CN104244705B - 病原体抗性的柑橘组合物、生物体、系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及，根据一些实施方案，病原体抗性的柑橘组合物、生物体、系统和方法。例如，组合物可以包括肽(例如防御素肽)和/或核酸(例如防御素核酸)。病原体抗性柑橘植物可以包括，在一些实施方案中，防御素肽和/或编码防御素肽的可表达核酸。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2012年1月27日提交的美国临时专利申请61/591,680和2012年5月2日提交的美国临时申请61/641,641的优先权，这两个申请通过引用被并入本文。
公开领域
本公开涉及，在一些实施方案中，病原体抗性的柑橘组合物、生物体、系统和方法。
公开背景
目前，还没有对细菌性溃疡病(柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodispv.citri))(Xac)，和/或由柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)(Las)引起的柑橘黄龙病(以前称青果病)具有抗性的柑橘栽培品种(cultivars)。实际上，在柑橘属中未曾发现对这些微生物病原体的遗传抗性。由于柑橘物种的复杂的生殖生物学和长的生命周期，通过传统的杂交育种产生抗性栽培品种的尝试受到了阻碍。
简述
相应地，对于植物(例如柑橘)来说，出现了提高对疾病的抗性的需要。进一步出现了对于用于制备基因修饰的植物(例如柑橘)的改进的方法、组合物和系统的需要。
本公开涉及，根据一些实施方案，病原体抗性柑橘组合物、生物体、系统和方法。例如，组合物可以包括核酸(例如防御素核酸)。在一些实施方案中，核酸可以包括核酸序列，其(a)与防御素序列(例如SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12和/或29)具有大约75％至大约100％的同一性(例如大约98％同一性)，和/或(b)编码与SEQ ID NOS：1，2，7，8和/或28具有大约95％至大约100％的同一性(例如98％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸可以包括与选自由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5组成的组的序列具有大约98％同一性的核酸序列，并编码具有与SEQ ID NO：1具有至少大约99％同一性的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，核酸可以包括与选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6组成的组的序列具有大约98％同一性的核酸序列，并编码具有与SEQ ID NO：2具有至少大约99％同一性的氨基酸序列的肽。根据一些实施方案，核酸可以包括与选自由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11组成的组的序列具有大约98％同一性的核酸序列，并编码具有与SEQ ID NO：7具有至少大约99％同一性的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，核酸可以包括与选自由SEQ ID NO：10和SEQID NO：12组成的组的序列具有大约98％同一性的核酸序列，并编码具有与SEQ ID NO：8具有至少大约99％同一性的氨基酸序列的肽。
在一些实施方案中，本公开涉及在柑橘中可操作的防御素表达载体。例如，表达载体可以包括，在5’至3’方向上，(a)表达控制序列；(b)与表达控制序列可操作地连接的可表达核酸(例如编码外源多肽的核酸)；和(c)与可表达核酸可操作地连接的3’终止序列。在一些实施方案中，外源核酸可以包括与选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：29组成的组的核酸序列具有至少大约75％同一性(例如至少大约98％同一性)的核酸序列。根据一些实施方案，表达载体可以位于细菌细胞或植物细胞中。在一些实施方案中，表达载体可以在相对于编码序列(例如由外源核酸序列编码的)的位置-4至4包括核苷酸序列AACAATGG。根据一些实施方案，表达载体可以包括具有从大约1至大约200个核苷酸长度的接头(例如表达控制序列的3’端和/或核酸(例如编码外源多肽的核酸)的5’端)。
在一些实施方案中，本公开涉及包括表达载体的细菌细胞。例如，细菌细胞可以包括表达载体，该表达载体包括，在5’至3’方向上，(a)表达控制序列；(b)与表达控制序列可操作地连接的可表达核酸(例如编码外源多肽的核酸)；和(c)与可表达核酸可操作地连接的3’终止序列。例如，细菌细胞可以包括表达载体，该表达载体包括，在5’至3’方向上，(a)表达控制序列；(b)与表达控制序列可操作地连接的外源核酸；和(c)与外源核酸可操作地连接的3’终止序列，其中外源核酸包括与选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12组成的组的核酸序列具有至少大约98％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，本公开涉及包括表达载体的植物细胞(例如柑橘植物细胞)。例如，植物细胞(例如柑橘植物细胞)可以包括表达载体，该表达载体包括，在5’至3’方向上，(a)表达控制序列；(b)与表达控制序列可操作地连接的可表达核酸(例如编码外源多肽的核酸)；和(c)与可表达核酸可操作地连接的3’终止序列。例如，植物细胞(例如柑橘植物细胞)可以包括表达载体，该表达载体包括，在5’至3’方向上，(a)表达控制序列；(b)与表达控制序列可操作地连接的外源核酸；和(c)与外源核酸可操作地连接的3’终止序列，其中外源核酸包括与选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：29组成的组的核酸序列具有至少大约98％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，植物细胞(例如柑橘植物细胞)可以位于植物(例如柑橘植物)中。柑橘植物的实例包括，但不限于橙(orange)和葡萄柚(grapefruit)。植物细胞可以包括防御素肽。在一些实施方案中，防御素肽可以具有与SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：28具有至少大约99％同一性的氨基酸序列(例如由表达载体核酸编码和/或从其表达的)。
在一些实施方案中，本公开涉及包括表达载体的柑橘植物(例如橙和/或葡萄柚)。柑橘植物可以在单个细胞、多个细胞中(例如嵌合体)或在所有细胞中包括表达载体。在一些实施方案中，嵌合体植物可以由嫁接产生。例如，柑橘植物可以包括在所有细胞中具有表达载体的转基因植物的嫁接物(例如接穗)和在其细胞中具有不同表达载体或没有表达载体的植物(例如砧木)。在一些实施方案中，柑橘植物可以在单个细胞、多个细胞(例如嵌合体)中或在所有细胞中包括第一表达载体(例如编码第一防御素肽)，并在单个细胞、多个细胞(例如嵌合体)中或在所有细胞中包括第二表达载体(例如编码第二防御素肽)。例如，柑橘植物细胞可以包括(a)第一表达载体，该第一表达载体包括，在5’至3’方向上，(i)第一表达控制序列；(ii)与第一表达控制序列可操作地连接的第一外源核酸；和(iii)与第一外源核酸可操作地连接的第一3’终止序列，其中第一外源核酸包括与选自由SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11组成的组的核酸序列具有至少大约98％同一性的核酸序列；和(b)第二表达载体，该第二表达载体包括，在5’至3’方向上，(iv)第二表达控制序列；(v)与第二表达控制序列可操作地连接的第二外源核酸；和(vi)与第二外源核酸可操作地连接的第二3’终止序列，其中第二外源核酸包括与选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12组成的组的核酸序列具有至少大约98％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，柑橘植物可以在单个细胞、多个细胞(例如嵌合体)中或在所有细胞中包括表达载体，该表达载体包括编码第一防御素肽(例如SoD2)的第一核酸序列和编码第二防御素肽(例如SoD7)的第二核酸序列。在一些实施方案中，柑橘植物可以在单个细胞、多个细胞(例如嵌合体)中或在所有细胞中包括防御素肽。柑橘植物可以在单个细胞、多个细胞(例如嵌合体)中或在所有细胞中包括第一防御素肽(例如与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7具有至少大约99％同一性的肽)，并在单个细胞、多个细胞(例如嵌合体)中或在所有细胞中包括第二防御素肽(例如与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8具有至少大约99％同一性的肽)。
