JP5541747B2 - 低分子の免疫学的測定法及びキット - Google Patents

低分子の免疫学的測定法及びキット Download PDF

Info

Publication number
JP5541747B2
JP5541747B2 JP2012068667A JP2012068667A JP5541747B2 JP 5541747 B2 JP5541747 B2 JP 5541747B2 JP 2012068667 A JP2012068667 A JP 2012068667A JP 2012068667 A JP2012068667 A JP 2012068667A JP 5541747 B2 JP5541747 B2 JP 5541747B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
lipase
reaction
measurement
antibody
added
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2012068667A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2013200208A (ja
Inventor
望 荒井
慶一 庄司
恒 伊神
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LSI Medience Corp
Original Assignee
LSI Medience Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LSI Medience Corp filed Critical LSI Medience Corp
Priority to JP2012068667A priority Critical patent/JP5541747B2/ja
Publication of JP2013200208A publication Critical patent/JP2013200208A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5541747B2 publication Critical patent/JP5541747B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

本発明は、低分子の高精度な免疫学的測定法及びキットに関する。
血液中の低分子(例えば、ハプテンなど)はその大部分が特異的、非特異的にタンパク質・脂質などに結合していることが知られている。また、低分子は、容器にも非特異的に結合することが知られているため、低分子の総量を正確に精度良く測定するためには低分子を特異的、非特異的結合から遊離する必要があった(特許文献1)。特に低分子が甲状腺ホルモン、ステロイドホルモンの場合はそれぞれ代表的な結合タンパク質が存在し、甲状腺ホルモンの場合はサイロキシン・バインディンググロブリンに、ステロイドホルモンの場合はアルブミンもしくはセックスホルモン・バインディンググロブリンに結合していることが知られている(非特許文献1)。従来知られている低分子の特異的結合阻害剤は、コルチゾールの免疫測定法におけるグルタミン酸溶液(特許文献2)、8−アニリノ1−ナフタレンスルホン酸(ANS)あるいはその塩(特許文献3)、ステロイドホルモン測定方法における測定外ステロイドの共存(特許文献4)やサリチル酸(特許文献5)などが報告されている。一方、非特異的結合阻害剤として低分子の測定法における疎水性アミノ酸(特許文献6)なども報告されている。
特開平7−270412号公報 特開昭53−101521号公報 特開昭61−12547号公報 特開平6−102275号公報 特開平6−34636号公報 特開平7−270412号公報
日本臨床42巻11号(11,1984)31−36
本発明者らは、臨床検体の低分子の免疫学的測定法において、低分子に結合する脂質類が測定に負あるいは正の影響を与えてしまい、正確に測定できないことに気がついた。本発明はこの問題に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、特に低分子の脂質に対する非特異反応抑制物質(結合阻害物質)を開発し、低分子の免疫学的測定法において検体中の低分子の濃度を正確に測定する方法及びキットを提供するものである。
本発明者らは、上記のような課題に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、脂質の低分子に対する非特異反応を、脂質を分解することが可能な非特異反応抑制物質(結合阻害物質)によって抑制できることを発見し、低分子の免疫学的測定法において検体中の低分子の濃度を正確に測定する方法及びキットを見出した。
本発明はこの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち、本発明は
[1]脂質を分解することが可能な非特異反応抑制物質を用いることを特徴とする、低分子の免疫学的測定方法、
[2]前記低分子がハプテンである、[1]の測定方法、
[3]前記非特異反応抑制物質がリパーゼ類である、[1]又は[2]の測定方法、
[4]前記非特異反応抑制物質が、肝臓由来リパーゼ、非肝臓由来リパーゼ、リポプロテインリパーゼ、ホルモン感受性リパーゼ、及びホスホリパーゼからなる群から選んだ少なくとも1つのリパーゼである、[1]〜[3]のいずれかの測定方法、
[5]脂質を分解することが可能な非特異反応抑制物質を含有する、低分子の免疫学的測定キット、
[6]前記低分子がハプテンである、[5]の測定キット、
[7]前記非特異反応抑制物質がリパーゼ類である、[5]又は[6]の測定キット、
