CN112126701A - 用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对、试剂盒及其应用 - Google Patents

用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对、试剂盒及其应用。本发明公开了用于鉴别硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的两个引物对PMD_1和PMD_2。本发明以待鉴定的硬毛粗盖孔菌原生质体单核体的基因组DNA为模板，用PMD_1和PMD_2引物扩增，根据检测所得PCR产物大小来确定其交配型。本发明中的方法简单易行，缩短了鉴别时间并简化了鉴别步骤，准确度高，可适用于食药用菌，尤其是硬毛粗盖孔菌遗传育种、基因组学等相关领域的研究。

Description

用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对、试 剂盒及其应用
技术领域
本发明属于食药用菌鉴定技术领域，具体涉及用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对、试剂盒及其应用。
背景技术
硬毛粗盖孔菌(Coriolopsis trogii)隶属于担子菌门(Basidiomycota)，多孔菌科(Polyporaceae)，是一种蕴藏量较大的野生菌物资源，可生于活的杨树等树木上，具有很强的木质纤维素分解能力。硬毛粗盖孔菌及其近缘物种在科研和生产中主要作为一种产漆酶类真菌使用，且具有较强的药理作用，可以发挥抗癌功效。此外，硬毛粗盖孔菌的菌丝和子实体耐高温能力强，生长发育周期相对较短。以上优点使其成为研究多孔菌发育、耐热以及生物质高值化利用等的良好材料。
单核体菌丝是食药用菌遗传和育种研究的重要基础材料，分为孢子单核体和原生质体单核体。原生质体单核体是营养菌丝的无性后代，可通过双核菌丝的原生质体单核化技术获得，遗传物质未经过遗传重组等过程，最大程度反映亲本的遗传特征。由于不需要经历出菇过程，在实验室条件下具有操作性强，重复性强，耗时较短等优点。
传统交配型的鉴定通过杂交的方法进行，依赖于两个单核体杂交后锁状联合的有无判定交配型是否相同或不同。此方法耗时较长，效率较低，且准确性受到实验人员主观影响较大。
因此，提供能提高检测效率，缩短检测时长，更准确有效的鉴别硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对，并以此为基础建立一套完整的检测方法，对于硬毛粗盖孔菌原生质体单核体的鉴定，乃至食药用菌/多孔菌遗传育种、基因组学等相关领域都具有极为重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对；
本发明的另一目的在于提供一种硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型鉴定试剂盒；
本发明的另一目的在于提供一种鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的方法；
本发明的另一目的在于提供上述引物对在制备硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型鉴定制剂中的应用；
本发明的另一目的在于提供上述方法在食药用菌遗传育种及基因组学检测中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对，该引物对的核苷酸序列如PMD_1或PMD_2所示：
PMD_1引物对的核苷酸序列为：
PMD_1F：5’-GGCAGTTGTTGTTCTCAGTGT-3’(SEQ ID NO.1)；
PMD_1R：5’-GGATCATCAGCAATGGTCAGTT-3’(SEQ ID NO.2)；
PMD_2引物对的核苷酸序列为：
PMD_2F：5’-TTCGGTGTGCCTCTCCTATG-3’(SEQ ID NO.3)；
PMD_2R：5’-CGTTGCGTAGTAGTAGTTGATGA-3’(SEQ ID NO.4)。
该特异引物对根据硬毛粗盖孔菌的全基因组序列设计。
硬毛粗盖孔菌双核菌株Ct001保藏于广东省科学院生物工程研究所菌种库，经ITS扩增和测序确认其为硬毛粗盖孔菌。单核体菌株通过原生质体单核化获得，编号为1-50。硬毛粗盖孔菌单核体的全基因组DNA通过天根生化科技(北京)有限公司的快速DNA提取检测试剂盒KG203获得。
本发明提供的引物对可用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体的交配型，如果扩增产物含有450bp(采用PMD_1引物对)或552bp(采用PMD_2引物对)的DNA片段，则鉴定为AxBx交配型，如果产物均不含有450bp或552bp的DNA片段，则鉴定为AyBy交配型。
本发明的第二个方面，提供：
一种硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型鉴定试剂盒，包括上述的引物对。
本发明提供的试剂盒可用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体的交配型，如果扩增产物含有450bp(采用PMD_1引物对)或552bp(采用PMD_2引物对)的DNA片段，则鉴定为AxBx交配型，如果产物均不含有450bp或552bp的DNA片段，则鉴定为AyBy交配型。
