CN104313167A - 快速鉴定b族链球菌兼检测其耐药性的引物及方法及引物应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物及方法及引物应用。四对特异性引物分别是：鉴定B族链球菌的cfb基因引物对cfb-F和cfb-R；检测B族链球菌对大环类酯类耐药性的ermB基因引物对ermB-F和ermB-R；检测B族链球菌对大环类酯类耐药性的mefA/E基因引物对mefA/E-F和mefA/E-R；检测B族链球菌对林可酰胺类耐药性的linB基因引物对linB-F和linB-R。该方法包括：步骤一，DNA提取；步骤二，引物设计；步骤三，基因的扩增；步骤四，结果判读。本发明能鉴定孕妇生殖道的GBS并同时检测GBS对红霉素、克林霉素的耐药性，从而指导临床用药。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物及方法及引物应用。
背景技术
B族链球菌（Group B Streptococci，GBS），又称无乳链球菌，可引起新生儿肺炎、脑膜炎、败血症等疾病。新生儿患有GBS感染与母亲生殖道的GBS定植关系密切，美国疾病控制与预防中心（CDC）的指导方针推荐对妊娠35-37周的孕妇进行GBS定植筛查和抗生素预防治疗，青霉素是首选药物。据文献报道，有12%的孕妇对青霉素过敏，对青霉素过敏的孕妇如果克林霉素药敏试验敏感，美国CDC推荐克林霉素作为青霉素过敏的孕妇的替代用药。
目前，孕妇生殖道微生物菌群种类多，环境复杂，传统的GBS检测方法特异性不高，灵敏度低。现有技术中对B族链球菌的检测方法主要依靠常规的细菌学培养方法，检测耗时一般需要2~3天，其存在操作繁琐、耗时长的缺点；B族链球菌的耐药性检测依靠药敏纸片试验结果，该方法试验耗时长，受人为因素、培养基质量、药敏纸片含药的准确性和均匀性的影响较大，存在操作繁琐，快速性、准确性方面不足等缺点。因此，现有技术难以有效对孕妇进行产前GBS筛查和抗生素预防。
另外，现有技术中仅有鉴定GBS的分子生物学试剂盒，即现有技术是利用GBS的分子生物学试剂盒对GBS进行鉴定，但是，现有技术在对GBS进行鉴定的过程中，并不能同时检测GBS的耐药性。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法。
本发明的目的之三在于针对现有技术的不足，提供引物在快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的应用。
为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
提供快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物，包括由四对特异性引物构成的引物对组；
所述四对特异性引物分别是：用于鉴定B族链球菌的cfb基因引物对cfb-F和cfb-R；用于检测B族链球菌对大环类酯类耐药性的ermB 基因引物对ermB-F和ermB-R；用于检测B族链球菌对大环类酯类耐药性的mefA/E基因引物对mefA/E-F和mefA/E-R；用于检测B族链球菌对林可酰胺类耐药性的linB基因引物对linB-F和linB-R。
所述四对特异性引物的基因序列如下：
cfb-F：5’-TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA-3’
cfb-R：5’-GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT-3’
ermB-F：5’-GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA-3’
ermB-R：5’-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC-3’
mefA/E-F：5’-AGT ATC ATT AAT CAC TAG TGC-3’
mefA/E-R：5’-TTC TTC TGG TAC TAA AAG TGG-3’
linB-F：5’-CCT ACC TAT TGT TTG TGG AA-3’
linB-R：5’-ATA ACG TTA CTC TCC TAT TC-3’。
为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
提供快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，它是利用上述所述的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物进行快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，它包括以下步骤：
步骤一，DNA提取：利用细菌核酸提取试剂盒，对B族链球菌的DNA进行提取；并测定所提取到的DNA的浓度；
步骤二，引物设计：根据B族链球菌的cfb基因序列、大环类酯类耐药性的ermB 基因序列和mefA/E基因序列、林可酰胺类耐药性的linB基因序列进行特异性PCR引物序列的设计；设计的四对特异性引物的基因序列如下：
cfb-F：5’-TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA-3’
cfb-R：5’-GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT-3’
ermB-F：5’-GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA-3’
ermB-R：5’-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC-3’
