CN104804741B

CN104804741B - 一种单发射上转换纳米荧光探针及其合成方法

Info

Publication number: CN104804741B
Application number: CN201510145213.8A
Authority: CN
Inventors: 张凡; 周磊
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2017-04-12
Anticipated expiration: 2035-03-31
Also published as: CN104804741A

Abstract

本发明属于纳米生物材料技术领域，具体为一种单发射上转换纳米荧光探针及其合成方法。本发明荧光探针是一种一核三壳层结构的纳米晶体，其包括上转换发光中心核层、惰性壳层、二氧化硅壳层和染料掺杂二氧化硅壳层四个部分；上转换发光中心为激活离子掺杂的稀土纳米晶体，惰性壳层完全包裹发光核心；二氧化硅壳层可以避免上转换发光中心和染料之间的荧光共振能量转移；染料掺杂二氧化硅壳层用于去除不需要的上转换发射峰，选择保留特定的上转换发射峰，实现单发射上转换荧光。本发明可以同时原位检测多个信号分子，进一步提高检测的灵敏度以及准确度。本发明的荧光探针在蛋白表达、生物样品高通量筛选、多通道生物学检测和疾病诊断等方面具有广阔的应用前景。

Description

一种单发射上转换纳米荧光探针及其合成方法

技术领域

本发明属于纳米生物材料技术领域，具体涉及一种单发射上转换纳米荧光探针及其合成方法。

背景技术

近年来，癌症已成为一个全球性公共健康问题，早期检测和治疗可以有效降低癌症的死亡率，所以癌症的早期诊断具有十分重要的意义。大多数恶性肿瘤(尤其是乳腺癌和前列腺癌)是高度异构的,包含混合的良性细胞,恶性细胞,成纤维细胞,和其他基质细胞,血管细胞,浸润炎症细胞(巨噬细胞和淋巴细胞等)。人类肿瘤的诊断和预后分类目前主要是基于免疫组织化学方法,这种方法一次只能检测一种待检物质，而且免疫组织化学是半定量的并且检测结果具有较大的主观性。当前可以同时检测多种目标分子的检测方法如RT-PCR技术、基因芯片、蛋白质芯片、二维凝胶电泳、质谱分析等需要破坏细胞或组织标本来进行检测,导致失去宝贵的细胞和组织形态与原始肿瘤相关的3D信息。与上述方法相比，基于光学显微镜的荧光成像方法具有一系列优势，不仅可以维持细胞或组织的原有形态，检测灵敏度也更高。生物分析、疾病诊断和生物医药研究领域需要蛋白和基因靶向识别的更多信息，而多重检测实现了核酸和蛋白的快速信号识别。研究人员可以从各类复杂生物体系中的生物样品获得更多的信息，从而为疾病的诊断和治疗提供更多的科学依据。然而目前所采用的多重检测使用的探针分子多位荧光染料或者量子点材料，由于有机荧光染料和量子点的荧光发射峰较宽，相互之间重叠严重，随着样品数量的增多其精确性也就开始下降。而且荧光染料和量子点大多使用紫外光或者可见光激发，在此类激发光源下生物样本有较高的自体荧光背景。而且在长时间光照下染料还容易发生光漂白现象。

稀土上转换材料具有较高的发光效率、较小的光漂白、较长的荧光寿命以及较低的长期毒性等，是用于多重检测的一种很有前景的荧光探针。但是由于上转换材料掺杂的稀土离子具有多能级的特性，不同稀土离子掺杂或是不同浓度的掺杂得到的材料具有多个发射峰，不同的材料具有光谱重叠，限制了它的应用，如果能够通过一些结构设计得到单波长发射的上转换纳米颗粒，那么将会是一种理想的多重检测荧光探针，在生物分析和疾病检测方面有更广阔的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备工艺简单、可用于多重检测的单发射上转换纳米荧光探针及其合成方法。

本发明提供的单发射上转换纳米荧光探针，是一种一核三壳层结构的纳米晶体，其从内而外依次为上转换发光中心核层、惰性壳层、二氧化硅壳层和染料掺杂二氧化硅壳层；其中，所述上转换发光中心为激活离子掺杂的稀土纳米晶体，所述惰性壳层完全包裹转换发光中心，惰性壳层用于增强纳米晶体的发光稳定性和发光效率；所述二氧化硅壳层用以隔绝上转换发光中心和染料之间的荧光共振能量转移；染料掺杂二氧化硅壳层可以通过选择合适的染料吸收发光中心的特定发射峰，从而实现单发射上转换荧光。本发明通过在纳米晶体合成过程中改变稀土离子掺杂的种类和掺杂量，改变上转换发射波长，再通过选择合适的染料吸收发光中心的特定发射峰，可以得到一系列不同单波长发射的上转换纳米荧光探针。

