타낼 수 있다. 이 때 발색이 나타나지 않는다면, 검체 내 컨쥬게이트와 반응하는 특이 항원에 대한 항체가 없음을 의미한다. 즉, 검체 내 항체가 없다면 코팅된 항원 단백질에 어떠한 항체도 결합하지 못하고 발색 반응도 나타나지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 키트는 HRPO 컨쥬게이트 (Horseradish peroxidase Conjugate)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예는 다음의 단계를 포함하는 아프리카 돼지열병 (African swine fever; ASF) 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다:

시료를 준비하는 준비 단계; 및

시료를 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 접촉시키는 접촉 단계.

본 발명에 있어서 시료는 아프리카 돼지열병 바이러스 I형 (African swine fever virus type I; ASFV type I) 및 아프리카 돼지열병 바이러스 II형 (ASFV type II)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이러스, 및 이의 항체를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 소변, 눈물, 윤활액, 타액, 상처 유체 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로부터 분리된 것일 수 있으며, 예를 들어, 혈청으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 접촉 단계는 시료를 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 접촉시키는 것일 수 있다. 이를 통해, 항원-항체 반응 (antigen-antibody reaction)이 진행될 수 있다.

본 발명에 있어서 접촉 단계는 20 내지 30 ℃, 20 내지 29 ℃, 20 내지 28 ℃, 21 내지 30 ℃, 21 내지 29 ℃, 21 내지 28 ℃, 22 내지 30 ℃, 22 내지 29℃ 또는 22 내지 28 ℃의 온도 조건에서 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 22 내지 28 ℃의 온도 조건 (상온)에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 정보 제공 방법은 접촉 단계를 수행한 시료를 발색효소와 접촉시키는 발색 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 발색효소는 HRPO (Horseradish peroxidase) 및 Protein A가 컨쥬게이션 (conjugation)된 HRPO 컨쥬게이트 (conjugate)일 수 있다.

HRPO 컨쥬게이트는 검체 내 특이 항원에 대한 항체와 결합하여 발색 반응을 나타낼 수 있다. 이 때 발색이 나타나지 않는다면, 검체 내 컨쥬게이트와 반응하는 특이 항원에 대한 항체가 없음을 의미한다. 즉, 발색 단계에서 발색 반응이 나타나지 않는다면 검체 내 항체가 없음을 의미한다.

본 발명의 정보 제공 방법은 시료에 아프리카 돼지열병 바이러스의 항체가 존재하는지를 확인함으로써, 대상체가 아프리카 돼지열병에 감염되었는지 여부를 간편하고 신속하게 확인할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 구조 단백질인 p22, p30 및 p54로부터 재조합 항원에서 발현시키려는 부위를 나타낸 모식도이다.
도 2a 내지 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 구조 단백질인 p22, p30 및 p54를 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드가 DH5a 대장균에 도입되었는지를 전기영동법으로 확인한 것이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합된 p22, p30 및 p54 단백질의 발현을 확인한 SDS-PAGE 사진이다.
도 4a 내지 4c는 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합된 p22, p30 및 p54 단백질을 정제한 SDS-PAGE 사진이다.
도 5는 ASFV 유전자 II형 (파주 분리)에 대하여, 본 발명의 키트를 이용한 반응성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6c는 ASFV 유전자 II형 (파주 분리)에 대하여, 상용화된 종래의 키트 (ID Screen Confirmation ELISA, ID Screen Competition ELISA 및 INgezim PPA COMPAC ELISA)를 이용한 반응성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 ASFV 유전자 I형 (OURT 88/3)에 대하여, 본 발명의 키트를 이용한 반응성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 8c는 ASFV 유전자 I형 (OURT 88/3)에 대하여, 상용화된 종래의 키트 (ID Screen Confirmation ELISA, ID Screen Competition ELISA 및 INgezim PPA COMPAC ELISA)를 이용한 반응성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 ASFV 비발생 지역의 항혈청에 대하여, 본 발명의 키트를 이용한 반응성 측정 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. ASFV의 재조합 항원 유전자 클로닝

아프리카 돼지콜레라 바이러스 (African swine fever virus; ASFV)의 구조 단백질인 p22, p30 및 p54의 발현을 위해, AccuPower^® ProFi Taq PCR PreMix를 이용하여 에스토니아-2014주로부터 20 ul의 DNA 시료를 준비하였다. 발현하려는 p22-TM, p30 및 p54-TM의 부위를 도 1에 모식도로 나타내었다.

p22, p30 및 p54를 암호화하는 염기서열의 중합효소연쇄반응 (Polymerase chain reaction; PCR)은 변성 (denaturation) (94 ℃, 30초), 어닐링 (annealing) (55 ℃, 30초), 연장 (extension) (72 ℃, 60초)으로 1회의 사이클 (cycle)을 구성하여 총 30 사이클을 수행하였고, 마지막 사이클을 수행한 후 72 ℃에서 5분 동안 유지하였다. PCR 증폭에 이용된 ASFV 재조합 항원 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.

