CN108486269A - 一种鉴定毛栓孔菌s0301中同核体菌株的方法 - Google Patents
一种鉴定毛栓孔菌s0301中同核体菌株的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108486269A CN108486269A CN201810175037.6A CN201810175037A CN108486269A CN 108486269 A CN108486269 A CN 108486269A CN 201810175037 A CN201810175037 A CN 201810175037A CN 108486269 A CN108486269 A CN 108486269A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mating type
- bacterial strain
- homokaryon
- type gene
- bacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 47
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims abstract description 42
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 35
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000007689 inspection Methods 0.000 abstract 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 10
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 241001191009 Gymnomyza Species 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 241000751139 Beauveria bassiana Species 0.000 description 2
- 241001290175 Coriolopsis trogii Species 0.000 description 2
- 108700005088 Fungal Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000221775 Hypocreales Species 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000233622 Phytophthora infestans Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000222354 Trametes Species 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 235000006161 Mucuna pruriens Nutrition 0.000 description 1
- 244000111261 Mucuna pruriens Species 0.000 description 1
- 108010002724 Pheromone Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100038344 Vomeronasal type-1 receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010799 enzyme reaction rate Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000001295 genetical effect Effects 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002427 pheromone receptor Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种鉴定毛栓孔菌S0301中同核体菌株的方法；该方法通过交配型基因引物对原生质体再生技术得到的再生单菌进行PCR验证，扩增出一种交配型基因的为同核体菌株，交配型基因引物包括用于检测交配型基因位点b1的特异性引物对TM1‑1F/TM1‑1R和/或TM1‑2F/TM1‑2R，用于检测交配型基因位点b2的特异性引物对TM2‑1F/TM2‑1R和/或TM2‑2F/TM2‑2R；同时与通过油镜下观察菌丝显微特征锁状联合的有、无的传统方法相比，运用本发明所提供的方法对同核体的识别与锁状联合观察结果完全相符，且检查结果特异性强，稳定可靠，能准确快速的区分不同类型的同核体菌株。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速鉴定耐热毛栓孔菌S0301中同核、异核体菌株的方法，该方法基于交配型基因特异序列的PCR技术，建立快捷、准确的同核、异核菌株鉴定方法，获得耐热毛栓孔菌T. trogii S0301同核体核菌株。
背景技术