在一些实施方案中，本公开涉及在柑橘植物中表达包括编码被表达肽(例如防御素肽)的核酸序列的外源核酸的方法。例如，方法可以包括使包括外源核酸的表达盒或者包括外源核酸的表达载体与柑橘植物的细胞胞质在允许外源核酸表达并允许被表达肽形成的条件下接触。在一些实施方案中，外源核酸可以包括与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：29的核酸序列具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体和/或表达盒可以包括，在5’至3’方向上，表达控制序列，与表达控制序列可操作地连接的外源核酸，以及与外源核酸可操作地连接的3’终止序列。根据一些实施方案，被表达肽可以包括与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和/或SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，使表达载体或盒接触可以进一步包括将细胞与包括表达载体或表达盒的农杆菌细胞共培养以形成共培养的植物细胞。根据一些实施方案，可以从共培养的植物细胞再生植物。
在一些实施方案中，本公开涉及对具有微生物感染(例如细菌性溃疡(柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri))(Xac))，和/或由柑橘黄龙病菌(CandidatusLiberibacter asiaticus)(Las)引起的柑橘黄龙病(以前称青果病))和/或对其有感染风险的柑橘植物进行治疗的方法。例如，方法可以包括在柑橘植物中形成至少一种防御素肽。在一些实施方案中，在柑橘植物中形成至少一种防御素肽可以包括，在允许防御素核酸表达的条件下，将柑橘植物嫁接到第二种柑橘植物的扦插物(cutting)(例如接穗或砧木)上，第二种柑橘植物包括表达载体和/或表达盒，所述表达载体和/或表达盒包括，在5’至3’方向上，表达控制序列，与表达控制序列可操作地连接的防御素核酸，以及与防御素核酸可操作地连接的3’终止序列，其中防御素核酸包括编码与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8和/或SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列的核酸序列。
附图简述
本专利的文件包含以彩色显示的至少一幅附图。经请求并缴纳必需的费用后，具有彩色附图的本专利的副本将由专利和商标局(the Patent and Trademark Office)提供。
可以通过部分参考本公开和附随的附图来理解本公开的一些实施方案，其中：
图1说明根据本公开的具体示例实施方案的包括编码SoD2的核酸的农杆菌转化构建体；
图2说明根据本公开的具体示例实施方案的包括编码SoD7的核酸的农杆菌转化构建体；
图3表示根据本公开的具体示例实施方案的Southern blot，显示在用SoD2(07)核酸转化的哈姆林(Hamlin)和路德红(Rohde Red)中的转基因事件中的插入数目，所述SoD2(07)核酸包括用于在柑橘中表达的GenScript-优化序列；
图4表示根据本公开的具体示例实施方案的Southern blot，显示在用SoD2(09)或SoD7(10)核酸转化的哈姆林和路德红中的转基因事件中的插入数目，所述SoD2(09)或SoD7(10)核酸每个包括用于在柑橘中表达的CODA-优化序列；
图5表示根据本公开的具体示例实施方案的northern blot，显示在用SoD2(07)或SoD7(08)核酸转化的马斯橙(Marrs)中的转基因事件中的RNA转录物，所述SoD2(07)或SoD7(08)核酸每个包括用于在柑橘中表达的GenScript-优化序列；
图6表示根据本公开的具体示例实施方案的northern blot，显示在用SoD2(09)或SoD7(10)核酸转化的哈姆林和路德红中的转基因事件中的RNA转录物，所述SoD2(09)或SoD7(10)核酸每个包括用于在柑橘中表达的CODA-优化序列；
图7表示根据本公开的具体示例实施方案的northern blot，显示在用SoD2(07)或SoD7(08)核酸转化的哈姆林和路德红中的转基因事件中的RNA转录物，所述SoD2(07)或SoD7(08)核酸每个包括用于在柑橘中表达的GenScript-优化序列；
图8表示根据本公开的具体示例实施方案的Southern blot，证明在用SoD2(11)或SoD7(12)核酸转化的哈姆林植物中插入SoD2或SoD7，所述SoD2(11)或SoD7(12)核酸每个包括用于在柑橘中表达的DNA 2.0-优化序列；
图9表示根据本公开的具体示例实施方案的Southern blot，证明在用SoD2(09、11)核酸、SoD7(08、12)核酸或SoD2和SoD7(13)二者的核酸转化的Ruby Red(01)或哈姆林(04)中插入防御素，所述SoD2(09、11)核酸、SoD7(08、12)核酸或SoD2和SoD7(13)二者的核酸均包括用于在柑橘中表达的使用序列优化算法(08和13用GenScript；09用Coda，并且11和12用DNA 2.0)优化的序列；
图10表示根据本公开的具体示例实施方案的northern blot，显示在用SoD2(11)核酸、SoD7(08、12)核酸或SoD2和SoD7(13)二者的核酸转化的Ruby Red(01)或哈姆林(04)中的转基因事件中的RNA转录物，所述SoD2(11)核酸、SoD7(08、12)核酸或SoD2和SoD7(13)二者的核酸每个包括用于在柑橘中表达的GenScript-优化序列(08和13)或DNA 2.0-优化序列(11和12)；
图11表示根据本公开的具体示例实施方案的Southern blot，证实在用SoD2(07)或SoD7(08)核酸转化的卡里佐枳橙(Carrizo Citrange)(CC)中插入防御素，所述SoD2(07)或SoD7(08)核酸每个包括用于在柑橘中表达的GenScript-优化序列；
图12表示根据本公开的具体示例实施方案的northern blot，显示在用SoD2(07)或SoD7(08)核酸转化的卡里佐枳橙(CC)中的转基因事件中的RNA转录物，所述SoD2(07)或SoD7(08)核酸每个包括用于在柑橘中表达的GenScript-优化序列；
图13A是根据本公开的具体示例实施方案的，从用柑橘溃疡病原体接种的非转基因葡萄柚树上切掉的叶片的照片；
图13B是根据本公开的具体示例实施方案的，从用柑橘溃疡病原体接种的SoD2转基因葡萄柚树上切掉的叶片的照片；
图14是根据本公开的具体示例实施方案的，将未感染的非转基因接穗嫁接在感染柑橘青果病的非转基因砧木上获得的嵌合葡萄柚树(左边和中间)，或者将未感染的SoD2转基因接穗嫁接在感染柑橘青果病的非转基因砧木上获得的嵌合葡萄柚树(右边)的照片；
图15A说明了根据本公开的具体示例实施方案的，在对待检材料进行第一次、第二次和第三次采样时被感染的第2代柑橘植物百分比；
图15B是图15A的柱状图续，其说明了根据本公开的具体示例实施方案的，在对待检材料进行第一次、第二次和第三次采样时被感染的第2代柑橘植物百分比；
