JP4896347B2 - 不溶性担体粒子比濁免疫測定用試薬 - Google Patents
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Description
【0001】
本発明は、ラテックス等の不溶性担体粒子を含む比濁免疫測定用試薬、不溶性担体粒子を用いた比濁免疫測定方法及び不溶性担体粒子を含む比濁免疫測定用キットに関し、より詳細には、吸光度を安定化し、かつ反応に関与して測定値に影響を与える血漿成分の働きを抑制することができる不溶性担体粒子を含む比濁免疫測定用試薬、不溶性担体粒子を用いた比濁免疫測定方法及び不溶性担体粒子を含む比濁免疫測定用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
ラテックスは、臨床検査の分野において検体中の抗原又は抗体を測定する免疫測定法に盛んに使用されている。例えば、特開平10−253629号公報には、pH4.2のリン酸クエン酸緩衝液等のpH4.0〜6.0の緩衝液中で、抗原又は抗体をポリスチレン系ラテックス粒子に担持させた後、pH8.0のトリス緩衝液等のpH6.5〜9.0の緩衝液に置換することからなる、高感度を維持しつつ、プロゾーンの発生を抑制し、バラツキが少なく、安定性に優れた免疫測定試薬の製造方法が記載されている。
【0003】
また、特開平9−318632号公報には、検体と、抗原又は抗体を担持したラテックス懸濁液とを混合し、この混合液中に二価アルコールを添加し、抗原抗体反応によるラテックス粒子の凝集によって生じる吸光度の変化量を測定することからなる、測定すべき抗原又は抗体が検体中に高濃度に含まれる場合にあっても、検体を希釈することなく原液のままで測定可能なラテックス比濁免疫測定方法が記載されている。
【0004】
また、特開平7−301632号公報には、表面にカルボキシレート基を有するラテックス粒子と該粒子に共有結合で結合した免疫反応体とを含む担持した微粒子であって、ラテックス粒子が0.1〜0.6μmの直径及び8〜35平方オングストロームの表面カルボキシレート占有領域を有する、担持した微粒子、及び該微粒子と緩衝液とを含むイムノアッセイ試薬が記載されている。
【0005】
上記のように、ラテックスはラテックス比濁免疫測定法等免疫凝集反応を利用した測定系によく用いられているが、ラテックス懸濁液は、その中に微量に混入する重金属イオンなどによって反応液中に共存する血漿成分と反応し、抗原又は抗体のラテックス担体に対する吸着性を変化させたり、あるいは抗原又は抗体を結合させたラテックスから抗原又は抗体が解離して遊離の抗原又は抗体が発生し、反応時のラテックス凝集の度合いを変化させたりすることによって、感度が不安定化するという問題があった。また、抗原や抗体を結合させていないラテックスの場合では、表面の電荷を担っているカルボキシル基やスルホ基に重金属イオンが結合することによって表面電荷が変化し、感度が不安定化するという問題があった。
【0006】
本発明の課題は、ラテックス等の不溶性担体粒子凝集反応に関与して測定値に影響を与える血漿成分の働きを抑制して凝集反応を安定化し、反応液の吸光度が安定化することにより精確な測定結果を与えることができる不溶性担体粒子比濁免疫測定用試薬や不溶性担体粒子比濁免疫測定用キット、及び該試薬やキットを用いる不溶性担体粒子比濁免疫測定法を提供することにある。
【0007】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究し、ラテックス凝集反応を不安定化する血漿成分、すなわち血漿中に存在する微量の複数価の金属イオンに対して、分子式中に特定の基を有する化合物を含む緩衝剤を用いると、ラテックス表面の荷電状態を安定化し、ラテックスに結合した抗原又は抗体の遊離を防止し、ラテックス凝集反応を安定化して、精確な測定結果を得ることができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【0010】
本発明は、抗原及び抗体を担持していない不溶性担体粒子の懸濁液、及び、ビシン又はトリシン緩衝剤を含む緩衝液を含有する第一試薬と、抗ヒト変性HbA1c抗体、及び、ビシン又はトリシン緩衝剤を含む緩衝液を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のHbA1cの不溶性担体粒子比濁免疫測定用キット(1)や、ビシン又はトリシン緩衝剤が、その使用濃度が5〜200mmol/Lに調整し得るような形態で含まれていることを特徴とする前記(1)記載の不溶性担体粒子比濁免疫測定用キット(2)や、抗原及び抗体を担持していない不溶性担体粒子が、その使用濃度が0.005〜5重量%に調整し得るような形態で含まれていることを特徴とする前記(1)又は(2)記載の不溶性担体粒子比濁免疫測定用キット(3)や、不溶性担体粒子が、ラテックスであることを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれかに記載の不溶性担体粒子比濁免疫測定用キット(4)に関する。
