JP7386220B2 - 抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体若しくは抗体キット、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子、及びこれらを用いた測定試薬若しくは測定方法 - Google Patents
抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体若しくは抗体キット、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子、及びこれらを用いた測定試薬若しくは測定方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、不溶性担体粒子に固定化された場合、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む被験試料中のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と特異的に凝集反応を起こす抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体若しくは抗体キット、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子、及びこれらを用いた、被験試料中のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出、測定するための測定試薬若しくは測定方法に関する。
出血を伴う消化器官の疾患として、炎症、腫瘍、癌等が知られている。そして、これらの疾患のスクリーニング検査として、糞便中のヘモグロビンの存在を調べる便潜血検査が行われている。そして、この検査は主に免疫測定法によって行われる（特開昭６１－１３７０６４号公報）。
しかし、糞便中に含まれるヘモグロビンは、被験試料である糞便中に含まれる細菌を始めとした種々の要因によって、また、消化管内を移動する際にも分解されて、検出、測定が出来なくなる。それゆえ、糞便中のヘモグロビンの検出、測定は、下行結腸や直腸の出血の検査には有効であるが、上部消化管の出血を検査することは困難である。
そこで、糞便中に含まれる細菌を始めとした種々の要因によって分解を受けないヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を測定することが提案され、実施されている。しかしながら、この測定原理は、ヘモグロビンに特異的に結合する抗体とハプトグロビンに特異的に結合する抗体を組み合わせたサンドイッチ免疫測定法である（特開平２－１９３０７１号公報）。
ＥＬＩＳＡに代表されるサンドイッチ免疫測定法は、測定の過程において被験試料に含まれる被測定物以外のタンパク成分等を除去する洗浄工程を含むため、測定に要する時間が長くなる。そのため、短時間で多数の被験試料を検出、測定する必要がある検出、測定には適していない。
また、ヘモグロビンおよびハプトグロビンの基本構造は四量体を形成しており、常法で得られたヘモグロビンに特異的に結合する抗体とハプトグロビンに特異的に結合する抗体を組み合わせて、短時間で多数の被験試料を検出、測定することが可能な凝集法による免疫測定法に適用すると、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体のみならず、複合体を形成していない遊離ヘモグロビンや遊離ハプトグロビンでも凝集反応を起こすため、精確な測定は困難である。
そこで、凝集法による免疫測定法に適用することが可能で、複合体を形成していない遊離ヘモグロビンや遊離ハプトグロビンを検出、測定せず、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体のみ検出、測定出来る抗体の作製およびその抗体を用いた凝集法による免疫測定法でヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出、測定する免疫測定法の確立が期待されている。
出血を伴う消化器官疾患のスクリーニング検査を行なうことは、重篤化する炎症、腫瘍、癌等を早期に発見するために重要な課題となっている。そこで、消化管内で分解を受けないヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を短時間で多数検体を検出、測定出来る試薬が求められている。
それゆえ、本発明は、複合体を形成していない遊離ヘモグロビンおよび遊離ハプトグロビンは検出、測定せず、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に、短時間で多検体の検出、測定が出来る凝集法による免疫測定法に使用することが可能な抗体を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、不溶性担体粒子に結合させることによって、複合体を形成していない遊離ヘモグロビンおよび遊離ハプトグロビンとは反応せず、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と特異的に反応する抗体を見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体であって、モノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体。
（２）５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）または１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）である、（１）の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体。
（３）２種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、２種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を含む、抗体キット。
（４）２種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）、７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７０）、１－５Ｇ－３Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７１）、１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）、７９－８Ｇ－３Ｆ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７２）、およびＳＵ１１２からなる群より選ばれる少なくとも２種類以上である、（３）の抗体キット。
（５）抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体がマウス由来である、（１）～（４）のいずれかの抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体または抗体キット。
（６）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子であって、モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子。
（７）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が、５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）または１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）の１種類である、（６）のモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子。
（８）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が、５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）、７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７０）、１－５Ｇ－３Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７１）、１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）、７９－８Ｇ－３Ｆ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７２）、およびＳＵ１１２からなる群より選ばれる少なくとも２種類以上である、（７）のモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子。
（９）抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体がマウス由来である、（６）～（８）のいずれかのモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子。
（１０）モノクローナル抗体を固定化する不溶性担体粒子が、ラテックス粒子または金属コロイド粒子である、（６）～（９）のいずれかのモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子。
（１１）（６）～（１０）のいずれかのモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を含む、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出するための免疫学的測定試薬。