图15C是图15A的柱状图续，其说明了根据本公开的具体示例实施方案的，在对待检材料进行第一次、第二次和第三次采样时被感染的第2代柑橘植物百分比；
图16A说明了根据本公开的具体示例实施方案的，在对待检材料进行第一次、第二次和第三次采样时被感染的第2代和第3代柑橘植物百分比；
图16B是图16A的柱状图续，其说明了根据本公开的具体示例实施方案的，在对待检材料进行第一次、第二次和第三次采样时被感染的第2代和第3代柑橘植物百分比；
图16C是图16A的柱状图续，其说明了根据本公开的具体示例实施方案的，在对待检材料进行第一次、第二次和第三次采样时被感染的第2代和第3代柑橘植物百分比；并且
图17表示根据本公开的具体示例实施方案的Southern blot，证实在用SoD2和SoD7(13)二者的核酸转化的Rio Red(01)中插入防御素，所述SoD2和SoD7(13)二者的核酸每个包括用于在柑橘中表达的GenScript-优化序列；
图18表示根据本公开的具体示例实施方案的northern blot，显示在用SoD2和SoD7(13)二者的核酸转化的Rio Red(01)或哈姆林(04)中的转基因事件中的RNA转录物，所述SoD2和SoD7(13)二者的核酸每个包括用于在柑橘中表达的GenScript-优化序列；并且
图19是Western blot，其说明根据本公开的具体示例实施方案的抗-SoD7与包含SoD7的样品的结合。
序列表简述
可以通过部分参考本公开和附随的序列表理解本公开的一些实施方案，其中：
SEQ ID NO：1说明根据本公开的具体示例实施方案的菠菜(Spinacta oleracea)防御素(SoD2)的氨基酸序列；
SEQ ID NO：2说明根据本公开的具体示例实施方案的菠菜(Spinacta oleracea)防御素(SoD7)的氨基酸序列；
SEQ ID NO：3说明根据本公开的具体示例实施方案的表达菠菜(Spinaciaoleracea)防御素(SoD2)的GenScript-优化核酸序列；
SEQ ID NO：4说明根据本公开的具体示例实施方案的表达菠菜(Spinaciaoleracea)防御素(SoD7)的GenScript-优化核酸序列；
SEQ ID NO：5说明根据本公开的具体示例实施方案的表达菠菜(Spinaciaoleracea)防御素(SoD2)的CODA-优化核酸序列；
SEQ ID NO：6说明根据本公开的具体示例实施方案的表达菠菜(Spinaciaoleracea)防御素(SoD7)的CODA-优化核酸序列；
SEQ ID NO：7说明根据本公开的具体示例实施方案的包括PR-1b信号肽和菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD2)的嵌合肽的氨基酸序列；
SEQ ID NO：8说明根据本公开的具体示例实施方案的包括PR-1b信号肽和菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD7)的嵌合肽的氨基酸序列；
SEQ ID NO：9说明根据本公开的具体示例实施方案的包括编码PR-1b信号肽的核酸序列和用于表达菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD2)的GenScript-优化核酸序列的嵌合核酸序列；
SEQ ID NO：10说明根据本公开的具体示例实施方案的包括编码PR-1b信号肽的核酸序列和用于表达菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD7)的GenScript-优化核酸序列的嵌合核酸序列；
SEQ ID NO：11说明根据本公开的具体示例实施方案的包括编码PR-1b信号肽的核酸序列和用于表达菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD2)的CODA-优化核酸序列的嵌合核酸序列；
SEQ ID NO：12说明根据本公开的具体示例实施方案的包括编码PR-lb信号肽的核酸序列和用于表达菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD7)的CODA-优化核酸序列的嵌合核酸序列；
SEQ ID NO：13说明根据本公开的具体示例实施方案的包括编码PR-1b信号肽的核酸序列和用于表达菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD2)的GenScript-优化核酸序列的表达盒；
SEQ ID NO：14说明根据本公开的具体示例实施方案的包括编码PR-1b信号肽的核酸序列和用于表达菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD7)的GenScript-优化核酸序列的表达盒；
SEQ ID NO：15说明根据本公开的具体示例实施方案的包括编码PR-1b信号肽的核酸序列和用于表达菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD2)的CODA-优化核酸序列的表达盒；
SEQ ID NO：16说明根据本公开的具体示例实施方案的包括编码PR-1b信号肽的核酸序列和用于表达菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD7)的CODA-优化核酸序列的表达盒；
SEQ ID NO：17说明根据本公开的具体示例实施方案的表达控制序列(CaMV 35S启动子)；
SEQ ID NO：18说明根据本公开的具体示例实施方案的非翻译区(TEV 5’UTR)；
SEQ ID NO：19说明根据本公开的具体示例实施方案的表达控制序列(CaMV 35S终止子)；
SEQ ID NO：20说明根据本公开的具体示例实施方案的被称为Zn5的引物的核酸序列；
SEQ ID NO：21说明根据本公开的具体示例实施方案的被称为Zn6的引物的核酸序列；
SEQ ID NO：22说明根据本公开的具体示例实施方案的被称为Fcp的引物的核酸序列；
SEQ ID NO：23说明根据本公开的具体示例实施方案的被称为Rcp的引物的核酸序列；
SEQ ID NO：24说明根据本公开的具体示例实施方案的被称为GUSF的引物的核酸序列；
SEQ ID NO：25说明根据本公开的具体示例实施方案的被称为GUSR的引物的核酸序列；
SEQ ID NO：26说明根据本公开的具体示例实施方案的包括被修饰的PR-1b信号肽和用于表达菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD2)的具有单个缺失的GenScript-优化核酸序列的嵌合肽的氨基酸序列；
SEQ ID NO：27说明根据本公开的具体示例实施方案的包括编码被修饰的PR-1b信号肽和用于表达菠菜(Spinacia oleracea)防御素(SoD2)的具有单个缺失的GenScript-优化核酸序列的嵌合核酸序列；
SEQ ID NO：28说明根据本公开的具体示例实施方案的防御素的核心氨基酸序列；
SEQ ID NO：29说明根据本公开的具体示例实施方案的用于表达核心防御素的核酸序列；
SEQ ID NO：30说明根据本公开的具体示例实施方案的用于表达菠菜(Spinaciaoleracea)防御素(SoD2)的DNA 2.0-优化核酸序列；并且
SEQ ID NO：31说明根据本公开的具体示例实施方案的用于表达菠菜(Spinaciaoleracea)防御素(SoD7)的DNA 2.0-优化核酸序列。
详细描述
本公开涉及，在一些实施方案中，用于增强植物对与病原体(例如细菌、酵母、真菌、病毒)接触(例如感染)的反应的天生能力(如果有的话)的组合物、生物体、系统和方法。在一些实施方案中，本公开涉及用于在植物(例如柑橘)中表达基因产物(例如抗微生物肽)的组合物、生物体、系统和方法。例如，本公开涉及包括一种或更多种抗微生物肽和/或编码一种或更多种抗微生物肽的一种或更多种核酸的表达控制序列(例如启动子)、表达盒、表达载体、微生物和/或植物。
I.组合物
A.抗微生物肽
