CN111714930A - 一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质及方法 - Google Patents

一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111714930A
CN111714930A CN202010412846.1A CN202010412846A CN111714930A CN 111714930 A CN111714930 A CN 111714930A CN 202010412846 A CN202010412846 A CN 202010412846A CN 111714930 A CN111714930 A CN 111714930A
Authority
CN
China
Prior art keywords
circulating tumor
separation medium
tumor cells
antibody
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010412846.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111714930B (zh
Inventor
辛文秀
方琦璐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Cancer Hospital
Original Assignee
Zhejiang Cancer Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Cancer Hospital filed Critical Zhejiang Cancer Hospital
Priority to CN202010412846.1A priority Critical patent/CN111714930B/zh
Publication of CN111714930A publication Critical patent/CN111714930A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111714930B publication Critical patent/CN111714930B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N2001/4038—Concentrating samples electric methods, e.g. electromigration, electrophoresis, ionisation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质及方法。所述分离介质的制备方法包括以下步骤：(1)取具有三维框架结构的多孔材料作为基体；(2)在所述基体表面沉积一层用于增加基体表面粗糙度的功能层；(3)在功能层表面负载用于将抗循环肿瘤细胞特异性抗原的抗体结合到基体上的结合层。本发明用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质制备简单，成本低廉，但分离效率高。利用本发明分离介质从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的方法具有成本低廉，方法简单，可控性强，应用前景较强。

Description

一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质及 方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质及方法。
背景技术
恶性肿瘤的复发和转移是影响肿瘤预后和导致患者死亡的重要原因。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是从原发及继发肿瘤病灶脱落进入外周血的肿瘤细胞。近年来研究表明，CTC作为一种新型的实时监测非侵入性诊断工具，可有效应用于肿瘤的早期诊断及监测复发和转移，监测疾病进展，评估化疗药物疗效和预测肿瘤预后等方面，并且在肿瘤的分类治疗、个体化治疗时代，CTC的准确捕获与检测可为癌症患者提供最及时、最优化的治疗方案。相比传统的影像学检查及组织活检，CTC检测具有实时动态监测疾病变化、疗效评价等优势。
