CN102604945B - 对嗜肺军团菌O5型的wzt基因特异的核苷酸及其应用 - Google Patents
对嗜肺军团菌O5型的wzt基因特异的核苷酸及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102604945B CN102604945B CN2012101052786A CN201210105278A CN102604945B CN 102604945 B CN102604945 B CN 102604945B CN 2012101052786 A CN2012101052786 A CN 2012101052786A CN 201210105278 A CN201210105278 A CN 201210105278A CN 102604945 B CN102604945 B CN 102604945B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- type
- legionella
- seq
- legionella pneumophilia
- nucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 title abstract description 6
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 title abstract description 6
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 claims description 102
- 241000589248 Legionella Species 0.000 claims description 100
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 41
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 8
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 101150068332 KIT gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002493 microarray Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 abstract 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 5
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 206010035718 Pneumonia legionella Diseases 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000004378 air conditioning Methods 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000498 cooling water Substances 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589244 Fluoribacter bozemanae Species 0.000 description 2
- 206010048612 Hydrothorax Diseases 0.000 description 2
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 2
- 241000589264 Legionella longbeachae Species 0.000 description 2
- 208000004023 Legionellosis Diseases 0.000 description 2
- 208000035353 Legionnaires disease Diseases 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 iron ion Chemical class 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006533 ATP-Binding Cassette Transporters Proteins 0.000 description 1
- 102000005416 ATP-Binding Cassette Transporters Human genes 0.000 description 1
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589282 Fluoribacter dumoffii Species 0.000 description 1
- 206010021703 Indifference Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000589259 Legionella feeleii Species 0.000 description 1
