CN106868149A - 用于扩增荧光假单胞菌基因的双重pcr引物、荧光假单胞菌的检测方法及试剂盒 - Google Patents

用于扩增荧光假单胞菌基因的双重pcr引物、荧光假单胞菌的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物，双重PCR引物包括用于扩增荧光假单胞菌adnA基因的第一引物对，及用于扩增荧光假单胞菌fliC基因的第二引物对；采用第一引物对和第二引物对进行双重PCR，一次PCR反应可以同时得到两段基因片段的扩增产物，进而实现双靶点检测，相比于单一靶点检测方法而言提高了检测结果的可靠性，降低了漏检率，同时也没有增加检测时间，与逐一检测靶点的方法相比还降低了检测费用，提高了检测效率。采用该方法操作简单，能够快速有效地检测具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。

Description

用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物、荧光假单胞菌的 检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一组扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物。此外，本发明还涉及一种检测荧光假单胞菌的试剂盒，以及一种检测荧光假单胞菌的方法。
背景技术
荧光假单胞菌是原料乳中常见的主要危害嗜冷菌。在原料乳的加工生产过程中，荧光假单胞菌可能会在生产设备管道中或设备表面形成生物膜。生物膜一旦形成，将难以清除，并可能长期危害乳品的质量和安全。
当前检测微生物生物膜形成的方法，如结晶紫染色法、显微镜观测法等，只能识别微生物是否具有生物膜的形成能力，但不能鉴别微生物的种类。而能够鉴别微生物的基因检测方法，只能对荧光假单胞菌进行种类识别，不能鉴别荧光假单胞菌的生物膜形成能力。
对于乳品生产来说，具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌最具危害性，其对乳品生产的质量和安全有重要意义。此前，发明人开发了一种检测荧光假单胞菌的检测方法，通过设计一对引物进行单重PCR来检测，由于检测靶点单一，可能存在漏检的情况。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一组扩增荧光假单胞菌基因的PCR引物，采用该组引物进行双重PCR，可以特异性地扩增出单个靶点对应的基因扩增片段，一次性进行双靶点检测，降低了漏检率，提高了检测结果的可靠性。
具体的，第一方面，提供一组用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物，所述PCR引物包括用于扩增荧光假单胞菌adnA基因的第一引物对，及用于扩增荧光假单胞菌fliC基因的第二引物对；
第一引物对：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，
adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；
第二引物对：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，
fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。
第二方面，提供了一种检测荧光假单胞菌的试剂盒，包括第一方面所述的第一引物对和第二引物对、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和Taq酶。
第三方面，提供了一种检测荧光假单胞菌的方法，包括以下步骤：
(a)提取待测菌株的基因组DNA，获得模板DNA；
(b)进行双重PCR反应，双重PCR反应体系包括：权利要求1所述的第一引物对和和第二引物对、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、模板DNA以及ddH2O；
(c)将步骤(b)反应得到的产物进行电泳。
结合第三方面，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(b)中，反应体系中第一引物对的正向引物adnA-for、第一引物对的反向引物adnA-rev、第二引物对的正向引物fliC-for和第二引物对的反向引物fliC-rev的最终浓度均为1μM。
结合第三方面或上述某些可能的实施方式，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(b)中，反应体系中Taq酶的最终浓度为0.2-0.5U/μl。
结合第三方面或上述某些可能的实施方式，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(b)中，PCR缓冲液包括KCl、Tris-HCl和MgCl2，三者在反应体系中的最终浓度分别为50mM、10mM和1.5mM。
结合第三方面或上述某些可能的实施方式，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(b)中，反应体系中脱氧核糖核苷三磷酸最终浓度为0.25mM。
结合第三方面或上述某些可能的实施方式，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(b)中，双重PCR扩增的反应条件包括：94℃，预变性5min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min50s，循环40次；72℃延伸10min；4℃，保存。
在上述反应体系及反应条件下，检测荧光假单胞菌的方法中双重PCR的扩增效率更高，从而使检测效果更好。
结合第三方面或上述某些可能的实施方式，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(c)中产物电泳检测到长度为1.47kb的条带和/或长度为0.75kb的条带。
上述技术方案中，通过设计了一组(两对)用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物，可以特异性地扩增出荧光假单胞菌中的adnA基因片段和/或fliC基因片段，而对于其他种类的假单胞菌，则无法扩增出adnA基因片段和fliC基因片段，对于无生物膜形成能力的荧光假单胞菌，也无法扩增出adnA基因片段和fliC基因片段。因此，将第一引物对和第二引物对共同用于进行双重PCR来扩增待测菌株的adnA基因片段和/或fliC基因片段，通过检测adnA基因片段或fliC基因片段是否存在，就可以判断是否存在具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。
采用第一引物对和第二引物对进行双重PCR，一次实验操作可以同时得到两段基因片段的扩增产物，进而实现双靶点检测，相比于单一靶点检测方法而言提高了检测结果的可靠性，降低了漏检率，同时也没有增加检测时间，与逐一检测靶点的方法相比还降低了检测费用，提高了检测效率。采用该方法操作简单，能够快速有效地检测具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。
附图说明
图1为本发明所提供的第一个实施例的电泳结果。
图2为本发明所提供的第二个实施例的电泳结果。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步阐述。
adnA基因是负责荧光假单胞菌生物膜形成的调控基因，此前，发明人开发了一种检测荧光假单胞菌的检测方法，通过设计一对扩增adnA基因的引物，进行单重PCR来检测，由于检测靶点单一，可能存在漏检的情况。为此，发明人经过创造性劳动，提供一种改进方案，通过设计另一对扩增fliC基因的引物，fliC基因是负责荧光假单胞菌鞭毛生物合成的基因，adnA基因和fliC基因都是负责荧光假单胞菌生物膜形成的关键基因，将两对引物一起进行双重PCR来检测具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌，从而大大减少了漏检的情况。
具体地，设计的双重PCR引物包括用于扩增荧光假单胞菌adnA基因的第一引物对，及用于扩增荧光假单胞菌fliC基因的第二引物对；
第一引物对：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，
adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；
第二引物对：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，
fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。
双重PCR和单重PCR相比，由于引物的增多，会导致引物二聚体以及非特异性扩增的概率增多，因此，引物的设计十分重要。通过上述的两对引物对，从而实现同时特异性扩增adnA基因和fliC基因，提高了荧光假单胞菌的检测结果的可靠性，降低了漏检率，同时也没有增加检测时间，与逐一检测靶点的方法相比还降低了检测费用，提高了检测效率。
进一步地，通过优化双重PCR的条件，使得检测方法中两对引物对与反应体系中各组分的浓度、反应条件等相互配合，进一步减少引物二聚体和非特异性扩增。例如，通过优化退火温度，确保同一个退火温度下更好地实现两个PCR反应，从而进一步的增强引物PCR的特异性，减少非特异性扩增，得到特异性更强的条带。
