CN108559790B - 基于微流控芯片检测三种呼吸道病原体的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒以及使用方法，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针。本发明的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用TaqMan探针荧光PCR技术，针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌进行检测，设计引物和探针的序列在呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。

Description

基于微流控芯片检测三种呼吸道病原体的试剂盒及其使用 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒及其使用方法。
背景技术
呼吸道腺病毒(Respiratory Adenovirus,ADV)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,SP)和百日咳杆菌(Bordetella pertussis,BP)是造成儿童呼吸道疾病的常见病原体，对婴幼儿健康造成很大的威胁，ADV、SP和BP感染已成为全球性的问题。分子诊断技术可以满足对ADV、SP和BP快速诊断的需求，并且由于它们的遗传物质都为脱氧核糖核酸，样本提取后不需要进行逆转录过程，可以直接进行分子检测，所以能够快速、准确地进行病原体筛选，从而配合以正确的治疗，减少抗菌药物的滥用。
呼吸道腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，已知的有68种，分为A、B、C、D、E、F和G七个亚群，会引起呼吸道感染的主要为B组的3型、4型和7型。可以引起多种临床疾病，如感冒、支气管炎和肺炎，还可以导致急性发热性咽喉炎、咽结膜炎等疾病，5岁及以下儿童为易感人群。呼吸道腺病毒感染起病缓慢，首先表现为发热、咳嗽等，高热(39～41℃)持续8～14天，起病后3～4天出现呼吸困难，肺部体征出现较晚，可见肺外病症如肾病、肝肿大等。呼吸道腺病毒感染可能会很严重，尤其对免疫力低下的病人，会出现呼吸衰竭、传播性感染、出血性膀胱炎、神经性疾病，甚至死亡。呼吸道腺病毒常经空气飞沫传播，密切接触(手-鼻)传播等。多发生在冬末、春初，在婴幼儿、家庭、医院及新兵等群体中常可引起流行。
肺炎链球菌是革兰氏阳性菌，菌体似矛头状，成双或成短链状排列，5％～10％正常人上呼吸道中携带此菌，一般不致病；有毒株其致病性，与荚膜有密切关系，尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、年老体弱者易发生肺部感染。肺炎链球菌可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病，也是鼻窦炎、急性细菌性中耳炎和超过幼儿期的结膜炎的最常见原因。典型的大叶性肺炎起病急骤，病人有高烧、寒颤，开始时有阵发性干咳，不久有少量粘液痰，随后痰变黄色，呈粘脓性。据WHO估计，肺炎链球菌性疾病已经成为5岁以下儿童中疫苗可预防性疾病的首位致死因素，每年死于肺炎链球菌感染的人中5岁以下儿童占一半，甚至更多，发展中国家发生率与死亡率更高。
百日咳杆菌为革兰氏阴性菌，是小儿常见的急性呼吸道传染病，也能够感染青少年和成人。百日咳的特征为阵发性痉挛性咳嗽，咳嗽末伴有特殊的吸气吼声，病程较长，可达数周甚至3个月左右，故有百日咳之称。病人，尤其是症状轻微的非典型病人是重要的传染源，主要经飞沫传播。易感儿童接触病人后发病率接近90％，一岁以下患儿病死率高。百日咳潜伏期1～2周，发病早期(卡他期)仅有轻度咳嗽。细菌此时在气管和支气管粘膜上大量繁殖并随飞沫排出，传染性最大。1～2周后出现阵发性痉挛性咳嗽(痉挛期)，这时细菌释放毒素，导致粘膜上皮细胞纤毛运动失调，大量粘稠分泌物不能排出，刺激粘膜中的感受器产生强烈痉咳，呈现出特殊的高音调鸡鸣样吼声。形成的粘液栓子还能堵塞小支气管导致肺不张和呼吸困难、紫绀，此外可伴有呕吐、惊厥。4～6周后逐渐转入恢复期，阵咳减轻，趋向痊愈，但有1～10％病人易继发溶血性链球菌、流感杆菌等的感染。
现有技术针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的检测方法主要有分离培养法、免疫检测法、普通聚合酶链式反应(PCR)技术和荧光PCR法。培养法是把病原体在特定培养基上进行培养，再对产生的结果进行观察分析，例如从血液或胸腔积液培养分离获得肺炎链球菌仍是作为诊断的金标准。免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白。PCR法是核酸体外扩增技术，利用引物将待测目标基因在短时间内通过酶促化学反应扩增几十万甚至上百万倍。荧光PCR法是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因。
呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌感染已成为全球性的问题，对儿童健康造成很大的威胁，世界范围内对这三种病原体快速检测的需求也越来越高，而市场上的产品却少之又少，且暂无已注册的利用荧光PCR法进行检测的产品。
微流控芯片(microfluidics)或称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。这种技术原则上适用于从核酸、蛋白质直到有机、无机小分子的各种不同类型分子的反应、分离和检测。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点，它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。
目前利用荧光定量PCR法检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒市面上暂无已注册的同类产品，对这三种病原体的单项检测类产品也十分少，且全部为免疫检测法。但肺炎链球菌和百日咳杆菌有利用荧光PCR法检测的发明专利，其组成一般包括盐离子缓冲液、酶、引物、探针、质控品，以液态形式分管保存在-20℃下，使用时需要将多管试剂融化，按照一定的比例进行混合，配制成检测反应液，然后加入样本核酸，放入荧光定量PCR仪中进行检测，最后根据扩增曲线分析检测结果。
免疫法检测试剂针对的是样本中病原体引起机体产生的特异性抗体，抗体的检测有窗口期，在发病初期容易漏诊，且灵敏度、特异性较低，样本易污染且干扰物质较多，浓度过高或者过低时都容易造成结果错判，需要重复检测、复查才能确诊，检测的可信度较差；采用培养法检测耗时一般在一天以上，培养效果差，很多病原体无法培养，延误最佳治疗时机。