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000589262 Tatlockia micdadei Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 244000144987 brood Species 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005491 wire drawing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种对嗜肺军团菌血清型O5型的wzt基因特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸为：SEQ ID NO:1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸；与上述的核苷酸互补的核苷酸。这些核苷酸可用于制备检测嗜肺军团菌血清型O5型的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列。本发明的对嗜肺军团菌血清型O5型的wzt基因特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列的实用性强，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于商品化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种核苷酸及其应用，尤其涉及一种对嗜肺军团菌血清型5型(Legionella pneumophila serogroup O5)的wzt (LPS O-抗原的ABC转运子，ABC transporter of LPS O-antigen，以下简称wzt) 基因特异的核苷酸及其应用。
背景技术
军团菌最初是在美国发现的，是一种的无芽胞革兰氏阴性杆菌，对自然环境因素抵抗力较强，主要是引起呼吸道传染疾病，可通过气溶胶的方式在空气中散布，人类会因为吸入含菌的气溶胶而感染，引起军团病（Legionnaires disease，LD）。目前已知军团菌有52个种70多个血清型，能引起人类疾病的约有20种。常见的有嗜肺军团菌（Legionellapneumophila，LP）、 米氏军团菌（Legionella micdadei）、 博氏军团菌（Legionella bozemanii）、 菲氏军团菌（Legionellafeeleii）、 杜莫夫军团菌（Legionella dumoffii）和长滩军团菌（Legionella longbeachae）等。
其中嗜肺军团菌与人类疾病关系最为密切。根据O-抗原的不同，嗜肺军团菌可分为15个血清型。其中大约有70%的军团菌感染是由嗜肺军团菌O1引起的，20-30%是由其它血清型引起的，非嗜肺军团菌导致约5-10%的军团菌感染。
嗜肺军团菌为需氧革兰阴性杆菌，兼性胞内寄生菌，无荚膜 ，不产酸，不产气， 有一根至数根侧鞭毛或端鞭毛，可运动，菌体长 2-50μm,宽0.5-1μm。该菌生长营养要求较高，生长时需要半胱氨酸，甲硫氨酸和铁离子等，在活性炭 - 酵母浸出液琼脂（ BCYE） 培养基上可生长，在GVPC 平板上呈灰白色，边缘有紫蓝色光泽，挑起有拉丝；在含 2.5 % - 5.0 %的 CO2环境中生长很好, 厌氧条件下不生长。最适温度为 35 ℃ - 36℃， 具有一定的耐酸性和耐热性菌落颜色一般呈灰白色、紫色、蓝色或绿色, 但在普通血平板、普通琼脂或巧克力琼脂上不生长。
嗜肺军团菌在普通自来水中可存活400天以上，在60℃ 左右甚至在火山口附近的水塘里都能发现军团菌的踪迹。我国报告的病例多是嗜肺军团菌血清 O1 型、O5型、O6型。在欧美各国嗜肺军团菌肺炎占肺炎病例中的2.4 %-8.4 %。
随着分子技术特别是PCR技术的发展，许多分子生物学方法被用于军团菌分子分型和流行病学研究。目前已用于军团菌分型的4种常用分子分型技术为：随机扩增多态性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、脉冲场凝胶电泳( Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、核酸测序分型(Sequence-based typing，SBT)。由于其一次即可分离出大量DNA片段，且具有操作简便，重复率好等优势，先后用于军团菌分子分型和流行病学调查。
聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，简称PCR技术)作为微生物检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对嗜肺军团菌血清型O5型的wzt基因特异的核苷酸，所述核苷酸为：
1）SEQ ID NO:1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸；
2）与1）所示的核苷酸互补的核苷酸。
上述核苷酸可以用于制备检测嗜肺军团菌血清型O5型的wzt基因的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列；所述嗜肺军团菌血清型O5型可以取样于自来水、矿泉水、空调冷却水的培养物的粗提液，或是嗜肺军团菌血清型O5型的纯培养物的粗提液等。
其中所述取样于自来水、矿泉水、空调冷却水培养物的嗜肺军团菌血清型O5型粗提液指的是采用常规方法制备获得。
其中所述嗜肺军团菌血清型O5型的纯培养物的粗提液指的是采用常规方法制备获得。
本发明还提供一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括上述的核苷酸；其中所述的PCR引物优选为如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸。
SEQ NO:1 ATAATAAAGCAAGCCTTGAT 特异扩增嗜肺军团菌血清型O5型的wzt基因上游引物
SEQ NO:2 TTCTGGATGAAAACCAGTC 特异扩增嗜肺军团菌血清型O5型的wzt基因下游引物
上述多重PCR检测试剂盒可以包括如下试剂： 10 mM dNTP 20μL；10×酶特异性反应缓冲液50μL；5 U/μL 耐热DNA聚合酶 8μL；引物各10μL；阳性对照品10μL，阴性对照品10μL；ddH2O 5mL。
上述针对嗜肺军团菌血清型O5型的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理—扩增—电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。
本发明还提供一种基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸。
本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸。