mefA/E-F：5’-AGT ATC ATT AAT CAC TAG TGC-3’
mefA/E-R：5’-TTC TTC TGG TAC TAA AAG TGG-3’
linB-F：5’-CCT ACC TAT TGT TTG TGG AA-3’
linB-R：5’-ATA ACG TTA CTC TCC TAT TC-3’；
步骤三，基因的扩增：采用步骤二所设计的四对特异性引物对步骤一提取的B族链球菌的DNA进行多重PCR扩增，得到PCR反应产物；
步骤四，结果判读：将步骤三得到的PCR反应产物分别进行电泳，然后利用凝胶成像仪进行成像，并对成像结果进行判读：
如果仅出现cfb基因条带，表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类、林可酰胺类和链阳性霉素B类均无耐药性；
如果同时出现cfb基因条带和ermB基因条带，则表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类、林可酰胺类和链阳性霉素B类均有耐药性，耐药表型分为cMLSB（组成性对MLSB耐药）或iMLSB（诱导性对MLSB耐药）；
如果同时出现cfb基因条带和mefA/E基因条带，则表示GBS阳性，该GBS仅对大环内酯类有耐药性，耐药表型为M（大环内脂类、链阳性霉素B耐药，林可酰胺类敏感）；
如果同时出现cfb基因条带和linB基因条带，则表示GBS阳性，该GBS对林可酰胺类有耐药性，耐药表型为L（克林霉素耐药，红霉素敏感或中介）；
如果同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、mefA/E基因条带；或同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、linB基因条带；或同时出现cfb基因条带、mefA/E基因条带、linB基因条带；或同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、mefA/E基因条带、linB基因条带，则表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类和林可酰胺类均有耐药性。
上述技术方案中，所述步骤三中，所述多重PCR的反应体系以总量20μL~30μL计包括：Mixtiplex pcr mix2 10μL~15μL、Mixtiplex pcr mix1Taq酶 0.1μL~0.5μL、linB-F和linB-R引物各0.5μL~2μL、mefA/E-F和mefA/E-R引物各0.2μL~0.8μL、ermB-F和ermB-R引物各0.1μL~0.9μL、cfb-F和cfb-R引物各 0.05μL~0.5μL、DNA 0.5μL~4μL、无菌去离子水余量；
其中，Mixtiplex pcr mix2、Mixtiplex pcr mix1Taq酶、linB-F和linB-R引物、mefA/E-F和mefA/E-R引物、ermB-F和ermB-R引物、cfb-F和cfb-R引物的浓度均为8μM~12μM。
上述技术方案中，所述步骤三中，所述多重PCR的反应体系以总量25μL计包括：Mixtiplex pcr mix2 12.5μL、Mixtiplex pcr mix1Taq酶 0.23μL、linB-F和linB-R引物各1μL、mefA/E-F和mefA/E-R引物各0.5μL、ermB-F和ermB-R引物各0.3μL、cfb-F和cfb-R引物各0.1μL、DNA 1μL、无菌去离子水余量；
其中，Mixtiplex pcr mix2、Mixtiplex pcr mix1Taq酶、linB-F和linB-R引物、mefA/E-F和mefA/E-R引物、ermB-F和ermB-R引物、cfb-F和cfb-R引物的浓度均为10μM。
上述技术方案中，所述步骤三中，所述多重PCR扩增的程序为：94℃预变性60s； 94℃变形30s、53℃退火90s、72℃延伸30s，共30个循环；72℃后延伸10min。
上述技术方案中，所述步骤一中，所述细菌核酸提取试剂盒为MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0细菌核酸提取试剂盒；测定所提取到的DNA的浓度是采用核酸蛋白含量测定仪进行测定。
上述技术方案中，所述步骤二中，所述引物设计是根据GeneBank收录的B族链球菌的cfb基因序列、大环类酯类耐药性的ermB 基因序列和mefA/E基因序列、林可酰胺类耐药性的linB基因序列，利用Primer软件和Oligo6.0软件进行特异性PCR引物序列的设计。
上述技术方案中，所述步骤四中，将5μL PCR反应产物与1μL 6×loadingbuffer混匀，然后于100V/cm~120 V/cm的电压下采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳20min~40min。
为了实现上述目的之三，本发明采用如下技术方案：
提供引物在快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的应用，所述引物为上述所述的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物。
本发明与现有技术相比较，有益效果在于：
（1）本发明提供的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物，具有特异性强和敏感性高的优点，能够快速鉴定B族链球菌兼能同时检测B族链球菌对大环类酯类（如红霉素）和林可酰胺类（如克林霉素）的耐药性，具有非常重要的应用价值。