根据一些实施方案，本公开涉及具有杀虫活性、抗微生物活性和/或抗病毒活性的肽和/或蛋白，其可以包括但不限于抗生物素蛋白，营养期杀虫蛋白(例如Vip3A)，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白(例如Cry1、Cry1Ab、Cry2、Cry9)，豌豆白蛋白(例如PA1b)，多毛菌素A(hirsutellin A)，凝集素(例如雪花莲凝集素(snowdrop lily lectin)、大蒜凝集素，洋葱凝集素)，淀粉酶抑制剂(例如α淀粉酶抑制剂)，arcelins(例如来自豆类的arcelins)，蛋白酶抑制剂，溶菌酶(例如牛溶菌酶、人溶菌酶、软体动物溶菌酶)，防御素(例如SoD2和/或SoD7)，几丁质酶，β-1，3-葡聚糖酶，其变体和/或其组合。抗微生物肽可以包括，例如，一种或更多种属于植物防御素家族的抗微生物肽。这些多肽最初是从菠菜叶片(Spinacia oleracea)中分离的。在一些实施方案中，防御素可以是小的(大约5kDa)，可以是碱性的和/或可以是富含半胱氨酸的。在一些实施方案中，防御素可以包括具有与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2共享至少大约95％同一性，至少大约96％同一性，至少大约97％同一性，至少大约98％同一性，至少大约99％同一性，和/或大约100％同一性的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，抗微生物肽可以进一步包括独立地和/或共同地是各自中性的(例如不会有害地影响抗细菌功能)，和/或增强抗细菌功能(例如通过将肽指向所期望的部位(例如细胞中和/或胞外)的一个或更多个氨基酸。例如，防御素可以包括来源于烟草病程相关的(PR)-1b蛋白的信号肽，其允许肽被转运到植物细胞的质外体中(例如通过分泌途径)和/或在叶片、茎、花、果实、种子和/或根的细胞间隙空间中积聚。根据一些实施方案，防御素可以包括具有与SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8共享至少大约95％同一性，至少大约96％同一性，至少大约97％同一性，至少大约98％同一性，至少大约99％同一性，和/或大约100％同一性的氨基酸序列的肽。
B.核酸
在一些实施方案中，本公开涉及包括编码一种或更多种抗微生物肽的一种或更多种序列的核酸(例如盒、载体)。例如，核酸可以包括盒，所述盒包括合成的SoD2和/或SoD7基因的核酸序列。合成的SoD2和/或SoD7密码子可以指定与天然菠菜相同的氨基酸序列，它们的密码子按柑橘密码子使用被优化。包括SoD2和/或SoD7编码序列的核酸可以包括编码信号肽(例如PR-1b)的序列。在一些实施方案中，包括编码抗微生物肽的序列的核酸的表达可以通过将起始密码子放置在有利的(例如最优的)5’上下游序列(context)中而被优化。根据一些实施方案，核酸可以包括表达控制序列(例如与编码序列可操作地连接)。例如，核酸可以包括在具有TEV植物马铃薯Y病毒(TEV plantpotyvirus)的5’UTR的双重增强的CaMV35S启动子(为了提供对防御素基因的翻译增强活性)控制下的编码基因序列。
根据一些实施方案，核酸可以包括与SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31具有至少大约75％同一性，与SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或29具有至少大约80％同一性，与SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31具有至少大约85％同一性，与SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31具有至少大约90％同一性，与SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31具有至少大约95％同一性，与SEQ IDNOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31具有至少大约97％同一性，与SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31具有至少大约98％同一性，与SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31具有至少大约99％同一性，和/或与SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31具有大约100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列可以编码与SEQ ID NOS：1，2，7，8和/或28具有至少大约98％同一性，与SEQ ID NOS：1，2，7，8和/或28具有至少大约99％同一性，和/或与SEQ ID NOS：1，2，7，8和/或28具有大约100％同一性的氨基酸序列。根据一些实施方案，核酸可以与参考核酸序列具有第一量级的序列同一性，并且可以编码与参考氨基酸序列具有第二量级的序列同一性的氨基酸序列。例如，根据一些实施方案，核酸可以与SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31具有大约85％的同一性，并且编码与SEQ ID NOS：1，2，7，8和/或28具有大约100％同一性的氨基酸序列。
根据一些实施方案，核酸序列可以与具有SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31的核苷酸序列的核酸在严格条件下杂交。严格条件可以包括，例如，(a)4X SSC，65℃，然后0.1X SSC，65℃，60分钟，和/或(b)50％甲酰胺，4X SSC，65℃。核酸可以包括具有SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31的序列的核酸的缺失片段(例如从大约1至大约12个碱基的缺失)，该片段保留了对能够感染柑橘植物的至少一种微生物的抗微生物活性。得益于本公开的本领域普通技术人员可以制备具有SEQ ID NOS：3，4，5，6，9，10，11，12，29，30和/或31的序列的核酸的一个或更多个缺失片段，并对得到的片段进行针对能够感染柑橘植物的至少一种微生物的抗微生物活性的筛选。
可以通过用其序列或元件作为查询序列，使用Gapped BLAST算法(Altschul等，1997Nucl.Acids Res.25：3389-3402)，使用BLOSUM62矩阵，缺口成本(gap cost)为11，存留成本(persistence cost)为每残基1，并且E值为10，进行数据库搜索来识别具有如SEQ IDNOS：3，4，5，6，30和/或31的序列的核酸序列。根据一些实施方案，可以通过任何可利用的方法来评估序列同一性。例如，可以在FASTA应用组件(Pearson和Lipman，1988Proc.Nat.Acad.Sci.85：2444-2448；Pearson，1990Methods in Enzymology 183：63-98)中用ALIGN(全球比对)或LALIGN(本地同源性比对)，使用BLOSUM50矩阵，缺口罚分为-16、-4，来比较两个序列。可以根据ClustalW(Larkin等，2007，Bioinformatics 23(21)：2947-2948)、BLAST、FASTA或类似的算法评估序列相似性。
C.表达盒和载体
在一些实施方案中，本公开涉及用于在细胞中表达核酸序列(例如编码序列)，并包括表达控制序列和与该表达控制序列可操作地连接的核酸序列的表达载体和/或表达盒。因此，例如，表达盒可以包括被期望在植物中表达的异源编码序列。
1.表达载体