CTC在外周血中的含量非常少，每10ml血液中含有约1亿个白细胞和500亿个红细胞，而CTC仅含少数几个或几十个，因此，在进行检测和生物学分析之前，应首先对待检测样品中的CTC进行有效的富集与分离。目前，伴随现在检测技术的广泛应用，以及对肿瘤转移机制的深入研究，CTC逐渐被人们所重视，人们研制并开发了多种用于循环肿瘤细胞的富集、检测及分子生物学表征等技术。现有富集CTC的方法主要有三种：密度梯度离心法、过滤法和免疫磁珠分离法。密度梯度离心法和过滤法是根据血液中各种细胞密度或尺寸不同的原理进行分离，分离纯度低，且密度梯度离心法在细胞的处理过程中会不可避免的损失肿瘤细胞，影响捕获效率。免疫磁珠分离法虽能捕获效率较高，但其制作过程复杂、费用较高限制了其广泛应用。
近年来，三维纳米结构材料在CTC的捕获方面引起了科学家的关注。王树涛等(Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48,8970-8970)首次将三维纳米结构基片应用于CTC放入检测。之后，导电聚合物(Adv.Mater.2011,23,4788-4792)、TiO2纳米材料(Adv.Mater.2012,24,2756-2760)等构建的三维纳米结构均用于循环肿瘤细胞的捕获方面。这些方法捕获效率高、灵敏度高，但是存在成本较高、使用不便等缺陷。因此，迫切需求一种新型的价廉、高效和高特异性的CTC捕获技术和检测方法。
公开号为CN103589629A的中国发明专利公开了一种循环肿瘤细胞分离系统，包括样品准备模块、进样模块、第一微流控芯片、释放模块和收集模块，所述样品准备模块用于将血液处理为检测样品，所述进样模块用于将检测样品注入第一微流控芯片，所述第一微流控芯片用于提取检测样品中的循环肿瘤细胞，所述释放模块用于使循环肿瘤细胞脱离第一微流控芯片获得采集样品，所述收集模块用于收集采集样品。
公开号为CN105771015A的中国发明专利公开了一种用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料及其制备方法，该材料由多孔石墨烯、硅微球、硅基底三种材料组成，以静电吸附自组装而成三维阵列结构，经过对石墨烯和硅微球表面进行化学改性，分别修饰固定用于细胞捕获的E-selectin蛋白分子和配体，实现了强化细胞识别的仿生结构；该材料可集成于微流控芯片中，增强芯片对循环肿瘤细胞的识别和捕获，提高分离效率并有利于对捕获细胞的检测分析；改变固定的识别配体，也可用于对不同类型细胞的有效捕获，可从外周血样中识别并捕获稀有的肿瘤细胞。
以上专利中所采用的方法都需要将捕获材料集成到微流控芯片中，微流控芯片的制造效率非常低并且成本很高。另外，由于微流控芯片上的孔道数量通道通常只有几条，因此样品的分离效率很低。本专利所采用的泡沫材料基体为三维结构，内部存在大量的孔道并且孔道间的孔径可控，相应的与样品接触的有效面积远大于微流控芯片。另外泡沫材料的制造成本远低于微流控芯片，具有更好的应用前景。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质及方法。
一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质，所述分离介质的制备方法包括以下步骤：
(1)取具有三维框架结构的多孔材料作为基体；
(2)在所述基体表面沉积一层用于增加基体表面粗糙度的功能层；
(3)在功能层表面负载用于将抗循环肿瘤细胞特异性抗原的抗体结合到基体上的结合层。
优选的，所述结合层通过氢键、静电吸附或功能蛋白质共价结合方式将抗循环肿瘤细胞特异性抗原的抗体结合到基体上。
更优选的，步骤(3)中，先在功能层表面沉积明胶与生物素的混合层；再使用链霉亲和素或者亲和素与所述混合层中的生物素结合；最后将偶联有生物素的抗循环肿瘤细胞特异性抗原的抗体与所述链霉亲和素结合。其中，所述抗体为抗EGFR抗体、抗MUC-1抗体、抗EGFR-2抗体、抗EpCAM抗体、抗HER2抗体中的至少一种。所述混合层中明胶与生物素的质量比为0.02～0.16∶1；所述基体表面除去偶联抗体之外的其余各层总厚度为3nm～100nm。
优选的，所述多孔材料为泡沫铜、泡沫镍、泡沫铁镍或泡沫铝。
优选的，所述多孔材料的孔径大小为5ppi～50ppi。
优选的，所述功能层为包含元素铜、金或银的金属单质、合金、金属氧化物或金属氢氧化物。
本发明又提供了一种非医学诊断为目的的从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：
(a)使用所述的分离介质作为过滤介质对血样进行过滤，用于吸附循环肿瘤细胞；
(b)将吸附的循环肿瘤细胞释放；
(c)分离并收集释放后的循环肿瘤细胞。
优选的，所述电解池使用的电解液为PBS磷酸缓冲盐溶液或者生理盐水。
