JP2682697C - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】
本発明は、不溶性担体を使用し免疫凝集反応に基づいて被測定物質を測定する
ために用いられ、高い検出感度で非特異反応が少ない免疫凝集反応測定試薬およ
び免疫凝集反応測定法に関する。特に抗原および抗体の測定に適した免疫凝集反
応測定試薬に関する。また、特に梅毒トレポネーマ抗体およびＨＢＳ抗体の測定
に適した免疫凝集反応測定試薬に関する。 【従来の技術】 体液中の微量成分などの測定方法のひとつとして、目的とする被測定物質であ
る抗原または抗体に対応する抗体または抗原を不溶性担体に担持させ、被測定物
質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合を検出することにより
、被測定物質を測定する免疫測定法がある。このような測定法として、ラテック
ス凝集反応法、赤血球凝集反応法などが知られている。 この凝集の程度を検出する方法としては、凝集の有無を肉眼で判定する方法と
、反応液に光を照射して散乱光あるいは透過光を測定する方法がある。 肉眼で判定する方法は試料中の抗原あるいは抗体の有無の判定法、あるいは半
定量法として用いられている。光学的な測定方法は試料中の抗原あるいは抗体の
定量に用いられている。 これらの凝集反応の測定法において、測定感度の向上あるいは抗原抗体反応の
促進を目的として、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略すときがある）
を反応系に添加することが提案されている。例えば、特開昭５８−４７２５６号
公報では、抗原または抗体を担持した不溶性微粒子と抗体及び／または抗原とを
溶液中で反応させ、反応混合物に光を照射して反応の進行度を光学的に測定する
抗原抗体反応の測定法において、溶液中にポリエチレングリコールを共存させて
いる。これは測定感度の向上を目的とするものであり、ポリエチレングリコール
としては、平均分子量が１，０００以上のものが効果ありとされ、実施例では１
，５４０〜８，０００のものが使用されている。 また、特開昭５９−５４９６８号公報では、赤血球凝集反応の促進用試薬とし
て、リン酸緩衝液に溶解させたポリエチレングリコールが使用されている。この
実施例においては、平均分子量４，０００〜２０，０００のポリエチレングリコ
ールが使用されている。 また、不溶性担体を使用した凝集反応を測定原理とするものではないが、特公
昭６３−４５０６６号公報では、変性ヒト免疫グロブリンを含有する溶液とリウ
マチ因子との反応において、凝集促進剤としてポリエチレングリコールを使用し
ており、平均分子量として１，０００〜２０，０００のものが有効に使えるとの
記載がある。 このように、抗原抗体反応の反応系にポリエチレングリコールを使用すること
が提案されているが、その分子量は、平均分子量２０，０００以下のものである
。 【発明が解決しようとする課題】 従来、使用されてきたＰＥＧは、平均分子量２万以下のものであるが、感度向
上または反応促進の効果はまだ不十分であり、更に効果の高いものが求められて いた。 本発明は、上記の問題点を解決するものであり、その目的とするところは、高
い検出感度で非特異反応が少ない免疫凝集反応測定試薬および測定方法を提供す
ることにある。 更に、梅毒トレポネーマ抗体またはＨＢＳ抗体の測定に適した免疫凝集反応測
定試薬を提供することにある。 【課題を解決するための手段】 上記の問題点を解決するために、ポリエチレングリコールについて鋭意研究し
た。ポリエチレングリコールの感度向上または反応促進の効果は、反応系中での
濃度が高いほど大きくなる。しかし、ポリエチレングリコールの濃度を上げて行
くと試料そのものが混濁を生じたり、抗原あるいは抗体を感作した不溶性担体そ
のものが凝集を生じる。本発明者は、従来検討されたことのない末端基定量法に
よる平均分子量３万以上のポリエチレングリコールについて、反応系中での濃度
とその効果について検討し、平均分子量を大きくすると、末端基定量法による平
均分子量２万以下のものを使用したときと比較して極めて少量で、同等以上の感
度向上効果があり、かつ、試料を混濁させず、非特異的な凝集反応もひき起こさ
ないことを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明の免疫凝集反応測定試薬は、被測定物質である抗原または抗
体に対応する抗体または抗原を担持した不溶性担体および末端基定量法による平
均分子量３０，０００以上のポリエチレングリコールから構成され、そのことに
より前記目的が達成される。 本発明の免疫凝集反応測定試薬は、被測定物質である抗体に対応する抗原を担
持した不溶性担体および末端基定量法による平均分子量３０，０００以上のポリ
エチレングリコールから構成され、そのことにより前記目的が達成される。 本発明の免疫凝集反応測定試薬は、梅毒トレポネーマ抗原またはＨＢＳ抗原を
担持した不溶性担体および末端基定量法による平均分子量３０，０００以上のポ
リエチレングリコールから構成され、そのことにより前記目的が達成される。 本発明の免疫凝集反応測定法は、被測定物質である抗原または抗体に対応する
抗体または抗原を不溶性担体に担持させ、被測定物質との抗原抗体反応により生 じた不溶性担体の凝集の度合を検出することにより、被測定物質を測定する方法
であって、該抗原抗体反応の反応系に末端基定量法による平均分子量３０，００
０以上のポリエチレングリコールを存在させ、そのことにより前記目的が達成さ
れる。 本発明に用いられるＰＥＧとしては、末端基定量法による平均分子量３万〜５
００万、好ましくは５万〜２００万のものが好適である。 本発明で用いられる不溶性担体としては、有機高分子粉末、無機物質粉末、微
生物、血球および細胞膜片などが挙げられる。有機高分子粉末としては、不溶性
アガロース、セルロース、不溶性デキストランなどが例示でき、好ましくはラテ
ックス懸濁液がよい。ラテックスとしては、例えばポリスチレン、スチレン−ス
チレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリ
ロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重
合体、ポリ酢酸ビニルアクリレート等がある。用いるラテックスの平均粒径は、
測定対象物質の検出濃度或は測定機器によって、０．０５〜１．０μｍのものが
適宜選択される。無機物質粉末としてはシリカ、アルミナ、或は金、チタン、鉄
、ニッケル等の金属片などが例示される。 本発明により測定されるべき物質は特に限定されず、一般に抗原抗体反応を利
用して測定し得る生理活性物質はいずれも測定が可能である。被測定物質として
は、タンパク、脂質などがあり、それには例えば、各種抗原、抗体、レセプター
、酵素などが挙げられる。具体的には、ＣＲＰ，ヒトフィブリノーゲン、リウマ
チ因子、アルファーフェトプロティン（ＡＦＰ）、抗ストレプトリジンＯ抗体、
梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、ＨＢＳ抗体、ＨＢｃ抗体、
ＨＢｅ抗体、ＨＬＴＶ Ｉ、II、IIIに対する抗体などが例示される。 本発明により被測定物質を測定する場合の測定系は、例えばラテックス凝集反
応や血球凝集法などの凝集法が利用される。試薬の調製は、まず公知の方法によ
り、不溶性担体に抗原または抗体を物理的に吸着あるいは化学的に結合により担
持（感作）させる。用いる抗体は免疫グロブリンあるいはその断片、例えばＦ(a
b')2でも良い。 次に、測定系について述べる。例えば、ラテックス試薬を用いた抗原抗体反応 により被測定物質を測定する場合には、被測定物質である抗原または抗体に対応
する抗体または抗原を担持したラテックス試薬にあらかじめＰＥＧを添加してお
く。あるいは、ＰＥＧを含まないラテックス試薬を使用することも可能で、この
場合には抗原抗体反応時にＰＥＧが該反応系に存在するようにすればよい。例え
ば、検体にあらかじめＰＥＧを添加しておく方法；使用する緩衝液にＰＥＧを加
えておく方法などがあり、特に限定されない。言いかえれば、本発明の測定試薬
は、例えば、抗体または抗原を担持した不溶性担体、およびＰＥＧを含む、１液
系の試薬；抗体または抗原を担持した不溶性担体を含む第１試薬と、ＰＥＧを含
む緩衝液でなる、第２試薬とで構成される２液系の試薬；など種々の形態であり
得る。 このような試薬を用いて凝集反応を行ない、生じた凝集の程度を光学的に観察
もしくは目視観察することにより被測定物質が測定され得る。具体的には、不溶
性担体の凝集の程度を光学的に検出する方法においては、測定は散乱光強度、吸
光度または透過光強度を測定する光学機器で行う。測定の波長は３００〜２４０
