CN105385773A - 一种检测荧光假单胞菌的方法及其试剂盒和引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测荧光假单胞菌的方法及其试剂盒和引物。所述的方法包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA，以其为模板，以核苷酸序列分别如SEQ？ID？NO.1、SEQ？ID？NO.2、SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.4所示的引物进行双重PCR反应；检测双重PCR反应产物中分别在384bp和194bp位置处单一扩增产物的存在。所述引物包括核苷酸序列如前述。所述试剂盒包括前述引物。本发明的方法检测耗时短，成本低，检测结果可靠，结果判定简单，为微生物检测领域提供了一种简单快速灵敏的检测荧光假单胞菌的方法，尤其是为食品安全检测领域提供了一种更快捷方便的检测方法。

Description

一种检测荧光假单胞菌的方法及其试剂盒和引物
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种检测荧光假单胞菌的方法及其试剂盒和引物。
背景技术
荧光假单胞菌(PseudomonasFluorescens)在分类学上属于假单胞菌属(Pseudomonas)，菌体细胞为直的短杆状，大小为0.7～0.8×2.3～2.8微米，两端圆形，无菌毛，不产芽孢，革兰氏染色阴性，有数根极生鞭毛，利用鞭毛运动。荧光假单胞菌是好养或者兼性厌氧的细菌，进行严格的呼吸型代谢，以氧为最终电子受体，但能以硝酸盐为替代的电子受体进行厌氧呼吸。其化能营养为异养，不需要有机生长因子。在酸性环境下几乎所有的种都不能生长。荧光假单胞菌不产脓青酶，氧化酶阳性，接触酶阳性，甲基红试验阳性，精氨酸双水解酶阳性，V.P试验阴性。能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能从蔗糖合成果胶糖。荧光假单胞菌的生长温度范围为4～37℃，在4℃时繁殖最快，在42℃时就会停止生长，超过70℃，只需数秒即可被杀死。
荧光假单胞菌DNA中G+C的含量是60～61％，细胞内不积累聚-β-羟基丁酸盐，不能水解细胞外的聚-β-羟基丁酸盐，腐生。大多数菌株分泌可溶性的黄绿色色素，这些色素在紫外光下(波长260㎜以下)呈现荧光，这些色素特别在缺铁和特殊培养基中产生(如King等1954年发表的B培养基)。荧光假单胞菌的某些种也产生特征性的蓝、绿或橙色吩嗪色素(特别在King等的A培养基中)。不产生特征性的吩嗪色素的罕见菌株有时会以它们的营养或生理特性被鉴定为其他的种。
荧光假单胞菌属于嗜冷菌的一种，是食品中极为常见的一种嗜冷微生物，它是一种条件致病菌。随着冷冻(藏)食品在日常生活中占据比例越来越大，荧光假单胞菌对人类的危害几率也将大大增加。目前，国内对荧光假单胞菌的检测和鉴定依然以传统培养方法为标准，传统的检测方法费时费力，通常需要5～7天才能确定检测结果。不能满足快速高通量监测食品的要求。随着分子生物学技术的发展，分子生物学方法如聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)已被运用到检测食品中荧光假单胞菌。然而，由于目前运用PCR检测荧光假单胞菌的靶点较少，要么因保守性较高，种特异性不强，而出现假阳性结果，要么由于不同荧光假单胞菌菌株基因组序列差异比较大，容易产生假阴性结果，造成漏检。因此亟需一种快速，简便，准确的检测方法，能够对食品进行有效监测。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术对荧光假单胞菌的检测的操作繁琐，检测时间长，假阳性和假阴性高的缺陷，提供一种检测荧光假单胞菌菌株的方法即荧光假单胞菌的双重PCR检测方法及其试剂盒和引物。采用本发明的检测方法检测荧光假单胞菌菌株，检测时间短，成本低，检测结果特异，结果判定简单，具有大规模应用价值。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一是：一种检测荧光假单胞菌的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，以核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物进行双重PCR反应；和
(3)检测步骤(2)所得反应产物中分别在384bp和194bp位置处单一扩增产物的存在。
根据本发明，步骤(1)中，所述的提取待测样品的基因组DNA的方法为本领域常规，如使用市售的各种基因组DNA提取试剂盒进行操作，较佳的为CTAB法。所述的待测样品为常规的，较佳地为乳品或者液态低温保藏乳经过增菌培养得到的；所述的增菌培养为常规的，较佳地为将乳品或者液态低温保藏乳和选择性增菌液混合，进行培养；所述的选择性增菌液为常规的，较佳的选择性增菌液包括如下组分：蛋白胨10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaCL10g，蒸馏水定容至1L。
