CN108411039B - 基于微流控芯片检测呼吸道合胞病毒a、b型的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

基于微流控芯片检测呼吸道合胞病毒a、b型的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明公开了一种基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒以及使用方法，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道合胞病毒A、B型的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针。本发明的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用TaqMan探针荧光PCR技术，针对呼吸道合胞病毒A、B型进行检测，设计引物和探针的序列在呼吸道合胞病毒A、B型的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。

Description

基于微流控芯片检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒及其使 用方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒及其使用方法。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是一种单链RNA病毒，属于副粘液病毒科，是造成世界范围内婴幼儿下呼吸道病毒性感染最常见的原因之一。由于RSV在细胞中可以引起细胞融合病变，根据它在细胞培养中的细胞病变特征命名为呼吸道合胞病毒。
RSV最显著的特征是每一次RSV感染只能调节以后感染的严重程度，产生的抗体并不能对机体产生永久性保护，因此RSV可反复感染。母传抗体也不能预防感染的发生，因而出生不久的小婴儿即可发病，常引起小儿间质性肺炎及毛细支气管炎，是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原体。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为毛细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为呼吸道感染。潜伏期3～7天，RSV感染有明显的季节性，主要暴发流行于冬春季节，每年的11月～次年2月为暴发流行的高峰季节。
呼吸道合胞病毒是由包裹负链RNA的核衣壳和包膜组成的，其基因组编码10种蛋白质，包括7种结构蛋白(G、F、M1、M2、P、L、N)和3种非结构蛋白(NS1、NS2、SH)，其中G蛋白和F蛋白位于病毒颗粒的表面，是主要的糖蛋白。RSV根据抗原性的不同可分为A、B两亚型，两亚型间的主要区别在于G蛋白的基因差异，G蛋白是RSV毒株中变异最大的蛋白，仅存在5％的抗原相关性。有文献报道，A亚型呼吸道合胞病毒相较于B亚型，具有更强的致病性，婴幼儿感染后，B亚型比A亚型对同型G蛋白的抗原反应更强烈且有效。
我国每隔数年会出现由呼吸道合胞病毒感染导致的流行性喘憋型肺炎，常造成数十万人发病，不同年份A、B亚型可以交替成为流行优势株。RSVA、RSVB亚型患儿均以咳嗽、喘息为主要症状，其次为鼻塞流涕、发热、呼吸困难，两亚型临床表现无明显差异。利用分子技术可以快速、准确地进行分型，避免误用或者滥用碱性药物，对呼吸道感染早期诊断以及正确治疗的意义十分重大。
目前市场上针对呼吸道合胞病毒的检测方法主要有病毒培养法、免疫检测法和荧光PCR法。培养法是把病原体在特定培养基上进行培养，再对产生的结果进行观察分析。免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白。荧光PCR法是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因。
微流控芯片(microfluidics)或称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。这种技术原则上适用于从核酸、蛋白质直到有机、无机小分子的各种不同类型分子的反应、分离和检测。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点,它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。
目前市面上暂无利用荧光定量PCR法检测呼吸道合胞病毒A型、B型的同类试剂盒，但有这两种病原体单项或者包含这两种病原体的多项检测荧光定量PCR法试剂盒的发明专利，可以作为参照进行比对。其组成一般包括盐离子缓冲液、酶、引物、探针、质控品，以液态形式分管保存在-20℃下，使用时需要将多管试剂融化，按照一定的比例进行混合，配制成检测反应液，然后加入样本核酸，放入荧光定量PCR仪中进行检测，最后根据扩增曲线分析检测结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种可同时快速检测呼吸道合胞病毒A、B型的基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道合胞病毒A、B型的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；
其中，特异性保守序列的引物序列为：
呼吸道合胞病毒A型，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
呼吸道合胞病毒B型，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
特异性TaqMan探针序列为：
呼吸道合胞病毒A型，SEQ ID NO.3；
呼吸道合胞病毒B型，SEQ ID NO.6。
上述技术方案的试剂盒可对呼吸道合胞病毒A、B型进行快速准确检测，能在各种环境中简便易用，保证检测的时效性、特异性和灵敏度；针对呼吸道合胞病毒A、B型各自的保守序列上设计特异性引物探针，并在探针上标记荧光信号，可以同时检测并区分出呼吸道合胞病毒A、B型；由于采用微流控芯片进行扩增，增大了反应腔内液体的比表面积，且热传导更快，能使试剂迅速的进行升降温，并能通过仪器和芯片配合控制反应液的密闭性，避免污染泄漏；试剂盒中检测试剂为干粉状态，预装在微流控芯片中，在不同的反应腔内分别预装有检测呼吸道合胞病毒A、B型的检测试剂干粉，可在4℃低温或常温下保存，使用时仅需加入提取好的核酸样本即可上机检测，解决了低温保存和使用操作繁琐的问题；本发明的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用TaqMan探针荧光PCR技术，针对呼吸道合胞病毒A、B型进行检测，设计引物和探针的序列在呼吸道合胞病毒A、B型的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。
其中，SEQ ID NO.1：CCATTCGCATCTCGCGTT；
SEQ ID NO.2：CATCGCACGTCAACAACG；
SEQ ID NO.3：GTAGGCTACATGTGGAAGAATGC；
SEQ ID NO.4：GTACACAAGGCTCCACAA；
SEQ ID NO.5：CGTATGATGTGTTGTAGCA；
SEQ ID NO.6：CTGTACAACTGTTCACACGTCTAGAA。
优选的，所述预装干粉检测试剂还包括有PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl2、HotStart Taq酶、逆转录酶和UNG酶。
采用了UNG酶/dUTP防污染体系，能减少前次PCR反应产物带来的污染干扰；将逆转录酶与HotStart Taq酶混合使用，先进行逆转录过程合成出cDNA，再进行PCR扩增，没有添加随机引物，过程一步完成，无需开盖，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。
所使用的探针为荧光标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核昔酸。在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在荧光PCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时HotStart Taq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板RNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
优选的，所述引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50～500nM；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％w/v；所述HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度均为0.5U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均为0.1mM～2mM；所述MgCl2在扩增体系中的终浓度为1.5mM～10mM。
其中，M＝mol/L，是浓度单位；w/v为质量体积比；此外，酶的浓度是在一个反应体系里1U。
优选的，所述阳性质控品中含有呼吸道合胞病毒A、B型的扩增基因序列的质粒。
优选的，所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片具有微流控流道，包括一条出样主流道以及若干条分样流道；各分样流道分体设置，每个分样流道对应一个反应腔，能等分各个反应腔的试剂。
优选的，所述预装干粉检测试剂的制备方法为：
