CN108529555A - 一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面、制备方法及其应用 - Google Patents
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- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
Abstract
一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面、制备方法及其应用，属于生物技术领域。本发明具体是在基底表面制备出与待测循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构阵列，然后将肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在结构阵列表面，利用所述结构阵列与特异性抗体的协同作用，实现对循环肿瘤细胞的高效、特异性捕获。此种根据靶细胞尺寸设计微米/纳米结构的理念，也可用于其他细胞的检测，这为生物检测基底的制备提供了一个新的蹊径。本发明所制备的基底可以高效、特异性捕获循环肿瘤细胞，具有制备简单、成本低廉的特点，被捕获的细胞具有很好的生存效率，为生物检测基底的制备提供了一个新的蹊径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面、制备方法及其在高效捕获循环肿瘤细胞中应用。
背景技术
恶性肿瘤是导致人类死亡的三大疾病之一，而其中90％以上的死亡是由转移性肿瘤引起的。肿瘤细胞或细胞团脱离原始的肿瘤位置，进入血液或淋巴液，进而扩散至其他器官，为肿瘤的转移提供了可能。这就使得检测这部分游离在血液或淋巴液中的肿瘤细胞变得尤为重要。1869年，Ashworth教授 (Aust.Med.J.,1869,14,146-147)通过与不同种类的肿瘤细胞进行彻底的比较，首次在癌症患者的外周血中发现了循环肿瘤细胞(CirculatingTumor Cells)。据研究表明(Nat.Rev.Clin.Oncol.,2013,10,377-389)，监控血液中循环肿瘤细胞的数目，可以有效地评估肿瘤转移的风险，进行肿瘤的早期检测，评估治疗效果等。因此，检测外周血中循环肿瘤细胞的数目，对临床诊断和治疗具有重要的意义。
然而，实现循环肿瘤细胞的检测，分离和后续的培养仍然是一个巨大的挑战，由于循环肿瘤细胞在血液中十分稀少。这就要求检测方法具有高效，特异性捕获并且被捕获的细胞可以连续培养以用于随后的生物学研究等优点。目前，循环肿瘤细胞的捕获和分离方法主要包括依赖于循环肿瘤细胞的尺寸和表面结构或抗原来实现的，主要包括，基于循环肿瘤细胞的尺寸分离技术 (Am.J.Pathol.,2000,156,57-63)，免疫磁性分离技术(N.Engl.J.Med.,2004,351,781-791),微流控技术(Nature,2007,450,1235-1239)和微米/纳米结构基底(Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48,8970-8973)。基于循环肿瘤细胞的尺寸分离技术主要是利用循环肿瘤细胞与血细胞尺寸不同来实现细胞的分离与检测的，但由于循环肿瘤细胞与白细胞的尺寸不一，使得这种方法捕获细胞的纯度与捕获效率较低。免疫磁性分离技术是目前临床上最常用的技术，其特点是利用肿瘤细胞表面的特异性抗体包覆的免疫磁性粒子捕获循环肿瘤细胞，以快速的磁响应从血液中检测和分离循环肿瘤细胞，这种方法具有检测时间短，相对上一种方法提高了捕获效率等优点，但是制备成本较高，操作较繁琐，限制了该方法的应用。微流控的方法是首先利用肿瘤细胞表面的特异性抗体修饰基底表面，然后通过控制待测样品的流速来使待测样品中细胞与基底充分接触，进而特异性捕获循环肿瘤细胞。该方法具有很高的捕获效率与特异性，但是复杂的制备流程限制了它的应用。利用微米/纳米结构基底与其上修饰的肿瘤细胞表面的特异性抗体的协同作用捕获循环肿瘤细胞的方法，最早由王树涛等提出。该方法是利用微米/纳米结构与细胞表面的微绒毛，伪足等结构作用，大大地提高了捕获效率与特异性。随后王树涛等(Adv.Healthcare Mater.,2015,4,838-843)又提出与细胞体和细胞表面微纳结构同时作用的三维陷阱结构，进一步提升了循环肿瘤细胞的捕获效率。