步骤(2)中，所述的PCR反应为本领域常规，只要能够扩增出荧光假单胞菌菌株特异性的基因片段即可。
较佳地，本发明中所述双重PCR反应的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/LMg2+，0.2-0.3mmol/LdNTP，0.1-0.3μM核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物，0.3-0.6μM核苷酸序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示的引物，0.01-0.1U/μLTaq酶，10-100ng/μLDNA模板。较佳地，本发明中所述双重PCR反应的反应程序为：①预变性：92-95℃，3-6min；②变性：92-95℃，20-40s；③退火：58-63℃，20-40s；④延伸：68-74℃，20-40s；步骤②至④共30-35个循环；⑤后延伸：70-74℃，8-12min；⑥降温：降至4-15℃，结束，保存。
更佳地，本发明中所述双重PCR反应的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTP，0.2μM核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物，0.4μM核苷酸序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示的引物，0.04U/μLTaq酶，40ng/μLDNA模板。更佳地，本发明中所述双重PCR反应的反应程序为：①预变性：94℃，5min；②变性：94℃，30s；③退火：60℃，40s；④延伸：72℃，30s；步骤②至④共35个循环；⑤后延伸：72℃，10min；⑥降温：降至12℃，结束，保存。
步骤(3)中，所述的检测可以采用本领域常规的方法，优选为凝胶电泳检测法，可以是琼脂糖凝胶电泳，也可以是聚丙烯酰胺凝胶电泳。根据本领域常规可知，在本发明中，若步骤(2)所得的反应产物分别在384bp和194bp的位置存在单一扩增产物，则说明待检样品中含有荧光假单胞菌菌株；如果所得的反应产物分别在384bp和194bp位置不存在单一扩增产物，则待测样品中不含有荧光假单胞菌菌株。
本发明提供的方法尤其适用于检测乳品中的荧光假单胞菌菌株，特别适用于液态低温保藏乳中的荧光假单胞菌菌株的检测。
本发明提供的技术方案之二是：一种用于双重PCR检测荧光假单胞菌的引物，所述引物由核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物组成。
本发明提供的技术方案之三是：一种检测荧光假单胞菌的试剂盒，其包括前述引物对。
本发明中，较佳地，所述的试剂盒还包括PCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和Mg2+中的一种或多种。更佳地，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂和/或阳性基因组DNA。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：采用本发明提供的检测方法检测荧光假单胞菌，检测时间缩短了，检测成本降低了，检测效率提高了；并且本发明提供的检测方法，对于检测荧光假单胞菌具有种特异性，检测结果可靠，结果判定简单，具有较大的实际应用价值，尤其为乳品检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的检测荧光假单胞菌细菌的方法，对判别乳品中是否含有荧光假单胞菌菌株具有极大应用空间。
附图说明
图1是实施例1中PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳实验结果。泳道1～11依次为：荧光假单胞菌IQCC12601，荧光假单胞菌AS1.867，荧光假单胞菌AS1.55，荧光假单胞菌AS1.823，荧光假单胞菌CICC20225，荧光假单胞菌CICC21896，荧光假单胞菌CICC21918，荧光假单胞菌CICC23248，荧光假单胞菌CICC23250，荧光假单胞菌CICC23251，荧光假单胞菌CICC23246，M为100bpDNAMarker。