(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到PCR管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；
(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：
-50℃，1h，1大气压；
-40℃，5h，＜10Pa；
-10℃，2h，＜10Pa；
0℃，2h，＜10Pa；
30℃，5h，＜10Pa；
(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。
采用上述方法将检测试剂处理为干粉形态，可预装在微流控芯片中，能够在4℃低温或常温下保存一年以上，不影响检测效果，使用时仅需加入样本即可上机检测，方便易用。
优选的，所述预装干粉检测试剂是预装在所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片中。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种采用前述试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：
(1)将样品DNA/RNA共提取模板200μL加入微流控核酸检测芯片的加样孔中，盖好加样孔盖，放入微流控芯片检测仪中检测；
(2)PCR扩增反应的条件为：
92～97℃预变性1～10min；
92～97℃变性5～10s，58～62℃退火延伸15～30s，30～45个循环；
(3)有效性判定：
阴性对照孔是未加引物探针的空白孔，检测结果应为阴性，且阳性对照孔检测出为阳性，否则实验视为无效；
(4)结果判读：
根据对应的反应腔的检测信号给出结果，直接判断呼吸道合胞病毒A型、B型的阴阳性结果。
优选的，所述步骤(1)中的样本从人的痰液或鼻咽拭子中提取。
本发明与普通荧光PCR法、免疫法和细菌培养法等相比，具有以下优势：
1.特异性强：本发明的引物探针针对呼吸道合胞病毒A型、B型的特异性保守区域序列设计，特异性强。
2.敏感性高：本发明能检测到10copies/μL浓度的目的基因序列。
3.易于保存：本发明的在微流控芯片内预装干粉试剂，保存方便。
4.分型检测：在一个芯片内区分呼吸道合胞病毒A型、B型。
5.无污染：检测过程为封闭操作，大大降低了污染及结果偏差的可能性。
6.操作简单快速：无需配制检测试剂，仅需加样一次，即可上机检测，从标本送检到得出结果可在2个小时以内完成。
7.结果判读明确、客观；若需要亦可对结果进行定量分析。
8.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作员和环境都无危害。
具体实施方式
实施例1：本实施例的基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道合胞病毒A、B型的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片具有微流控流道，包括一条出样主流道以及若干条分样流道；各分样流道分体设置，每个分样流道对应一个反应腔，能等分各个反应腔的试剂；
其中，特异性保守序列的引物序列为：
呼吸道合胞病毒A型，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
呼吸道合胞病毒B型，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
特异性TaqMan探针序列为：
呼吸道合胞病毒A型，SEQ ID NO.3；
呼吸道合胞病毒B型，SEQ ID NO.6。
所述预装干粉检测试剂还包括有PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl2、HotStart Taq酶、逆转录酶和UNG酶。
检测呼吸道合胞病毒A、B型的干粉检测试剂预装到微流控核酸检测芯片不同的反应腔内；
检测试剂经过干燥工艺制成干粉形态，可预装于微流控芯片中；
具体的预装干粉检测试剂的制备方法为：
(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到PCR管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；
(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：
-50℃，1h，1大气压；
-40℃，5h，＜10Pa；
-10℃，2h，＜10Pa；
0℃，2h，＜10Pa；
30℃，5h，＜10Pa；
(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。
制备好的预装干粉检测试剂是预装在所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片中。
在本实施中，呼吸道合胞病毒A、B型的特异性保守序列的引物在扩增体系中的终浓度优选为100nM；呼吸道合胞病毒A、B型的特异性保守序列的TaqMan荧光探针在扩增体系中的终浓度优选为50nM；海藻糖在扩增体系中的终浓度优选为1％w/v；牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度优选为0.2％w/v；HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度均优选为1U；dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均优选为0.5mM；MgCl2在扩增体系中的终浓度优选为5.5mM；阳性质控品中含有呼吸道合胞病毒A、B型的扩增基因序列的质粒；
试剂盒的操作和结果判定：
(1)将样品DNA/RNA共提取模板(从人的痰液、鼻咽拭子等样本中提取)200μL加入微流控核酸检测芯片的加样孔中，盖好加样孔盖，放入微流控芯片检测仪中检测；
(2)PCR扩增反应的条件为：
95℃预变性2min；
95℃变性10s，58℃退火延伸30s，40个循环；
上述PCR扩增反应的条件还可以进行这样选择：92～97℃预变性1～10min；92～97℃变性5～10s，58～62℃退火延伸15～30s，30～45个循环；
(3)有效性判定：
阴性对照孔是未加引物探针的空白孔，检测结果应为阴性，且阳性对照孔检测出为阳性，否则实验视为无效；
(4)结果判读：
1号反应腔的数据对应合胞病毒A型，2号反应腔的数据对应合胞病毒B型，仪器软件会把对应的反应腔的荧光强度值进行数据处理，直接判断呼吸道合胞病毒A型、B型的阴阳性结果。
实施例2
用微流控芯片检测4个样品，编号1～4。1号样品含有合胞病毒A型核酸，2号样品含有合胞病毒B型核酸，3号样品含有合胞病毒A型和B型核酸，4号样品只有正常人的核酸，不含合胞病毒A型或B型的核酸。按照实施例1相同的方法进行检测操作，检测结果见表1。
表1
样品编号 1号 2号 3号 4号
1号反应腔 + - + -
2号反应腔 - + + -
检测结果表明本试剂盒用在微流控芯片检测能够准确的检测并区分出呼吸道合胞病毒A型、B型感染。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，例如引物在扩增体系中的终浓度在100～1000nM范围内进行选择，探针在扩增体系中的终浓度在50～500nM范围内进行选择，海藻糖在扩增体系中的终浓度在1％～10％范围内进行选择，牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度在0.1％～5％范围内进行选择，HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度均在0.5U～5U范围内进行选择，dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均在0.1mM～2mM范围内进行选择，MgCl2在扩增体系中的终浓度在1.5mM～10mM范围内进行选择，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 南京岚煜生物科技有限公司
<120> 基于微流控芯片检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒及其使用方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒A型(respiratory syncytial virus)
<400> 1
ccattcgcat ctcgcgtt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒A型(respiratory syncytial virus)
<400> 2
catcgcacgt caacaacg 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒A型(respiratory syncytial virus)
<400> 3
gtaggctaca tgtggaagaa tgc 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒B型(respiratory syncytial virus)
<400> 4
gtacacaagg ctccacaa 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒B型(respiratory syncytial virus)
<400> 5
cgtatgatgt gttgtagca 19
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒B型(respiratory syncytial virus)
<400> 6
ctgtacaact gttcacacgt ctagaa 26

Claims (2)

1.一种基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道合胞病毒A、B型的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；
其中，特异性保守序列的引物序列为：
呼吸道合胞病毒A型，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
呼吸道合胞病毒B型，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
特异性TaqMan探针序列为：
呼吸道合胞病毒A型，SEQ ID NO.3；
呼吸道合胞病毒B型，SEQ ID NO.6；
所述预装干粉检测试剂还包括有PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl2、HotStart Taq酶、逆转录酶和UNG酶；
所述引物在扩增体系中的终浓度为100nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50nM；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.2％w/v；所述HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为1U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均为0.5mM；所述MgCl2在扩增体系中的终浓度为5.5mM；
所述阳性质控品中含有呼吸道合胞病毒A、B型的扩增基因序列的质粒；
所述预装干粉检测试剂的制备方法为：
(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到PCR管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；
(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：
-50℃，1h，1大气压；
-40℃，5h，＜10Pa；
-10℃，2h，＜10Pa；
0℃，2h，＜10Pa；
30℃，5h，＜10Pa；
(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态；
所述预装干粉检测试剂是预装在所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片中。
2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒，其特征在于，所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片具有微流控流道，包括一条出样主流道以及若干条分样流道；各分样流道分体设置，每个分样流道对应一个反应腔，能等分各个反应腔的试剂。
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