普通的荧光PCR检测试剂虽然具有较好的灵敏度和特异性，但是试剂盒一般为多管液态试剂构成，平时需要保存在-20℃环境中，在操作时需要将各管试剂按照比例混合使用，对于保存运输条件、操作方法等方面有较高的要求，容易因保存不当和操作失误引起检测结果不可信。同时由于甲型流感病毒和乙型流感病毒的亚型种类很多，检测试剂盒一般针对的是甲型流感病毒和乙型流感病毒最为常见的亚型，有时因为病毒毒株的变异，可能会产生漏检的情况。由于荧光定量PCR仪检测后的结果需要专业人员来对扩增曲线分析，有时候会有人为误差产生。最后，因为荧光定量PCR仪的升降速度较慢，检测时间一般在1～2个小时，耗时较长。
为了对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌进行快速准确检测，且能在各种环境中简便易用，需要一种基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒及其使用方法，并且要保证检测的时效性、特异性和灵敏度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种可同时快速检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌三种病原体的基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；
其中，特异性保守序列的引物序列为：
呼吸道腺病毒，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
肺炎链球菌，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
百日咳杆菌，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
特异性TaqMan探针序列为：
呼吸道腺病毒，SEQ ID NO.3；
肺炎链球菌，SEQ ID NO.6；
百日咳杆菌，SEQ ID NO.9。
上述技术方案的试剂盒可对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌进行快速准确检测，能在各种环境中简便易用，保证检测的时效性、特异性和灵敏度；针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌各自的保守序列上设计特异性引物探针，并在探针上标记荧光信号，可以同时检测并区分出呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌；由于采用微流控芯片进行扩增，增大了反应腔内液体的比表面积，且热传导更快，能使试剂迅速的进行升降温，并能通过仪器和芯片配合控制反应液的密闭性，避免污染泄漏；试剂盒中检测试剂为干粉状态，预装在微流控芯片中，在不同的反应腔内分别预装有检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的检测试剂干粉，可在4℃低温或常温下保存一年以上，不影响检测效果，使用时仅需加入提取好的核酸样本即可上机检测，解决了低温保存和使用操作繁琐的问题，方便易用；本发明的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用TaqMan探针荧光PCR技术，针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌进行检测，设计引物和探针的序列在呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。
其中，SEQ ID NO.1：CAGCTCAGTCGAATCGCA；
SEQ ID NO.2：CACATCAATCGACTCGCAG；
SEQ ID NO.3：GTCTGTAGAGAGGCTCTACGGC；
SEQ ID NO.4：GACTTGAGCTAGCACA；
SEQ ID NO.5：CTGATGCCTGTCTACGA；
SEQ ID NO.6：CTGTCTGACTGATCATCGTCCTCATC；
SEQ ID NO.7：CAGCGCTAGCTGCAATCC；
SEQ ID NO.8：GCTAGCTGGCTACTGAGC；
SEQ ID NO.9：CGTCCTAGACTAGCGTTCAATACAG。
优选的，所述预装干粉检测试剂还包括有PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl2、HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶。
采用了UNG酶/dUTP防污染体系，能减少前次PCR反应产物带来的污染干扰；将逆转录酶与HotStart Taq酶混合使用，先进行逆转录过程合成出cDNA，再进行PCR扩增，没有添加随机引物，过程一步完成，无需开盖，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。
本发明所使用的探针为荧光标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核昔酸。在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在荧光PCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时HotStart Taq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板RNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
优选的，所述引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50～500nM；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％w/v；所述HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度均为0.5U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均为0.1mM～2mM；所述MgCl2在扩增体系中的终浓度为1.5mM～10mM。
其中，M＝mol/L，是浓度单位；w/v为质量体积比；此外，酶的浓度是在一个反应体系里1U。
优选的，所述阳性质控品中含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的扩增基因序列的质粒。
优选的，所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片具有微流控流道，包括一条出样主流道以及若干条分样流道；各分样流道分体设置，每个分样流道对应一个反应腔，能等分各个反应腔的试剂。
本发明还提供一种所述预装干粉检测试剂的制备方法为：
(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到PCR管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；
(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：
-50℃，1h，1大气压；