（１２）５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）、７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７０）、１－５Ｇ－３Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７１）、１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）、または７９－８Ｇ－３Ｆ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７２）である、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体。
（１３）（１）～（５）のいずれかの抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体または抗体キット、（６）～（１０）のいずれかのモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子、（１１）の免疫学的測定試薬、あるいは、（１２）の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を用いた、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出するための免疫学的測定方法。
（１４）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を用いた、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出するための免疫学的測定方法であって、モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、免疫学的測定方法。
（１５）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）または１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）の１種類である、（１４）の免疫学的測定方法。
（１６）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）、７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７０）、１－５Ｇ－３Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７１）、１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）、７９－８Ｇ－３Ｆ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７２）、およびＳＵ１１２からなる群より選ばれる少なくとも２種類以上である、（１４）の免疫学的測定方法。
（１７）抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体がマウス由来である、（１４）～（１６）のいずれかの免疫学的測定方法。
（１８）抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を固定化する不溶性担体粒子が、ラテックス粒子または金属コロイド粒子である（１４）～（１７）のいずれかの免疫学的測定方法。
（１）抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体であって、モノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体。
（２）５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）または１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）である、（１）の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体。
（３）２種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、２種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を含む、抗体キット。
（４）２種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）、７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７０）、１－５Ｇ－３Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７１）、１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）、７９－８Ｇ－３Ｆ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７２）、およびＳＵ１１２からなる群より選ばれる少なくとも２種類以上である、（３）の抗体キット。
（５）抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体がマウス由来である、（１）～（４）のいずれかの抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体または抗体キット。
（６）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子であって、モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子。
（７）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が、５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）または１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）の１種類である、（６）のモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子。
（８）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が、５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）、７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７０）、１－５Ｇ－３Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７１）、１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）、７９－８Ｇ－３Ｆ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７２）、およびＳＵ１１２からなる群より選ばれる少なくとも２種類以上である、（７）のモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子。
（９）抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体がマウス由来である、（６）～（８）のいずれかのモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子。
（１０）モノクローナル抗体を固定化する不溶性担体粒子が、ラテックス粒子または金属コロイド粒子である、（６）～（９）のいずれかのモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子。
（１１）（６）～（１０）のいずれかのモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を含む、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出するための免疫学的測定試薬。
（１２）５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）、７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７０）、１－５Ｇ－３Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７１）、１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）、または７９－８Ｇ－３Ｆ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７２）である、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体。
（１３）（１）～（５）のいずれかの抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体または抗体キット、（６）～（１０）のいずれかのモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子、（１１）の免疫学的測定試薬、あるいは、（１２）の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を用いた、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出するための免疫学的測定方法。
（１４）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を用いた、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出するための免疫学的測定方法であって、モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、免疫学的測定方法。
（１５）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）または１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）の１種類である、（１４）の免疫学的測定方法。