以下实施例中涉及的菌种有荧光假单胞菌1035，M73，M55，M45，1044、1034、N25和D64，恶臭假单胞菌菌株796，莓实假单胞菌菌株M66、海雀假单胞菌菌株M62，非荧光假单胞菌菌株A102、D103和784，上述菌种在本发明中均为待测菌株，只是为了验证说明本发明技术方案的技术效果，不涉及本发明技术方案的本身，不会影响本发明技术方案的实施。
以下实施例中使用的10X buffer为PCR缓冲液中的一种，10X buffer包括200mMKCl、40mM Tris-HCl和6mM MgCl2。dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸，ddH2O为双蒸水，均为本领域专业术语。
下列实施例中未作特别说明的试剂和实验设备，均可以通过商业途径直接购得。
实施例一
(1)已知的，荧光假单胞菌1035，M73，M55，M45，1044和1034均是具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌菌株，荧光假单胞菌N25是不具备生物膜形成能力的荧光假单胞菌菌株，将上述7个菌株从-20℃冰箱中取出置于冰盒上，以2％体积比的接种量接种到含1ml LB培养基的EP管中，30℃培养箱培养24h。
(2)取1ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)，室温下放置5-10分钟。加入新配制的溶液Ⅱ(0.2M NaOH，1％SDS)200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(不振荡)，冰浴5分钟。加入150μl预冷的溶液Ⅲ(5M醋酸钾缓冲液，pH 4.8)，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿(1:1)，振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。将沉淀(待检测DNA)溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg/ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
(3)进行双重PCR扩增，扩增所用的是第一引物对和第二引物对，
第一引物对：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，
adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；
第二引物对：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，
fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。
双重PCR反应体系组成是：
PCR反应条件是：94℃，预变性5min；94℃，15s，60℃，30s，72℃，1min50s，循环40次；72℃，10min；4℃，保存。
(4)将扩增获得的产物进行电泳，电泳结果如附图1所示。
1.47kb和0.75kb处的条带分别为adnA和fliC基因片段，这两个条带含有其中之一或都含有则代表此泳道的菌株为具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。
附图1中，泳道M:2kbMarker，泳道1:N25，泳道2:1035，泳道3:M73，泳道4:M55，泳道5:M45，泳道6:1044，泳道7:1034。从电泳结果可见，N25在1.47kb和0.75kb处均无条带，说明其不形成生物膜。而菌株1035，M73和1034在0.75kb处有条带，说明这三种菌株具有生物膜形成能力。菌株M55在1.47kb和0.75kb处都有条带，说明其具有生物膜形成能力。菌株M45和1044在1.47kb处有条带，说明二者具有生物膜形成能力。
采用实施例的双重PCR的方法所检测的结果与已知的待测菌株的实际情况相符，说明采用上述技术方案所提供的双重PCR引物进行扩增，对于不具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌，无法扩增得到adnA基因和/或fliC片段，只有具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌才能扩增相应靶点的基因片段，从而实现有针对性地、准确快速地检测出具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。
实施例二
(1)已知的，假单胞菌菌株D64为具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌，而恶臭假单胞菌菌株796，莓实假单胞菌菌株M66、海雀假单胞菌菌株M62，非荧光假单胞菌菌株A102、D103和784都不具备生物膜形成能力。将上述7个菌株从-20℃冰箱中取出置于冰盒上，以2％体积比的接种量接种到含1ml LB培养基的EP管中，30℃培养箱培养24h。
(2)取1ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)，室温下放置5-10分钟。加入新配制的溶液Ⅱ(0.2M NaOH，1％SDS)200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(不振荡)，冰浴5分钟。加入150μl预冷的溶液Ⅲ(5M醋酸钾缓冲液，pH 4.8)，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿(1:1)，振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。将沉淀(待检测DNA)溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg/ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
(3)进行双重PCR扩增，扩增所用的是第一引物对和第二引物对，
第一引物对：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，
adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；
第二引物对：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，
fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。
双重PCR反应体系组成是：
PCR反应条件是：94℃，预变性5min；94℃，15s，60℃，30s，72℃，1min50s，循环40次；72℃，10min；4℃，保存。
将扩增获得的产物进行电泳，电泳结果如附图2所示。
附图2中，泳道M:2kbMarker,泳道1:D64，泳道2:796，泳道3:M62，泳道4:M66，泳道5:A102，泳道6:D103，泳道7:784。从电泳结果可见，菌株D64在1.47kb和0.75kb处均有条带，说明其是具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。796、M62、M66、A102、D103和784这6个菌株对应的泳道在1.47kb和0.75kb处均无条带，说明这6种菌株都不形成生物膜。采用实施例的双重PCR的方法所检测的结果与已知的待测菌株的实际情况相符，说明采用上述技术方案所提供的双重PCR引物进行扩增，对于不具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌，以及其他菌株，均无法扩增得到adnA基因和/或fliC片段，只有具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌才能扩增相应靶点的基因片段，从而实现有针对性地、准确快速地检测出具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。
以上对本发明所提供的一组用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物、荧光假单胞菌的检测方法及试剂盒进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 光明乳业股份有限公司
<120> 用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物、荧光假单胞菌的检测方法及试
剂盒
<130> EKP170060-DD-1-SQ
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtggcgtg aaaccaaaat 20
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<212> DNA
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<400> 2
tcaatcatcc gcctgttca 19
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<212> DNA
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<400> 3
gatgcagcgc ctgtcttc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcagtacagc ggaaggca 18