图2是实施列1中PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1～32依次为：荧光假单胞菌BDPF001，荧光假单胞菌BDPF002，荧光假单胞菌BDPF003，荧光假单胞菌BDPF004，荧光假单胞菌BDPF005，荧光假单胞菌BDPF006，荧光假单胞菌BDPF007，荧光假单胞菌BDPF008，荧光假单胞菌BDPF009，荧光假单胞菌BDPF010，荧光假单胞菌BDPF011，荧光假单胞菌BDPF012，荧光假单胞菌BDPF013，荧光假单胞菌BDPF014，荧光假单胞菌BDPF015，荧光假单胞菌BDPF016，荧光假单胞菌BDPF017，荧光假单胞菌BDPF018，荧光假单胞菌BDPF019，荧光假单胞菌BDPF020，荧光假单胞菌BDPF021，荧光假单胞菌BDPF022，荧光假单胞菌BDPF023，荧光假单胞菌BDPF024，荧光假单胞菌BDPF025，荧光假单胞菌BDPF026，荧光假单胞菌BDPF027，荧光假单胞菌BDPF029，荧光假单胞菌BDPF030，荧光假单胞菌BDPF031，荧光假单胞菌BDPF032，M为100bpDNAMarker。
图3是实施列1中PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1～11依次为：恶臭假单胞菌ATCC17485，恶臭假单胞菌CICC21884，铜绿假单胞菌IQCC12625，产碱假单胞菌IQCC12604，洋葱假单胞菌CICC21624，类产碱假单胞菌IQCC12603，施氏假单胞菌IQCC112612，绿针假单胞菌CICC21627，稻草假单胞菌CICC21628，门多萨假单胞菌CICC21629，荧光假单胞菌IQCC12601，M为100bpDNAMarker。
图4是实施列1中PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1～30依次为：鼠伤寒沙门氏菌ATCC14023，肠炎沙门氏菌ATCC13311，阴沟肠杆菌ATCC13047，大肠杆菌ATCC43889，大肠杆菌ATCC25922，奇异变形杆菌ATCC12453，普通变形杆菌ATCC33420，枸橼酸杆菌ATCC8090，肺炎克雷伯杆菌ATCC27336，肺炎克雷伯杆菌ATCC46114，宋志氏志贺氏菌CMCC51334，痢疾志贺氏菌CMCC51335，福氏志贺氏菌ATCC51371，绿脓杆菌CDCB32116，蜡样芽胞杆菌ATCC1220，气味沙雷氏菌ATCC33077，粘质沙雷氏菌ATCC14040，金黄色葡萄球菌ATCC29213，金黄色葡萄球菌ATCC8095，屎肠球菌ATCC14025，粪肠球菌ATCC49452，产气肠杆菌ATCC13048，霍乱弧菌SJTU32001，副溶血弧菌ATCC17802，副溶血弧菌ATCC33846，创伤弧菌ATCC27562，阪崎克罗诺杆菌ATCC29544，单核增生李斯特菌AB97021，单核增生李斯特菌ATCC13313，荧光假单胞菌IQCC12601。
图5为实施列1中PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳验证引物灵敏度实验图谱。泳道1～11依次为：1.69×109fg/PCR，1.69×108fg/PCR，1.69×107fg/PCR，1.69×106fg/PCR，1.69×105fg/PCR，1.69×104fg/PCR，1.69×103fg/PCR，1.69×102fg/PCR，1.69×10fg/PCR，1.69fg/PCR，ddH2O，M为100bpDNAMarker。
图6为对比实施例1中利用双重PCR检测方法和现有技术引物16SPSEfluF/RPCR检测方法对奶样品检测结果琼脂糖凝胶电泳图。泳道1～10为样品1～10，泳道11为阴性对照无菌水，A图为利用双重PCR检测方法得到的电泳图，B图为利用现有技术引物16SPSEfluF/RPCR检测方法得到的电泳图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。所用Marker购自天根生化科技(北京)有限公司，产品型号为MarkerI(MD101)。
实施例1对荧光假单胞菌菌株的双重PCR检测
(一)引物合成
合成能够PCR扩增荧光假单胞菌促旋酶(gyrase)B亚基基因以及金属蛋白酶操纵子(apr)特异基因序列的引物，序列如下：
SEN1-L：5’-GCCAGCAGAGTCACCTTCCA-3’(SEQIDNO:1)，
SEN2-R：5’-AGCACAAAGTCGCCACCACC-3’(SEQIDNO:2)，
SEN3-L:5’-TAYGGBTTCAAYTCCAAYAC-3’(SEQIDNO:3)，
SEN4-R:5’-VGCGATSGAMACRTTRCC-3’(SEQIDNO:4)。
SEN3-L和SEN4-R为简并引物，Y、B、V、M、S和R均为简并碱基，其中Y代表C或T，B代表G、C或T，V代表A、G或C，M代表A或C，S代表G或C，R代表A或G。
(二)双重PCR检测方法的反应体系及反应参数
采用上述引物，以荧光假单胞菌菌株的基因组DNA为模板，进行PCR反应体系和反应程序的建立和优化，经过单因素、多因素试验和杂交试验，从而建立了适用于检测阪崎克罗诺杆菌菌株的反应体系及反应参数。