在一些实施方案中，本公开涉及表达载体，其可以包括，例如，具有表达控制序列和与该表达控制序列可操作地连接的编码序列的核酸。在一些实施方案中，表达控制序列可以包括一个或更多个启动子，一个或更多个操纵子，一个或更多个增强子，一个或更多个核糖体结合位点，和/或其组合。表达控制序列可以包括，例如，具有启动子活性的核酸。根据一些实施方案，表达控制序列可以是在(a)选自根、叶片、茎、花、种子和/或果实的器官中，和/或(b)选自表皮、周皮薄壁组织厚角组织厚壁组织木质部韧皮部和/或分泌结构的器官中是组成性活性的或条件性活性的。根据一些实施方案，表达控制序列可以是可操作的以驱动核酸序列(例如编码序列)在细胞中的表达。表达的度量可以包括，例如，基因产物(例如RNA和/或蛋白质)出现和/或积聚的速度和/或到一个或更多个时间点(例如起始点之后经过的时间和/或发育阶段)为止基因产物的总积聚量。在一些实施方案中，基因产物的比较试验可以是定性的、半定量的和/或定量的。比较试验可以间接地和/或直接地评估基因产物的存在和/或量。在一些实施方案中，表达控制序列可以对一种或更多种刺激(例如，一种或更多种小分子，一种或更多种植物防御诱导试剂，机械损伤，温度，压力)敏感。例如，在被微生物(例如细菌或病毒)感染后，表达控制序列的活性可以被增强或被抑制。
表达控制序列可以在允许编码序列表达(例如转录)的条件下与细胞(例如植物细胞)接触。表达载体的实例可以包括图1和图2中所示的农杆菌转化构建体。根据一些实施方案，表达控制序列可以在允许编码序列在源自植物细胞的一个和/或更多个细胞中表达的条件下与植物细胞(例如胚细胞、干细胞、愈伤组织细胞)接触。在一些实施方案中，表达载体可以在允许该表达载体的至少一部分遗传给细胞后代的条件下与细胞(例如植物细胞)接触。根据一些实施方案，表达载体可以包括一个或更多个选择标记。例如，当载体在细菌宿主、酵母宿主和/或植物宿主中时，表达载体可以包括用于选择的标记。
2.表达盒
根据一些实施方案，本公开涉及表达盒，其可以包括，例如，具有表达控制序列和与该表达控制序列可操作地连接的编码序列的核酸。表达盒可以被包括在表达载体中。在一些实施方案中，编码序列可以包括在至少一种植物细胞中可表达的任何编码序列。例如，编码序列可以包括植物序列、酵母序列、细菌序列、病毒序列(例如植物病毒)、人工序列、其反义序列、其片段、其变体，和/或其组合。在一些实施方案中，编码序列可以包括编码具有杀虫、抗细菌、抗真菌、抗微生物和/或抗病毒活性的一种或更多种基因产物的序列。在一些实施方案中，编码序列可以包括起始密码子、内含子和/或翻译终止序列。根据一些实施方案，编码序列可以包括一种或更多种天然的或人工的编码序列(例如编码单个蛋白或嵌合体)。根据一些实施方案，表达盒可以可选地包括终止序列。在一些实施方案中，编码序列可以包括至少部分被进行密码子优化以在感兴趣的生物体(例如柑橘植物)中表达的序列。
在一些实施方案中，表达控制序列可以被用于构建表达盒，所述表达盒包括，在5’至3’方向上，(a)表达控制序列，(b)在该表达控制序列控制之下的异源基因或编码序列，或与天然植物基因互补的序列，和/或(c)3’终止序列(例如包括聚腺苷酸化位点的终止序列)。在一些实施方案中，表达盒的实例可以包括SEQ ID NOS：13-16所示的盒。表达盒可以被合并到各种自主复制载体中以便构建表达载体。例如，可以通过将表达控制序列连接到要被表达的序列(例如编码序列)上来构建表达盒。
一些用于构建表达盒的技术对本领域的普通技术人员来说是公知的。例如，可利用各种策略连接DNA片段，所述策略的选择取决于DNA片段末端的性质。得益于本公开的普通技术人员，编码序列(例如具有抗微生物活性)和/或其部分可以通过其它手段，例如化学或酶促合成被提供。根据一些实施方案，核酸可以包括，在5’至3’方向上，表达控制序列、接头(可选的)和编码序列。在一些实施方案中，核酸可以包括表达控制序列、接头和/或编码序列之间的一个或更多个限制性位点和/或接合位点。
II.微生物
在一些实施方案中，本公开涉及微生物，所述微生物包括抗微生物肽(例如异源抗微生物肽)和/或包括编码抗微生物肽的核酸序列的核酸(例如异源的和/或可表达的核酸)。例如，微生物可以包括细菌、酵母和/或病毒。微生物的实例包括但不限于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鳞翅类细胞系、水稻东格鲁病杆状病毒(Rice tungro bacilliform virus)、鸭跖草属黄花叶病毒(Commelinayellow mosaic virus)、香蕉条纹病毒(Banana streak virus)、芋杆状病毒(Tarobacilliform virus)和/或杆状病毒。根据一些实施方案，抗微生物肽对其宿主微生物来说可以是耐受的和/或无害的。微生物可以包括表达控制序列和与该表达控制序列可操作地连接的抗微生物肽编码序列。在一些实施方案中，包括编码抗微生物肽的核酸序列的核酸(例如异源的和/或可表达的核酸)可以存在于基因组核酸上和/或基因组外核酸上。
III.植物
在一些实施方案中，本公开涉及包括抗微生物肽(例如异源抗微生物肽)和/或包括编码抗微生物肽的核酸序列的核酸(例如异源的和/或可表达的核酸)的植物细胞(例如胚细胞、干细胞、愈伤组织细胞)、组织和/或植物。在一些实施方案中，植物和/或植物细胞可以是双子叶植物。双子叶植物的实例可以包括但不限于咖啡、番茄、胡椒、烟草、利马豆、拟南芥、橡胶、橙、葡萄柚、柠檬、酸橙(1ime)、柑(tangerine)、橘(mandarin)、柚子、马铃薯、南瓜、豌豆和/或甜菜。在一些实施方案中，植物细胞可以被包括在植物组织、植物器官和/或整株植物中。根据一些实施方案，组织、器官和/或整株植物中的植物细胞可以与一个或更多个同基因的(isogenic)细胞和/或一个或更多个异种的(heterogenic)细胞相邻。在一些实施方案中，植物可以包括原代转化株和/或其后代。在一些实施方案中，包括编码抗微生物肽的核酸序列的核酸(例如异源的和/或可表达的核酸)可以进一步包括与该核酸可操作地连接的表达控制序列。根据一些实施方案，编码抗微生物肽的核酸序列可以在植物中在一个或更多个直至所有的(例如基本上所有的)器官、组织和/或细胞类型中被表达，所述器官、组织和/或细胞类型包括但不限于茎秆(stalk)、叶片、根、种子、花、果实、分生组织、薄壁组织、贮藏薄壁组织、厚角组织、厚壁组织、表皮、叶肉、维管束鞘、保卫细胞、原生木质部、后生木质部韧皮部韧皮部伴随物(phloem companion)和/或其组合。在一些实施方案中，核酸和/或其基因产物(例如抗微生物肽)可以位于和/或转移至一个或更更多个细胞器(例如液泡、叶绿体、线粒体、质体)。
IV.方法
A.转化植物
根据一些实施方案，本公开涉及用于柑橘(例如柑橘植物的天然基因组)的独立转化的方法。例如，方法可以包括用根癌农杆菌(At)独立转化橙(甜橙，Citrus sinensis)栽培品种“路德红”、“哈姆林”和/或“马斯橙”的天然基因组。根据一些实施方案，转化方法可以包括使包括SoD2和/或SoD7序列(例如SoD2和/或SoD7合成基因序列)的核酸与柑橘植物接触。在一些实施方案中，转化的植物(例如新橙栽培品种的转化的基因组)可以独立地包含编码在柑橘属的天然基因库内未发现的微生物抗性的SoD2基因和/或SoD7基因的序列。根据一些实施方案，转化的橙栽培品种植物可以包括由SoD2基因和/或SoD7基因编码的肽。在一些实施方案中，包括SoD2基因和/或SoD7基因的序列的和/或包括由SoD2基因和/或SoD7基因编码的肽的转化植物可以呈现出对一些(例如广泛的)细菌和/或真菌病原体的抗性。例如，包括SoD2基因和/或SoD7基因的序列的和/或包括由SoD2基因和/或SoD7基因编码的肽的转化植物可以呈现出对细菌性溃疡病(柑橘溃疡病菌)(Xac)，和/或由柑橘黄龙病菌(Las)引起的柑橘黄龙病(以前称青果病)的抗性。参见下面的实施例部分。
B.嫁接
根据一些实施方案，本公开涉及将第一种植物(例如柑橘植物)的至少一部分与第二种植物(例如柑橘植物)的至少一部分嫁接。第一种植物可以处于任何所期望的状态，包括但不限于健康状态、疾病状态、损伤状态、应激状态(stressed condition)(例如热、冷、水等)和/或其组合。第一种植物可以具有任何所期望的基因型，包括但不限于野生型、转基因的、突变的，和/或关于感兴趣的基因和/或性状的等等基因型。