本发明的第三个方面，提供：
一种鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)以待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)检测扩增产物的条带长度，判断待测样品的交配型。
进一步地，上述步骤(3)中判断待测样品的交配型包括以下情况：
(a)若扩增产物含有450bp或552bp的条带，则判断待测样品为AxBx交配型；
(b)若扩增产物均不含有450bp或552bp的条带，则判断待测样品为AyBy交配型。
本发明提供的方法可用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体的交配型，采用PMD_1引物对时，如果扩增产物含有450bp的DNA片段，则鉴定为AxBx交配型，如果产物不含有450bp的DNA片段，则鉴定为AyBy交配型。采用PMD_2引物对时，如果扩增产物含有552bp的DNA片段，则鉴定为AxBx交配型，如果产物不含有552bp的DNA片段，则鉴定为AyBy交配型。
进一步地，上述步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：
Figure BDA0002684498740000031
更进一步地，上述步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系优选为：
Figure BDA0002684498740000032
其中Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0plus dye)购自Takara Bio公司。
进一步地，上述步骤(2)中所述引物对扩增的PCR反应条件为：95℃预变性3-5min；95℃变性15-30s，68℃退火15-30s，72℃延伸10-20s，32-35个循环；72℃终延伸5-7min。
更进一步地，上述步骤(2)中所述引物对扩增的PCR反应条件优选为：95℃预变性3min；95℃变性15s，68℃退火15s，72℃延伸15s，34个循环；72℃终延伸5min。
本发明的第四个方面，提供：
上述引物对在制备硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型鉴定制剂中的应用。
本发明提供的引物对可用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体的交配型，如果扩增产物含有450bp(采用PMD_1引物对)或552bp(采用PMD_2引物对)的DNA片段，则鉴定为AxBx交配型，如果产物均不含有450bp或552bp的DNA片段，则鉴定为AyBy交配型，因此，含有上述引物对的制剂同样可以用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体的交配型。
本发明的第五个方面，提供：
上述方法在食药用菌遗传育种及基因组学检测中的应用。
本发明中的方法基于DNA序列的分子生物学方法，可有效对不同交配型进行准确和快速鉴定。典型的四极性异宗结合食用菌通过原生质体单核化获得的单核体交配型为AxBx和AyBy。不同交配型单核体菌株的表型以及遗传物质都存在差异，因此，挑选合适交配型的单核体进行遗传和育种等的研究，具有重要意义。
进一步地，上述食药用菌包括多孔菌。
更进一步地，上述多孔菌为硬毛粗盖孔菌。
本发明的有益效果是：
1.本发明缩短了硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的鉴别时间并简化了交配型的鉴别步骤，其准确性和可靠性高。
2.本发明适用于食药用菌/多孔菌遗传育种、基因组学等相关领域对硬毛粗盖孔菌原生质体单核体的鉴定。
附图说明
图1为本发明引物对PMD_1对不同交配型的硬毛粗盖孔菌原生质体单核体PCR扩增产物的电泳图；
图2为本发明引物对PMD_2对不同交配型的硬毛粗盖孔菌原生质体单核体PCR扩增产物的电泳图；
图3为本发明引物对PMD_1和PMD_2以不同浓度DNA为模板PCR扩增产物电泳图；
图4为本发明引物对PMD_1和PMD_2以不同物种DNA为模板PCR扩增电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径获得的耗材和试剂。
1.硬毛粗盖孔菌原生质体单核体的制备
试剂：
硬毛粗盖孔菌培养基，包括PDA培养基、PDB培养基和再生培养基。
PDA培养基的制备方法为：将15.6g DifcoTM Potato Dextrose Agar(Becton,Dickinson and Company,Sparks,MD,USA)溶于400mL ddH2O中，121℃灭菌15min。
PDB培养基：将2.4g DifcoTM Potato Dextrose Broth(Becton,Dickinson andCompany,Sparks,MD,USA)溶于100mL ddH2O中，121℃灭菌15min。
再生培养基的制备方法为：15.6g DifcoTM Potato Dextrose Agar与82.15g蔗糖溶于400mL ddH2O中，121℃灭菌15min。
硬毛粗盖孔菌原生质体制备和再生：