[8]前記非特異反応抑制物質が、肝臓由来リパーゼ、非肝臓由来リパーゼ、リポプロテインリパーゼ、ホルモン感受性リパーゼ、及びホスホリパーゼからなる群から選んだ少なくとも1つのリパーゼである、[5]〜[7]のいずれかの測定キット、
に関する。
本発明の低分子の免疫学的測定方法及びキットによれば、脂質、中でも単純脂質、好ましくは中性脂肪の影響を回避し、安定して正確に検体中の低分子を測定することができる。
臨床検体におけるリパーゼ添加の効果を示すグラフである。横軸はリパーゼを添加有りの場合の検体測定値を、縦軸はリパーゼを添加無の場合の検体測定値を示す。
以下、本発明を更に詳細に説明するが、以下の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、本発明はこれらの内容のみに特定されるものではない。
本明細書における「低分子」とは、ハプテンなど、臨床検体中に混入している分子量1万以下、好ましくは1000以下の物質である。ハプテンなどのように生体由来の成分やその類似物質、医薬品などのように治療のために生体内に取り入れられるような物質も意味する。
例えば、前記「ハプテン」とは、分子量1万以下の低分子のうち、単独ではヒトあるいは動物に対し抗体産生を惹起させるのは困難だが、タンパク質等の高分子物質と結合することにより抗体産生を惹起しうる物質を指す。さらに、高分子に結合した状態における構造的に該当する部位を指す場合もある。臨床検査でハプテンとして測定されるものの例を挙げると、甲状腺ホルモン、ステロイド、アドレナリン等の低分子ホルモン、ガストリン、バソプレシン、アンジオテンシン等の小ペプチドホルモン、ビタミン類、各種合成薬剤等がある。
上記の「高分子」とは、ハプテンと異なり、単独で抗体産生を惹起できる抗原性を有する分子量5000以上の物質で、分子内にハプテン分子を含有するか、或いは化学的にハプテン分子を結合しうる官能基を有する必要がある。通常ウシ血清アルブミン、ウマフェリチンのようなタンパク質あるいはポリリジンのような、分子量数万から数十万で水溶性に優れ、官能基に富む物質が用いられる。
本発明で用いることのできる「ハプテンに対する類似物質(アナログ体)」とは、例えば、ステロイドに対しては、ステロイド骨格を有する該ステロイドの類似物質であればよく、例えば、エストラジオールに対しては、アルドステロン、アンドロステンジオン、コルチゾール、コルチゾン、DHEA−S、17α−エストラジオール、17β−エストラジオール−3−グルクロニド−17−硫酸塩、17β−エストラジオール−3β−D−グルクロニド、17β−エストラジオール−17β−D−グルクロニド、17β−エストラジオール−3−硫酸塩、5−アンドロステン−3β,17β−ジオール、17β−エストラジオール−17−プロピオン酸塩、17β−エストラジオール−3−硫酸−17−グルクロニド、17β−エストラジオール−17−吉草酸塩、エストリオール、エストリオール−3−硫酸塩、エストリオール−3−グルクロニド、エチステロン、ノルエチンドロン酢酸塩、17α−エチニル−エストラジオール、エストロン、エストロン−β−D−グルクロニド、エストロン−3−硫酸塩、エストロン−3β−グルクロニド、エストロン−3−硫酸塩、プレグネノロン、2−メトキシ−エストラジオール、クロミフェン、プレドニゾロン、ダナゾール、メステロロン、d−エキレニン、エキリン、ノルゲストレル、プロゲステロン、塩酸ラロキシフェン、タモキシフェンクエン酸塩、テストステロン、5α−ジヒドロテストステロン、5−アンドロステン−3β,17β−ジオールなどが挙げられる。上記で挙げた以外でも、当業者であれば該ステロイドの物質を合成したり購入することで入手することができる。
本発明において使用される検体としては、例えば全血、血清、血漿等の体液や尿、糞便抽出液等が挙げられる。
本発明の測定方法は、脂質を分解することが可能な非特異反応抑制物質を用いること以外は、公知の免疫学的測定法に従って実施することができる。
免疫学的測定法としては、一元放射免疫拡散法、比濁法、比ろう法、凝集法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法等があるが、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法は測定感度も高く、特に極微量成分の測定に好適である。
放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法はそれぞれ放射性物質、酵素、蛍光物質を、標的物質に特異的に反応する抗体に結合した標識抗体を用いる方法で、一般的には、抗体や抗原を不溶性担体に結合した固相化抗体または固相化抗原と組み合わせた固相法で使用される。固相法には「固相化抗体−抗原−標識抗体」複合物を作らせ測定するサンドイッチ法や、固相化抗原と検体中の遊離抗原が反応系内に添加された一定量の標識抗体に対して競合的に反応することを原理とする競合法がある。
本発明の測定原理は上述した免疫学的測定方法を使用することができる。
該免疫学的測定方法に使用可能な抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、抗体を産生する任意の動物種、例えば家兎、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウスまたはラットなど由来の抗体が使用できる。
また、使用可能な抗体としては完全抗体や、それを酵素処理や化学処理により切断したF(ab’)やFab’等のような抗体断片が挙げられる。