由上述的技术方案可见，本发明建立的一种PCR反应体系，可检测嗜肺军团菌血清型O5型，该试剂盒有如下优点：
（1）方法简便，周期短、速度快、可操作性强: 本发明所配制的PCR试剂盒配制方法简便，检测速度快、周期短，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却较低，市场应用前景广。本发明PCR试剂盒若用嗜肺军团菌5型的菌悬液进行PCR扩增，与经提取得到的DNA作为模板扩增所得结果一致，且敏感度和特异性无差别，可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可进行检测，因而节省了物力人力。
（2）检测灵敏度高：本发明提供的PCR检测试剂盒及其检测方法敏感性高，检测精度高，可以检测到1ng/μL的DNA模板。对常见致病菌可以进行全面、系统、准确的检测与鉴定。
(3)检测成本相对较低：可以推广应用于食品卫生监督、环境监测、商品检验检疫等领域，并为其他不同致病菌检测组合提供技术模式。
（4）准确性高：本发明根据嗜肺军团菌O5型的wzt基因的特异核苷酸序列，设计出引物。从而利用引物组合成复合PCR检测体系，能够直接将嗜肺军团菌血清型O5型和其他近源菌分开。
附图说明：
图1为本发明的试剂盒检测结果图，其中：1为待测样品，检测到病原菌；P为阳性对照品；N为阴性对照品；M为DL2000 DNA marker；
图2 为本发明试剂盒检测嗜肺军团菌其他血清型标准菌株电泳结果图，其中：1，嗜肺军团菌O5型 G3408；2，嗜肺军团菌O2型G2773；3，嗜肺军团菌O3型 G2772；4，嗜肺军团菌O4型 G2781；5，嗜肺军团菌O1型G2756；6，嗜肺军团菌O6型 G2771；7，嗜肺军团菌O7 型G3410；嗜肺军团菌O8 型G2820；9，嗜肺军团菌O9型 G2774；10，嗜肺军团菌O10型 G2818；11，嗜肺军团菌O11型 G2824；12，嗜肺军团菌O12型 G2822；13，嗜肺军团菌O13型 G2819；14，嗜肺军团菌O14型 G2817；15，嗜肺军团菌O15型 G2829；M，DL2000 DNA marker；
图3 为本发明试剂盒检测军团菌属非嗜肺军团菌电泳结果图，其中：1，嗜肺军团菌O5型G3408；2，Legionella anisa；3，Legionella longbeachae；4，Legionella micdadei；5，Legionella waltersii；6，Legionella steigerwaltii；7，Legionella bozemanii；8，Legionella gormanii；M，DL2000 DNA marker；
图4 为本发明检测军团菌属临床菌株电泳结果图，其中：1，嗜肺军团菌O5型 G3408；2，嗜肺军团菌O5型G2765；3，嗜肺军团菌1型G2759；4，嗜肺军团菌1型G2760；5，嗜肺军团菌2型G2761；6，嗜肺军团菌3型G2762；7，嗜肺军团菌7型G2763；8，嗜肺军团菌7型G2764；M，DL2000 DNA marker；
图5 为本发明试剂盒检测其它种属近源菌种标准菌株电泳结果图，其中：1，嗜肺军团菌O5型G3408；2，Salmonella；3，Shigella. Dysenteriae；4，Staphylococcus aureus；5，Yersinia enterocolitica；6，Pseudomon asaeruginosa；7，Aeromonas hydrophila；M，DL2000 DNA marker。
具体实施方式：
为保证本发明的上述和其它目的特征和优点更明白易懂，下面特举较佳实施例，同时结合说明书附图及具体实例对本发明进一步详细描述。
实施例1：
基因组的提取
（1）在超净工作台中，从菌种保藏管中吸取少量菌液，划线接种到军团菌BCYE生长平板上，37°C，5.0% CO2培养5-7天；
（2）向BCYE生长平板中加入2mL无菌水，用无菌圆头玻璃棒轻轻刮起菌苔，然后将菌悬液吸到1.5mL离心管中，8000rpm离心5分钟，弃上清，重复洗一次；
（3）加入250μL 50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬，12000rpm离心5分钟，弃上清；
（4）加入250μL 50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬，再加10μL 0.45M EDTA(pH8.0)，充分悬浮，37℃温浴20分钟；
（5）加入10μL 20mg/mL溶菌酶，37℃温浴20分钟；
（6）加入1.5μL 20mg/mL蛋白酶K，轻柔混匀；
（7）加入15μL 10%SDS，50℃水浴2小时至溶液澄清，期间轻轻颠倒混匀若干次；
（8）加2μL 20mg/mL RNAse，65℃水浴30分钟；
（9）用剪去尖头的枪头将上述溶液移到新的洁净离心管中；
（10）在通风橱中加入250μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，12000rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管，重复一次；
（11）在通风橱中加入250μL氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀，12000rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管；
（12）加入2.5倍体积的提前预冷的无水乙醇，轻摇，于-80℃沉淀DNA。12000rpm ，4℃离心15min；
（13）用1mL70%冰乙醇洗涤DNA沉淀，然后在65℃，10min烘干；
（14）用30μL TE溶解，并于-20 °C冰箱备用。
用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，同时用NanoDrop2000 OD仪测量DNA的纯度和浓度。
实施例2：
引物的设计
嗜肺军团菌血清型O5型的O抗原基因簇序列是本实验室自测的，通过比对分析，选取wzt基因作为该菌的特异靶基因，针对嗜肺军团菌O5型的wzt基因的特异区设计引物；如表1所示，上游引物是5’- ATAATAAAGCAAGCCTTGAT -3’，见序列SEQ ID NO:1；下游引物是5’- TTCTGGATGAAAACCAGTC -3’，见序列SEQ ID NO:2。