【0011】
本発明の不溶性担体粒子比濁免疫測定用試薬としては、不溶性担体粒子と、分子内に以下の[化学式4]で表される基を有する化合物又はその塩からなる緩衝剤とを含有する不溶性担体粒子比濁免疫測定用試薬であれば特に制限されるものではなく、また本発明の不溶性担体粒子比濁免疫測定方法としては、不溶性担体粒子と、分子内に以下の[化学式4]で表される基を有する化合物又はその塩からなる緩衝剤とを用いる不溶性担体粒子比濁免疫測定方法であれば特に制限されるものではない。ここで、不溶性担体粒子比濁免疫測定方法とは、不溶性担体粒子を用いる免疫凝集反応によって発生した濁度を測定して、検体中の抗原又は抗体を定量する方法をいう。さらに、本発明の不溶性担体粒子比濁免疫測定用キットとしては、不溶性担体粒子を含有する懸濁液と、分子内に以下の[化学式4]で表される基をもつ化合物又はその塩からなる緩衝剤を含む緩衝液とを含有する不溶性担体粒子比濁免疫測定用キットであれば特に制限されるものではない。
【0012】
【化学式1】
【0013】
上記緩衝剤である化合物としては、下記一般式[I]で表される化合物を例示することができ、一般式[I]中のR1,R2としては、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、トリ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、カルボキシアルキル基、ジ(カルボキシアルキル)アルキル基、トリ(カルボキシアルキル)アルキル基、置換もしくは非置換アミノアルキル基、置換もしくは非置換アミノカルボニルアルキル基、置換もしくは非置換アルコキシアルキル基、スルホアルキル基、ジ(スルホアルキル)アルキル基、トリ(スルホアルキル)アルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基、ジ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基、トリ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基等を挙げることができる。
【0014】
上記アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、トリ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、カルボキシアルキル基、ジ(カルボキシアルキル)アルキル基、トリ(カルボキシアルキル)アルキル基、置換もしくは非置換アミノアルキル基、置換もしくは非置換アミノカルボニルアルキル基、置換もしくは非置換アルコキシアルキル基、スルホアルキル基、ジ(スルホアルキル)アルキル基、トリ(スルホアルキル)アルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基、ジ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基、及びトリ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基におけるアルキル基としては、直鎖又は分枝状の炭素数が1〜6のアルキル基を挙げることができ、該直鎖又は分枝状の炭素数が1〜6のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を具体的に例示することができる。
【0015】
上記置換アミノアルキル基及び置換アミノカルボニルアルキル基における置換基としては、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、スルホアルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基、窒素原子を含んで形成される複素環基等を例示することができ、該アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、スルホアルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基におけるアルキル基としては、前記の直鎖又は分枝状の炭素数が1〜6のアルキル基を挙げることができる。上記窒素原子を含んで形成される複素環基としては、ピペラジニル基、モルホリノ基、ピペリジノ基等を挙げることができる。
【0016】
上記置換アルコキシアルキル基における置換基としては、水酸基、カルボキシル基、スルホ基等を挙げることができる。
【0017】