（2）本发明提供的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，通过多重PCR扩增，能够一次性同时扩增编码B族链球菌CAMP因子的基因cfb，介导B族链球菌大环类酯类耐药的基因 ermB、mefA/E，介导B族链球菌林可酰胺类耐药的基因linB，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，能对分离自孕妇生殖道的GBS进行鉴定并同时检测GBS对红霉素、克林霉素的耐药性，从而指导临床对青霉素过敏的孕妇合理及时地运用克林霉素等二线药物。
（3）本发明提供的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，克服了常规GBS鉴定操作繁琐及K-B药敏纸片法试验耗时长，受人为因素、培养基质量、药敏纸片含药的准确性和均匀性的影响较大，在快速性、准确性方面不足等缺点。
（4）本发明提供的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，具有特异性和灵敏性高的优点，且具有节约试剂及器材的经济性特点，还具有能够同时检出多个基因所带来的迅速性的优点，因此，该方法操作简单，简便易行，适合医院检验科对孕妇进行GBS筛查及其药物敏感性分析，指导临床及时合理用药，具有非常重要的应用价值。
附图说明
图1是四对特异性引物的浓度优化的结果图。图中，1~5和M分别代表如下内容：
M是Maker；
1：linB 0.4μM，mefA 0.2 μM，ermB 0.12μM，cfb 0.04μM；
2：linB 0.4μM，mefA 0.2 μM，ermB 0.12μM，cfb 0.08μM；
3：linB 0.4μM，mefA 0.2 μM，ermB 0.12μM，cfb 0.12μM；
4：linB 0.4μM，mefA 0.2 μM，ermB 0.12μM，cfb 0.16μM；
5：linB 0.4μM，mefA 0.2 μM，ermB 0.12μM，cfb 0.2 μM。
图2是Taq酶量优化的PCR电泳图。图中M是Maker，1~6分别对应Taq酶0.08μL、0.13μL、0.18μL、0.23μL、0.28μL、0.33μL。
图3是退火温度优化的PCR电泳图，图中M是Maker，1~9分别对应退火温度49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃。
图4是将PCR反应产物与6×loadingbuffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图。图中M是Maker，1~4分别对应B族链球菌cfb基因，红霉素耐药基因mefA/E，红霉素耐药基因ermB，克林霉素耐药基因linB ；5~8分别对应GBS cfb和mefA/E基因，GBS cfb和ermB基因，GBS cfb、mefA/E和ermB基因，GBS cfb、mefA/E、ermB和 linB。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
其中，本发明提及的GenBank是美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information ，NCBI)建立的DNA序列数据库。
其中，本发明提及的μM中的M是指mol/L。
实施例1。
快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物，包括由四对特异性引物构成的引物对组；
其中，四对特异性引物分别是：用于鉴定B族链球菌的cfb基因引物对cfb-F和cfb-R；用于检测B族链球菌对大环类酯类耐药性的ermB 基因引物对ermB-F和ermB-R；用于检测B族链球菌对大环类酯类耐药性的mefA/E基因引物对mefA/E-F和mefA/E-R；用于检测B族链球菌对林可酰胺类耐药性的linB基因引物对linB-F和linB-R。其中，大环类酯类，如红霉素；林可酰胺类，如克林霉素；
本实施例中，四对特异性引物的基因序列如下：
cfb-F：5’-TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA-3’
cfb-R：5’-GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT-3’
ermB-F：5’-GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA-3’
ermB-R：5’-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC-3’
mefA/E-F：5’-AGT ATC ATT AAT CAC TAG TGC-3’
mefA/E-R：5’-TTC TTC TGG TAC TAA AAG TGG-3’
linB-F：5’-CCT ACC TAT TGT TTG TGG AA-3’
linB-R：5’-ATA ACG TTA CTC TCC TAT TC-3’。
实施例2。
快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，它是利用实施例1的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物进行快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，它包括以下步骤：
步骤一，DNA提取：利用MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0细菌核酸提取试剂盒，对B族链球菌的DNA进行提取；并采用核酸蛋白含量测定仪测定所提取到的DNA的浓度；