表1 嗜肺军团菌血清型O5型的特异引物序列
实施例3：
特异引物的筛选
收集了1株嗜肺军团菌O5型标准菌株，14株嗜肺军团菌其它血清型的标准菌株、7株军团菌属其他菌株、1株嗜肺军团菌O5型临床分离株、6株军团菌属其它血清型临床分离株以及6株近缘菌验证引物的特异性，菌株编号和来源见下表2。
表2 供试的标准菌株
本专利所使用的临床菌株如下表3所示：
表3 供试临床菌株的生化检验结果
PCR体系为10μM 引物0.3μL、10×buffer 2.5μL、10mM dNTP 0.25μL、5 U/μL Taq 聚合酶0.2μL及3μL的待测样品模板到0.2mL的薄壁PCR管中，最后用ddH2O补足至25μL。所用引物在嗜肺军团菌5型的模板中得到阳性结果，在其它组中没有得到任何PCR产物带，所以这些寡核苷酸片段是高度特异的。
实施例4：
PCR检测试剂盒
一、检测实验所需材料及设备的准备
1. 试剂盒组成：
1）dNTP（10mM） 50μL；
2）10×buffer（10×酶特异性反应缓冲液） 300μL；
3）MgCl2 （25mM） 300μL；
4）Taq 聚合酶（5 U/μL） 5μL；
5）引物混合物（5 μM） 70μL；
6）阳性对照品（KP） 10μL；
7）阴性对照品（KN） 10μL；
8）ddH2O 5mL。
每个试剂盒可用于检测10个样品。
其中10×buffer 、dNTP、Taq 聚合酶由宝生物工程（大连）有限公司提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品（含有嗜肺军团菌5型的样品）、阴性对照品（将模板换成ddH2O）和ddH2O由我们自行制备。
使用上述PCR检测试剂盒进行嗜肺军团菌5型检测的方法包括以下步骤：
(1)待测环境样品模板的提取：
环境样品模板通常为痰、血、胸水肺组织、支气管抽提物、矿泉水取样、自来水取样、空调冷却水取样等的培养物的粗提液，或是嗜肺军团菌O5型的纯培养物的粗提液，或是纯DNA，或者是阳性对照品和阴性对照品。
用1.5mL 50mM Tris-HCl (pH8.0) 刮取培养物，在12000rpm条件下离心1分钟，去掉上清液；用500μL的ddH2O重悬沉淀，在12000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，倒干；用100μLddH2O重悬沉淀，在100℃沸水中水浴10分钟；再置于冰上10分钟后，在12000rpm条件下离心2分钟；用5μL中层上清做为PCR反应的模板。
（2）在PCR薄壁管中加入dNTP、10×酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、引物、待测样品模板和ddH2O，混匀，将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃ 5分钟
94℃ 30秒
58℃ 40秒
72℃ 30秒 回到第二步，共35个循环
72℃ 5分钟
（3）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果
①取3μL扩增产物与10×溴酚蓝上样缓冲液以9：1的体积比混合；
②将混合液上样于2％的琼脂糖凝胶上；
③将琼脂糖凝胶电泳120V稳压电泳约15分钟，用DL2000 Marker进行对照；
④观察并记录结果。
（4）分析并进行结果判断。
本发明通过配制一种可检测嗜肺军团菌血清型5型，可商品化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的成分组合在一起，使用时，提取待测样品，同时经过简单的操作程序就能进行灵敏、快速、简便的检测，检测试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂盒检测嗜肺军团菌5型所使用的试验设备简单，检测成本低。
使用阳性和阴性对照品的目的是用于质控整个操作过程，以便得出准确的判断。
本发明一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量见下表4所示，DNA模板量为0.5μL。
表4 一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量
| 成分 | 浓度 | 加样量（μL） |
| ddH2O | - | 18 |
| 10×酶特异性反应缓冲液 | 10× | 2.5 |
| MgCl2 | 25mM | 2.5 |
| dNTP | 10mM | 0.25 |
| P-1 | 10μM | 0.5 |
| P-2 | 10μM | 0.5 |
| Taq酶 | 5U/μl | 0.25 |
本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq聚合酶。
上述的阳性对照品为已确定是含有嗜肺军团菌5型的样品，阴性对照品则为ddH2O。
2．仪器设备
SANYO高压灭菌锅（SANYO公司）；T Gradient PCR仪（Biometra公司）；
各种型号移液器（Eppendorf公司）；Sigma1-13K离心机（Sigma公司）；5804R高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；ND-2000 NanoDrop OD仪器（ NanoDrop公司）；SIM-F124制冰机（日本SANYO）；超纯水净化系统（Milli-Q）；凝胶成像仪（UVP公司）和0.2mL PCR薄壁管。
3.待测样品的提供
本发明所用实验菌株如表1和表2所示。
二、检测实施的具体操作：将上述28株标准菌株和7株军团菌临床菌株在同样条件下采用本发明所提供的PCR检测试剂盒进行PCR方法的检测。
1. 待测样品模板的提取
A．针对标准菌株
1）20μL接菌量，无菌操作，划线接种于BCYE培养基中， 37℃、5%CO2培养2-3天；
2）用50mM Tris-HCl(pH8.0)刮取菌落，12000rpm离心5分钟，去上清；
3）用500μL ddH2O重悬沉淀，12000rpm离心5分钟，去上清，尽量空干；
