JP5701666B2 - 高親和性抗ハプテンポリクローナル抗体の作製法 - Google Patents
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Description
本発明はこの知見に基づいて成し遂げられたものである。
[1]動物(但し、ヒトを除く)にハプテンを免疫して産生されたポリクローナル抗体から、前記ハプテンの類似構造体に結合するポリクローナル抗体を除去する、高親和性抗ハプテンポリクローナル抗体の製造方法であって、前記の動物(但し、ヒトを除く)にハプテンを免疫して産生されたポリクローナル抗体と、前記ハプテンの類似構造体を担持させた不溶性担体とを接触させ、B/F分離を行うことによって高親和性抗ハプテンポリクローナル抗体を取得する、前記製造方法。
[2]動物(但し、ヒトを除く)にハプテンを免疫して産生されたイムノグロブリン画分を、前記ハプテンの類似構造体を固定したカラムに反応させ、前記カラムに結合しない画分を収集する、[1]の製造方法。
[3]前記ハプテンがエストラジオールである、[1]又は[2]の製造方法。
[4]前記ハプテンの類似構造体がエストリオール又はテストステロンである、[3]の製造方法。
また、本明細書では、以下のものを開示する。
[1]動物にハプテンを免疫して産生されたポリクローナル抗体から、前記ハプテンの類似構造体に結合するポリクローナル抗体を除去することを特徴とする、高親和性抗ハプテンポリクローナル抗体の製造方法。
[2]動物にハプテンを免疫して産生されたポリクローナル抗体と、前記ハプテンの類似構造体を担持させた不溶性担体とを接触させ、B/F分離を行うことによって高親和性抗ハプテンポリクローナル抗体を取得する、[1]の製造方法。
[3]動物にハプテンを免疫して産生されたイムノグロブリン画分を、前記ハプテンの類似構造体を固定したカラムに反応させ、前記カラムに結合しない画分を収集する、[1]又は[2]の製造方法。
[4]前記ハプテンがエストラジオールである、[1]〜[3]のいずれかの製造方法。
[5]前記ハプテンの類似構造体がエストリオール又はテストステロンである、[4]の製造方法。
本発明の製造方法は、免疫原と異なる抗原であり、その構造が免疫原と近接した類似構造体(アナログ体)を固定化した不溶性担体、特には不溶性担体カラムを作製し、公知の方法に従って作製されたポリクローナル抗体を、前記アナログ体を固定した不溶性担体と接触(カラムの場合にはアプライ)した後、不溶性担体に結合しなかった画分を取得することで高親和性の抗ハプテンポリクローナル抗体を作製する。
また、調製されたイムノグロブリン画分などを、本発明の製造方法に使用しても良いし、保存後、あるいは、市販品を購入して、それらの親和性を向上させるために、本発明の製造方法を実施しても良い。
本発明に使用可能なポリクローナル抗体を産生する動物としては、特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ラット、ブタなどが挙げられる。
エストラジオールに対するポリクローナル抗体を取得するために、β-Estradiol 6-(O-carboxymethyl)oxime:BSA(シグマ社)100μgを含む溶液を、同容量のフロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバントを等量ずつ混合したものを抗原として、ウサギ皮下へ2週間間隔で7回投与した。血清中に抗体が産生していることを確認後、さらに10μgの抗原を脈内に投与し、5日後に抗血清を取得した。さらに硫安沈殿操作後、プロテインAカラムを使用した精製操作により、抗エストラジオール抗体を取得した。
(1)E3−BSAの作製方法
E3(Estriol 3-carboxymethylether)(シグマ社)のカルボキシル基を、NHS(N-hydroxysuccinimide)/EDC[1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride]混合液とそれぞれが35mmol/Lになるように、DMF(N,N-ジメチルホルムアミド)中により活性化させた。一方で0.1mol/Lリン酸緩衝液中にBSA(Bovine serum albumin)が4mg/mLになるように懸濁したものを用意した。上記でカルボキシル基を活性化させたE3と、BSAをさらに終濃度0.06mmol/Lになるように混合し、BSA中のアミノ基と結合させるアミンカップリング法を行った。superdex200(GEヘルスケアサイエンス社)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーにより、未反応物の除去を行い、E3−BSAを作製した。
固定化用カラムとしてHitrap NHS-activated(GEヘルスケアサイエンス社)1mLを使用した。E3−BSAをカップリング用緩衝液(100mmol/L NaHCO3, 0.5mol/L NaCl, pH8.3)に終濃度3mg/mLに懸濁し、固定化用カラムにアプライした。室温で30分間静置させた後に、カラム6容積分のブロッキング用緩衝液(200mmol/L Glycine, 0.5mol/L NaCl, pH8.3)をロードした。さらにカラム6容積分の洗浄用緩衝液(100mmol/L CH3COONa, 0.5mol/L NaCl, pH4.0)をロードした後に、カラム6容積分のブロッキング用緩衝液をロードし、室温で30分間静置させ未反応のNHS活性化カルボキシル基をグリシンによりブロッキングした。その後、カラム6容積分の洗浄用緩衝液をロードした後に、カラム6容積分のブロッキング用緩衝液をロードし、最後にカラム6容積分の洗浄用緩衝液をロードすることにより、未反応物及び非特異吸着成分を除去することによってE3−BSA固定化カラムを作製した。
PBS(ダルベッコPBS(-))に実施例1で作製した抗エストラジオール抗体を24mg/mLになるように溶解させた。この溶液をカラム容量の1/4である250μL分、E3−BSA固定化カラムにアプライし、室温で30分間静置させた。その後、PBSをカラム容量の2倍添加し、押し出された画分を高親和性抗エストラジオール抗体とした。
(1)ビオチン化抗体の作製
上記で調製した高親和性抗エストラジオール抗体を50mmol/Lリン酸緩衝液中でビオチン(Biotin-(AC5)2Sulfo-Osu, 同仁堂社)と反応させた。反応液中の抗体の濃度は1mg/mLであり、これに対し、ビオチンを10当量添加し室温で30分間反応させた。未反応のビオチンは脱塩カラム(NAP-10 GE ヘルスケアサイエンス社)にて除去した。
標識エストラジオールの作製は上記、E3−BSAの作製方法と同様の方法で実施した。E2−6CMO(SIGMA社)のカルボキシル基を、NHS/EDC混合液とそれぞれが35mmol/Lになるように、DMF中により活性化させた。一方で0.1mol/Lリン酸緩衝液中にALP(アルカリフォスファターゼ)が2mg/mLになるように懸濁したものを用意した。上記でカルボキシル基を活性化させたE2−6CMOとALPをさらに終濃度0.009mmol/Lになるように混合し、ALP中のアミノ基と結合させるアミンカップリング法を行った。superdex200(GEヘルスケアサイエンス社)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーにより、未反応物の除去を行い標識エストラジオールを作製した。
小型自動免疫測定装置(PATHFAST;三菱化学メディエンス社製)を用いて測定を行った。詳細には、エストラジオール添加サンプル25μLと、ビオチン化抗エストラジオール抗体を0.1μg/mLを含む緩衝液[0.1mol/L MES (pH6), 0.05% Tween20, 0.5% BSA(シグマ社)]25μLを37℃で8分間反応させた。この混合溶液50μLに更にストレプトアビジン結合磁性粒子(Dynal社)がゼラチンを含む緩衝液[0.1mol/L MES (pH6), 0.6mol/L NaCl]に0.05%懸濁された溶液50μL及び標識エストラジオール0.05mAbsを含む緩衝液[0.01mol/L MES (pH5), 0.3mol/L NaCl, 0.1% BSA(シグマ社)]50μLを加え、37℃で5分間反応させた。0.01mol/L MOPS(pH7.5)、1mol/L NaCl、0.05%アジ化ナトリウム、0.05% TritonX−100で磁性粒子を洗浄した後、ケミルミネッセンス基質溶液[2−クロロ−5−(4−メトキシスピロ{1,2−ジオキセタン−3,2’−(5’−クロロ)−トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}−4−イル)−1−フェニルホスフェート・二ナトリウム:CDP−Star溶液]100μLを混合し、37℃で1分間反応させ、発光量をカウントした。
実施例3に示されるような高親和性抗エストラジオール抗体の作製処理を施さない(E3−BSA固定化カラムにアプライしない)抗エストラジオール抗体を使用して、前記実施例4、5に示される同様のエストラジオール測定試薬を作製した。この測定系を使用し、元来ポリクローナル抗体に存在する交差反応性を定量した。サンプルは活性炭処理が施され、血清中に含有されるステロイドが除去されたHuman serum double charcoal stripped(Golden West Biologicals, Inc.)を使用し、これにエストラジオール類似構造体である各種ステロイドを添加したものを使用した。本系において得られた標準曲線を使用し、類似構造体の本系における免疫活性から見積もられる量を算出した。ここにおいてサンプル中に実際に添加された類似構造体の量と免疫活性から得られる量の比率より、類似構造体の本系における交差反応性を算出した(表1)。
交差反応性と本製造法での親和性向上効果の関連性を評価するため、実施例6に示された交差反応性を示したテストステロンでの本態様での比較検証を行った。実施例2、3と同様の手法においてTestosterone 3-(O-carboxymethyl)oxime(シグマ社)を固定化させたカラムを使用し、実施例1で作製した抗エストラジオール抗体に処理を施した。未処理抗体、テストステロン固定化カラム、エストリオール固定化カラム各々において処理した3種類の抗体を使用した実施例5に示される測定系でエストラジオールに対する反応性を比較評価した。結果を表2に示す。
これらの結果から類似構造体のバリエーションを幾つか用意することにより、その親和性の調節が可能となり厳密さが要求される製造原料の抗体規格水準を常に満たすであろう製造法を確立することができると推定される。
Claims (4)
- 動物(但し、ヒトを除く)にハプテンを免疫して産生されたポリクローナル抗体から、前記ハプテンの類似構造体に結合するポリクローナル抗体を除去する、高親和性抗ハプテンポリクローナル抗体の製造方法であって、前記の動物(但し、ヒトを除く)にハプテンを免疫して産生されたポリクローナル抗体と、前記ハプテンの類似構造体を担持させた不溶性担体とを接触させ、B/F分離を行うことによって高親和性抗ハプテンポリクローナル抗体を取得する、前記製造方法。
- 動物(但し、ヒトを除く)にハプテンを免疫して産生されたイムノグロブリン画分を、前記ハプテンの類似構造体を固定したカラムに反応させ、前記カラムに結合しない画分を収集する、請求項1に記載の製造方法。
- 前記ハプテンがエストラジオールである、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記ハプテンの類似構造体がエストリオール又はテストステロンである、請求項3に記載の製造方法。
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