目前该方法由于具有捕获效率高，灵敏度高等优点，引起了越来越多科学家的关注。但是该方法同样具有成本较高，制备复杂等缺点，并且在设计微米/纳米结构基底的过程中，靶细胞的尺寸常常被忽视，以至于细胞无法与微米/ 纳米结构基底充分接触从而限制了基底的捕获效率。因此，迫切需要一种新的具有良好生物相容性的，高效的，高特异性的捕获循环肿瘤细胞的技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面、制备方法及其在高效捕获循环肿瘤细胞中应用。具体是在基底表面制备出与待测循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构阵列，然后将肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在结构阵列表面，利用所述结构阵列与特异性抗体的协同作用，实现对循环肿瘤细胞的高效、特异性捕获。此种根据靶细胞尺寸设计微米/纳米结构的理念，也可用于其他细胞的检测(不仅限于循环肿瘤细胞)，这为生物检测基底的制备提供了一个新的蹊径。本发明所制备的基底可以高效、特异性捕获循环肿瘤细胞，制备简单、成本低廉，并具有良好的生物相容性。
本发明所述的一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面的制备方法(根据循环肿瘤细胞尺寸设计的陷阱结构，该结构可以增大细胞与基底间的接触面积和相互作用)，其步骤如下：
A、将光刻胶旋涂在硅片基底表面，根据待测循环肿瘤细胞的尺寸选取合适的掩膜板进行光刻，光刻后在光刻胶表面获得光刻胶阵列，然后显影，从而在硅片表面得到光刻胶与硅表面相间的结构阵列；
B、在暴露出的硅表面进行金属催化刻蚀，得到硅纳米线结构；然后超声粉碎硅纳米线结构并洗去多余的光刻胶，得到硅片模板；
C、用氧气等离子体处理步骤B得到的硅片模板，并在其上修饰氟代硅烷化试剂以降低其表面能，然后浇筑聚二甲基硅氧烷(PDMS)，加热固化后剥离，得到与待测循环肿瘤细胞尺寸匹配的聚二甲基硅氧烷微纳复合结构基底；
D、将生物素分子修饰的肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在步骤C得到的聚二甲基硅氧烷微纳复合结构基底表面，从而得到与循环肿瘤细胞尺寸匹配并能高效捕获循环肿瘤细胞的微纳复合结构表面。
将含有循环肿瘤细胞的待测样品溶液滴加到步骤D得到的聚二甲基硅氧烷微纳复合结构表面上，并置于细胞培养箱中进行培养，利用所述基底结构与特异性抗体的协同作用，实现对样品中循环肿瘤细胞的高效特异性捕获；利用细胞捕获前后的生存效率对比实验和细胞捕获后的连续培养实验，表征固定了肿瘤细胞表面的特异性抗体的微纳复合结构基底表面的生物相容性。
步骤A，首先将硅片依次用丙酮、氯仿、乙醇、水在40～70W下超声清洗 5～10min，氮气吹干；随后以500～1500转/min的转速初旋6～10s，再以2000～ 5000转/min的转速旋涂1～3min，从而将正性光刻胶旋涂在清洗的硅片上；根据待测循环肿瘤细胞的尺寸选取合适的掩膜板紧贴在旋涂了正性光刻胶的硅片上，在功率为100W～200W的紫外汞灯下曝光1～3min，随后利用显影液显影 10～20s，洗去曝光的光刻胶，从而在硅片表面得到光刻胶与硅表面相间的结构阵列。
步骤B硅片模板的制备，是利用金属催化刻蚀，将步骤A得到的光刻胶与硅表面相间的结构阵列浸泡在等体积的0.01～0.02M的硝酸银水溶液与质量分数0.4％～1％的氢氟酸的混合溶液中，在室温下以光刻胶为掩膜，在暴露出的硅表面沉积银纳米粒子1～3min，随后将沉积了银纳米粒子的基底浸泡在3～6M 氢氟酸与0.1～0.3M过氧化氢的混合溶液中，在30～60℃下刻蚀10～40min，得到硅纳米线结构；最后将上述硅纳米线结构浸泡在丙酮中，在90～100W的功率下超声2～5h，以粉碎硅纳米线结构并洗去多余的光刻胶，得到硅片模板。