将PDA平板培养5d的菌丝1g使用匀浆仪打碎，分装至PDB培养基中，28℃静置培养2d；过滤，收集菌丝，置于2％溶壁酶溶液中，在30℃、60rpm/min条件下酶解2h；用无菌未脱脂的棉花过滤去除酶解液中残留的菌丝，滤液于4℃、3000rpm/min条件下离心10min；沉淀用0.6mol/L的甘露醇洗涤2次得到纯化的原生质体；使用血球计数板对原生质体计数，稀释浓度至104个/mL，取100μL涂布在再生培养基上，28℃避光倒置培养14d，直至陆续有单菌落再生。
硬毛粗盖孔菌原生质体单核体的获得：
将上述培养再生的单菌落使用无菌接种针转移至PDA培养基上，28℃插片培养3d。
于40倍光学显微镜下观察，如果没有锁状联合，则该菌株为原生质体单核体。
使用上述制备方法获得原生质体单核体菌株50个，分别编号为1-50，随机选取20个单核体进行下述试验。
鉴定原生质体单核体的交配型：
随机指定31号单核体交配型为AxBx，将其它所有单核体分别与31号菌株间隔2cm对峙培养，28℃培养8d后挑取交接处的菌丝，在显微镜下观察有无锁状联合。如果有锁状联合，则待鉴定菌株的交配型为AyBy，若无锁状联合，则待鉴定菌株的交配型为AxBx。利用该方法判定单核菌株5、6、7、11、12、13、16、17、21、24、25、30和31交配型为AxBx，单核菌株18、19、20、23、26、27和29交配型为AyBy。
实施例1：用于鉴别硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对：
鉴别硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对，引物对的核酸序列如下：
PMD_1F：5’-GGCAGTTGTTGTTCTCAGTGT-3’(SEQ ID NO.1)；
PMD_1R：5’-GGATCATCAGCAATGGTCAGTT-3’(SEQ ID NO.2)；
该特异引物对根据硬毛粗盖孔菌(菌株编号S0301)的全基因组序列设计。
使用快速DNA提取检测试剂盒KG203(天根生化科技(北京)有限公司)提取硬毛粗盖孔菌原生质体单核体菌株基因组DNA，包括如下步骤：
1.将各单核体菌株于PDA平板上28℃培养3d；
2.挑取菌丝于1.5mL的离心管中，加入100μL缓冲液B1；
3.使用研磨杵将样品捣碎；
4.加入100μL缓冲液B2，震荡混匀后，12000rpm离心2min，上清液即为所得基因组DNA。
鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的方法为：
通过上述方法提取硬毛粗盖孔菌原生质体单核体菌株的基因组DNA，然后以PMD_1F/R引物对进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0plusdye)(Takara Bio)12.5μL，引物PMD_1F/R各1.0μL，模板DNA 1.0μL，无菌双蒸水9.5μL。PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，68℃退火15s，72℃延伸15s，34个循环；72℃终延伸5min。取PCR产物5μL，使用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示。
结果发现，AxBx型单核体均扩增出450bp的条带，而AyBy型单核体均未扩增出450bp的条带，将对应样品由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序引物对同本发明的PMD_1引物对，发现结果与本实施例所得结果一致，说明本发明方法具有可行性。
实施例2：用于鉴别硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对：
鉴别硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对，引物对的核酸序列如下：
PMD_2F：5’-TTCGGTGTGCCTCTCCTATG-3’(SEQ ID NO.3)；
PMD_2R：5’-CGTTGCGTAGTAGTAGTTGATGA-3’(SEQ ID NO.4)。
该特异引物对根据硬毛粗盖孔菌(菌株编号S0301)的全基因组序列设计。
使用快速DNA提取检测试剂盒KG203(天根生化科技(北京)有限公司)提取硬毛粗盖孔菌原生质体单核体菌株基因组DNA，包括如下步骤：
1.将各单核体菌株于PDA平板上28℃培养3d；
2.挑取菌丝于1.5mL的离心管中，加入100μL缓冲液B1；
3.使用研磨杵将样品捣碎；
4.加入100μL缓冲液B2，震荡混匀后，12000rpm离心2min，上清液即为所得基因组DNA。
鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的方法为：
通过上述方法提取硬毛粗盖孔菌原生质体单核体菌株的基因组DNA，然后以PMD_2F/R引物对进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0plusdye)(Takara Bio)12.5μL，引物PMD_2F/R各1.0μL，模板DNA 1.0μL，无菌双蒸水9.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，68℃退火15s，72℃延伸15s，34个循环；72℃终延伸5min。取PCR产物5μL，使用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示。
