CN104711351A - 基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的特异引物组与应用 - Google Patents

基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的特异引物组与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的特异引物组与应用，所述的特异引物组，包括一对特异性内引物、一对特异性外引物和一条环引物；所述特异性内引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述特异性外引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述环引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明利用GAS中高度保守又高度特异的speB基因序列中的7个不同区域设计了5条特异引物组，包括2条外引物、2条内引物和1条环引物，通过上述特异引物组利用LAMP技术进行扩增，可以达到快速、准确检测化脓链球菌的目的。

Description

基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的特异引物组与应用
技术领域
本发明涉及基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的特异引物组与应用，属于生物技术技术领域。
背景技术
化脓链球菌(streptococcus pyogenes)又称A群链球菌(group A streptococci，GAS)，属于乙型溶血性链球菌，是人类细菌感染中最重要的病原之一。化脓链球菌可侵袭任何年龄的人，以儿童发病者多见。引起的化脓性感染主要有急性咽炎、急性扁桃体炎、丹毒、急性咽峡炎、急性肺部感染、猩红热、皮肤软组织感染、关节炎、中耳炎、内眼炎、鼻窦炎、阴道炎、子宫内膜炎，严重者可引起菌血症、败血症、中毒性休克样综合征(TSLS)等。该菌也是变态反应性疾病风湿热和急性肾小球肾炎的间接原因。
产生毒素和细胞外蛋白是A群链球菌致病的重要原因。产生的毒素有致热性外毒素(pyrogenic exotoxin)和链球菌溶血素(streptolysin)；致热性外毒素亦即红斑毒素，为一种耐热蛋白，有A，B，C三种不同的抗原型(speA、speB和speC)，除可使皮肤发生猩红热样皮疹外，尚有化脓、细胞毒、增强内毒素毒性等作用，其中，链球菌致热外毒素B(Streptococcal exotoxin B,speB)是A群链球菌以酶原形式分泌到胞外后形成的活性巯基蛋白酶。speB只存在于GAS中，被认为是GAS的重要致病因子。其能降解宿主胞外基质、免疫球蛋白和补体成分以及一些分泌蛋白，破坏宿主防御系统，使细菌逃避免疫清除，还协助GAS在最初感染部位的扩散和入侵深层组织。因此，在GAS引起的严重侵袭性感染过程中起重要作用。到目前为止，所有临床分离GAS菌株染色体DNA上都检测到了speB基因。
目前，实验室对A群链球菌感染的诊断主要依据细菌培养；β溶血链球菌进一步做A群血清凝集，但至少需要24小时，鉴于青霉素依然是A群链球菌感染的首选药物，在药物的选择上并不存在困难，因此及早检测出A群链球菌便可以及早用药，及早恢复，避免延误用药导致严重后果。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年由日本荣研化学株式会社开发的一种新颖的简便、快速、精确、低价恒温核酸扩增方法，LAMP法的基本原理是根据靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)在恒温条件(60-65℃)下进行扩增反应，在一小时内可以实现109-1010倍的扩增， 产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。与常规PCR相比，操作简单、快速、特异性强，灵敏度高，检测成本低，是特别适用于基层或海关等现场的检测方法。
但上述技术在具体应用于检测的过程中，主要存在如下技术难点：
1、需要找到合适的靶基因来进行检测，否则容易导致因假阳性结果的产生影响检测的准确性，甚至导致无法进行检测；
2、由于其采用多条引物在短时间内进行大量扩增，因此，对引物的要求高于一般的PCR引物设计要求。
由于上述技术难点的存在，目前还没有环介导等温扩增技术应用于化脓链球菌检测中的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的特异引物组与应用。
本发明技术方案如下：
基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的特异引物组，包括一对特异性内引物、一对特异性外引物和一条环引物；
所述特异性内引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述特异性外引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述环引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