本发明中，所述的上转换发光中心由基质、敏化离子和激活离子组成；其中，基质为NaReF₄、LiReF₄、KReF₄或BaReF₅，Re 为 Y、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu中的一种或几种；敏化离子为Nd³⁺，Yb³⁺中的一种或者两种；敏化离子的摩尔含量为0.01%~60%；激活离子为Ce³⁺、Pr³⁺、Sm³⁺、Eu³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺、Er³⁺、Tm³⁺、Ho³⁺中的一种或者几种；激活离子的摩尔含量为0.01%~20%。

本发明中，所述的惰性壳层仅由基质组成；其基质材料为：氟化物、氧化物、硫氧化物或卤化物；氟化物为：CaF₂、BaF₂、LaF₃、YF₃、ZnF₂、NaYF₄、NaYbF₄、LiYF₄、KYF₄、NaGdF₄或NaLuF₄；氧化物为：La₂O₃、Y₂O₃、Yb₂O₃、Gd₂O₃或Lu₂O₃；硫氧化物为Y₂O₂S、CaS₂或La₂S₃；卤化物为Cs₃Lu₂Br₉；惰性壳层用于增强纳米晶体的发光稳定性和发光效率，减少外界环境对下转换荧光的淬灭。

本发明提供上述单发射上转换纳米荧光探针的合成方法，具体步骤如下：

（1）壳层前驱体的制备：

a、稀土溶液前驱体的制备：在真空条件下将稀土盐溶解于高沸点的溶剂当中；其中，稀土盐选自：氯化物、硝酸盐、醋酸盐、氧化物、三氟乙酸盐、乙酰丙酮盐；包括的稀土元素为Y、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb或Lu；高沸点溶剂为：油酸、硬脂酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、十八烯、液体石蜡、橄榄油中的一种或者几种；溶解温度为20-150摄氏度；最终所得溶液的浓度为0.01 mol/L-5 mol/L；

b、三氟乙酸钠/钾/锂/钡溶液的制备：将三氟乙酸钠或三氟乙酸钾或三氟乙酸锂或三氟乙酸钡，溶解在高沸点溶剂中；高沸点溶剂为：油酸、硬脂酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、十八烯、液体石蜡、橄榄油中的一种或者几种；溶解温度为20-150摄氏度；最终所得溶液的浓度为0.01 mol/L-5 mol/L；

（2）上转换发光中心的合成：采用油酸、油胺、三正辛基氧膦、十八烯、液体石蜡为高温溶剂，稀土原料采用稀土氯化物、稀土三氟乙酸盐、稀土硝酸盐或者稀土醋酸盐；反应物还应包括氟化铵、氟化钠、氟化锂、氟化钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的一种或者几种；在200-320摄氏度、氮气气氛下反应，得到分散性和均匀性较好的上转换稀土纳米晶体；

（3）核、@壳1核壳结构纳米晶体的合成：以上一步中制备的上转换稀土纳米晶体为晶核，在150-340摄氏度高温条件下，连续交替引入壳层前驱体溶液，引入方式为滴加；每次引入高沸点稀土溶液前驱体与三氟乙酸钠/钾/锂/钡溶液的体积比例为10:1到1:10；

（4）核、@壳1、@壳2核壳结构纳米晶体的合成：以上一步中制备的核@壳1结构纳米晶体为晶核，在室温下，通过反向微乳液法，引入表面活性剂与硅源；表面活性剂与硅源的体积比例为1:1到1:25；所述表面活性剂可以是支化聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚 (CO-520)等，硅源可以是正硅酸四乙酯等；

（5）核、@壳1、@壳2、@壳3核壳结构纳米晶体的合成：以上一步中制备的核@壳1@壳2结构纳米晶体为晶核，在室温条件下，引入硅源和染料，硅源与染料的体积比例为2:1到1:10。这里硅源可以是正硅酸四乙酯，染料可以是酞菁镍(II)四磺酸四钠盐，罗丹明B异硫氰酸酯等；