将吸附的循环肿瘤细胞释放时，可以通过断开基体与功能层，或者通过断开功能层与结合层之间的连接。断开方法可以用电化学阳极氧化法、电化学阴极还原法或电化学催化法等。比如，可以将吸附循环肿瘤细胞的分离介质作为电解池的电极，通过电解将分离介质中的金属层溶解，释放出吸附在分离介质上的循环肿瘤细胞。
本发明方法为从血样中富集和分离肿瘤细胞，该技术手段可以用于将得到的肿瘤细胞检测后诊断血样来源生物体的健康状况，但除了这种涉及疾病诊断的用途之外，还有其他用途，比如，在富集和分离到肿瘤细胞后，可以用于科学研究、或用于开发药物等多种非疾病诊断方面的应用。
本发明用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质制备简单，成本低廉，但分离效率高。利用本发明分离介质从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的方法具有成本低廉，方法简单，可控性强，应用前景较强。
附图说明
图1为实施例1中在泡沫铜表面沉积得到的一维铜纳米线的扫描电镜图。
图2为实施例2中沉积纳米片后的泡沫镍的扫描电镜图。
图3为实施例3中在泡沫铜表面沉积一层氧化铜纳米线后的扫描电镜图。
图4为实施例4中在泡沫铜表面沉积一层铜纳米线后的扫描电镜图。
具体实施方式
实施例1
取一片直径为20mm，厚度为5mm，孔径为20ppi的泡沫铜(购自昆山隆圣宝电子材料有限公司)，用稀盐酸清洗表面氧化膜后，氮气烘干备用。取4g硫酸铜，以硫酸铜与抗坏血酸，按照1∶3的质量比与100mL去离子水配制的混合溶液为反应物，将制备好的泡沫铜置于混合溶液中，密封后150℃加热5h，在泡沫铜表面沉积得到一层金属铜纳米线，扫描电镜检测结果如图1所示，将沉积纳米线后的泡沫铜用蒸馏水清洗并氮气烘干备用。
取质量浓度为4％的明胶溶液(Sigma Aldrich)与水溶性生物素按照4∶1的质量比配制溶液，溶液pH调节为7.2，室温混合10小时。将配制好的明胶生物素混合溶液稀释至1％。将沉积铜纳米线的泡沫铜加入稀释后的溶液静置5分钟后取出并室温干燥30分钟，然后向其表面滴加10微升浓度为100微克/毫升的链霉亲和素溶液并静置5分钟后室温干燥30分钟，重复该步骤三次。采用表面轮廓仪探测到的沉积厚度为3纳米。将链接生物素的抗EpCAM抗体(Acro Biosystems)配制为20微克/毫升的溶液，向制备好的基体表面滴加50微升的该溶液并在37℃保持1小时，用PBS溶液清洗三次后备用。
将负载EpCAM抗体的泡沫铜封入液体柱形过滤器中。利用注射器取2毫升浓度为500个/毫升的MCF-7细胞的PBS悬浮液，以0.1mL/min的速度利用微量注射泵将血样由过滤器一端注入，并在另外一端收集，整个过程的环境温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。待收集结束后，将过滤器打开并取出泡沫铜基体，用PBS磷酸缓冲盐溶液冲洗表面后，将样本置于PBS磷酸缓冲盐溶液中，以负载样本的泡沫铜基体为工作电极，以石墨为对电极，对电池施加1.5V的电压。5h后，将电解液离心清洗并分离，利用吖啶橙对细胞进行染色10分钟，利用PBS清洗后，采用荧光倒置显微镜观察循环肿瘤细胞的捕获情况并计数。通过捕获数除以样品细胞总数计算捕获率，最终得到循环肿瘤细胞的捕获率可达到95％以上。
实施例2
取一片直径为20mm，厚度为5mm，孔径为5ppi的泡沫镍(昆山隆圣宝电子材料有限公司)，用稀盐酸清洗表面氧化膜后，氮气烘干备用。在泡沫镍表面以金属银为靶材，利用机械泵和扩散泵抽气获得10-3Pa左右的高真空，在150A的蒸发电流下蒸镀40s，沉积得到20nm左右片状结构的金属银镀层，扫描电镜检测结果如图2所示，将沉积纳米片后的泡沫镍用蒸馏水清洗并氮气烘干备用。
取质量浓度为5％的明胶溶液(Sigma Aldrich)与水溶性生物素按照2∶1的质量比配制溶液，溶液pH调节为7.2，室温混合10小时。将配制好的明胶生物素混合溶液稀释至0.5％。将沉积铜纳米线的泡沫铜加入稀释后的溶液静置5分钟后取出并室温干燥30分钟，然后向其表面滴加10微升浓度为100微克/毫升的链霉亲和素溶液并静置5分钟后室温干燥30分钟，重复该步骤五次。采用表面轮廓仪探测到的沉积厚度为9纳米。将链接生物素的抗EGFR抗体(Acro Biosystems)配制为10微克/毫升的溶液，向制备好的基体表面滴加100微升的该溶液并在37℃保持1小时，用PBS溶液清洗三次后备用。