-40℃，5h，＜10Pa；
-10℃，2h，＜10Pa；
0℃，2h，＜10Pa；
30℃，5h，＜10Pa；
(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。
采用上述方法将检测试剂处理为干粉形态，可预装在微流控芯片中，能够在4℃低温或常温下保存一年以上，不影响检测效果，使用时仅需加入样本即可上机检测，方便易用。
优选的，所述预装干粉检测试剂是预装在所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片中。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种采用前述试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：
(1)将样品DNA/RNA共提取模板200μL加入微流控核酸检测芯片的加样孔中，盖好加样孔盖，放入微流控芯片检测仪中检测；
(2)PCR扩增反应的条件为：
92～97℃预变性1～10min；
92～97℃变性5～10s，58～62℃退火延伸15～30s，30～45个循环；
(3)有效性判定：
阴性对照孔是未加引物探针的空白孔，检测结果应为阴性，且阳性对照孔检测出为阳性，否则实验视为无效；
(4)结果判读：
根据对应的反应腔的检测信号给出结果，直接判断呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的阴阳性结果。
优选地，所述步骤(1)中的所述样品DNA/RNA共提取模板是从人的痰液或/和鼻咽拭子样本中提取。
与现有技术相比，本发明与普通荧光PCR法、免疫法和细菌培养法等相比，具有以下优势：
1)特异性强：本发明的引物探针针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守区域序列设计，特异性强；
2)敏感性高：本发明能检测到10copies/μL浓度的目的基因序列；
3)易于保存：本发明的在微流控芯片内预装干粉试剂，保存方便；
4)分型检测：在一个芯片内区分呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌；
5)无污染：检测过程为封闭操作，大大降低了污染及结果偏差的可能性；
6)操作简单快速：无需配制检测试剂，仅需加样一次，即可上机检测，从标本送检到得出结果可在2个小时以内完成；
7)结果判读明确、客观；若需要亦可对结果进行定量分析；
8)安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作员和环境都无危害。
具体实施方式
实施例1：本实施例的基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片具有微流控流道，包括一条出样主流道以及若干条分样流道；各分样流道分体设置，每个分样流道对应一个反应腔，能等分各个反应腔的试剂；
其中，特异性保守序列的引物序列为：
呼吸道腺病毒，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
肺炎链球菌，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
百日咳杆菌，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
特异性TaqMan探针序列为：呼吸道腺病毒，SEQ ID NO.3；
肺炎链球菌，SEQ ID NO.6；
百日咳杆菌，SEQ ID NO.9；
所述预装干粉检测试剂还包括有：PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl2、HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶、
检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的干粉检测试剂预装到微流控核酸检测芯片不同的反应腔内；
检测试剂经过干燥工艺制成干粉形态，可预装于微流控芯片中；
具体的预装干粉检测试剂的制备方法为：
(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到PCR管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：
-50℃，1h，1大气压；
-40℃，5h，＜10Pa；
-10℃，2h，＜10Pa；
0℃，2h，＜10Pa；
30℃，5h，＜10Pa；
(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。
制备好的预装干粉检测试剂是预装在所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片中。
在本实施中，呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的引物在扩增体系中的终浓度优选为100nM；呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的TaqMan荧光探针在扩增体系中的终浓度优选为50nM；海藻糖在扩增体系中的终浓度优选为1％w/v；牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度优选为0.2％w/v；HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度均优选为1U；dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均优选为0.5mM；MgCl2在扩增体系中的终浓度优选为5.5mM；阳性质控品中含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的扩增基因序列的质粒；
试剂盒的操作和结果判定：
(1)将样品DNA/RNA共提取模板(从人的痰液、鼻咽拭子等样本中提取)200μL加入微流控核酸检测芯片的加样孔中，盖好加样孔盖，放入微流控芯片检测仪中检测；
(2)PCR扩增反应的条件为：
95℃预变性2min；
95℃变性10s，58℃退火延伸30s，40个循环；
上述PCR扩增反应的条件还可以进行这样选择：92～97℃预变性1～10min；92～97℃变性5～10s，58～62℃退火延伸15～30s，30～45个循环；
(3)有效性判定：
阴性对照孔是未加引物探针的空白孔，检测结果应为阴性，且阳性对照孔检测出为阳性，否则实验视为无效；
(4)结果判读：
1号反应腔的数据对应呼吸道腺病毒，2号反应腔的数据对应肺炎链球菌，3号反应腔的数据对应百日咳杆菌，仪器软件会把对应的反应腔的荧光强度值进行数据处理，直接判断呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的阴阳性结果。
实施例2：