（１６）１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）、７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７０）、１－５Ｇ－３Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７１）、１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）、７９－８Ｇ－３Ｆ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７２）、およびＳＵ１１２からなる群より選ばれる少なくとも２種類以上である、（１４）の免疫学的測定方法。
（１７）抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体がマウス由来である、（１４）～（１６）のいずれかの免疫学的測定方法。
（１８）抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を固定化する不溶性担体粒子が、ラテックス粒子または金属コロイド粒子である（１４）～（１７）のいずれかの免疫学的測定方法。
本発明は、上記抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化して作製した免疫学的測定試薬を用いることにより、被験試料中に含まれる、複合体を形成していない遊離ヘモグロビンおよび／または遊離ハプトグロビンの影響を受けることなく、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に測定することが可能となる。
そして、このことにより、ヘモグロビンと比較して検体中での安定性に優れているヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を被験物質として、出血を伴う消化器官疾患のスクリーニング検査を簡便かつ短時間で行なうことが可能となる。
本発明の一実施形態の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体である。
本発明の別の実施形態の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体は、抗体キットであり、具体的には２種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、２種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を含む、抗体キットである。
本発明におけるヘモグロビン－ハプトグロビン複合体は、ヘモグロビンとハプトグロビンにより形成された、遊離ヘモグロビンよりも安定な複合体である。血管中において何らかの理由により赤血球が破壊され、ヘモグロビンが血中に遊離すると、遊離したヘモグロビンが酸化されることにより酸化的血管障害毒性が生じる。そこで、ハプトグロビンが遊離したヘモグロビンと速やかに複合体を形成することにより、その毒性を中和させることが知られている。その後、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体は細網内皮系細胞の受容体を介して速やかに取り込まれ分解処理されるが、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体自体はヘモグロビンに比べて安定であることが知られている。
ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体が安定な構造物である性質に着目して、糞便中に含まれるヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出、測定することにより、消化管における出血を把握することが可能となる。
ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の検出、測定を行なう方法としては、免疫学的測定方法が好ましく、スクリーニング検査として多数の検体を短時間で行なう方法としては、免疫凝集反応方法がさらに好ましい。免疫凝集反応方法としては、担体粒子、たとえば、高感度測定が可能なホモジーニアスな系の粒子担体を用いた方法が好ましい。
また、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出、測定するという観点から、免疫学的測定方法に用いる抗体としては、モノクローナル抗体が適している。本発明は、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を免疫凝集反応方法に用いて検出、測定することが可能なモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出、測定する方法を構築する。
ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出、測定する方法を構築するための抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体として、その由来は特に限定されないが、マウス由来の抗ヒトヘモグロビンマウスモノクローナル抗体が好ましい。
抗ヒトヘモグロビンマウスモノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体の作製方法によって作製できる。たとえば、マウスを使った以下の方法が挙げられる。具体的には、マウスにヒトヘモグロビンで免疫した後、肥大化した脾臓を提出し、脾臓由来のＢ細胞を調製し、別に増殖させたマウスミエローマ細胞と電気融合法により細胞融合させ、Ｂ細胞とミエローマ細胞が融合して出来た細胞を選択培地を利用して増殖およびクローニングを行う。その結果発育したコロニーがヒトヘモグロビンに対する抗体を産生しているか否かを確認する。ヒトヘモグロビンに対する抗体を産生していると認められた細胞をクローニングし、抗ヒトヘモグロビンマウスモノクローナル抗体産生細胞株を得る。得られた抗ヒトヘモグロビンマウスモノクローナル抗体産生細胞株を培養し、その培養上清または培養細胞をマウスの腹腔内で増殖させて得られた腹水より抗体を精製し、抗ヒトヘモグロビンマウスモノクローナル抗体とする。
次に、抗ヒトヘモグロビンマウスモノクローナル抗体を免疫凝集反応方法に適用するため、該抗体を不溶性担体粒子に固定化する。モノクローナル抗体を固定化するための不溶性担体粒子としては、一般的に使用されるラテックス粒子、シリカ粒子、金属コロイド粒子、磁性粒子、蛍光粒子、赤血球等が挙げられるが、これらに限定されることはない。
また、該不溶性担体粒子の粒子径としては、５０～５００ｎｍが好ましく、７５～３５０ｎｍがさらに好ましいが、特にこの範囲に捉われることなく、使用することが可能である。
さらに、抗体を不溶性担体粒子に固定化する方法としては、公知の技術である、抗体と不溶性担体粒子を混合して不溶性担体粒子の表面に抗体を物理的吸着を行なうことにより不溶性担体粒子への抗体の固定化が可能である。
また、表面にアミノ基やカルボキシル基を導入した不溶性担体粒子を用いる場合には、グルタルアルデヒドやカルボキシイミド試薬を用いた化学結合によって不溶性担体粒子の表面への抗体の固定化が可能である。
これらの方法により得られた１以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が固定化された不溶性担体粒子は、複合体を形成していない遊離ヘモグロビンおよび遊離ハプトグロビン、並びにヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む混合物に付与し、遊離ヘモグロビンおよび遊離ハプトグロビンとは凝集反応は認められず、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体とは凝集反応を生ずることを確認し、本願発明の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体及び抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を得る。
すなわち、不溶性担体粒子に固定化することによりヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と特異的に凝集反応を生ずる抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が得られ、該抗体を不溶性担体粒子に固定化することによる抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が得られる。それによって、ヘモグロビン－ハグロビン複合体を特異的に反応する、該抗体又は該モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を含む測定試薬、ヘモグロビン－ハグロビン複合体を特異的に検出、測定する、該抗体又は該モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を用いた測定方法も得られる。
本発明の一実施形態の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体として好ましくは、不溶性担体粒子に固定化した場合ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と特異的に凝集反応を起こす、ＮＰＭＤに受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８として寄託された５Ｃ－２Ａ、またはＮＰＭＤに受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９として寄託された１２－９Ｇ－Ｃである。
また、本発明の別の実施形態の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体キットとして好ましくは、２種類以上のモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化した場合ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と特異的に凝集反応を起こす、ＮＰＭＤに受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２２６８）として寄託された５Ｃ－２Ａ、ＮＰＭＤに受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７０（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２２７０）として寄託された７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ、ＮＰＭＤに受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７１（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２２７１）として寄託された１－５Ｇ－３Ｃ、ＮＰＭＤに受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２２６９）として寄託された１２－９Ｇ－Ｃ、ＮＰＭＤに受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７２（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２２７２）として寄託された７９－８Ｇ－３Ｆ、およびＳＵ１１２（日本バイオテスト研究所）からなる群より選ばれる少なくとも２種類以上である。
本発明の測定試薬は、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体又は抗体キット、あるいは、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を含み、その他、例えば、各種電解質、緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、または増感剤等の成分を含んでもよい。
本発明の測定方法は、１種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を用いた、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出するための免疫学的測定方法であり、該モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しないため、複合体を形成していない遊離ヘモグロビンおよび遊離ハプトグロビン、並びにヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む混合物から、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体のみ特異的に検出、測定することができる。
本発明の測定方法は、上記モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子と検体（被験試料）とを混合して、凝集反応の有無によって、検体中のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出、測定する。検体は、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含み得る試料であれば特に限定されないが、血液、便、尿、汗などであることが好ましく、便であることが特に好ましい。凝集反応の検出、測定方法は、一般的な方法であればよく、たとえば、吸光度の測定、散乱光強度の測定、目視による測定（スライド凝集法）等が挙げられる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１ 抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体の作製）
（１）マウスへの免疫
７週齢のメスのＢａｌｂ／ｃおよびｄｄＹのマウス各５頭に対してヘモグロビンで免疫した。免疫プロトコールとしては、初回免疫としてアジュバントと混和したヘモグロビン溶液を背部皮下に５０μｇ／マウスの用量で行なった。
（１）マウスへの免疫
７週齢のメスのＢａｌｂ／ｃおよびｄｄＹのマウス各５頭に対してヘモグロビンで免疫した。免疫プロトコールとしては、初回免疫としてアジュバントと混和したヘモグロビン溶液を背部皮下に５０μｇ／マウスの用量で行なった。
初回免疫の４週間後にアジュバントと混和したヘモグロビン溶液を背部皮下に５０μｇ／マウスの用量で免疫し、さらにその４週間後にアジュバントと混和したヘモグロビン溶液を背部皮下に５０μｇ／マウスの用量で免疫した。
各々の免疫後に、１２５Ｉで標識したヘモグロビンを用いた２抗体法のＲＩＡ法で抗血清価を測定した。その結果、ｄｄＹのマウスの１頭で高い抗血清価が得られ、細胞融合に供した。なお、２回目の免疫後および３回目の免疫後の抗血清価に変動は認められなかった。
（２）細胞融合
細胞融合を行なう３日前にヘモグロビン溶液を腹腔内に５０μｇ／マウスの用量で最終免疫を行なった。細胞融合は、初回免疫より１６週間経過したマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。
細胞融合を行なう３日前にヘモグロビン溶液を腹腔内に５０μｇ／マウスの用量で最終免疫を行なった。細胞融合は、初回免疫より１６週間経過したマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。
調製した脾細胞とマウスミエローマＮＳ－１細胞を電気融合法にて細胞融合を行ない、融合細胞選択培地に懸濁して９６穴マイクロプレートに播種した。
（３）モノクローナル抗体産生細胞株のスクリーニング
細胞融合の１０日後に１２５Ｉで標識したヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を用いた２抗体法のＲＩＡ法で、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングした。
細胞融合の１０日後に１２５Ｉで標識したヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を用いた２抗体法のＲＩＡ法で、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングした。
（実施例２ モノクローナル抗体の結合特異性）
（１）モノクローナル抗体の選定
細胞融合により得られた抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体４５クローンおよび市販の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体ＳＵ１１２（日本バイオテスト研究所）の合計４６クローンを選定し、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との結合特異性を評価した。
（１）モノクローナル抗体の選定
細胞融合により得られた抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体４５クローンおよび市販の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体ＳＵ１１２（日本バイオテスト研究所）の合計４６クローンを選定し、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との結合特異性を評価した。
評価の方法としては、各々の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体をポリスチレンラテックス粒子に固定化し、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料と反応させたときの凝集の度合いを比較した。
（２）モノクローナル抗体のポリスチレンラテックス粒子への固定化
各々のモノクローナル抗体を粒径２１１ｎｍのポリスチレンラテックス粒子に固定化した。
各々のモノクローナル抗体を粒径２１１ｎｍのポリスチレンラテックス粒子に固定化した。
上記のポリスチレンラテックス粒子への抗体の固定化は、公知の技術を利用して実施した。すなわち、ポリスチレンラテックス粒子と抗体を混合して疎水性であるポリスチレンラテックス粒子の表面に抗体を物理的吸着を行なうことにより、ポリスチレンラテックス粒子への抗体の固定化を行なった。
（３）試料の調製
ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の試料は、３２．３ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンおよびそれと等モルのハプトグロビンを等液量で混和して作製した。ヘモグロビンのみの試料は、１６．１ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンを含むものを使用した。
ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の試料は、３２．３ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンおよびそれと等モルのハプトグロビンを等液量で混和して作製した。ヘモグロビンのみの試料は、１６．１ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンを含むものを使用した。
（４）ラテックス凝集の測定方法
９６穴平底マイクロプレートのウェルを用いて凝集反応を行なった。具体的な方法は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）をマイクロプレートの各ウェルに１００μＬ分注し、各々の抗体を固定化したポリスチレンラテックス粒子溶液を５０μＬ添加した後に試料を３０μＬ添加した。
９６穴平底マイクロプレートのウェルを用いて凝集反応を行なった。具体的な方法は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）をマイクロプレートの各ウェルに１００μＬ分注し、各々の抗体を固定化したポリスチレンラテックス粒子溶液を５０μＬ添加した後に試料を３０μＬ添加した。
サンライズレインボー（テカンジャパン社）を用いて試料の添加１０秒後および５分１０秒後に波長６６０ｎｍで吸光度を測定し、その差を凝集の指標とした。
ヘモグロビンと反応させたときの凝集の度合いに比較して、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と反応させたときの凝集の度合いが高かった抗体又はその組合せを表１に示す。これらの抗体を特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した。表１に示されたモノクローナル抗体又はその組合せを用いることにより、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に測定することが出来る試薬が期待される。５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）および１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）のモノクローナル抗体は、単独で使用してもほとんどヘモグロビンの影響を受けることなく、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集することが認められた。また、１－５Ｇ－３Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７１）とＳＵ１１２（日本バイオテスト研究所）との組み合わせ、５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）と７９－８Ｇ－３Ｆ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７２）との組み合わせ、５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）と７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７０）との組み合わせ、５Ｃ－２Ａ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６８）と７９－８Ｇ－３Ｆとの組み合わせ、１２－９Ｇ－Ｃ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２６９）と７９－８Ｇ－３Ｆ（ＮＰＭＤ受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２２７２）との組み合わせも、ほとんどヘモグロビンの影響を受けることなく、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集することが認められた。
（実施例３ ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との特異的反応（１））
（１）モノクローナル抗体固定化ラテックス溶液の調製
５Ｃ－２Ａのモノクローナル抗体を、実施例２と同様の方法でラテックス粒子に固定化してラテックス溶液とした。
（１）モノクローナル抗体固定化ラテックス溶液の調製
５Ｃ－２Ａのモノクローナル抗体を、実施例２と同様の方法でラテックス粒子に固定化してラテックス溶液とした。
（２）ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体試料の調製
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）中に、１１．４ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンおよび０．０、３．８、７．５、または１１．３ｐｍｏｌ／ｍＬのハプトグロビンを含む溶液を調製した。すなわち、ヘモグロビンおよびハプトグロビンが強固に結合する性質を持つことより、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体およびヘモグロビンが、理論上は、各々０．０および１１．４ｐｍｏｌ／ｍＬ、３．８および７．６ｐｍｏｌ／ｍＬ、７．５および３．９ｐｍｏｌ／ｍＬ、ならびに１１．３および０．１ｐｍｏｌ／ｍＬ含む溶液を調製した。
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）中に、１１．４ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンおよび０．０、３．８、７．５、または１１．３ｐｍｏｌ／ｍＬのハプトグロビンを含む溶液を調製した。すなわち、ヘモグロビンおよびハプトグロビンが強固に結合する性質を持つことより、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体およびヘモグロビンが、理論上は、各々０．０および１１．４ｐｍｏｌ／ｍＬ、３．８および７．６ｐｍｏｌ／ｍＬ、７．５および３．９ｐｍｏｌ／ｍＬ、ならびに１１．３および０．１ｐｍｏｌ／ｍＬ含む溶液を調製した。
（３）モノクローナル抗体固定化ラテックス粒子とヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との反応
モノクローナル抗体固定化ラテックス粒子とヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との反応を７１７０Ｓ形自動分析装置（日立ハイテクノロジー社製）を用いて確認した。測定方法は、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体含有溶液１５μＬをＨ７１７０Ｓの反応セルに加えた後に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）１００μＬを加え、その後モノクローナル抗体固定化ラテックス溶液２５μＬを加えた後の４４０秒間の波長６６０ｎｍでの濁度変化量を求めた。
モノクローナル抗体固定化ラテックス粒子とヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との反応を７１７０Ｓ形自動分析装置（日立ハイテクノロジー社製）を用いて確認した。測定方法は、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体含有溶液１５μＬをＨ７１７０Ｓの反応セルに加えた後に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）１００μＬを加え、その後モノクローナル抗体固定化ラテックス溶液２５μＬを加えた後の４４０秒間の波長６６０ｎｍでの濁度変化量を求めた。
０ｐｍｏｌ／ｍＬとなるようにハプトグロビンを添加したときの濁度変化量を０と補正し、ハプトグロビンが１１．３ｐｍｏｌ／ｍＬ含まれるように添加した溶液の濁度変化量を１００％としたときの濁度変化率を表２に示す。
ハプトグロビンの添加濃度、すなわちヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の濃度の増加に伴い、ラテックス粒子に固定化したモノクローナル抗体との抗原抗体反応によって生じるラテックス凝集による濁度変化が増加する。また、ハプトグロビンの添加濃度が低いときにはラテックス凝集による濁度変化が低いことから、ハプトグロビンと結合していないヘモグロビンとの反応が認められないと推察された。これらより、５Ｃ－２Ａのモノクローナル抗体を用いることにより、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出することが可能となる。
（実施例４ ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との特異的反応（２））
（１）モノクローナル抗体固定化ラテックス溶液の調製
１－５Ｇ－３Ｃ、７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ、ＳＵ１１２、および７９－８Ｇ－３Ｆのモノクローナル抗体を、実施例２と同様の方法でラテックス粒子に固定化してラテックス溶液とした。そして、１－５Ｇ－３ＣとＳＵ１１２および７Ｃ－７Ｂ－８Ｅと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せのラテックス溶液を作製し、試験に供した。
（１）モノクローナル抗体固定化ラテックス溶液の調製
１－５Ｇ－３Ｃ、７Ｃ－７Ｂ－８Ｅ、ＳＵ１１２、および７９－８Ｇ－３Ｆのモノクローナル抗体を、実施例２と同様の方法でラテックス粒子に固定化してラテックス溶液とした。そして、１－５Ｇ－３ＣとＳＵ１１２および７Ｃ－７Ｂ－８Ｅと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せのラテックス溶液を作製し、試験に供した。
（２）ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体試料の調製
１３．０ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンおよび０．０、９．４、１１．３、または１３．０ｐｍｏｌ／ｍＬのハプトグロビンを含む他は実施例３と同様の方法で調製した。すなわち、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体およびヘモグロビンが、理論上は、各々０．０および１３．０ｐｍｏｌ／ｍＬ、９．４および３．６ｐｍｏｌ／ｍＬ、１１．３および１．７ｐｍｏｌ／ｍＬ、ならびに１３．０および０．０ｐｍｏｌ／ｍＬ含む溶液を調製した。
１３．０ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンおよび０．０、９．４、１１．３、または１３．０ｐｍｏｌ／ｍＬのハプトグロビンを含む他は実施例３と同様の方法で調製した。すなわち、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体およびヘモグロビンが、理論上は、各々０．０および１３．０ｐｍｏｌ／ｍＬ、９．４および３．６ｐｍｏｌ／ｍＬ、１１．３および１．７ｐｍｏｌ／ｍＬ、ならびに１３．０および０．０ｐｍｏｌ／ｍＬ含む溶液を調製した。
（３）モノクローナル抗体固定化ラテックス粒子とヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との反応
実施例３と同様の方法で濁度変化量を求めた。
０ｐｍｏｌ／ｍＬとなるようにハプトグロビンを添加したときの濁度変化を量０と補正し、ヘモグロビンとハプトグロビンを等量に調製した、ハプトグロビンが１３．０ｐｍｏｌ／ｍＬ含まれるように添加した溶液の濁度変化量を１００％としたときの濁度変化率を表３に示す。
実施例３と同様の方法で濁度変化量を求めた。
０ｐｍｏｌ／ｍＬとなるようにハプトグロビンを添加したときの濁度変化を量０と補正し、ヘモグロビンとハプトグロビンを等量に調製した、ハプトグロビンが１３．０ｐｍｏｌ／ｍＬ含まれるように添加した溶液の濁度変化量を１００％としたときの濁度変化率を表３に示す。
実施例３と同様の結果が得られた。すなわち、ハプトグロビンの添加濃度、すなわちヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の濃度の増加に伴い、ラテックス粒子に固定化したモノクローナル抗体との抗原抗体反応によって生じるラテックス凝集による濁度変化が増加した。このことより、１－５Ｇ－３ＣとＳＵ１１２との組み合わせ、および７Ｃ－７Ｂ－８Ｅと７９－８Ｇ－３Ｆとの組合せを用いることにより、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出することが可能となる。
（比較例１ ＥＬＩＳＡ法によるヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の測定）
実施例２において、ヘモグロビンと反応させたときには凝集反応がみられず、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との特異的な反応が確認された、５Ｃ－２Ａと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せについて、ＥＬＩＳＡ法でのヘモグロビンおよび
ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との結合の特異性を評価した。
実施例２において、ヘモグロビンと反応させたときには凝集反応がみられず、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との特異的な反応が確認された、５Ｃ－２Ａと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せについて、ＥＬＩＳＡ法でのヘモグロビンおよび
ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との結合の特異性を評価した。
（１）モノクローナル抗体固定化ラテックス溶液の調製
５Ｃ－２Ａを９６穴マイクロプレートに固相化して固相化プレートとし、７９－８Ｇ－３Ｆにホースラディシュペルオキシダーゼを標識化して酵素標識化物とした。上記の９６穴マイクロプレートへの抗体の固相化は、公知の技術を利用して実施した。すなわち、９６穴マイクロプレートに抗体添加して疎水性である９６穴マイクロプレートの表面に抗体を物理的吸着を行うことにより、９６穴マイクロプレートへの抗体の固相化を行った。
５Ｃ－２Ａを９６穴マイクロプレートに固相化して固相化プレートとし、７９－８Ｇ－３Ｆにホースラディシュペルオキシダーゼを標識化して酵素標識化物とした。上記の９６穴マイクロプレートへの抗体の固相化は、公知の技術を利用して実施した。すなわち、９６穴マイクロプレートに抗体添加して疎水性である９６穴マイクロプレートの表面に抗体を物理的吸着を行うことにより、９６穴マイクロプレートへの抗体の固相化を行った。
（２）ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体試料の調製
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）中に１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンおよび１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのハプトグロビンを含む溶液を調製し、この溶液を５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）で倍々希釈して、１．６、３．２、６．３または１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料を調製した。
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）中に１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンおよび１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのハプトグロビンを含む溶液を調製し、この溶液を５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）で倍々希釈して、１．６、３．２、６．３または１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料を調製した。
（３）ＥＬＩＳＡの測定方法
９６穴マイクロプレートに標準液または検体１０μＬを加え、３分間攪拌した後に、２５℃で６０分間静置した。静置後、界面活性剤含有５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄した。
９６穴マイクロプレートに標準液または検体１０μＬを加え、３分間攪拌した後に、２５℃で６０分間静置した。静置後、界面活性剤含有５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄した。
洗浄後、９６穴マイクロプレートに酵素標識物１００μＬを加え、３分間攪拌した後に、２５℃で６０分間静置した。静置後、界面活性剤含有５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄した。
洗浄後、９６穴マイクロプレートに０．４ｍｇ／ｍＬ ｏ－フェニレンジアミン含有基質溶解液１００μＬを加え、２５℃で１４分間静置した。静置後、３Ｎ 硫酸を反応停止液として１００μＬ添加した。
測定は、サンライズレインボー（テカンジャパン社）を用いて測定波長４９２／６５０ｎｍで行った。ラテックス等の不溶性担体に固定化することにより、ヘモグロビンと反応させたときには凝集反応がみられず、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との特異的な反応が確認された、５Ｃ－２Ａと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せを用いたＥＬＩＳＡ法での測定結果を表４に示す。５Ｃ－２Ａと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せを用いたＥＬＩＳＡ法では、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体双方と反応しており、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出することはできなかった。
（実施例５ ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との特異的反応（３））
実施例２において、ヘモグロビンと反応させたときには凝集反応がみられず、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との特異的な反応が確認された、５Ｃ－２Ａと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せについて、ラテックス凝集法でのヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との結合の特異性を評価した。
実施例２において、ヘモグロビンと反応させたときには凝集反応がみられず、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との特異的な反応が確認された、５Ｃ－２Ａと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せについて、ラテックス凝集法でのヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との結合の特異性を評価した。
（１）モノクローナル抗体固定化ラテックス溶液の調製
５Ｃ－２Ａおよび７９－８Ｇ－３Ｆのモノクローナル抗体を、実施例２と同様の方法でラテックス粒子に固定化してラテックス溶液とした。５Ｃ－２Ａおよび７９－８Ｇ－３Ｆのモノクローナル抗体を固定化したラテックス溶液を混合し、試験に供した。
５Ｃ－２Ａおよび７９－８Ｇ－３Ｆのモノクローナル抗体を、実施例２と同様の方法でラテックス粒子に固定化してラテックス溶液とした。５Ｃ－２Ａおよび７９－８Ｇ－３Ｆのモノクローナル抗体を固定化したラテックス溶液を混合し、試験に供した。
（２）ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体試料の調製
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）中に１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンおよび１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのハプトグロビンを含む溶液を調製し、この溶液を５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）で倍々希釈して、１．６、３．２、６．３または１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料を調製した。
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）中に１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンおよび１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのハプトグロビンを含む溶液を調製し、この溶液を５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）で倍々希釈して、１．６、３．２、６．３または１２．６ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料を調製した。
（３）ラテックス凝集法の測定方法
Ｒ１として５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用い、Ｒ２として上記のモノクローナル抗体固定化ラテックス溶液を用いた。測定は、日立７１７０Ｓ形自動分析装置（日立ハイテクノロジー社製）を用いて行なった。測定方法は、標準液または検体１５μＬを反応セルに加えた後に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μＬ加え、その後モノクローナル抗体固定化ラテックス溶液を２５μＬ加えた後の４４０秒間の波長６６０ｎｍでの濁度変化量を測定した。
Ｒ１として５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用い、Ｒ２として上記のモノクローナル抗体固定化ラテックス溶液を用いた。測定は、日立７１７０Ｓ形自動分析装置（日立ハイテクノロジー社製）を用いて行なった。測定方法は、標準液または検体１５μＬを反応セルに加えた後に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μＬ加え、その後モノクローナル抗体固定化ラテックス溶液を２５μＬ加えた後の４４０秒間の波長６６０ｎｍでの濁度変化量を測定した。
（４）モノクローナル抗体固定化ラテックス粒子とヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との反応
ＥＬＩＳＡ法では、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体双方との反応が確認された、５Ｃ－２Ａと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せを用いたラテックス凝集法での測定結果を表５に示す。５Ｃ－２Ａと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せは、ラテックス等の不溶性担体に固定化することにより、ヘモグロビンと反応させたときには凝集反応がみられず、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との特異的に反応することが確認された。
ＥＬＩＳＡ法では、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体双方との反応が確認された、５Ｃ－２Ａと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せを用いたラテックス凝集法での測定結果を表５に示す。５Ｃ－２Ａと７９－８Ｇ－３Ｆの組合せは、ラテックス等の不溶性担体に固定化することにより、ヘモグロビンと反応させたときには凝集反応がみられず、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との特異的に反応することが確認された。
（実施例６ 検体の測定（１））
従来法の一つのＥＬＩＳＡ法および本発明の方法を用いてヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の測定を行なった。
従来法の一つのＥＬＩＳＡ法および本発明の方法を用いてヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の測定を行なった。
（１）ＥＬＩＳＡ法によるヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の測定
抗ヒトハプトグロビンモノクローナル抗体を９６穴マイクロプレートに固相化して固相化プレートとし、抗ヒトヘモグロビンポリクローナル抗体にホースラディッシュペルオキシダーゼを標識化して酵素標識物とした。
抗ヒトハプトグロビンモノクローナル抗体を９６穴マイクロプレートに固相化して固相化プレートとし、抗ヒトヘモグロビンポリクローナル抗体にホースラディッシュペルオキシダーゼを標識化して酵素標識物とした。
９６穴マイクロプレートに５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１００μＬと標準液または検体１０μＬを加え、５分間撹拌した後に、２５℃で１２０分間静置した。静置後、界面活性剤含有５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて３回洗浄した。
洗浄後、９６穴マイクロプレートに酵素標識物１００μＬを加え、５分間撹拌した後に、２５℃で５５分間静置した。静置後、界面活性剤含有５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて３回洗浄した。
洗浄後、９６穴マイクロプレートに０．４ｍｇ／ｍＬ ｏ－フェニレンジアミン含有基質溶解液１００μＬを加え、２５℃で１５分間静置した。静置後、２Ｎ 硫酸を反応停止液として１００μＬ添加した。
測定は、サンライズレインボー（テカンジャパン社）を用いて測定波長４９２／６５０ｎｍで行ない、標準の測定結果から得られた検量線を基に検体の測定値を求めた。
（２）ラテックス凝集法によるヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の測定
Ｒ１として５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用い、Ｒ２として実施例３のモノクローナル抗体固定化ラテックス溶液を用いた。
Ｒ１として５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用い、Ｒ２として実施例３のモノクローナル抗体固定化ラテックス溶液を用いた。
測定は、ＪＣＡ－ＢＭ２２５０（日本電子社）を用いて行なった。測定方法は、標準液または検体８μＬを反応セルに加えた後にＲ１を５０μＬ加え、その後Ｒ２を１６．７μＬ加えた後の４７１秒間の波長６５８ｎｍでの濁度変化量を測定し、標準の測定結果から得られた検量線を基に検体の測定値を求めた。
（３）測定結果
５検体をＥＬＩＳＡおよびラテックス凝集法で測定した結果を表６に、測定間の相関図を図１に示す。
ラテックス凝集法による検体の測定結果は、ＥＬＩＳＡによる検体の測定結果と同等で、相関係数は０．９９８と良好であった。なお、図１の数値の１はヘモグロビンとしての濃度が１２．９ｐｍｏｌ／ｍＬを示している。
５検体をＥＬＩＳＡおよびラテックス凝集法で測定した結果を表６に、測定間の相関図を図１に示す。
ラテックス凝集法による検体の測定結果は、ＥＬＩＳＡによる検体の測定結果と同等で、相関係数は０．９９８と良好であった。なお、図１の数値の１はヘモグロビンとしての濃度が１２．９ｐｍｏｌ／ｍＬを示している。
これらの結果より、本発明を用いることにより、検体中のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を精確に測定することが可能となり、病気の診断に寄与することが判った。
本発明は、不溶性担体粒子に固定化することによりヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出、測定することが出来るモノクローナル抗体若しくは抗体キット、およびそのモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子、並びにこれらを用いて検体中のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出、測定するための測定試薬及び測定方法を提供するものである。この発明を糞便検体に適用することにより、消化器官での出血の有無を短時間で精度良く調べることが可能となる。
Claims (10)
- ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出するための免疫学的測定方法であって、
前記方法が、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を用いた凝集反応により、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出することを含み、
前記抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が、第１のスクリーニング及び第２のスクリーニングを経て得られたものであり、
前記第１のスクリーニングが、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を用いて、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の両方と反応する抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体をスクリーニングすることであり、
前記第２のスクリーニングが、前記第１のスクリーニングによって得られた各々の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を固定化したポリスチレンラテックス粒子と、ヘモグロビンを含む試料およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料のそれぞれとを反応させたときに、前記ヘモグロビンを含む試料と反応させたときの凝集の度合いと比較して、前記ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料と反応させたときの凝集の度合いが高い抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体をスクリーニングすることであり、
前記検出が、前記モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子の溶液に、同量の第１の試料又は第２の試料を添加した凝集反応において、添加１０秒後および５分１０秒後に波長６６０ｎｍで吸光度を測定し、５分１０秒後の吸光度と１０秒後の吸光度との吸光度の差を凝集反応の指標とした場合、第１の試料の吸光度の差／第２の試料の吸光度の差の比が９４０／３９０以上である反応条件で行われ、
前記第１の試料は、３２．３ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンと、３２．３ｐｍｏｌ／ｍＬのハプトグロビンとを等液量で混和して作製したヘモグロビン－ハプ卜グロビン複合体の試料であり、前記第２の試料は、１６．１ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンを含むヘモグロビンのみの試料である、免疫学的測定方法。 - ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出するための免疫学的測定方法であって、前記方法が、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を用いた凝集反応により、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出することを含み、
前記抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が、第１のスクリーニング及び第２のスクリーニングを経て得られたものであり、
前記第１のスクリーニングが、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を用いて、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の両方と反応する抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体をスクリーニングすることであり、
前記第２のスクリーニングが、前記第１のスクリーニングによって得られた各々の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を固定化したポリスチレンラテックス粒子と、ヘモグロビンを含む試料およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料のそれぞれとを反応させたときに、前記ヘモグロビンを含む試料と反応させたときの凝集の度合いと比較して、前記ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料と反応させたときの凝集の度合いが高い抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体をスクリーニングすることである、免疫学的測定方法。 - 前記モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、遊離ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む混合物中のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出する、請求項１又は２に記載の免疫学的測定方法。
- 前記抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が２種類以上であり、前記モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子がヘモグロビン－ハプトグロビン複合体のみと凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫学的測定方法。
- 前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子又は金属コロイド粒子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫学的測定方法。
- １種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を含み、
前記モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子がヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応することにより、前記ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出する免疫学的測定試薬であって、
前記抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が、第１のスクリーニング及び第２のスクリーニングを経て得られたものであり、
前記第１のスクリーニングが、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を用いて、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の両方と反応する抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体をスクリーニングすることであり、
前記第２のスクリーニングが、前記第１のスクリーニングによって得られた各々の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を固定化したポリスチレンラテックス粒子と、ヘモグロビンを含む試料およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料のそれぞれとを反応させたときに、前記ヘモグロビンを含む試料と反応させたときの凝集の度合いと比較して、前記ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料と反応させたときの凝集の度合いが高い抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体をスクリーニングすることであり、
前記検出が、前記免疫学的測定試薬に同量の第１の試料又は第２の試料を添加した凝集反応において、添加１０秒後および５分１０秒後に波長６６０ｎｍで吸光度を測定し、５分１０秒後の吸光度と１０秒後の吸光度との吸光度の差を凝集反応の指標とした場合、第１の試料の吸光度の差／第２の試料の吸光度の差の比が９４０／３９０以上である反応条件で行われ、
前記第１の試料は、３２．３ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンと、３２．３ｐｍｏｌ／ｍＬのハプトグロビンとを等液量で混和して作製したヘモグロビン－ハプ卜グロビン複合体の試料であり、前記第２の試料は、１６．１ｐｍｏｌ／ｍＬのヘモグロビンを含むヘモグロビンのみの試料である、免疫学的測定試薬。 - １種類以上の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を不溶性担体粒子に固定化することにより得られたモノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子を含み、
前記抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が、第１のスクリーニング及び第２のスクリーニングを経て得られたものであり、
前記第１のスクリーニングが、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を用いて、ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の両方と反応する抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体をスクリーニングすることであり、
前記第２のスクリーニングが、前記第１のスクリーニングによって得られた各々の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を固定化したポリスチレンラテックス粒子と、ヘモグロビンを含む試料およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料のそれぞれとを反応させたときに、前記ヘモグロビンを含む試料と反応させたときの凝集の度合いと比較して、前記ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料と反応させたときの凝集の度合いが高い抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体をスクリーニングすることであり、
前記モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子がヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と凝集反応することにより、前記ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出する免疫学的測定試薬。 - 前記モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子が、遊離ヘモグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む混合物中のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を特異的に検出する、請求項６又は７に記載の免疫学的測定試薬。
- 前記抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体が２種類以上であり、前記モノクローナル抗体固定化不溶性担体粒子がヘモグロビン－ハプトグロビン複合体のみと凝集反応する反面、ヘモグロビンと凝集反応しない、請求項６～８のいずれか一項に記載の免疫学的測定試薬。
- 前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子又は金属コロイド粒子である、請求項６～９のいずれか一項に記載の免疫学的測定試薬。
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