本发明中，针对不同发光中心的光学性质，通过控制加入染料的种类，调节得到不同单波长发射的上转换材料。例如，在铥为发光离子时，加入染料酞菁镍(II)四磺酸四钠盐，可以得到475 nm单蓝光发射的上转换材料。在铒为发光离子时，加入染料酞菁镍(II)四磺酸四钠盐，可以得到550 nm单绿光发射的上转换材料，加入染料罗丹明B异硫氰酸酯，可以得到650 nm单红光发射的上转换材料。染料在水或乙醇中的浓度为0.1 g/L到 10 g/L。

本发明所合成的核壳结构纳米晶体（单波长发射的荧光探针），最终实现了在980nm激发光下，475 nm、550 nm和 650 nm三个波段的单波长发射。通过研究不同染料加入量，确定了其最小加入量。

本发明可以通过在纳米晶体合成过程中改变稀土离子掺杂的种类和掺杂量，改变上转换发射波长，再选择合适的染料参杂的二氧化硅壳层（纳米滤光片层）去除不需要的上转换发射峰得到一系列不同单波长发射的上转换纳米荧光探针。本发明可以同时原位检测多个信号分子，进一步提高检测的灵敏度以及准确度。本发明的荧光探针在蛋白表达、生物样品高通量筛选、多通道生物学检测和疾病诊断等方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为980 nm近红外激发，单波长发射荧光纳米材料的结构示意图。

图2为所制备的NaGdF₄: 20 % Yb/0.2 % Tm@NaGdF₄@SiO₂@SiO₂-NPTAT核@壳1@壳2@壳3核壳结构纳米晶体的透射电子显微镜照片。

图3为所制备的NaGdF₄: 20 % Yb/0.2 % Tm@NaGdF₄@SiO₂@SiO₂-NPTAT单蓝光发射核@壳1@壳2@壳3核壳结构纳米晶体在980 nm近红外光激发下的荧光光谱图。

图4为所制备的NaGdF₄: 20 % Yb/2 % Er@NaGdF₄@SiO₂@SiO₂-NPTAT单绿光发射核@壳1@壳2@壳3核壳结构纳米晶体在980 nm近红外光激发下的荧光光谱图。

图5为所制备的NaYbF₄: 10 % Er@NaYF₄@SiO₂@SiO₂-RhB isothiocyanate单红光发射核@壳1@壳2@壳3核壳结构纳米晶体在980 nm近红外光激发下的荧光光谱图。

具体实施方式

实施例1：

NaGdF₄: 20 % Yb/0.2 % Tm@NaGdF₄@SiO₂@SiO₂-NPTAT单蓝光发射上转换纳米晶的制备。具体步骤如下：

（1）壳层前驱体的制备。Gd-OA（0.1 M）前驱体的制备：取50 mL三口圆底烧瓶为反应容器，依次加入2.5 mmol GdCl₃，10 mL 油酸（OA），15 mL十八烯（ODE）。在真空和磁力搅拌条件下加热至140摄氏度并保持1小时，最终得到澄清透明的Gd-OA（0.1 M）前驱体。

Na-TFA-OA前驱体的制备：取25 mL三口圆底烧瓶为反应容器，依次加入4 mmol三氟乙酸钠和10 mL 油酸，在真空和搅拌条件下室温溶解，得到无色透明澄清的Na-TFA-OA前驱体溶液。

（2）NaGdF₄: 20 % Yb/0.2 % Tm上转换纳米晶核的合成

取100 mL三口圆底烧瓶为反应容器，首先加入0.798mmol GdCl₃、0.2mmol YbCl₃、以及0.002mmol TmCl₃；随后加入15g 油酸（OA），6g 十八烯（ODE）。将反应物搅拌加热至120℃，真空脱水脱氧30分钟，最终得到透明混合溶液。将1 mmol NaOH和4 mmol NH₄F溶解于10mL甲醇溶液中混合并且注入上述反应溶液中进行反应。连续搅拌20分钟后，将反应物在高纯氩气保护下以10℃/min的速度升温至285℃后保温反应100分钟。将反应物冷却至50℃后加入乙醇使产物从溶液中沉淀析出，随后离心，使用无水乙醇反复洗涤3-5次后得到产物。

（3）NaGdF₄: 20 % Yb/0.2 % Tm@NaGdF₄核壳纳米晶的合成

取5 mL上述提纯液（~ 0.5 mmol）于8 mL油酸（OA），12 mL 十八烯（ODE）混合加热至70摄氏度，在真空条件下保持30分钟除去反应体系中的环己烷和氧气。然后将反应体系以20℃/min的速度升温至280摄氏度。然后向反应瓶中交替滴加1 mL Gd-OA前驱体和0.5mL Na-TFA-OA前驱体。每次滴加的间隔时间为15分钟。滴加次数可根据壳层厚度的需要进行调整。待反应结束后，将反应母液冷却至50℃后加入乙醇使产物从溶液中沉淀析出，随后离心，使用无水乙醇反复洗涤3-5次后得到产物，并将产物溶解于5 mL环己烷中备用。