０ｎｍが使用できる。測定方法については公知の方法に従い、用いる不溶性担体
の大きさあるいは濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度また
は透過光強度の増加もしくは減少を測定することにより行われる。また、これら
の方法を併用することも可能である。 不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判定する試薬においては、通常、試料と感作
不溶性担体を含む溶液を判定板上で混合し、１〜５分間揺り動かした後、凝集の
有無を判定する。凝集判定には、単に肉眼判定以外に、ビデオカメラで撮影し、
画像処理を施すことによって判定することも可能である。 この免疫凝集反応測定法において、抗原抗体反応の反応系に存在させるＰＥＧ
の濃度は、ＰＥＧの分子量、共存する塩、タンパク、糖類などの添加物の濃度に
よって適宜選ばれる。一般には、該反応系に０．０１〜３％（ｗ／ｗ）、好まし
くは、０．０５〜１．５％（ｗ／ｗ）の割合で含有されるように調製される。Ｐ
ＥＧ濃度が０．０１％（ｗ／ｗ）を下まわると、ＰＥＧと抗原および抗体との相
互作用が小さくなる結果、増感効果が得られない。逆に３％（ｗ／ｗ）を上まわ
ると不溶性担体が非特異的に凝集し易くなる。 上記抗原抗体反応の条件は通常の場合と同様であり、反応媒体としては、被測
定物質の種類に応じた各種緩衝液が用いられる。この緩衝液は、被測定物質を失
活させることがなく、かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオン強度やｐＨを
有するものであればよい。例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝
液が使用される。反応のｐＨは、５〜１０特に６〜８が好ましい。反応温度は０
〜５０℃特に２０〜４０℃が好ましい。反応時間は適宜決められる。反応時には
、さらに測定系の特異性を高めるために、塩化コリンなどの第４級アンモニウム
塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオン、カオトロピックイオン（Ｃｌ-、Ｉ-、ＳＣＮ-な
ど）、ゼラチンなどを添加することも可能である。 本発明によれば、末端基定量法による平均分子量３万以上のＰＥＧの働きによ
り、高感度かつ非特異反応が少ない測定ができる。 なお、本発明の原理は、分子量の大きなＰＥＧの抗原抗体反応の促進効果によ
っており、抗原または抗体を不溶性担体に担持しない免疫比濁法の試薬、測定方
法においても、その測定感度の向上、抗原抗体反応の促進効果がある。 以下に、本発明の実施例を述べ、その効果を具体的に説明する。 【実施例】 本発明を以下の実施例にて説明する。 本実施例および比較例においてＰＥＧは、すべて和光純薬工業（株）のものが
使用された。 実施例１ ヒトＣＲＰの測定試薬及び測定法−凝集像の肉眼観察による検出方法 （１）抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製 抗ヒトＣＲＰ抗体を１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）に溶解した液１０ｍｌに、平均粒径が０．２６μｍのポリスチレンラ
テックス（固形分１０％、積水化学社製）１ｍｌを添加し、３７℃にて６０分間
攪拌した。次いで、この液を４℃にて６０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心分離
した。得られた沈殿物にウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略）を０．５重量
％含有する０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）１０ｍｌを添加し、ラテック
スを懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製した。 （２）ＰＥＧ溶液の調製 平均分子量５００，０００のＰＥＧを、ＢＳＡを１重量％含有するリン酸−食
塩緩衝液［０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１０Ｍ ＮａＣｌ］に
、０、０．１０、０．２５、０．５０、１．００重量％の濃度になるように溶解
した。 （３）ヒトＣＲＰ測定試薬 本実施例のヒトＣＲＰ測定試薬は、上記（１）項の抗ＣＲＰ抗体感作ラテック
スからなる第１試薬と、上記（２）項のＰＥＧを含む緩衝液からなる第２試薬と
から構成される２液系の試薬である。 （４）標準ＣＲＰ液の調製 ＣＲＰを０．０、０．１０、０．５０、１．００、２．０μｇ／ｍｌ濃度で含
むヒト血清を上記（２）項のＰＥＧ溶液で１：１に希釈して、ＣＲＰ濃度０．０
〜１．０μｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を調製した。 （５）抗原抗体反応 標準ＣＲＰ液５０μｌを判定板上に採り、これに上記（１）項の抗ＣＲＰ抗体
感作ラテックス液５０μｌを滴下し混和する。判定板を手に持ち、ゆるやかに揺
動し２分後に凝集の度合を肉眼で観察した。結果を第１表に示した。 ＋：凝集を示したもの −：凝集を示さなかったもの 比較例１ 実施例１におけるＰＥＧ溶液の調製の項を、次のように行ったことを除いては
、実施例１と同様にして、ヒトＣＲＰ測定試薬を作成した。 ＰＥＧ溶液の調製：平均分子量７，５００のＰＥＧを、実施例１の（２）項で使
用したものと同じ緩衝液に０、１、２、３、４重量％の濃度になるように溶解し
た。 標準ＣＲＰ液は次のように調製した。 標準ＣＲＰ液の調製：ＣＲＰを０．０、０．１０、０．５０、１．００、２．０
μｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を上記のＰＥＧ溶液で１：１に希釈して、ＣＲＰ
濃度０．０〜１．０μｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を調製した。 上記の標準ＣＲＰ液を使用し、実施例１と同様に抗原抗体反応を行った。結果
を表２に示した。 ＋：凝集を示したもの −：凝集を示さなかったもの 第１表および第２表において、標準ＣＲＰ液濃度が０．０（ゼロ）μｇ／ｍｌ
で凝集を示したものは、ＰＥＧによってラテックスそのものが凝集したことによ る。 第１表および第２表より、平均分子量５００，０００のＰＥＧを使用した場合
の検出感度はＣＲＰ液濃度０．２５μｇ／ｍｌであるが、平均分子量７，５００
のＰＥＧの場合のそれは、０．５μｇ／ｍｌであることがわかる。従って、５０
０，０００のＰＥＧを使用した方が高い検出感度である。 実施例２ ヒトＣＲＰの測定試薬及び測定法−光学的な検出方法 （１）抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製 実施例１の（１）項で使用した平均粒径が０．２６μｍのポリスチレンラテッ
クスの代わりに、０．１３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％、積水
化学社製）を用いたことを除いては、実施例１の（１）項と同様にして、抗ＣＲ
Ｐ抗体感作ラテックス液を調製した。 （２）ＰＥＧ溶液の調製 末端基定量法による平均分子量５０，０００のＰＥＧを、ＢＳＡを０．５重量
％含有する０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）に、０．０，０．５、１．０
、２．０、３．０重量％の濃度になるように溶解した。 （３）ヒトＣＲＰ測定試薬 本実施例のヒトＣＲＰ測定試薬は、上記（１）項の抗ＣＲＰ抗体感作ラテック
スからなる第１試薬と、上記（２）項のＰＥＧを含む緩衝液からなる第２試薬と
から構成される２液系の試薬である。 （４）標準ＣＲＰ液 ＣＲＰを０、０．１、０．２、０．２５、０．５μｇ／ｍｌ含むヒト血清を使
用した。 （５）抗原抗体反応 標準ＣＲＰ液３μｌを、上記（２）項のＰＥＧ溶液５００μｌで希釈する。こ
れに上記（１）項の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液５０μｌを添加し、攪拌混合
する。該ラテックス液の添加から５分後に５７０ｎｍの吸光度を分光光度計で読
み取る。 なお、抗原抗体反応は３７℃で行なった。 その結果をｃｅｌｌ長１ｃｍとして換算し第３表に示した。比較例２ 実施例２で使用した末端基定量法による平均分子量５０，０００のＰＥＧの代
わりに、末端基定量法による平均分子量が２０，０００のＰＥＧを用いたことを
除いては、実施例２と同様にして抗原抗体反応を行なった。その結果を第４表に