结果发现，AxBx型单核体均扩增出552bp的条带，而AyBy型单核体均未扩增出552bp的条带，将对应样品由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序引物对同本发明的PMD_2引物对，发现结果与本实施例所得结果一致，说明本发明方法具有可行性。
灵敏度试验
随机选取21号单核体的DNA，使用本发明中引物对进行PCR扩增(扩增条件如实施例2中所述)。其中，电泳泳道1-6分别为21号单核体菌株不同浓度DNA为模板的扩增结果，1-6泳道对应的DNA浓度分别为：5.0ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.01ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL。
结果表明(图3)当模板浓度大于等于0.005ng/μL时，PMD_1可以达到较好的检测效果，且当浓度为0.0005ng/μL时，还可以观测到微弱的条带。当模板浓度大于等于0.01ng/μL时，PMD_2可以达到较好的检测效果，且当浓度为0.005ng/μL时，还可以观测到微弱的条带。以上结果表明本发明提供的引物对扩增灵敏度高，可对较低DNA浓度的样品进行检测。
特异性试验
使用不同食药用菌DNA，使用本发明中引物对进行PCR扩增(扩增条件如实施例2中所述)。其中，电泳泳道1-8代表的物种分别为：花脸香蘑、灵芝(GL012菌株AxBx型单核体)、灵芝(GL012菌株AyBy型单核体)、硬毛粗盖孔菌双核菌株(菌株编号：Ct001)、灵芝(CGMCC5.0069)、白香蘑、灵芝(菌株编号：CGMCC5.0026)、紫丁香蘑。
结果显示(图4)，仅硬毛粗盖孔菌双核菌株(菌株编号：Ct001)出现扩增，其他样品均未出现条带，说明本发明提供的引物对仅在硬毛粗盖孔菌中能够扩增出条带，引物对特异性好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省科学院生物工程研究所
<120> 用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对、试剂盒及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcagttgtt gttctcagtg t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggatcatcag caatggtcag tt 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcggtgtgc ctctcctatg 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgttgcgtag tagtagttga tga 23

Claims (10)

1.用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如PMD_1或PMD_2所示：
PMD_1引物对的核苷酸序列为：
PMD_1F：5’-GGCAGTTGTTGTTCTCAGTGT-3’；
PMD_1R：5’-GGATCATCAGCAATGGTCAGTT-3’；
PMD_2引物对的核苷酸序列为：
PMD_2F：5’-TTCGGTGTGCCTCTCCTATG-3’；
PMD_2R：5’-CGTTGCGTAGTAGTAGTTGATGA-3’。
2.一种硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对。
3.一种鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)以待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)检测扩增产物的条带长度，判断待测样品的交配型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中判断待测样品的交配型包括以下情况：
(a)若扩增产物含有450bp或552bp的条带，则判断待测样品为AxBx交配型；
(b)若扩增产物不含有450bp或552bp的条带，则判断待测样品为AyBy交配型。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：
Figure FDA0002684498730000011
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3-5min；95℃变性15-30s，68℃退火15-30s，72℃延伸10-20s，32-35个循环；72℃终延伸5-7min。
7.权利要求1所述的引物对在制备硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型鉴定制剂中的应用。
8.权利要求3至6任一所述的方法在食药用菌遗传育种及基因组学检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述食药用菌包括多孔菌。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述多孔菌为硬毛粗盖孔菌。
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