4）用100μL ddH2O重悬沉淀，混匀，100℃沸水浴10分钟；
5）置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟；
6）取5μL中层上清做为PCR反应的模板。
B．针对环境培养物（痰、血、胸水肺组织、支气管抽提物、矿泉水、自来水、空调冷凝水等）
1）用50mM Tris-HCl(pH8.0)刮取菌落，12000rpm离心5分钟，去上清；
2）用500μLddH2O重悬沉淀，12000rpm离心5分钟，去上清，尽量控干；
3）用100μLddH2O重悬沉淀，混匀，100℃沸水浴10分钟，
4）置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟；
5）取5μL中层上清做为PCR反应的模板。
2. 用微量移液器分别吸取PCR试剂盒中5μM 引物0.4μL，25mM的10×buffer 2.5μL、10mM的dNTP 0.25μL，5 U/μL Taq 聚合酶0.25μL及5μL的待测样品模板到0.2mL的薄壁PCR管中，最后用ddH2O补足至25μL，充分混匀；
3. 将混合物高速离心数秒后在PCR仪上依下列温度和时间进行扩增：94℃ 5分钟1个循环；94℃ 40秒，58℃ 40秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 5分钟 1个循环；
4. 在电泳设备中电泳PCR扩增产物，记录结果。
1）取3μL扩增产物与10×溴酚蓝上样缓冲液混合；
2）将混合液上样于1.5％的琼脂糖凝胶上；
3）将琼脂糖凝胶经120V电压稳压电泳约10分钟，用DL2000 Marker进行对照；
4）观察前沿溴酚蓝指示剂迁移至距加样孔至少3cm停止电泳，在凝胶成像仪上观察并记录试验结果；
5. 依据如下条件进行结果判断嗜肺军团菌O5型应在293bp处有一条带。
阳性对照和阴性对照试验只要将待测样品模板换成嗜肺军团菌O5型阳性模板和嗜肺军团菌O5型阴性模板（含大肠杆菌）即可，含有嗜肺军团菌O5型的样品模板具有293bp片段，不含嗜肺军团菌O5型的样品模板无此片段。标准菌株电泳结果记录见图2所示：所有标准菌株除嗜肺军团菌1型有293bp片段外，其他菌株均无扩增产物。临床菌株电泳结果记录见图4所示：总计有8株，除嗜肺军团菌O5型有293bp片段外，其他菌株均无扩增产物。这说明采用PCR检测方法可排除假阳性反应，根据有无以上片段进行的嗜肺军团菌O5型的检测鉴定，检测准确度提高了，避免了因检测失误而导致的损失。
利用上述实验步骤得到的杂交试剂盒，可用于检测嗜肺军团菌血清型O5型。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津生物芯片技术有限责任公司
天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
<120> 对嗜肺军团菌O5型的wzt基因特异的核苷酸及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 嗜肺军团菌05型
<400> 1
ataataaagc aagccttgat 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 嗜肺军团菌05型
<400> 2
ttctggatga aaaccagtc 19
Claims (4)
1.一种对嗜肺军团菌血清型O5型的wzt基因特异的核苷酸，其特征在于所述核苷酸如SEQ ID NO：1所示的核苷酸和SEQ ID NO：2所示的核苷酸。
2.一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于包括如下试剂： 10 mM dNTP 20μL；10×酶特异性反应缓冲液50μL；5 U/μL 耐热DNA聚合酶 8μL；引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2各10μL；阳性对照品10μL，阴性对照品10μL；ddH2O 5mL。
4.SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸在制备用于检测嗜肺军团菌血清型O5型的wzt基因试剂盒方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012101052786A CN102604945B (zh) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | 对嗜肺军团菌O5型的wzt基因特异的核苷酸及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012101052786A CN102604945B (zh) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | 对嗜肺军团菌O5型的wzt基因特异的核苷酸及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102604945A CN102604945A (zh) | 2012-07-25 |
| CN102604945B true CN102604945B (zh) | 2013-06-26 |
Family
ID=46522717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012101052786A Expired - Fee Related CN102604945B (zh) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | 对嗜肺军团菌O5型的wzt基因特异的核苷酸及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102604945B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103757092B (zh) * | 2013-10-24 | 2014-12-24 | 南开大学 | 一种对米克戴德军团菌wzx的特异的核苷酸及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102311950A (zh) * | 2010-07-08 | 2012-01-11 | 南开大学 | 对嗜肺军团菌1型的wzt特异的核苷酸及其应用 |
