CN106498046A - 用于扩增荧光假单胞菌基因的pcr引物、荧光假单胞菌的检测方法及试剂盒 - Google Patents

用于扩增荧光假单胞菌基因的pcr引物、荧光假单胞菌的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组用于扩增荧光假单胞菌基因的PCR引物，正向引物为：5’‑ATGTGGCGTGAAACCAAAAT‑3’，反向引物为：5’‑TCAATCATCCGCCTGTTCA‑3’，所述PCR引物用于扩增荧光假单胞菌的生物膜形成调控基因。采用上述技术方案中的PCR引物用于待测菌株基因的PCR扩增，通过检测adnA基因的是否存在，从而有针对性的、准确快速地检测出具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。

Description

用于扩增荧光假单胞菌基因的PCR引物、荧光假单胞菌的检测 方法及试剂盒
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一组扩增荧光假单胞菌基因的PCR引物。此外，本发明还涉及一种检测荧光假单胞菌的试剂盒，以及一种检测荧光假单胞菌的方法。
背景技术
荧光假单胞菌是原料乳中常见的主要危害嗜冷菌。在原料乳的加工生产过程中，荧光假单胞菌可能会在生产设备管道中或设备表面形成生物膜。生物膜一旦形成，将难以清除，并可能长期危害乳品的质量和安全。
当前检测微生物生物膜形成的方法，如结晶紫染色法、显微镜观测法等，只能识别微生物是否具有生物膜的形成能力，但不能鉴别微生物的种类。而能够鉴别微生物的基因检测方法，只能对荧光假单胞菌进行种类识别，不能鉴别荧光假单胞菌的生物膜形成能力。
对于乳品生产来说，具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌最具危害性，其对乳品生产的质量和安全有重要意义。而目前尚未有检测具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌的方法，这是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
未解决上述技术问题，本发明提供了一组扩增荧光假单胞菌基因的PCR引物，采用该引物进行PCR，可以特异性检测出具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。
具体的，一方面，提供了一组用于扩增荧光假单胞菌基因的PCR引物，正向引物为：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，反向引物为：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’，上述PCR引物用于扩增荧光假单胞菌的生物膜形成调控基因。
第二方面，提供了一种检测荧光假单胞菌的试剂盒，包括正向引物5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’、反向引物5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和Taq酶。
第三方面，还提供了一种检测荧光假单胞菌的方法，包括以下步骤：
(a)培养待测菌株；
(b)提取待测菌株的DNA，获得模板DNA：
(c)进行PCR扩增，PCR反应体系包括：权利要求1上述的正向引物和反向引物、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、模板DNA以及ddH2O；
(d)将步骤(c)扩增得到的产物进行电泳。
进一步地，上述步骤(c)中，反应体系中正向引物和反向引物的最终浓度均为1μM。
进一步地，上述步骤(c)中，反应体系中Taq酶的最终浓度为0.2-0.5U/μl。
进一步地，上述步骤(c)中，PCR缓冲液包括KCl、Tris-HCl和MgCl2，三者在反应体系中的最终浓度分别为50mM、10mM和1.5mM。
进一步地，上述步骤(c)中，反应体系中脱氧核糖核苷三磷酸最终浓度为0.25μM。
进一步地，上述步骤(c)中，PCR扩增的反应条件包括：94℃，预变性5min；94℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸1min50s，循环40次；72℃延伸10min。
进一步地，上述步骤(a)中，培养待测菌株采用LB培养基。
进一步地，上述待检测DNA的长度为1.5kb。
adnA基因是负责荧光假单胞菌生物膜形成的调控基因，本发明通过设计了一对用于扩增荧光假单胞菌基因的PCR引物，可以特异性地扩增出荧光假单胞菌中的adnA基因片段，而对于其他种类的假单胞菌，则无法扩增出adnA基因片段，对于无生物膜形成能力的荧光假单胞菌，也无法扩增出adnA基因片段。因此，将上述技术方案中的PCR引物用于待测菌株基因的PCR扩增，通过检测adnA基因的是否存在，从而判断是否存在具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。
此外，通过采用上述PCR引物进行扩增和检测，操作方法简单，可以快速有效地检测具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。
附图说明
图1为本发明所提供的第一个实施例的电泳结果。
图2为本发明所提供的第二个实施例的电泳结果。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步阐述。以下实施例中涉及的菌种有荧光假单胞菌N92，N93，N97，D104，D15，D16，D41和N44，假单胞菌N53，J935，M44和A106，莓实假单胞菌N31和D84，海雀假单胞菌M61和M62，上述的菌种在本发明中均为待测菌株，只是为了验证说明本发明技术方案的技术效果，不涉及本发明技术方案的本身，不会影响本发明技术方案的实施。
下述实施例中使用的10X buffer为PCR缓冲液中的一种，10Xbuffer包括200mMKCl、40mM Tris-HCl和6mM MgCl2。dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸，ddH2O为双蒸水，均为本领域专业术语。
下列实施例中未作特别说明的试剂和实验设备，均可以通过商业途径直接购得。
实施例一
(1)已知的，荧光假单胞菌N92，N93，N97，D104，D15，D16，D41和N44均是具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌菌株，将上述8个菌株从-20℃冰箱中取出置于冰盒上，以2％体积比的接种量接种到含1ml LB培养基的EP管中，30℃培养箱培养24h。
(2)取1ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)),室温下放置5-10分钟。加入新配制的溶液Ⅱ(0.2M NaOH，1％SDS)200μl,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(不振荡),冰浴5分钟。加入150μl预冷的溶液Ⅲ(5M醋酸钾缓冲液，pH 4.8)，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。将沉淀(待检测DNA)溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg/ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