步骤二，引物设计：根据GeneBank收录的B族链球菌的cfb基因序列、大环类酯类耐药性的ermB 基因序列和mefA/E基因序列、林可酰胺类耐药性的linB基因序列，利用Primer软件和Oligo6.0软件进行特异性PCR引物序列的设计；设计的四对特异性引物的基因序列如下：
cfb-F：5’-TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA-3’
cfb-R：5’-GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT-3’
ermB-F：5’-GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA-3’
ermB-R：5’-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC-3’
mefA/E-F：5’-AGT ATC ATT AAT CAC TAG TGC-3’
mefA/E-R：5’-TTC TTC TGG TAC TAA AAG TGG-3’
linB-F：5’-CCT ACC TAT TGT TTG TGG AA-3’
linB-R：5’-ATA ACG TTA CTC TCC TAT TC-3’；
步骤三，基因的扩增：采用步骤二所设计的四对特异性引物对步骤一提取的B族链球菌的DNA进行多重PCR扩增，得到PCR反应产物；
本实施例中，多重PCR的反应体系以总量25μL计包括：Mixtiplex pcr mix2 12.5μL、Mixtiplex pcr mix1Taq酶 0.23μL、linB-F和linB-R引物各1μL、mefA/E-F和mefA/E-R引物各0.5μL、ermB-F和ermB-R引物各0.3μL、cfb-F和cfb-R引物各0.1μL、DNA 1μL、无菌去离子水余量；
其中，Mixtiplex pcr mix2、Mixtiplex pcr mix1Taq酶、linB-F和linB-R引物、mefA/E-F和mefA/E-R引物、ermB-F和ermB-R引物、cfb-F和cfb-R引物的浓度均为10μM。
其中，多重PCR扩增的程序为：94℃预变性60s；94℃变性30s、53℃退火90s、72℃延伸30s，共30个循环；72℃后延伸10min。
步骤四，结果判读：将5μL PCR反应产物与1μL 6×loadingbuffer混匀，然后于110V/cm的电压下采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳30min，然后利用凝胶成像仪进行成像，并对成像结果进行判读：
如果仅出现cfb基因条带（153bp），表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类、林可酰胺类和链阳性霉素B类均无耐药性；
如果同时出现cfb基因条带和ermB基因条带（639bp），则表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类（如红霉素）、林可酰胺类（如克林霉素）和链阳性霉素B类（MLSB）均有耐药性，耐药表型分为cMLSB（其中，cMLSB是指：组成性对MLSB耐药）或iMLSB（其中，iMLSB是指：诱导性对MLSB耐药）；
如果同时出现cfb基因条带和mefA/E基因条带（346bp），则表示GBS阳性，该GBS仅对大环内酯类有耐药性，耐药表型为M（大环内脂类、链阳性霉素B耐药，林可酰胺类敏感）；
如果同时出现cfb基因条带和linB基因条带（944bp），则表示GBS阳性，该GBS对林可酰胺类有耐药性，耐药表型为L（克林霉素耐药，红霉素敏感或中介）；
如果同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、mefA/E基因条带；或同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、linB基因条带；或同时出现cfb基因条带、mefA/E基因条带、linB基因条带；或同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、mefA/E基因条带、linB基因条带，则表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类和林可酰胺类均有耐药性。
实施例3。
快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，它是利用实施例1的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物进行快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，它包括以下步骤：
步骤一，DNA提取：利用MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0细菌核酸提取试剂盒，对B族链球菌的DNA进行提取；并采用核酸蛋白含量测定仪测定所提取到的DNA的浓度；
步骤二，引物设计：根据GeneBank收录的B族链球菌的cfb基因序列、大环类酯类耐药性的ermB 基因序列和mefA/E基因序列、林可酰胺类耐药性的linB基因序列，利用Primer软件和Oligo6.0软件进行特异性PCR引物序列的设计；设计的四对特异性引物的基因序列如下：
cfb-F：5’-TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA-3’
cfb-R：5’-GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT-3’
ermB-F：5’-GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA-3’
ermB-R：5’-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC-3’
mefA/E-F：5’-AGT ATC ATT AAT CAC TAG TGC-3’
mefA/E-R：5’-TTC TTC TGG TAC TAA AAG TGG-3’
linB-F：5’-CCT ACC TAT TGT TTG TGG AA-3’
linB-R：5’-ATA ACG TTA CTC TCC TAT TC-3’；
步骤三，基因的扩增：采用步骤二所设计的四对特异性引物对步骤一提取的B族链球菌的DNA进行多重PCR扩增，得到PCR反应产物；
本实施例中，多重PCR的反应体系以总量20μL计包括：Mixtiplex pcr mix2 10μL、Mixtiplex pcr mix1Taq酶0.1μL、linB-F和linB-R引物各0.5μL、mefA/E-F和mefA/E-R引物各0.2μL、ermB-F和ermB-R引物各0.1μL、cfb-F和cfb-R引物各 0.05μL、DNA 0.5μL、无菌去离子水余量；
其中，Mixtiplex pcr mix2、Mixtiplex pcr mix1Taq酶、linB-F和linB-R引物、mefA/E-F和mefA/E-R引物、ermB-F和ermB-R引物、cfb-F和cfb-R引物的浓度均为8μM。
其中，多重PCR扩增的程序为：94℃预变性60s；94℃变性30s、53℃退火90s、72℃延伸30s，共30个循环；72℃后延伸10min。
步骤四，结果判读：将5μL PCR反应产物与1μL 6×loadingbuffer混匀，然后于100V/cm的电压下采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳40min，然后利用凝胶成像仪进行成像，并对成像结果进行判读：
如果仅出现cfb基因条带（153bp），表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类、林可酰胺类和链阳性霉素B类均无耐药性；
如果同时出现cfb基因条带和ermB基因条带（639bp），则表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类（如红霉素）、林可酰胺类（如克林霉素）和链阳性霉素B类（MLSB）均有耐药性，耐药表型分为cMLSB（其中，cMLSB是指：组成性对MLSB耐药）或iMLSB（其中，iMLSB是指：诱导性对MLSB耐药）；
如果同时出现cfb基因条带和mefA/E基因条带（346bp），则表示GBS阳性，该GBS仅对大环内酯类有耐药性，耐药表型为M（大环内脂类、链阳性霉素B耐药，林可酰胺类敏感）；
如果同时出现cfb基因条带和linB基因条带（944bp），则表示GBS阳性，该GBS对林可酰胺类有耐药性，耐药表型为L（克林霉素耐药，红霉素敏感或中介）；
如果同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、mefA/E基因条带；或同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、linB基因条带；或同时出现cfb基因条带、mefA/E基因条带、linB基因条带；或同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、mefA/E基因条带、linB基因条带，则表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类和林可酰胺类均有耐药性。
实施例4。
快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，它是利用实施例1的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物进行快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，它包括以下步骤：
步骤一，DNA提取：利用MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0细菌核酸提取试剂盒，对B族链球菌的DNA进行提取；并采用核酸蛋白含量测定仪测定所提取到的DNA的浓度；
步骤二，引物设计：根据GeneBank收录的B族链球菌的cfb基因序列、大环类酯类耐药性的ermB 基因序列和mefA/E基因序列、林可酰胺类耐药性的linB基因序列，利用Primer软件和Oligo6.0软件进行特异性PCR引物序列的设计；设计的四对特异性引物的基因序列如下：
cfb-F：5’-TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA-3’
cfb-R：5’-GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT-3’
ermB-F：5’-GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA-3’
ermB-R：5’-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC-3’
mefA/E-F：5’-AGT ATC ATT AAT CAC TAG TGC-3’
mefA/E-R：5’-TTC TTC TGG TAC TAA AAG TGG-3’
linB-F：5’-CCT ACC TAT TGT TTG TGG AA-3’
linB-R：5’-ATA ACG TTA CTC TCC TAT TC-3’；