栓菌属（Trametes，Coriolous)菌株是自然界重要的木质纤维素降解菌，能分泌复杂的木素纤维素降解酶系。其中，漆酶是主要的木质素降解酶之一，木质素结构的复杂性决定了漆酶同工酶的多样性和漆酶对底物选择的非严格特异性。Trametes属菌株漆酶具有同工酶种类多、热稳定性高、氧化还原电位高等优势，且热稳定性酶还具有抵抗化学变性能力强、耐受强酸碱的能力强、酶反应速度快等特点，是重要的漆酶基因资源和特殊用途漆酶的潜在来源。然而，栓菌等白腐菌产漆酶普遍存在次生代谢阶段形成，发酵周期长、产量低，而且受真菌中普遍存在多个漆酶同工酶的影响，漆酶组成不明确、组成稳定性差。因此，原生质体融合和基因导入等微生物遗传育种方法对于Trametes属菌株进行改造十分必要。从再生菌株群体中筛选同核体菌株需要耗费大量的时间和精力，如研究者在毛栓孔菌属T. hirsuta YJ-9-1菌株的原生质体再生研究中发现，只有1.5%的菌株为同核体菌株。因而亟需一种同核体菌株快速准确鉴定方法，以提高后续的研究进程。
四级异宗的高等担子菌的有性生殖受到基因组上两个不连锁的A和B位点控制。子实体产生的同核菌株，可按A、B两个交配型因子的不同分为四种不同的交配型，只有A、B因子均不同的单核体才能够亲和形成双核体。依据此特征，研究者在球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和致病疫霉(Phytophthora infestans)中尝试建立基于交配型因子基因序列的单、双核菌丝PCR鉴定方法，且PCR鉴定与显微镜下锁状联合的观察结果一致。
锁状联合的有无是判断异核体菌株和同核体菌株的常用标准，该方法存在工作量大、耗时的缺点，而且该方法对毛栓孔菌等菌丝纤细、锁状结构难以观察的菌株而言难度更大。且锁状联合的观察无法区分不同类型的同核体，而不同类型的单核体菌株在表型上会有差异。因此，有必要建立更方便的同核体菌株鉴定方法。
发明内容
本发明是为了解决目前耐热毛栓孔菌T. trogii S0301同核体菌株分离难、鉴定难的问题，提供了一种可以快速分离鉴定耐热毛栓孔菌T. trogii S0301中同核、异核菌株的方法和通用引物对，通过特异引物对进行PCR扩增后，根据不同类型条带的有无，鉴定分离毛栓孔菌属菌株的同核菌株，对菌株的基因操作提供一定的便利条件。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
以实验室耐热毛栓孔菌S0301二代基因组数据中交配型b位点组成基因序列为基础，在相对应b1和b2基因的边界区分别选择了b1-1、b1-2、b2-1、b2-2基因设计了4对特异引物对M1-1F/R、M1-2F/R、M2-1F/R、M2-2F/R，用以确定我们检测PCR扩增的片段是否是交配型b位点的相关基因；
其中所述的M1-1F/R、M1-2F/R、M2-1F/R、M2-2F/R特异引物对中：
M1-1F的核苷酸序列为5’- GCCATAAGGCATGGATATCCCAA -3’；
M1-1R的核苷酸序列为5’- GCAACAAAAGGCAAAAATACAAG -3’；
M1-2F的核苷酸序列为5’- TAGCCATTGTTTCTTTAGCGCC -3’；
M1-2R的核苷酸序列为5’- GTGCAAGCAGCCTTTTGTCGTAC -3’；
M2-1F的核苷酸序列为5’- CACTTCCCACAAATTCAATAT -3’；
M2-1R的核苷酸序列为5’- AGCGGACTCTCACATATAGC -3’；
M2-2F的核苷酸序列为5’- GTCTCCGGCTTAACTATCCCT -3’；
M2-2R的核苷酸序列为5’- CTTTCGGAAGAATCTCCGTCT -3’；
提取实验室耐热毛栓孔菌S0301的基因组DNA作为模板，25μL PCR扩增体系包括10×Easy Taq buffer 2.5 μL、2.5mM dNTPs 2 μL、Easy Taq DNA Polymerase 0.5 μL、10 μM/L的M1-1F/R（M1-2F/R或M2-1F/R或M2-2F/R）引物各1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 17 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 sec，61 ℃退火30 sec，72 ℃延伸60 sec，30循环；72 ℃延伸10 min。
PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，挑选片段大小与预期片段一致的PCR产物连接载体并测序。本实验所用引物的合成及序列测定均在昆明擎科生物工程有限公司完成。经Blast搜索及与其它物种相应交配基因的比对分析见表2，推测四个基因全长分别为1555bp（B1-1），1622 bp（B1-2），1840 bp（B2-1）和2113 bp（B2-2），序列提交到Genbank数据库，测序后得到的四种交配性基因序列号分别为MF990238； MF990239； MF990240；MF990241。
通过毛栓孔菌原生制备与再生方法，得到足够多的再生菌株；通过菌丝裂解或提取DNA方法，获得再生菌株的DNA模板，采用交配型基因引物对对再生单菌进行PCR扩增，交配型基因引物是在测序后确定的b1-1、b1-2、b2-1、b2-2基因是交配型基因b1/b2位点附近的相关基因的基础上又设计了4对相对较短的特异验证引物对，用于检测交配型基因b1位点的特异引物对TM1-1F/ TM1-1R和/或TM1-2F/ TM1-2R，用于检测交配型基因b2位点的特异引物对TM2-1F/ TM2-1R和/或TM2-2F/ TM2-2R；