以下反应体系和反应程序都能得到在384bp和194bp位置的单一的扩增产物。所述PCR反应体系为：1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/LMg2+，0.2-0.3mmol/LdNTP，0.1-0.3μM引物SEN1-L，0.1-0.3μM引物SEN2-R，0.3-0.6μM引物SEN3-L，0.3-0.6μM引物SEN4-R，0.01-0.1U/μLTaq酶，10-100ng/μLDNA模板。所述PCR扩增程序为：92-95℃预变性3-6min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：92-95℃变性20-40s，58-63℃退火20-40s，68-74℃延伸20-40s；循环共30-35个；循环结束后，70-74℃延伸8-12min，降温至4-15℃，结束。
最优的PCR反应体系为：1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTP，0.2μM引物SEN1-L，0.2μM引物SEN2-R，0.4μM引物SEN3-L，0.4μM引物SEN4-R，0.04U/μLTaq酶，40ng/μLDNA模板。最优的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸30s；循环共35个；循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。在最优的反应体系和反应程序下，其在384bp和194bp左右的扩增产物的产量最高，电泳条带最明显、最清晰。
因此，本发明建立了最优的双重PCR检测方法如下：先加入11.3μL无菌水到反应管中，再依次加入10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg2+2.0μL，2.5mmol/L的dNTP1.0μL，10μM引物SEN1-L1.0μL，10μM引物SEN2-R1.0μL，10μM引物SEN3-L2.0μL，10μM引物SEN4-R2.0μL，5.0U/μLTaq酶0.2μL，最后加模板溶液2μL，并以无菌水为模板作为反应的阴性对照。然后将反应管离心后，放入PCR反应仪中，按照以下PCR程序进行：在94℃预变性5min，接着作35个循环，每个循环的程序包括94℃变性30s，退火温度60℃，退火时间为40s，然后在72℃延伸30s，循环结束后在72℃延伸10min，最后降温至12℃，结束所有操作程序。
(三)特异性评价试验
取荧光假单胞菌菌株43株和39株作为阴性对照的非荧光假单胞菌菌株如表1所示，表1中序号为12编号为BDPF001-BDPF032的菌株为分离菌株，是发明人从原料乳中分离而得，经过生理生化方法、16SrRNA测序等方法鉴定为荧光假单胞菌；序号为33和41的菌株经过生理生化方法、16SrRNA测序等方法鉴定分别为绿脓杆菌、霍乱弧菌；表中其他菌株均可以通过公开渠道购买得到。按照基因组DNA模板提取方法，分别提取基因组DNA。提取过程如下：将所取菌株(如表1所示)分别接种至5mL的LB液体培养基中，在37℃培养过夜后，利用CTAB法提取基因组DNA。
CTAB法提取荧光假单胞菌基因组步骤如下：
(1)取过夜增菌培养的菌液1ml加入1.5mL的离心管中。
(2)10000rpm/min离心5min，弃上清后再用无菌去离子水重悬清洗菌体，10,000r/min离心5min，弃上清。
(3)加入456μLTE缓冲液和24μL溶菌酶(20mg/mL)，37℃水浴1-2h；
(4)加入53μL10％SDS，68℃干浴15min；
(5)加入87μL5MNaCl，69μL1％CTAB【购自生工生物工程(上海)股份有限公司】，68℃干浴15min。
(6)加入苯酚300μL，氯仿-异戊醇(24:1，v/v)300μL，静置，12，800r/min离心10min。
(7)取上清200～400μL，加入等体积氯仿-异戊醇(24:1，v/v)，12，800r/min离心5min，取上清200～400μL，加入2倍体积冰无水乙醇，-20℃放置2h。
(8)12,000r/min离心2min，弃上清，加入70％乙醇清洗，12,000r/min离心2min，弃上清后室温下风干。加入无菌去离子水或TE50～100μL溶解DNA，-20℃保存待用。
每株菌株的DNA溶液均稀释到浓度为20ng/μL，均取2μL作为PCR反应模板添加到PCR反应体系中进行扩增反应，反应采用前述最优的反应体系和最优的扩增程序。采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断所得PCR产物分别在384bp和194bp位置是否存在单一扩增条带，结果见表1，电泳结果见图1-图4。