第二种植物可以处于任何所期望的状态，包括但不限于健康状态、疾病状态、损伤状态、应激状态(例如热冷水等)和/或其组合。第二种植物可以具有任何所期望的基因型，包括但不限于野生型、转基因的、突变的，和/或关于感兴趣的基因和/或性状的等等基因型。第一种和/或第二种植物可以包括至少一种抗微生物肽和/或包括编码至少一种抗微生物肽的序列的至少一种核酸。在第一种植物包括至少一种抗微生物肽和/或包括编码至少一种抗微生物肽的序列的至少一种核酸，并且第二种植物包括至少一种抗微生物肽和/或包括编码至少一种抗微生物肽的序列的至少一种核酸的情况下，符合期望的是第一种和第二种植物具有相同的和/或不同的抗微生物肽和/或编码抗微生物肽的核酸。嫁接可以包括切割第一种植物的一部分以形成新鲜的切割位点，切割第二种植物的一部分以产生第二切割位点，和/或使第一切割位点和第二切割位点接触。切割位点可以包括至少一个维管束。嫁接可以包括形成嫁接接点和/或，任选地，封闭嫁接接点(例如通过在嫁接接点周围涂覆一种或多种阻隔材料)。
C.治疗植物疾病
在一些实施方案中，本公开涉及预防、减轻和/或治疗植物疾病(例如柑橘疾病)和/或植物疾病的至少一种症状的组合物、生物体、系统和方法。例如，方法可以包括将具有植物疾病和/或表现植物疾病的至少一种症状的的植物(例如柑橘植物)的至少一部分，与包括抗微生物肽的植物(例如柑橘植物)的至少一部分嫁接。植物疾病的实例包括但不限于细菌性溃疡病(柑橘溃疡病菌(Xac)，和/或由柑橘黄龙病菌(Las)引起的柑橘黄龙病(以前称青果病)。根据一些实施方案，预防、减轻和/或治疗植物疾病(例如柑橘疾病)和/或植物疾病的至少一种症状可以包括治疗和/或治愈柑橘的一种或更多种毁灭性细菌疾病。例如，包括以可表达的方式稳定整合的SoD2和SoD7转基因的植物可以呈现出对细菌性溃疡病(柑橘溃疡病菌(Xac)，和/或由柑橘黄龙病菌(Las)引起的柑橘黄龙病(以前称青果病)，但不限于这些病的抗性。这种抗性已被观察到，如下述实施例中所述。
根据一些实施方案，本公开涉及用于增加植物对植物疾病(例如柑橘疾病)的天然抗性，和/或给植物赋予对植物疾病(例如柑橘疾病)的抗性的组合物、生物体、系统和方法。例如，方法可以包括使植物与抗微生物肽和/或包括编码抗微生物肽的核酸序列的可表达的核酸接触。在一些实施方案中，包括编码抗微生物肽的核酸序列的可表达的核酸可以是和/或可以包括表达盒。根据一些实施方案，接触可以包括将目标植物的至少一部分与包括抗微生物肽和/或包括编码抗微生物肽的核酸序列的可表达的核酸的植物嫁接。在一些实施方案中，接触可以包括使目标植物的至少一部分与载体接触，所述载体(例如通过农杆菌介导的转化)包括抗微生物肽和/或包括编码抗微生物肽的核酸序列的可表达的核酸。植物疾病的实例包括但不限于细菌性溃疡病(柑橘溃疡病菌(Xac)，和/或由柑橘黄龙病菌(Las)引起的柑橘黄龙病(以前称青果病)。
D.制备柑橘-可表达的抗微生物肽
在一些实施方案中，本公开涉及用于形成柑橘-可表达的核酸的组合物、生物体、系统和方法，所述柑橘-可表达的核酸包括编码至少一种源自菠菜的抗微生物肽的核酸序列。例如，方法可以包括识别感兴趣的抗微生物肽的氨基酸序列，反向翻译氨基酸序列以产生第一核酸序列；为在柑橘中表达对第一核酸序列进行密码子优化以产生第二核酸序列，和/或合成具有第二核酸序列的核酸。在一些实施方案中，方法可以包括，使具有第二核酸序列的核酸与一个或更多个具有表达控制序列的核酸共价结合，所述表达控制序列相对于具有第二核酸序列的核酸在可操作的方向和/或位置上从而在柑橘中是可操作的。
如得益于本公开的本领域技术人员所理解的，可以预期其他等同的或可选择的病原体抗性柑橘组合物、生物体、系统和方法，而不背离本文所包含的描述。相应地，所显示的和所描述的实现本公开的方式仅仅被解释为举例说明。
本领域技术人员可以在形状、大小、数量和/或部件的排布上进行各种变化，而不背离本公开的范围。例如，表达控制序列、编码序列、接头和/或终止序列的位置和数量可以变化。根据一些实施方案，每个公开的方法和方法步骤可以与任何其他公开的方法或方法步骤联合实施或以任何顺序实施。当出现动词“可以”的时候，它是要表达可选条件和/或许可条件，但是它的使用不是要表示任何可操作性的缺乏，除非另有说明。本领域技术人员可以在制备和使用本公开的组合物、装置和/或系统的方法上进行各种变化。例如，组合物、装置和/或系统可以以适合微生物和/或植物的方式被制备和或使用(例如关于卫生、传染性、安全性、毒性、生物计量以及其他考虑)。在期望的情况下，可以实施本公开的一些实施方案，而排除其他实施方案。例如，可以实施一些多肽实施方案，而排除特定的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：26)，和/或可以实施一些核酸实施方案，而排除特定的核酸序列(例如SEQ IDNO：27)。
而且，在已经提供范围的情况下，公开的端点可以被认为是如特定的实施方案所期望或所需要的精确值和/或近似值。当端点是近似的时，灵活度可以根据范围的数量级相称地改变。例如，一方面，在大约5至大约50的范围的情况中，大约50的范围端点可以包括50.5，但不包括52.5或55，而另一方面，在大约0.5至大约50的范围的情况中，大约50的范围端点可以包括55，但不包括60或75。此外，在一些实施方案中，混合和搭配范围端点可能是符合期望的。而且，在一些实施方案中，每个公开的数字(例如在一个或更多个的实施例、表格和/或附图中)可以成为范围的基础(例如所述值+/-大约10％，所述值+/-大约50％，所述值+/-大约100％)和/或范围端点。关于前者，实施例、表格和/或附图中描述的50的值可以成为例如大约45至大约55，大约25至大约100，和/或大约0至大约100的范围的基础。
这些等同方式和替代方式以及显而易见的改变和修饰是要被包括在本公开的范围内。相应地，前述公开是要举例说明，而不是要限制由所附的权利要求说明的本公开的范围。
实施例
本公开的一些具体的示例实施方案可以由本文中提供的一个或更多个实施例进行说明。
实施例1：植物材料
通常如Yang等，Plant Cell Reports(植物细胞报告)(2000)19：1203及下列等等所述制备用于转化的植物材料(例如甜橙(Citrus sinensis))。
实施例2：质粒构建和细菌菌株
通常如Yang等，Plant Cell Reports(2000)19：1203及下列等等所述进行质粒构建和细菌菌株。
实施例3：农杆菌共培养和植物转化
通常如Yang等，Plant Cell Reports(2000)19：1203及下列等等所述进行农杆菌共培养和植物转化。
实施例4：转基因幼苗的选择和再生
通常如Yang等，Plant Cell Reports(2000)19：1203及下列等等所述进行转基因幼苗的选择和再生。
实施例5：转基因幼苗的嫁接
通常如Yang等，Plant Cell Reports(2000)19：1203及下列等等所述进行转基因幼苗的嫁接。
实施例6：Southern和Northern分析
通常如Yang等，Plant Cell Reports(2000)19：1203及下列等等所述进行Southern和Northern分析。
实施例7：在柑橘树中表达
表l说明用于柑橘的密码子优化的核酸序列的具体示例实施方案。所显示的信号肽和编码序列的结构基因的两侧是特定的限制性酶切位点。这些序列被用于构建用于制备转基因植物的表达盒、载体和转化的农杆菌。
表1.抗微生物基因的特定核苷酸序列的示例实施方案。为柑橘中密码子使用对核苷酸序列进行优化。
选择下面的栽培品种用于转化：
橙：哈姆林(“04”)，路德红(“05”)和马斯橙(“06”)(图3-7)；
葡萄柚：Ruby Red(“01”)(图8-11)和Rio Red(下面的实施例14)；
卡里佐枳橙(“CC”)(图12-13)；
飞龙枳(Flying Dragon)砧木(“13”和“16”)；
弗罗斯特尤利克(Frost Eureka)和弗罗斯特里斯本(Frost Lisbon)(13”和“16”)；
斯文格枳柚(Swingle)砧木(13”和“16”)；以及
C22砧木。
用于每个栽培品种的构建体如表2所示。
表2.用编码菠菜(Spinacia oleracea)抗微生物肽的SoD2和SoD7基因各自的三种不同的合成序列转化的橙、葡萄柚、柠檬和柑橘砧木栽培品种(幼苗上胚轴)(总共至少521个事件)。
A.橙的转化