其中所述的TM1-1F/ TM1-1R和TM1-2F/ TM1-2R特异引物对中：
TM1-1F的核苷酸序列为5’-TCGTTGCTCTCGTGTTTGCT-3’；
TM1-1R的核苷酸序列为5’-TTTGGTATCCGCGCTTGAAT-3’ ；
TM1-2F的核苷酸序列为5’-AGGCTCAAAGGGTGGATTCAA-3’ ；
TM1-2R的核苷酸序列为5’-GCTCTGGTCCGTAACGATAGG-3’ ；
所述的TM2-1F/ TM2-1R和TM2-2F/ TM2-2R特异引物对中：
TM2-2F的核苷酸序列为5’- TTCCCGCCCTCTACAATACG-3’ ；
TM2-1R的核苷酸序列为5’- TGCCCAGAACAAACCAAAAC-3’ ；
TM2-2F的核苷酸序列为5’-ACTTGGTCGTCTTTGTGTTG-3’ ；
TM2-2R的核苷酸序列为5’- ATCTTTGGAGGCCTTGTTAC-3’。
进一步，获得不同毛栓孔菌再生菌株的DNA模板，通过PCR验证菌株的同核、异核情况， 25μL PCR扩增体系包括10× Easy Taq buffer 2.5 μL、2.5mM dNTPs 2 μL、Easy TaqDNA Polymerase 0.5 μL、10 μM/L的TM1-1F/R（TM1-2F/R或TM2-1F/R或TM2-2F/R）引物各1μL、DNA模板1 μL、ddH2O 17 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 sec，58℃退火30 sec，72 ℃延伸60 sec，30循环；72 ℃延伸10 min。
特异引物对TM1-1F/ TM1-1R，检测菌株b1位点交配型基因b1-1时，可以获得大小约为750 bp的唯一条带；特异引物对TM1-2F/ TM1-2R，检测菌株b1位点交配型基因b1-2时，可以获得大小约为400 bp的唯一条带；特异引物对TM2-1F/ TM2-1R，检测菌株b2位点交配型基因b2-1时，可以获得大小约为540bp的唯一条带；特异引物对TM2-2F/ TM2-2R，检测菌株b2位点交配型基因b2-2时，可以获得大小约为300 bp的唯一条带。
本发明与油镜下观察毛栓孔菌菌丝有无锁状联合的传统方法相比，具有明显的先进性，可以快速，准确的鉴定耐热毛栓孔菌T. trogii S0301中同核、异核体菌株，且能区分不同的同核体菌株类型，方法简便且结果可靠。
附图说明
图 1为毛栓孔菌S0301再生菌株显微镜下锁状联合结构观察图，a图为同核体菌株，在油镜下未观察到锁状联合结构；b图为异核体菌株，可以看到箭头所指的明显的锁状结构；本实验所有显微观察均在100×油镜物镜和10×目镜下进行；
图 2为代表性再生单菌交配型基因类型PCR扩增产物检测电泳图；M代表Marker-DL2000（图中从上到下的条带以此为2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、10 0bp）；a图代表以再生菌株编号10、11、19、30、5、25、39、45的DNA为模板，以引物对TM1-1F/ TM1-1R扩增交配型b1位点的基因；b图代表以再生菌株编号10、11、19、30、5、25、39、45的DNA为模板，以引物对TM1-2F/ TM1-2R扩增交配型b1位点的基因；c图代表以再生菌株编号10、11、19、30、5、25、39、45的DNA为模板，以引物对TM2-1F/ TM2-1R扩增交配型b2位点的基因；d图代表以再生菌株编号10、11、19、30、5、25、39、45的DNA为模板，以引物对TM2-2F/ TM2-2R扩增交配型b2位点的基因；b和d图中未标空白代表没加模板的负对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：耐热毛栓孔菌S0301的原生质体制备和再生菌株制备
从MA培养基平板菌落边缘打取菌块（直径0.5 cm）接种到GYP液体培养基中，低速培养4-6 d，打碎菌丝后继续培养3-4d；培养结束，3层擦镜纸收集菌丝，用等渗透缓冲液（0.6 M的甘露醇、100 mM柠檬酸-磷酸缓冲液，pH 5.4）冲洗菌体三次，8000 g离心10 min后用推滤除菌的酶解液（含1%溶壁酶的等渗透缓冲液）充分悬浮，28 ℃、80 rpm酶解1.5 h；酶解液经3层擦镜纸过滤，滤液经3000 rpm离心15 min，原生质体沉淀经等渗透缓冲液多次洗涤，离心后获得1-2 mL原生质体；取适当稀释的原生质体溶液进行血球计数板技术和涂布再生平板，28 ℃培养2-3 d，菌落计数计算原生质体的再生率，从再生平板上挑取若干再生单菌菌落用于后续实验。
实施例2：耐热毛栓孔菌S0301的交配型基因b1、b2位点克隆及基因分析
挑取MA培养基平板上28 ℃培养6 d的毛栓孔菌S0301新鲜菌丝，液氮冷冻条件下研磨至粉末状，取0.1g粉末提取基因组DNA，提取方法参照真菌基因组提取试剂盒进行（Biomega）。
以实验室耐热毛栓孔菌S0301二代基因组数据中交配型b位点组成基因序列为基础，在相对应b1和b2基因的边界区分别设计了4对引物，设计结果见表1。根据序列合成相关引物对，其中引物M1-1F/R和M1-2F/R分别对应于b1位点附近的两个基因b1-1和b1-2基因；引物M2-1F/R和M2-2F/R分别对应于b2位点附近的两个基因b2-1和b2-2基因。