示した。 第３表および第４表において、＊印は血清そのものが混濁を生じたあるいはラ
テックスそのものがＰＥＧにより凝集を生じたことを表わす。従って＊印以下の
濃度のＰＥＧを使用しなければならない。 第３表および第４表において、ＰＥＧ濃度１％で末端基定量法による平均分子
量５０，０００のＰＥＧと２０，０００のものを比較すると、各標準ＣＲＰ液濃
度での反応性（波長５７０ｎｍの吸光度）は末端基定量法による平均分子量５０
，０００のものの方が高い。すなわち、ＰＥＧの分子量は５０，０００のものを
用いる方が高い検出感度が得られることがわかる。 実施例３ ヒトフィブリノーゲン（Ｆｇ）の測定試薬及び測定法−光学的な検出方法 （１）抗ヒトフィブリノーゲン（抗Ｆｇ）抗体感作ラテックス液の調製 抗Ｆｇ山羊産生抗体を２ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で、０．３Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７．０）に溶解した液１０ｍｌに、平均粒径が０．１０μｍのポリスチレン
ラテックス（固形分１０％、積水化学社製）１ｍｌを添加し、室温にて１２０分
間攪拌した。次いで、この液を４℃にて６０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心分
離した。得られた沈殿物にＢＳＡを０．２重量％含有する０．３Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）１０ｍｌを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗Ｆｇ抗体感作ラテ
ックス液を調製した。 （２）ＰＥＧ溶液の調製 平均分子量５００，０００のＰＥＧを、ＢＳＡを０．２重量％で含有する０．
３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、０．０、０．１、０．２、０．３、０．４
重量％の濃度になるように溶解した。 （３）Ｆｇ測定試薬 本実施例のＦｇ測定試薬は、上記（１）項の抗Ｆｇ抗体感作ラテックスからな
る第１試薬と、上記（２）項のＰＥＧを含む緩衝液からなる第２試薬とから構成
される２液系の試薬である。 （４）標準Ｆｇ液 Ｆｇを０、１．０、２．０、４．０、８．０μｇ／ｍｌを含むヒト血清を使用
した。 （５）抗原抗体反応 標準Ｆｇ液１０μｌを、上記（２）項のＰＥＧ溶液４００μｌで希釈する。こ
れに上記（１）項の抗Ｆｇ抗体感作ラテックス液６０μｌを添加し、攪拌混合す
る。該ラテックス液の添加から６０秒後と１６０秒後の波長５７０ｎｍの吸光度
の差を分光光度計で読み取る。抗原抗体反応は３７℃で行なった。その結果を第
５表に示した。 比較例３ 実施例３で使用したＰＥＧ溶液を代わりに、平均分子量３，０００のＰＥＧを
実施例５と同じ緩衝液に０．０、０．５、１．０、２．０、３．０重量％の濃度
になるように溶解したＰＥＧ溶液を用いたことを除いては、実施例３と同様にし
て抗原抗体反応を行なった。その結果を第６表に示した。 第５表および第６表において、＊印は血清そのものが混濁を生じたあるいはラ
テックスそのものがＰＥＧにより凝集を生じたことを表わす。従って＊印以下の
濃度のＰＥＧを使用しなければならない。 第５表および第６表において、平均分子量５００，０００のＰＥＧ濃度０．３
％使用のものと、分子量３，０００のＰＥＧ濃度２．０％使用のものの吸光度を
比較すると、各フィブリノーゲン濃度での反応性（波長５７０ｎｍの吸光度）は
平均分子量５００，０００のものの方が高い。すなわち、ＰＥＧの分子量は５０
０，０００のものを用いる方が高い検出感度を得られることがわかる。 実施例４ 梅毒抗体の測定試薬及び測定法−凝集像の肉眼観察による検出方法 梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体の測定を行なった。本実施例においては、
次に挙げる試薬および測定用検体を使用した。後述の実施例５〜７及び比較例４
〜７においても、特に指示されない限り、同名の試薬および検体については、同
様のものを使用した。 ＰＢＳ（リン酸緩衝液）：リン酸−ナトリウム（２水和物）、リン酸二ナトリウ
ム（２水和物）および塩化ナトリウムを、リン酸および塩化ナトリウムの終濃度
がそれぞれ０．０２Ｍおよび０．１５Ｍ、ｐＨが７．４となるように精製水に加
えて、調製を行なった。 １％ＢＳＡ・ＰＢＳ：ＰＢＳにＢＳＡを１％（ｗ／ｗ）となるように溶解させて
調製した。 １％トリトンＸ−１００：リン酸緩衝液にトリトンＸ−１００を１％（ｗ／ｗ）
となるように溶解させた。 梅毒抗原液：家兎睾丸中で１０〜１４日間培養したトレポネーマ パリダム［Ｔ
ｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ；ＣＤＣ （Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉ
ｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ
， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｅｄｕｃａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ， Ａｔｌａｎｔａ， Ｇｅｏｒｇｉａ）より入
手したものを家兎睾丸に接種し、継代培養したものを用いた］を生理食塩水中に
１０9個菌体／ｍｌとなるように懸濁した菌体懸濁液１ｍｌを採り、リン酸緩衝
液中で遠心分離（６，０００ｒｐｍ×５分、３回）することにより洗浄した。次
いで、得られた沈殿に１％トリトンＸ−１００を１ｍｌ添加し、３７℃にて３０
分間インキューベートした。その後、これを超遠心分離機にかけて（５０，００
０ｒｐｍ×１時間）上清を採取し、１％トリトン−１００で１，０００倍希釈し
て使用した。 梅毒陽性家兎血清：トレポネーマ パリダムを睾丸に接種後４５日間飼育した家
兎から血清を採取した。この血清を１％ＢＳＡ・ＰＢＳで１００倍、２００倍お
よび４００倍に希釈して使用した。 正常家兎血清：トレポネーマ パリダムを接種されていない家兎から採取した血
清を用いた。市販のＴＰＨＡキット（セロディアＴＰ；富士レビオ製）を用いて
タイターを測定したところ、結果は陰性を示した。この血清を１％ＢＳＡ・ＰＢ
Ｓで１００倍から４００倍に希釈して用いた。 ラテックス：積水化学工業（株）製の粒子０．２３μｍのポリスチレンラテック
ス（固形分１０％）を用いた。 ０．２０、０．５、１．００および２．００％ＰＥＧ５００，０００：平均分子
量５００，０００のＰＥＧを１％ＢＳＡ・ＰＢＳに、それぞれ０．２０、０．５
０、１．００および２．００％（ｗ／ｗ）となるように溶解させたもの。 （Ａ）ラテックスへの梅毒抗原の感作：ラテックス１００μｌと、梅毒抗原液４
００μｌとを速やかに混合し、室温で攪拌した。１時間後に１％ＢＳＡ・ＰＢＳ
を５ｍｌ加え、１５０００ｒｐｍで１時間得遠心した。これを２回繰り返してラ
テックスを洗浄した。洗浄後のペレットを２ｍｌの０．２０．０．５０、１．０
０および２．００％ＰＥＧ５００，０００に懸濁させ、よく分散して固形分０．
５％のラテックス試薬を得た。これを４℃にて保存した。 （Ｂ）梅毒抗体の測定：梅毒陽性家兎血清と（Ａ）項で得られたラテックス試薬
とを５０μｌずつ判定板上に採り（このため反応時のＰＥＧ最終濃度は０．１〜
１．０％となる）、混合・攪拌したのち３分間反応させた。対照として、正常家
兎血清についても同様に反応を行なった。ラテックス試薬の凝集を目視観察した
。凝集した検体を陽性、凝集の認められなかった検体を陰性とした。その結果を
第７表に示す。第７表において＋および＋＋は陽性（＋＋は凝集の度合が大きい
）、±は偽陽性、そして−は陰性を示す。 比較例４ ０．２０〜２．００％ＰＥＧ５００，０００の代わりに、下記の２．０、４．
０、６．０、８．０％ＰＥＧ７，５００または１％ＢＳＡ・ＰＢＳを用いて実施
例４と同様に反応を行なった。その結果を第７表に示す。 ２．０、４．０、６．０および８．０％ＰＥＧ７，５００：平均分子量７，５０
０のＰＥＧを１％ＢＳＡ・ＰＢＳに、それぞれ２．０、４．０、６．０および８
．０％（ｗ／ｗ）となるように溶解させたもの。 第７表より、ＰＥＧの分子量は５００，０００を使用する方が７，５００より
も高い検出感度が得られることがわかった。 実施例５ 梅毒抗体の測定試薬及び測定法−光学的な検出方法 実施例４と同様の検体および試薬を用い、日立７０５０型全自動分析装置によ
り測定を行なった。但し、梅毒抗原感作ラテックス試薬にはＰＥＧ５００，００
０は加えず、１％ＢＳＡ・ＰＢＳで希釈して固形分０．２５％に調製した。 また、ＰＥＧ５００，０００は１％ＢＳＡ・ＰＢＳに０．１、０．２５、０．