从表1中可知，除了荧光假单胞菌菌株外，其余阴性对照菌株均没有特异扩增条带。表1中，-：PCR结果为阴性；+：PCR结果为阳性。表1中荧光假单胞菌使用了11株由中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定的荧光假单胞菌菌株(即表1中序号为1-11的荧光假单胞菌)，代表了该属内常见的典型的荧光假单胞菌菌株。荧光假单胞菌和假单胞菌属内其它菌株的亲缘关系最近，本次试验共使用了1株假单胞菌属标准菌株，10株分离菌株，以及29株非假单胞菌属菌株作为阴性对照菌种。所使用的这些菌株和荧光假单胞菌菌株具有较近的亲缘关系。如果这些菌株经本发明的引物通过双重PCR反应实验后扩增不到特异的片段，那么其它的和荧光假单胞菌菌株亲缘关系更远的菌株更加难以扩增到目的片段(384bp和194bp)，因此经过这些亲缘关系较近的菌株的验证，充分保证了本发明引物的特异性。上述结果充分证明本发明的方法仅能通过PCR反应扩增出荧光假单胞菌种内的任何菌株的对应序列，而其它的任何菌株即使假单胞菌属中与荧光假单胞菌亲缘关系极近的菌株均不会得到与荧光假单胞菌相同的扩增产物片段。
表1.特异性评价所用菌株及试验结果
(四)灵敏度评价试验
提取荧光假单胞菌基因组的总DNA，经测定，荧光假单胞菌模式菌株AS1.55基因组总DNA溶液的浓度为1690ng/μL，用无菌水作10倍梯度稀释，共稀释9个梯度，每个浓度梯度分别取1μL加入PCR反应体系，凝胶电泳检测扩增产物，在凝胶成像仪中观察凝胶电泳结果，如图5所示，图中：泳道1～10：DNA模板浓度分别为1.69×109fg/PCR，1.69×108fg/PCR，1.69×107fg/PCR，1.69×106fg/PCR，1.69×105fg/PCR，1.69×104fg/PCR，1.69×103fg/PCR，1.69×102fg/PCR，1.69×10fg/PCR，1.69fg/PCR；泳道11：ddH2O；泳道M：100bp分子量标准(DNAmarker)。由图2可知，在第8条泳道可以看到清晰的条带，所对应DNA浓度为169fg/PCR，而第7条泳道之后看不到扩增条带。因此，判定PCR检测灵敏度为169fg/PCR，具有较高的灵敏度。
实施例2人工污染荧光假单胞菌模式菌株AS1.867检测试验
将活化的荧光假单胞菌(AS1.867)菌液接入LB培养基中摇床培养至稳定期，平板计数得初始菌浓度为1.8×109cfu/mL。将25mLUHT奶样品即经过超高温瞬时灭菌(135℃，3-5s)的牛奶加入225mL选择性增菌液中(选择性增菌液包括以下组分：蛋白胨10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaCL10g，蒸馏水定容至1L)，分别接入浓度为180cfu/mL、18cfu/mL、1.8cfu/mL的荧光假单胞菌1mL，每个浓度做3个平行实验。于0h、4h、6h、8h、10h、12h、24h各取样1次，用煮沸法提取基因组DNA，每个时间点的样品均取2μL作为PCR反应模板添加到PCR反应体系中进行双重扩增反应。扩增反应采用前述最优的反应体系和最优的扩增程序，以灭菌蒸馏水为空白对照。实验检测结果如表2所示。
上述煮沸法步骤如下：取1mL菌液，放入1.5mL离心管中，之后，5,000r/min离心10min，取上清液，再12,000r/min离心5min，收集菌体；用无菌双蒸水重新悬浮菌体，离心洗涤后加入100μL无菌超纯水，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20℃放置30min；在37℃解冻后，12,000r/min离心5min，取上清液即样品的基因组DNA放置-20℃备用。
表2人工污染样品双重PCR检测结果
在上述250mL增菌培养液(25mLUHT奶样品+225mL选择性增菌液)中，荧光假单胞菌人工接种量分别为180cfu/mL、18cfu/mL和1.8cfu/mL的实验组，在500mL无菌包装袋中30℃增菌24h后均可检测到荧光假单胞菌。
对比实施例1
从10个不同的牧场各取一份奶样品，编号1～10，每个样品均25mL。将1～10号样品分别加入225mL选择性增菌液(简称增菌液)中，在30℃下增菌培养24h，然后每个样品各取1mL增菌液按照CTAB法抽提基因DNA。将DNA浓度稀释到10-100ng/μL作为模板，利用实施例1建立的最优的双重PCR检测方法进行检测，同时利用文献(ScarpelliniM,FranzettiL,GalliA.DevelopmentofPCRassaytoidentifyPseudomonasfluorescensanditsbiotype[J].FEMSMicrobiolLetters,2004,236(2):257-260)报道的引物16SPSEfluF/R对上述10份样品进行PCR检测。引物16SPSEfluF/R序列为：正向引物16SPSEfluF核苷酸序列为5’-TGCATTCAAAACTGACTG-3’(SEQIDNO:5)；反向引物16SPSER核苷酸序列为5’-AATCACACCGTGGTAACCG-3’(SEQIDNO:6)。