表1为毛栓孔菌S0301菌株b1和b2位点基因克隆引物
使用验证引物对，M1-1F/R，M1-2F/R，M2-1F/R和M2-2F/R分别从S0301全基因组中通过PCR扩增的方法分别得到b1-1基因，b1-2基因，b2-1基因和b2-2基因的PCR产物。25 μL PCR扩增体系为10× Easy Taq buffer 2.5 μL、2.5mM dNTPs 2 μL、Easy Taq DNAPolymerase 0.5 μL、10 μM/L的引物各1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 17 μL；PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 sec，61 ℃退火30 sec（具体退火温度根据引物的理论温度推算），72 ℃延伸60 sec，30循环；72 ℃延伸10 min；引物具体序列见表1。
PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，挑选片段大小与预期片段一致的PCR产物连接载体并测序。本实验所用引物的合成及序列测定均在昆明擎科生物工程有限公司完成。
b1-1、 b1-2、 b2-1和b2-2四个基因片段全长分别为1555 bp、1622 bp、1840 bp和2113 bp。经Blast搜索及与其它物种相应交配基因的比对分析见表2，四个基因均与Genbank数据库中的其它物种的交配基因（信息素受体，pheromone receptor）显示出一定的相似性，表明它们为该菌株交配型相关基因，结果见表2；序列提交到Genbank数据库，序列号分别为MF990238、 MF990239、 MF990240和MF990241。
表2毛栓孔菌Trametes trogii S0301菌株交配型基因Blast分析
。
实施例3：耐热毛栓孔菌S0301菌丝培养及再生单菌菌株锁状联合观察
经毛栓孔菌S0301的原生质体再生，共获得45个再生菌株；挑取再生单菌菌块至GYP固体平板，采用插片法在离菌块近、中、远处插入三张灭菌载玻片，待菌丝蔓延至最边缘载玻片，在100×油镜10×目镜下观察菌丝显微特征及锁状联合的有无。
根据再生平板上菌落的直径大小，随机挑取45个再生菌株用于显微观察。毛栓孔菌T. trogii S0301菌丝纤细，细胞分隔和锁状联合等特征结构需要借助油镜观察结果见图1；油镜观察结果表明：45个再生菌株在显微镜能明显的依菌丝粗细和锁状联合有无分为两类，编号为5、25、39、45等的19个再生单菌菌株能产生明显的锁状结构的异核体菌株，其菌丝粗壮；编号为10、11、19、30等26个再生单菌菌株是缺少锁状结构的同核体菌株，菌丝纤细，锁状联合具体情况见表3第二栏（图1，表3）。
表3毛栓孔菌S0301再生单菌菌株锁状联合观察、交配型基因PCR结果比较
。
实施例4：毛栓孔菌S0301的再生菌株交配型的分子鉴定
在经过实施例2的BLAST结果我们确定了b1-1、b1-2、b2-1、b2-2基因确实是交配型基因位点b1/b2附近的相关基因，进一步，我们在b1-1、b1-2、b2-1、b2-2基因的基础上设计并筛选出了四对相对较短的特异引物对TM1-1F/R，TM1-2F/R，TM2-1F/R和TM2-2F/R用于b1和b2基因位点的克隆，引物序列见表4。
表4 毛栓孔菌S0301菌株b1和b2位点基因验证引物
挑取新鲜培养的再生单菌菌丝少许于1.5 mL离心管中，加入200μL裂解液（1 M Tris-Hcl Buffer，pH8.0，100 mL，500 mM EDTA，pH8.0，20mL，去离子水定容到1 L，高温高压灭菌），微波裂解5 s离心后上清用作PCR模板，以b1和b2位点序列为基础设计的长度相对较短的特异引物TM1-1F/R、TM1-2F/R、TM2-1F/R和TM2-2F/R用来扩增再生菌株；25μL PCR扩增体系包括10× Easy Taq buffer 2.5 μL、2.5mM dNTPs 2 μL、Easy Taq DNA Polymerase0.5 μL、10 μM/L的引物各1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 17 μL；PCR扩增程序为：94 ℃预变性5min；94 ℃变性30 sec，58 ℃退火30 sec，72 ℃延伸60 sec，30循环；72 ℃延伸10 min（引物序列见表4）。
PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示见表3第三栏，部分代表性菌株PCR产物电泳结果见图2；b1b2表示同时拥有两种b1、b2两种基因型是异核菌株；b1表示只有b1一种基因型是同核菌株；b2表示只有b2一种基因型是同核菌株（本研究中未找到只拥有b2型的同核菌株）。
为排除菌丝裂解产物作为PCR模板对PCR结果的不利影响，本研究进一步提取45个再生单菌的基因组DNA作为PCR模板进行验证。把45株再生菌株接种在MA培养基上，28 ℃培养6 d，挑取MA平板上的新鲜菌丝，液氮冷冻条件下研磨至粉末状，取0.1 g粉末提取基因组DNA，提取方法参照真菌基因组提取试剂盒进行，并以45个菌株的总DNA作为PCR模板，PCR结果与菌丝裂解液为模板结果一致。
实施例5：两种毛栓孔菌S0301同核体菌株鉴定方法的比较