「固相化抗体−抗原−標識抗体」複合物を作らせ測定するサンドイッチ法の場合、これらの抗体は、固相担体あるいは標識物質に固定化される。固相担体としては、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、粒子、ナノ粒子、膜などが挙げられる。粒子としては、磁性粒子、ポリスチレンラテックスのような疎水性粒子、粒子表面にアミノ基、カルボキシル基などの親水基を有する共重合ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。中でも、迅速簡便なB/F分離を実現する観点においては磁性粒子が特に好ましく、具体的には、例えば、四酸化三鉄(Fe)、三酸化二鉄(Fe)、種々のフェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる微粒子等の磁性粒子が好ましく用いられる。また、これらの磁性粒子を、ポリスチレン等の高分子のラテックスや、ゼラチン、リポソーム等の内部に含まれる形で調製したり、表面に固定化したりしたものを好ましく用いることができる。膜としては、ニトロセルロース膜、セルロース濾紙、ナイロン膜などが挙げられ、イムノクロマトグラフィーなどを原理とする簡易測定キットの試験片にも使用することも可能である。
該免疫学的測定方法に使用可能な標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位元素、発色物質、不溶性粒状物質、などが挙げられる。該標識用の酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレッセイン誘導体(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC))、ローダミン誘導体、グリーン蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェリンなどが挙げられる。化学発光物質としては、アクリジニウムエステルなどが挙げられる。放射性同位元素としては、125I、H、14C、32P、などが挙げられる。発色物質としては、パラニトロアニリン(pNA)などが挙げられる。すなわち、発色、蛍光、時間分解蛍光、化学発光、電気化学発光、放射活性等を測定する方法を用いることができる。
また、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を用いて発光、蛍光又は発色反応を行うことにより、標識物質を測定できる。例えば、酵素がアルカリホスファターゼである場合、基質としては、CDP−star(登録商標)(2−クロロ−5−(4−メトキシスピロ{1,2−ジオキセタン−3,2’−(5’−クロロ)−トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}−4−イル)−1−フェニルホスフェート・二ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3−(4−メトキシスピロ{1,2−ジオキセタン−3,2−(5’−クロロ)トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}−4−イル)フェニルリン酸2ナトリウム)、AMPPD(登録商標)(アダマンチルメトキシフェニルホスホリルジオキシセタン)、APS−5などの化学発光基質;4−メチルウンベリフェリルフォスフェート(4−methylumbelliferylphosphate)などの蛍光基質;p−ニトロフェニルホスフェート、BCIP(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−リン酸)、NBT(4−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド)、INT(ヨードニトロテトラゾリウム)などの発色基質を用いることができる。
本発明における非特異反応抑制物質の使用方法としては、標的物質とそれに対する特異的な抗体との特異的な免疫反応工程の前に、予め適当な緩衝液中で非特異反応抑制物質と検体を接触させ、適当な時間(例えば1分〜2時間)インキュベートする方法がある。この間に、検体中の非特異反応を起こす物質(非特異反応物質)は非特異反応抑制物質と反応し、特異的な免疫反応工程での標識抗体との非特異反応活性は失われる。
非特異反応抑制物質が、特異的免疫反応工程に影響しない測定法を使用する場合には、インキュベートを完了した検体と非特異反応抑制物質の混合液をそのまま用いればよく、一方、特異的免疫反応工程に影響する測定法を使用する場合には、特異的免疫反応工程を行う前に、インキュベートを完了した後の非特異反応抑制物質を除去すれば良い。
特異的免疫反応工程に影響しない測定法とは、例えば、最も一般的に用いられるサンドイッチ法の場合、特異的免疫反応で分離される「固相化抗体−非特異反応物質−標識抗体」サンドイッチ複合体に関わらない測定法である。このような場合、具体的には、前記複合体と共に分離されない非特異反応抑制物質(例えば、遊離のタンパク質や分離されない粒子などを含むもの)が使用できる。
特異的免疫反応工程に影響する測定法とは、例えば、最も一般的に用いられるサンドイッチ法の場合、特異的免疫反応で分離される「固相化抗体−非特異反応物質−標識抗体」サンドイッチ複合体に関わる測定法である。このような場合、具体的には、前記複合体と共に分離される非特異反応抑制物質(例えば、前記複合体が磁性粒子を含み、磁力体で分離される場合、同様な磁性粒子などを含むもの)が使用できる。
本発明における非特異反応抑制物質の別の使用方法としては、非特異反応抑制物質の共存下に特異的免疫反応工程を行う方法がある。例えば、最も一般的に用いられるサンドイッチ法の場合、固相化抗体と検体中の抗原(標的物質)とを反応させる第一免疫反応工程の緩衝液に非特異反応抑制物質を添加する。非特異反応が検出されるのは、抗体の特異的反応部位を介さずに「固相化抗体−非特異反応物質−標識抗体」サンドイッチ複合体を形成するためであるが、この場合、第一免疫反応中に非特異反応物質の標識抗体に対する反応活性が非特異反応抑制物質により吸収される。さらに、抗体の特異反応部位を介して固定化された抗原と標識抗体とを反応させる第二免疫反応工程の緩衝液にも添加すれば、第一免疫反応工程で完全に吸収されなかった非特異反応物質も吸収されるため、測定の信頼性をより一層高めることができる。