步骤C与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构基底的制备，首先是用氧气等离子体在功率为100～300W，氧气流量为50～100sccm，时间为1～3min 的条件下处理步骤B所述的硅片模板，随后将其放入玻璃培养皿中，并在其周围用毛细管均匀散点数滴氟代硅烷化试剂，将培养皿加盖后置于90～250℃的热台上加热2～3h，使氟代硅烷化试剂修饰在硅片模板表面，以降低其表面能；随后将充分搅拌的PDMS预聚物溶液(单体与引发剂质量比为5∶1～10∶1)浇筑在氟代硅烷化试剂修饰的硅片模板上，在60～70℃下加热固化3～4h，降至室温后剥离PDMS，得到与循环肿瘤细胞尺寸匹配的PDMS微纳复合结构基底。
步骤D中特异性抗体的固定步骤如下：
(1)利用氧气等离子体在功率100～300W,氧气流量50～100sccm下处理步骤C所述微纳复合结构基底1～2min，以使基底表面带有羟基基团；
(2)将步骤(1)中所述基底浸泡在体积百分数为2％的羟甲基硅烷三醇的钠盐的水溶液中2～5h，使基底表面修饰上羧基基团；随后用磷酸缓冲溶液冲洗基底2～5次，再将其浸泡在包含25mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与10μg/mL的链霉亲合素(SA)的硼酸缓冲溶液(pH＝7.4,10mM) 中0℃过夜，取出，用磷酸缓冲溶液冲洗3～5次，得到链霉亲合素(SA)包覆的基底；
(3)用磷酸缓冲溶液将生物素分子修饰的肿瘤细胞表面的特异性抗体稀释至10μg/mL，然后将得到的抗体溶液滴加在步骤(2)得到的链霉亲合素(SA) 包覆的基底上，室温下放置30～60min，利用生物素分子与链霉亲合素的作用，将抗体固定在微纳复合结构基底表面，每1cm2的基底上滴加20～30μL抗体溶液。
所述生物素分子修饰的肿瘤细胞表面的特异性抗体为生物素分子修饰的抗EpCAM抗体，光刻胶为BP212正性光刻胶，氟代硅烷化试剂为三乙氧基 -1H,1H,2H,2H-十三氟-N-辛基硅烷(1H，1H，2H，2H-perfluorooctyltriethoxysilane)，均为市售产品。
所述的丙酮，氯仿，乙醇，氢氟酸，过氧化氢，硝酸银，PDMS，羟甲基硅烷三醇的钠盐，EDC，SA，显影液，均为市售产品。
所述的根据循环肿瘤细胞尺寸选择的掩膜板为定制产品，任何人均可以通过定制得到本发明使用的掩膜板。
本发明所述的一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面，其是由上述方法制备得到。
本发明所述的一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面，其可以在高效捕获循环肿瘤细胞中得到应用。
本发明建立了一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面、制备方法及其在高效捕获循环肿瘤细胞中应用，此方法具有捕获效率高，特异性强等特点，并且制备简单，成本低廉，被捕获的细胞具有很好的生存效率，为生物检测基底的制备提供了一个新的蹊径。
附图说明
图1.本发明实施例1中制备的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的四方堆积的微米柱阵列。图1(a～d)为制备流程示意图，图1(e～h)为图1(a～d)所对应的扫描电子显微镜图片。其中图1(e～g)为平面电镜图，图1(g)中插图为硅片模板的切面电镜图，图1(h)为45度角倾斜的斜面电镜图。如图1(h)所示，所得的微纳复合结构由四方堆积的周期性微米柱阵列及每个微米柱表面的多刺纳米结构组成，使得该结构可以同时作用于细胞体及细胞表面的微纳结构，最大化二者的接触面积及相互作用，达到高效捕获循环肿瘤细胞的目的。标尺为10μm。
图2.本发明实施例1的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在与循环肿瘤细胞尺寸匹配的四方排列的微米柱阵列基片上的过程示意图。
图3.本发明实施例1中固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的四方排列的微米柱阵列基片与MCF-7细胞共同培养45min后的荧光显微照片。标尺为50μm。
图4.本发明实施例2中MCF-7细胞被捕获到固定了肿瘤细胞表面的抗 EpCAM抗体的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的四方排列的微米柱阵列基片上的扫描电子显微镜图片。标尺为50μm。
图5.本发明实施例3中制备的四种不同的PDMS结构的扫描电子显微镜图片。标尺为20μm。