（4）NaGdF₄: 20 % Yb/0.2 % Tm@NaGdF₄@SiO₂核壳纳米晶的合成

取0.5 mL上述提纯液，加入0.5 mL CO-520, 16.5 mL 环己烷，搅拌15分钟，得到澄清透明溶液，再加入0.2 mL 氨水和2.1 mL CO-520，超声15分钟后加入100 uL 正硅酸四乙酯。室温搅拌1小时。

（5）NaGdF₄: 20 % Yb/0.2 % Tm@NaGdF₄@SiO₂@SiO₂-NPTAT核壳纳米晶的合成

在上述溶液中，加入0.1 mL 酞菁镍(II)四磺酸四钠盐（NPTAT (5mg/mL）），室温搅拌47小时后加入乙醇使产物从溶液中沉淀析出，随后离心，使用无水乙醇反复洗涤3-5次后得到产物。

实施例2：

NaGdF₄: 20 % Yb/2 % Er@NaGdF₄@SiO₂@SiO₂-NPTAT单绿光发射上转换纳米晶的制备。具体步骤如下：

（2）NaGdF₄: 20 % Yb/2 % Er上转换纳米晶核的合成

取100 mL三口圆底烧瓶为反应容器，首先加入0.78mmol GdCl₃、0.2mmol YbCl₃、以及0.02mmol ErCl₃；随后加入15g 油酸（OA），6g 十八烯（ODE）。将反应物搅拌加热至120℃，真空脱水脱氧30分钟，最终得到透明混合溶液。将1 mmol NaOH和4 mmol NH₄F溶解于10mL甲醇溶液中混合并且注入上述反应溶液中进行反应。连续搅拌20分钟后，将反应物在高纯氩气保护下以10℃/min的速度升温至285℃后保温反应100分钟。将反应物冷却至50℃后加入乙醇使产物从溶液中沉淀析出，随后离心，使用无水乙醇反复洗涤3-5次后得到产物。

（3）NaGdF₄: 20 % Yb/2 % Er@NaGdF₄核壳纳米晶的合成

（4）NaGdF₄: 20 % Yb/2 % Er@NaGdF₄@SiO₂核壳纳米晶的合成

实施例3：

NaYbF₄: 10 % Er@NaYF₄@SiO₂@SiO₂-RhB isothiocyanate单红光发射上转换纳米晶的制备。具体步骤如下：

（1）壳层前驱体的制备。Y-OA（0.1 M）前驱体的制备：取50 mL三口圆底烧瓶为反应容器，依次加入2.5 mmol YCl₃，10 mL 油酸（OA），15 mL十八烯（ODE）。在真空和磁力搅拌条件下加热至140摄氏度并保持1小时，最终得到澄清透明的Y-OA（0.1 M）前驱体。

（2）NaYbF₄: 10 % Er上转换纳米晶核的合成

取50 mL三口圆底烧瓶为反应容器，首先加入1 mmol 三氟乙酸钠、0.9 mmol 三氟乙酸镱、0.1 mmol 三氟乙酸铒；随后加入16 mL油酸（OA），8 mL油胺（OMA）。将上述混合物搅拌加热至120 ℃，真空脱水脱氧30分钟，最终得到透明混合溶液。随后将反应物在高纯氩气保护下以15℃/min的速度升温至275摄氏度并保持温度反应30分钟。待反应结束后，将反应母液冷却至50℃后加入乙醇使产物从溶液中沉淀析出，随后离心，使用无水乙醇反复洗涤3-5次后得到产物，并将产物溶解于10 mL环己烷中备用。

（3）NaYbF₄: 10 % Er@NaYF₄核壳纳米晶的合成

取5 mL上述提纯液（~ 0.5 mmol）于8 mL油酸（OA），12 mL 十八烯（ODE）混合加热至70摄氏度，在真空条件下保持30分钟除去反应体系中的环己烷和氧气。然后将反应体系以20℃/min的速度升温至280摄氏度。然后向反应瓶中交替滴加1 mL Y-OA前驱体和0.5mL Na-TFA-OA前驱体。每次滴加的间隔时间为15分钟。滴加次数可根据壳层厚度的需要进行调整。待反应结束后，将反应母液冷却至50℃后加入乙醇使产物从溶液中沉淀析出，随后离心，使用无水乙醇反复洗涤3-5次后得到产物，并将产物溶解于5 mL环己烷中备用。