用包括具有信号肽的GenScript-优化的SoD2(“07”)，具有信号肽的GenScript-优化的SoD7(“08”)，具有信号肽的CODA-优化的SoD2(“09”)，或具有信号肽的CODA-优化的SoD2(“10”)的单个构建体转化橙植物。图3表示Southern blot，显示了用GenScript-优化的SoD2转化的哈姆林(0407)和用GenScript-优化的SoD2转化的路德红(0507)中的转基因事件中的插入数量。图4表示Southern blot，显示用CODA-优化的SoD2转化的哈姆林(0409)或用CODA-优化的SoD7转化的哈姆林(0410)，以及用CODA-优化的SoD2转化的路德红(0509)或用CODA-优化的SoD7转化的路德红(0510)中的转基因事件中的插入数量。哈姆林中GenScript-优化的SoD7(“08”)和CODA-优化的SoD2(“09”)的其他转化事件显示在图9中。
橙栽培品种哈姆林、路德红和马斯橙的转基因植物(n＝82)产生这些抗微生物基因的高水平的转录物(表2和图5-7)。图5表示northern blot，显示在用为柑橘中密码子使用进行GenScript-优化的SoD2基因转化的马斯橙，(0607)或为柑橘中密码子使用进行GenScript-优化的SoD7基因转化的马斯橙(0608)中的转基因事件中的RNA转录物。图6表示northern blot，显示在用CODA-优化的SoD2转化的哈姆林(0409)或用CODA-优化的SoD7转化的哈姆林(0410)，以及用CODA-优化的SoD2转化的路德红(0509)或用CODA-优化的SoD7转化的路德红(0510)中的转基因事件中的RNA转录物。图7表示northern blot，显示在用GenScript-优化的SoD2转化的哈姆林(0407)或用GenScript-优化的SoD7转化的哈姆林(0408)，以及用GenScript-优化的SoD2转化的路德红(0507)或用GenScript-优化的SoD7转化的路德红(0508)中的转基因事件中的RNA转录物。为了识别，表2包含栽培品种和基因组合的转基因事件代码。
橙植物(哈姆林)也用包括没有信号肽的DNA 2.0-优化的SoD2(“11”)或没有信号肽的DNA 2.0-优化的SoD7(“12”)的单个构建体转化。图8表示Southern blot，证实在这些橙植物中插入SoD2或SoD7。哈姆林中SoD7(12)的其他转化事件显示在图9中。
B.葡萄柚的转化
Ruby Red(“0l”)植物用包括没有信号肽的DNA 2.0-优化的SoD2(“11”)或没有信号肽的DNA 2.0-优化的SoD7(“12”)的单个构建体转化。图9表示Southern blot(膜暴露于SoD2和SoD7二者的探针)，证实在这些葡萄柚植物中插入SoD2或SoD7。图10表示northernblot(膜暴露于SoD2和SoD7二者的探针)，显示在用SoD2转化的Ruby Red(0111)或SoD7转化的RubyRed(0112)中的转基因事件中的RNA转录物。为了识别，表2包含栽培品种和基因组合的转基因事件代码。
C.卡里佐枳橙和C22的转化
卡里佐枳橙和C22砧木用包括uidA，和SoD2或SoD7或SoD2+SoD7的任一个的构建体转化。图11表示Southern blot，证实在这些卡里佐枳橙植物中插入SoD2(其泳道标记为“07”)和SoD7(其道标记为“08”)。图12表示northern blot，显示从这些用SoD2(具有信号肽的GenScript-优化序列)和SoD7(具有信号肽的GenScript-优化序列)转化的卡里佐枳橙植物(标记为“CC”)分离的RNA转录物。为了识别，表2包含栽培品种和基因组合的转基因事件代码。每个中C22转化事件的数量由阳性GUS染色证实。
斯文格枳柚和飞龙枳柚(柑橘砧木)植物用不同构建体转化，所述构建体包括包括具有信号肽的GenScript-优化的SoD2和SoD7的单个构建体。C22、飞龙枳柚和斯文格枳柚植物的成功转化至少已由阳性GUS染色证实。
D.柠檬的转化
弗罗斯特里斯本和弗罗斯特尤利克(柠檬)植物用不同构建体转化，所述构建体包括包括具有信号肽的GenScript-优化的SoD2和SoD7的单个构建体。C22、飞龙枳柚和斯文格枳柚植物的成功转化至少已由阳性GUS染色证实。
实施例8：溃疡病抗性试验
使用通常如Francis MI等，2010，Eur J Plant Pathol 127：571-578所述的分离叶片试验评估溃疡病抗性。简短来说，分离的不成熟叶片(～75％展开)在无菌水中漂洗三次以除去杂物，短暂浸入70％乙醇中然后是0.5％次氯酸钠中进行消毒，再在无菌水中漂洗三次。消毒的叶片(每组实验重复3-4片x3组重复实验)用在佛罗里达州戴德县分离的Xcc菌株的含水悬液在其远轴表面浸润。被接种的叶片被压在软水琼脂板表面，用封口膜封上，并在环境可控的生长箱中温育。
图13A显示如上所述地用柑橘溃疡病原体接种非转基因“Rio Red”叶片的结果，而图13B显示如上所述地用柑橘溃疡病原体接种表达SoD2的“Rio Red”植物的转基因叶片的结果。可以看到转基因叶片上的病变的大小和数量大大减少。
实施例9：通过嫁接进行柑橘青果病(黄龙病(HLB))疾病抗性试验
图14显示用柑橘青果病病原体接种非转基因“Rio Red”(左边的两颗树)或表达SoD2的转基因“Rio Red”(右边的一颗树)的嫁接的结果。使用用HLB感染的非转基因砧木(Cleopatra mandarin)。向该砧木嫁接几个转基因“Rio Red”的芽并且重复这一行为。然后对“Rio Red”的非转基因芽进行同样的方案。8周后，可以看到转基因嫁接物快速生长，而对照则没有生长。
实施例10：通过木虱接种进行柑橘青果病(HLB)疾病抗性检测
通过两种度量标准评估对细菌感染的抗性和生长。首先，通过感染的百分比，即被感染的暴露植物的数量评价抗性。其次，使用基于PCR的方法扩增细菌序列。在此方法中，感染的相对程度影响产生可检测信号所需的PCR循环的数目。例如严重感染的植物可能只需要几次循环，而低细菌滴度的植物可能需要更多的循环。通常，需要30次或更多次才能观察到可检测信号的植物被认为未被感染。由于柑橘的某些感染发展缓慢，在第一次暴露的时间之后的5-11个月以及从那之后的6-9个月期间收集样品用于检测。样品收集的频率可以从大约每45天至大约每120天而不同。每个转基因事件的10-15组重复实验加上非转基因对照被随意地置于含有成千上万只携带柑橘青果病病原体的木虱的防虫温室中。在连续暴露于木虱之后大约5个月进行第一次PCR检测。为检测病原体而进行的DNA提取和PCR基本上如Irey MS等，2006，Proc.Fla.State Hort.Soc.119：89-93所述。
实施例11：第1代的繁殖和抗性
用包括具有人工防御素基因构建体的表达载体的农杆菌转化红葡萄柚(2个品种(varieties))和甜橙(3个品种)，所述人工防御素构建体在信号肽上包括2个氨基酸的插入并在编码序列中包括单个氨基酸的缺失(SEQ ID NOS：26和27)。在具有高水平SoD2RNA表达的基础上进一步检测总共6个转化事件。如本文所述培养植物，并如所述地评估细菌抗性。11个月后在田中收集第一组样品(DO)。在第一次采样后的指定的天数(42-471)收集后续的样品(例如D42＝11个月+42天)。结果显示在表3中。
表3：第1代感染数据
实施例12：第2代的繁殖和抗性
用包括下述防御素基因构建体之一的农杆菌转化甜橙(2个品种)：
(a)具有烟草PR-1b信号肽的GenScript-优化的SoD2(SEQ ID NO：9)，
(b)具有烟草PR-1b信号肽的CODA-优化的SoD2(SEQ ID NO：11)，
(c)具有烟草PR-1b信号肽的GenScript-优化的SoD7(SEQ ID NO：10)，或
(d)具有烟草PR-1b信号肽的CODA-优化的SoD7(SEQ ID NO：12)。
观察到总共71个转化事件。如本文所述培养植物，并如所述地评估细菌抗性。5个月后在木虱房中收集第一组样品(第0天)。在第一次采样后的指定的天数收集后续的样品(例如第73天＝5个月+73天)。结果显示在图15、图16、表4和表5中。
实施例13：第3代的繁殖和抗性
用包括下述防御素基因构建体之一的农杆菌转化一个甜橙品种和一个葡萄柚品种：
(a)没有信号肽的GenScript-优化的SoD2(SEQ ID NO：3)，或
(b)没有信号肽的GenScript-优化的SoD7(SEQ ID NO：4)。
观察到总共36个转化事件。如本文所述培养植物，并如所述地评估细菌抗性。5个月后在木虱房中收集第一组样品(第0天)。在第一次采样后的指定的天数收集后续的样品(例如第103天＝5个月+103天)。结果显示在图16和表5中。
实施例14：第4代的繁殖和抗性
制备第一品系的甜橙(2个品种)、一种葡萄柚和两种砧木以共表达(i)具有烟草PR-1b信号肽的GenScript-优化的SoD2(SEQ ID NO：9)和(ii)具有烟草PR-1b信号肽的GenScript-优化的SoD7(SEQ ID NO：10)。更特别地，用双防御素构建体转化植物，所述双防御素载体在5’至3’方向上包括SoD2、uidA和SoD7(13)。观察到总共29个转化事件，以及在组织培养中或者刚好在组织培养之外有另外28个GUS阳性的候选物。被证实共表达SoD2和SoD7的植物被培养并在感染试验中被评估以确定共表达预防、改善和/或治疗感染的程度。
图9表示Southern blot(膜暴露于SoD2和SoD7的探针)，显示在用包括SoD2和SoD7的双防御素构建体转化的哈姆林(0413)中的转化事件的插入数量。图10也显示了在用包括SoD2和SoD7的双防御素构建体转化的哈姆林(0413)中的转化事件的插入数量。
用双防御素构建体(13)转化Rio Red植物(02)。图17表示Southern blot，证实在这些Rio Red植物中插入SoD2和SoD7二者。用在SoD2、uidA和SoD7内部切割的单个限制性酶切割DNA，并用SoD2和SoD7二者的探针同时进行印迹。图18表示northern blot，显示从用SoD2(具有信号肽的GenScript-优化序列)和SoD7(具有信号肽的GenScript-优化序列)转化的Rio Red植物(标记为“02”)分离的RNA转录物。还显示了从哈姆林植物(标记为“04”)分离的RNA转录物。
实施例15：第5代的繁殖和抗性
对SoD2和SoD7的共表达的评价正在进行。制备一品系的甜橙(1个品种)以共表达(i)没有信号肽的DNA 2.0SoD2(SEQ ID NO：30)和(ii)没有信号肽的DNA 2.0SoD7(SEQ IDNO：31)。通过Southern和northern blotting分析证实转化和表达。如本文所述培养植物并如所述地检测细菌抗性。被证实共表达SoD2和SoD7的植物被培养并在感染试验中被评估以确定对其共表达预防、改善和/或治疗感染的程度。
实施例16：防御素构建体在不同植物中的表达
包括为柑橘密码子优化的核酸序列的防御素构建体的稳定表达已在下列植物中被证实：
对于所有构建体，发现跨越一系列表达水平，从无表达(例如虽然Southern结果证明该基因存在，经常是以多拷贝存在，可能是转基因被沉默)到低表达到高表达的单个转化事件。
实施例17：SoD2和SoD7的抗体
产生SoD2和SoD7的抗体。由GenScript合成全长SoD7肽。等分的合成SoD7(每次200ug)每三周被注射到2只不同的兔的每一只中，共注射4次。第3次注射后2周和第4次注射后2周收集血清。用Protein A柱纯化IgG。使IgG制备物经过合成SoD7与琼脂糖小球结合的柱，然后用低pH的缓冲液洗脱来纯化SoD7特异性IgG。对洗脱物进行与从1ng至100ng的合成SoD7的稀释系列结合的筛选。图19是Western blot，说明纯化的SoD7-特异性IgG抗体与在转基因植物(第3、4和6-9道)、带有合成SoD7肽的非转基因植物任一个中(第5道)大约20ng的SoD7肽的结合或与纯的合成SoD7(第10道)的结合。
Claims (13)
1.一种核酸，所述核酸由与选自由SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:5组成的组的序列具有大约98％同一性的核酸序列组成，并编码由与SEQ ID NO:26的位置1至位置51相同的氨基酸序列组成的成熟肽，其中所述成熟肽在柑橘中具有有效的对黄龙病柑橘青果病的抗微生物活性。
2.一种肽，所述肽由与SEQ ID NO:26的位置1至位置51相同的氨基酸序列组成，其中所述肽在柑橘中具有有效的对黄龙病柑橘青果病的抗微生物活性。
3.一种核酸，所述核酸由与选自由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:30组成的组的序列具有大约98％同一性的核酸序列组成，并编码与SEQ ID NO:26的位置-2至位置51相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列编码成熟肽，其中所述成熟肽在柑橘中具有有效的对黄龙病柑橘青果病的抗微生物活性。
4.一种表达载体，所述表达载体包括，在5’至3’方向上：
表达控制序列；
与所述表达控制序列可操作地连接的外源核酸；和
与所述外源核酸可操作地连接的3’终止序列，其中所述外源核酸包括与选自由SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:30组成的组的核酸序列具有至少98％同一性的核酸序列，其中所述外源核酸编码由与SEQ ID NO:26的位置1至位置51相同的氨基酸序列组成并且在柑橘中具有有效的对黄龙病柑橘青果病的抗微生物活性的成熟肽。
5.根据权利要求4的表达载体，其中所述表达载体位于细菌细胞中。
6.根据权利要求4的表达载体，其中所述表达载体位于植物细胞中。
7.根据权利要求4的表达载体，所述表达载体进一步包括所述表达控制序列的3’、所述外源核酸的5’的接头，并且所述接头具有从大约1至大约200个核苷酸的长度。
8.一种细菌细胞，所述细菌细胞包括表达载体，所述表达载体包括，在5’至3’方向上：
表达控制序列；
与所述表达控制序列可操作地连接的外源核酸；和
与所述外源核酸可操作地连接的3’终止序列，其中所述外源核酸由与选自由SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:30组成的组的核酸序列具有至少98％同一性的核酸序列组成，
其中所述外源核酸编码由与SEQ ID NO:26的位置1至位置51相同的氨基酸序列组成的成熟肽，其中所述成熟肽在柑橘中具有有效的对黄龙病柑橘青果病的抗微生物活性。
9.一种在柑橘植物中表达包括编码被表达肽的核酸序列的外源核酸的方法，所述方法包括：
使包括所述外源核酸的表达盒或者包括所述外源核酸的表达载体与所述柑橘植物的细胞胞质在允许所述外源核酸表达并允许所述被表达肽形成的条件下接触，
其中所述外源核酸由与选自由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:30组成的组的核酸序列具有至少98％同一性的核酸序列组成，
所述表达盒或表达载体包括，在5’至3’方向上，表达控制序列，与所述表达控制序列可操作地连接的外源核酸，和与所述外源核酸可操作地连接的3’终止序列，并且
所述被表达肽由与SEQ ID NO:26的位置1至位置51相同的氨基酸序列组成，
其中所述被表达的肽具有在柑橘中有效的对黄龙病柑橘青果病的抗微生物活性。
10.根据权利要求9的方法，其中所述接触进一步包括将细胞与包括所述表达载体或所述表达盒的农杆菌细胞共培养以形成共培养的细胞。
11.根据权利要求9的方法，所述方法进一步包括从共培养的细胞再生植物。
12.一种核酸，所述核酸由与选自由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:30组成的组的序列具有约98％同一性的核酸序列组成，
其中所述核酸序列编码由与SEQ ID NO:26相同的氨基酸序列组成的前肽，
其中所述前肽编码具有在柑橘中有效的对黄龙病柑橘青果病的抗微生物活性的成熟肽。
13.根据权利要求12的核酸，其中所述成熟肽由与SEQ ID NO:26的位置1至位置51相同的肽组成。
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