通过实施例3和实施例4并结合表3的结果分析；首先我们可以确定这两种检测方法在同核体检出结果上完全一致。
其中实施例3中通过显微镜观察菌丝的锁状联合情况的有无，从而来确定菌株是同核还是异核的。这种方法被广泛的使用，但对于我们的毛栓孔菌S0301的拥有再生菌株来说，由于它的菌丝过于纤细，在油镜下虽然可以清楚的看清楚锁状联合情况。但该方法存在工作量大、耗时的缺点，且无法区分不同类型的单核体，而不同类型的单核体菌株在表型上会有差异。因此运用此传统方法来确定我们再生菌株的同、异核情况时，大大提高了难度，并大大减慢了我们的实验进程。而本发明中运用的毛栓孔菌S0301的再生菌株交配型的分子鉴定方法，为检测方法的准确、迅速、简单提供了条件。在我们得到再生菌株后，只需要通过简单的菌丝裂解方法制备模板，通过PCR扩增特异的交配型基因片段的有无，即可确定菌株是否同核体菌株，以及是何种类型的同核体菌株
本发明采用交配型基因分子鉴定的方法对同核体的识别与锁状联合观察结果完全相符，且交配型基因的PCR鉴定能准确地区分不同的同核体菌株。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种鉴定毛栓菌S0301中同核体菌株的方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
tcgttgctct cgtgtttgct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
tttggtatcc gcgcttgaat 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
aggctcaaag ggtggattca a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
gctctggtcc gtaacgatag g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
ttcccgccct ctacaatacg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
tgcccagaac aaaccaaaac 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
acttggtcgt ctttgtgttg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
atctttggag gccttgttac 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
gccataaggc atggatatcc caa 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
gcaacaaaag gcaaaaatac aag 23
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
tagccattgt ttctttagcg cc 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
gtgcaagcag ccttttgtcg tac 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
cacttcccac aaattcaata t 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 14
agcggactct cacatatagc 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
gtctccggct taactatccc t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 16
ctttcggaag aatctccgtc t 21
Claims (1)
1.一种鉴定毛栓孔菌S0301中同核体菌株的方法，其特征在于：通过交配型基因引物对原生质体再生技术得到的再生单菌进行PCR验证，扩增出一种交配型基因的为同核体菌株，交配型基因引物包括用于检测交配型基因位点b1的特异性引物对TM1-1F/ TM1-1R和/或TM1-2F/ TM1-2R，用于检测交配型基因位点b2的特异性引物对TM2-1F/ TM2-1R和/或TM2-2F/ TM2-2R；
所述的针对b1位点的TM1-1F/ TM1-1R和TM1-2F/ TM1-2R特异引物对中：
TM1-1F的核苷酸序列为5’-TCGTTGCTCTCGTGTTTGCT-3’；
TM1-1R的核苷酸序列为5’-TTTGGTATCCGCGCTTGAAT-3’；
TM1-2F的核苷酸序列为5’-AGGCTCAAAGGGTGGATTCAA-3’；
TM1-2R的核苷酸序列为5’-GCTCTGGTCCGTAACGATAGG-3’；
所述的针对b2位点的TM2-1F/ TM2-1R和TM2-2F/ TM2-2R特异引物对中：
TM2-2F的核苷酸序列为5’- TTCCCGCCCTCTACAATACG-3’；
TM2-1R的核苷酸序列为5’- TGCCCAGAACAAACCAAAAC-3’；
TM2-2F的核苷酸序列为5’-ACTTGGTCGTCTTTGTGTTG-3；