서열번호	명명	서열목록(5` -> 3`)	비고
1	ASFV p22 Forward	CGGGATCCTATAAGAAACAACAACCACCGA	△Transmembrane
2	ASFV p22 Reverse	CCCTCGAGTGCATGTTTATGATTTCTAGGT
3	ASFV p30 Forward	AACGGATTTAAGATCATCTTCACAAGTTGTGTTTCATGCGGGTAG
4	ASFV p30 Reverse	CTACCCGCATGAAACACAACTTGTGAAGATGATCTTAAATCCGTT
5	ASFV p54 Forward	CGCGGATCCGAATTCATGTATACTATTCTC	△Transmembrane
6	ASFV p54 Reverse	CGCAAGCTTGTCGACCAAGGAGTTTTCTAG

합성된 p22-TM, p30 및 p54-TM의 유전자 단편을 각각 pET32a (Novagen) 벡터의 MCS (multiple coloning site)에 존재하는 제한효소 자리인 BamHIㆍXhoI을 이용하여 p22-TM을 클로닝하고, 그리고 EcoRIㆍSalI을 이용하여 p30과 p54-TM을 클로닝하였다. 형질전환은 열 충격법 (Heat shock)을 이용하여 DH5a 대장균에 삽입함으로써 수행되었다. 이후, 플라스미드 DNA를 추출하고 제한효소를 처리함으로써 도입 유전자의 서열을 확인하여, 그 결과를 도 2a 내지 2c에 나타내었다.

도입 유전자의 서열은 표 2에 나타내었다.

서열번호	명명	서열목록(5'->3')	비고
7	p22-TM nucleotide	ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCG GACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCC CCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAAC ATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTG CTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTG AAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCAT CATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAA TTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATG GCTGATATCGGATCCTATAAGAAACAACAACCACCGAAAAAGGTCTGTAAAGTAGATAAA GATTGTGGTAGTGGAGAGCATTGTGTTCGTGGATCATGTAGCTCATTGAGCTGCTTAGAT GCCGTAAAAATGGACAAACGAAATATTAAGATAGATTCTAAGATTTCCTCATGCGAATTC ACTCCCAATTTTTACCGTTTTACGGATACTGCTGCTGATGAGCAGCAAGAATTTGGAAAA ACACGGCATCCTATAAAAATAACTCCATCTCCAAGTGAATCCCATAGCCCCCAAGAGGTG TGTGAAAAATATTGTTCATGGGGAACCGATGACTGTACAGGTTGGGAATATGTTGGTGAT GAAAAGGAGGGAACATGTTATGTATATAATAATCCACATCACCCGGTTCTTAAATATGGT AAGGATCACATCATAGCCTTACCTAGAAATCATAAACATGCACTCGAGCACCACCACCAC CACCACTGA	969 nt
8	p30 nucleotide	ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCG GACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCC CCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAAC ATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTG CTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTG AAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCAT CATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAA TTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATG GCTGATATCGGATCCGAATTCATGGATTTTATTTTAAATATATCCATGAAAATGGAGGTC ATCTTCAAAACGGATTTAAGATCATCTTCACAAGTTGTGTTTCATGCGGGTAGTCTGTAT AATTGGTTTTCTGTTGAGATTATCAATAGCGGTAGAATTGTTACGACCGCTATAAAAACA TTGCTTAGTACTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCGTATATATGCAGGGCAAGGG TATACTGAACATCAGGCTCAAGAAGAATGGAATATGATTCTGCATGTGCTGTTTGAAGAG GAGACGGAATCCTCAGCATCTTCGGAGAACATTCATGAAAAAAATGATAATGAAACCAAT GAATGCACATCCTCCTTTGAAACGTTGTTTGAGCAAGAGCCCTCATCGGAGGTACCTAAA GACTCCAAGCTGTATATGCTTGCACAAAAGACTGTGCAACATATTGAACAATATGGAAAG GCACCTGATTTTAACAAGGTTATTAGAGCACATAATTTTATTCAAACCATTTATGGAACC CCTCTAAAGGAAGAAGAAAAAGAGGTGGTAAGACTCATGGTTATTAAACTTTTAAAAAAA AAAGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA	1131 nt
9	p54-TM nucleotide	ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCG GACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCC CCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAAC ATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTG CTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTG AAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCAT CATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAA TTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATG GCTGATATCGGATCCGAATTCATGGATTCTGAATTTTTTCAACCGGTTTATCCGCGGCAT TATGGTGAGTGTTTGTCACCAGTCACTACACCAAGCTTCTTCTCCACACATATGTATACT ATTCTCATTGCTATCGTGGTCTTAGTCATCATTATCATCGTTCTAATCTATCTATTCTCT TCAAGAAAGAAAAAAGCTGCTGCTATTGAGGAGGAGGATATACAGTTTATAAATCCTTAT CAAGATCAGCAGTGGGTAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCAGCTGGAGCG ACTACAGCAAGTGTAGGCAAGCCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACA AACAAACCAGTTACGGACAACCCAGTTACGGACAGACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCG GCGGCCGCACCTGCGGCCGCGAGTGCTCCTGCTCATCCGGCTGAGCCTTACACGACAGTC ACTACTCAGAACACTGCTTCACAAACAATGTCGGCTATTGAAAATTTACGACAAAGAAAC ACCTATACGCATAAAGACCTAGAAAACTCCTTGGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAG CACCACCACCACCACCACTGA	1101 nt

표 2의 도입 유전자로부터 발현된 재조합 항원의 아미노산 서열은 표 3에 나타내었다.

서열번호	명명	서열목록(N-ter -> C-ter)	비고
10	p22-TM polypeptide	MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLN IDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHH HHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSYKKQQPPKKVCKVDK DCGSGEHCVRGSCSSLSCLDAVKMDKRNIKIDSKISSCEFTPNFYRFTDTAADEQQEFGK TRHPIKITPSPSESHSPQEVCEKYCSWGTDDCTGWEYVGDEKEGTCYVYNNPHHPVLKYG KDHIIALPRNHKHALEHHHHHH	322 aa
11	p30 polypeptide	MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLN IDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHH HHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEFMDFILNISMKMEV IFKTDLRSSSQVVFHAGSLYNWFSVEIINSGRIVTTAIKTLLSTVKYDIVKSARIYAGQG YTEHQAQEEWNMILHVLFEEETESSASSENIHEKNDNETNECTSSFETLFEQEPSSEVPK DSKLYMLAQKTVQHIEQYGKAPDFNKVIRAHNFIQTIYGTPLKEEEKEVVRLMVIKLLKK KVDKLAAALEHHHHHH	376 aa
12	p54-TMpolypeptide	MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLN IDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHH HHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEFMDSEFFQPVYPRH YGECLSPVTTPSFFSTHMYTILIAIVVLVIIIIVLIYLFSSRKKKAAAIEEEDIQFINPY QDQQWVEVTPQPGTSKPAGATTASVGKPVTGRPATNRPATNKPVTDNPVTDRLVMATGGP AAAPAAASAPAHPAEPYTTVTTQNTASQTMSAIENLRQRNTYTHKDLENSLVDKLAAALE HHHHHH	366 aa

실시예 2. ASFV 재조합 항원의 발현

p22-TM 플라스미드와 p30 플라스미드는 각각 BL21(DE3) 발현 대장균에, p54-TM 플라스미드는 BL21 codonplus (DE3) 발현 대장균에 형질 전환하여 재조합 항원의 발현을 확인하였다.

OD600 값이 0.5일 때, 1 mM 이소프로필 β1-티오갈락토피라노사이드 (Isopropyl βIPTG)로 인덕션하여 37 ℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액은 6,000 rpm, 15분, 4 ℃ 조건에서 원심분리하여 수확하였다. 재조합 항원의 발현 여부의 확인을 위하여, SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 수행하였고, 그 결과를 도 3a 내지 3c에 나타내었다.

도 3a 내지 3c에서 확인할 수 있듯이, Lane 3 및 Lane 4의 밴드가 진한 것으로 보아 각각의 ASFV 재조합 항원은 적절히 발현되었다.

실시예 3. ASFV 재조합 항원의 정제

재조합 항원 (항원 단백질)의 정제는 재조합 항원의 C-말단 (C-terminal)에 존재하는 6X His tag을 이용하여 니켈 (Ni) 친화성 크로마토그래피로 정제 조건을 확립하였다. 크로마토그래피 정제는 AKTA Start (GE 헬스케어)를 이용하였다. HiTrap Chelating HP 컬럼 (GE Healthecare)에 0.1 M NiSO₄ [Nickel(II) sulfate] 용액을 흘려준 후 증류수 (DW)로 세척하여 컬럼을 준비하였다.

재조합 항원의 정제를 위해 대장균 침전물을 20 mM 이미다졸 (Imidazole)이 포함된 50 mM Tris-base, 150 mM NaCl pH 8.7 용액으로 현탁하였다. 현탁한 대장균 침전물은 초음파 분쇄기 (Sonicator)를 이용하여 파쇄한 후 12,578 x g에서 10분 동안 원심 분리하여 (A50S-8 No.7 Rotor, 한일), 상등액 (단백질 추출액)을 수득하였다.

단백질 추출액은 Millipore 0.45 um 시린지 필터 (syringe filter)로 여과하였고, 20 mM 이미다졸이 포함된 50 mM Tris-base, 150 mM NaCl pH 8.7 버퍼로 평형화된 HiTrap Chelating HP 컬럼 (GE 헬스케어)에 로딩하였다.

컬럼의 비드에 결합된 단백질은 100 mM 이미다졸이 포함된 50 mM Tris-base, 150 mM NaCl pH 8.7 세척 버퍼로 세척한 후, 500 mM 이미다졸이 들어있는 버퍼로 재조합 항원의 용출을 수행하였다. 용출된 단백질은 14 kDa 컷-오프 투석 튜빙 (Cut-off dialtsis tubing, 시그마)을 이용하여, 50 mM 탄산염-탄산수소염 (Carbonate-Bicarbonate) pH 9.6 버퍼에 대해 하룻밤 동안 1번, 그리고 6시간 동안 1번 투석하였다.

투석한 단백질을 회수하여 BCA 단백질 어세이 키트 (Thermo Scientific)를 이용하여 정량하고, 단백질 (항원 단백질)의 순도는 SDS-PAGE로 확인하여, 그 결과를 도 4a 내지 4c 및 표 4에 나타내었다.

	BSA Control	ASFV p22 (2배 희석)	ASFV p30 (원액)	ASFV p54 (2배 희석)
A	1,940.2	1,902.7	1,088.3	1,266.6
B	1,078.1	1,114.9	624.7	745.9
C	571.3	519.7	295.5	331.2
D	289.5	260.3	81.6	170.1
E	123.5	95.1	<Min	49.6
F	38.6	<Min	<Min	<Min
G	<Min	<Min	<Min	<Min
H	<Min	<Min	<Min	<Min

ASFV 항원 시료의 농도는 표 4에 나타난 것과 같이 A와 B well의 흡광도 값에 시료 희석 비율을 곱하여 얻은 값의 평균값으로 수치를 계산하였으며, BSA control의 농도는 2 mg/mL이다. 항원 시료 희석방법은 A well은 희석하지 않고 얻은 수치값이며 B~H well까지 2진 희석으로 항원 시료를 희석하여 수치값을 얻었다. 이런 계산법으로 나타내면 ASFV p22 항원의 농도는 4.1 mg/mL이고, ASFV p30의 농도는 1.2 mg/mL, ASFV p54의 농도는 2.8 mg/mL 이었다.

실시예 4. ASFV 재조합 항원을 이용한 항체 진단 키트의 제작 및 성능 평가

4-1. ASFV 감염 양성 혈청 구축

약 8주령의 일반 돼지 10두를 준비하였다. 돼지는 5두씩 2개의 군으로 나누고, 1군에는 ASF OURT 88/3 바이러스 [약독화 ASFV(유전형 I형)]를 10⁴ TCID50 (Tissue Culture Infective Dose 50%) 만큼 근육 주사로 접종하고 (표 5의 개체번호 8-6 내지 8-10), 다른 1군에는 국내 분리 파주 1차 [국내 발생 ASFV(유전형 II형)] 바이러스를 10 HAD⁵⁰/ml 만큼 근육 주사로 접종하였다 (표 6의 개체 번호 7-1 내지 7-5).

접종 후, 0 내지 28일 동안 경시별 채혈을 진행하여 혈청을 분리하였고, 혈청은 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 및 IPT (Indirect Immunoperoxidase Test)를 이용하여 ASFV 항체를 측정하여 역가를 평가하였다. 평가 결과는 표 5 및 6에 나타내었다.

개체 번호	DPI^*	0	3	5	7	8	9	11	12	13	14	28
8-6	IPT Titer	-	-	-	-	40배	40배	400배	400배	400배	400배	4000배
8-7	IPTTiter	-	-	-	-	40배	40배	400배	400배	400배	400배	N/T^**
8-8	IPTTiter	-	-	-	40배	40배	40배	400배	400배	400배	400배	4000배
8-9	IPTTiter	-	-	-	-	-	400배	400배	400배	4000배	4000배	40000배
8-10	IPTTiter	-	-	-	-	-	40배	40배	400배	40배	400배	40000배

DPI^*: 접종 후 경과일 (day of post-infection), N/T^**: 폐사

표 5의 개체번호 8-7은 접종 14일 경과 후 안락사하였다.

개체 번호	DPI	0	3	5	7	8	9	11	12	13	14	15	17
7-1	IPT Titer	-	-	-	-	-	-	40배	N/T	N/T	N/T	N/T	N/T
7-2	IPTTiter	-	-	-	-	40배	N/T	N/T	N/T	N/T	N/T	N/T	N/T
7-3	IPTTiter	-	-	-	-	-	40배	40배	N/T	N/T	N/T	N/T	N/T
7-4	IPTTiter	-	-	-	-	N/T	N/T	N/T	N/T	N/T	N/T	N/T	N/T
7-5	IPTTiter	-	-	-	-	-	-	-	40배	40배	40배	40배	40배

표 6의 모든 두수는 접종 후 7일 내지 17일 경과 후 폐사하였다.

4-2. ASFV 음성 혈청 구축

ASFV 비발생 지역인 미국의 2017년 야외 샘플 (424개 샘플)과 국내 ASFV 발생 전인 2012년 야외 샘플 (592개 샘플)을 모아 평가에 사용하였다.

4-3. ASFV 항원 단백질 부동화 키트의 제작

ASFV 항원 단백질의 플레이트 부착 농도는 표 7에 나타난 것과 같이 ASFV 항원 단백질 p22, p30 및 p54의 혼합 비율을 다르게 하여 얻은 실험값으로 농도를 설정하였다. 항원 단백질 혼합 비율을 비교한 결과, ID.vet사에서 판매하는 ASFV 감염혈청을 희석한 샘플 (Sample 1)을 가장 민감하게 표현하는 혼합 비율은 p22를 0.5 ug/mL 농도로, p30을 1.0 ug/mL 및 p54를 4.0 ug/mL의 농도로 혼합한 실험 조건인 것으로 나타났다.

	실시예 1		실시예 2		실시예 3
Antigencoating concentration	p22 (0.50 ug/mL)+ p30 (1.00 ug/mL)+ p54 (4.00 ug/mL)		p22 (3.00 ug/mL)+ p30 (1.00 ug/mL)+ p54 (1.00 ug/mL)		p22 (1.00 ug/mL)+ p30 (3.00 ug/mL)+ p54 (1.00 ug/mL)
Sample	O.D	S/P Value	O.D	S/P Value	O.D	S/P Value
Sample 1-1	1.861	1.44	1.702	1.28	1.557	1.28
Sample 1-2	1.297	1.01	1.273	0.96	1.133	0.93
Sample 1-3	0.894	0.69	0.909	0.69	0.774	0.63
Sample 1-4	0.578	0.45	0.568	0.43	0.554	0.45
Sample 1-5	0.402	0.31	0.388	0.29	0.314	0.26
Sample 1-6	0.249	0.19	0.324	0.24	0.221	0.18
Sample 1-7	0.216	0.17	0.264	0.20	0.138	0.11
Sample 1-8	0.183	0.14	0.149	0.11	0.126	0.10

이에, 96웰 마이크로플레이트 (well microplate)에 ASFV 항원 단백질 p22 [발현숙주세포 BL21 (DE3)]를 0.50 ug/mL 농도로, p30 [발현숙주세포 BL21 (DE3)]을 1.00 ug/mL의 농도로, p54 [발현숙주세포 BL21 codonplus (DE3)]를 4.00 ug/mL의 농도로 웰당 100 ul씩 가하여 플레이트 표면에 부착시킨 후, 반응하지 않은 항원 단백질은 세척하여 제거하였다.

1% Casein-PBS-T blocking 용액을 웰 당 200 ul씩 분주하고 25 ℃ 조건에서 2 시간 동안 반응시킨 후, 인산 완충용액-tween 20 [0.05% tween-20 (v/v%)이 포함된 인산완충용액, pH 7.4; 이하, PBS-T]으로 3회 세척하여, 키트를 제작하였다.

4-4. 효소 면역 측정법의 반응성 평가 시험

(1) HRPO 컨쥬게이트 준비

Protein A (Microprotein, cat. no. A100L20) 및 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase; HRP)를 컨쥬게이션한 HRPO 컨쥬게이트 (Conjugate)를 컨쥬게이트 희석 버퍼 (인산완충용액-tween 20 0.05%, pH 7.4)에 5 ng/ml로 희석하여 이용하였다.

(2) 검체 희석 버퍼 (specimen dilution buffer)

돼지 혈청 검체를 희석하기 위한 검체 희석 버퍼는 PBS-T를 사용하였다.

(3) 반응성 평가

키트에 ASFV 감염에 의한 항혈청 및 다양한 음성 항혈청을 1:100으로 희석한 후 96웰 플레이트의 각 웰에 100 ul씩 가하여 45분 동안 실온 (25 ± 3 ℃)에서 반응시키고, PBS-T 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 검체를 제거하였다.

다음으로 HRPO 컨쥬게이트를 0.005 ug/mL 농도로 가하여 30분 동안 실온 (25 ± 3 ℃)에서 반응시키고, PBS-T로 3회 세척하였다. HRPO 컨쥬게이트 항체는 검체 내 특이 항원에 대한 항체와 결합하여 발색 반응을 나타낸다. 발색이 나타나지 않는다면, 검체 내 컨쥬게이트와 반응하는 특이 항원에 대한 항체가 없음을 의미한다. 검체 내 항체가 없다면 코팅된 항원 단백질에 어떠한 항체도 결합하지 못하고 발색 반응이 나타나지 않게 된다.

반응하지 않은 HRPO 컨쥬게이트를 세척한 후, 퍼옥시다제의 기질용액 (TMB substrate solution)을 가하여 반응시키고 황산 (sulfuric acid, H₂SO₄) 0.5 M을 플레이트의 각 웰에 50 ul씩 분주한 뒤, Sunrise ELISA reader (Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 항원에 대한 반응성을 측정하였다.

먼저, ASFV 유전자 II형 (파주 분리)에 대하여, 본 발명의 키트를 이용한 반응성 측정 결과는 도 5에 나타내었고, 상용화된 종래의 키트 (ID Screen Confirmation ELISA, ID Screen Competition ELISA 및 INgezim PPA COMPAC ELISA)를 이용한 반응성 측정 결과는 도 6a 내지 6c에 나타내었다. [빨간색 절취선은 Positive cut-off line (upper dotted line), 파란색 절취선은 Suspected cut-off line (lower dotted line)을 나타낸 것임] 여기서, cut-off line이란 양음성 판정기준을 의미한다. suspected cut-off line은 제품마다 양성 또는 음성, 즉 2개로만 판정하지 않고 의양성이란 구간을 설정하여 키트의 판정기준을 총 3가지로 나누어 의양성 구간을 판정하는 기준점을 의미한다.

도 5의 실험값은 표 8에, 도 6a 내지 6c의 실험값은 표 9 내지 11에 나타내었다.

개체 번호	DPI	0	3	5	7	8	9	11	12	13	14	15	17
7-1	S/P Value	0.110	0.099	0.098	0.076	0.267	0.619	0.935	-	-	-	-	-
7-2	S/PValue	0.110	0.108	0.126	0.240	0.545	-	-	-	-	-	-	-
7-3	S/PValue	0.102	0.089	0.160	0.213	0.051	0.742	1.069	-	-	-	-	-
7-4	S/PValue	0.142	0.095	0.100	0.380	0.245	-	-	-	-	-	-	-
7-5	S/PValue	0.089	0.069	0.080	0.088	0.087	0.079	0.073	0.086	0.096	0.140	0.288	0.252

개체 번호	DPI	0	3	5	7	8	9	11	12	13	14	15	17
7-1	PI(%) Value	1.6	25.2	27.2	14.7	0.0	36.5	44.6	-	-	-	-	-
7-2	PI(%)Value	19.1	30.0	24.6	28.1	41.0	-	-	-	-	-	-	-
7-3	PI(%)Value	1.6	30.7	25.7	18.5	0.0	35.6	42.5	-	-	-	-	-
7-4	PI(%)Value	24.6	34.4	20.0	28.1	-	-	-	-	-	-	-	-
7-5	PI(%)Value	20.4	28.9	33.4	29.2	21.8	26.1	25.8	18.2	11.0	16.9	0.0	19.7

개체 번호	DPI	0	3	5	7	8	9	11	12	13	14	15	17
7-1	S/P(%) Value	-0.2	1.0	-0.8	0.3	3.6	7.9	4.1	-	-	-	-	-
7-2	S/P(%)Value	-0.3	-1.9	0.1	2.7	5.5	-	-	-	-	-	-	-
7-3	S/P(%) Value	0.9	0.2	1.0	4.4	6.4	10.7	12.9	-	-	-	-	-
7-4	S/P(%) Value	-1.9	-2.5	-0.6	-2.0	-	-	-	-	-	-	-	-
7-5	S/P(%)Value	0.2	-1.7	3.9	1.2	0.8	0.3	2.8	1.6	0.6	0.2	-3.2	1.9

개체 번호	DPI	0	3	5	7	8	9	11	12	13	14	15	17
7-1	S/P(%) Value	0.6	0.7	1.2	0.6	1.6	3.8	4.5	-	-	-	-	-
7-2	S/P(%)Value	0.6	0.3	0.2	1.2	2.9	-	-	-	-	-	-	-
7-3	S/P(%)Value	0.7	0.7	0.9	1.6	4.5	8.9	7.7	-	-	-	-	-
7-4	S/P(%)Value	1.1	0.6	0.4	1.0	-	-	-	-	-	-	-	-
7-5	S/P(%)Value	0.6	0.0	0.7	0.5	0.2	0.0	0.3	0.6	0.5	0.2	0.0	0.0

도 5 및 도 6a 내지 6c, 표 8 내지 11에서 확인할 수 있듯이, 유전자 II형 검체에 대하여 ASFV 재조합 항원 (p22+p30+p54)으로 플레이트가 코팅된 본 발명의 키트는 종래의 상용화된 키트들 보다 월등히 높은 반응성을 나타내었다.

다음으로, ASFV 유전자 I형 (OURT 88/3)에 대하여, 본 발명의 키트를 이용한 반응성 측정 결과는 도 7에 나타내었고, 상용화된 종래의 키트 (ID Screen Confirmation ELISA, ID Screen Competition ELISA 및 INgezim PPA COMPAC ELISA)를 이용한 반응성 측정 결과는 도 8a 내지 8c에 나타내었다.

도 7의 실험값은 표 12에, 도 8a 내지 8c의 실험값은 표 13 내지 15에 나타내었다.

개체 번호	DPI	0	3	5	7	8	9	11	12	13	14	28
8-6	S/P Value	0.176	0.208	0.157	0.353	0.373	0.521	0.861	1.070	1.035	1.143	1.242
8-7	S/P Value	0.061	0.088	0.137	0.375	0.654	0.738	1.031	1.115	1.144	1.213	-
8-8	S/PValue	0.084	0.103	0.120	0.390	0.608	0.885	1.130	1.136	1.146	1.195	1.224
8-9	S/P Value	0.144	0.183	0.187	0.391	0.579	0.840	1.068	1.101	1.140	1.163	1.184
8-10	S/P Value	0.081	0.094	0.136	0.252	0.388	0.728	0.915	1.031	1.034	1.086	1.284

개체 번호	DPI	0	3	5	7	8	9	11	12	13	14	28
8-6	Blocking(%) Value	29.4	34.4	37.1	39.1	53.6	56.1	70.3	69.2	70.2	74.8	85.9
8-7	Blocking(%)Value	33.2	35.4	39.2	27.6	38.7	53.7	76.4	67.2	65.0	53.7	-
8-8	Blocking(%)Value	27.8	36.9	38.1	43.8	57.1	67.4	74.3	68.9	66.2	65.5	74.3
8-9	Blocking(%)Value	31.1	33.8	34.5	28.8	27.9	46.8	66.1	66.9	71.1	70.7	90.9
8-10	Blocking(%)Value	36.9	34.4	24.3	37.9	55.7	64.5	80.6	79.8	81.0	80.0	91.0

개체 번호	DPI	0	3	5	7	8	9	11	12	13	14	28
8-6	S/P(%) Value	1.0	1.9	2.4	6.9	11.8	13.7	53.2	34.1	70.3	60.4	95.3
8-7	S/P(%)Value	-1.3	-1.1	-0.8	7.5	14.0	15.5	30.2	36.9	54.8	47.7	-
8-8	S/P(%)Value	-0.4	0.7	2.5	23.4	29.5	26.8	50.7	51.7	56.2	58.8	85.4
8-9	S/P(%)Value	4.8	2.4	5.1	8.8	-2.1	17.6	55.1	61.4	66.5	73.4	102.2
8-10	S/P(%)Value	1.9	1.2	1.2	13.4	25.5	32.1	34.5	79.6	77.5	76.9	107.7

개체 번호	DPI	0	3	5	7	8	9	11	12	13	14	28
8-6	PI(%) Value	1.0	0.6	1.0	1.9	5.4	0.8	40.2	48.6	56.1	69.1	86.6
8-7	PI(%)Value	0.2	0.3	0.3	5.4	17.6	9.6	43.7	52.7	62.2	60.3	-
8-8	PI(%)Value	0.5	0.4	0.9	11.8	27.0	26.1	50.7	54.2	64.2	65.7	81.0
8-9	PI(%)Value	3.4	3.9	3.9	6.8	0.9	32.9	46.7	47.9	61.5	68.1	91.4
8-10	PI(%)Value	0.9	0.6	1.0	11.0	19.4	13.7	48.1	58.2	64.2	69.6	65.2

도 7 및 도 8a 내지 8c, 표 12 내지 15에서 확인할 수 있듯이, 유전자 II형 검체에 대한 결과와 달리 유전자 I형 검체에 대하여 본 발명의 키트는 종래의 상용화된 키트와 비슷한 반응성을 나타내었다.

다음으로, ASFV 비발생 지역의 항혈청을 반응시킨 결과를 도 9 및 표 16에 나타내었다.

S/P values	0-0.1	0.1-0.2	0.2-0.3	0.3-0.4	0.4-0.5	0.5-0.6	0.6-0.7	0.7-0.8
Frequency (n)	463	469	63	16	4	0	1	0

도 9 및 표 16에서 확인할 수 있듯이, ASFV 재조합 항원 (p22+p30+p54)으로 플레이트가 코팅된 본 발명의 키트는 99.5% (n=1,016)의 항혈청에 대하여 음성인 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명의 p22, p30 및 p54 항원 단백질 (3종)로 플레이트가 코팅된 키트는 ASFV에 감염되었는지 여부를 신속하고 간편하게 검출할 수 있으며, ASFV 비발생 지역 항혈청에 대하여 음성을 나타내는 것으로 보아 높은 정확도로 ASFV 감염 여부를 판정할 수 있다.

<110> MEDIAN Diagnostics Inc. REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> COMPOSITION FOR DIAGNOSTIC AFRICAN SWINE FEVER USING THREE RECOMBINANT ANTIGENS AND DIAGNOSTIC KITS COMPRISING THEREO <130> PN210073 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASFV p22 Forward <400> 1 cgggatccta taagaaacaa caaccaccga 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASFV p22 Reverse <400> 2 ccctcgagtg catgtttatg atttctaggt 30 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASFV p30 Forward <400> 3 aacggattta agatcatctt cacaagttgt gtttcatgcg ggtag 45 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASFV p30 Reverse <400> 4 ctacccgcat gaaacacaac ttgtgaagat gatcttaaat ccgtt 45 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASFV p54 Forward <400> 5 cgcggatccg aattcatgta tactattctc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASFV p54 Reverse <400> 6 cgcaagcttg tcgaccaagg agttttctag 30 <210> 7 <211> 969 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> p22-TM nucleotide <400> 7 atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60 gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120 ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180 atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240 ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300 aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360 catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420 ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480 gctgatatcg gatcctataa gaaacaacaa ccaccgaaaa aggtctgtaa agtagataaa 540 gattgtggta gtggagagca ttgtgttcgt ggatcatgta gctcattgag ctgcttagat 600 gccgtaaaaa tggacaaacg aaatattaag atagattcta agatttcctc atgcgaattc 660 actcccaatt tttaccgttt tacggatact gctgctgatg agcagcaaga atttggaaaa 720 acacggcatc ctataaaaat aactccatct ccaagtgaat cccatagccc ccaagaggtg 780 tgtgaaaaat attgttcatg gggaaccgat gactgtacag gttgggaata tgttggtgat 840 gaaaaggagg gaacatgtta tgtatataat aatccacatc acccggttct taaatatggt 900 aaggatcaca tcatagcctt acctagaaat cataaacatg cactcgagca ccaccaccac 960 caccactga 969 <210> 8 <211> 1131 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> p30 nucleotide <400> 8 atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60 gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120 ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180 atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240 ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300 aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360 catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420 ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480 gctgatatcg gatccgaatt catggatttt attttaaata tatccatgaa aatggaggtc 540 atcttcaaaa cggatttaag atcatcttca caagttgtgt ttcatgcggg tagtctgtat 600 aattggtttt ctgttgagat tatcaatagc ggtagaattg ttacgaccgc tataaaaaca 660 ttgcttagta ctgttaagta tgatattgtg aaatctgctc gtatatatgc agggcaaggg 720 tatactgaac atcaggctca agaagaatgg aatatgattc tgcatgtgct gtttgaagag 780 gagacggaat cctcagcatc ttcggagaac attcatgaaa aaaatgataa tgaaaccaat 840 gaatgcacat cctcctttga aacgttgttt gagcaagagc cctcatcgga ggtacctaaa 900 gactccaagc tgtatatgct tgcacaaaag actgtgcaac atattgaaca atatggaaag 960 gcacctgatt ttaacaaggt tattagagca cataatttta ttcaaaccat ttatggaacc 1020 cctctaaagg aagaagaaaa agaggtggta agactcatgg ttattaaact tttaaaaaaa 1080 aaagtcgaca agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc accaccactg a 1131 <210> 9 <211> 1101 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> p54-TM nucleotide <400> 9 atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60 gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120 ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180 atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240 ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300 aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360 catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420 ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480 gctgatatcg gatccgaatt catggattct gaattttttc aaccggttta tccgcggcat 540 tatggtgagt gtttgtcacc agtcactaca ccaagcttct tctccacaca tatgtatact 600 attctcattg ctatcgtggt cttagtcatc attatcatcg ttctaatcta tctattctct 660 tcaagaaaga aaaaagctgc tgctattgag gaggaggata tacagtttat aaatccttat 720 caagatcagc agtgggtaga agtcactcca caaccaggta cctctaaacc agctggagcg 780 actacagcaa gtgtaggcaa gccagtcacg ggcagaccgg caacaaacag accagcaaca 840 aacaaaccag ttacggacaa cccagttacg gacagactag tcatggcaac tggcgggccg 900 gcggccgcac ctgcggccgc gagtgctcct gctcatccgg ctgagcctta cacgacagtc 960 actactcaga acactgcttc acaaacaatg tcggctattg aaaatttacg acaaagaaac 1020 acctatacgc ataaagacct agaaaactcc ttggtcgaca agcttgcggc cgcactcgag 1080 caccaccacc accaccactg a 1101 <210> 10 <211> 322 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> p22-TM polypeptide <400> 10 Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp 1 5 10 15 Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp 20 25 30 Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp 35 40 45 Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn 50 55 60 Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu 65 70 75 80 Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser 85 90 95 Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 115 120 125 Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln 130 135 140 His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met 145 150 155 160 Ala Asp Ile Gly Ser Tyr Lys Lys Gln Gln Pro Pro Lys Lys Val Cys 165 170 175 Lys Val Asp Lys Asp Cys Gly Ser Gly Glu His Cys Val Arg Gly Ser 180 185 190 Cys Ser Ser Leu Ser Cys Leu Asp Ala Val Lys Met Asp Lys Arg Asn 195 200 205 Ile Lys Ile Asp Ser Lys Ile Ser Ser Cys Glu Phe Thr Pro Asn Phe 210 215 220 Tyr Arg Phe Thr Asp Thr Ala Ala Asp Glu Gln Gln Glu Phe Gly Lys 225 230 235 240 Thr Arg His Pro Ile Lys Ile Thr Pro Ser Pro Ser Glu Ser His Ser 245 250 255 Pro Gln Glu Val Cys Glu Lys Tyr Cys Ser Trp Gly Thr Asp Asp Cys 260 265 270 Thr Gly Trp Glu Tyr Val Gly Asp Glu Lys Glu Gly Thr Cys Tyr Val 275 280 285 Tyr Asn Asn Pro His His Pro Val Leu Lys Tyr Gly Lys Asp His Ile 290 295 300 Ile Ala Leu Pro Arg Asn His Lys His Ala Leu Glu His His His His 305 310 315 320 His His <210> 11 <211> 376 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> p30 polypeptide <400> 11 Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp 1 5 10 15 Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp 20 25 30 Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp 35 40 45 Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn 50 55 60 Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu 65 70 75 80 Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser 85 90 95 Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 115 120 125 Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln 130 135 140 His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met 145 150 155 160 Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met 165 170 175 Lys Met Glu Val Ile Phe Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val 180 185 190 Val Phe His Ala Gly Ser Leu Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile 195 200 205 Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr 210 215 220 Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly 225 230 235 240 Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val 245 250 255 Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His 260 265 270 Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr 275 280 285 Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu 290 295 300 Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys 305 310 315 320 Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr 325 330 335 Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu 340 345 350 Met Val Ile Lys Leu Leu Lys Lys Lys Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala 355 360 365 Leu Glu His His His His His His 370 375 <210> 12 <211> 366 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> p54-TM polypeptide <400> 12 Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp 1 5 10 15 Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp 20 25 30 Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp 35 40 45 Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn 50 55 60 Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu 65 70 75 80 Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser 85 90 95 Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 115 120 125 Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln 130 135 140 His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met 145 150 155 160 Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val 165 170 175 Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser 180 185 190 Phe Phe Ser Thr His Met Tyr Thr Ile Leu Ile Ala Ile Val Val Leu 195 200 205 Val Ile Ile Ile Ile Val Leu Ile Tyr Leu Phe Ser Ser Arg Lys Lys 210 215 220 Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr 225 230 235 240 Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys 245 250 255 Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg 260 265 270 Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro 275 280 285 Val Thr Asp Arg Leu Val Met Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro 290 295 300 Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val 305 310 315 320 Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu 325 330 335 Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu Val 340 345 350 Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 355 360 365