检测结果如图6所示，利用本发明的双重PCR方法检测到荧光假单胞菌的样品数为8，而经过引物16SPSEfluF/R检测到含有荧光假单胞菌的数量为9。而10份样品经生理生化方法进行检测，检测到8份样品中含有荧光假单胞菌，与本发明建立的双重PCR方法相符率为100％。而用引物16SPSEfluF/R则有一份样品为假阳性，与生理生化方法相符率为90％。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种非疾病诊断或治疗目的的检测荧光假单胞菌(PseudomonasFluorescens)的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，以核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物进行双重PCR反应；和
(3)检测步骤(2)所得反应产物中分别在384bp和194bp位置处单一扩增产物的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双重PCR反应的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/LMg2+，0.2-0.3mmol/LdNTP，0.1-0.3μM核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物，0.3-0.6μM核苷酸序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示的引物，0.01-0.1U/μLTaq酶，10-100ng/μLDNA模板；和/或，所述双重PCR反应的反应程序为：①预变性：92-95℃，3-6min；②变性：92-95℃，20-40s；③退火：58-63℃，20-40s；④延伸：68-74℃，20-40s；步骤②至④共30-35个循环；⑤后延伸：70-74℃，8-12min；⑥降温：降至4-15℃，结束，保存。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双重PCR反应的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTP，0.2μM核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物，0.4μM核苷酸序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示的引物，0.04U/μLTaq酶，40ng/μLDNA模板；和/或，所述双重PCR反应的反应程序为：①预变性：94℃，5min；②变性：94℃，30s；③退火：60℃，40s；④延伸：72℃，30s；步骤②至④共35个循环；⑤后延伸：72℃，10min；⑥降温：降至12℃，结束，保存。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取的方法为CTAB法。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的待测样品为乳品或者液态低温保藏乳经过增菌培养得到的；所述的增菌培养较佳地将乳品或者液态低温保藏乳和选择性增菌液混合，进行培养；所述的选择性增菌液较佳地包括如下组分：蛋白胨10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaCL10g，蒸馏水定容至1L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的检测为凝胶电泳检测法，较佳地为琼脂糖凝胶电泳检测法。
7.一种用于双重PCR检测荧光假单胞菌的引物，其特征在于，其由核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物组成。
8.一种检测荧光假单胞菌的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求7所述的引物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括PCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和Mg2+中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂和/或阳性基因组DNA。
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