（4）NaYbF₄: 10 % Er@NaYF₄@SiO₂核壳纳米晶的合成

取0.5 mL 上述提纯液，加入0.5 mL CO-520, 16.5 mL 环己烷，搅拌15分钟，得到澄清透明溶液，再加入0.2 mL 氨水和2.1 mL CO-520，超声15分钟后加入100 uL 正硅酸四乙酯。室温搅拌1小时。

（5）罗丹明B异硫氰酸酯（RhB isothiocyanate）染料的修饰

取罗丹明B异硫氰酸酯10 mg，加入10 mL无水乙醇，20 uL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），室温搅拌48小时后离心，使用无水乙醇洗涤2-3次后得到产物。烘干待用。

（6）NaYbF₄: 10 % Er@NaYF₄@SiO₂@SiO₂-RhB isothiocyanate核壳纳米晶的合成

在上述（4）得到溶液中，加入（5）中硅烷修饰过后的0.1 mL罗丹明B异硫氰酸酯(10mg/mL），室温搅拌47小时后加入乙醇使产物从溶液中沉淀析出，随后离心，使用无水乙醇反复洗涤3-5次后得到产物。

Claims

1.一种单发射上转换纳米荧光探针，其特征在于是一种一核三壳层结构的纳米晶体，从内而外依次为上转换发光中心核层、惰性壳层、二氧化硅壳层和染料掺杂二氧化硅壳层；其中，所述上转换发光中心为激活离子和敏化离子掺杂的稀土纳米晶体，所述惰性壳层完全包裹转换发光中心，惰性壳层用于增强纳米晶体的发光稳定性发光效率；所述二氧化硅壳层用于隔绝上转换发光中心和染料之间的荧光共振能量转移；所述染料掺杂二氧化硅壳层通过选择合适的染料吸收发光中心的特定发射峰，从而实现单发射上转换荧光；其中：

所述的上转换发光中心由基质、敏化离子和激活离子组成；其中，基质为NaReF₄、LiReF₄、KReF₄或BaReF₅，Re 为 Y、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu中的一种或几种；敏化离子为Nd³⁺，Yb³⁺中的一种或者两种；敏化离子的摩尔含量为0.01%~60%；激活离子为Ce³⁺、Pr³⁺、Sm³⁺、Eu³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺、Er³⁺、Tm³⁺、Ho³⁺中的一种或者几种；激活离子的摩尔含量为0.01%~20%；

所述的惰性壳层由基质组成；其基质材料为：氟化物、氧化物、硫氧化物或卤化物；氟化物为：CaF₂、BaF₂、LaF₃、YF₃、ZnF₂、NaYF₄、NaYbF₄、LiYF₄、KYF₄、NaGdF₄或NaLuF₄；氧化物为：La₂O₃、Y₂O₃、Yb₂O₃、Gd₂O₃或Lu₂O₃；硫氧化物为Y₂O₂S、CaS₂或La₂S₃；卤化物为Cs₃Lu₂Br₉ 。

2.根据权利要求1所述的单发射上转换纳米荧光探针，其特征在于在980 nm激发光下，单波长发射波段为475 nm、550 nm和 650 nm。

3.一种如权利要求1或2所述的单发射上转换纳米荧光探针的合成方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）壳层前驱体的制备：

（3）核@壳1核壳结构纳米晶体的合成：以上一步中制备的上转换稀土纳米晶体为晶核，在150-340摄氏度高温条件下，连续交替引入壳层前驱体溶液，引入方式为滴加；每次引入高沸点稀土溶液前驱体与三氟乙酸钠/钾/锂/钡溶液的体积比例为10:1到1:10；

（4）核@壳1@壳2核壳结构纳米晶体的合成：以上一步中制备的核@壳1结构纳米晶体为晶核，在室温下，通过反向微乳液法，引入表面活性剂与硅源；表面活性剂与硅源的体积比例为1:1到1:25；

（5）核@壳1@壳2@壳3核壳结构纳米晶体的合成：以上一步中制备的核@壳1@壳2结构纳米晶体为晶核，在室温条件下，引入硅源和染料；硅源与染料的体积比例为2:1到1:10。

4.根据权利要求3所述的单发射上转换纳米荧光探针的合成方法，其特征在于染料为酞菁镍(II)四磺酸四钠盐，或罗丹明B异硫氰酸酯。