上述特异引物组在基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌中的应用。
上述特异引物组在制备基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的试剂盒中的应用。
根据本发明优选的，所述的基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的试剂盒，包括：
上述特异引物组、反应液、BstDNA聚合酶。
根据本发明优选的，所述的反应液组分如下：
40mM Tris-HCl，20mM氯化钾，20mM硫酸铵，16mM硫酸镁，0.2wt％Tween-20，甜菜碱1.5M～2.0M，dNTP浓度2.5～3.0mM。反应液采用Tris-HCl缓冲体系，更加稳定。
根据本发明进一步优选的，所述的甜菜碱浓度为1.6M。提高了甜菜碱的浓度，更好的保护Bst DNA聚合酶的活性，提高反应效率；降低引物浓度，提高了反应的特异性，降低了假阳性的产生。
根据本发明进一步优选的，所述的dNTP的浓度为2.8mM。
根据本发明优选的，所述的试剂盒还包括荧光染料。加入荧光染料有利于对结果的判断，这样不仅可以通过是否有沉淀产生来判断是否为阳性，而且可以通过颜色的改变来进一步判断验证，增加了结果判断的准确性。
根据本发明进一步优选的，所述的荧光染料为锰离子鳌和型钙黄绿素，反应浓度为0.02～0.10μmol/mL。采用钙黄绿素作为染料用于结果判断，反应效率高，特异性好，只能检测到LAMP反应而对常规PCR反应无效，避免因核酸扩增中的微弱PCR反应带来的假阳性；染料预先加到反应液，反应结束后不需要再打开反应管，避免了因形成气溶胶产生的DNA污染，有效保护反应环境，避免后续检测中的假阳性。
根据本发明优选的，所述的BstDNA聚合酶的反应浓度为300～350U/mL，优选320U/mL。
有益效果
1、本发明利用GAS中高度保守又高度特异的speB基因序列中的7个不同区域设计了5条特异引物组，包括2条外引物、2条内引物和1条环引物，通过上述特异引物组利用LAMP技术进行扩增，可以达到快速、准确检测化脓链球菌的目的；
2、本发明所述采用特异引物组制备的试剂盒，可以实现快速、准确检测化脓链球菌，整个操作过程简便，结果判断容易，解决了现有技术的筛选培养的耗时长或PCR检测对检测条件要求高、程序复杂、成本高的问题；
附图说明
图1是实施例1中LAMP目视鉴定GAS菌的结果；
其中：1、临床分离GAS菌的样本；2、阳性对照(化脓链球菌ATCC19615)；3、阴性对照；
图2是实施例2中LAMP目视鉴定GAS菌的特异性结果；
其中：1、GAS菌ATCC 19615(100ng/μL)；2、临床分离GAS菌的标本；3～15分别为无乳链球菌、星座链球菌、F群凝集链球菌、G群凝集链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、流感嗜血杆菌；
图3是实施例3中LAMP灵敏度检测结果；
其中：1～9分别为GAS菌ATCC 19615的DNA浓度为102～10-6ng/μL；
图4是实施例3中PCR灵敏度检测结果；
其中：M,DL2000DNA marker，1～7分别为GAS菌ATCC 19615的DNA浓度为102～10-4ng/μL；
图5是实施例4中LAMP目视检测临床标本结果；
其中：2、5、7、11、17、18号为LAMP实验阳性，其余为阴性。
图6是实施例5中LAMP目视检测结果；
其中，1、2、3、4号分别为实验组1、实验组2、实验组3、实验组4扩增结果，5号为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物试剂来源 
BstDNA聚合酶购自New England Biolabs公司；
实施例1
1、DNA提取
1.1靶DNA提取：GAS(来源于美国菌种保藏中心，菌种编号ATCC 19615)标准菌株接种于血琼脂平板培养基，CO2孵箱培养24小时，用取菌环刮取固体平板上的菌落，置于含0.2ml无菌双蒸水的EP管中，沸水浴8-10min，8000-12000rpm离心2-5min，取上清转移至新的EP管中，即为样本DNA，可直接用于LAMP反应。
1.2临床穿刺、抽吸或导管等液体样本的DNA提取：液体样本先10000-12000rpm离心5min，去上清，将沉淀与蒸馏水1：1混合后置沸水中水浴8-10min，8000-12000rpm离心2-5min，取上清转移至新的EP管中，即为样本DNA，可直接用于LAMP反应。
1.3拭子等样本的DNA提取：将咽部或其他化脓性分泌物拭子置于1ml蒸馏水中，充分震荡，弃去拭子，按照液体样本方法提取DNA(参见《Journal of Medical Microbiology,》中P444～451中的记载，出版号ISSN 0022-2615，出版日期2008)；
1.4痰液样本DAN提取：用无菌收集瓶收集痰标本，加入5倍体积的生理盐水，搅拌以去除唾液，然后用巴斯德吸管，将生理盐水吸去，加入等体积的痰消化溶液(1wt％胰蛋白酶溶于灭菌的0.01mol/l，pH 7.6的磷酸盐缓冲液)，摇动混合液以混匀，置37℃水浴约60分钟，至完全液化。再按照液体样本方法提取DNA。