また、一般式[I]中のR1,R2としては、R1,R2が窒素原子と共に環状構造を形成し、置換もしくは無置換のピペラジニル基、置換もしくは無置換のモルホリノ基、又は置換もしくは無置換のピペリジノ基を形成する基を挙げることができ、該置換ピペラジニル基、置換モルホリノ基、及び置換ピペリジノ基における置換基としては、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、トリ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、カルボキシアルキル基、ジ(カルボキシアルキル)アルキル基、トリ(カルボキシアルキル)アルキル基、置換もしくは非置換アミノアルキル基、置換もしくは非置換アミノカルボニルアルキル基、置換もしくは非置換アルコキシアルキル基、スルホアルキル基、ジ(スルホアルキル)アルキル基、トリ(スルホアルキル)アルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基、ジ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基、トリ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基等を挙げることができる。
【0018】
上記アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、トリ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、カルボキシアルキル基、ジ(カルボキシアルキル)アルキル基、トリ(カルボキシアルキル)アルキル基、置換もしくは非置換アミノアルキル基、置換もしくは非置換アミノカルボニルアルキル基、置換もしくは非置換アルコキシアルキル基、スルホアルキル基、ジ(スルホアルキル)アルキル基、トリ(スルホアルキル)アルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基、ジ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基、及びトリ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基におけるアルキル基としては、前記の直鎖又は分枝状の炭素数が1〜6のアルキル基を挙げることができる。
【0019】
上記置換アミノアルキル基及び置換アミノカルボニルアルキル基における置換基としては、前記の置換アミノアルキル基及び置換アミノカルボニルアルキル基における置換基が挙げることができる。また、上記置換アルコキシアルキル基における置換基としては、前記の置換アルコキシアルキル基における置換基が挙げることができる。
【0020】
【化学式2】
【0021】
前記ヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル基、2−ヒドロキシエチル基、2−ヒドロキシプロピル基、2−ヒドロキシブチル基、2−ヒドロキシペンチル基、2−ヒドロキシヘキシル基等を、ジ(ヒドロキシアルキル)アルキル基としては、ジ(ヒドロキシメチル)メチル基、ジ(2−ヒドロキシエチル)メチル基等を、トリ(ヒドロキシアルキル)アルキル基としては、トリ(ヒドロキシメチル)メチル基、トリ(2−ヒドロキシエチル)メチル基等を、カルボキシアルキル基としては、カルボキシメチル基、2−カルボキシエチル基等を、ジ(カルボキシアルキル)アルキル基としては、ジ(カルボキシメチル)メチル基、ジ(2−カルボキシエチル)メチル基等を、トリ(カルボキシアルキル)アルキル基としては、トリ(カルボキシメチル)メチル基、トリ(2−カルボキシエチル)メチル基等を、それぞれ具体的に例示することができる。
【0022】
また、前記置換もしくは無置換のアミノアルキル基としては、アミノメチル基、2−アミノエチル基、N−メチルアミノメチル基、2−(N−メチルアミノ)エチル基等を、置換もしくは無置換のアミノカルボニルアルキル基としては、アミノカルボニルメチル基、2−アミノカルボニルエチル基、N−メチルアミノカルボニルメチル基、2−(N−メチルアミノカルボニル)エチル基等を、置換もしくは無置換のアルコキシアルキル基としては、メトキシメチル基、エトキシメチル基、2−メトキシエチル基、(カルボキシメチルオキシ)メチル基、(2−ヒドロキシエチルオキシ)メチル基等を、スルホアルキル基としては、スルホメチル基、2−スルホエチル基等を、ジ(スルホアルキル)アルキル基としては、ジ(スルホメチル)メチル基、ジ(2−スルホエチル)メチル基等を、トリ(スルホアルキル)アルキル基としては、トリ(スルホメチル)メチル基、トリ(2−スルホエチル)メチル基等を、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基としては、2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル基、3−ヒドロキシ−4−スルホプロピル基等を、ジ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基としては、ジ(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)メチル基、ジ(3−ヒドロキシ−4−スルホプロピル)メチル基等を、トリ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基としては、トリ(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)メチル基、トリ(3−ヒドロキシ−4−スルホプロピル)メチル基等を、それぞれ具体的に例示することができる。