(3)进行PCR扩增，扩增所用的正向引物是adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，所用的反向引物是adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’。PCR反应体系组成是：
PCR反应条件是：94℃，变性5min；94℃，15s，57℃，30s，72℃，1min50s，循环40次；72℃，10min；4℃，保存。
(4)将扩增获得的产物进行电泳，电泳结果如附图1所示。
1.5Kb处的条带即为adnA基因片段，代表此泳道的菌株为具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。附图1中，泳道1:2kb Marker,泳道2:N92，泳道3:N93，泳道4:N97，泳道5:D104，泳道6:D15，泳道7:D16，泳道8:D41,泳道9:N44。8个泳道在1.5kb处均有条带，说明，对于具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌，采用上述的PCR引物进行扩增，均能有效地检测出来。
实施例二
(1)已知的，假单胞菌菌株N53，J935，M44为具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌，A106为不具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌，莓实假单胞菌N31和D84、海雀假单胞菌M61和M62均不是荧光假单胞菌。将上述8个菌株分别从-20℃冰箱中取出置于冰盒上，以2％体积比的接种量接种到含1mL LB培养基的EP管中，30℃培养箱培养24h。
(2)取1ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)),室温下放置5-10分钟。加入新配制的溶液Ⅱ(0.2M NaOH，1％SDS)200μl,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(不振荡),冰浴5分钟。加入150μl预冷的溶液Ⅲ(5M醋酸钾缓冲液，pH 4.8),盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
(3)进行PCR扩增，扩增所用的正向引物是adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，所用的反向引物是adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’。PCR反应体系组成是：
PCR反应条件是：94℃，变性5min；94℃，15s，57℃,30s，72℃，1min50s，循环40次；72℃，10min；4℃，保存。
(4)将扩增获得的产物进行电泳，电泳结果如附图2所示。
1.5Kb处的条带即为adnA基因片段，代表此泳道的菌株为具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。附图2中，泳道1:2kbMarker,泳道2:N53，泳道3:J935，泳道4:M44，泳道5:A106，泳道6:N31，泳道7:D84，泳道8:DM6141,泳道9:M62。从电泳结果可见，菌株N53、J935、M44是具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌，在1.5kb处有条带，A106、N31、D84、M61和M62在1.5Kb处均无条带，这个结果与待测菌株的实际情况相符，说明采用上述技术方案所提供的PCR引物进行扩增，对于不具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌，以及其他菌株，均无法扩增得到adnA基因片段，只有具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌才能扩增得到adnA基因片段，从而实现有针对性地、准确快速地检测出具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。
以上对本发明所提供的一组用于扩增荧光假单胞菌基因的PCR引物、荧光假单胞菌的检测方法及试剂盒进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一组用于扩增荧光假单胞菌基因的PCR引物，其特征在于，正向引物为：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，反向引物为：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’，所述PCR引物用于扩增荧光假单胞菌的生物膜形成调控基因。
2.一种检测荧光假单胞菌的试剂盒，其特征在于，包括正向引物5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’、反向引物5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和Taq酶。
3.一种检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)培养待测菌株；
(b)提取待测菌株的DNA，获得模板DNA：
(c)进行PCR扩增，PCR反应体系包括：权利要求1所述的正向引物和反向引物、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、模板DNA以及ddH2O；
(d)将步骤(c)扩增得到的产物进行电泳。
4.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，反应体系中正向引物和反向引物的最终浓度均为1μM。
5.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，反应体系中Taq酶的最终浓度为0.2-0.5U/μl。
6.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，PCR缓冲液包括KCl、Tris-HCl和MgCl2，三者在反应体系中的最终浓度分别为50mM、10mM和1.5mM。
7.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，反应体系中脱氧核糖核苷三磷酸最终浓度为0.25μM。
8.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，PCR扩增的反应条件包括：94℃，预变性5min；94℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸1min50s，循环40次；72℃延伸10min。
9.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，培养待测菌株采用LB培养基。
10.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述待检测DNA的长度为1.5kb。
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