1.5临床固体样本的DNA提取：固体样本置于1倍体积蒸馏水中，沸水浴8-10min， 8000-12000rpm离心2-5min，取上清转移至新的EP管中，即为样本DNA，可直接用于LAMP反应。
2引物设计及筛选
根据GAS speB基因的核酸序列，设计LAMP引物，引物组包括一对特异性内引物和一对特异性外引物和一条环引物，根据反应时间及特异性对不同引物的反应进程和结果进行监测、筛选，确定反应快、特异性高的最佳引物。然后根据最佳引物设计一环引物。引物序列见表1。
表1 引物序列及长度
3、LAMP反应体系
LAMP反应总体系为25μL，分别是，反应缓冲液(RM)12.5μL，荧光目视检测试剂(FD)1.0μL(0.00125μmol)，Bst DNA聚合酶1.0μL(320U/mL)，去离子水(DW)3.5μL，外引物F3、B3各1μL(5pmol/μL)，内引物FIP、BIP各1μL(40pmol/μL)，环引物LB 1μL(20pmol/μL)，待检DNA 2μL。反应前可根据所需的反应量将除待检DNA以外的试剂预混合，再分装，反应时各管加入2μL待检测DNA即可。
阳性对照：反应时在反应液中加入GAS标准菌株的DNA；
阴性对照：反应时在反应液中加入超纯水。
其中，反应缓冲液成分及含量见表2；
表2 反应缓冲液成分及浓度
4、试剂盒设置 
每个试剂盒中应包含检测管和对照管，最少应设置3个LAMP反应管(阳性对照、阴性对照和检测管)，本试剂盒设置10个LAMP反应管。试剂盒内含20个适配10-100μl移液器的Tip头。
试剂盒内含：若干个反应管(内含23μL反应液)、1管阳性对照DNA(内含10μL GAS标准菌株DNA)、1管阴性对照DNA(内含100μL无菌超纯水)。
5、反应条件 
将2μL待检DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阳性对照和阴性对照，阳性对照中加入GAS标准菌株DNA，阴性对照中加入无菌超纯水。将LAMP反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应30-60min。
6、结果判定 
在LAMP反应进行的过程中，随着大量DNA的合成，产生一种副产物焦磷酸根离子，其浓度与生成的DNA成正比。预先加入荧光染料，反应初期，显色液中的钙黄绿素与荧光淬灭剂锰离子结合而不发荧光。由于焦磷酸根离子更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素。游离的钙黄绿素可以自发荧光，在镁离子存在的条件下，这种荧光效果得到了加强。在自然光下可被裸眼观察到。扩增反应前，反应液为淡橙色，DNA被扩增后反应液变为绿色。因此从反应开始至结果判读均不需要打开反应管，可以有效避免因形成气溶胶而导致的DNA污染及假阳性的产生。
所以，反应液变为绿色的为阳性结果；本实验在35min时检测管与阳性对照管出现绿色浑浊的阳性结果，60min时阴性对照仍然浅橙色透明。若反应时间延长至60min以上，可能会出现假阳性，结果判定以60分钟之内为准。检测结果如图1所示。
实施例2
特异性试验:按照实施例1所述25μL扩增体系配制反应液，分别以化脓链球菌ATCC19615(标准菌株)、化脓链球菌(临床分离菌株)、无乳链球菌(临床分离菌株)、星座链球菌(临床分离菌株)、F群凝集链球菌(临床分离菌株)、G群凝集链球菌(临床分离菌株)、草绿色链球菌(临床分离菌株)、肺炎链球菌ATCC6305,、粪肠球菌ATCC29212、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假 单胞菌ATCC27853、表皮葡萄球菌ATCC12228、流感嗜血杆菌ATCC10211的粗提DNA为模板，进行LAMP扩增。
结果显示35分钟时，只有化脓链球菌标准菌株和临床分离菌株呈阳性，时间延长至60min其他菌株仍为阴性，表明本引物具有很高的特异性。结果如图2所示。
实施例3
用微量分光光度计检测化脓链球菌ATCC19615的DNA的浓度，并调整为100ng/μL，用双蒸水进行10倍连续倍比稀释，使DNA在反应体系中的分布为10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL、10-6ng/μL，然后分别进行LAMP与PCR扩增(利用LAMP反应2条外引物F3、B3分别作为PCR反应的上游引物与下游引物)，LAMP扩增结果显示第5管(0.01ng/μL)仍能出现阳性反应，说明本LAMP试剂盒灵敏度为0.01ng/μL。PCR扩增结果用1％琼脂糖凝胶电泳检测效果，结果如图所示，PCR检测灵敏度为1ng/μL，所以，本LAMP试剂盒灵敏度比传统PCR方法高100倍。结果如图3和图4所示。
实施例4
临床采集20份疑似化脓链球菌感染的标本，按上述提取方法获得DNA，用建立的LAMP检测试剂盒进行扩增，和经典细菌培养鉴定结果进行比较。结果显示本LAMP试剂盒鉴定出阳性标本6份，与培养鉴定结果的相符率为100％。结果如图5所示。
实施例5
取实施例1有化脓链球菌ATCC 19615标准菌株制备的样本DNA，采用如下试剂盒进行检测，操作方法的条件同实施例1步骤5的条件：
实验组1：
基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的试剂盒，包括：