图6.本发明实施例3中不同PDMS结构的捕获效率柱状图。
图7.本发明实施例4中MCF-7细胞被捕获前后的荧光显微照片。其中死细胞在图中被注明。标尺为100μm。
图8.本发明实施例4中MCF-7细胞被捕获后连续培养0，12，24，48h的荧光显微照片。标尺为100μm。
具体实施方式
下面通过实施例进一步阐明本发明方法及应用，而不是要用这些实施例来限制本发明。本发明主要是构筑一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面、制备方法及其在高效捕获循环肿瘤细胞中应用，并提出这一利用靶细胞尺寸设计微纳结构的思路。
实施例1
本实施例以MCF-7细胞和Hela细胞为待捕获细胞和参比细胞(MCF-7细胞表面具有膜抗原EpCAM，而Hela细胞不具有)，由于二者尺寸主要分布于 10～20μm，所以，本实施例选用圆孔阵列作为掩膜板，该阵列呈四方排布，周期为20μm，孔径为10μm，来制备四方排布的柱状阵列，作为微纳复合结构表面捕获上述两种细胞，来对本发明的捕获体系做进一步阐述和验证。利用微纳复合结构表面高效捕获循环肿瘤细胞的具体步骤如下：
(1)构筑微纳复合结构表面
将硅片用丙酮，氯仿，乙醇，水在70W的功率下依次超声5min，氮气吹干后，以1500转/min初旋6s，5000转/min旋涂1min将光刻胶(BP212)旋涂在硅片表面，随后将周期为20μm，圆孔直径为10μm的四方排布的孔模板紧贴在旋涂了光刻胶的硅片上，用功率为175W的紫外汞灯进行曝光，时间为2min。将曝光后的样品放入显影液中显影12s，用蒸馏水冲洗，并用氮气吹干，在硅片表面得到光刻胶网状结构(图1(a))。随后，以光刻胶网状结构为掩膜，利用硝酸银(0.01M)与氢氟酸(质量分数为0.4％)等体积混合的混合液，在暴露出的硅表面沉积银纳米粒子，沉积时间为2min，取出，用蒸馏水冲洗并用氮气吹干。将上述基底放入氢氟酸与过氧化氢的混合溶液中进行刻蚀，其中氢氟酸的浓度为4.8M，过氧化氢的浓度为0.2M，刻蚀时间为16min，反应温度为60℃。在暴露出的硅表面刻蚀成硅纳米线结构(图1(b))。将上述基底放入丙酮中进行超声(有结构那一面向下)，超声功率为100W，时间为3h，以粉碎硅纳米线结构(得到硅纳米线主要是由于金属催化刻蚀是以沉积的金属为催化剂进行的刻蚀，在有银沉积的地方会被刻蚀下去，形成孔。本实验沉积的银粒子较多，刻蚀条件较剧烈，使得孔与孔相连接，挤出纳米线结构)，并除去剩余光刻胶，得到硅孔模板(图1(c))。利用氧气等离子体处理硅孔模板，功率为300w，氧气流量为 100sccm，时间为2min。随后，将硅孔模板放入玻璃培养皿中，并在其周围用毛细管均匀散点数滴氟代硅烷化试剂(1H，1H，2H，2H-perfluorooctyltriethoxysilane)，将培养皿加盖后置于150℃的热台上加热3h，以将氟代硅烷化试剂修饰在硅孔模板表面。将PDMS预聚物溶液(单体与引发剂的质量比为10∶1)充分搅拌，倾倒在硅孔模板表面，在68℃下加热固化3h，降至常温，剥离PDMS，得到与循环肿瘤细胞尺寸匹配的PDMS柱状结构表面(图1(d))，柱的高度大约为10μm。由于硅纳米线断裂位置不一，使得所得柱状结构为微纳复合结构。图1(e～h) 为图1(a～d)对应的扫描电子显微镜(日立，SU8020FE-SEM)图片。其中图 1(g)右上角的插图为硅孔结构切面的扫描电子显微镜照片，比例尺均为10μm。
(2)将抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的 PDMS微纳复合结构表面固定过程如图2所示，具体步骤如下：
(a)利用氧气等离子体在功率为300W，氧气流量为100sccm下处理步骤 (1)所述的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的PDMS微纳复合结构表面1min，以使基底表面带有羟基基团。
(b)将步骤(a)中所述基底浸泡在体积比为2％的羟甲基硅烷三醇的钠盐的水溶液中3h，使基底表面修饰上羧基基团。随后，用磷酸缓冲溶液冲洗基底5 次，将其浸泡在包含25mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 与10μg/mL的链霉亲合素(SA)的硼酸缓冲溶液(pH＝7.4,10mM)中0℃过夜，取出，用磷酸缓冲溶液冲洗5次，得到SA包覆的基底。