【0023】
また、一般式[I]で表される化合物の中でも下記一般式[II]で表される化合物が好ましく、一般式[II]中のR1,R2,R3としては、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、トリ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、カルボキシアルキル基、ジ(カルボキシアルキル)アルキル基、トリ(カルボキシアルキル)アルキル基、置換もしくは非置換アミノアルキル基、置換もしくは非置換アミノカルボニルアルキル基、置換もしくは非置換アルコキシアルキル基、スルホアルキル基、ジ(スルホアルキル)アルキル基、トリ(スルホアルキル)アルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基、ジ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基、トリ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基等を挙げることができる。上記アルキル基、ヒドロキシアルキル基、ジ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、トリ(ヒドロキシアルキル)アルキル基、カルボキシアルキル基、ジ(カルボキシアルキル)アルキル基、トリ(カルボキシアルキル)アルキル基、置換もしくは非置換アミノアルキル基、置換もしくは非置換アミノカルボニルアルキル基、置換もしくは非置換アルコキシアルキル基、スルホアルキル基、ジ(スルホアルキル)アルキル基、トリ(スルホアルキル)アルキル基、スルホ−ヒドロキシ−アルキル基、ジ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基、及びトリ(スルホ−ヒドロキシ−アルキル)アルキル基としては、それぞれ、前記の各基が挙げることができ、それぞれの具体例も前記の通りである。
【0024】
上記置換アミノアルキル基、置換アミノカルボニルアルキル基及び置換アルコキシアルキル基における置換基としては、それぞれ、前記の各基が挙げることができ、それぞれの具体例も前記の通りである。
【0025】
【化学式3】
【0026】
本発明で用いられる緩衝剤として、具体的には、グッド緩衝剤として知られているビシン[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン]、トリシン{N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン}の他、グリシン、ADA[N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸]等を挙げることができ、中でも下記式[III]で表されるビシンや式[IV]で表されるトリシンが、不溶性担体粒子凝集反応をより安定化することができるので好ましい。
【0027】
【化学式4】
【0028】
【化学式5】
【0029】
上記一般式[I]、特に一般式[II]で表される化合物からなる緩衝剤は、5〜200mmol/L濃度で使用することがラテックス等の不溶性担体粒子凝集反応をより安定化することができるので好ましい。不溶性担体粒子凝集反応における反応時のpHは、反応を安定化する上で非常に重要であり、緩衝成分の濃度が5mmol/L以上では、一定のpHを維持することが容易となり、他方、200mmol/L以下では不溶性担体粒子同士が抗原抗体反応によらない非特異的な凝集を起こすことがない。また、緩衝成分を含有する緩衝液のpHを調節する酸類としては通常の塩酸や、硫酸、硝酸の他、酢酸等の有機酸等を使用することができ、アルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウムなどを使用することができる。また、本発明における緩衝剤には、上記緩衝成分の他、必要に応じて他の任意成分をも含ませることができる。かかる任意成分としては、検体中の脂質の可溶化に効果のある界面活性剤、特にポリオキシエチレングリコール基を持ったノニオン系界面活性剤やその他カチオン系、アニオン系界面活性剤を例示することができる。
【0030】
本発明における不溶性担体粒子としては、上記本発明の緩衝剤と併用した場合に、測定値に影響を与える血漿成分の働きを抑制して凝集反応を安定化しうるものであればどのようなものでもよく、例えば、特公昭58−11575号公報等に記載された従来公知の有機高分子物質の微粒子や、無機酸化物の微粒子、あるいは核となるこれらの物質の表面を有機物等で表面処理した微粒子を例示することができ、具体的には、例えば、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、(メタ)アクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート等の合成樹脂(ラテックス)や、ニトロセルロース、セルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体や、金属、セラミック、ガラス、シリコンラバー等の無機物を挙げることができる。これらの中でも、特にポリスチレン系の合成高分子、電荷を与える為に成分としてアクリル酸系のモノマーやスルホン酸をもつモノマーなどを共重合したポリスチレン系の合成高分子が好ましい。
【0031】
上記のように、本発明においては、上記不溶性担体として、ポリスチレンラテックス等のラテックス粒子が特に好ましく用いられる。ポリスチレンラテックス等の表面の疎水性が強いラテックスを用いると、タンパク質やペプチドの吸着をスムーズにすることができる。また、乳化剤として界面活性剤を用いないソープフリー重合によって得られるポリスチレンラテックス粒子は、表面の負電荷同士の反発に基づき、界面活性剤なしでも安定に存在できるので特に好ましく用いることができる。その他、種々の変性ラテックス(例えば、カルボン酸変性ラテックス)、磁性ラテックス(磁性粒子を内包させたラテックス)等を必要に応じて用いることもできる。
【0032】
定量的にイムノアッセイを行う場合、通常は、不溶性担体粒子の大きさの均一性、表面状態の制御、内部構造の選択などが高度の次元で要求されるが、このような試薬向けの良好なラテックス等の不溶性担体粒子は、市販品の中から選択して用いることが可能である。また、不溶性担体粒子の形状としては、特に制限されるものではないが、例えば、球状等を挙げることができ、球状の場合の粒子径としては、例えば0.03〜0.8μmの平均粒径、特に0.06〜0.2μmの平均粒径が好ましい。そしてまた、本発明における不溶性担体粒子の反応液中の濃度としては、特に制限がないが、例えば、0.001〜10重量%、好ましくは0.005〜5重量%、より好ましくは0.01〜2重量%の濃度で使用することが不溶性担体粒子凝集反応をより安定化することができるので好ましい。
【0033】
本発明の不溶性担体粒子比濁免疫測定用試薬としては、その使用濃度が5〜200mmol/Lに調整し得るような形態で含まれているビシン、トリシン等の緩衝剤、その使用濃度が0.005〜5重量%に調整し得るような形態で含まれているラテックス等の不溶性担体粒子、不溶性担体粒子担持用抗原又は抗体、及びその他の任意成分を含有する試薬を例示することができる。また、かかる試薬において、抗原又は抗体をあらかじめ担持させた不溶性担体粒子を使用することもできる。
【0034】
本発明の不溶性担体粒子比濁免疫測定方法としては、抗原又は抗体をビシン、トリシン等の緩衝剤の存在下に不溶性担体粒子に、化学結合や物理吸着等により担持させ、次いで免疫凝集反応を行わせる方法や、抗原又は抗体を担持させた不溶性担体粒子に、緩衝剤の存在下に免疫凝集反応を行わせる方法を挙げることができ、その場合、緩衝剤は緩衝液として、不溶性担体粒子は不溶性担体粒子懸濁液として、使用することができるが、不溶性担体粒子は緩衝液に懸濁させた状態で使用してもよい。また、免疫凝集反応時や、抗原又は抗体の不溶性担体粒子担持時における、緩衝剤濃度を5〜200mmol/L、不溶性担体粒子を濃度0.005〜2重量%とすることが好ましい。
【0035】
本発明の不溶性担体粒子比濁免疫測定用キットとしては、ビシン、トリシン等の緩衝剤を5〜200mmol/Lの濃度で含有する緩衝液、ラテックス等の不溶性担体粒子を0.005〜5重量%の濃度で含有する懸濁液、不溶性担体粒子担持用抗原又は抗体、及びその他の任意成分を含有する試薬からなるキットを例示することができる。また、かかる測定用キットにおいて、抗原又は抗体をあらかじめ担持させた不溶性担体粒子を使用することもできる。
【0036】
以下に、実施例を掲げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、実施例中の%表記は、特に断りがない場合は重量%を示す。
【実施例1】
【0037】
[試薬1(緩衝液)の調製]
緩衝剤としてのビシン(同仁化学社製)3.26gを蒸留水に溶解し、0.1gのトリトンX−100、17.5gの塩化ナトリウム、0.01gのアジ化ナトリウムをそれぞれ添加し、20℃でpHを計測しながら1mol/Lの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液を加え、pH8.0に調整し、蒸留水で全量を1,000mLとした。また、ビシンの代わりに、緩衝剤としてトリシン(同仁化学社製)3.58g、TAPSO{2−ヒドロキシ−3−[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパンスルホン酸}(同仁化学社製)5.18g、POPSO[ピペラジン−1,4−ビス(2−ヒドロキシ−3−プロパンスルホン酸)・2水和物](同仁化学社製)7.97g、TES{2−[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]エタンスルホン酸}(同仁化学社製)4.59gをそれぞれ蒸留水に溶解し、同様にトリトンX−100、塩化ナトリウム、アジ化ナトリウムを添加し、pH8.0に調整した後、蒸留水で全量を1,000mLとした。このようにして、本発明のビシン又はトリシンをそれぞれ20mmol/L含む緩衝液と、比較例としてTAPSO、POPSPO、TESをそれぞれ20mmol/L含む緩衝液とからなる5種類の緩衝液を調製した。
【0038】
[試薬2(抗体担持ラテックス懸濁液)の調製]
平均粒子径0.31μmの10%ポリスチレンラテックス懸濁液(協和メデックス社製)1容に、1/60mol/LのPBS溶液(pH7.4になるように1mol/Lの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液で調製したもの)9容を添加してラテックスを希釈し、1%ラテックス懸濁液とした。また、抗ヒトフェリチン抗体(協和メデックス社製)は、蛋白濃度が50μg/mLになるように1/60mol/LのPBS溶液で希釈し担持用の抗体液とした。1%ラテックス懸濁液600μLを25℃のインキューベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、これに上記抗体液1200μLを素早く添加し、25℃にて2時間攪拌した。その後、10mmol/Lのグリシン緩衝液にBSA(和光純薬社製)が0.6%、トリトンX−100(シグマ社製)が0.015%になるように調製したブロッキング液を3mL添加し、25℃にて続けて2時間攪拌した。その後、4℃、15000rpmにて1時間遠心分離した。得られた沈殿にブロッキング液を4mL添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は3回行った。この沈殿にブロッキング液6mLを添加し、0.1%の抗体担持ラテックス懸濁液とした。
【0039】
[検体の調製]
人血液を採血管(ベノジェクト真空採血管;テルモ社製)で採血後、2時間放置して得られた上澄み液(血清)を検体1とした。また、人血液をEDTA採血管(ベノジェクト真空採血管;テルモ社製)で採血後、2時間放置して得られた上澄み液(血清)を検体2とし、人血液を採血管(ベノジェクト真空採血管;テルモ社製)で採血後、2時間放置して得られた上澄み液(血清)に、エチレンジアミン四酢酸二カリウム(同仁化学社製)を1mg/mLになるように添加したものを検体3とした。
【0040】
[試薬1と試薬2を用いた検量線の作成]
フェリチン(スクリプス社製)を生理食塩水に溶解して、10.9、21.9、43.8、87.5、175ng/mLの各濃度のフェリチン溶液をそれぞれ調製し、これらを10μLずつ140μLの試薬1に添加し、37℃、6分間反応させた後、150μLの試薬2を添加し、37℃、13分後に、日立自動分析装置7170型を使用して、2ポイントエンド法(測光ポイント21−39)、主波長750nm、副波長800nmで吸光度変化量を測定することにより検量線を作成した。
【0041】
[試薬1と試薬2を用いたフェリチン濃度の測定]
上記検量線を作成したと同様に、前記検体1と検体2及び検体3の各10μLを、140μLの試薬1にそれぞれ添加し、37℃、6分間反応させた後、調製直後の150μLの試薬2を添加し、37℃13分後に、日立自動分析装置7170型を使用して、2ポイントエンド法(測光ポイント21−39)、主波長750nm、副波長800nmで吸光度変化量を測定し、上記検量線を用いて各検体中のフェリチン濃度を測定した。結果を表1に示す。また、調製直後の試薬1に代えて、調製後1週間が経過した試薬1を用いる他は上記と同様にして測定した結果を表2に示す。表1及び表2から、緩衝剤としてビシンやトリシンを用いた場合、測定感度が安定することがわかる。
【0042】
【表1】
【0043】
【表2】
【実施例2】
【0044】
[試薬3(ラテックス懸濁液)の調製]