用本发明的基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒检测4个样品，编号1～4，含有病原体核酸。1号样品含有呼吸道腺病毒核酸，2号样品含有肺炎链球菌核酸，3号样品含有百日咳杆菌核酸，4号样品只有正常人的核酸，不含呼吸道腺病毒或肺炎链球菌或百日咳杆菌的核酸。按照实施例1相同的方法进行检测操作，检测结果见表1。
表1：
样品编号 1号 2号 3号 4号
1号反应腔 + - - -
2号反应腔 - + - -
3号反应腔 - - + -
检测结果表明本试剂盒用在微流控芯片检测能够准确的检测并区分出呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌感染。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，例如引物在扩增体系中的终浓度在100～1000nM范围内进行选择，探针在扩增体系中的终浓度在50～500nM范围内进行选择，海藻糖在扩增体系中的终浓度在1％～10％范围内进行选择，牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度在0.1％～5％范围内进行选择，HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度均在0.5U～5U范围内进行选择，dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均在0.1mM～2mM范围内进行选择，MgCl2在扩增体系中的终浓度在1.5mM～10mM范围内进行选择，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 南京岚煜生物科技有限公司
<120> 基于微流控芯片检测三种呼吸道病原体的试剂盒及其使用方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 呼吸道腺病毒(respiratory syncytial virus)
<400> 1
cagctcagtc gaatcgca 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 呼吸道腺病毒(respiratory syncytial virus)
<400> 2
cacatcaatc gactcgcag 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 呼吸道腺病毒(respiratory syncytial virus)
<400> 3
gtctgtagag aggctctacg gc 22
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 4
gacttgagct agcaca 16
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 5
ctgatgcctg tctacga 17
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 6
ctgtctgact gatcatcgtc ctcatc 26
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 百日咳杆菌(Bordetella pertussis)
<400> 7
cagcgctagc tgcaatcc 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 百日咳杆菌(Bordetella pertussis)
<400> 8
gctagctggc tactgagc 18
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 百日咳杆菌(Bordetella pertussis)
<400> 9
cgtcctagac tagcgttcaa tacag 25

Claims (2)

1.一种基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；
其中，特异性保守序列的引物序列为：
呼吸道腺病毒，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
肺炎链球菌，SEQ ID NO.4 和SEQ ID NO.5；
百日咳杆菌，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
特异性TaqMan探针序列为：呼吸道腺病毒，SEQ ID NO.3；
肺炎链球菌，SEQ ID NO.6；
百日咳杆菌，SEQ ID NO.9；
所述预装干粉检测试剂还包括有PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl2、HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶；
所述引物在扩增体系中的终浓度为100nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50nM；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1%w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.2%w/v；所述HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为1U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均为0.5mM；所述MgCl2在扩增体系中的终浓度为5.5mM；
所述阳性质控品中含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的扩增基因序列的质粒；
所述预装干粉检测试剂的制备方法为：
（1）将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到PCR管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；（2）将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：
-50℃，1h，1大气压；
-40℃，5h，＜10Pa；
-10℃，2h，＜10Pa；
0℃，2h，＜10Pa；
30℃，5h，＜10Pa；
（3）干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态；
所述预装干粉检测试剂是预装在所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片中。
2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片具有微流控流道，包括一条出样主流道以及若干条分样流道；各分样流道分体设置，每个分样流道对应一个反应腔，能等分各个反应腔的试剂。
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