５０および１．００％（ｗ／ｗ）に溶解させて使用した。すなわち、この試薬は
感作ラテックス液からなる第１試薬とＰＥＧ溶液からなる第２試薬とから構成さ れるものである。 測定方法と測定結果 検体として梅毒陽性家兎血清または正常家兎血清３μｌを採り、これに上記の
ＰＥＧ５００，０００の０．１〜１．００％溶液３５０μｌを加えた。これに上
記の梅毒抗原感作ラテックス液５０μｌを添加後、この溶液を攪拌・混合した。
そして、該ラテックス液の添加から８０秒後と３２０秒後の波長５７０ｎｍにお
ける吸光度の差（ΔＯＤ570）を分光光度計で読み取った。なお、抗原抗体反応
は３７℃で行なった。ΔＯＤ570を１０，０００倍して結果を第８表に示した。 また、使用したＰＥＧの濃度とΔＯＤ570との関係を第１図に示した。 比較例５ ０．１〜１．０％ＰＥＧ５００，０００の代わりに、ＰＥＧ７，５００を１％
ＢＳＡ・ＰＢＳにそれぞれ１．０、２．０、３．０、４．０％（ｗ／ｗ）となる
ように溶解させたもの、または１％ＢＳＡ・ＰＢＳを用いて、実施例５と同様に
反応を行なった。その結果を第８表に示した。 また、使用したＰＥＧの濃度とΔＯＤ570との関係を第２図に示した。 第８表、第１図および第２図よりＰＥＧ５００，０００の方がＰＥＧ７，５０
０より高感度かつ非特異反応の少ない定量ができることが分かった。なお、第１
図をみると、ＰＥＧ濃度０．５％で正常血清でのΔＯＤ570値が低く、梅毒陽性
血清でのΔＯＤ570値が高い値を示しているので至適ＰＥＧ濃度は０．５％であ
る。 実施例６ ＨＢＳ抗体の測定試薬および測定法−凝集像の肉眼観察による検出方法 本実施例において、実施例４と同一名の試薬は実施例４と同様に調製を行なっ
た。その他の試薬の調製法を次に示す。 ＨＢｓ抗原液：ヒト血漿よりアフィニティークロマトグラフィーにより精製した
精製ＨＢｓ抗原を使用した。抗原はリン酸緩衝液に溶解し、濃度をローリー法に
より測定した。使用直前に、リン酸緩衝液により希釈し、濃度を１〜１０μｇ／
ｍｌとなるように調製し、これをＨＢｓ抗原液とした。 抗ＨＢｓ抗血清（陽性家兎血清）：精製ＨＢｓ抗原を、フロイントの完全アジュ
バントとともに家兎に免疫して得られた抗血清を、正常ヒト血清を結合させたカ
ラムで吸収操作をしてから用いた。正常ヒト血清を結合させたカラムはＣＮＢｒ
活性化セファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア社）を用い、メーカー（ファルマシ
ア）の使用説明書に従って行なった。吸収操作を行なった抗ＨＢｓ抗血清は、１
％ＢＳＡ・ＰＢＳにより８０倍から８００倍に希釈して用いた。 正常家兎血清：ＨＢｓ抗原が接種されていない家兎から採取した血清を用いた。
市販ＰＨＡキットあるいはＥＩＡキットにより抗体の有無を測定したところ、陰 性であった。この血清を１％ＢＳＡ・ＰＢＳで８０倍から８００倍に希釈して用
いた。 ０．２〜０．６％ＰＥＧ５００，０００：平均分子量５００，０００のＰＥＧを
１％ＢＳＡ・ＰＢＳで０．２、０．３、０．３５、０．４および０．６％（ｗ／
ｗ）に溶解したもの。 １．０〜２．０％ＰＥＧ５０，０００：末端基定量法による平均分子量５０，０
００のＰＥＧを１％ＢＳＡ・ＰＢＳで１．０、１．５および２．０％（ｗ／ｗ）
に溶解したもの。 （Ａ）ラテックスへのＨＢｓ抗原の感作：ラテックス１００μｌと、ＨＢｓ抗原
液４００μｌとを速やかに混合し、室温で攪拌した。１時間後に１％ＢＳＡ・Ｐ
ＢＳを５ｍｌ加え、１５０００ｒｐｍで１時間遠心した。これを２回繰り返して
ラテックスを洗浄した。洗浄後のペレットを２ｍｌの０．２〜０．６％ＰＥＧ５
００，０００または１．０〜２．０％ＰＥＧ５０，０００に懸濁させ、よく分散
して固形分０．５％のラテックス試薬を得た。これを４℃にて保存した。 （Ｂ）ＨＢｓ抗体の測定 ＨＢｓ陽性家兎血清と本実施例（Ａ）項で得られたラテックス試薬とを５０μ
ｌずつ判定板上に採り、混合・攪拌したのち３分間反応させた。対照として、正
常家兎血清についても同様に反応を行なった。ラテックス試薬の凝集を実施例４
と同様に行なった。その結果を第９表に示す。 比較例６ 実施例６で使用したＰＥＧ５００，０００またはＰＥＧ５０，０００の代わり
に、下記の１．０〜４．０％ＰＥＧ７，５００、１０〜２０％ＰＥＧ１，０００
または１％ＢＳＡ・ＰＢＳを用いて、実施例６と同様に反応を行なった。その結
果を第９表に示す。 １．０〜４．０％ＰＥＧ７，５００：平均分子量７，５００のＰＥＧを，１％Ｂ
ＳＡ・ＰＢＳに、１．０、２．０、３．０および４．０％（ｗ／ｗ）に溶解した
もの。 １０〜２０％ＰＥＧ１，０００：平均分子量１，０００のＰＥＧを１％ＢＳＡ・
ＰＢＳに、１０、１５および２０％（ｗ／ｗ）に溶解したもの。 第９表よりＰＥＧの分子量は３０，０００以上を用いる方が高い検出感度が得
られることがわかった。また、ＰＥＧの分子量は５０，０００より５００，００
０を用いる方が、より高い感度が得られることがわかった。 実施例７ ＨＢＳ抗体の測定試薬及び測定法−光学的な検出方法 実施例６の検体および試薬を用い、日立７０５０型全自動分析装置により測定
を行なった。但し、ＨＢＳ抗原感作ラテックス試薬にはＰＥＧ５００，０００ま
たは５０，０００は加えず、１％ＢＳＡ・ＰＢＳで希釈して固形分０．２５％に
調製した。また、ＰＥＧ５００，０００は１％ＢＳＡ・ＰＢＳに０．２、０．３ 、０．３５、０．４および０．６％（ｗ／ｗ）に、ＰＥＧ５０，０００は１％Ｂ
ＳＡ・ＰＢＳに１．０、１．５および２．０％（ｗ／ｗ）に溶解させて使用した
。すなわち、この試薬は感作ラテックス液からなる第１試薬とＰＥＧ溶液からな
る第２試薬とから構成されるものである。 測定方法と測定結果 検体としてＨＢＳ陽性家兎血清または正常家兎血清２０μｌを採り、これに上
記の各濃度のＰＥＧ５００，０００またはＰＥＧ５０，０００の溶掖３５０μｌ
を加えた。これに上記のＨＢＳ抗原感作ラテックス液５０μｌを添加後、この溶
液を攪拌・混合した。そして、該ラテックス液の添加から８０秒後と３２０秒後
の波長５７０ｎｍにおける吸光度の差（ΔＯＤ570）を分光光度計で読み取った
。なお、抗原抗体反応は３７℃で行なった。ΔＯＤ570を１０，０００倍して結
果を第１０表に示した。 また、使用したＰＥＧの濃度とΔＯＤ570との関係をＰＥＧ５００，０００に
ついては第３図、ＰＥＧ５０，０００については第４図に示した。 比較例７ ＰＥＧ５００，０００またはＰＥＧ５０，０００の代わりに、ＰＥＧ７，５０
０を１％ＢＳＡ・ＰＢＳにそれぞれ１．０、２．０、３．０および４．０％（ｗ
／ｗ）となるように溶解させたもの、ＰＥＧ１，０００を１％ＢＳＡ・ＰＢＳに
それぞれ１０、１５および２０％（ｗ／ｗ）となるように溶解させたものまたは
１％ＢＳＡ・ＰＢＳを用いて、実施例７と同様に反応を行なった。その結果を第
１０表に示した。 また、使用したＰＥＧの濃度とΔＯＤ570との関係をＰＥＧ７，５００につい
て第５図、ＰＥＧ１，０００について第６図に示した。 第１０表および第３〜６図より、ＰＥＧの分子量は３０，０００以上を用いる
方が高い検出感度が得られかつ非特異反応の少ない定量ができることがわかった
また、ＰＥＧの分子量は５０，０００よりも５００，０００を用いる方がさら
に高い検出感度が得られることが分かった。 ＰＥＧ５００，０００を用いた場合、０．３〜０．３５％で高い検出感度が得
られかつ非特異反応が少なく、至適であることがわかった。 【発明の効果】 本発明によれば、このように、不溶性担体を使用し免疫凝集反応に基づく被測
定物質の測定において、高い検出感度で非特異反応が少ない免疫凝集反応測定試
薬および免疫凝集反応測定法が提供される。従って、本発明の試薬及び測定法は
、各種の生理活性物質、特に、アルファーフェトプロティン抗原、梅毒トレポネ
ーマ抗体およびＨＢＳ抗体などの測定に適している。
ために用いられ、高い検出感度で非特異反応が少ない免疫凝集反応測定試薬およ
び免疫凝集反応測定法に関する。特に抗原および抗体の測定に適した免疫凝集反
応測定試薬に関する。また、特に梅毒トレポネーマ抗体およびＨＢＳ抗体の測定
に適した免疫凝集反応測定試薬に関する。 【従来の技術】 体液中の微量成分などの測定方法のひとつとして、目的とする被測定物質であ
る抗原または抗体に対応する抗体または抗原を不溶性担体に担持させ、被測定物
質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合を検出することにより
、被測定物質を測定する免疫測定法がある。このような測定法として、ラテック
ス凝集反応法、赤血球凝集反応法などが知られている。 この凝集の程度を検出する方法としては、凝集の有無を肉眼で判定する方法と
、反応液に光を照射して散乱光あるいは透過光を測定する方法がある。 肉眼で判定する方法は試料中の抗原あるいは抗体の有無の判定法、あるいは半
定量法として用いられている。光学的な測定方法は試料中の抗原あるいは抗体の
定量に用いられている。 これらの凝集反応の測定法において、測定感度の向上あるいは抗原抗体反応の
促進を目的として、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略すときがある）
を反応系に添加することが提案されている。例えば、特開昭５８−４７２５６号
公報では、抗原または抗体を担持した不溶性微粒子と抗体及び／または抗原とを
溶液中で反応させ、反応混合物に光を照射して反応の進行度を光学的に測定する
抗原抗体反応の測定法において、溶液中にポリエチレングリコールを共存させて
いる。これは測定感度の向上を目的とするものであり、ポリエチレングリコール
としては、平均分子量が１，０００以上のものが効果ありとされ、実施例では１
，５４０〜８，０００のものが使用されている。 また、特開昭５９−５４９６８号公報では、赤血球凝集反応の促進用試薬とし
て、リン酸緩衝液に溶解させたポリエチレングリコールが使用されている。この
実施例においては、平均分子量４，０００〜２０，０００のポリエチレングリコ
ールが使用されている。 また、不溶性担体を使用した凝集反応を測定原理とするものではないが、特公
昭６３−４５０６６号公報では、変性ヒト免疫グロブリンを含有する溶液とリウ
マチ因子との反応において、凝集促進剤としてポリエチレングリコールを使用し
ており、平均分子量として１，０００〜２０，０００のものが有効に使えるとの
記載がある。 このように、抗原抗体反応の反応系にポリエチレングリコールを使用すること
が提案されているが、その分子量は、平均分子量２０，０００以下のものである
。 【発明が解決しようとする課題】 従来、使用されてきたＰＥＧは、平均分子量２万以下のものであるが、感度向
上または反応促進の効果はまだ不十分であり、更に効果の高いものが求められて いた。 本発明は、上記の問題点を解決するものであり、その目的とするところは、高
い検出感度で非特異反応が少ない免疫凝集反応測定試薬および測定方法を提供す
ることにある。 更に、梅毒トレポネーマ抗体またはＨＢＳ抗体の測定に適した免疫凝集反応測
定試薬を提供することにある。 【課題を解決するための手段】 上記の問題点を解決するために、ポリエチレングリコールについて鋭意研究し
た。ポリエチレングリコールの感度向上または反応促進の効果は、反応系中での
濃度が高いほど大きくなる。しかし、ポリエチレングリコールの濃度を上げて行
くと試料そのものが混濁を生じたり、抗原あるいは抗体を感作した不溶性担体そ
のものが凝集を生じる。本発明者は、従来検討されたことのない末端基定量法に
よる平均分子量３万以上のポリエチレングリコールについて、反応系中での濃度
とその効果について検討し、平均分子量を大きくすると、末端基定量法による平
均分子量２万以下のものを使用したときと比較して極めて少量で、同等以上の感
度向上効果があり、かつ、試料を混濁させず、非特異的な凝集反応もひき起こさ
ないことを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明の免疫凝集反応測定試薬は、被測定物質である抗原または抗
体に対応する抗体または抗原を担持した不溶性担体および末端基定量法による平
均分子量３０，０００以上のポリエチレングリコールから構成され、そのことに
より前記目的が達成される。 本発明の免疫凝集反応測定試薬は、被測定物質である抗体に対応する抗原を担
持した不溶性担体および末端基定量法による平均分子量３０，０００以上のポリ
エチレングリコールから構成され、そのことにより前記目的が達成される。 本発明の免疫凝集反応測定試薬は、梅毒トレポネーマ抗原またはＨＢＳ抗原を
担持した不溶性担体および末端基定量法による平均分子量３０，０００以上のポ
リエチレングリコールから構成され、そのことにより前記目的が達成される。 本発明の免疫凝集反応測定法は、被測定物質である抗原または抗体に対応する
抗体または抗原を不溶性担体に担持させ、被測定物質との抗原抗体反応により生 じた不溶性担体の凝集の度合を検出することにより、被測定物質を測定する方法
であって、該抗原抗体反応の反応系に末端基定量法による平均分子量３０，００
０以上のポリエチレングリコールを存在させ、そのことにより前記目的が達成さ
れる。 本発明に用いられるＰＥＧとしては、末端基定量法による平均分子量３万〜５
００万、好ましくは５万〜２００万のものが好適である。 本発明で用いられる不溶性担体としては、有機高分子粉末、無機物質粉末、微
生物、血球および細胞膜片などが挙げられる。有機高分子粉末としては、不溶性
アガロース、セルロース、不溶性デキストランなどが例示でき、好ましくはラテ
ックス懸濁液がよい。ラテックスとしては、例えばポリスチレン、スチレン−ス
チレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリ
ロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重
合体、ポリ酢酸ビニルアクリレート等がある。用いるラテックスの平均粒径は、
測定対象物質の検出濃度或は測定機器によって、０．０５〜１．０μｍのものが
適宜選択される。無機物質粉末としてはシリカ、アルミナ、或は金、チタン、鉄
、ニッケル等の金属片などが例示される。 本発明により測定されるべき物質は特に限定されず、一般に抗原抗体反応を利
用して測定し得る生理活性物質はいずれも測定が可能である。被測定物質として
は、タンパク、脂質などがあり、それには例えば、各種抗原、抗体、レセプター
、酵素などが挙げられる。具体的には、ＣＲＰ，ヒトフィブリノーゲン、リウマ
チ因子、アルファーフェトプロティン（ＡＦＰ）、抗ストレプトリジンＯ抗体、
梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、ＨＢＳ抗体、ＨＢｃ抗体、
ＨＢｅ抗体、ＨＬＴＶ Ｉ、II、IIIに対する抗体などが例示される。 本発明により被測定物質を測定する場合の測定系は、例えばラテックス凝集反
応や血球凝集法などの凝集法が利用される。試薬の調製は、まず公知の方法によ
り、不溶性担体に抗原または抗体を物理的に吸着あるいは化学的に結合により担
持（感作）させる。用いる抗体は免疫グロブリンあるいはその断片、例えばＦ(a
b')2でも良い。 次に、測定系について述べる。例えば、ラテックス試薬を用いた抗原抗体反応 により被測定物質を測定する場合には、被測定物質である抗原または抗体に対応
する抗体または抗原を担持したラテックス試薬にあらかじめＰＥＧを添加してお
く。あるいは、ＰＥＧを含まないラテックス試薬を使用することも可能で、この
場合には抗原抗体反応時にＰＥＧが該反応系に存在するようにすればよい。例え
ば、検体にあらかじめＰＥＧを添加しておく方法；使用する緩衝液にＰＥＧを加
えておく方法などがあり、特に限定されない。言いかえれば、本発明の測定試薬
は、例えば、抗体または抗原を担持した不溶性担体、およびＰＥＧを含む、１液
系の試薬；抗体または抗原を担持した不溶性担体を含む第１試薬と、ＰＥＧを含
む緩衝液でなる、第２試薬とで構成される２液系の試薬；など種々の形態であり
得る。 このような試薬を用いて凝集反応を行ない、生じた凝集の程度を光学的に観察
もしくは目視観察することにより被測定物質が測定され得る。具体的には、不溶
性担体の凝集の程度を光学的に検出する方法においては、測定は散乱光強度、吸
光度または透過光強度を測定する光学機器で行う。測定の波長は３００〜２４０
０ｎｍが使用できる。測定方法については公知の方法に従い、用いる不溶性担体
の大きさあるいは濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度また
は透過光強度の増加もしくは減少を測定することにより行われる。また、これら
の方法を併用することも可能である。 不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判定する試薬においては、通常、試料と感作
不溶性担体を含む溶液を判定板上で混合し、１〜５分間揺り動かした後、凝集の
有無を判定する。凝集判定には、単に肉眼判定以外に、ビデオカメラで撮影し、
画像処理を施すことによって判定することも可能である。 この免疫凝集反応測定法において、抗原抗体反応の反応系に存在させるＰＥＧ
の濃度は、ＰＥＧの分子量、共存する塩、タンパク、糖類などの添加物の濃度に
よって適宜選ばれる。一般には、該反応系に０．０１〜３％（ｗ／ｗ）、好まし
くは、０．０５〜１．５％（ｗ／ｗ）の割合で含有されるように調製される。Ｐ
ＥＧ濃度が０．０１％（ｗ／ｗ）を下まわると、ＰＥＧと抗原および抗体との相
互作用が小さくなる結果、増感効果が得られない。逆に３％（ｗ／ｗ）を上まわ
ると不溶性担体が非特異的に凝集し易くなる。 上記抗原抗体反応の条件は通常の場合と同様であり、反応媒体としては、被測
定物質の種類に応じた各種緩衝液が用いられる。この緩衝液は、被測定物質を失
活させることがなく、かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオン強度やｐＨを
有するものであればよい。例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝
液が使用される。反応のｐＨは、５〜１０特に６〜８が好ましい。反応温度は０
〜５０℃特に２０〜４０℃が好ましい。反応時間は適宜決められる。反応時には
、さらに測定系の特異性を高めるために、塩化コリンなどの第４級アンモニウム
塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオン、カオトロピックイオン（Ｃｌ-、Ｉ-、ＳＣＮ-な
ど）、ゼラチンなどを添加することも可能である。 本発明によれば、末端基定量法による平均分子量３万以上のＰＥＧの働きによ
り、高感度かつ非特異反応が少ない測定ができる。 なお、本発明の原理は、分子量の大きなＰＥＧの抗原抗体反応の促進効果によ
っており、抗原または抗体を不溶性担体に担持しない免疫比濁法の試薬、測定方
法においても、その測定感度の向上、抗原抗体反応の促進効果がある。 以下に、本発明の実施例を述べ、その効果を具体的に説明する。 【実施例】 本発明を以下の実施例にて説明する。 本実施例および比較例においてＰＥＧは、すべて和光純薬工業（株）のものが
使用された。 実施例１ ヒトＣＲＰの測定試薬及び測定法−凝集像の肉眼観察による検出方法 （１）抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製 抗ヒトＣＲＰ抗体を１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）に溶解した液１０ｍｌに、平均粒径が０．２６μｍのポリスチレンラ
テックス（固形分１０％、積水化学社製）１ｍｌを添加し、３７℃にて６０分間
攪拌した。次いで、この液を４℃にて６０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心分離
した。得られた沈殿物にウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略）を０．５重量
％含有する０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）１０ｍｌを添加し、ラテック
スを懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製した。 （２）ＰＥＧ溶液の調製 平均分子量５００，０００のＰＥＧを、ＢＳＡを１重量％含有するリン酸−食
塩緩衝液［０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１０Ｍ ＮａＣｌ］に
、０、０．１０、０．２５、０．５０、１．００重量％の濃度になるように溶解
した。 （３）ヒトＣＲＰ測定試薬 本実施例のヒトＣＲＰ測定試薬は、上記（１）項の抗ＣＲＰ抗体感作ラテック
スからなる第１試薬と、上記（２）項のＰＥＧを含む緩衝液からなる第２試薬と
から構成される２液系の試薬である。 （４）標準ＣＲＰ液の調製 ＣＲＰを０．０、０．１０、０．５０、１．００、２．０μｇ／ｍｌ濃度で含
むヒト血清を上記（２）項のＰＥＧ溶液で１：１に希釈して、ＣＲＰ濃度０．０
〜１．０μｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を調製した。 （５）抗原抗体反応 標準ＣＲＰ液５０μｌを判定板上に採り、これに上記（１）項の抗ＣＲＰ抗体
感作ラテックス液５０μｌを滴下し混和する。判定板を手に持ち、ゆるやかに揺
動し２分後に凝集の度合を肉眼で観察した。結果を第１表に示した。 ＋：凝集を示したもの −：凝集を示さなかったもの 比較例１ 実施例１におけるＰＥＧ溶液の調製の項を、次のように行ったことを除いては
、実施例１と同様にして、ヒトＣＲＰ測定試薬を作成した。 ＰＥＧ溶液の調製：平均分子量７，５００のＰＥＧを、実施例１の（２）項で使
用したものと同じ緩衝液に０、１、２、３、４重量％の濃度になるように溶解し
た。 標準ＣＲＰ液は次のように調製した。 標準ＣＲＰ液の調製：ＣＲＰを０．０、０．１０、０．５０、１．００、２．０
μｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を上記のＰＥＧ溶液で１：１に希釈して、ＣＲＰ
濃度０．０〜１．０μｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を調製した。 上記の標準ＣＲＰ液を使用し、実施例１と同様に抗原抗体反応を行った。結果
を表２に示した。 ＋：凝集を示したもの −：凝集を示さなかったもの 第１表および第２表において、標準ＣＲＰ液濃度が０．０（ゼロ）μｇ／ｍｌ
で凝集を示したものは、ＰＥＧによってラテックスそのものが凝集したことによ る。 第１表および第２表より、平均分子量５００，０００のＰＥＧを使用した場合
の検出感度はＣＲＰ液濃度０．２５μｇ／ｍｌであるが、平均分子量７，５００
のＰＥＧの場合のそれは、０．５μｇ／ｍｌであることがわかる。従って、５０
０，０００のＰＥＧを使用した方が高い検出感度である。 実施例２ ヒトＣＲＰの測定試薬及び測定法−光学的な検出方法 （１）抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製 実施例１の（１）項で使用した平均粒径が０．２６μｍのポリスチレンラテッ
クスの代わりに、０．１３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％、積水
化学社製）を用いたことを除いては、実施例１の（１）項と同様にして、抗ＣＲ
Ｐ抗体感作ラテックス液を調製した。 （２）ＰＥＧ溶液の調製 末端基定量法による平均分子量５０，０００のＰＥＧを、ＢＳＡを０．５重量
％含有する０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）に、０．０，０．５、１．０
、２．０、３．０重量％の濃度になるように溶解した。 （３）ヒトＣＲＰ測定試薬 本実施例のヒトＣＲＰ測定試薬は、上記（１）項の抗ＣＲＰ抗体感作ラテック
スからなる第１試薬と、上記（２）項のＰＥＧを含む緩衝液からなる第２試薬と
から構成される２液系の試薬である。 （４）標準ＣＲＰ液 ＣＲＰを０、０．１、０．２、０．２５、０．５μｇ／ｍｌ含むヒト血清を使
用した。 （５）抗原抗体反応 標準ＣＲＰ液３μｌを、上記（２）項のＰＥＧ溶液５００μｌで希釈する。こ
れに上記（１）項の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液５０μｌを添加し、攪拌混合
する。該ラテックス液の添加から５分後に５７０ｎｍの吸光度を分光光度計で読
み取る。 なお、抗原抗体反応は３７℃で行なった。 その結果をｃｅｌｌ長１ｃｍとして換算し第３表に示した。比較例２ 実施例２で使用した末端基定量法による平均分子量５０，０００のＰＥＧの代
わりに、末端基定量法による平均分子量が２０，０００のＰＥＧを用いたことを
除いては、実施例２と同様にして抗原抗体反応を行なった。その結果を第４表に
示した。 第３表および第４表において、＊印は血清そのものが混濁を生じたあるいはラ
テックスそのものがＰＥＧにより凝集を生じたことを表わす。従って＊印以下の
濃度のＰＥＧを使用しなければならない。 第３表および第４表において、ＰＥＧ濃度１％で末端基定量法による平均分子
量５０，０００のＰＥＧと２０，０００のものを比較すると、各標準ＣＲＰ液濃
度での反応性（波長５７０ｎｍの吸光度）は末端基定量法による平均分子量５０
，０００のものの方が高い。すなわち、ＰＥＧの分子量は５０，０００のものを
用いる方が高い検出感度が得られることがわかる。 実施例３ ヒトフィブリノーゲン（Ｆｇ）の測定試薬及び測定法−光学的な検出方法 （１）抗ヒトフィブリノーゲン（抗Ｆｇ）抗体感作ラテックス液の調製 抗Ｆｇ山羊産生抗体を２ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で、０．３Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７．０）に溶解した液１０ｍｌに、平均粒径が０．１０μｍのポリスチレン
ラテックス（固形分１０％、積水化学社製）１ｍｌを添加し、室温にて１２０分
間攪拌した。次いで、この液を４℃にて６０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心分
離した。得られた沈殿物にＢＳＡを０．２重量％含有する０．３Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）１０ｍｌを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗Ｆｇ抗体感作ラテ
ックス液を調製した。 （２）ＰＥＧ溶液の調製 平均分子量５００，０００のＰＥＧを、ＢＳＡを０．２重量％で含有する０．
３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、０．０、０．１、０．２、０．３、０．４
重量％の濃度になるように溶解した。 （３）Ｆｇ測定試薬 本実施例のＦｇ測定試薬は、上記（１）項の抗Ｆｇ抗体感作ラテックスからな
る第１試薬と、上記（２）項のＰＥＧを含む緩衝液からなる第２試薬とから構成
される２液系の試薬である。 （４）標準Ｆｇ液 Ｆｇを０、１．０、２．０、４．０、８．０μｇ／ｍｌを含むヒト血清を使用
した。 （５）抗原抗体反応 標準Ｆｇ液１０μｌを、上記（２）項のＰＥＧ溶液４００μｌで希釈する。こ
れに上記（１）項の抗Ｆｇ抗体感作ラテックス液６０μｌを添加し、攪拌混合す
る。該ラテックス液の添加から６０秒後と１６０秒後の波長５７０ｎｍの吸光度
の差を分光光度計で読み取る。抗原抗体反応は３７℃で行なった。その結果を第
５表に示した。 比較例３ 実施例３で使用したＰＥＧ溶液を代わりに、平均分子量３，０００のＰＥＧを
実施例５と同じ緩衝液に０．０、０．５、１．０、２．０、３．０重量％の濃度
になるように溶解したＰＥＧ溶液を用いたことを除いては、実施例３と同様にし
て抗原抗体反応を行なった。その結果を第６表に示した。 第５表および第６表において、＊印は血清そのものが混濁を生じたあるいはラ
テックスそのものがＰＥＧにより凝集を生じたことを表わす。従って＊印以下の
濃度のＰＥＧを使用しなければならない。 第５表および第６表において、平均分子量５００，０００のＰＥＧ濃度０．３
％使用のものと、分子量３，０００のＰＥＧ濃度２．０％使用のものの吸光度を
比較すると、各フィブリノーゲン濃度での反応性（波長５７０ｎｍの吸光度）は
平均分子量５００，０００のものの方が高い。すなわち、ＰＥＧの分子量は５０
０，０００のものを用いる方が高い検出感度を得られることがわかる。 実施例４ 梅毒抗体の測定試薬及び測定法−凝集像の肉眼観察による検出方法 梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体の測定を行なった。本実施例においては、
次に挙げる試薬および測定用検体を使用した。後述の実施例５〜７及び比較例４
〜７においても、特に指示されない限り、同名の試薬および検体については、同
様のものを使用した。 ＰＢＳ（リン酸緩衝液）：リン酸−ナトリウム（２水和物）、リン酸二ナトリウ
ム（２水和物）および塩化ナトリウムを、リン酸および塩化ナトリウムの終濃度
がそれぞれ０．０２Ｍおよび０．１５Ｍ、ｐＨが７．４となるように精製水に加
えて、調製を行なった。 １％ＢＳＡ・ＰＢＳ：ＰＢＳにＢＳＡを１％（ｗ／ｗ）となるように溶解させて
調製した。 １％トリトンＸ−１００：リン酸緩衝液にトリトンＸ−１００を１％（ｗ／ｗ）
となるように溶解させた。 梅毒抗原液：家兎睾丸中で１０〜１４日間培養したトレポネーマ パリダム［Ｔ
ｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ；ＣＤＣ （Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉ
ｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ
， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｅｄｕｃａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ， Ａｔｌａｎｔａ， Ｇｅｏｒｇｉａ）より入
手したものを家兎睾丸に接種し、継代培養したものを用いた］を生理食塩水中に
１０9個菌体／ｍｌとなるように懸濁した菌体懸濁液１ｍｌを採り、リン酸緩衝
液中で遠心分離（６，０００ｒｐｍ×５分、３回）することにより洗浄した。次
いで、得られた沈殿に１％トリトンＸ−１００を１ｍｌ添加し、３７℃にて３０
分間インキューベートした。その後、これを超遠心分離機にかけて（５０，００
０ｒｐｍ×１時間）上清を採取し、１％トリトン−１００で１，０００倍希釈し
て使用した。 梅毒陽性家兎血清：トレポネーマ パリダムを睾丸に接種後４５日間飼育した家
兎から血清を採取した。この血清を１％ＢＳＡ・ＰＢＳで１００倍、２００倍お
よび４００倍に希釈して使用した。 正常家兎血清：トレポネーマ パリダムを接種されていない家兎から採取した血
清を用いた。市販のＴＰＨＡキット（セロディアＴＰ；富士レビオ製）を用いて
タイターを測定したところ、結果は陰性を示した。この血清を１％ＢＳＡ・ＰＢ
Ｓで１００倍から４００倍に希釈して用いた。 ラテックス：積水化学工業（株）製の粒子０．２３μｍのポリスチレンラテック
ス（固形分１０％）を用いた。 ０．２０、０．５、１．００および２．００％ＰＥＧ５００，０００：平均分子
量５００，０００のＰＥＧを１％ＢＳＡ・ＰＢＳに、それぞれ０．２０、０．５
０、１．００および２．００％（ｗ／ｗ）となるように溶解させたもの。 （Ａ）ラテックスへの梅毒抗原の感作：ラテックス１００μｌと、梅毒抗原液４
００μｌとを速やかに混合し、室温で攪拌した。１時間後に１％ＢＳＡ・ＰＢＳ
を５ｍｌ加え、１５０００ｒｐｍで１時間得遠心した。これを２回繰り返してラ
テックスを洗浄した。洗浄後のペレットを２ｍｌの０．２０．０．５０、１．０
０および２．００％ＰＥＧ５００，０００に懸濁させ、よく分散して固形分０．
５％のラテックス試薬を得た。これを４℃にて保存した。 （Ｂ）梅毒抗体の測定：梅毒陽性家兎血清と（Ａ）項で得られたラテックス試薬
とを５０μｌずつ判定板上に採り（このため反応時のＰＥＧ最終濃度は０．１〜
１．０％となる）、混合・攪拌したのち３分間反応させた。対照として、正常家
兎血清についても同様に反応を行なった。ラテックス試薬の凝集を目視観察した
。凝集した検体を陽性、凝集の認められなかった検体を陰性とした。その結果を
第７表に示す。第７表において＋および＋＋は陽性（＋＋は凝集の度合が大きい
）、±は偽陽性、そして−は陰性を示す。 比較例４ ０．２０〜２．００％ＰＥＧ５００，０００の代わりに、下記の２．０、４．
０、６．０、８．０％ＰＥＧ７，５００または１％ＢＳＡ・ＰＢＳを用いて実施
例４と同様に反応を行なった。その結果を第７表に示す。 ２．０、４．０、６．０および８．０％ＰＥＧ７，５００：平均分子量７，５０
０のＰＥＧを１％ＢＳＡ・ＰＢＳに、それぞれ２．０、４．０、６．０および８
．０％（ｗ／ｗ）となるように溶解させたもの。 第７表より、ＰＥＧの分子量は５００，０００を使用する方が７，５００より
も高い検出感度が得られることがわかった。 実施例５ 梅毒抗体の測定試薬及び測定法−光学的な検出方法 実施例４と同様の検体および試薬を用い、日立７０５０型全自動分析装置によ
り測定を行なった。但し、梅毒抗原感作ラテックス試薬にはＰＥＧ５００，００
０は加えず、１％ＢＳＡ・ＰＢＳで希釈して固形分０．２５％に調製した。 また、ＰＥＧ５００，０００は１％ＢＳＡ・ＰＢＳに０．１、０．２５、０．
５０および１．００％（ｗ／ｗ）に溶解させて使用した。すなわち、この試薬は
感作ラテックス液からなる第１試薬とＰＥＧ溶液からなる第２試薬とから構成さ れるものである。 測定方法と測定結果 検体として梅毒陽性家兎血清または正常家兎血清３μｌを採り、これに上記の
ＰＥＧ５００，０００の０．１〜１．００％溶液３５０μｌを加えた。これに上
記の梅毒抗原感作ラテックス液５０μｌを添加後、この溶液を攪拌・混合した。
そして、該ラテックス液の添加から８０秒後と３２０秒後の波長５７０ｎｍにお
ける吸光度の差（ΔＯＤ570）を分光光度計で読み取った。なお、抗原抗体反応
は３７℃で行なった。ΔＯＤ570を１０，０００倍して結果を第８表に示した。 また、使用したＰＥＧの濃度とΔＯＤ570との関係を第１図に示した。 比較例５ ０．１〜１．０％ＰＥＧ５００，０００の代わりに、ＰＥＧ７，５００を１％
ＢＳＡ・ＰＢＳにそれぞれ１．０、２．０、３．０、４．０％（ｗ／ｗ）となる
ように溶解させたもの、または１％ＢＳＡ・ＰＢＳを用いて、実施例５と同様に
反応を行なった。その結果を第８表に示した。 また、使用したＰＥＧの濃度とΔＯＤ570との関係を第２図に示した。 第８表、第１図および第２図よりＰＥＧ５００，０００の方がＰＥＧ７，５０
０より高感度かつ非特異反応の少ない定量ができることが分かった。なお、第１
図をみると、ＰＥＧ濃度０．５％で正常血清でのΔＯＤ570値が低く、梅毒陽性
血清でのΔＯＤ570値が高い値を示しているので至適ＰＥＧ濃度は０．５％であ
る。 実施例６ ＨＢＳ抗体の測定試薬および測定法−凝集像の肉眼観察による検出方法 本実施例において、実施例４と同一名の試薬は実施例４と同様に調製を行なっ
た。その他の試薬の調製法を次に示す。 ＨＢｓ抗原液：ヒト血漿よりアフィニティークロマトグラフィーにより精製した
精製ＨＢｓ抗原を使用した。抗原はリン酸緩衝液に溶解し、濃度をローリー法に
より測定した。使用直前に、リン酸緩衝液により希釈し、濃度を１〜１０μｇ／
ｍｌとなるように調製し、これをＨＢｓ抗原液とした。 抗ＨＢｓ抗血清（陽性家兎血清）：精製ＨＢｓ抗原を、フロイントの完全アジュ
バントとともに家兎に免疫して得られた抗血清を、正常ヒト血清を結合させたカ
ラムで吸収操作をしてから用いた。正常ヒト血清を結合させたカラムはＣＮＢｒ
活性化セファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア社）を用い、メーカー（ファルマシ
ア）の使用説明書に従って行なった。吸収操作を行なった抗ＨＢｓ抗血清は、１
％ＢＳＡ・ＰＢＳにより８０倍から８００倍に希釈して用いた。 正常家兎血清：ＨＢｓ抗原が接種されていない家兎から採取した血清を用いた。
市販ＰＨＡキットあるいはＥＩＡキットにより抗体の有無を測定したところ、陰 性であった。この血清を１％ＢＳＡ・ＰＢＳで８０倍から８００倍に希釈して用
いた。 ０．２〜０．６％ＰＥＧ５００，０００：平均分子量５００，０００のＰＥＧを
１％ＢＳＡ・ＰＢＳで０．２、０．３、０．３５、０．４および０．６％（ｗ／
ｗ）に溶解したもの。 １．０〜２．０％ＰＥＧ５０，０００：末端基定量法による平均分子量５０，０
００のＰＥＧを１％ＢＳＡ・ＰＢＳで１．０、１．５および２．０％（ｗ／ｗ）
に溶解したもの。 （Ａ）ラテックスへのＨＢｓ抗原の感作：ラテックス１００μｌと、ＨＢｓ抗原
液４００μｌとを速やかに混合し、室温で攪拌した。１時間後に１％ＢＳＡ・Ｐ
ＢＳを５ｍｌ加え、１５０００ｒｐｍで１時間遠心した。これを２回繰り返して
ラテックスを洗浄した。洗浄後のペレットを２ｍｌの０．２〜０．６％ＰＥＧ５
００，０００または１．０〜２．０％ＰＥＧ５０，０００に懸濁させ、よく分散
して固形分０．５％のラテックス試薬を得た。これを４℃にて保存した。 （Ｂ）ＨＢｓ抗体の測定 ＨＢｓ陽性家兎血清と本実施例（Ａ）項で得られたラテックス試薬とを５０μ
ｌずつ判定板上に採り、混合・攪拌したのち３分間反応させた。対照として、正
常家兎血清についても同様に反応を行なった。ラテックス試薬の凝集を実施例４
と同様に行なった。その結果を第９表に示す。 比較例６ 実施例６で使用したＰＥＧ５００，０００またはＰＥＧ５０，０００の代わり
に、下記の１．０〜４．０％ＰＥＧ７，５００、１０〜２０％ＰＥＧ１，０００
または１％ＢＳＡ・ＰＢＳを用いて、実施例６と同様に反応を行なった。その結
果を第９表に示す。 １．０〜４．０％ＰＥＧ７，５００：平均分子量７，５００のＰＥＧを，１％Ｂ
ＳＡ・ＰＢＳに、１．０、２．０、３．０および４．０％（ｗ／ｗ）に溶解した
もの。 １０〜２０％ＰＥＧ１，０００：平均分子量１，０００のＰＥＧを１％ＢＳＡ・
ＰＢＳに、１０、１５および２０％（ｗ／ｗ）に溶解したもの。 第９表よりＰＥＧの分子量は３０，０００以上を用いる方が高い検出感度が得
られることがわかった。また、ＰＥＧの分子量は５０，０００より５００，００
０を用いる方が、より高い感度が得られることがわかった。 実施例７ ＨＢＳ抗体の測定試薬及び測定法−光学的な検出方法 実施例６の検体および試薬を用い、日立７０５０型全自動分析装置により測定
を行なった。但し、ＨＢＳ抗原感作ラテックス試薬にはＰＥＧ５００，０００ま
たは５０，０００は加えず、１％ＢＳＡ・ＰＢＳで希釈して固形分０．２５％に
調製した。また、ＰＥＧ５００，０００は１％ＢＳＡ・ＰＢＳに０．２、０．３ 、０．３５、０．４および０．６％（ｗ／ｗ）に、ＰＥＧ５０，０００は１％Ｂ
ＳＡ・ＰＢＳに１．０、１．５および２．０％（ｗ／ｗ）に溶解させて使用した
。すなわち、この試薬は感作ラテックス液からなる第１試薬とＰＥＧ溶液からな
る第２試薬とから構成されるものである。 測定方法と測定結果 検体としてＨＢＳ陽性家兎血清または正常家兎血清２０μｌを採り、これに上
記の各濃度のＰＥＧ５００，０００またはＰＥＧ５０，０００の溶掖３５０μｌ
を加えた。これに上記のＨＢＳ抗原感作ラテックス液５０μｌを添加後、この溶
液を攪拌・混合した。そして、該ラテックス液の添加から８０秒後と３２０秒後
の波長５７０ｎｍにおける吸光度の差（ΔＯＤ570）を分光光度計で読み取った
。なお、抗原抗体反応は３７℃で行なった。ΔＯＤ570を１０，０００倍して結
果を第１０表に示した。 また、使用したＰＥＧの濃度とΔＯＤ570との関係をＰＥＧ５００，０００に
ついては第３図、ＰＥＧ５０，０００については第４図に示した。 比較例７ ＰＥＧ５００，０００またはＰＥＧ５０，０００の代わりに、ＰＥＧ７，５０
０を１％ＢＳＡ・ＰＢＳにそれぞれ１．０、２．０、３．０および４．０％（ｗ
／ｗ）となるように溶解させたもの、ＰＥＧ１，０００を１％ＢＳＡ・ＰＢＳに
それぞれ１０、１５および２０％（ｗ／ｗ）となるように溶解させたものまたは
１％ＢＳＡ・ＰＢＳを用いて、実施例７と同様に反応を行なった。その結果を第
１０表に示した。 また、使用したＰＥＧの濃度とΔＯＤ570との関係をＰＥＧ７，５００につい
て第５図、ＰＥＧ１，０００について第６図に示した。 第１０表および第３〜６図より、ＰＥＧの分子量は３０，０００以上を用いる
方が高い検出感度が得られかつ非特異反応の少ない定量ができることがわかった
また、ＰＥＧの分子量は５０，０００よりも５００，０００を用いる方がさら
に高い検出感度が得られることが分かった。 ＰＥＧ５００，０００を用いた場合、０．３〜０．３５％で高い検出感度が得
られかつ非特異反応が少なく、至適であることがわかった。 【発明の効果】 本発明によれば、このように、不溶性担体を使用し免疫凝集反応に基づく被測
定物質の測定において、高い検出感度で非特異反応が少ない免疫凝集反応測定試
薬および免疫凝集反応測定法が提供される。従って、本発明の試薬及び測定法は
、各種の生理活性物質、特に、アルファーフェトプロティン抗原、梅毒トレポネ
ーマ抗体およびＨＢＳ抗体などの測定に適している。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明により血清中の梅毒トレポネーマ抗体を測定したときの、ＰＥ
Ｇ濃度と測定の結果得られる吸光度との関係を示すグラフである。第２図は、こ
の場合の比較例を示すグラフである。第３図および第４図は、本発明により血清
中のＨＢＳ抗体を測定したときの、ＰＥＧ濃度と測定の結果得られる吸光度との 関係を示すグラフである。第５図、第６図は、この場合の比較例を示すグラフで
ある。
Ｇ濃度と測定の結果得られる吸光度との関係を示すグラフである。第２図は、こ
の場合の比較例を示すグラフである。第３図および第４図は、本発明により血清
中のＨＢＳ抗体を測定したときの、ＰＥＧ濃度と測定の結果得られる吸光度との 関係を示すグラフである。第５図、第６図は、この場合の比較例を示すグラフで
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 被測定物質である抗原または抗体に対応する抗体または抗原を
担持した不溶性担体および末端基定量法による平均分子量３０，０００以上のポ
リエチレングリコールから構成される免疫凝集反応測定試薬。 【請求項２】 被測定物質である抗体に対応する抗原を担持した不溶性担体お
よび末端基定量法による平均分子量３０，０００以上のポリエチレングリコール
から構成される免疫凝集反応測定試薬。 【請求項３】 被測定物質である抗体に対応する抗原が、梅毒トレポネーマ抗
原またはＨＢＳ抗原である請求項２記載の免疫凝集反応測定試薬。 【請求項４】 被測定物質である抗原または抗体に対応する抗体または抗原を
不溶性担体に担持させ、被測定物質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の
凝集の度合を検出することにより、被測定物質を測定する免疫凝集反応測定法で
あって、該抗原抗体反応の反応系に末端基定量法による平均分子量３０，０００
以上のポリエチレングリコールを存在させる、免疫凝集反応測定法。
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