特异引物组，包括一对特异性内引物、一对特异性外引物和一条环引物；所述特异性内引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述特异性外引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述环引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
反应液，采用文献常见LAMP方法浓度反应液：20mM Tris-HCl，10mM氯化钾，10mM硫酸铵，8mM硫酸镁，0.1wt％Tween-20，甜菜碱0.8M，dNTP浓度1.4mM。(参见王永,赵新等LAMP检测无乳链球菌方法的建立及应用，华北农学报·2009,24(5):234-238)
BstDNA聚合酶，反应浓度300U/mL；
实验组2
基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的试剂盒，包括：
特异引物组同实验组1；
反应液，组分如下：
40mM Tris-HCl，20mM氯化钾，20mM硫酸铵，16mM硫酸镁，0.2wt％Tween-20，甜菜碱1.6M，dNTP浓度2.8mM。
BstDNA聚合酶，反应浓度350U/mL；
实验组3
基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的试剂盒，包括：
特异引物组同实验组1；
反应液，组分如下：
40mM Tris-HCl，20mM氯化钾，20mM硫酸铵，16mM硫酸镁，0.2wt％Tween-20，甜菜碱1.6M，dNTP浓度2.5mM。
BstDNA聚合酶，浓度320U/mL。
实验组4
基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的试剂盒，包括：
特异引物组同实验组1；
反应液，组分如下：
40mM Tris-HCl，20mM氯化钾，20mM硫酸铵，16mM硫酸镁，0.2wt％Tween-20，甜菜碱1.6M，dNTP浓度3.0mM。
BstDNA聚合酶，反应浓度340U/mL；
荧光染料，锰离子鳌和型钙黄绿素，反应浓度为0.05μmol/mL。
从附图6可以看出，实验组1、实验组2、实验组3、实验组4结果的浑浊度逐渐增加，而且实验组4加了钙黄绿素以后，不但可以通过浑浊度，更可以通过颜色的变化来判断结果的阴阳性，更直观，更准确。
综上所述，采用本试剂盒检测，从取得样本到结果判定结束仅需1h左右，而传统培养鉴定需要经过接种、培养、血清凝集，至少需要24h后才能鉴定出结果，相比之下，本实验建立的目视环介导等温扩增快速检测化脓链球菌的的引物组及试剂盒具有高效快速、操作简单、特异性与敏感性高、结果判断直接等优点，可操作性强,适合于各级医院检验科对化脓链球菌的快速鉴定。

Claims (10)

1.基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的特异引物组，其特征在于，包括一对特异性内引物、一对特异性外引物和一条环引物；
所述特异性内引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述特异性外引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述环引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.权利要求1所述特异引物组在基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌中的应用。
3.权利要求1所述特异引物组在制备基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的试剂盒中的应用。
4.一种基于环介导等温扩增法检测化脓链球菌的试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1所述的特异引物组、反应液、BstDNA聚合酶。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的反应液组分如下：
40mM Tris-HCl，20mM氯化钾，20mM硫酸铵，16mM硫酸镁，0.2wt％Tween-20，甜菜碱1.5M～2.0M，dNTP浓度2.5～3.0mM。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的甜菜碱浓度为1.6M。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的dNTP的浓度为2.8mM。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光染料。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光染料为锰离子鳌和型钙黄绿素，反应浓度为0.02～0.10μmol/mL。
10.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的BstDNA聚合酶的反应浓度为300～350U/mL，优选320U/mL。
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