-
2012
- 2012-04-12 CN CN2012101052786A patent/CN102604945B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102311950A (zh) * | 2010-07-08 | 2012-01-11 | 南开大学 | 对嗜肺军团菌1型的wzt特异的核苷酸及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Christel Cazalet等.Multigenome analysis identifies a worldwide distributed epidemic Legionella pneumophila clone that emerged within a highly diverse species.《Genome Res》.2008,第18卷第431-441页. |
| Multigenome analysis identifies a worldwide distributed epidemic Legionella pneumophila clone that emerged within a highly diverse species;Christel Cazalet等;《Genome Res》;20081231;第18卷;第431-441页 * |
| 刘胜泉等.嗜肺军团菌pip基因原核质粒的构建及其表达.《宁夏医科大学学报》.2012,第34卷(第1期),第10-14页. |
| 嗜肺军团菌pip基因原核质粒的构建及其表达;刘胜泉等;《宁夏医科大学学报》;20120131;第34卷(第1期);第10-14页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102604945A (zh) | 2012-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2596059C (en) | Method of quantitatively analysing microorganism targeting rrna | |
| CN103898227B (zh) | 一种对克罗诺杆菌o抗原特异的核苷酸及其应用 | |
| CN102628042B (zh) | 对嗜肺军团菌O9型的wzm基因特异的核苷酸及其应用 | |
| CN101942505A (zh) | 致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒 | |
| CN104059975A (zh) | 对普罗威登斯菌o3，o4，o8，o12，o13和o20特异的核苷酸及其应用 | |
| CN101469326B (zh) | 一种对奇异变形杆菌的its特异的核苷酸及其应用 | |
| CN102719542A (zh) | 霍乱弧菌(vc)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
| CN102676664A (zh) | 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法 | |
| CN104342496B (zh) | 一种快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法 | |
| CN104342487B (zh) | 支原体核酸恒温扩增方法 | |
| CN104004842A (zh) | 一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重pcr引物组及检测方法 | |
| CN105567802A (zh) | 肺炎衣原体荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN102168131B (zh) | 扩增常见致病型军团菌gyrB基因特异区引物及其应用 | |
| CN102604945B (zh) | 对嗜肺军团菌O5型的wzt基因特异的核苷酸及其应用 | |
| CN102154488B (zh) | 大肠杆菌o157:h7双重pcr快速检测方法及试剂盒 | |
| CN104531860B (zh) | 一种志贺氏菌的分子检测方法及其应用 | |
| CN103305613A (zh) | 大鲵致病性嗜水气单胞菌pcr诊断试剂盒 | |
| KR101752274B1 (ko) | 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형 stx1 및 stx2를 동시에 판별하기 위한 고감도 실시간 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형의 판별 방법 | |
| CN102851361B (zh) | 沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌pcr-焦磷酸法的检测引物、试剂盒和检测方法 | |
| CN106929573B (zh) | 对嗜肺军团菌O12型的wzm和wecA基因特异的核苷酸序列及其应用 | |
| CN108384866A (zh) | 一种宋内志贺菌特异核苷酸pcr检测试剂盒 | |
| CN105256041A (zh) | 对亲水气单胞菌o44，o24，o25和o28特异的核苷酸及应用 | |
| CN102140514B (zh) | 检测嗜肺军团菌多种血清型致病菌特异性引物及试剂盒 | |
| CN103757092B (zh) | 一种对米克戴德军团菌wzx的特异的核苷酸及其应用 | |
| CN105256028B (zh) | 对柠檬酸杆菌017和o39特异的核苷酸及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130626 |