TM2-2R的核苷酸序列为5’- ATCTTTGGAGGCCTTGTTAC-3’。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810175037.6A CN108486269B (zh) | 2018-03-02 | 2018-03-02 | 一种鉴定毛栓孔菌s0301中同核体菌株的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810175037.6A CN108486269B (zh) | 2018-03-02 | 2018-03-02 | 一种鉴定毛栓孔菌s0301中同核体菌株的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108486269A true CN108486269A (zh) | 2018-09-04 |
| CN108486269B CN108486269B (zh) | 2021-08-20 |
Family
ID=63341334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810175037.6A Active CN108486269B (zh) | 2018-03-02 | 2018-03-02 | 一种鉴定毛栓孔菌s0301中同核体菌株的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108486269B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112126701A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-12-25 | 广东省科学院生物工程研究所 | 用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对、试剂盒及其应用 |
| CN114410814A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-04-29 | 中国科学院微生物研究所 | 一种基于rpb2序列杂合位点鉴定茯苓同核、异核菌株的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103184280A (zh) * | 2013-02-04 | 2013-07-03 | 北京市农林科学院 | 鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对is-818 |
| CN105505891A (zh) * | 2016-01-06 | 2016-04-20 | 昆明理工大学 | 一种热稳定性毛栓菌漆酶TtLac13及其应用 |
-
2018
- 2018-03-02 CN CN201810175037.6A patent/CN108486269B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103184280A (zh) * | 2013-02-04 | 2013-07-03 | 北京市农林科学院 | 鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对is-818 |
| CN105505891A (zh) * | 2016-01-06 | 2016-04-20 | 昆明理工大学 | 一种热稳定性毛栓菌漆酶TtLac13及其应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| INGER SKREDE等: "Molecular Characterization of Sexual Diversity in a Population of Serpula lacrymans,a Tetrapolar Basidiomycete", 《GENES GENOMES GENETICS》 * |
| NCBI: "Trametes versicolor FP-101664 SS1 unplaced genomic scaffold TRAVEscaffold_9, whole genome shotgun sequence", 《GENBANK》 * |
| 张美景等: "玉米黑粉菌单倍体菌株的分离及交配型a位点的鉴别", 《江苏农业科学》 * |
| 李江等: "毛栓菌原生质体制备和再生及单核菌株产漆酶特性", 《菌物学报》 * |
| 陈明杰等: "香菇B交配型位点的分子遗传学结构研究Ⅱ.一个香菇单核体的B位点结构的分子解析", 《菌物学报》 * |
| 高升等: "耐热毛栓孔菌S0301同核体菌株的快速鉴定及产漆酶能力比较", 《应用与环境生物学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112126701A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-12-25 | 广东省科学院生物工程研究所 | 用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对、试剂盒及其应用 |
| CN112126701B (zh) * | 2020-09-16 | 2022-04-22 | 广东省科学院生物工程研究所 | 用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对、试剂盒及其应用 |