(c)用磷酸缓冲溶液将生物素化的肿瘤细胞表面的特异性抗体(抗EpCAM 抗体)稀释至10μg/mL，滴加在步骤(b)所述基底上，室温下放置45min以得到抗体包覆的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构基底(每1cm2的基底上滴加25μL抗体溶液)。
(3)准备待测与参比样品
取20μL的MCF-7细胞与Hela细胞悬液，分别用细胞计数器计数并计算浓度，分别用细胞培养基DMEM稀释两种细胞至105个细胞/mL，混合均匀，常温下备用。
(4)捕获待测与参比样品中的循环肿瘤细胞
将包覆了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构基底放入细胞培养板中(面积9.6cm2)中，取步骤(3)中所述细胞悬液3mL(105个细胞/mL)滴在微纳复合结构表面，在37℃的纯净空气，包含体积分数为5％的CO2条件下培养45min，利用微纳复合结构和肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的协同作用，实现对循环肿瘤细胞的高效捕获。
(5)评估被捕获的循环肿瘤细胞
捕获结束后，将步骤(4)所述的捕获了循环肿瘤细胞的微纳复合结构用磷酸缓冲溶液冲洗5次，以去除非特异性黏附的细胞。用含有质量分数为4％的多聚甲醛的磷酸缓冲溶液固定细胞20min，用含有质量分数为0.2％的Triton X-100 的磷酸缓冲溶液处理样品10min以增加细胞膜的渗透性。随后，将样品浸泡在 DAPI水溶液(10μg/mL)中15min并用磷酸缓冲溶液冲洗五次以除去多余DAPI。每个样品选取五个中心位置，用奥林巴斯(IX73)倒置显微镜拍照(图3)，并对捕获了循环肿瘤细胞的微纳复合结构上的细胞进行计数，计数捕获效率。
实验结果表明，肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体包覆的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面对MCF-7细胞的捕获效率为91％，而对Hela细胞的捕获效率仅26％，表明该方法可以高效特异性地捕获循环肿瘤细胞。
实施例2
用含有质量分数为2.5％的戊二醛的磷酸缓冲溶液在4℃下浸泡实施例1所述的捕获了MCF-7细胞的微纳复合结构，过夜，以固定被捕获的细胞。随后，用一系列具有一定梯度的不同体积分数的乙醇水溶液(0，30％，50％，70％，90％， 100％)，来使细胞脱水，并在常温下干燥。溅射10nm的金膜，并用日立(SU8020 FE-SEM)扫描电子显微镜表征被固定的MCF-7细胞，结果如图4所示。细胞体被捕获在四个柱之间，与微米级阵列作用，而在细胞与每一个柱接触的位置伸出大量伪足，说明细胞表面的微纳结构可以与柱表面的微纳结构相互作用。因此，与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构可以同时作用于细胞体和细胞表面的微纳结构，增加了二者的接触面积，并得到了更大的捕获效率。
实施例3
将实施例1中所述的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构命名为 PDMS-1。并利用实施例1中所述相同的方法，更换光刻模板，得到周期为10μm、柱宽为5μm、柱高为10μm和周期为60μm、柱宽为30μm、柱高为10μm的两种与循环肿瘤细胞尺寸不匹配的结构，分别命名为PDMS-2与PDMS-3。利用实施例1中相同的方法对空白硅片进行金属催化刻蚀得到硅纳米线阵列，超声粉碎硅纳米线，并浇筑PDMS预聚物，固化，冷却剥离，得到粗糙的PDMS表面结构，命名为RPDMS。四种PDMS结构的扫描电子显微镜(日立，SU8020FE-SEM) 照片如图5所示。图5(a)～(d)分别对应RPDMS，PDMS-1，PDMS-2，PDMS-3 结构。利用实施例1中所述方法将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体包覆在上述 PDMS结构以及平面PDMS结构上，并放入细胞培养板中，与MCF-7细胞共同培养45min后，取出，染色，显微拍照并计数。得到的细胞捕获效率如图6所示。其中包覆了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的PDMS 结构表面(anti-EpCAM/PDMS-1)获得了最大的捕获效率，是由于该结构可以使细胞限域在四个柱之间，同时与细胞体和细胞表面微纳结构作用，最大化与细胞之间的接触面积和相互作用，从而达到最大的捕获效率。
实施例4
本实施例中，我们通过细胞被捕获前后的生存效率实验和对被捕获的细胞进行连续培养实验来表征固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构基底表面的生物相容性。具体操作如下：
(1)利用实施例1中所述方法，制备肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体包覆的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的PDMS结构表面(anti-EpCAM/PDMS-1)用于随后的实验。
(2)等体积混合15μg/mL的吖啶橙与15μg/mL的碘化丙啶，得到工作液，用于活/死细胞染色，其中活细胞只能被吖啶橙染成绿色，而死细胞可以被吖啶橙和碘化丙啶染成绿色加红色。
(3)取20μL的MCF-7细胞悬液，用细胞计数器计数并计算浓度，用细胞培养基DMEM稀释细胞至105个细胞/mL，混合均匀，常温下备用。
(4)将固定了肿瘤细胞表面抗EpCAM抗体的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的 PDMS微纳复合结构(anti-EpCAM/PDMS-1)放入细胞培养板内，取步骤(3) 中所述细胞悬液3mL(105个细胞/mL)滴在PDMS微纳复合结构表面，在37℃的纯净空气，包含体积分数为5％的CO2条件下培养45min。
(5)对于捕获前的MCF-7细胞，取细胞悬液1mL(105个/mL),加入0.5μL 工作液，染色15min，每5min震荡一次。随后，离心分离细胞悬液(1000转/min， 3min)并用DMEM冲洗细胞，分散回新鲜的DMEM中。对于被捕获后的MCF-7 细胞，将工作液滴加到步骤(4)所述的捕获了MCF-7细胞的PDMS微纳复合结构表面(每1cm2的基底上滴加1mL工作液)，染色五分钟。每个样品选取五个中心位置用奥林巴斯(IX73)倒置显微镜拍照，结果如图7所示。其中死细胞已在图中注明。经过计算，被捕获在固定了肿瘤细胞表面抗EpCAM抗体的与循环肿瘤细胞尺寸匹配的PDMS微纳复合结构表面的细胞的生存效率为98.6％。
(6)将步骤(4)中所述的捕获了MCF-7细胞的PDMS微纳复合结构基底浸泡在新鲜的DMEM中，连续培养(0，12，24，48h)并用5μg/mL的钙黄绿素染色(每1cm2的基底上滴加0.5mL的钙黄绿素染料)，随后利用奥林巴斯(IX73) 倒置显微镜拍照，结果如图8所示。在培养12h和24h后，细胞明显伸展，体积增大，并在培养48h后显著增殖。
由上述两个实验可见，该基底具有很好的生物相容性。
Claims (8)
1.一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面的制备方法，其步骤如下：
A、将光刻胶旋涂在硅片基底表面，根据待测循环肿瘤细胞的尺寸选取合适的掩膜板进行光刻，光刻后在光刻胶表面获得光刻胶阵列，然后显影，从而在硅片表面得到光刻胶与硅表面相间的结构阵列；
B、在暴露出的硅表面进行金属催化刻蚀，得到硅纳米线结构；然后超声粉碎硅纳米线结构并洗去多余的光刻胶，得到硅片模板；
C、用氧气等离子体处理步骤B得到的硅片模板，并在其上修饰氟代硅烷化试剂以降低其表面能，然后浇筑聚二甲基硅氧烷，加热固化后剥离，得到与待测循环肿瘤细胞尺寸匹配的聚二甲基硅氧烷微纳复合结构基底；
D、将生物素分子修饰的肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在步骤C得到的聚二甲基硅氧烷微纳复合结构基底表面，从而得到与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面。
2.如权利要求1所述的一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面的制备方法，其特征在于：步骤A，首先将硅片依次用丙酮、氯仿、乙醇、水在40～70W下超声清洗5～10min，氮气吹干；随后以500～1500转/min的转速初旋6～10s，再以2000～5000转/min的转速旋涂1～3min，从而将正性光刻胶旋涂在清洗的硅片上；根据待测循环肿瘤细胞的尺寸选取合适的掩膜板紧贴在旋涂了正性光刻胶的硅片上，在功率为100W～200W的紫外汞灯下曝光1～3min，随后利用显影液显影10～20s，洗去曝光的光刻胶，从而在硅片表面得到光刻胶与硅表面相间的结构阵列。
3.如权利要求1所述的一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面的制备方法，其特征在于：步骤B硅片模板的制备，是利用金属催化刻蚀，将步骤A得到的光刻胶与硅表面相间的结构阵列浸泡在等体积的0.01～0.02M的硝酸银水溶液与质量分数0.4％～1％的氢氟酸的混合溶液中，在室温下以光刻胶为掩膜，在暴露出的硅表面沉积银纳米粒子1～3min，随后将沉积了银纳米粒子的基底浸泡在3～6M氢氟酸与0.1～0.3M过氧化氢的混合溶液中，在30～60℃下刻蚀10～40min，得到硅纳米线结构；最后将上述硅纳米线结构浸泡在丙酮中，在90～100W的功率下超声2～5h，以粉碎硅纳米线结构并洗去多余的光刻胶，得到硅片模板。
4.如权利要求1所述的一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面的制备方法，其特征在于：步骤C微纳复合结构基底的制备，首先是用氧气等离子体在功率为100～300W，氧气流量为50～100sccm，时间为1～3min的条件下处理步骤B所述的硅片模板，随后将其放入玻璃培养皿中，并在其周围用毛细管均匀散点数滴氟代硅烷化试剂，将培养皿加盖后置于90～250℃的热台上加热2～3h，使氟代硅烷化试剂修饰在硅片模板表面，以降低其表面能；随后将充分搅拌的单体与引发剂质量比为5∶1～10∶1的聚二甲基硅氧烷预聚物溶液浇筑在氟代硅烷化试剂修饰的硅片模板上，在60～70℃下加热固化3～4h，降至室温后剥离聚二甲基硅氧烷，得到与循环肿瘤细胞尺寸匹配的聚二甲基硅氧烷微纳复合结构基底。
5.如权利要求1所述的一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面的制备方法，其特征在于：步骤D中特异性抗体的固定步骤如下，
(1)利用氧气等离子体在功率100～300W,氧气流量50～100sccm下处理步骤C所述聚二甲基硅氧烷微纳复合结构基底1～2min，以使基底表面带有羟基基团；
(2)将步骤(1)中所述基底浸泡在体积百分数为2％的羟甲基硅烷三醇的钠盐的水溶液中2～5h，使基底表面修饰上羧基基团；随后用磷酸缓冲溶液冲洗基底2～5次，再将其浸泡在包含25mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与10μg/mL的链霉亲合素的硼酸缓冲溶液中0℃过夜，取出，用磷酸缓冲溶液冲洗3～5次，得到链霉亲合素包覆的基底；
(3)用磷酸缓冲溶液将生物素分子修饰的肿瘤细胞表面的特异性抗体稀释至10μg/mL，然后将得到的抗体溶液滴加在步骤(2)得到的链霉亲合素包覆的基底上，室温下放置30～60min，利用生物素分子与链霉亲合素的作用，将抗体固定在微纳复合结构基底表面，每1cm2的基底上滴加20～30μL抗体溶液。
6.如权利要求1所述的一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面的制备方法，其特征在于：生物素分子修饰的肿瘤细胞表面的特异性抗体为生物素分子修饰的抗EpCAM抗体，光刻胶为BP212正性光刻胶，氟代硅烷化试剂为三乙氧基-1H,1H,2H,2H-十三氟-N-辛基硅烷。
7.一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面，其特征在于：是由权利要求1～7任何一项所述的方法制备得到。
8.权利要求7所述的一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面在高效捕获循环肿瘤细胞中的应用。
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