緩衝剤としてのビシン3.26gを蒸留水に溶解させ、10%ラテックス(粒径0.087μm;積水化学社製)3.3mL、及び0.1gのアジ化ナトリウムを添加し、20℃でpHを計測しながら1mol/Lの水酸化ナトリウム水溶液又は塩酸を加え、pHを7.8に調整し、蒸留水で全量を1,000mLとした。また、ビシンの代わりに、緩衝剤としてトリシン3.58g、TAPSO5.18g、POPSO7.97g、TES4.59gをそれぞれ蒸留水に溶解し、同様にラテックス、アジ化ナトリウムを添加し、pHを7.8に合わせ、蒸留水で全量を1,000mLとした。このようにして、本発明のビシン又はトリシンをそれぞれ20mmol/L含む緩衝液と、比較例としてTAPSO、POPSPO、TESをそれぞれ20mmol/L含む緩衝液とからなる5種類の緩衝液を調製した。
【0045】
[試薬4(抗体溶液)の調製]
抗原として変性ヒトHbA1cを用いてマウスを免疫し、常法により得られる抗ヒトHbA1cマウスモノクローナル抗体を抗体溶液の調製に用いた。ビシン緩衝剤3.26gを蒸留水に溶解し、塩化ナトリウムを15g添加し、20℃でpHを計測しながら1mol/Lの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液を加え、pHを7.0に調整し、Tween20(和光純薬社製)を2g添加し、アジ化ナトリウムを0.1g添加し、次いで前記抗ヒト変性HbA1cマウスモノクローナル抗体を0.025g(IgG換算)、抗マウスIgGヤギポリクローナル抗体(和光純薬社製)を0.04g(IgG換算)添加し、蒸留水で全量を1,000mLとした。また、ビシン緩衝剤の代わりにトリシン緩衝剤3.58g、TAPSO緩衝剤5.18g、POPSO緩衝剤7.97g、TES緩衝剤4.59g、をそれぞれ蒸留水に溶解し、同様に塩化ナトリウムを添加し、pHを7.0に合わせたものに、ビシンの場合と同様に、Tween20、アジ化ナトリウムを添加し、次いで抗ヒトHbA1cマウスモノクローナル抗体、抗マウスIgGヤギポリクローナル抗体を添加し、蒸留水で全量を1,000mLとした。
【0046】
[検体の調製]
人血液をEDTA採血管(ベノジェクト真空採血管;テルモ社製)で採血後、2時間放置して沈殿した血球層10μLをとり、蒸留水1mLで希釈した検体4と、この検体4にEDTA採血管の上澄み液である血漿を10μL添加した血漿混入検体5を調製した。
【0047】
[試薬3と試薬4を用いた検量線の作成]
東ソー自動グリコヘモグロビン分析計HLC−723GHbVを用いて測定したHbA1c値が、0.0%、4.2%、7.7%、11.3%、14.8%であった各検体を用いて、日立自動分析装置7170型を使用して吸光度変化量を測定することにより検量線を作成した。上記吸光度変化量の測定は、240μLの試薬3に4μLの検体を添加し、37℃で5分間反応させた後、80μLの試薬4を添加し、37℃で5分間反応させた後に主波長450nm、副波長800nmにて、2ポイントエンド法(測光ポイント16−34)で吸光度変化量を測定することにより行った。
【0048】
[試薬3と試薬4を用いたHbA1c濃度の測定]
上記検量線を作成したと同様に、前記検体4と検体5の各4μLを、調製直後の240μLの試薬3にそれぞれ添加し、37℃で5分間反応させた後、調製3日後の80μLの試薬4を添加し、37℃で5分間反応させた後に、日立自動分析装置7170型を使用して、2ポイントエンド法(測光ポイント16−34)、主波長450nm、副波長800nmで吸光度変化量を測定し、上記検量線を用いて各検体中のHbA1c濃度を測定した。結果を表3に示す。また、調製直後の試薬3に代えて、調製後1週間が経過した試薬3を用いる他は上記と同様にして測定した結果を表4に示す。表3及び表4から、緩衝剤としてビシンやトリシンを用いた場合、測定感度が安定していることがわかる。
【0049】
【表3】
【0050】
【表4】
【産業上の利用可能性】
【0051】
本発明によると、不溶性担体粒子凝集反応に関与して測定値に影響を与える血漿成分の働きを抑制して凝集反応を安定化し、反応液の吸光度を安定化し、精確な測定結果を与えることができる。
Claims (4)
- 抗原及び抗体を担持していない不溶性担体粒子の懸濁液、及び、ビシン又はトリシン緩衝剤を含む緩衝液を含有する第一試薬と、抗ヒト変性HbA1c抗体、及び、ビシン又はトリシン緩衝剤を含む緩衝液を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のHbA1cの不溶性担体粒子比濁免疫測定用キット。
- ビシン又はトリシン緩衝剤が、その使用濃度が5〜200mmol/Lに調整し得るような形態で含まれていることを特徴とする請求項1記載の不溶性担体粒子比濁免疫測定用キット。
- 抗原及び抗体を担持していない不溶性担体粒子が、その使用濃度が0.005〜5重量%に調整し得るような形態で含まれていることを特徴とする請求項1又は2記載の不溶性担体粒子比濁免疫測定用キット。
- 不溶性担体粒子が、ラテックスであることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の不溶性担体粒子比濁免疫測定用キット。
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