Claims (9)

1.一组用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物，其特征在于，双重PCR引物包括用于扩增荧光假单胞菌adnA基因的第一引物对，及用于扩增荧光假单胞菌fliC基因的第二引物对；
第一引物对：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，
adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；
第二引物对：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，
fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。
2.一种检测荧光假单胞菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的第一引物对和第二引物对、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和Taq酶。
3.一种检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)提取待测菌株的基因组DNA，获得模板DNA；
(b)进行双重PCR反应，双重PCR反应体系包括：权利要求1所述的第一引物对和和第二引物对、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、模板DNA以及ddH2O；
(c)将步骤(b)反应得到的产物进行电泳。
4.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，反应体系中第一引物对的正向引物adnA-for、第一引物对的反向引物adnA-rev、第二引物对的正向引物fliC-for和第二引物对的反向引物fliC-rev的最终浓度均为1μM。
5.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，反应体系中Taq酶的最终浓度为0.2-0.5U/μl。
6.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，PCR缓冲液包括KCl、Tris-HCl和MgCl2，三者在反应体系中的最终浓度分别为50mM、10mM和1.5mM。
7.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，反应体系中脱氧核糖核苷三磷酸最终浓度为0.25mM。
8.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，双重PCR扩增的反应条件包括：94℃，预变性5min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min50s，循环40次；72℃延伸10min；4℃，保存。
9.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(c)中产物电泳检测到长度为1.47kb的条带和/或长度为0.75kb的条带。
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CN116987805A (zh) * 2023-08-16 2023-11-03 福建省农业科学院生物技术研究所 一种用于检测变形假单胞菌的pcr引物及试剂盒

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CN105385773A (zh) * 2015-12-24 2016-03-09 光明乳业股份有限公司 一种检测荧光假单胞菌的方法及其试剂盒和引物

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