Claims

서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 0.50 ug/mL 농도;
서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 1.00 ug/mL 농도; 및
서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 4.00 ug/mL 농도;
로 포함하는 아프리카 돼지열병 (African swine fever; ASF) I형 및 II형 동시 진단용 항원 조성물.
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서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 0.50 ug/mL 농도;
서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 1.00 ug/mL 농도; 및
서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 4.00 ug/mL 농도;
로 포함하는 아프리카 돼지열병 (African swine fever; ASF) I형 및 II형 동시 진단용 키트.
제4항에 있어서, 상기 키트는 발색효소를 추가로 포함하는 것인, 아프리카 돼지열병 I형 및 II형 동시 진단용 키트.
제5항에 있어서, 상기 발색효소는 Q dot (Quantum dot), HRPO (Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제 (Glucose Oxidase), 루시퍼라아제 (luciferase), 베타-디-갈락토시다아제 (β말산탈수소효소 (malate dehydrogenase; MDH) 및 아세틸콜린에스터라아제 (acetylcholinesterase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 효소와 프로틴 A가 컨쥬게이션 (conjugation)된 것인, 아프리카 돼지열병 I형 및 II형 동시 진단용 키트.
다음의 단계를 포함하는 아프리카 돼지열병 (African swine fever; ASF) I형 및 II형 동시 진단을 위한 정보 제공 방법:
시료를 준비하는 준비 단계; 및
시료를 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 0.50 ug/mL 농도, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 1.00 ug/mL 농도 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 4.00 ug/mL 농도로 포함하는 조성물과 접촉시키는 접촉 단계.
제7항에 있어서, 상기 접촉 단계는 20 내지 30 ℃의 온도 조건에서 수행되는 것인, 정보 제공 방법.