将负载EGFR抗体的泡沫铜封入液体柱形过滤器中。利用注射器取1毫升浓度为2000个/毫升的MDA-MD-231细胞的PBS悬浮液。以0.2毫升/分的速度利用微量注射泵将血样由过滤器一端注入，并在另外一端收集，整个过程的环境温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。待收集结束后，将过滤器打开并取出泡沫铜基体，用PBS磷酸缓冲盐溶液冲洗表面后，将样本置于PBS磷酸缓冲盐溶液中，以负载样本的泡沫基体为工作电极，以石墨为对电极，对电池施加1.5V的电压。5小时后，将电解液离心清洗并分离，利用吖啶橙对细胞进行染色10分钟，利用PBS清洗后，采用荧光倒置显微镜观察循环肿瘤细胞的捕获情况并计数。通过捕获数除以样品细胞总数计算捕获率，最终得到循环肿瘤细胞的捕获率可达到95％以上。
实施例3
取一片直径为20mm，厚度为5mm，孔径为50ppi的泡沫铜(昆山隆圣宝电子材料有限公司)，用稀盐酸清洗表面氧化膜后，氮气烘干备用。将清洗好的泡沫铜置于石英舟中，放入管式炉中在氧气气氛下500℃加热3小时，在泡沫铜表面可以得到一层氧化铜纳米线，扫描电镜检测结果如图3所示(方法参考Y.Wu et al.,Materials Letters 211(2018)247–249)。
取质量浓度为4％的明胶溶液(Sigma Aldrich)与水溶性生物素按照0.5∶1的质量比配制溶液，溶液pH调节为7.2，室温混合10小时。将配制好的明胶生物素混合溶液稀释至1％。向沉积铜纳米线的泡沫铜滴加500微升的溶液静置5分钟后室温干燥30分钟，然后向其表面滴加50微升浓度为200微克/毫升的链霉亲和素溶液并静置5分钟后室温干燥30分钟，重复该步骤10次。采用表面轮廓仪探测到的沉积厚度为100纳米。将链接生物素的抗MUC-1抗体(Acro Biosystems)配制为15微克/毫升的溶液，向制备好的基体表面滴加50微升的该溶液并在37℃保持1小时，用PBS溶液清洗三次后备用。
将负载抗MUC-1抗体的泡沫铜封入液体柱形过滤器中。利用注射器取2毫升浓度为500个/毫升的MCF-7细胞的PBS悬浮液，以0.1毫升/分的速度利用微量注射泵将血样由过滤器一端注入，并在另外一端收集，整个过程的环境温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。待收集结束后，将过滤器打开并取出泡沫铜基体，用PBS磷酸缓冲盐溶液冲洗表面后，将样本置于PBS磷酸缓冲盐溶液中，以负载样本的泡沫铜基体为工作电极，以石墨为对电极，对电池施加1.5V的电压。5h后，将电解液离心清洗并分离，利用吖啶橙对细胞进行染色10分钟，利用PBS清洗后，采用荧光倒置显微镜观察循环肿瘤细胞的捕获情况并计数。通过捕获数除以样品细胞总数计算捕获率，最终得到循环肿瘤细胞的捕获率可达到95％以上。
实施例4
取一片直径为20mm，厚度为5mm，孔径为50ppi的泡沫铜(昆山隆圣宝电子材料有限公司)，用稀盐酸清洗表面氧化膜后，氮气烘干备用。将清洗好的泡沫铜置于石英舟中，放入管式炉中在氧气气氛下600℃加热10小时，在泡沫铜表面可以得到一层氧化铜纳米线，以该泡沫铜为阴极，以石墨为阳极，0.1M的KOH溶液为电解质，采用-1.4V(对可逆氢电极电位)的电位进行电解还原，直至还原电流接近于0A并稳定后取下，即在泡沫铜表面可得到一层铜纳米线，扫描电镜检测结果如图4所示。
取浓度为4％的明胶溶液(Sigma Aldrich)与水溶性生物素按照0.5∶1的质量比配制溶液，溶液pH调节为7.2，室温混合10小时。将配制好的明胶生物素混合溶液稀释至1％。将沉积铜纳米线的泡沫铜加入稀释后的明胶溶液静置5分钟后室温干燥30分钟，然后向其表面滴加10微升浓度为100微克/毫升的链霉亲和素溶液并静置5分钟后室温干燥30分钟，重复该步骤5次。采用表面轮廓仪探测到的沉积厚度为8纳米。将链接生物素的抗EpCAM抗体(Acro Biosystems)配制为20微克/毫升的溶液，向制备好的基体表面滴加50微升的该溶液并在37℃保持1小时，用PBS溶液清洗三次后备用。
将负载EpCAM抗体的泡沫铜封入液体柱形过滤器中。利用注射器取2毫升浓度为500个/毫升的MCF-7细胞的PBS悬浮液，以0.1毫升/分的速度利用微量注射泵将血样由过滤器一端注入，并在另外一端收集，整个过程的环境温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。待收集结束后，将过滤器打开并取出泡沫铜基体，用PBS磷酸缓冲盐溶液冲洗表面后，将样本置于PBS磷酸缓冲盐溶液中，以负载样本的泡沫铜基体为工作电极，以石墨为对电极，对电池施加1.5V的电压。5h后，将电解液离心清洗并分离，利用吖啶橙对细胞进行染色10分钟，利用PBS清洗后，采用荧光倒置显微镜观察循环肿瘤细胞的捕获情况并计数。通过捕获数除以样品细胞总数计算捕获率，最终得到循环肿瘤细胞的捕获率可达到95％以上。
实施例5
取一片直径为20mm，厚度为5mm，孔径为20ppi的泡沫铜(昆山隆圣宝电子材料有限公司)，用稀盐酸清洗表面氧化膜后，氮气烘干备用。取60mmol氢氧化钠，8mmol过硫酸铵溶于40mL的去离子水中形成均匀溶液，将泡沫铜加入到该溶液中室温反应40分钟，在泡沫铜表面可以得到一层氢氧化铜纳米线。
取浓度为4％的明胶溶液(Sigma Aldrich)与水溶性生物素按照0.5∶1的质量比配制溶液，溶液pH调节为7.2，室温混合10小时。将配制好的明胶生物素混合溶液稀释至1％。将沉积氢氧化铜纳米线的泡沫铜加入稀释后的明胶溶液静置5分钟后室温干燥30分钟，然后向其表面滴加20微升浓度为100微克/毫升的链霉亲和素溶液并静置5分钟后室温干燥30分钟，重复该步骤5次。采用表面轮廓仪探测到的沉积厚度为20纳米。将链接生物素的抗EpCAM抗体(Acro Biosystems)配制为20微克/毫升的溶液，向制备好的基体表面滴加50微升的该溶液并在37℃保持1小时，用PBS溶液清洗三次后备用。
将负载EpCAM抗体的泡沫铜封入液体柱形过滤器中。利用注射器取2毫升浓度为500个/毫升的MCF-7细胞的PBS悬浮液，以0.1毫升/分的速度利用微量注射泵将血样由过滤器一端注入，并在另外一端收集，整个过程的环境温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。待收集结束后，将过滤器打开并取出泡沫铜基体，用PBS磷酸缓冲盐溶液冲洗表面后，将样本置于PBS磷酸缓冲盐溶液中，以负载样本的泡沫铜基体为工作电极，以石墨为对电极，对电池施加1.5V的电压。5h后，将电解液离心清洗并分离，利用吖啶橙对细胞进行染色10分钟，利用PBS清洗后，采用荧光倒置显微镜观察循环肿瘤细胞的捕获情况并计数。通过捕获数除以样品细胞总数计算捕获率，最终得到循环肿瘤细胞的捕获率可达到95％以上。
实施例6
取一片直径为20mm，厚度为5mm，孔径为50ppi的泡沫铁镍(昆山隆圣宝电子材料有限公司)，用稀盐酸清洗表面氧化膜后，氮气烘干备用。在泡沫铁镍表面以金属银为靶材，利用机械泵和扩散泵抽气获得10-3Pa左右的高真空，在150A的蒸发电流下蒸镀40s，沉积得到20nm左右片状结构的金属银镀层，将沉积纳米片后的泡沫铁镍用蒸馏水清洗并氮气烘干备用。
取质量浓度为5％的明胶溶液(Sigma Aldrich)与水溶性生物素按照2∶1的质量比配制溶液，溶液pH调节为7.2，室温混合10小时。将配制好的明胶生物素混合溶液稀释至0.5％。将沉积纳米片后的泡沫铁镍加入稀释后的溶液静置5分钟后取出并室温干燥30分钟，然后向其表面滴加50微升浓度为100微克/毫升的链霉亲和素溶液并静置5分钟后室温干燥30分钟，重复该步骤十次。采用表面轮廓仪探测到的沉积厚度为50纳米。将链接生物素的抗EGFR抗体(Acro Biosystems)配制为10微克/毫升的溶液，向制备好的基体表面滴加100微升的该溶液并在37℃保持1小时，用PBS溶液清洗三次后备用。
将负载EGFR抗体的泡沫铁镍封入液体柱形过滤器中。利用注射器取1毫升浓度为2000个/毫升的MDA-MD-231细胞的PBS悬浮液。以0.2毫升/分的速度利用微量注射泵将血样由过滤器一端注入，并在另外一端收集，整个过程的环境温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。待收集结束后，将过滤器打开并取出泡沫基体，用PBS磷酸缓冲盐溶液冲洗表面后，将样本置于PBS磷酸缓冲盐溶液中，以负载样本的泡沫基体为工作电极，以石墨为对电极，对电池施加1.5V的电压。5小时后，将电解液离心清洗并分离，利用吖啶橙对细胞进行染色10分钟，利用PBS清洗后，采用荧光倒置显微镜观察循环肿瘤细胞的捕获情况并计数。通过捕获数除以样品细胞总数计算捕获率，最终得到循环肿瘤细胞的捕获率可达到95％以上。
实施例7
取一片直径为20mm，厚度为5mm，孔径为5ppi的泡沫铝(昆山隆圣宝电子材料有限公司)，用稀盐酸清洗表面氧化膜后，氮气烘干备用。在泡沫铝表面以金属银为靶材，利用机械泵和扩散泵抽气获得10-3Pa左右的高真空，在150A的蒸发电流下蒸镀60s，沉积得到30nm左右片状结构的金属银镀层，将沉积纳米片后的泡沫铝用蒸馏水清洗并氮气烘干备用。
取质量浓度为5％的明胶溶液(Sigma Aldrich)与水溶性生物素按照2∶1的质量比配制溶液，溶液pH调节为7.2，室温混合10小时。将配制好的明胶生物素混合溶液稀释至0.5％。将沉积纳米片后的泡沫铝加入稀释后的溶液静置5分钟后取出并室温干燥30分钟，然后向其表面滴加10微升浓度为100微克/毫升的链霉亲和素溶液并静置5分钟后室温干燥30分钟，重复该步骤十五次。采用表面轮廓仪探测到的沉积厚度为40纳米。将链接生物素的抗EGFR抗体(Acro Biosystems)配制为10微克/毫升的溶液，向制备好的基体表面滴加100微升的该溶液并在37℃保持1小时，用PBS溶液清洗三次后备用。
将负载EGFR抗体的泡沫铝封入液体柱形过滤器中。利用注射器取1毫升浓度为2000个/毫升的MDA-MD-231细胞的PBS悬浮液。以0.2毫升/分的速度利用微量注射泵将血样由过滤器一端注入，并在另外一端收集，整个过程的环境温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。待收集结束后，将过滤器打开并取出泡沫铝基体，用PBS磷酸缓冲盐溶液冲洗表面后，将样本置于PBS磷酸缓冲盐溶液中，以负载样本的泡沫基体为工作电极，以石墨为对电极，对电池施加1.5V的电压。5小时后，将电解液离心清洗并分离，利用吖啶橙对细胞进行染色10分钟，利用PBS清洗后，采用荧光倒置显微镜观察循环肿瘤细胞的捕获情况并计数。通过捕获数除以样品细胞总数计算捕获率，最终得到循环肿瘤细胞的捕获率可达到95％以上。

Claims (10)

1.一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质，其特征在于，所述分离介质的制备方法包括以下步骤：
(1)取具有三维框架结构的多孔材料作为基体；
(2)在所述基体表面沉积一层用于增加基体表面粗糙度的功能层；
(3)在功能层表面负载用于将抗循环肿瘤细胞特异性抗原的抗体结合到基体上的结合层。
2.如权利要求1所述的分离介质，其特征在于，所述结合层通过氢键、静电吸附或功能蛋白质共价结合方式将抗循环肿瘤细胞特异性抗原的抗体结合到基体上。
3.如权利要求2所述的分离介质，其特征在于，步骤(3)中，先在功能层表面沉积明胶与生物素的混合层；再使用链霉亲和素或者亲和素与所述混合层中的生物素结合；最后将偶联有生物素的抗循环肿瘤细胞特异性抗原的抗体与所述链霉亲和素结合。
4.如权利要求3所述的分离介质，其特征在于，所述抗体为抗EGFR抗体、抗MUC-1抗体、抗EGFR-2抗体、抗EpCAM抗体、抗HER2抗体中的至少一种。
5.如权利要求3所述的分离介质，其特征在于，所述混合层中明胶与生物素的质量比为0.02～0.16∶1；所述基体表面除去偶联抗体之外的其余各层总厚度为3nm～100nm。
6.如权利要求1所述的分离介质，其特征在于，所述多孔材料为泡沫铜、泡沫镍、泡沫铁镍或泡沫铝。
7.如权利要求1所述的分离介质，其特征在于，所述多孔材料的孔径大小为5ppi～50ppi。
8.如权利要求1所述的分离介质，其特征在于，所述功能层为包含元素铜、金或银的金属单质、合金、金属氧化物或金属氢氧化物。
9.一种非医学诊断为目的的从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)使用如权利要求1～8任一所述的分离介质作为过滤介质对血样进行过滤，用于吸附循环肿瘤细胞；
(b)将吸附的循环肿瘤细胞释放；
(c)分离并收集释放后的循环肿瘤细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述电解池使用的电解液为PBS磷酸缓冲盐溶液或者生理盐水。
CN202010412846.1A 2020-05-15 2020-05-15 一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质及方法 Active CN111714930B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010412846.1A CN111714930B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010412846.1A CN111714930B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111714930A true CN111714930A (zh) 2020-09-29
CN111714930B CN111714930B (zh) 2022-01-04

Family

ID=72564487

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010412846.1A Active CN111714930B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111714930B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112501122A (zh) * 2020-12-09 2021-03-16 河南大学 一种肿瘤细胞的分离提取方法
CN112844342A (zh) * 2021-01-20 2021-05-28 季华实验室 一种用于富集循环肿瘤细胞的功能化基底及其制备方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103275934A (zh) * 2013-06-05 2013-09-04 南昌大学 微量循环肿瘤细胞的分离方法
US20150050669A1 (en) * 2010-03-05 2015-02-19 Samsung Electronics Co., Ltd. Method and kit for isolating target cell
US20150212095A1 (en) * 2012-03-31 2015-07-30 Nvigen, Inc. Magnetic nanocompositions for highly sensitive molecular and cellular enrichment, purification and detection
CN108529555A (zh) * 2018-05-10 2018-09-14 吉林大学 一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面、制备方法及其应用
CN108753569A (zh) * 2018-05-25 2018-11-06 苏州博福生物医药科技有限公司 一种用于捕获细胞或生物分子的富集筛选机构
CN108780090A (zh) * 2015-12-02 2018-11-09 利摩日大学 分离癌症干细胞的方法
CN109874316A (zh) * 2018-05-25 2019-06-11 昆山汇先医药技术有限公司 用于从样本中富集筛选目标物例如细胞、细菌或生物分子的装置
CN209589868U (zh) * 2019-03-06 2019-11-05 成都中珠健联基因科技有限责任公司 高效提取肿瘤细胞的提取装置

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150050669A1 (en) * 2010-03-05 2015-02-19 Samsung Electronics Co., Ltd. Method and kit for isolating target cell
US20150212095A1 (en) * 2012-03-31 2015-07-30 Nvigen, Inc. Magnetic nanocompositions for highly sensitive molecular and cellular enrichment, purification and detection
CN103275934A (zh) * 2013-06-05 2013-09-04 南昌大学 微量循环肿瘤细胞的分离方法
CN108780090A (zh) * 2015-12-02 2018-11-09 利摩日大学 分离癌症干细胞的方法
CN108529555A (zh) * 2018-05-10 2018-09-14 吉林大学 一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面、制备方法及其应用
CN108753569A (zh) * 2018-05-25 2018-11-06 苏州博福生物医药科技有限公司 一种用于捕获细胞或生物分子的富集筛选机构
CN109874316A (zh) * 2018-05-25 2019-06-11 昆山汇先医药技术有限公司 用于从样本中富集筛选目标物例如细胞、细菌或生物分子的装置
CN209589868U (zh) * 2019-03-06 2019-11-05 成都中珠健联基因科技有限责任公司 高效提取肿瘤细胞的提取装置

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112501122A (zh) * 2020-12-09 2021-03-16 河南大学 一种肿瘤细胞的分离提取方法
CN112844342A (zh) * 2021-01-20 2021-05-28 季华实验室 一种用于富集循环肿瘤细胞的功能化基底及其制备方法
CN112844342B (zh) * 2021-01-20 2023-01-31 季华实验室 一种用于富集循环肿瘤细胞的功能化基底及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111714930B (zh) 2022-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111714930B (zh) 一种用于从血样中富集和分离循环肿瘤细胞的分离介质及方法
Cui et al. ZnO nanowire-integrated bio-microchips for specific capture and non-destructive release of circulating tumor cells
CN109839501B (zh) 一种测定循环肿瘤细胞的电致化学发光免疫传感器及其制备方法与应用
Vandghanooni et al. Recent advances in aptamer-based nanosystems and microfluidics devices for the detection of ovarian cancer biomarkers
Chang et al. Biomimetic immunomagnetic gold hybrid nanoparticles coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry for the detection of circulating tumor cells
CN108896638B (zh) 一种基于二氧化钛掺杂石墨烯负载海参状金钯核壳纳米粒子的免疫传感器的制备方法及应用
US10634670B2 (en) Composition comprising of a conducting polymer for detecting, capturing, releasing, and collecting cell
CN109613244B (zh) 一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法及应用
CN111235103A (zh) 一种用于细胞捕获的流动识别纳米囊泡及其制备方法与应用
Zhao et al. Label-free amperometric immunosensor based on graphene oxide and ferrocene-chitosan nanocomposites for detection of hepatis B virus antigen
CN110907416A (zh) 一种基于空心纳米针管电穿孔系统的循环肿瘤细胞检测装置及其检测方法
Xu et al. A novel microfluidic chip for fast, sensitive quantification of plasma extracellular vesicles as biomarkers in patients with osteosarcoma
Khondakar et al. Prospects in Cancer Diagnosis: Exosome-Chip for Liquid Biopsy
CN112986359B (zh) 基于CuBTC@MoS2-AuNPs修饰电极及CA125检测方法
Wang et al. Gold nanoparticles engineered nanoporous membrane with sandwich structure for sensitive electrochemical quantification of exosome
CN109991298B (zh) 一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法及应用
CN111893023A (zh) 肿瘤细胞捕获装置及其制备、应用
CN110104610B (zh) 一种花粉结构微粒及其制备方法和用途
CN111939992A (zh) 捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法及微流体装置
CN108529555B (zh) 一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面、制备方法及其应用
CN108132287B (zh) 一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备方法及应用
CN115932008A (zh) 一种循环肿瘤细胞富集探针、其制备方法及在构建诊断传感器中的应用
CN112718027B (zh) 微流控芯片和温敏材料复合系统及其制备方法和应用
CN115466787A (zh) 一种三维石墨烯/银纳米粒子复合纳米标记材料和lncRNA分子的电化学传感检测方法
CN113484390B (zh) 一种基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant