CN112980806B - 基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,取含有纳微复合球的阵列的芯片,纳微复合球由纳米球镶嵌在微米球上的纳米孔组成,纳米球具有病毒吸附能力,微米球表面对病毒没有特异性吸附能力,球内部含有磁性颗粒,利用纳微复合球上的纳米球捕获病毒溶液中的病毒,得到病毒‑纳微球复合颗粒,分离出单个病毒‑纳微球复合颗粒,从而分离出病毒单颗粒。本发明采用微吸管法、磁镊子法或液滴微流控法结合纳微复合球,实现对病毒单颗粒的捕获、检测和分离,本发明方法具有高效快速、成本低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,特别涉及基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法。
背景技术
病毒研究的一项关键的基础工作是需要获得各种病毒颗粒和基因组信息。在常规生物学中,主要通过培养皿的单菌落技术、光学显微操作的单颗粒技术,来获得单菌落、单细胞,进而通过纯培养和分子测序,获得基因组。但由于病毒个体极其微小,绝大多数在15-200nm,采用这些生物学方法,难以获得病毒单颗粒。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法。
本发明采用以下技术方案:
基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,取含有纳微复合球的阵列的芯片,所述纳微复合球由纳米球镶嵌在微米球上的纳米孔组成,所述纳米球具有病毒吸附能力,所述微米球表面对病毒没有特异性吸附能力,球内部含有磁性颗粒,利用所述纳微复合球上的纳米球捕获病毒溶液中的病毒,得到病毒-纳微球复合颗粒,分离出单个病毒-纳微球复合颗粒,从而分离出病毒单颗粒。
进一步地,所述纳米球直径为5-1500nm,表面经氨基化、羧基化、生物素化或量子点修饰。
进一步地,所述微米球的直径为1-25μm,表面经荧光或量子点修饰。
进一步地,所述病毒单颗粒的分离步骤如下:
A1、取含有纳微复合球的阵列的芯片,将含有病毒的溶液添加到所述芯片表面,病毒颗粒被吸附在纳微复合球的纳米球上;
A2、用不含病毒的液体洗涤芯片,通过芯片底面负压抽吸过滤,经若干次淋洗和过滤去除多余的病毒;
A3、取出所述芯片,用电子显微镜观察并记录吸附了单个病毒的纳微复合球的位置;
A4、在光学显微镜下用磁镊子或者微吸管,捕获吸附了单个病毒的纳微复合球,从而得到单个病毒颗粒。
进一步地,所述不含病毒的液体为去离子水。
进一步地,所述病毒单颗粒的分离步骤如下:
B1、取含有纳微复合球的阵列的芯片,将纳微复合球从所述芯片上取出;
B2、将纳微复合球加入到含有病毒的溶液中,病毒吸附固定在所述纳微复合球的纳米球上;
B3、采用离心法或磁吸附法去除未被吸附的病毒,重新悬浮得到吸附了病毒颗粒的纳微复合球溶液;
B4、以纳微复合球溶液为流动相,油相为分散相,在液滴微流控系统中,先将单个纳微复合球包裹在单个液滴中,然后单个液滴被分离,从而得到单病毒颗粒。
进一步地,步骤B1中所述将纳微复合球从所述芯片上取出时采用超声、磁分离或芯片底部正压反向冲洗的方法。
进一步地,所述芯片采用多孔陶瓷过滤板或单晶硅板。
进一步地,所述纳米球采用直径为15-200nm的、表面经氨基化修饰的二氧化硅纳米球。
进一步地,所述微米球采用直径为2-5μm的、表面经荧光修饰的、球内部含有纳米磁性颗粒的聚苯乙烯微球。
采用上述技术方案后,本发明与背景技术相比,具有如下优点:
本发明利用纳微复合球进行病毒单颗粒的分离,所述纳微球阵列于陶瓷芯片或硅芯片上,所述纳微球为纳米球被镶嵌在微米球表面的纳米孔中组成,其中,纳米球用于捕获病毒颗粒,而微米球用于检测和分离复合球。根据病毒的表面特性,可在纳米球表面进行功能化修饰,来捕获病毒,因受限于纳米球的表面积大小,单个病毒颗粒被吸附在纳米球表面;而微米球表面不吸附病毒,表面可荧光、量子点等修饰,球内部可含磁性物质,使得在可见光、荧光等在光学显微镜下能够检测复合球,然后用微吸管、磁镊子或液滴微流控,分离单个病毒-纳微球复合颗粒,得到病毒单颗粒。本发明采用微吸管法、磁镊子法或液滴微流控法结合纳微复合球,实现对病毒单颗粒的捕获、检测和分离,本发明方法具有高效快速、成本低的优点。
附图说明
图1为微吸管法分离病毒单颗粒的示意图;
图2为微吸管法分离噬菌体GVE2的透射电镜图;
图3为液滴微流控法分离病毒单颗粒的示意图;
图4为磁镊子法分离病毒单颗粒的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例一
本实施公开了一种基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,本实施例用到的含有纳微复合球的阵列的芯片,其中,所述芯片为市售的2英寸、厚度50μm双面抛光硅片,阵列在所述芯片上的纳微复合球由纳米球镶嵌在微米球表面的纳米孔中组成,其中,微米球为聚苯乙烯微米球,直径5μm,表面经荧光修饰,球内部含有纳米磁性颗粒,移除外磁场无剩磁,不具有病毒吸附能力,纳米球为二氧化硅纳米球,直径1300nm,表面氨基化修饰,具有病毒吸附能力。
采用微吸管法分离单病毒颗粒,具体如下:
以GVE2噬菌体为对象,该噬菌体头部直径60nm,尾部宽6nm,长200nm,从好氧嗜热芽孢杆菌Geobacillius sp.E263分离得到。
取一定浓度的噬菌体溶液,滴加在上述阵列了纳微复合球的硅芯片上,连接一定时间后,多次添加去离子水洗涤复合球表面,通过芯片底部抽吸的方法去除未吸附的噬菌体。然后,如图1所示,采用微吸管法分离单病毒颗粒,在光学显微镜下,调节微操纵位移平台来精确地控制微吸管移动,通过吸取单个复合球得到病毒单颗粒。图2所示为复合球分离GVE2噬菌体单颗粒的透射电镜(TEM)图,该结果用其他方法进一步确认获得的是单个噬菌体颗粒。
实施例二
本实施公开了一种基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,本实施例用到的含有纳微复合球的阵列的芯片,其中,所述芯片为市售的厚度3mm,平均过滤孔径0.45-0.8μm的多孔陶瓷,阵列在所述芯片上的纳微复合球由纳米球镶嵌在微米球表面的纳米孔中组成,其中,微米球为聚苯乙烯微米球,直径2μm,表面经荧光修饰,球内部含有纳米磁性颗粒,移除外磁场无剩磁,不具有病毒吸附能力,纳米球为二氧化硅纳米球,直径100nm,表面氨基化修饰,具有病毒吸附能力。
采用液滴微流控的方法分离单个复合小球,具体如下:
采用超声、芯片底部正压过滤的方法,将复合微球从芯片上取出,然后加入到含有一定病毒浓度的溶液中,病毒吸附固定到复合球上的纳米球球面。采用磁分离法去除未被吸附的病毒,重新悬浮得到吸附了病毒的复合球溶液。液滴微流控分离单个复合球,主要包括三个步骤:首先,将复合球通过DEAN流阵列呈一直线居中排列,然后,以复合球溶液为流动相,油相为分散相,将单个复合球包裹在单个液滴中,最后将单个液滴分离到酶标板的孔中。如图3所示的单液滴分离,先将单个液滴储存在锥形扩大区,然后通过控制主流道和侧流道的流量,将包裹了单个纳微复合球收集到酶标板的孔洞中,并通过酶标仪进行跟踪监测。
实施例三
本实施公开了一种基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,本实施例用到的含有纳微复合球的阵列的芯片,其中,所述芯片为市售的厚度3mm,平均过滤孔径0.45-0.8μm的多孔陶瓷,阵列在所述芯片上的纳微复合球由纳米球镶嵌在微米球表面的纳米孔中组成,其中,微米球为聚苯乙烯微米球,直径2μm,表面经荧光修饰,球内部含有纳米磁性颗粒,移除外磁场无剩磁,不具有病毒吸附能力,纳米球为二氧化硅纳米球,直径100nm,表面氨基化修饰,具有病毒吸附能力。
采用磁镊法分离单个复合小球,具体如下:
不将纳微复合球从芯片上取出来,直接用于分离病毒单颗粒。取一定浓度的病毒溶液,滴加在上述阵列了纳微复合球的芯片上,连接一定时间后,多次添加去离子水洗涤复合球表面,通过芯片底部抽吸的方法去除未吸附的噬菌体。然后,在光学显微镜下,调节微操纵位移平台来精确地控制磁镊子移动,如图4所示,通过吸取单个纳微复合球得到病毒单颗粒。所采用的微米球为球内部含纳米磁性颗粒的聚苯乙烯微米球,当磁镊子靠近时,聚苯乙烯球产生磁性被吸附,当磁镊子不通电,磁性消除,球落下。
本实施例采用坡莫合金lj85来加工磁针,磁针针尖圆弧直径为3-10μm。将制备好的磁针固定于XYZ位移平台上,在光学显微镜下,将磁针靠近微珠,调节电流大小,使得磁针激发的磁场在针尖的几个微米范围内,以达到可以吸引单个磁性微米球并且移动时不掉落。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,其特征在于:取含有纳微复合球的阵列的芯片,所述纳微复合球由纳米球镶嵌在微米球上的纳米孔组成,所述纳米球具有病毒吸附能力,所述微米球表面对病毒没有吸附能力,所述微米球内部含有磁性颗粒,利用所述纳微复合球上的纳米球捕获病毒溶液中的病毒,得到病毒-纳微球复合颗粒,分离出单个病毒-纳微球复合颗粒,从而分离出病毒单颗粒;所述纳米球直径为5-1300nm,表面经氨基化、羧基化、生物素化或量子点修饰;所述微米球的直径为2-25μm。
2.如权利要求1所述的基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,其特征在于:所述微米球表面经荧光修饰。
3.如权利要求1所述的基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,其特征在于:所述微米球表面量子点修饰。
4.如权利要求2所述的基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,其特征在于:所述病毒单颗粒的分离步骤如下:
A1、取含有纳微复合球的阵列的芯片,将含有病毒的溶液添加到所述芯片表面,病毒颗粒被吸附在纳微复合球的纳米球上;
A2、用不含病毒的液体洗涤芯片,通过芯片底面负压抽吸过滤,经若干次淋洗和过滤去除多余的病毒;
A3、取出所述芯片,用电子显微镜观察并记录吸附了单个病毒的纳微复合球的位置;
A4、在光学显微镜下用磁镊子或者微吸管,捕获吸附了单个病毒的纳微复合球,从而得到单个病毒颗粒。
5.如权利要求4所述的基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,其特征在于:所述不含病毒的液体为去离子水。
6.如权利要求2所述的基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,其特征在于:所述病毒单颗粒的分离步骤如下:
B1、取含有纳微复合球的阵列的芯片,将纳微复合球从所述芯片上取出;
B2、将纳微复合球加入到含有病毒的溶液中,病毒吸附固定在所述纳微复合球的纳米球上;
B3、采用离心法或磁吸附法去除未被吸附的病毒,重新悬浮得到吸附了病毒颗粒的纳微复合球溶液;
B4、以纳微复合球溶液为流动相,油相为分散相,在液滴微流控系统中,先将单个纳微复合球包裹在单个液滴中,然后单个液滴被分离,从而得到单病毒颗粒。
7.如权利要求6所述的基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,其特征在于:步骤B1中所述将纳微复合球从所述芯片上取出时采用超声、磁分离或芯片底部正压反向冲洗的方法。
8.如权利要求4或6所述的基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,其特征在于:所述芯片采用多孔陶瓷过滤板或单晶硅板。
9.如权利要求4或6所述的基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,其特征在于:所述纳米球采用直径为15-200nm、表面经氨基化修饰的二氧化硅纳米球。
10.如权利要求4或6所述的基于纳微复合球的病毒单颗粒分离方法,其特征在于:所述微米球采用直径为2-5μm、表面经荧光修饰的、球内部含有纳米磁性颗粒的聚苯乙烯微球。
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