步骤三，基因的扩增：采用步骤二所设计的四对特异性引物对步骤一提取的B族链球菌的DNA进行多重PCR扩增，得到PCR反应产物；
本实施例中，多重PCR的反应体系以总量30μL计包括：Mixtiplex pcr mix2 15μL、Mixtiplex pcr mix1Taq酶0.5μL、linB-F和linB-R引物各2μL、mefA/E-F和mefA/E-R引物各0.8μL、ermB-F和ermB-R引物各0.9μL、cfb-F和cfb-R引物各0.5μL、DNA 4μL、无菌去离子水余量；
其中，Mixtiplex pcr mix2、Mixtiplex pcr mix1Taq酶、linB-F和linB-R引物、mefA/E-F和mefA/E-R引物、ermB-F和ermB-R引物、cfb-F和cfb-R引物的浓度均为12μM。
其中，多重PCR扩增的程序为：94℃预变性60s；94℃变性30s、53℃退火90s、72℃延伸30s，共30个循环；72℃后延伸10min。
步骤四，结果判读：将5μL PCR反应产物与1μL 6×loadingbuffer混匀，然后于120V/cm的电压下采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳20min，然后利用凝胶成像仪进行成像，并对成像结果进行判读：
如果仅出现cfb基因条带（153bp），表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类、林可酰胺类和链阳性霉素B类均无耐药性；
如果同时出现cfb基因条带和ermB基因条带（639bp），则表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类（如红霉素）、林可酰胺类（如克林霉素）和链阳性霉素B类（MLSB）均有耐药性，耐药表型分为cMLSB（其中，cMLSB是指：组成性对MLSB耐药）或iMLSB（其中，iMLSB是指：诱导性对MLSB耐药）；
如果同时出现cfb基因条带和mefA/E基因条带（346bp），则表示GBS阳性，该GBS仅对大环内酯类有耐药性，耐药表型为M（大环内脂类、链阳性霉素B耐药，林可酰胺类敏感）；
如果同时出现cfb基因条带和linB基因条带（944bp），则表示GBS阳性，该GBS对林可酰胺类有耐药性，耐药表型为L（克林霉素耐药，红霉素敏感或中介）；
如果同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、mefA/E基因条带；或同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、linB基因条带；或同时出现cfb基因条带、mefA/E基因条带、linB基因条带；或同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、mefA/E基因条带、linB基因条带，则表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类和林可酰胺类均有耐药性。
实验
1、材料
1.1菌株
金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212、铜绿假单胞菌ATCC27853；临床孕产妇阴道、肛拭子分离的对红霉素和（或）克林霉素耐药的B族链球菌。
1.2 主要仪器和试剂
蒸汽灭菌器、超净工作台、CO2培养箱、电子天平、微量移液枪Eppendorf,成像仪，核酸蛋白含量测定仪，PCR仪，DNA提取试剂盒 MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、Taq酶、DNA maeker DL2000
1.3引物设计
根据GeneBank收录的B族链球菌cfb基因序列、GBS红霉素耐药ermB、mefA/E基因序列、GBS克林霉素耐药linB基因序列，利用Primer 软件和Oligo6.0设计特异性PCR引物，DNA引物由英潍捷基上海贸易有限公司合成。引物序列具体如下：
cfb-F：5’-TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA-3’
cfb-R：5’-GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT-3’
ermB-F：5’-GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA-3’
ermB-R：5’-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC-3’
mefA/E-F：5’-AGT ATC ATT AAT CAC TAG TGC-3’
mefA/E-R：5’-TTC TTC TGG TAC TAA AAG TGG-3’
linB-F：5’-CCT ACC TAT TGT TTG TGG AA-3’
linB-R：5’-ATA ACG TTA CTC TCC TAT TC-3’
2、方法
2.1 DNA提取
挑取培养基上单个菌落生理盐水洗脱，用细菌基因组核酸提取试剂盒（MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0）提取细菌DNA，提取方法参照说明书进行。提取到的核酸样本利用核酸蛋白含量测定仪测定浓度。
2.2四重PCR条件和反应体系优化
对四对引物的浓度、最适酶量、不同退火温度（49~57℃）进行优化，摸索四重PCR最佳反应条件和反应体系。
2.3基因扩增和测序
采用设计的四对特异性引物对提取的GBS基因组DNA进行多重PCR扩增，部分PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像；部分PCR产物送英潍捷基上海贸易有限公司进行序列测定，并登陆美国国立生物信息中心GenBank进行DNA序列同源性比对分析。
2.4 特异性和敏感性试验
2.4.1用优化的四重PCR方法对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、B族链球菌、无菌去离子水进行检测，评价四重PCR方法的特异性。
2.4.2将20ng/ul的GBS DNA进行10倍梯度稀释至200fg/ul，用优化的四重PCR方法分别对其检测，评价四重PCR方法的敏感性。
3、结果
3.1 试验结果请见图1至图4。
如图1、2、3所示，多重PCR的最佳反应体系以总量25μL计包括：Mixtiplex pcr mix2 12.5μL、Mixtiplex pcr mix1Taq酶 0.23μL、linB-F和linB-R引物各1μL、mefA/E-F和mefA/E-R引物各0.5μL、ermB-F和ermB-R引物各0.3μL、cfb-F和cfb-R引物各0.1μL、DNA 1μL、无菌去离子水余量；
其中，Mixtiplex pcr mix2、Mixtiplex pcr mix1Taq酶、linB-F和linB-R引物、mefA/E-F和mefA/E-R引物、ermB-F和ermB-R引物、cfb-F和cfb-R引物的浓度均为10μM。
多重PCR最佳扩增程序：94℃预变性60s；94℃变性30s、53℃退火90s、72℃延伸30s，共30个循环；72℃后延伸10min。
3.2 基因扩增和测序
如图4所示，多重PCR扩增产物电泳出现与预期扩增长度（cfb 153bp、ermB 639bp、mefA/E 346bp、linB 944bp）相同的片段，将PCR扩增产物基因测序结果与已知cfb、ermB、mefA/E、linB基因核苷酸序列进行在线BLAST同源性比对，一致性均为99%。
3.3 四重PCR方法的特异性和敏感性试验
用建立的四重PCR方法检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、B族链球菌、无菌去离子水，只有B族链球菌扩增出cfb基因片段，其他细菌及无菌去离子水均未扩增出cfb基因片段，表明建立的方法特异性强。
用建立的四重PCR方法分别对200ng/ul~200fg/ul的GBS细菌DNA进行检测，电泳结果表明方法最低检测限为20pg/ul的细菌DNA。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物，其特征在于：包括由四对特异性引物构成的引物对组；
所述四对特异性引物分别是：用于鉴定B族链球菌的cfb基因引物对cfb-F和cfb-R；用于检测B族链球菌对大环类酯类耐药性的ermB 基因引物对ermB-F和ermB-R；用于检测B族链球菌对大环类酯类耐药性的mefA/E基因引物对mefA/E-F和mefA/E-R；用于检测B族链球菌对林可酰胺类耐药性的linB基因引物对linB-F和linB-R。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物，其特征在于：所述四对特异性引物的基因序列如下：
cfb-F：5’-TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA-3’
cfb-R：5’-GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT-3’
ermB-F：5’-GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA-3’
ermB-R：5’-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC-3’
mefA/E-F：5’-AGT ATC ATT AAT CAC TAG TGC-3’
mefA/E-R：5’-TTC TTC TGG TAC TAA AAG TGG-3’
linB-F：5’-CCT ACC TAT TGT TTG TGG AA-3’
linB-R：5’-ATA ACG TTA CTC TCC TAT TC-3’。
3.快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，其特征在于：它是利用权利要求1或2所述的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物进行快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，它包括以下步骤：
步骤一，DNA提取：利用细菌核酸提取试剂盒，对B族链球菌的DNA进行提取；并测定所提取到的DNA的浓度；
步骤二，引物设计：根据B族链球菌的cfb基因序列、大环类酯类耐药性的ermB 基因序列和mefA/E基因序列、林可酰胺类耐药性的linB基因序列进行特异性PCR引物序列的设计；设计的四对特异性引物的序列如下：
cfb-F：5’-TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA-3’
cfb-R：5’-GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT-3’
ermB-F：5’-GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA-3’
ermB-R：5’-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC-3’
mefA/E-F：5’-AGT ATC ATT AAT CAC TAG TGC-3’
mefA/E-R：5’-TTC TTC TGG TAC TAA AAG TGG-3’
linB-F：5’-CCT ACC TAT TGT TTG TGG AA-3’
linB-R：5’-ATA ACG TTA CTC TCC TAT TC-3’；
步骤三，基因的扩增：采用步骤二所设计的四对特异性引物对步骤一提取的B族链球菌的DNA进行多重PCR扩增，得到PCR反应产物；
步骤四，结果判读：将步骤三得到的PCR反应产物分别进行电泳，然后利用凝胶成像仪进行成像，并对成像结果进行判读：
如果仅出现cfb基因条带，表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类、林可酰胺类和链阳性霉素B类均无耐药性；
如果同时出现cfb基因条带和ermB基因条带，则表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类、林可酰胺类和链阳性霉素B类均有耐药性，耐药表型分为cMLSB（组成性对MLSB耐药）或iMLSB（诱导性对MLSB耐药）；
如果同时出现cfb基因条带和mefA/E基因条带，则表示GBS阳性，该GBS仅对大环内酯类有耐药性，耐药表型为M（大环内脂类、链阳性霉素B耐药，林可酰胺类敏感）；
如果同时出现cfb基因条带和linB基因条带，则表示GBS阳性，该GBS对林可酰胺类有耐药性，耐药表型为L（克林霉素耐药，红霉素敏感或中介）；
如果同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、mefA/E基因条带；或同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、linB基因条带；或同时出现cfb基因条带、mefA/E基因条带、linB基因条带；或同时出现cfb基因条带、ermB基因条带、mefA/E基因条带、linB基因条带，则表示GBS阳性，该GBS对大环内酯类和林可酰胺类均有耐药性。
4.根据权利要求3所述的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，其特征在于：所述步骤三中，所述多重PCR的反应体系以总量20μL~30μL计包括：Mixtiplex pcr mix2 10μL~15μL、Mixtiplex pcr mix1Taq酶 0.1μL~0.5μL、linB-F和linB-R引物各0.5μL~2μL、mefA/E-F和mefA/E-R引物各0.2μL~0.8μL、ermB-F和ermB-R引物各0.1μL~0.9μL、cfb-F和cfb-R引物各 0.05μL~0.5μL、DNA 0.5μL~4μL、无菌去离子水余量；
其中，Mixtiplex pcr mix2、Mixtiplex pcr mix1Taq酶、linB-F和linB-R引物、mefA/E-F和mefA/E-R引物、ermB-F和ermB-R引物、cfb-F和cfb-R引物的浓度均为8μM~12μM。
5.根据权利要求3所述的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，其特征在于：所述步骤三中，所述多重PCR的反应体系以总量25μL计包括：Mixtiplex pcr mix2 12.5μL、Mixtiplex pcr mix1Taq酶 0.23μL、linB-F和linB-R引物各1μL、mefA/E-F和mefA/E-R引物各0.5μL、ermB-F和ermB-R引物各0.3μL、cfb-F和cfb-R引物各0.1μL、DNA 1μL、无菌去离子水余量；
其中，Mixtiplex pcr mix2、Mixtiplex pcr mix1Taq酶、linB-F和linB-R引物、mefA/E-F和mefA/E-R引物、ermB-F和ermB-R引物、cfb-F和cfb-R引物的浓度均为10μM。
6.根据权利要求3所述的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，其特征在于：所述步骤三中，所述多重PCR扩增的程序为：94℃预变性60s； 94℃变形30s、53℃退火90s、72℃延伸30s，共30个循环；72℃后延伸10min。
7.根据权利要求3所述的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，其特征在于：所述步骤一中，所述细菌核酸提取试剂盒为MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0细菌核酸提取试剂盒；测定所提取到的DNA的浓度是采用核酸蛋白含量测定仪进行测定。
8.根据权利要求3所述的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，其特征在于：所述步骤二中，所述引物设计是根据GeneBank收录的B族链球菌的cfb基因序列、大环类酯类耐药性的ermB 基因序列和mefA/E基因序列、林可酰胺类耐药性的linB基因序列，利用Primer软件和Oligo6.0软件进行特异性PCR引物序列的设计。
9.根据权利要求3所述的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的方法，其特征在于：所述步骤四中，将5μL PCR反应产物与1μL 6×loadingbuffer混匀，然后于100V/cm~120 V/cm的电压下采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳20min~40min。
10.引物在快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的应用，其特征在于：所述引物为权利要求1或2所述的快速鉴定B族链球菌兼检测其耐药性的引物。
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