| CN114410814A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-04-29 | 中国科学院微生物研究所 | 一种基于rpb2序列杂合位点鉴定茯苓同核、异核菌株的方法 |
| CN114410814B (zh) * | 2021-12-29 | 2024-02-02 | 中国科学院微生物研究所 | 一种基于rpb2序列杂合位点鉴定茯苓同核、异核菌株的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108486269B (zh) | 2021-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6666268B2 (ja) | 液滴ソートによるヌクレオチド配列排除富化（ｎｅｅｄｌｓ） | |
| CN109996892A (zh) | 单细胞测序文库的构建方法及其应用 | |
| US11299741B2 (en) | Manipulation of genes involved in signal transduction to control fungal morphology during fermentation and production | |
| CN105734164B (zh) | 一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重pcr试剂盒 | |
| CN102312000A (zh) | 一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pi1、Pi2的检测方法 | |
| CN110268063A (zh) | 利用自动化遗传操作和菌株纯化步骤建立真菌生产菌株的方法 | |
| CN108486269A (zh) | 一种鉴定毛栓孔菌s0301中同核体菌株的方法 | |
| CN103866048B (zh) | 番鸭细小病毒和鹅细小病毒的hrm鉴别方法、试剂盒和引物组 | |
| CN102010910A (zh) | 基于环介导等温扩增技术的疟原虫属和种的核酸筛查方法 | |
| CN114540519B (zh) | 用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物、试剂盒及鉴别方法 | |
| CN115976238A (zh) | 一种包含15种支原体qPCR快速检测试剂盒及其使用方法和应用 | |
| CN112176080B (zh) | 特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法 | |
| JP4648023B2 (ja) | ジャガイモそうか病原因菌種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子若しくは１６ＳｒＲＮＡ遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するための新規プライマー対、及びそれらを用いたジャガイモそうか病原因菌種の検出・識別方法 | |
| Kamangu | Comparison of the quality of the DNA extracted from different media at the laboratory of molecular biology of the faculty of medicine of UNIKIN | |
| NL2026261A (en) | Molecular Marker Closely Linked to Chinese Cabbage Turnip Mosaic Virus Resistance Gene retrcs03 and Application Thereof | |
| CN106701747A (zh) | 一种通用pcr引物对及其应用 | |
| CN105331740A (zh) | 一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型pcr-hrm的引物和方法 | |
| CN108060160A (zh) | 一种用于fish探针标记的bac-dna的快速制备方法 | |
| CN104390949A (zh) | 一种光子晶体微球流式芯片及其制备方法和应用 | |
| CN104531695B (zh) | 一种干酪乳杆菌的特异性分子标记dna序列及其用途 | |
| CN108384886A (zh) | 扁蓿豆ssr标记的检测引物组、试剂盒及其应用和扁蓿豆自交亲和基因型的筛选方法 | |
| CN108018370A (zh) | 冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 | |
| CN104846111A (zh) | 用于筛选枯草芽孢杆菌荧光定量pcr内参基因引物 | |
| CN106676163A (zh) | 检测毕赤酵母细胞dna的引物及方法 | |
| CN107418951B (zh) | 一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |