JP2001221800A - 複合体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 複合体の免疫学的測定において遊離している
その構成物質の影響、抗体の選択及び測定方法を限定す
ることなく測定可能とする方法を提供する。 【解決する手段】 免疫学的測定において試料中に存在
する物質とその物質と結合し得る物質との結合の結果生
じる複合体を免疫学的に測定するにあたり、予め、多量
に存在する遊離の物質またはその物質と結合性の物質を
免疫学的に不活性化することにより、遊離の物質又は結
合性の物質の影響を実質的に受けることなく、しかも抗
体の選択および測定方法を限定されることなく物質と結
合性物質との複合体の免疫学的測定方法を提供をするも
のである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は臨床検査分野で生体
試料物質の測定用検査試薬に用いられる。

【０００２】

【従来の技術】酵素と酵素阻害物質の複合体、例えばト
ロンビンとアンチトロンビン−ＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）
やプラスミンとα２−プラスミンインヒビター複合体
（ＰＩＣ）の濃度を測定する場合、複合体に特異的なモ
ノクローナル抗体を樹立してラテックス比濁法により測
定する方法及び複合体を構成している各酵素及び阻害物
質にそれぞれ特異的な抗体を用いてサンドイッチ酵素免
疫測定法により測定する方法が知られている。複合体に
特異的なモノクロナール抗体による測定はその抗体の製
法が極めて困難なため、一部を除いて商品化されていな
い。一方、それぞれの特異抗体を用いるサンドイッチ酵
素免疫測定法は、測定対象とする複合体よりもはるかに
多量に共存する遊離の酵素又は阻害物質の影響を受ける
ため、抗体の選択が限られると言った問題があった。例
えば血漿中のＴＡＴを測定する場合には、通常ＴＡＴ濃
度が約１〜５０ｎｇ／ｍＬ程度であるのに対してＡＴ−
ＩＩＩの濃度は通常約２５０μg／ｍＬと５０００〜２
５０００倍も高い。従ってＴＡＴ特異的なモノクローナ
ル抗体を調製しようとしても、ＡＴ−ＩＩＩとの交差反
応性を２５万分の１以下に押さえなければならないた
め、そのようなモノクローナル抗体の調製は困難であっ
た。一方トロンビンに対する抗体とＡＴ−ＩＩＩに対す
る抗体を用いるサンドイッチ免疫測定を行う場合にも、
抗トロンビン抗体を固相化し、試料を反応させた後、複
合体を固相に捕獲し、その後十分に洗浄して、標識した
抗ＡＴ−ＩＩＩ抗体を反応させて測定しているように、
特定の抗体の組み合わせ及び測定方法が限定されてい
た。

【０００３】

【解決しようとする課題】本発明は、試料中に存在する
物質とその物質と結合し得る物質との結合の結果生じる
複合体を免疫学的に測定するにあたり、予め、多量に存
在する遊離の物質またはその物質と結合性の物質を免疫
学的に不活性化することにより、遊離の物質又は結合性
の物質の影響を実質的に受けることなく、しかも抗体の
選択および測定方法を限定されることなく物質と結合性
物質との複合体の免疫学的測定方法を提供することであ
る。

【０００４】

【解決する手段】本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、
試料中に存在する物質と結合性物質との複合体を免疫学
的に測定するにあたり、予め、多量に存在する遊離の物
質または結合性物質を酵素的あるいは免疫学的に不活性
化することにより、遊離の物質又は結合性物質の影響を
実質的に受けることなく、しかも抗体の選択および測定
方法を限定されることなく物質と結合性物質との複合体
の免疫学的測定方法を見出し本発明を完成させるに至っ
た。

【０００５】以下により具体例をあげて本発明を詳細に
説明する。測定対象として上げられる複合体の例として
は、前述のＴＡＴ、ＰＡＰのほか、トロンビンとヒルジ
ン複合体、エラスターゼとα１−アンチトリプシン複合
体、トリプシンとトリプシンインヒビター複合体、活性
型Ｘ因子とＡＴ―ＩＩＩ複合体、プロテインＣとプロテ
インＣインヒビター複合体、組織プラスミノゲンアクチ
ベーターとプラスミノゲンアクチベーターインヒビター
複合体、活性型ＶＩＩ因子と組織因子経路インヒビター
（ＴＦＰＩ）、組織因子と凝固第ＶＩＩ因子複合体、プ
ラスミノゲンとプラスミノゲンアクチベーター複合体、
ヘモグロビンとハプトグロビン複合体、プロテインＡ又
はプロテインＧと免疫グロブリン複合体、抗原と特異抗
体複合体の免疫複合体等が挙げられる。遊離の物質とそ
の物質に対する結合性物質の酵素的あるいは免疫学的な
不活化の方法としては、蛋白質分解酵素による分解、酸
あるいはアルカリによる不活性化、界面活性剤による不
活性化、等を選択して用いることができる。適用する免
疫学的測定方法は、酵素免疫測定法、担体を用いる比濁
法又は担体を用いない免疫比濁法、イムノクロマト法、
等公知の免疫測定法が適用される。

【０００６】具体的な実施態様として、ＴＡＴを例に本
発明をさらに詳細に説明する。ＴＡＴの構成成分である
トロンビンはその前駆体であるプロトロンビンが活性型
凝固第Ｘ因子により限定分解されることにより生じる。
生じたトロンビンはフィブリノゲンを基質としてフィブ
リンに変換する。遊離のトロンビンはＡＴ−ＩＩＩと結
合することにより複合体（ＴＡＴ）を形成してその活性
を失う。血液中のＴＡＴ濃度を測定することは血液学検
査の重要な項目である。このＴＡＴ複合体を本発明の方
法で測定するには、一定量の検体に蛋白分解酵素、例え
ばサーモライシン、パパイン、プロテアーゼＫ等を添加
し遊離のＡＴ−ＩＩＩを分解する。その試料を抗ＴＡＴ
複合体モノクローナル抗体を吸着させたラテックス試薬
と反応させる。ここで用いるモノクローナル抗体はＴＡ
Ｔ複合体を免疫原にして調製するが、ＡＴ−ＩＩＩと約
０．１％の交差反応性を有するものでも使用可能であ
る。

【０００７】同様に蛋白分解酵素でＡＴ−ＩＩＩを分解
した試料を、抗ＡＴ−ＩＩＩ抗体を固定化したメンブラ
ンストリップと抗トロンビン抗体を金コロイド粒子標識
したイムノクロマトグラフィーに供し展開させ測定する
ことも可能である。通常の方法では遊離のＡＴ−ＩＩＩ
濃度が測定対象のＴＡＴ濃度に比して大過剰であるため
このような、ラテックス凝集測定やイムノクロマトグラ
フィー測定は不可能であったが、本発明はそれを可能に
する。

【０００８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に説明する
が、本発明は実施例に限定されるものではない。

【０００９】

【実施例１】蛋白分解酵素サーモライシンを１０単位／
ｍＬとなるように０．１ｍｏｌ／Ｌのヘペス緩衝液ｐＨ
７．２に溶解した。その２００μＬと種々の濃度のＴＡ
Ｔを含むヒト血漿１００μＬを３７℃で５分間反応させ
た。対照としてサーモライシンを含まない緩衝液２００
μＬと同じＴＡＴを含むヒト血漿１００μＬを反応させ
た。その後、ＡＴ−ＩＩＩと約０．１％の交差反応性を
有する抗ＴＡＴモノクロナール抗体を感作させた粒径
０．３２μｍのラテックス試薬３０μＬと３７℃で反応
させ５分間あたりの波長７００ｎｍでの吸光度変化量を
測定することによりＴＡＴ濃度を測定した。その結果を
表１に示した。

【００１０】

【表１】

【００１１】以上の結果、サーモライシン無添加の従来
の方法では、交差反応のために、ＴＡＴが含まれていな
い場合にも、吸光度変化をおこしＴＡＴ濃度依存性の信
号は得られず、測定できない。一方、サーモライシンを
添加した本発明の方法ではＴＡＴ濃度に応じた吸光度変
化が観測されＴＡＴの測定が可能であることが判った。

【００１２】

【発明の効果】以上説明したように本発明は、免疫学的
測定において試料中に存在する物質とその物質と結合し
得る物質との結合の結果生じる複合体を免疫学的に測定
するにあたり、予め、多量に存在する遊離の物質または
その物質と結合性の物質を免疫学的に不活性化すること
により、遊離の物質又は結合性の物質の影響を実質的に
受けることなく、しかも抗体の選択および測定方法を限
定されることなく物質と結合性物質との複合体の免疫学
的測定方法を提供をするものであり、より正確な測定を
可能とする。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】物質とその物質に結合しうる結合対との結
   合の結果生成する複合体を免疫学的に測定する方法にお
   いて、予め遊離の物質及び／又はその物質に結合しうる
   結合対の物質を実質的に免疫学的測定に影響を及ぼさな
   い程度に不活化する工程を含むことを特徴とする物質と
   その物質に結合し得る結合対との結合の結果生じる複合
   体の免疫学的測定方法。
2. 【請求項２】物質とその物質に結合しうる結合対との組
   み合わせが、酵素と酵素阻害物質、酵素又は酵素前駆体
   とその活性化物質である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】請求項１又は請求項２に記載の測定用試薬