JPS63298061A

JPS63298061A - ヒトｃ反応性タンパクの定量法

Info

Publication number: JPS63298061A
Application number: JP13307687A
Authority: JP
Inventors: Kazunobu Tanno; 和信丹野; Hiromi Iijima; 飯嶋　裕已; Kiyotaka Kawagoe; 川越　清隆
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1987-05-28
Filing date: 1987-05-28
Publication date: 1988-12-05
Anticipated expiration: 2010-11-15
Also published as: JPH07107534B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は試料中のヒトＣ反応性タンパク（以下ＣＲＰと
略す）の高感度で迅速な定量法、特にラテックス凝集比
濁法を利用する定量法に関する。

〔従来の技術〕

ＣＲＰは炎症性疾患や組織に崩壊があるような病態の時
に著しく増加することが認められ、臨床検査に広く用い
られてきた。

ＣＲＰの測定は従来、毛細管法や一次免疫拡散法（以下
５ＲｕＤ法と称す）などによる半定量法が主であったが
、近年溶液内抗原−抗体反応を利用したレーザーネフエ
ロメーター法や免疫比濁法による定量法が試みられ、数
多くの検討結果が報告されており、またその問題点も指
摘されている。

しかしながら、ＣＲＰの測定は臨床所見に合わせて検討
すると従来の半定量法に比絞して定量法の方が意義が大
きいことが明らかに認められている。だが、いままでに
報告されている定量値はｍｇ〜μｇ　／　ｍ　Ｑオーダ
ーの範囲でクラウスとオスモンドら（Ｄ、　Ｒ，Ｃ１ａ
ｕｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｌ　ａｄ、ｃｌｉｎ。

Ｍｅｄ８７　　（１９７６）１２０〜１２８）　による
Ｒ丁へ法での健康人のＣＲＰ値が６８〜８，２００ｎｇ
／　ｍ　Ｑであることが報告されて以来、ＣＲＰの高感
度定量法が注目され、その臨床的意義が問われるように
なってきたが測定方法の確立は充分ではなかった。

そこで、抗原又は抗体を感作した不溶性担体を使用し、
抗原−抗体反応によるラテックス凝集反応を起こさせ、
吸光度の増加を測定して、該反応の動力学を求め、これ
から、試料中の抗原又は抗体を定量する方法が提案され
ている（特開昭５３−６２８２６号公報）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、前記公報に記載の方法を利用しても、ＣＲＰの
定量においては、次のような欠点がある。

抗ＣＲＰ抗体を感作した不溶性担体のラテックス試薬は
、感度が高く、また、該ラテックス試薬自体の吸光度が
高いため、試料中のＣＲＰ濃度が低い場合には、吸光度
の増加とＣＲＰ濃度は対応するが、試料中のＣＲＰ濃度
が少し高くなるだけで、吸光度の増加と試料中のＣＲＰ
ｉｌ１度が対応せず、ＣＲＰを正確に定量することがで
きない。

また、抗ＣＲＰ抗体を感作した不溶性担体のラテックス
は、同一感作条件で感作しても、得られたラテックス試
薬の抗原−抗体反応の反応性が大きく異なる。すなわち
、該ラテックス試薬はロット毎の差が大きく、安定した
試薬となりにくい。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、試料及び抗ＣＲＰ抗体を感作した不溶性担体
を混合して混合液とし、この混合液中にトリアルキルア
ミン、その塩及び第４級アンモニウム塩からなる群から
選ばれる少なくとも一種の水溶性化合物を共存させて抗
原−抗体反応によるることを特徴とするＣＲＰの定量法
に関する。

上記試料としては、血清、胸腔、腹水等がある。

上記の不溶性担体としては、゛診断用ポリスチレン系ラ
テックス粒子等公知のものが使用でき、該担体に抗ＣＲ
Ｐ抗体を物理的又は化学的に吸着させて抗ＣＲＰ抗体が
感作された不溶性担体とされる。不溶性担体は、測定感
度向上の点から、粒径が０．２　μｍ以下であるのが好
ましく１粒径の下限は０．０５　μｍであるのが好まし
い。また、抗ＣＲＰ抗体としては、ウサギ、ヒツジ、ヤ
ギ等の動物由来の多価抗体、モノクロナール抗体などが
使用される。

この感作された不溶性担体は、上記混合液中に適宜の濃
度で使用されるが、吸光度等の光学的強度の測定の容易
さから０．０５重量％以下になるように使用されるのが
好ましく、十分に反応させる点からは０．０１　重量％
以上が好ましい。

前記水溶性化合物としては、トリアルキルアミンとして
トリエチルアミン等、トリアルキルアミンの塩としてト
リエチルアミンの溶酸塩等及び第４級アンモニウム塩と
して塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、臭
化アセチルコリン。

塩酸ベタイン等がある。これらの化合物は、一種又は二
種以上使用される。この不溶性化合物は、前記混合液中
に、適宜の濃度になるように使用されるが、好ましくは
０．１〜３Ｍ、特に好ましくは０．３〜１Ｍになるよう
に使用される。該不溶性化合物が少なすぎると添加する
ことによる効果が小さく、多すぎると測定感度が低下し
やすくなる。

前記の感作された不溶性担体及び水溶性化合物は、各々
、適当な媒体に分散及び溶解して使用するのが好ましい
。この場合、前記の感作された不溶性担体と水溶性化合
物は、同一の媒体に分散及び溶解して１液のラテックス
試薬として使用しても、各々、別個に媒体に分散又は溶
解させてラテックス試薬と溶液状の試薬の２液型試薬と
して使用してもよい。

ここで、媒体としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液
、トリス塩酸緩衝液、グツド緩衝液等が好ましい。

上記１液のラテックス試薬中には、さらに、牛血清アル
ブミン、シヨ糖、塩濃度調整のためにＮａＣＱ等を適宜
溶解させてもよい。

また、ラテックス試薬と溶液状の試薬の２液型試薬とし
て使用する場合にも、それぞれに、適宜。

血清アルブミン、ＮａＣＱ等を溶解してもよく、該ラテ
ックス試薬にさらに適宜、前記水溶性化合物を溶解して
もよい。

前記１液のラテックス試薬及び２液型試薬のラテックス
試薬において、感作された不溶性担体は、前記混合液中
の濃度が調整しやすくなるように適宜の濃度で使用され
るが、０．１〜０．５重量％の濃度になるようにするの
が、一般に使用しやすい。

前記の水溶性化合物は、１液のラテックス試薬及び２液
型試薬の溶液状の試薬において、前記混合液中での濃度
が調整しやすくなるように適宜の濃度で溶解される。

また、前記の媒体に、適宜、牛血清アルブミン。

Ｎ　ａ　ＣＱ等を溶解させて、前記試薬と共に、液量調
整のために使用してもよい。

本発明において、試料、前記の感作された不溶性担体及
び前記水溶性化合物は適宜の順序で混合され、混合液と
される。

前記抗原−抗体反応は、２５〜３７℃で行なうのが好ま
しく１反応中は恒温にするのが好ましい。

この範囲をはずれると抗原−抗体反応が不安定になりや
すい。さらに、この反応は、５秒〜１５分間行なわれる
のが好ましく、特に１０秒から１０分間行なわれるのが
好ましい、５秒未満では、上記反応が不充分であり、吸
光度からＣＲＰを定量するのが困難になり、１５分を越
えると短時間測定の長所が減じる。

上記ラテックス凝集反応開始後、混合液の吸光度が好ま
くは５００〜１，０００　　ｎｍの範囲から適切な波長
を選択して測定される。

また、吸光度測定におけるセルの光路長は、５〜１０ｍ
ｍであるのが好ましい。

光学的強度吸光度又は散乱光強度を意味し、反応開始後
の測定値のうち１個を用いて定量される。

従って、一定の光学的強度に達するまでの時間を測定す
る方法をも採用することができる。

定量は、ＣＲＰ既知量の試料（例えば、ＣＲＰ標準血清
とその希釈系列）について、前記の測定を行ない、その
測定値とＣＲＰ量とから検量線を作成しておき、ＣＲＰ
未知量の試料について同一条件で測定した測定値から該
検量線において対応するＣＲＰ量を求めることによって
行なうことができる。

反応開始後、１回測定する方法で前記の２液型の試薬を
用いる場合には、さらに、次のようにして定量する。

すなわち、試料について吸光度（ＡＴ）を測定し、この
値から試料に起因する吸光度（Ａｓｓ）とラテックス試
薬に起因する吸光度を差し引き、算出濁度（ＡＣＲＰ）
　　を求める。

ここで、試料に起因する吸光度とは、例えば、上記混合
液の調整において、ラテックス試料の代わりに生理食塩
水を使用して得た液の吸光度である。

ラテックス試料に起因する吸光度とは、例えば、上記し
た混合液の調整において、試料の代わりに生理食塩水を
使用して得た液の吸光度（ＡＲＢ）から、上記した混合
液において試料及びラテックス試薬の代わりに生理食塩
水を使用して得た吸光度（ＡＢＢ）を差し引いた値であ
る。

上記ＡＴＩ　Ａｓｎｔ　ＡＲＢ、　ＡＢＢからＣＲＰに
関する吸光度ＡＣＲＰが次の式により求められる。

ＡＣＲＰ＝　ＡＴ　−Ａｓａ　　（ＡＲＢ　−Ａａｕ）
Ａ　ＣＲＰからＣＲＰを定量する方法は、前記の定量の
方法と同様である。

以上は、散乱光強度でも同様である。

〔実施例〕

次に、試薬、測定方法、実測結果などに関連して本発明
方法を詳細に説明する。以下、％は重量％を意味する。

実施例１１）試薬ｉ）希釈液０．５７Ｍ塩化コリン、　Ｏ、１，５Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１
２及び０．１％牛血清アルブミン含有０．０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，５０’）ｉｉ）ラテックス試薬上記ｉ）希釈液（但し、酸化コリンを含まない）に抗Ｃ
ＲＰ抗体を感作した０、２　μｍ未満の診断用ポリスチ
レン系ラテックス粒子を分散させた試液（ラテックス濃
度０．１重量％）上記の表の４種の液を調製し、各液を３７℃で１０分間
恒温反応した後、５７０ｎｍ吸光度を測定し、検体の吸
光度（ＡＣＲＰ）　　を式％式％）から算出する。検体としてＣＲＰ陽性血清の１／　５（
１，０ｍ　ｇ／　ｄ　Ｑ）から５１５（５，０ｍｇ／ｄ
　Ｑ）まで５個の希釈系列を用いて吸光度とＣＲＰ値（
ｍｇ／ｄ１２）との希釈直線系列を作成した。測定は、
日立自動分析表［７０５形（以下日立７０５形と略す）
を用い、上記測定原理を適用した。

日立７０５形では分析法プログラムの２ポイントエンド
法を使用すると自動的に装置が、上記測定法にもとづい
て演算し、測定結果を算出する。反応温度は２５℃〜３
７°Ｃ１測定波長は５７０ｎｍ’＆ｍ択し、−波長測光
を採用した。

３）実測結果上記で得られた希釈直線性を第１図にグラフ１として示
す。

実施例２実施例１において、ラテックス試薬中の０．５７Ｍ塩化
コリンを、０．６　Ｍ塩化アセチルコリン、０．５　Ｍ
塩酸ベタイン及び０．１　Ｍトリエチルアミンに換えた
こと以外は実施例１と同様に行なった。それぞれの場合
に、第１図のグラフ１と同様の直線性に優れた検量線が
得られた。

比較例１実施例１における希釈液に、塩化コリンを含有させない
こと以外は、実施例１と同様に行なった得られた検量線
を第１図に、グラフ２°として示す第１図から明らかな
ようにトリアルキルアミンその塩、及び第４級アンモニ
ウム塩からなる群から選ばれる少なくとも一種の上記化
合物を共存させた場合に、希釈直線性は良好な直線が得
られる（グラフ１）が得られるが、上記化合物無添加の
場合、抗原過剰による地帯現象が生じ、高値で測定値が
低下する（グラフ２）。

〔発明の効果〕

本発明によればＣＲＰの測定において良好な直線性が得
られるため、検量線の作成が容易になり定量精度も向上
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１及び比較例１における測定結果を示
すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１、試料及び抗ヒトＣ反応性タンパク抗体を感作した不
溶性担体を混合して混合液とし、この混合液中にトリア
ルキルアミン、その塩及び第４級アンモニウム塩からな
る群から選ばれる少なくとも一種の水溶性化合物を共存
させて抗原−抗体反応によるラテックス凝集反応を起こ
させて光学的強度を測定し、この測定値から試料中のヒ
トＣ反応性タンパクを定量することを特徴とするヒトＣ
反応性タンパクの定量法に関する。