上記と同様に、いずれの測定法も使用可能であるが、特異的免疫反応工程で非特異反応抑制物質が使用されるため、前記特異的免疫反応工程に影響しない測定法で行う方が好ましい。
また、1段階サンドイッチ法においても免疫反応工程の緩衝液に非特異反応抑制物質を添加して反応させることにより、非特異反応は回避される。
上記と同様に、いずれの測定法も使用可能であるが、特異的免疫反応工程で非特異反応抑制物質が使用されるため、前記特異的免疫反応工程に影響しない測定法で行う方が好ましい。
非特異反応抑制物質の添加時期は、標的物質や測定法に合わせて、好適な方法を適宜選択すれば良い。
本発明で対象とする非特異反応物質は脂質である。脂質とは、単純脂質、複合脂質、誘導脂質が挙げられるが、中でも単純脂質、好ましくは中性脂肪に効果を有する。中性脂肪とは、脂肪酸のグリセリンエステルであり、脂肪酸グリセリンエステルにはモノグリセリド(モノアシルグリセロール)、ジグリセリド(ジアシルグリセロール)、トリグリセリド(トリアシルグリセロール)が存在するが、血液中に含まれる中性脂肪のほとんどはトリグリセリドである。
よって、公知の脂質を分解することが可能な物質を非特異反応抑制物質として使用することができる。具体的には、リパーゼ類が挙げられる。特に、肝臓由来リパーゼ、非肝臓由来リパーゼ、リポプロテインリパーゼ、ホルモン感受性リパーゼ、ホスホリパーゼ等が挙げられる。生体試料から精製したものでも、インビトロで作製したものでも使用できる。前記精製あるいは作製は、公知の方法に従って実施することができ、また、簡単に購入することもできる。
本発明における非特異反応抑制物質は、免疫反応工程の前に予め適当な緩衝液に添加して使用されるか、あるいは免疫反応工程の緩衝液に添加して使用される。非特異反応物質を反応させる工程における非特異反応抑制物質の有効活性濃度は、当業者であれば、それらの種類によって、適宜、好適な濃度に決定することができる。好適な濃度とは、脂質を分解することが可能である濃度であれば良いが、例えば、特開2002−369681号公報にリパーゼ類が0.1〜20U/mLで脂質を分解できることが記載されている。更に、後述する実施例に示すように、検体中の低分子の測定において、脂質の影響を抑制することが可能な濃度を検討し、適宜、設定することができる。例えば、本発明は検体と初めに接触する反応場において1.0〜500U/mLの濃度において有効であることが確認されている。
本発明において、リパーゼ類の使用濃度の下限としては、検体と初めに接触する反応場において、例えば、1U/mL以上、好ましくは5U/mL以上、より好ましくは10U/mL以上、更に好ましくは20U/mL以上、特に好ましくは300U/mL以上である。リパーゼ類の使用濃度の上限としては、例えば、1000U/mL以下、好ましくは800U/mL以下、より好ましくは500U/mL以下、特に好ましくは400U/mL以下である。
本発明で使用される緩衝液は公知の通常免疫反応に使われる適当な緩衝液であってよい。
また、緩衝液中に通常用いられる添加剤、例えば、反応促進剤、洗浄剤または安定剤と共に使用することができる。さらに別の非特異反応抑制物質と共に用いることもできる。適当な緩衝液として例えば、20〜100mmol/Lリン酸塩緩衝液(pH6〜8)または50mmol/Lトリス−塩酸/100mmol/L NaCl(pH7〜8)などが使用できる。反応促進剤としては例えばデキストランサルフェートまたはポリエチレングリコールなど、洗浄剤としては例えばTritonX−100、Tween20などを、また安定化剤としてアルブミン、スキムミルク、ゼラチンなどのタンパク質やアジ化ナトリウム、チメロサール、ケーソンCG、プロクリンなどの防腐剤を挙げることができる。
本発明の非特異反応抑制物質を含む測定キットとしては、従来の免疫学的測定キットに前記非特異反応抑制物質を更に含ませることができる。一般に、ELISA法による測定キットは標識抗体液、固相化抗体、標準物質などの試薬から構成され、さらに必要に応じて、サンドイッチ法で検体と固相化抗体を反応させるため緩衝液、酵素反応のための発色液と反応停止液、固相を洗浄するための洗浄液、検体の前処理剤などを含んで構成される。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合、復元のための溶液も添付される場合がある。
本発明の非特異反応抑制物質は単独でキットの構成試薬にしてもよいし、他の構成試薬に予め添加してもよい。しかし、測定操作を増やすことなしに非特異反応抑制効果が得られることを考慮すれば、構成試薬の一成分として添加するのが好ましい。例えば、本発明の非特異反応抑制物質は、検体処理液や検体と固相化抗体を反応する緩衝液や標識抗体溶液に添加してキットの構成試薬とすることが挙げられる。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合には復元液に添加することもできる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《材料》
以下の実施例で使用した材料を示す。
リパーゼは、旭化成より購入した非肝臓由来リパーゼ:T−63 Lipase(LPBP)を用いた。
脂質は、フレゼニウス カービ ジャパンより購入した20%イントラリピッド輸液を用いた。イントラリピッド輸液は、トリグリセリドを主成分とする大豆油を含む。
《実施例1:テストステロンの免疫学的測定法へのリパーゼの添加効果の検討》
(1−1)抗テストステロン抗体結合磁性粒子の作製
抗テストステロン抗体を50mmol/Lリン酸緩衝液中でBiotin−(AC5)2Sulfo−Osu(同仁堂社)と反応させた。反応液中の抗体の濃度は1mg/mLであり、これに対し、ビオチンを10当量添加し室温で30分間反応させた。未反応のビオチンは脱塩カラム(NAP−10:GEヘルスケアサイエンス社)にて除去した。
ストレプトアビジン結合磁性粒子(Dynal社)がゼラチンを含む緩衝液[0.1mol/L MES(pH6)、0.6mol/L NaCl]に0.05%で懸濁された溶液と、上記で調製したビオチン化抗テストステロン抗体を0.02μg/mLになるように混合し、抗テストステロン抗体結合粒子とした。
(1−2)標識テストステロンの作製
標識テストステロンの作製はTestosterone−3CMO(SIGMA社)のカルボキシル基を、NHS/EDC混合液とそれぞれが35mmol/Lになるように、DMF中にて活性化させた。一方で0.1mol/Lリン酸緩衝液中にALP(アルカリフォスファターゼ)が2mg/mLになるように懸濁したものを用意した。上記でカルボキシル基を活性化させたTestosterone−3CMOとALPをさらに終濃度0.009mmol/Lになるように混合し、ALP中のアミノ基と結合させるアミンカップリング法を行った。Superose6(GEヘルスケアサイエンス社)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーにより、未反応物の除去を行い標識テストステロンを作製した。
(1−3)テストステロンの測定
テストステロンの測定は、小型自動免疫測定装置(PATHFAST;三菱化学メディエンス社製)を用いて、以下のような競合反応系で行った。詳細には、健常人由来の血清25μLと、緩衝液1[0.1mol/L HEPES(pH7.0)、0.05% Tween20、0.5% BSA(セラケア社)]25μLを37℃で8分間反応させた(反応1)。この混合溶液50μLに、更に抗テストステロン抗体結合磁性粒子と、ゼラチンを含む緩衝液2[0.1mol/L MES(pH6)、0.6mol/L NaCl]に0.05%で懸濁された溶液50μL、及び0.075mAbsの標識テストステロンを含む緩衝液3[0.01mol/L MES(pH5.5)、0.3mol/L NaCl、0.1% BSA(セラケア社)]50μLを加え、37℃で5分間反応させた(反応2)。0.01mol/L MOPS(pH7.5)、1mol/L NaCl、0.05%アジ化ナトリウム、0.05% TritonX−100で上記磁性粒子を洗浄した後、ケミルミネッセンス基質溶液[2−クロロ−5−(4−メトキシスピロ{1,2−ジオキセタン−3,2’−(5’−クロロ)−トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}−4−イル)−1−フェニルホスフェート・二ナトリウム:CDP−Star溶液]100μLを混合し、37℃で1分間反応させ、発光量をカウントした。
リパーゼは、緩衝液3に0、100、200、500、1000U/mLになるように添加した。反応場(反応2)でのリパーゼ濃度は0、33.3、66.7、166.7、333.3U/mLである。
サンプルは、血清に脂質を500、1000mg/dLになるように添加し、ブランクに対するテストステロンの回収率(回収量/ブランク)を求めた。
結果を、表1に示す。
ブランクと比較して脂質が存在することによって、約10%もの正の誤差を生じた。リパーゼを添加することにより、誤差は小さくなった。脂質添加量が500mg/dLの場合には、緩衝液3へリパーゼを100U/mL以上で添加すると、ブランクに対し+5%以内の誤差、脂質添加量が1000mg/dLの場合には、緩衝液3へリパーゼを200U/mL以上で添加すると、ブランクに対し+5%以内の誤差となり、診断薬として正確に測定できると認められる値となった。
想定される高脂血症等の患者検体を考慮すると、少なくとも、緩衝液3へ添加するリパーゼの有効濃度は100U/mL以上、反応場(反応2)では33.3U/mL以上であることがわかった。更に、緩衝液3へリパーゼを1000U/mLで添加した場合には、ブランクに対し+2%以内の誤差となり、非常に高い精度で測定できることがわかった。
Figure 0005541747
≪実施例2:リパーゼ添加工程の検討≫
次に、実施例1のテストステロン測定において、いずれの工程でもリパーゼの効果が得られるか検討した。具体的には、緩衝液1、2、3にリパーゼを1000U/mLになるように添加した。ただし、反応場におけるリパーゼ濃度は、リパーゼを緩衝液1に加えた場合は、反応1では500U/mL、反応2では166.7U/mL、リパーゼを緩衝液2あるいは3に加えた場合には、反応2では333.3U/mLである。サンプルとしては、血清に脂質を0、500、1000mg/dLになるように添加し、ブランクに対するテストステロンの回収率(回収量/ブランク)を求めた。
結果を表2に示す。
緩衝液1、2、3のいずれにリパーゼを添加しても、ブランクに対し+5%以内の誤差となり、いずれの工程に添加してもリパーゼが有効であることが確認できた。
Figure 0005541747
≪実施例3:臨床検体へのリパーゼ添加効果の検討≫
次に臨床検体において、リパーゼの添加効果が認められるか検討した。具体的には、脂質(中性脂肪)濃度が500mg/dL以上の高脂血症群31名、および健常人群検体38名の血清を用いて、リパーゼ添加有無の影響を相関解析により検討した。実施例1のテストステロン測定において、緩衝液3にリパーゼを0、1000U/mLになるように添加したそれぞれの系において各検体を測定した。反応場(反応2)におけるリパーゼ濃度は0、333.3U/mLである。
結果を図1に示す。横軸はリパーゼを添加有りの場合の検体測定値を、縦軸はリパーゼを添加無の場合の検体測定値を示す。高脂血症群ではリパーゼ添加無の測定値が下がることが確認された。
以上より、リパーゼの添加によって高脂血症群の挙動が改善することが判明した。
≪実施例4:エストラジオール(E2)の免疫学的測定法へのリパーゼの添加効果の検討≫
(4−1)抗E2抗体含有緩衝液1の作製
抗E2抗体を50mmol/Lリン酸緩衝液中でビオチンBiotin−(AC5)2Sulfo−Osu( 同仁堂社)と反応させた。反応液中の抗体の濃度は1mg/mLであり、これに対し、ビオチンを10当量添加し室温で30分間反応させた。未反応のビオチンは脱塩カラム(NAP−10:GEヘルスケアサイエンス社)にて除去した。
上記で調製した抗E2抗体を0.1μg/mLとなるよう0.1mol/L Tris−HCl(pH7.0)、0.05% Tween20、1% BSA(セラケア社)にて希釈し、抗E2抗体含有緩衝液1とした。
(4−2)標識エストラジオールの作製
標識エストラジオールの作製は上記(1−2)の標識テストステロンの作製方法と同様の方法で実施した。E2−6CMO(SIGMA社)のカルボキシル基を、NHS/EDC混合液とそれぞれが35mmol/Lになるように、DMF中にて活性化させた。一方で0.1mol/Lリン酸緩衝液中にALP(アルカリフォスファターゼ)が2mg/mLになるように懸濁したものを用意した。上記でカルボキシル基を活性化させたE2−6CMOとALPをさらに終濃度0.009mmol/Lになるように混合し、ALP中のアミノ基と結合させるアミンカップリング法を行った。Superose6(GEヘルスケアサイエンス社)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーにより、未反応物の除去を行い標識エストラジオールを作製した。
(4−3)エストラジオールの測定
エストラジオールの測定は、小型自動免疫測定装置(PATHFAST;三菱化学メディエンス社製)を用いて、以下のような競合反応系で行った。詳細には、血清に脂質を添加したサンプル25μLと、抗E2抗体含有緩衝液1[0.1mol/L Tris−HCl(pH7.0)、0.05% Tween20、1% BSA(セラケア社)]25μLを37℃で8分間反応させた(反応3)。この混合溶液50μLに、更にストレプトアビジン結合磁性粒子(Dynal社)と、ゼラチンを含む緩衝液2[0.1mol/L MES(pH6)、0.6mol/L NaCl]に0.05%で懸濁された溶液50μL、及び0.05mAbsの標識エストラジオールを含む緩衝液3[0.01mol/L CH3COONa(pH5)、0.3mol/L NaCl、0.1% BSA(セラケア社)]50μLを加え、37℃で5分間反応させた(反応4)。0.01mol/L MOPS(pH7.5)、1mol/L NaCl、0.05%アジ化ナトリウム、0.05% TritonX−100で上記磁性粒子を洗浄した後、ケミルミネッセンス基質溶液[2−クロロ−5−(4−メトキシスピロ{1,2−ジオキセタン−3,2’−(5’−クロロ)−トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}−4−イル)−1−フェニルホスフェート・二ナトリウム:CDP−Star溶液]100μLを混合し、37℃で1分間反応させ、発光量をカウントした。
リパーゼは、緩衝液1に0、10、55U/mLになるように添加した。ただし、反応場におけるリパーゼ濃度は反応3では0、5.0、27.5U/mL、反応4では1.67、9.17U/mLである。
サンプルは、血清に脂質を0、500、1000mg/dLになるように添加し、ブランクに対する標識エストラジオールの回収率を求めた。
結果を、表3に示す。
リパーゼ添加無し(0)に比較して脂質が存在することによって、約10%もの正の誤差を生じた。リパーゼを添加することにより、誤差は小さくなり、緩衝液1に添加されるリパーゼ10U/mLでは、ブランクに対し±5%以内の誤差となり、診断薬として正確に測定できると認められる値となり、リパーゼの有効濃度は10U/mL以上であることがわかった(すなわち、反応場3において5U/mL以上、反応場4で1.67U/mL以上である)。更に、緩衝液1にリパーゼが55U/mLで添加されている際には、ブランクに対し±2%以内の誤差となり、非常に高い精度で測定できることがわかった。
Figure 0005541747
≪実施例5:リパーゼ添加工程の検討≫
次に、実施例4のエストラジオール測定において、いずれの工程でもリパーゼの効果が得られるか検討した。具体的には、緩衝液1あるいは2にリパーゼを55U/mLになるように添加した。反応場における濃度は、緩衝液1に添加した場合には反応3では27.5U/mL、反応4では9.17U/mL、緩衝液2に添加した場合には18.3U/mLである。サンプルとしては、血清に脂質を0、500、1000mg/dLになるように添加し、ブランクに対する標識エストラジオールの回収率(回収量/ブランク)を求めた。
結果を表4に示す。
緩衝液1及び2のいずれにリパーゼを添加しても、ブランクに対し+5%以内の誤差となり、いずれの工程に添加してもリパーゼが有効であることが確認できた。
Figure 0005541747
以上のデータより、ステロイドホルモン(テストステロン、E2)はトリグリセリドのような脂質にトラップされやすいが、リパーゼの添加により影響を回避することが可能であることがわかった。
本発明の低分子の免疫学的測定方法及び測定キットを用いることにより、検体中の非特異反応物質の影響を簡便かつ効果的に抑制し、検体中の微量成分を正確に測定することが可能となる。低分子は、臨床検体中に低濃度で存在することが多く、それが高精度に測定可能となることは、様々な疾患の診断や病態の把握、また、治療薬の薬効評価などに有用である。

Claims (8)

  1. 脂質を分解することが可能な非特異反応抑制物質を用いることを特徴とする、低分子の免疫学的測定方法。
  2. 前記低分子がハプテンである、請求項1に記載の測定方法。
  3. 前記非特異反応抑制物質がリパーゼ類である、請求項1又は2に記載の測定方法。
  4. 前記非特異反応抑制物質が、肝臓由来リパーゼ、非肝臓由来リパーゼ、リポプロテインリパーゼ、ホルモン感受性リパーゼ、及びホスホリパーゼからなる群から選んだ少なくとも1つのリパーゼである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の測定方法。
  5. 脂質を分解することが可能な非特異反応抑制物質を含有する、低分子の免疫学的測定キット。
  6. 前記低分子がハプテンである、請求項5に記載の測定キット。
  7. 前記非特異反応抑制物質がリパーゼ類である、請求項5又は6に記載の測定キット。
  8. 前記非特異反応抑制物質が、肝臓由来リパーゼ、非肝臓由来リパーゼ、リポプロテインリパーゼ、ホルモン感受性リパーゼ、及びホスホリパーゼからなる群から選んだ少なくとも1つのリパーゼである、請求項5〜7のいずれか一項に記載の測定キット。
JP2012068667A 2012-03-26 2012-03-26 低分子の免疫学的測定法及びキット Active JP5541747B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012068667A JP5541747B2 (ja) 2012-03-26 2012-03-26 低分子の免疫学的測定法及びキット

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012068667A JP5541747B2 (ja) 2012-03-26 2012-03-26 低分子の免疫学的測定法及びキット

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2013200208A JP2013200208A (ja) 2013-10-03
JP5541747B2 true JP5541747B2 (ja) 2014-07-09

Family

ID=49520564

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012068667A Active JP5541747B2 (ja) 2012-03-26 2012-03-26 低分子の免疫学的測定法及びキット

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP5541747B2 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6409016B2 (ja) * 2016-03-31 2018-10-17 積水メディカル株式会社 ラテックス免疫凝集法における測定誤差低減方法
US11668708B2 (en) 2017-09-29 2023-06-06 Sekisui Medical Co., Ltd. Method for reducing measurement error in latex agglutination immunoassay
CN108982880A (zh) * 2018-05-31 2018-12-11 湖南远璟生物技术有限公司 一种睾酮磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
JP6739481B2 (ja) * 2018-08-20 2020-08-12 積水メディカル株式会社 ラテックス免疫凝集法における測定誤差低減方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3401903B2 (ja) * 1994-03-29 2003-04-28 東ソー株式会社 ステロイド・ホルモンまたはビタミン類の測定法
JP2003322653A (ja) * 2002-05-07 2003-11-14 Toshiba Corp プローブ固定支持体及びプローブ固定担体
JP4879067B2 (ja) * 2007-03-30 2012-02-15 シスメックス株式会社 免疫測定用検体前処理液、免疫測定用試薬キット及び免疫測定方法
JP5676498B2 (ja) * 2012-01-20 2015-02-25 株式会社Lsiメディエンス 非特異反応を抑制する免疫学的測定試薬及び測定方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013200208A (ja) 2013-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20090087869A1 (en) Sandwich immunoassay and method of detecting an antigen by using the same
US10436806B2 (en) Method of measuring lipoprotein's capacity to accept cholesterol
JP5541747B2 (ja) 低分子の免疫学的測定法及びキット
JP5808808B2 (ja) 非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法及びキット
CN111175494A (zh) 一种甲状腺球蛋白抗体检测试剂盒及其使用方法
JP2023017986A (ja) 自己抗体の直接イムノアッセイ測定法
CN110514844A (zh) 一种人五聚素3磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
WO2019174104A1 (zh) 一种测定抗环瓜氨酸肽抗体的试剂盒及其应用、检测方法
US11543413B2 (en) Kit and method for quantitative detection of HBsAg
WO2019188297A1 (ja) リポタンパク質の取り込み能を測定する方法及び試薬
EP1064552B1 (en) Immunoassays using casein coating of particles
JP6578119B2 (ja) 前立腺特異抗原の測定方法及び測定キット
JP5612081B2 (ja) 切断可能な連結剤を有するコンジュゲート
AU2009247267B2 (en) Method for quantification of antigen-specific canine or human IgE
JPH03225277A (ja) 多項目の免疫化学的測定法
EP0262217A1 (en) SOLID PHASE ANALYSIS PROCEDURE.
WO2012153773A1 (ja) 可溶性lr11の免疫学的測定方法
WO2023163176A1 (ja) セリンプロテアーゼの検出用または測定用試薬
JP5701666B2 (ja) 高親和性抗ハプテンポリクローナル抗体の作製法
JP5110353B2 (ja) 新規な酸化ldl複合体及びその検知方法
JP4585708B2 (ja) 複合体を形成する物質の測定方法及び測定試薬
JP2021099243A (ja) 免疫学的測定法
JP2002196000A (ja) 類縁体に起因する非特異反応を抑制した新規測定法
JPH02266263A (ja) 免疫測定法および免疫測定用具
JPH01232263A (ja) トリヨードサイロニン摂取率免疫測定法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20131107

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20140313

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20140401

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20140430

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5541747

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250